Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek bakterii

Sposoby wprowadzania DNA do innych (niż bakterie) typów komórek

Co oznacza klonowanie molekularne?

Termin „klonowanie molekularne”, którystosuje się w odniesieniu do pojedynczegofragmentu DNA (np. genu) oznaczapowielanie (replikację) takiego odcinkaDNA w komórkach gospodarza(najczęściej bakterie Escherichia coli), przyudziale odpowiedniego wektora DNA(który w tych komórkach będzie sięsamodzielnie replikował)

Klonowanie DNA jest podstawową technikąinżynierii genetycznej, która umożliwia:•wyizolowanie i namnożenie wybranego fragmentugenomu (np. genu) z genomu jakiegoś organizmu,•przeprowadzania manipulacji, na przykładmutagenezy,•uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcjikodowanego przez niego produktu białkowego

Do klonowania molekularnego niezbędne są dwa elementy:•wektor DNA•gospodarz

Zrekombinowane DNA plazmidowe

Klonowanie molekularne

Schemat klonowania fragmentu

DNA w wektorze plazmidowym:

1. Przygotowanie fragmentu DNA, który chcemy sklonować w wektorze

2. Izolacja i przygotowanie wektora, w którym chcemy sklonować fragment DNA (etapy 1 i 2 zwykle odbywają się równocześnie)

3. Ligacja wektora i wstawki (rekombinacja in vitro)

4. Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do odpowiedniego gospodarza np. transformacja bakterii zrekombinowanym DNA

5. Selekcja i analiza transformantów(screening)

Jak otrzymać zrekombinowane DNA-schemat klonowania molekularnego

1. Fragment DNA do klonowania najczęściej uzyskujemy przez trawienie większej cząsteczki odpowiednim enzymem restrykcyjnym (ale możemy także rekombinować w wektorach fragmenty DNA powielone w reakcji PCR)

2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia (lub amplifikacji, jeśli fragment DNA powielamy w PCR), ewentualne oczyszczenie produktu trawienia przez izolację fragmentu DNA z żelu agarozowego

OPCJONALNIE :

a) Dodanie nowego miejsca restrykcyjnego po trawieniu enzymem generującym tępe końce - poprzez ligację linkerów DNA np. wyposażonych w miejsce restrykcyjne

b) Zamiana lepkiego 5’ końca na koniec tępy (np. egzonukleazą, polimerazą Klenowa)

c) Zamiana lepkiego 3’ końca na koniec tępy (np. polimerazą Klenowa)

I. Przygotowanie fragmentu DNA, który chcemy sklonować w wektorze

II. Przygotowanie DNA wektora plazmidowego do rekombinacji in vitro

1. Izolacja plazmidowego wektora z komórek E. coli

2. Wektor do klonowania przed rekombinacją musi być zlinearyzowany odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym (najczęściej takim samym jak fragment poddawany rekombinacji*).

Trawienie odbywa się w obrębie MCS wektora

5'-G^G A T C C-3

3'-C C T A G^G-5'

5'-A^G A T C T-3‘

3'-T C T A G^A-5'

BamHI BglII

*

3. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia DNA wektora – szczególnie istotna w przypadku wektora!!!

a) Opcjonalnie defosforylacja 5’ końców wektora, która zapobiega jego autoligacji (defosforylacjama sensn tylko przy trawieniu wektora DNA pojedynczym enzymem)

W rekombinacji in vitro wykorzystuje się ligazę DNA faga T4 (ligaza ta wymaga ATP i poza lepkimi w miarę wydajnie „skleja” także tępe końce DNA)

III. Ligacja wektora i wstawki –rekombinacja DNA in vitro

Optymalna temp. działania ligazy T4 od 4 (dla końców lepkich), 15-25 (dla końców tępych)

W mieszaninie ligacyjnejrekombinowany fragment DNA (wstawka insert,) powinien stanowić molowy nadmiar względem ilości cząsteczek wektora

•Przy małym stężeniu DNA wstawki najbardziej prawdopodobne jest połączenie końców tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja).

•Wzrost stężenia DNA w reakcji ligacji zwiększa prawdopodobieństwo połączenia dwóch różnych cząsteczek DNA

•Dla większości aplikacji można przyjąć stosunek molarny wstawka : wektor - 3:1

•W reakcji ligacji prawie nigdy nie powstaje 100% zrekombinowanego DNA, dlatego wektory wyposaża się w systemy wizualnej selekcji

zrekombinowanych klonów, poddaje się je defosforylacji itp.

IV. Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do bakterii

1. Transformacja

Zjawisko transformacji – czyli pobierania nagiego DNA z podłoża do komórek wykazano po raz pierwszy w bakteriach G+ Streptococcus pneumoniae (a potem także w Pneumonococcus czy Diplococcus) - Fred Griffiths 1928.

• Griffith sformułował hipotezę, że tzw. "czynnik transformujący" pochodzący od zabitych przez podgrzewanie bakterii szczepu S dokonał zmiany bakterii R w szczep trwale zjadliwy. Proces ten został nazwany transformacją.

• 16 lat później, w roku 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarthy, wyjaśnili mechanizmy leżące u podłoża zjawisk zaobserwowanych w tym eksperymencie, równocześnie dowodząc, że tzw. czynnikiem transformującym jest DNA.

•Zdolność transformacji bakterii

zależy od tzw. stanu kompetencji

•Stan naturalnej kompetencji uwarunkowany jest genetycznie.

•W takiej transformacji najlepiej pobierany jest liniowy dsDNA. Jedna nić ulega degradacji, druga rekombinacji do genomu gospodarza.

•Naturalną zdolność wchodzenia w stan kompetencji wykazują głównie bakterie Gramdodatnie(Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus).

•Bakterie Gram-ujemne zwłaszcza te z rodziny Enterobacteriaceae (m.in. E. coli) podlegają tego typu transformacji ze znacznie mniejsza wydajnością

Sztuczna kompetencja –

•transformacja E. coli plazmidowym DNA z użyciem metody chemicznej

•podstawowy sposób wprowadzania zrekombinowanego DNA do bakterii

Procedura transformacji E. coli plazmidowym DNA metodą chemiczną:

1. Przygotowanie hodowli biorcy we wczesnej fazie logarytmicznej (OD600 0.3-0.4)

2. Otrzymanie komórek kompetentnych przez traktowanie bakterii zimnym (0 st.C) roztworem 50 lub 100mM chlorku wapnia (w niektórych modyfikacjach stosuje się dodatek innych jonów np. Mg lub Rb). Roztwory chlorków sprawiają ze osłona komórkowa staje się przepuszczalna np. dla plazmidu

3. Zmieszanie komórek kompetentnych z preparatem DNA (plazmid adsorbuje się na powierzchni komórki) i poddanie krótkotrwałemu działaniu szoku cieplnego. Szybkie podwyższanie temperatury (do 42 st. C na ok. 3 min.)powoduje zmiany w powłokach komórkowych bakterii (podwyższona temperatura wpływa na stan fizyczny lipidów w błonie powodując powiększenie porów) pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek

4. Pozostawienie komórek w podłożu nieselekcyjnym na okres umożliwiający powrót komórek do normalnego stanu fizjologicznego i wyrażenie się genów zawartych na wprowadzanym plazmidzie lub wektorze fagowym (co najmniej 1 godz. W pożywce bez antybiotyku z napowietrzaniem)- bardzo ważne!!!

5. Wysiew komórek na podłoża selekcyjne lub w przypadku transformacji z wykorzystaniem wektora fagowego (np. M13) na płytki bez selekcji z agarem miękkim – „top agarem”

Od czego zależy wydajność transformacji bakterii metodą chemiczną?

1. Szczep biorcy powinien być bezplazmidowy (wrażliwy na antybiotyki), mieć nieaktywny system restrykcyjny (Res-) zapobiega degradacji obcego DNA oraz system rekombinacji (RecA-) co zapewnia stabilność wprowadzanych plazmidów w komórce Takie cechy mają np. szczepy E. coli DH5 i XL1-Blue rekomendowane jako biorcy w transformacji

2. DNA plazmidowy powinien być oczyszczony – nadmiar soli, enzymów restrykcyjnych, resztek fenolu, obniża lub hamuje wydajność transformacji

3. Najbardziej efektywną formą transformacji jest forma ccc DNA plazmidu, transformacja formą liniową jest mało wydajna i stosowana tylko w szczególnych wypadkach

4. Wydajność transformacji zależy od wielkości cząsteczki plazmidu, duże cząsteczki transformują się trudniej

5. Nadmiar DNA nie wpływa na wzrost wydajności, optymalna ilość dla E. coli powinna wynosić od 20-200 ng na reakcję

6. Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas wirowania, mieszania z DNA. Wszystkie etapy preparatyki należy przeprowadzać w lodzie.

Wydajność podaje się jako liczbę transformantów w przeliczeniu na 1 mikrogram DNA. Dla E. coli wydajność ta w metodzie wapniowej (z chlorkiem wapnia) waha się od 104 do 106 (max. 107 na 1 g plazmidowego DNA).

2. Elektrotransformacja (elektroporacja)

Istotą metody jest przepuszczenie przez zawiesinę

komórek krótkiego (5-10 msek) impulsu prądu o

bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V). Prowadzi

do powstawania porów (wielkości do 2 nm) w błonie

(impuls elektryczny przejściowo i odwracalnie

przerywa ciągłość błony), przez które do komórek

może wnikać DNA.

Po raz pierwszy zastosowana przez Dovera i wsp.

1988 roku dla bakterii, zyskała wielką popularność,

ponieważ pozwala transformować gatunki,

które trudno uzyskują kompetencję metodami

chemicznymi.

Zalety elektroporacji w porównaniu z metodą chemiczną :

•można uzyskać bardzo wysoką wydajność transformacji (109-1010

transformantów na g DNA, to co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż w metodzie chemicznej)

•można wprowadzać bardzo duże cząsteczki DNA (np. plazmidy z insertami wielkości setek kpz) np. zrekombinowane wektory do konstrukcji bibliotek genowych z dużymi wstawkami.

Pewną wadą jest to że łatwo można zniszczyć (zabić) komórki

bakteryjne w zawiesinie

V. Selekcja transformantów (bakterii niosących zrekombinowane wektory plazmidowe) na odpowiednich podłożach selekcyjnych

Analiza transformantów:• Namnożenie bakterii niosących zrekombinowane DNA w płynnym podłożu selekcyjnym• Izolacja plazmidowego DNA• Kontrolne trawienie plazmidowego DNA – analiza obecności

wstawki w wektorze

Zwykle nie służy to klonowaniu molekularnemu!!! (wyjątkiem są tu drożdże)

Problem z nomenklaturą!!!

Jeżeli wprowadzamy zrekombinowane DNA do:

1. Bakterii i drożdży zachodzi proces transformacji (zjawisko opisane przez O. Avery’ego)

2. Komórek roślin – także mówimy o transformacji genetycznej roślin choć to zupełnie inny proces niż w przypadku bakterii

3. Komórek zwierzęcych lub ludzkich mówimy o transfekcji (ponieważ używamy wtedy głownie wektorów pochodzenia wirusowego). W tym wypadku pojęcie transformacji dotyczy transformacjinowotworowej tych komórek

Metody wprowadzania DNA (np. zrekombinowanego) do innych (niż bakterie) typów komórek

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do drożdży (np.

zrekombinowanych YAC-ów):

• Transformacja metodami chemicznymi komórek drożdży odbywa się

na zasadach podobnych jak w przypadku transformacji komórek

bakteryjnych

• zrekombinowane DNA możemy też wprowadzać do drożdży przez

elektrotransformację

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do roślin•Wykorzystuje się bakterie Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes,które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.•Posiadają w swojej komórce plazmidy (Ti, Ri), kodujący geny niezbędne do infekcjirośliny. Jeden z fragmentów plazmidu Ti, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje sięz materiałem genetycznym komórki gospodarza.•Dzięki usunięciu części sekwencji wewnątrz plazmidu T, w to miejsce można stawić dowolny fragment DNA, który chcemy dostarczyć do roślinny•Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają infekcji przez Agrobacterium

Izolacja plazmidu Ti, trawienie ER w sekwencji T-DNA

Miejsce rozpoznania ER

Fragment DNA do rekombinacji w plazmidzie Ti

Bakterie Agrobacteriumtumefaciens

Zrekombinowany plazmid Ti

Zrekombinowany wektor Ti jest wprowadzany do komórek Agrobacteriumpozbawionych plazmidu Ti

Bakterie infekując komórki roślin dostarczają obcy gen do genomu gospodarza

T-DNA z obcym genem wprowadzany do genomu rośliny

Stransformo-wanewektorem Ti komórki roślinne są hodowane in vitro

Regeneracja rośliny in vitro z populacji wyselekcjonowanych komórek zmodyfikowanych genetycznie

Etap uzyskania plazmidu Ti zrekombinowanego z obcym fragmentem DNA przeprowadza się w komórkach E. coli bo wektor Ti ma szeroki zakres gospodarzy

Schemat transformacja genetycznej roślin dwuliściennych z użyciem

plazmidowego wektora Ti A. tumefaciens

1) Wybór odcinka DNA mającego stanowić „transgen” w roślinie i wstawienie go w odpowiednie miejsce wektora będącego pochodną plazmidu T – zrekombinowany plazmid T wprowadzamy do E. coli (transformacja metodą chemiczną)

2) Wprowadzeniu zrekombinowanego plazmidu T do Agrobacterium (transformacja metodą chemiczną lub elektrotransformacja),

3) Inkubacja bakterii niosących wektor z fragmentem tkanki roślinnej (kokultywacja) – umieszczenie eksplantatów w roztworze bakterii

4) Przeniesienie fragmentów tkanki na pożywkę selekcyjno-regeneracyjną z odpowiednim antybiotykiem (czynnik eliminujący Agrobacterium i czynnik selekcyjny transformantów)

5) Indukcja podziałów komórkowych i powstanie bezkształtnej masy dzielących się komórek zwanej kalusem,

6) Regeneracja roślin z komórek kalusa za pomocą pożywek zawierających hormony roślinne,

7) Ukorzenianie rośliny w odpowiedniej pożywce,8) Przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy

molekularne, fizjologiczno-biochemiczne

Transformacja genetyczna roślin dwuliściennych

-Mikrowstrzeliwanie – biobalistyka (nie wymaga tworzenia protoplastów z komórek roślinnych)

Inne metody są stosowane raczej rzadko – w większości wymagają uzyskania protoplastów

Sposoby transformacji genetycznej roślin czyli wprowadzania obcego np. zrekombinowanego DNA do roślin jednoliściennych (zboża, trawy i cebulowate)

• Dominują metody biologiczne, które są najbardziej skuteczne -transfekcja z użyciem zrekombinowanych wektorów wirusowych tj. inkubacja linii odpowiednich komórek z zawiesiną zrekombinowanego wirusa w odpowiednich warunkach (pożywka, temp. itd.)

Inne metody

• Lipofekcja (najczęściej wprowadzane jest tzw. DNA bezwektorowe)

• Mikroiniekcja dojądrowa - DNA bezwektorowe

• Elektrotransformacja – zwykle DNA bezwektorowe

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich:

• Liposomy to drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe. Powstają one spontanicznie, jeżeli pewne typy lipidów zawiesi się w roztworze wodnym. Ich błonę stanowi podwójna warstwa lipidowa, tak więc budową przypominają np. błonę komórki.

Wykorzystanie liposomów i lipopleksów – lipofekcja

• Liposomy wiążą i kondensują DNA spontanicznie, tworząc kompleksy o wysokim powinowactwie do błon komórkowych

• DNA zawarte w liposomach jest dostarczane do komórki na zasadzie endocytozy

• najczęściej ze względu na ograniczoną pojemność liposomów wprowadza się DNA bezwektorowe

Liposomy powinny być dodatkowo wyposażone w: • elementy kierujące DNA do jądra komórkowego• peptydy, zdolne niszczyć błony endosomalne i zapobiegać lizosomalnej degradacji DNA• rekombinazy, wspomagające wbudowanie wprowadzonego DNA do genomu komórki• białka i RNA, które mogą służyć ekspresji wprowadzonego DNA

Wykorzystanie liposomów i lipopleksów – lipofekcja

Mikroiniekcja dojądrowa (dotyczy głównie komórek zwierzęcych np. modyfikowanych w procesie transgenezy)

•Metoda powstała w latach 70 XX wieku. •Polega na wstrzykiwaniu DNA bezpośrednio do jąder komórek za pomocą szklanych mikroigieł, kontrolowanych przez sterowane hydraulicznie mikromanipulatory, przy równoczesnej obserwacji pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. •Metoda ta jest bardzo wydajna ale praco - i czasochłonna•Zazwyczaj wprowadzane DNA jest bezwektorowe