Biochemia stresu oksydacyjnegobiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2010/AJ/stres... · 2010. 12....
Transcript of Biochemia stresu oksydacyjnegobiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2010/AJ/stres... · 2010. 12....
Biochemia
stresu oksydacyjnego
Wykład 5
Oksygenazy hemowe - nowe funkcje starych enzymów
Aktywność oksygenaz hemowych
oksygenaza hemowa
Ferritin
uszkodzenie tkanek
białka
hemowe
Fe2+uszkodzenie tkanek
bilirubina ochronabiliwerdyna
CO
ochrona
rozpuszczalna cylaza
guanylanowa
cGMPGTP
pompa żelazowa
ochrona
Hem
ochronap38
BvR
Skutki braku HO-1 u myszy
Na istotność HO-1 wskazuję skutki jej braku u myszy: zwiększona
peroksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwój
gonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.
- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.
After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.
0
100
200
300
400
HO-1+/+
Enhanced free radicals production
by murine HO-1-/- fibroblasts
% F
luore
scene o
f untr
eate
d c
ells
cells treated with
50 M hemin for 24 h
0
20
40
60
80
100
Reduced survival of
murine HO-1-/- fibroblasts
cells treated with
100 M hemin for 24 h
% S
urv
ival
HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-
*
*
Yet et al. FASEB J. 2003.
Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych
lesion
lesion
lipid accumulations
Yet et al. FASEB J. 2003.
barwienie na elastynę
barwienie na makrofagi
Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych
Yet et al. FASEB J. 2003.
Tworzenie neointimy 14 dni po uszkodzeniu tętnicy udowej
u myszy HO-1-/-
Duckers et al. Nature Med. 2001
WT mice HO-1-/- mice
Brak HO-1 nasila tworzenie neointimy
Taha et al. J Physiol Pharmacol 2009
Isotypic
Control
WT LPS
Bright
field
WT
Control
HO-1 KO
Control
HO-1 KO
LPS
Wpływ braku HO-1 na reakcję zapalną
TNF
[Immunohistochemistry]
TN
Fα
[pg/m
L]
0
1000
2000
3000
WT KO
Serum
0
40
80
120
160
Media
TN
Fα
[pg/m
L]
WT KO
VCAM-1
Brak HO-1 u człowieka
U jedynego znanego pacjenta pozbawionego HO-1:
* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL)
we krwi
* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia
Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjny
prowadzą do:
* poważnych uszkodzeń śródbłonka
* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych w
tętnicach
Dulak et al. Antioxidant Redox Signal 2002
HO-1 zwiększa syntezę VEGF(szczurze VSMC)
(Hemina: aktywator HO-1; SnPPIX: inhibitor HO-1)
0
50
100
150
200
250
control hemin hemin
SnPPIX
*
#
0
50
100
150
200
VEG
Fpro
tein
[% o
f contr
ol]
*
#
hemin
SnPPIX
hemincontrol
HO
-1 a
cti
vit
y [
% o
f contr
ol]
HO-1
activityVEGF
expression
Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez
aktywację promotora
(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003
VEG
F [
% o
f contr
ol]
0
50
100
150
200
250
300
*
VEGF protein
control b-gal HO-1
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
VEG
F/G
APD
H r
ati
o
*
VEGF mRNA
control b-gal HO-1
Lum
inesc
ence [
% o
f contr
ol]
0
100
200
300
400
b-gal HO-1
*
VEGF promoter activity
pGL2-VEGF
Brd
U incorp
ora
tion
[% o
f contr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
intact VEGF SnPP
1 M
SnPP
3 MSnPP
10 M
CuPP
10 M
**
Endothelial cell proliferation
Cry
tsal vio
let
stain
ing
[% o
f contr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
intact VEGF VEGF
SnPPIX
VEGF
CuPPIX
*
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003
Endothelial cell migration
Tube
formation
Capillary
sprouting
control VEGF
VEGF + SnPPIX VEGF + CuPPIX
control
VEGF + SnPPIX VEGF + CuPPIX
Zahamowanie aktywności HO-1 zmniejsza potencjal angiogenny
śródbłonka
VEGF
Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007
0
50
100
150
200
250
300
VEGFbgal cDNA CORM
cum
ula
tive length
of
spro
uts
[% o
f re
fere
nce] * *
VEGF
HO-1 cDNA
VEGF VEGF
HO-1
CO
cGMP
p38
PKG CREB
PKA
AP-1AP-1
PI3K Akt
VEGF HO-1 cDNA
gal cDNA
VEGF +
VEGF + VEGF + CORM
Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar
Deshane et al. J Exp Med, 2007
HO-1 jest konieczna do proangiogennego działania SDF-1
HO-1-/-
Grochot-Przeczek et al., in preparation.
Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC
[PCNA staining]
EPC WT EPC KOVEGF VEGFcontrol control
*
*
0
20
40
60
80
100
Control
% o
f posi
tive c
ells
WT
KO
VEGF
30 ng/ml
Lectin
AcLDL
KO control KO VEGF
WT control WT VEGF
*
*
Grochot-Przeczek, in preparation, Deshane et al. J Exp Med, 2007
WT
KO
WT
KO
0
10
20
30
40
50
num
ber
of
cells
control SDF-1 CM
*
**
control SDF-1 CM
HO-1 ułatwia migrację EPC
Control H2O2 50 uM
Annexin
V p
osi
tive c
ells
[% o
f contr
ol]
*
** #
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900HO-1 +/+
HO-1 -/-
Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny
Grochot-Przeczek et al., in preparation.
Apoptosis[Annexin V staining]
Kanulacja komory oka za pomocą (igła
30 gauge)
2 h of ciśnienia
hydrostatycznego (80-90 mmHg)
Usunięcie igły i reperfuzja (drugie oko-
kontrola)
Podanie EPC znakowanych PKH67
dye do ciała szklistego
Deshane et al. J Exp Med, 2007.
0
5
10
15
20
25
30
35
HO-1+/+ HO-1-/-
SD
F-1
(pg/m
g p
rote
in)
Injured (LE)
Control (RE)
##
Model niedotlenienia siatkówki u myszy
HO-1+/+
Rh-agglutinin Merged PKH 67
Deshane et al. J Exp Med, 2007
HO-1-/-
Rh-agglutinin Merged PKH 67
Wpływ braku HO-1 na aktywność EPC
Yoshida et al. Circulation 2001.
Niski poziom ekspresji HO-1 nie wystarcza do cytoprotekcji
WTHO-1+/-
0
1
2
3
4
5
6
WT HO-1+/-
*
Infarct sizeCK release
(Myszy WT i myszy HO-1+/-)
Polimorfizm promotera HO-1 u ludzi
Yamada et al. Am J Hum Genet 2000; Chen et al. Eur Heart J 2004.
(GT)n
Exon 1
Częstość (GT)n w populacji
Kaneda et al. ATVB 2002
Yamada et. al. Am J Hum Genet 2000
Częstość (GT)n w populacji
Chen et al. Eur Heart J 2004
Częstość (GT)n w populacji
HO
-1/E
F2
HO
-1/E
F2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37
Longer
0
0.1
0.2
0.3
0.4
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37
Number of (GT)n repeats
0
0.2
0.4
0.6
22 23 24 25 27 28 29 30
Shorter
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
22 23 24 25 27 28 29 30
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
22 23 24 25 27 28 29 30
Number of (GT)n repeats
0
0.4
0.8
1.2
44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 63 64 65 66 67
CoPPIXBoth
0
0.1
0.2
0.3
44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 6364 65 66 67
H2O2
0
1
2
3
4
15d-PGJ2
44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 63 64 65 66 67
Number of (GT)n repeats
HO
-1/E
F2
Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1
Taha et al. ATVB 2010.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
allele
fre
quency
number of GT repeats
S M L
Taha et al. ATVB 2010.
Częstość alleli (GT)n HO-1 w populacji
*
***
0
0.004
0.008
0.012
S M L
HO
-1/E
F2
0
0.06
0.12
0.18
S M L
HO
-1/E
F2
**
***
control
H2O2
0
0.2
0.4
0.6
S M L
HO
-1/E
F2 CoPP
***
0
0.4
0.8
1.2
1.6
S M
HO
-1/E
F2 15d-PGJ2
*
**
0
0.04
0.08
0.12
S M L
HO
-1/E
F2 LPS
*
0
0.01
0.02
S M L
HO
-1/E
F2
IFN
0
0.01
0.02
S M LH
O-1
/EF2
hemin
0
0.03
0.06
0.09
S M L
HO
-1/E
F2
hypoxia
L
Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1
Taha et al. ATVB 2010.
*
**
***
***
* **
***
***
* *
** *** *
*
**0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
control hemin CoPPIX H2O2 15d-PGJ2 IFN LPS hypoxia
HO
-1/E
F2
S M L
Taha et al. ATVB 2010.
Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1
***
**
0
100
200
300
400Brd
U r
educti
on [
% o
f contr
ol]
S M Lcontrol
Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka
VEGF
Taha et al. ATVB 2010.
0
2000
4000
6000
8000
S M L
length
of
capilla
ries
[AU
]
control VEGF
VEGFcontrol
0
100
200
300
mig
rati
on [
%of
contr
ol]
S M Lcontrol
VEGF
VEGFcontrol
Taha et al. ATVB 2010.
Wpływ polimorfizmu HO-1 na migrację śródbłonka
[ELISA]
IL-1
#
#
*
*
0
50
100
150
200
250
S M L
IL-1
β[p
g/m
l]
Allele
#
#
Control
LPS
Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną
Taha et al. ATVB 2010.
[ELISA]
ICAM-1 E-selectin
IL-6 TNF
Taha et al. ATVB 2010.
Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną
*
0
5
1
0
15
20
25
S M L
GSH
: G
SSG
[nm
ol/
mg]
GSH : GSSG
0
1.0
2.0
3.0
S M L
Glu
tath
ione [
nm
ol/
mg]
**Total glutathione
0
0.4
0.8
1.2
1.6
S M L
GSH
[nm
ol/
mg]
GSH
S M L
**
0
0.4
0.8
1.2
GSSG
[nm
ol/
mg] GSSG
[HPLC]
Wpływ polimorfizmu promotora HO-1 na status oksydacyjny
Taha et al. ATVB 2010.
control100 200 400 800
H2O2 [uM]
***
****** ***
******
*
*
0
20
40
60
80
100
120
MT
T [
% o
f contr
ol]
Test redukcji MTT
Time [h]
0
20
40
60
80
0 3 6 12 24
annexin
[%
of
cells]
*
Barwienie na aneksynę-V
S M L
Taha et al. ATVB 2010.
Wpływ polimorfizmu HO-1 na żywotność śródbłonka
Oksygenaza hemowa-1
Skutki indukcji HO-1:
• Cytoprotekcja
(oporność na stres oksydacyjny)
• Immunomodulacja(zahamowanie zapalenia, regulacja
komórek Treg)
• Modulacja angiogenezy
heme
HGF
inflammatory
cytokines
oxidants hypoxia
irradiation
chemo-
therapy
after Otterbein et al. 2003
heme
Berberat et al. Clin Cancer Res 2005
Ekspresja HO-1 w liniach raka trzustki
Panc-1 MIAPaCa Colo 357 SU.86.86
Marinissen et al. JBC 2006
GPCR indukuje ekspresję HO-1
Berberat et al. Clin Cancer Res 2005
Ekspresja HO-1 w nowotworze trzustki
Nowis et al. Oncogene 2006.
HO-1 jest indukowana przez PDT linii C26 adenocarcinomy
Częstość alleli HO-1 (GT)n wśród osób zdrowych
i chorych na OSCC lub OSF
Chang et al. Br J Cancer 2004.
OSCC - oral squamous cell carcinoma
OSF - oral submucous fibrosis
Longer (GT)n repeat allele in HO-1 promoter is associated with the risks of
areca-related OSCC, while the shorter (GT)n repeat allele may have protective
effects for OSCC.
Marinissen et al. JBC 2006
Inhibicja HO-1 zwiększa transformację fibroblastów
indukowanej GPCR
Marinissen et al. JBC 2006
DMBA PMA
HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
Red - PCNA Blue - DAPI Green - lectin
Waś et al. under revision
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
10 20 300
100100
125
150
* * ** * *
***
*** *
Time [weeks]
Weig
ht
incre
ase
[%
] +/++/
--/-
HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-
10 20 300
25
50
75
100
w 4 w 6
w17 w 26 w 27
Time [weeks]
Mic
e w
ith t
um
ors
[%]
+/++/
--/-
10 20 300
25
50
75
100
Time [weeks]
Surv
ival [%
]
+/++/
--/-
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
Waś et al. under revision
Waś et al. under revision
papilloma
carcinoma
papilloma
carcinoma
HO-1 +/+
HO-1 -/+
HO-1 -/-
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
Waś et al. under revision
Wpływ HO-1 na fibroblasty z nadekspresją c-myc
* *
*
*
#
# #
0
0.1
0.2
0.3
control DMBA c-myc
cyclin-D
1/E
F2 *
* *
B
*
#
0
0.2
0.4
0.6
0.8
cyclin-D
2/E
F2 C
control DMBA c-myc
*
0
0.01
0.02
0.03 D
cyclin-D
3/E
F2
control DMBA c-myc
Expression of cell cycle regulating genes
+/+
+/-
-/-
positive
controltransformed
fibroblasts
negative
control
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
+/+num
ber
of
colo
nie
s/fi
eld
*
*
+/- -/-
Clonogenic assay
Fibroblasts overexpressing c-myc
HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-
• Myszy C57Bl/6 x FvB o różnym genotypie HO-1
• Dożylne lub podskórne podanie komórek czerniaka B16(F10)-luc-GF
B
Wpływ HO-1 w podścielisku na wzrost czerniaka
Luciferase activity
Lucif
era
se a
cti
vit
yGFP expression
B16(F10)-WT B16(F10)-luc-GFP
Waś et al. in preparation
Waś et al., in preparation
Pro
life
rati
ng c
ells
[%]
Apopto
tic c
ells
[%]
Volu
me [
mm
3]
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
125
HO-1 +/+
HO-1 +/-
HO-1 -/-
Czas od zaszczepienia [dni]P
rzeżycie
[%
]
Wpływ HO-1 w podścielisku na wzrost czerniaka
Surv
ival [%
]
time after injection
time after injection
Wpływ HO-1 w podścielisku na zasiedlanie płuc
przez komórki czerniaka
Waś et al., in preparation
HT
WT
KO
HT
Lum
inesc
ence f
rom
lungs
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0
WT HT KO
Waś et al. Am J Pathol, 2006
• Dożylne lub podskórne podanie
komórek czerniaka z normalnym lub
podwyższonym poziomie HO-1
Wpływ nadekspresji HO-1 na komórki czerniaka
• Myszy C57Bl/6 o normalnym poziomie
HO-1
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
HO-1 zwiększa żywotność i potencjał angiogenny
komórek czerniaka
Wzrost guzów czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1
Wielkość guza Obszary nekrotyczne
Waś et al. Am J Pathol, 2006
Waś et al. Am J Pathol, 2006
Struktura guzów czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1
CD45 staining - FACS analysis
0
10
20
30
40
50
WT HO-1 overexpression
Perc
enta
ge o
f le
ukocyte
s (%
of
all)
*WT
HO-1 overexpression
H&E staining
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
Naciek zapalny w czerniaku B16(F10) i B16(F10)-HO1
Serum Tumor
Was et al. Am J Pathol 2006
Unaczynienie czerniaków B16(F10) i B16(F10)-HO1
Waś et al. unpublished
0
100
200
Mig
rati
on [
% o
f contr
ol]
B16(F10)-luc-GFP B16(F10)-luc-GFP
-HO1
*
0
100
200
Invasi
on [
% o
f contr
ol]
*
B16(F10)-luc-GFP B16(F10)-luc-GFP
-HO1
Migracja komórek czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1
0
20
40
60
80
0 1 2 3weeks after injection
nu
mb
er o
f m
eta
sta
ses WT
HO-1
p=0.054
*
*
HO-1 zwiększa liczbę
przerzutów w płucach
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
*
*
Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka
Day of experiment
0
20
40
60
80
10 20 30 40 50
Surv
ival ra
te [
%]
WT
HO-1
100
P=0.017
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka
na przeżywalność myszy
*
*
*
*
Nowis et al. Oncogene, 2006.
Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach adenokarcinomy
na skuteczność PDT
Wpływ HO-1 na wzrost guzów endothelioma
Marinissen et al. JBC 2006
HO-1
Fe2+
biliverdin
bilirubin
CO
↑ Proliferation:- keratinocytes
- endothelium
- angioma
- pancreatic cancer cells
- melanoma
- lung cancer cells
- hepatoma
- sarcoma
↓ Proliferation:- epithelium
- astroglia
- T-lymphocytes
- fibroblasts
- smooth muscle cells
- breast carcinoma
- papillary thyroid carcinoma
- gastric cancer cells
Mediators:↑ p38, EGF, EDG-7,
FGFR-1
↓ p21, BTG-2
p21cGMP
p38
caveolin cyclin A
- cyclin A
- cyclin E1
- cyclin D
- cdk-2
ERK1/2
ferritin
iron pomp
iron
availability
Mediators:↑ p21, p38, caveolin-1
↓ cdk-2, cyclin A, E, D1,
↓ ERK1/2
↓ iron availability
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.
Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału
HO-1biliverdin
bilirubin
CO
cGMP
p38
↓ Inflammation- melanoma IL-10
INF ,
IL-
1b,
TNF,
IL-6
iNOS
Fe2+
ROS
ferritin
iron pomp
AP-1
NF B
E-selectin
ICAM-1
VCAM
Mediators↑ IL-10, TNFR-1, LSP-1
↓ INF , IL-1b, TNF, IL-6, iNOS, T 4
↓ ROS, E-selectin, ICAM , VCAM
JNK
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.
Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału
↓ Apoptosis:- endothelium
- fibroblasts
- vascular smooth
muscles
- hepatoma
- melanoma
- thyroid carcinoma
- chronic myelogenic
leukemia
- gastric cancer cells
- colon cancer cells
- bladder cancer cells
ROS
Mediators↑ Akt, Bcl, cIAP-1, p21,
↑MT1X, SOD-2, GSTA1, ATF4,
↑ MDR, Mrp
↓ ROS, Bax, p53
↓ cytochrome c release,
HO-1
Fe2+
biliverdin
bilirubin
CO
cGMP
ferritin
iron pomp
cytochrome c
release, p53
p21PKGAkt
p38
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.
Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału
HO-1
Fe2+
biliverdin
bilirubin
CO
cGMP
p38
ferritin
iron pomp
VEGF expression
VEGF signaling
SDF signaling
SDF-1
VEGF
IL-8
TNF
TP↑ Angiogenesis
- glioma
- melanoma
- pancreatic cancer
- lung carcinoma
- Kaposi sarcoma
Mediators↑ VEGF, EGF,
↑ Tb4, HYAL-1, MCT-1
PKG
PKA
Akt
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.
Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału
HO-1 activation
↑↓ tumor cell proliferation↓ inflammatory response
↑ immunosuppression
↑ angiogenesis↑ metastasis
tumorigenesis
radiotherapy
chemotherapy
photodynamic therapy
more invasive tumors
Jozkowicz et al. Antioxidant Redoc Signal. 2007.
Wpływ HO-1 na nowotworzenie
Oncogene-like potential
Very new:
Dziękuję
Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej