GENOMIKA FUNKCJONALNA

Jak działają geny i genomy?

Poziom I:

Analizy transkryptomu

Adnotacja – (ang. annotation)

•pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu – analiza bioinformatyczna (in silico)

•identyfikacja genów (ORF), sekwencji regulatorowych i przypisywanie im funkcji (hipotetycznych)

Komputerowa analiza sekwencji nie może być ostatecznym dowodem na istnienie genu

Analiza bioinformatyczna musi być potwierdzona eksperymentalnie

Jednym ze sposobów stwierdzenia, że dany odcinek DNA jestrzeczywiście kodującym fragmentem genomu (genem) jestzbadanie transkryptomu komórki, czyli sprawdzenie:

•czy w komórce znajduje się transkrypt hipotetycznego genu, ajeśli tak to:

•ile jest jego kopii?

•kiedy (tj. w jakich warunkach: czas, miejsce, czynnikizewnętrzne), dany transkrypt się pojawia?

Analiza trankryptomu komórki (zarówno globalna jak i dotyczącawybranych genów) dostarcza nam wielu cennych informacji natemat sposobu działania genomu:

1. pozwala zmapować we fragmencie DNA pozycjetranskrybowane czyli mówi nam, że w konkretnym regioniegenomu znajduje się gen (a nie np. pseudogen)

2. umożliwia lokalizację granicy intron-ekson w przypadkueukariotycznych genów nieciągłych

3. pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie ekspresji genów

Struktura transkryptów mRNA

•transkrypt mRNA jest dłuższy niż część kodująca genu (zaczyna się powyżej kodonu start - 5’ UTR i ciągnie poniżej kodonu stop 3’ UTR, nawet do kilkuset nt)

•dojrzały transkrypt eukariotyczny nie zawiera intronów i jest zwykle poliadenylowany na końcu 3’ (na końcu 5’ „czapeczka” - 7-metyloguanozyna)

Test hybrydyzacyjny typu northern – najprostsza metoda potwierdzenia, że odcinek DNA, który podejrzewamy, że jest kodującym fragmentem genomu (genem) rzeczywiście nim jest

1. Ekstrakcja RNA z komórki

•Stosunkowo trudna w przypadku bakterii (szybka degradacja transkryptów mRNA, krótki okres półtrwania)

•Łatwa w przypadku eukariontów – obecność ogonka Poly(A)

2. Elektroforeza w warunkach denaturujących (żel agarozowy z formaldehydem – zapobiega tworzeniu się

struktur dsRNA)

3. Transfer RNA z żelu na membranę – zasada analogiczna jak w przypadku hybrydyzacji Southerna – różnice dotyczą warunków samego przenoszenia RNA

4. Przygotowanie sondy- najczęściej wyznakowany fragment DNA, obejmujący hipotetyczny gen

5. Hybrydyzacja i detekcja

Alternatywą dla hybrydyzacji typu northern jest RT-PCR

Analiza klonów biblioteki cDNAumożliwia zmapowanie w sekwencji genomowej genów, które w danych warunkach uległy ekspresji (jest to

przykład globalnej analizę trnaskryptomu, ponieważ badamy zbiór wielu klonów cDNA)

Etapy analizy :

1. Konstrukcja biblioteki cDNA

2. Sekwencjonowaniebiblioteki cDNA

3. Porównanie uzyskanych sekwencji cDNA z sekwencją genomową

Real-Time PCR (qPCR)

Polimeraza

(z aktywnością egzonukleazy 5’-3’)

dNTP

bufor, MgCl2

Matryca - DNA

Denaturacja nici, przyłączanie

Starterów

Wydłużanie nici

Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym

•Real-Time PCR (qPCR)

Dzięki użyciu np. sond fluorescencyjnych reakcja ma 1. Bardzo dużą czułość 2. Daje możliwość oznaczenia ilości powielanego odcinka DNA

•W metodzie qPCR wydajność amplifkacji obserwujemy poprzez pomiar

fluorescencji

•Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością degradowanego znacznika

(sondy) a zatem ilością powstającego produktu

•to z kolei zależy od wyjściowej ilości kopii cząsteczek matrycy np. ilości kopii

mRNA danego genu

•qRT-PCR (ang. quantitative reverse transcriptase real-time PCR), pierwszym

etapem jest przepisanie RNA na cDNA przy pomocy odwrotnej transkryptazy

•W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi

fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów

cDNA (dla różnych genów)

Reakcja qRT-PCR umożliwia zbadanie różnic w ilości mRNA

Różnych genów w tej samej tkance, komórce

Tego samego genu w różnych warunkach (np. tkankach zdrowych i zmienionych chorobowo)

u różnych pacjentów z tą samą chorobą

i wiele innych…..

Badanie promotorów (i innych sekwencji regulatorowych), które decydują o intensywności ekspresji (transkrypcji) genów z użyciem tzw. genów reporterowych

Gen reporterowy to taki, którego ekspresję można łatwo zaobserwować i zmierzyć ilościowo

Geny reporterowe możemy zastosować aby określić

• gdzie (np. w jakiej tkance),

• kiedy (w jakich warunkach, w jakim okresie życia)

• na jakim poziomie interesujący nas gen ulega ekspresji

Zasada działania i konstrukcji tzw. fuzji transkrypcyjnych

Aby gen reporterowy mógł wiarygodnie wskazywać gdzie i kiedy badany gen ulega ekspresji, trzeba zastąpić promotor genu reporterowego, promotorem genu badanego tworząc tzw. fuzję tranksrypcyjną

W takim układzie gen reporterowy będzie miał taki wzór ekspresji jak gen badany, a aktywność reportera można łatwo wykryć i zmierzyć ilościowo

lacZ

oriV

MCS

Tet

oriT

trfA

pMP220(104000 pz)

XhoI

BglI

IE

coR

IK

pn

IX

baI

Pst

I

• lacZ –-galaktozydaza: umożliwia badania promotorów (głównie bakteryjnych) detekcja: test histochemiczny

• uidA – glukuronidaza (GUS) – oznaczenia enzymatyczne szczególnie w komórkach i ekstraktach roślinnych (brak naturalnego tła GUS w roślinach), detekcja: test histochemiczny

Przykłady genów reporterowych

Lux – lucyferaza, która katalizuje utlenianie lucyferyny, lux – badanie aktywności promotorów zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych, detekcja: chemiluminescencja

świetliki Phausis splendidula Photobacterium phosphoreum

GFP – wyizolowane z genomu meduza Aequoria victoria (obecnie dostępne w różnych odmianach, różniących się kolorem świecenia: EGFP (ang. enhanced green fluorescent protein – białko wzmocnionej zielonej fluorescencji), (blue, BFP), (cyan, CFP), (yellow, YFP) .

)

GFP białko zielonej fluoresencencji (green fluorescent protein), detekcja fluorescencja

Globalne (czyli dotyczące dużej liczby genów) analizy transkryptomu – macierze DNA

Macierz DNA - gęsto ułożone cząsteczki DNA, umieszczone nastałym podłożu (nośniku: np. szkle, plastiku, membranienylonowej) reprezentujące

a) cały genomu

b) kodujące odcinki genomu, czyli geny (najczęściej wszystkie,albo dużą ich część) badanego organizmu

Tego typu układy przeznaczone są do równoległych analiz opartych na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, za pomocą których możemy pokazać np.: wyrażanie się genów w komórce oraz różnice w poziomie ich ekspresji (transkrypcji)

Nazewnictwo inne niż w tradycyjnych technikach hybrydyzacyjnych:

„probe” - sonda - kwas nukleinowy o znanej sekwencji, unieruchomiony na nośniku

„target” - wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, który poddajemy badaniu, jest to cała populacja cząsteczek np. całkowite mRNA komórkowe – czyli transkryptywszystkich genów

Macierze są opisywane w wersji makro i mikro.

Różnica dotyczy pojemności macierzy tj. liczby unieruchomionych na stałej powierzchni odcinków DNA

Makromacierze –

mała gęstość sond na dużej powierzchni, mała pojemność jeśli chodzi o reprezentację genów z danego genomu

Mikromacierze –

duża gęstość sond, „łatwo zmieścić wszystkie geny genomu”

Istnieją dwa podstawowe warianty mikromacierzy DNA które

różnią się:

•rodzajem sondy - rodzajem kwasu nukleinowego umieszczonego na stałej powierzchni

•przeznaczeniem (zastosowaniem)

Format I: mikromacierz oligonukleotydowa – chip genowy, chip DNA

sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci bardzo krótkich syntetycznych (tworzonych de novo na podstawie znajomości sekwencji genomu) odcinków DNA długości 20~80 nt (oligonukleotydów)

Ten typ mikromacirzy z syntezą in situ został opracowany przez firmę Affymetrix, Inc.

Format II: mikromacierz cDNA

sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci odcinków cDNA długości 500~5,000 pz

Zasadnicze zastosowanie macierzy oligonukleotydowych (Format I) :

(1) Oznaczenie ilości mRNA genów w pojedynczej (tej

samej) próbce

Macierz oligonukleotydowa ma ogromną specyficzność wiązania i

wykrywania „targetu” (na chipie jest kilkanaście kopii sond danego

genu) co czyni ją bardziej użyteczną przy monitorowaniu ekspresji

genów w genomach, w których mRNA ulega dojrzewaniu

W eksperymentach z chipami

oligonukloetydowymi do

jednego chipa

hybrydyzowana jest

tylko jedna próbka typu

„target”.

Etapy przygotowania „targetu”

1. Ekstrakcja mRNA

2. Odwrotna transkrypcja do

cDNA

3. Znakowanie (np. biotyną)

z transkrypcją cDNA do

cRNA

Po wyznakowaniu cRNAs

hybrydyzuje się z chipem,

a następnie wybarwia w

celu uwidocznienia

hybrydyzacji i określenia

intensywności wiązania

do sondy

Mikromacierze cDNA (Format II)

Podstawowe zastosowanie macierzy cDNA to porównywanie

poziomu ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami

Eksperyment z macierzą cDNA obejmuje najczęściej przygotowanie dwóch

próbek „targetów”: kontrolnej i badanej (np. tkanki zdrowej i zmienionej

nowotworowo).

Przygotowanie dwóch „targetów”

Z dwóch różnych próbek izoluje się mRNA poddaje się je odwrotnej transkrypcji

do cDNA w czasie której próbki znakuje się fluorescencyjnym barwnikiem np.

próbkę kontrolną barwnikiem zielonym (Cy3), a badaną czerwonym (Cy5).

Dzięki temu można je użyć równocześnie do hybrydyzacji do tej samej

macierzy.

Co się wtedy stanie?

Dwie próbki kompetycyjnie wiążą się do macierzy a próbka, która zawiera więcej

specyficznego cDNA (tzn. wyjściowo zawierała więcej mRNA – czyli poziom

ekspresji określonych genów był wyższy) wygra to współzawodnictwo.

Jeśli np. w tzw. próbce kontrolnej jest więcej mRNA dla danego genu w

porównaniu z tzw. próbką badaną (czyli ekspresja danego genu w próbce

badanej jest mniejsza) więcej DNA wyznakowanego Cy3 (zielony

barwnik) zwiąże się z sondą i plamka będzie świecić na zielono. Jeśli

będzie odwrotnie – plamka będzie świecić na czerwono.

Macierz cDNA jest szczególnie przydatna przy globalnych analizach

polegających na równoczesnym porównywaniu ekspresji wielu genów

w komórkach rosnących w dwu różnych warunkach (stanach

fizjologicznych)

Globalna analiza transkryptomu typu RNA-seqz wykorzystaniem techniki NGS

Systemy NGS są w stanie:1. Wydajnie sekwencjonować

cząsteczki DNA2. Policzyć cząsteczki

kwasów nukleinowych