Rozwój myszy z wyjądrzonych oocytów, do których

wprowadzono jądra komórek pęcherzykowych

Wakayama,T., Perry, A.C.F., Zuccotti, M., Johnson, K.R., Yanagimachi, R. Nature 394, 369-374 (1998)

Wstęp:

• Pierwsze udane doświadczenia z klonowaniem ssaków opierały się na przeszczepianiu przedjądrzy 1-komórkowych zarodków myszy (McGrath&Solter, 1983).

• Dalsze prace prowadzone były na oocytach owcy, bydła domowego i królika, efektem było uzyskanie klonów w wyniku transplantacji jąder pochodzących z bruzdkujących zarodków lub węzłów zarodkowych.

• Próby uzyskania klonów będących genetycznymi kopiami dorosłych osobników owca Dolly powstała w wyniku przeszczepienia do oocytu komórki gruczołu mlekowego 6-letniej owcy (Wilmut i współaut., 1997).

• Wiadomo, że najlepsze efekty przynosi przeszczepianie jąder komórek znajdujących się w fazie G0.

Cel doświadczenia:

• Zbadanie czynników wpływających na rozwój embrionów powstałych z wyjądrzonych oocytów, do których przeszczepiono jądra w pełni zróżnicowanych komórek somatycznych.

• Wykorzystane komórki (Sertoliego, nerwowe i pęcherzykowe) nie pochodziły z hodowli tkankowych.

Materiał i metody:

• Komórki pęcherzykowe pobrano od samic szczepu B6D2F1 (seria A i B) oraz B6C3F1 (seria C), u których wywołano superowulację poprzez podanie hormonów eCG i hCG, komórki pęcherzykowe oddzielono od oocytów w roztworze hialuronidazy.

• Wyselekcjonowano komórki o wielkości 10-12 µm, przechowywano je do 3h w HEPES-CZB zawierającym 10% poliwinylopirolidonu.

• Komórki Sertoliego izolowano od samców szczepu B6D2F1 i przechowywano w HEPES-Ham F-12.

• Neurony izolowano z kory mózgu samicy B6D2F1 ( jądra o średnicy 7-8 µm).

• Wszystkie komórki somatyczne powinny być w fazie G0.

Materiał i metody – c.d.• Oocyty pobierano od samic szczepu

B6D2F1, którym podano eCG, a 13h przed zabiciem – hCG.

• Mikromanipulacji dokonywano przy pomocy mikromanipulatora piezoelektrycznego w kropli HEPES-CZB zawierającego 5 µg/ml cytocholazyny B ( jej obecność zapobiegała wyrzucaniu II ciałka kierunkowego).

• Chromosomy II metafazy wraz z wrzecionem podziałowym usuwano poprzez wciągnięcie ich do pipety z minimalną ilością cytoplazmy i oderwanie od oocytu.

• Następnie wyjądrzone oocyty przenoszono do pożywki niezawierającej cytocholazyny B i przechowywane do 2h w temperaturze 37,5oC.

Materiał i metody – c.d.• Jądra komórek somatycznych

oczyszczano z cytoplazmy przy pomocy pipety o średnicy 7 µm i w ciągu 5 min wszczepiano do wyjądrzonego oocytu.

• Oocyty aktywowano w obecności 10 mM Sr2+ w dwóch grupach: pierwszą grupę od razu po przeszczepieniu jąder, drugą grupę w ciągu 1-6 h, wszystkie oocyty przechowywano w pożywce zawierającej cytocholazynę B.

• Zarodki w stadium 2-8 komórek wszczepiano do jajowodów/macic samic szczepu CD-1, pokrytych 1-3 dni wcześniej sterylnymi samcami szczepu CD-1.

Wyniki:• W pierwszym eksperymencie oocyty z jądrami komórek

pęcherzykowych aktywowano w różnym czasie od momentu przeszczepienia jąder i okazało się, że moment aktywacji ma istotne znaczenie dla rozwoju zarodków.

• Ok. 40% oocytów aktywowanych od razu rozwinęło się do stadium moruli/blastocyty.

• Stadium moruli/blastocysty osiagnęło 60% oocytów aktywowanych 1-3h po transplantacji jąder i 67% oocytów aktywowanych 3-6h po transplantacji jąder.

• Wśród wszystkich aktywowanych oocytów 64% miało dwa przedjądrza, 36% - trzy lub wiecej.

• Obecność cytocholazyny B zablokowała tworzenie II ciałka kierunkowego.

• Analiza chromosomów 13 aktywowanych oocytów wykazała, że 85% z nich ma prawidłową liczbę chromosomów 2n=40.

a) oocyt otoczony przez komórki pęcherzykowe

b)-e) jądra pochodzące z komórek pęcherzykowych po przeszczepieniu do wyjądrzonego oocytu

f) blastocysty

Wyniki – c.d.

• Na bazie tych informacji oocyty, do których przeszczepiono jądra komórek Sertoliego i komórek nerwowych, aktywowano 1-6h po transplantacji jąder.

• Oocyty z jądrami komórek Sertoliego: 40% rozwinęło się do stadium moruli/blastuli, z tego jeden płód rozwijał się przez 8,5 dnia po zapłodnieniu w macicy, potem został uśmiercony.

• Oocyty z jadrami komórek nerwowych: 22% osiągnęło stadium moruli/blastocysty, jeden zarodek rozwijał się w macicy, ale obumarł ok. 6-7 dnia po zapłodnieniu.

• Ponieważ wyniki pierwszego doświadczenia z przeszczepionymi jądrami komórek pęcherzykowych były bardziej obiecujące, autorzy pracy skupili się na oocytach, do których przeszczepiali jądra tych właśnie komórek.

Wyniki – c.d.

a) Cumulina ur. 3.10.1997b) Cumulina w wieku 2,5 miesiąca

z własnym potomstwem (ojciec ze szczepu CD-1)

c) Myszy agouti będące klonami dawczyni komórek pęcherzykowych ze szczepu B6C3F1, w środku „matka zastępcza”, z prawej strony – dawczyni oocytów.

Wyniki – c.d.

Dowody na to, że uzyskane myszy są klonami dawczyń komórek pęcherzykowych i nie mają zanieczyszczeń genetycznych:

1)Oocyty nie były wystawione na działanie plemników in vitro.2)Matki zastępcze (CD-1) zostały pokryte sterylnymi samcami

(CD-1),poza tym, nawet, gdyby doszło do zapłodnienia, potomstwo byłoby białe. Poza tym, samicom wszczepiano zarodki 2-8 dniowe, a zapłodnienie na tym etapie nie jest możliwe.

3)Wszystkie urodzone myszy miały czarne oczy, myszy z serii B miały czarne futro, a myszy z serii C i D – futro agouti. W każdym przypadku otrzymano spodziewany fenotyp.

4)Wszystkie urodzone myszy były samicami.

Wyniki – c.d.5) Wyniki Southern blot.6) Gdyby jądra nie zostały

usunięte całkowicie, powstałe zarodki byłyby hiperploidalne i nie przeszłyby pełnego rozwoju.

7) Przeprowadzono dodatkowy test polegający na usunięciu jader z 204 oocytów, w żadnym z nich nie zaobserwowano pojawienia się chromosomów.

Wnioski:• Odstęp czasowy pomiędzy przeszczepieniem jądra i

aktywacją jest korzystny dla rozwoju zarówno pre- jak i postimplantancyjnego.

• Może to być związane z wystawieniem na „działanie” cytoplazmy bogatej w MPF, niewykluczone, że w chromatynie zachodzą zmiany epigenetyczne istotne dla dalszego rozwoju zarodka.

• Użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego pozwala na przeprowadzanie szybkich i wydajnych manipulacji na komórkach i ogranicza śmiertelność zarodków.

• Nie wiadomo, dlaczego nie udało się uzyskać pełnego rozwoju zarodków z jądrami komórek Sertoliego i nerwowych, możliwe, że stadium fazy G0, w którym się znajdowały nie pozwala na podtrzymanie rozwoju zarodka.

• Niewielka liczba urodzeń (2-3%) w stosunku do ilości implantowanych zarodków (57-71%) wskazuje na to, że w rozwój postimplantacyjny mogą być zaangażowane liczne czynniki regulatorowe i punkty kontrolne.

• Ssaki można klonować, ale wydajność jest dosyć niska.

KONIEC