Biochemia stresu oksydacyjnego

Patofizjologia NOSów

Porównanie NOSów

Alderton et al. Biochem J. 2001

oxygenase domain reductase domain

Aktywność eNOS

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

Wpływ NO na transdukcję sygnału

Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

tissue injury

tissue protection

(Cys)

Huang PL. Trends Endocrin Metabol 2009

Regulacja aktywności eNOS

poziom ekspresji mRNA i białka

dostępność substratu

dostępnośćkofaktorów

lokalizacja komórkowa

fosforylacja

reakcja NO z O2'-

Huang PL. Trands Endorcrin Matabol 2009.

Regulacja aktywności eNOS przez kinazy

Regulacja aktywności eNOS przez Ca2+ i fosforylację

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

PKG

AMPK

Czynniki ryzyka wywołujące dysfunkcję eNOS

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

Stres oksydacyjny wywołuje dysfunkcję śródbłonka

Ding and Triggle. Uer J Physiol 2010.

- Wszystkie formy NOS wpływają na regulację ciśnienia krwi:* eNOS - bezpośrednia regulacja wazorelaksacji i funkcji mięśni gładkich (obniżanie

ciśnienia krwi)* nNOS - brak wpływu na ciśnienie krwi w warunkach kontrolnych, ale być może

kontrola baroreceptorów (nNOS jest produkowana w centrach wazomotorycznych i nerwach periwaskularnych). Być może nNOS może podnosić ciśnienie krwi, chroniąc zmniejszając eyzyko hipotencji np. podczas anestezji)

* iNOS - wywołuje hipotensję podczas szoku septycznego

- Jedną z głównych przyczyn dysfunkcji śródbłonka (niewłaściwa regulacja wazorelaksacji) jest niedobór NO produkowanego przez eNOS. Jest to element patogenezy:

* miażdżycy* nadciśnienia* cukrzycy* hipercholesterolemii* przedwczesnego starzenia

- Dysfunkcja pojawia się przed zmianami anatomicznymi (przed hiperplazjąmięśniówki lub tworzeniem złogów lipidowych w naczyniach).

NOS - regulacja ciśnienia krwi

Liu et al. Cardiovasc Res 2007

blaszka miażdżycowa

Tang and Vanhoutte. Eur J Physiol 2010.

Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń

Skurcz mięśni gładkich ściany naczynia regulowany jest przez śródbłonek

Tang and Vanhoutte. Eur J Physiol 2010.

Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń

Tang and Vanhoutte. Eur J Physiol 2010.

Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń

Ding and Triggle. Uer J Physiol 2010.

Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń

WT

db/db

Wpływ starzenia się na dysfunkcję naczyń

Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń

Herrera et al. Aging Res Rev 2010

- Starzenie się wpływa zarówno na komórki śródbłonka jak i mięśni gładkich (VSMC) oraz komunikację między tymi typami komórek.

- Najważniejsze zmiany w VSMC to:* nasilona migracja* nasilona proliferacja* deregulacja odpowiedzi na na czynnikiwzrostowe bodźce proapoptotyczne(rozrost mięśniówki)

* deregulacja ekspresji kanałów wapniowych i potasowych (nasilona kurczliwość, reakcja zapalna i prozakrzepowa)

- Najważniejsze zmiany w śródbłonku to:* zmniejszona aktywność (ale nie ekspresja) eNOS, zwiększona aktywność arginazy

(zmniejszona produkcja i/lub dostępność NO)* zwiększona ekspresja i aktywność cyklooksygenaz (COX) i produkowanych przez

nie wazokonstryktorów* nasilona produkcja ROS

ECVSMC

Herrera et al. Aging Res Rev 2010

Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń

Herrera et al. Aging Res Rev 2010

Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń

Herrera et al. Aging Res Rev 2010

Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń

TERT: telomerase reverse transcriptase.

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

Czynniki ryzyka wywołujące dysfunkcję eNOS

śródbłonek

metylotrasferaza

dimetyloarginaza

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

Stres oksydacyjny wywołuje miażdżycę

Powstawianie i inaktywacja ROS w śródbłonku

Forstermann U. Eur J Physiol 2010

Zawał- ischemia - ischemia-reperfuzja

http://www.pathology.washington.edu/research/labs/murry/images/lvr_00.jpg

Tlenek azotu a zapalenie

Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

- Zawał powoduje naciek komórek zapalnych, które produkują ROS, proteazy i cytokiny prozapalne. Prowadzi to do uszkodenia śródbłonka.

- W wyniku uszkodzenia śródbłonka dochodzi do wazokonstrykcji i ischemii w odległych od zawału miejscach mięśnia sercowego. Strefa uszkodzenia rozszerza się.

- Aktywacja eNOS (np. przez VEGF uwalniany przez niedotlenione tkanki, czy statyny podawane przez lekarza) łagodzi te objawy (pod warunkiem, że eNOS produkuje NO a nie anionorodnik ponadtlenkowy).

eNOS i iNOS a uszkodzenie po ischemii i reperfuzji

Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

- Angiotensyna i cytokiny prozapalne indukują stres oksydacyjny. To prowadzi do indukcji NFB i ekspresji iNOS.

- iNOS może stanowić drugą linię obrony. Jeśli eNOS jest zablokowana, iNOS staje sięgłównym źródłem NO i może dzięki temu pełnić funkcje cytoprotekcyjne (pod warunkiem, że ekspresja nie jest zbyt silna, stężenia NO byt wysokie, gdyż wtedy mogądziałać toksycznie i prooksydacyjnie, np. poprzez wpływ na łańcuch oddechowy).

- Istotną rolę odgrywa również indukcja COX-2 i produkcja prze nią PGE2 i PGI2.

COX-2

PGE2, PGI2

Syntazy tlenku azotu, a przebudowa LV

Serce po zawale

Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

- W wyniku zawału zwiększa się obciążenie pozostałej części serca. Prowadzi to do aktywacji receptorów angiotensyny i zwiększenia produkcji ROS.

- Indukcja iNOS przez pewien czas działa ochronnie.

- Szczególnie istotne w zapobieganiu przebudowie jest zwiększenie dostępności BH4 (np. kwas foliowy nasila produkcję BH4).

Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

Tlenek azotu a neowaskularyzacja

- NO zwiększa produkcję VEGF oraz nasila jego aktywność w komórkach śródbłonka (zwłaszcza migrację i morfogenezę).

- VEGF chroni śródbłonek przed apoptozą, nasila angiogenezę i waskulogenezę, prowadząc do utworzenia nowych naczyńkrwionośnych.

- Niewystarczająca angiogenezaprowadzi do powstawania większej blizny pozawałowej i zwłóknienia.

Insulino-oporność i cukrzyca typu 2

http://www.pathology.washington.edu/research/labs/murry/images/lvr_00.jpg

Gao & Mann. Cardiovasc Res 2009.

Rola oksydazy NAD(P)H w indukcji stresu oksydacyjnego w cukrzycy

Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

BAT i UCP-1

- BAT u gryzoni:* odpowiada za termogenezę

bezdrżeniową* zwiększa wydatki energe-

tyczne* zmniejsza otyłość* zmniejsza tworzenie białych

adipocytów

- Kluczowym białkiem w termogenezie bezdrżeniowej jest UCP-1, eksprymowane w BAT

- Ekspresja UCP-1 jest indukowana przez kwasy tłuszczowej

UCP3

Argyropoulos & Harper. J Appl Physiol 2002.

- Ulega ekspresji głównie w mięśniach szkieletowych

UCP-2 w łańcuchu oddechowym

- W komórkach trzustki:* pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego

i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny.

* Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny.

- Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.

- UCP-2 jest eksprymowane w różnych tkankach, w tym w komórkach b-trzustki

Bugger & Abel. Cardiovasc Res 2010; Tabit et al. Rev Endocr Metab Disord 2010

Synteza insuliny

Freeman & COX: Hum Mol Genet 2006.

- Zmiany w metaboliźmiekomórek prowadzą do zmian w wydzielaniu insuliny:

* Wzrost poziomu glukozy zwiększa poziom metabolizmu komórek i podnosi poziom komórkowego ATP.

* To prowadzi do zamknięcia kanałów KATP, depolaryzacji błony, aktywacji zależnych od potencjału kanałów Ca2+, napływu Ca2+ do cytoplazmy.

* Wzrost poziomu Ca2+ jest bezpośrednim sygnałem uwalnia-nia insuliny.

Stres oksydacyjny w cukrzycy

Transdukcja sygnału od insuliny

Huang PL. Trands Endorcrin Matabol 2009.

Stres oksydacyjny indukuje insulinooporność

Newsholme et al. J Physiol 2007.

Długotrwała hiperglikemia i hiperlipidemiaprowadzi do:- wzrostu produkcji ROS i RNS- aktywacji kinaz (np. JNK, p38, IKK)

* kinazy te fosforylują IRS-1* IKK aktywuje NFB

NFB indukuje ekspresję iNOS co prowadzi do:- wzrostu NO- nitrozylacji IRS-1

Fosforylacja seryny i S-nitrozylacja IRS-1 prowadzi do:- degradacji proteosomalnej IRS-1- zmniejszenia transdukcji sygnału- braku właściwej odpowiedzi na insulinę

IRS-1: insulin receptor substrate-1

Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy

http://www.pathology.washington.edu/research/labs/murry/images/lvr_00.jpg

Gojenie ran u myszy z cukrzycą

Days after wounding

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 13 15

Surf

ace

of t

hew

ound

[%]

WT

db/db**

*****

***

*** *** *** ****** ***

***

Grochot-Przeczek et al. PLoS ONE, 2009

db/db WT

Day 1

Day 3

Day 8

Day 17

Day 0

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Fazy gojenia ranFaza zapalenia (kilka dni)

- Natychmiast po utworzeniu skrzepu w ranie dochodzi do wazodylatacji i nacieku leukocytarnego. Bardzo nasila sięaktywność fagocytarna neutrofili.

Faza proliferacji (2 dni - kilka tygodni)

- Fibroblasty proliferują wypełniając ubytki i tworząc tkankę ziarninową. Nasila się angiogeneza. Keratynocyty migrują i proliferują zamykając ranę.

Faza przebudowy (miesiące)

- Dochodzi do wzmożonej syntezy kolage-nu wzmacniającego tkankę, oraz do przekształcenia tkanki ziarninowej w typowe tkanki (lub utworzenia blizny).

Mechanisms of blood vessels formation

Formation of bloodvessels de novo

Incorporation to pre-existingvessels

paracrine stimulationof endothelial cells(VEGF, bFGF, IL-8…)

Carmeliet P. Nat Med, 2000

Brem & Tomic-Canic. J Clin Invest 2007.

Upośledzenie gojenia ran w cukrzycy- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka

- VEGF: vascular endothelial growth factor- SDF-1: stromal cell derived growth factor

- eNOS: endothelial nitric oxide synthase

Jarajapu & Grant. Circ Res 2010.

Upośledzenie funkcji EPC w cukrzycy

EPC: komórki progenitorowe śródbłonka

- U zdrowych osobników czynniki uwalniane przez ischemiczne lub zranione tkanki mobilizują komórki progenitorowe (w tym EPC) ze szpiku, a te po dotarciu do miejsc zranienia lub niedotlenienia uwalniajączynniki proangenne (w tym niewielkie ilości NO i ROS) oraz biorą udział w neowaskularyzacji i naprawie naczyń.

- W cukrzycy sygnały wysyłane przez niedotlenione lub zranione tkanki są słabsze, przez co mobilizacja komórek progenitoro-wych jest mniejsza. Komórki progenitorowektóre docierają do zranionych tkanek uwalniają niewiele czynników proangiogen-nych, natomiast dużo prozapalnych i antyangiogennych (w tym duże ilości NO i ROS).

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Mobilizacja EPC ze szpiku

- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka- VEGF: vascular endothelial growth factor- MMP-9: matrix metalloproteinase-9- eNOS: endothelial nitric oxide synthase

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Regulacja mobilizacji EPC w hipoksji

- W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji eNOS przez kinazy PI3K/Akt, przez co zmniejsza się produkcja NO.

- Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnika ponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO-) i zmniejszenia dostępności NO.

- W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływ komórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się do upośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie.

- Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku.

WT db/db

Wpływ cukrzycy na EPC

Kotlinowski et al., in preparation

Percentage of EPC in bone marrow

0.0000

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.0010

0.0012

healthy diabetic

% C

D45

-/KD

R+/S

ca-1

+/le

ctin

+

*

0

200

400

600

800

0

10

20

30

40

50

0

2

4

6

8

10

num

ber

of c

ells

*

Migration to SDF-1

healthy diabetic

num

ber

of c

onne

ctio

ns

*

healthy diabetic

Morphogenesis

cum

ulat

ive

keng

thof

spr

outs

*

healthy diabetic

Capillary sprouting

Kotlinowski et al., in preparation

Wpływ cukrzycy na komórki śródbłonkaKrążki aorty zatopione w matriżelu - 5 dni inkubacji. Widoczne tworzące siękapilary.

Myszy WT

Myszy db/db

Odtwarzanie krążenia w mięśniu myszy z cukrzycą

Ebrahimian et al. Am J Pathol 2006

diabetes diabetes + NAC

diabetes + NACdiabetes

NAC - N-acetylocyteina

Dziękuję

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej