Wektory DNA - klonowanie molekularne

Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. „zmusić” go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany tj. zrekombinowany in vitro z odpowiednim elementem genetycznym zwanym wektorem czyli cząsteczką DNA

•zdolną do „wnikania” do wnętrza komórek tego gospodarza

•zdolną do autonomicznej replikacji

O takim fragmencie DNA wbudowanym do wektora i wprowadzonym do jakiegoś gospodarza (najczęściej

bakteryjnego) mówimy że jest on sklonowany w bakteriach

Co oznacza klonowanie molekularne?

Termin „klonowanie” w odniesieniu do pojedynczegofragmentu DNA oznacza namnażenie (powielanie)określonego odcinka DNA w komórkach gospodarza,(najczęściej bakterie np. Escherichia coli), przy zastosowaniuodpowiedniego wektora.

Klonowanie DNA jest podstawową techniką inżynieriigenetycznej. Klonowanie molekularne umożliwia:•znalezienie, wyizolowanie i namnożenie wybranego genu z genomujakiegoś organizmu,•przeprowadzania manipulacji, na przykład mutagenezy,•uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcji kodowanego przezniego produktu.

Do klonowania molekularnego niezbędne są dwa elementy:

•wektor•gospodarz

Nie zawsze celem klonowania molekularnego jest produkcja białka przez komórki bakteryjne- sklonowanie fragmentu DNA jest często celem samym w sobie

Tranfsormacja

Ekspresja ludzkiej insuliny w bakteriach

Enzym restrykcyjny

Wektor plazmidowy

ludzkie cDNA linker

Zrekombinowane DNA plazmidowe

Klonowanie molekularne

chromosombakteria

rekombinowana insulina rekombinowana insulina

•Klonowanie molekularne można przeprowadzić w komórkach mikroorganizmów jak i eukariotycznych, ale:

•Klonowanie w komórkach prokariotycznych jest nieporównywalnie prostsze

ponieważ komórki bakteryjne łatwo jest hodować i izolować z nich duże ilości specyficznego DNA, które można poddawać kolejnym zabiegom: : sekwencjonowaniu, mapowaniu, transformacji, hybrydyzacji itd.

•W bakteriach możemy z powodzeniem klonować (powielać) geny prokariotyczne i eukariotyczne.

Mówimy klonowanie molekularne = myślimy klonowanie w bakteriach

Jako wektorów do klonowania molekularnego w mikroorganizmach używa się:

1. Plazmidów

2. Bakteriofagów

3. Kombinacji elementów genetycznych plazmidowo-fagowychnp. kosmidów, fagemidów, itp.

Wektory plazmidowe

1. Ogólnego przeznaczenia – proste powielanie wybranego genu

2. Wektory do „zadań specjalnych” (są to wektory, które oprócz samego powielania DNA umożliwiają np.

• wydajną ekspresję sklonowanego genu – produkcję białka

• badanie własności sklonowanego genu lub odcinka DNA

• otrzymywanie jednoniciowego DNA (ssDNA)

• stabilne powielanie ekstremalnie duże fragmentów DNA –konstrukcja banków (bibliotek) genomowych

Cechy dobrego wektora plazmidowego

•Zdolny do autonomicznej replikacji (niezależnej od chromosomu gospodarza) –musi posiadać tzw. origin replikacji – oriV(nieliczne wektory integracyjne, wbudowują się do DNA

gospodarza, są bardziej stabilne, mają mniejszą ilość kopii)

•Marker selekcyjny (czyli gen kodujący białko

odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek , do których wniknął.

•MCS (multiple cloning site – miejsce wielokrotnego klonowania tzw. polilinker) Pozwala na swobodny dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego do sklonowania fragmentu DNA.

•Wektor powinien być niezdolny do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu szczepach (mały zakres gospodarza), nie posiadać zdolności koniugacyjnych.

•Powinien być stosunkowo niewielki (poniżej 10 kpz)

kilkadziesiąt – kilkaset pz

Wektory plazmidowe – miejsce startu replikacji

Plazmid Replikon

(oriV)

Ilość kopii na

komórkę

pBR322 i pochodne pMB1 15-20

wektory serii pUC pMB1 500-700

pACYC i pochodne p15A 10-12

pSC101 i pochodne pSC101 ~5

ColE1 ColE1 15-20

Replikony ColE1 i pMB1 są niezgodne, są natomiast zgodne z pSC101 i p15A

Miejsce startu replikacji (oriV ) wektora plazmidowego determinuje:

• ilość kopi wektora w komórce

• zgodność z innymi wektorami plazmidowymi

MCS (polilinker)

500-700 kopii na komórkę

• Plazmidy takie jak pUC umożliwiają tzw. wizualną identyfikację klonów zrekombinowanych, dzięki wstawieniu do wektora genu (lub fragmentu

genu) kodującego enzym, który rozkłada jakiś barwny substrat.

• MCS znajduje się wtedy w obrębie tego genu. Jego przerwanie przez wstawienie obcego fragmentu DNA sprawia że kolonie zawierające zrekombinowany i niezrekombinowany wektor rosną na płytce selekcyjnej wybarwiając się na różne kolory

• Wektory (nie tylko plazmidowe) zazwyczaj posiadają również systemy pozwalające na odróżnienie komórek gospodarza który pobrał wektor zrekombinowany od takiego, który zamknął się bez połączenia z obcym fragmentem DNA.

Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów

Wektor zawiera N-końcowy fragment beta-galaktozydazy (genu lacZ), wprowadza się go komórek, które syntetyzują tylko część C-końcową beta-galaktozydazy (niosących zmutowany geny lacZ). Obydwa peptydy mogą asocjować (-komplementacja) tworząc aktywne enzymatycznie białko.

Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów c.d.

Szczep gospodarza bakteryjnego do klonowania molekularnego ma specjalne właściwości! (został odpowiednio zmodyfikowany)

X-gal sztuczny substrat dla beta-galaktozydazy

IPTG sztuczny induktor beta-galaktozydazy (tzw. bezinteresowny)

Selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić przez zahamowanie namnażania się klonów komórek zawierających niezrekombinowany plazmid.

Takie wektory zawierają gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja klonowanego DNA inaktywuje ekspresję letalnego genu umożliwiając wzrost rekombinantów.

Wektory plazmidowe specjalnego przeznaczenia

I. Plazmidowe wektory ekspresyjne – pozwalają na nadprodukcję (nadekspresję) białka w komórkach gospodarza - bakteriach

Co wyróżnia wektory ekspresyjne?

1. Silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę

RNA gospodarza Silny promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest

inicjowana wiele razy na minutę

regulowany – można go „włączać i wyłączać”

Ptac promotor hybrydowy zlożony z regionu -35 promotora trp i regionu

promotorowo/operatorowego-10 lac. Ekspresja Ptac podlega represjiprzez białko LacI.

• PL faga , lac E. coli, trp E. coli, bla (promotor genu -laktamazy E. coli).

I. Plazmidowe wektory ekspresyjne

Co wyróżnia wektory ekspresyjne?

1. Silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę

RNA gospodarza np.

•Silny promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę.

•regulowany promotor oznacza że można go indukować. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).

Promotory genów bakteriofagowych

•T7, SP6 i T3

Plazmidowe wektory ekspresyjne z promotorem późnych białek faga T7 (seria wektorów pET+”specjalny szczep bakterii E. coli”)

•Promotor PL faga jest kilka razy silniejszy od lac. Jest kontrolowany przez termowrażliwy represor CI, który jest inaktywowany w podwyższonej temperaturze (42 st. C) co powoduje wzrost ekspresji genu.

2. Wektory ekspresyjne są wyposażone w sekwencje niezbędne do translacji mRNA transkrybowanego ze sklonowanego genu

• RBS (ribosome binding site): miejsce wiązania rybosomu

• Sztuczny kodon startowy ATG

Tranfsormacja

Ekspresja ludzkiej insuliny w bakteriach

Enzym restrykcyjny

Plazmidowywektor

ekspresyjny

ludzkie cDNA linker

Zrekombinowane DNA plazmidowe

Klonowanie molekularne

chromosombakteria

rekombinowana insulina rekombinowana insulina

Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja rekombinowanej insuliny w bakteriach

II. Wektory do transkrypcji RNA in vitro

Zawierają promotory bakteriofagów takiej jak T3, T7 i/lub SP6 umieszczone przed miejscem wstawienia DNA.

Zastosowanie: wydajna produkcja RNA (np. mRNA) in vitro

III. Wektory do badania własności sklonowanego genu lub odcinka DNA, np. do badania aktywności promotorów

lacZ

oriV

MCS

Tet

oriT

trfA

pMP220(104000 pz)

XhoI

BglI

IE

coR

IK

pn

IX

baI

Pst

I

Fragmenty DNA wprowadza się w tych wektorach w pobliżu genu reporterowego np. pozbawionego własnego promotora genu lacZ i mierzy aktywność jego ekspresji

IV. Wektory do rekombinacji i klonowania nietypowychfragmentów DNA

Nietypowych: np. uzyskanych inaczej niż przez trawienie cząsteczek DNA enzymami restrykcyjnymi – np. fragmentów DNA, które zostały uzyskane w reakcji PCR

2. Wektory bakteriofagowe

Wektory fagowe: bakteriofag

Fag zawiera ds DNA wielkości 48502 pz, 12 pz jednoniciowe lepkie końce cos

Ok. 60% genomu faga jest niezbędna do jego litycznego cyklu życiowego, środkowa część 15 kpz (ok. 1/3) może być zastąpiona obcym DNA.

DNA z delecją nie może być pakowany w główki, co staje się zaletą ponieważ tylko DNA ze wstawionym obcym DNA może się zapakować w główki (dobra selekcja fagów zrekombinowanych).

Schemat klonowania DNA w wektorze-fagu

Inne wektory bakteriofagowe:

•pochodne bakteriofaga P1 (Sternberg 1990)

•podobne do faga , oparte na wersjach delecyjnych genomu faga P1.

•P1 ma większy niż genom co pozwala klonować większe fragmenty DNA do 125 kpz – konstrukcja bibliotek genomowych

Wektory fagowe: bakteriofag M13

•Jego genom to ssDNA (6407 pz), 200-300 kopii na komórkę,

•Po wniknięciu do komórki jest syntetyzowana druga komplementarna nić DNA, w formie ds DNA ulega replikacji. W końcowej fazie ponownie powstają formy ssDNA pakowane w osłonki i uwalniane z komórki

•Służy do klonowania niewielkich fragmentów DNA (zwykle poniżej 1 kpz)

•Seria wektorów M13mp18/19 zbudowanych na bazie faga M13 posiada możliwość -komplementacji, syntetyczny MCS

•Ich podstawowe zastosowanie to otrzymywanie jednoniciowego DNA (ssDNA), które dawniej używane było w sekwencjonowaniu DNA oraz mutagenezie in vitro.

3. Kombinacje plazmidów i bakteriofagów

a) Fagemidy

Uzyskuje się je np. przez wprowadzenie do wektora plazmidowego fragmentu ori z jednoniciowego bakteriofaga M13 lub f1.

Wektory te służą podobnie jak pochodne M13 do otrzymywania kopii ssDNA wykorzystywanych do sekwencjonowania DNA lub syntezy znakowanego DNA.

b) Kosmidy- wektory plazmidowe wyposażone

w sekwencję cos faga , ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz co oznacza, że można do niego sklonować od 35-45 kpz.

Zastosowanie

•Konstrukcja bibliotek genomowych

Fosmidy - specyficzna odmiana kosmidów

•Zawierają miejsce startu replikacji z plazmidu F oraz sekwencję cos z faga .

•Budowa podobna do kosmidów,

•Znacznie mniejsza ilość kopii na komórkę i dzięki temu większa stabilność

Wektory drożdżowe

Drożdże jako komórki gospodarzy posiadają pewne zalety:

•mają struktury komórkowe typowe dla eukariota ale są jednokomórkowe

•geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe ponieważ proces obróbki mRNA jest zbliżony do tego, który występuje u wyższych eukariontów

•powstające białka mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym

Kiedy zatem użyć drożdży jako gospodarza w klonowaniu molekularnym?

1. W przypadku klonowania eukariotycznych genów, które nie dają się sklonowować w bakteriach

2. wtedy gdy zależy nam nie tylko na prostym powieleniu DNA, ale także na uzyskaniu ekspresji genu w komórce eukariotycznej i otrzymaniu białek odpowiednio zmodyfikowanych potranslacyjnie

WEKTORY DROŻDŻOWE - wektory wahadłowe

(ang. shuttle vector)

wahadłowość to cecha typowa dla wielu wektorów eukariotycznych

Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne) mają:

• dwa odrębne miejsca startu replikacji (jedno z nich jest wykorzystywanew eukariotycznych komórkach - drożdży, drugie w komórkachprokariotycznych E. coli)

• dwa typy markerów selekcyjnych: dla komórek drożdżowych jak ibakteryjnych

• umożliwia to wygodne utrzymywanie wektora w komórkachbakteryjnych oraz np. ekspresję sklonowanych genów wdrożdżach

1983 Murray i Szostak – sztuczny chromosom drożdżowy YAC

YAC ma wielkość 10-15 kb (chromosom drożdżowy od 230 do>2500 kpz) co oznacza w YAC-u można sklonować odcinek DNA do 2,5 Mpz

Wektory te są w drożdżach stabilne mitotycznie nawet bez presjiselekcyjnej i utrzymują się jako liniowy minichromosom (w ilości 1-2kopii na kom.)

YAC składa się z części

1. prokariotycznej-(plazmidowe oriV i marker selekcyjny – gen oporności na antybiotyk)

2. eukariotycznej• która zawiera: odcinek ori ARS, centromer CEN, telomery i geny selekcyjne (np. his3, trp1, ura3 –nie są to geny oporności na antybiotyk)

• przynajmniej jedno unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania obcego DNA

•System do wizualnej selekcji klonów zrekombinowanych sup4(białe i różowe) ale nie jest to alfa-komplementacja

BamH1

BamH1

Sup4

Dodatkowo w części eukariotycznej występują sekwencje umożliwiające ekspresję sklonowanego genu tzw. kaseta ekspresyjna, która obejmuje:

• promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza eukariotycznego (drożdżową polimerazę RNA)

• terminator transkrypcji

• MCS (zwykle mało rozbudowane)

• sztuczną sekwencję intronowej, która umożliwia dojrzewanie transkrtyptu mRNA powstającego ze sklonowanego genu eukariotycznego

Zrekombinowane YAC-i powielają się drożdżach dzięki chromosomalnym mechanizmom replikacji!!!

Jak używać YAC-a?

Wektory do komórek wyższych eukariontów (zwierząt i ludzi)

•Należy rozpatrywać je raczej w kategoriach systemów dostarczaniagotowego konstruktu genetycznego lub transgenu

•Znajdują zastosowanie w tzw. badaniach podstawowych in vitro (liniekomórkowe), terapii genowej czy transgenezie

•są w większości wektorami wahadłowymi

•Są oparte głównie na wirusach (odpowiednio zrekombinowane DNAwirusowe, w których geny samego wirusa zostały usunięte lub zastąpionesekwencjami terapeutycznymi lub transgenami)

Jakie wirusy wykorzystuje się do konstrukcji wektorów

•retrowirusy oraz lentiwirusy (HIV)

•adenowirusy

•wirusy towarzyszące adenowirusom AAV (adenoassociatedvirus)

•wirus opryszczki HSV

•Wektory retrowirusowe i adenowirusowe są najczęściejstosowanymi wektorami eukariotycznymi wykorzystywanymi wdopuszczonych protokołach terapii genowej np. nowotworów

Podstawowe kryteria którymi należy kierować się przy tworzeniu wektorów wirusowych np. niosących terapeutyczne DNA to

•bezpieczeństwo

•specyficzność i stabilność dostarczania genów

•efektywność namnażania się w liniach komórkowych (produkcyjnych) -wysokie miano (duża liczba cząsteczek rekombinowanego wirusa w jednostce objętości)

• prosty system produkcji

•możliwość dostarczania materiału genetycznego o dużych rozmiarach

• brak immunogenności

Aktualnie nie dysponujemy jednym uniwersalnym nośnikiem wirusowym, a powyższe wymagania spełniają różne systemy wektorów. W związku z tym faktem, poszczególne systemy wirusowe wykorzystuje się do odpowiednich strategii i/lub konkretnych zastosowań

Co w trakcie konstrukcji wektora można usunąć z wirusa a co musi w nim pozostać?

Funkcje (i geny) wirusowe można podzielić na cis i trans.

•Cis to takie które nie mogą zostać usunięte z genomu wirusa np. miejsce startu replikacji lub sygnał "pakujący".

•Natomiast trans to geny których funkcje mogą z powodzeniem zostać zastąpione przez analogi pochodzące od zmodyfikowanych linii komórek pakujących.

•Zwykle dąży się do tego aby wszystkie geny trans usunąć z genomu wirusa i umieścić je w genetycznych elementach pomocniczych.

Daje to dużo miejsca na obce geny a poza tym zwiększa bezpieczeństwo, gdyż tak powstały wirus jest niezdolny do namnażania się poza komórkami pakującymi

Rekombinowane wektory retrowirusowe

Wektory retrowirusowe oparte są najczęściej na Mysim Wirusie Białaczki Moloney’a - MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus). Jest to podstawowa grupa wektorów znajdująca swoje główne zastosowanie w terapii nowotworów, gdyż mają one naturalną skłonność do infekowania intensywnie dzielących się komórek

LTR - gag - pol - env - (onc) - LTR

•gag – strukturalne białka płaszcza wirusa

•pol – odwrotna transkryptaza

•env – glikoproteiny otoczki wirusa

LTR - Long terminal repeat – sekwencja promotorowo-regulatorowana każdym z końców genomu RNA wirusa

Ponieważ wektor jest wahadłowy możemy go zrekombinować w bakteriach np. E. coli

Drugi składnik to linia komórek tzw. pakujących z prowirusempozbawionym sekwencji psi a posiadającym geny kodujące białka otoczki wirusa i odwrotną transkryptazę (geny: gag, pol, env).

DNA retrowirusa z włączonym do niego obcym genem (pierwszy składnik) wprowadza się do komórek pakujących

W komórkach pakujących DNA retrowirusa zostaje przepisane na RNA a to z kolei jest pakowane w otoczki białkowe.

Takie wiriony izoluje się i infekuje nimi komórki docelowe, w których następuje przepisanie RNA na DNA, które z kolei włączanejest do chromosomu właściwego biorcy

wektory wahadłowe rekombinuje się w bakteriach np. E. coli a do komórek eukariotycznych (pakujących) wprowadza się gotowe konstrukty

•Osobną grupę wektorów retrowirusowych stanowią pochodne

lentivirusów, takich jak HIV.

Mogą one zakażać nie tylko komórki dzielące się lecz praktycznie wszystkie

• Wektory adenowirusowe

Adenowirusy mogą infekować duży wachlarz typów komórek, także nie dzielące się i są w miarę łagodne

Ekspresja genów wprowadzony za ich pomocą jest silna i stabilna ale dość krótkotrwala, ponieważ DNA wirusa znajduje się poza DNA gospodarza (nie integrują się z genomem gospodarza) i dlatego nie ulega replikacji. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DNA jest coraz mniej.

Doskonale nadają się do terapii genowej mającej na celu zniszczenie komórek (suicide genes), ale nie są odpowiednie do dostarczania genów terapeutycznych

AAV- wirusy towarzyszące adenowirusom

•Należą one do niepatogennych ludzkich parvowirusów, które do namnażania wymagają obecności wirusów pomocniczych (najczęściej są to adenowirusy) (wada i zaleta).

•Atrakcyjność tego typu wektorów polega na tym, iż nie powodują żadnych ludzkich chorób (bo przy braku adenowirusa są defektywne replikacyjnie)

•Mają dość dużą pojemność (tylko ok. 4% genomu wirusa jest niezbędna)

•mogą dostarczać DNA do niedzielących się komórek.

•w naturalnej formie wbudowują geny do chromosomów gospodarza co pozwala na przedłużoną ekspresję transgenu

Wektory bazujące na herpeswirusach

Spośród herpeswirusów jako wektory są wykorzystywane dwa: Herpes simplex i Epstein-Barr

pojemność wektora Herpes simplex wynosi 40-50 kb.

Epstein-Barr virus ma duży genom (ok. 172 kb), a przy tym koniecznymi elementami cis są tylko dwa elementy, oriP, miejsce startu replikacji i gen EBNA-1, w sumie mające długość ok. 4 kb. Pozwala to na wprowadzenie bardzo dużych fragmentów DNA

Wirusy herpes nie wbudowują swojego meteriału genetycznego w genom gospodarza.

Mają one jednak powinowactwo do neuronów, dlatego bada się je głównie pod kątem ukierunkowanej terapii genowej tkanki nerwowej, m.in. w leczeniu choroby Parkinsona, złośliwych gliom (nowotworów mózgu).

Wektory pochodne bakulowirusów – eukariotyczne wektory ekspresyjne

•rodzina wirusów DNA chorobotwórczych dla stawonogów, głównie owadów.

•Genom bakulowirusów stanowi duży (128 kpz), kolisty, dwuniciowy DNA.

•wektor skonstruowany został z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporności na antybiotyk a także kasety ekspresyjnej , w skład której w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirusa czyli promotor i terminator.

•komórki owadów lub całe larwy transfekuje się mieszaniną DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora niosącego zrekombinowany gen i gen markerowy umożliwiający selekcję w komórkach owadów. Wewnątrz komórki dochodzi do homologicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa.

•System pozwala uzyskiwać typowe dla wyższych eukariontów modyfikacje potranslacyjne eksprymowanych białek.

•Wydajność produkcji jest dość niska a koszt stosunkowo wysoki. Znajdują one zastosowanie przy produkcji niektórych leków.

Markery selekcyjne stosowane w wektorach eukariotycznych

•W eukariotycznych komórkach biorcy najczęściej selekcjonuje się tzw. markerydominujące, czyli geny wyrażane w każdym tle genetycznym (nie są to genyoporności na antybiotyki)

Wyjątkami jeśli chodzi o markery selekcyjne będące genami oporności,które mogą być użyte w komórkach eukoriotycznych są:

•Kan - gen kodujący kinazę kanamycyny (możliwa do użycia w komórkachroślinnych) – oporność na kanamycynę

•Neo – bakteryjny gen oporności na neomycynę.

Może on ulegać ekspresji w komórkach eukariotycznych jeśli wyposaży się go weukariotyczne sekwencje regulatorowe

Neo może być używane do selekcji komórek eukariotycznych, ponieważ produkt genuinaktywuje antybiotyk G418, który jest toksyczny dla komórek eukariotycznych.

Ponadto nie występuje spontaniczna oporność na G418 w komórkach eukariotycznych.