Biochemia stresu oksydacyjnegobiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AJ/wyklad_02.pdfProdukcja O...

Biochemia stresu oksydacyjnego

Wykład 2Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach

Źródła ROS w komórce

- Enzymy generujące H2O2:np.* oksydaza aldehydowa* oksydaza D-aminokwasowa* okydaza -hydroksykwasowa* oksydaza ksantynowa* oksydaza acetylokoenzymu A* oksydaza glutarylokoenzymu A* oksydaza galaktozowa* oksydaza glikolanowa

- Enzymy generujące O2np. * oksydaza ksantynowa* oksydaza aldehydowa* oksydaza diaminowa* reduktaza cytochromu P450* reduktaza glutationowa* oksydaza galaktozowa* mieloperoksydaza* oksydoreduktaza NADPH* hydroperoksydaza prostaglandynowa* tyrozynaza* syntaza tlenku azotu* reduktaza cytochromu b5* lipooksygenaza* dioksygenaza tryptofanowa

.

- Cykle redoks i utleniania ksenobiotyków

- Utlenianie białek oddechowych (hemoglobiny, mioglobiny)

- Samoutlenianie związków niskocząsteczkowych (np. związków tiolowych)

- Łańcuch oddechowy w mitochondriach

Źródła ROS w komórce

Mitochondrium

Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

- Zewnętrzna błona mitochondrialna:* stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~1:1* duża zawartość poryn

- Cząsteczki o masie do ~6 kDa mogą swobodnie dyfundować do przestrzeni międzybłonowej. Większe muszą mieć sekwencję sygnałową na N-końcu, pozwalającąna wiązanie do translokaz.

- Przestrzeń międzykomórkowa:* stężenie małych cząsteczek podobne jak w cytozolu* skład białek jest odmienny niż w cytozolu

- Wewnętrzna błona mitochondrialna:* stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~3:1* duża zawartość kardiolipiny (zmniejszenie przepuszczalności błony)* brak poryn* transport wszystkich substancji wymaga transporterów* obecność białek odpowiedzialnych za fosforylację oksydacyjną, syntezę i

hydrolizę ATP, transport białek regulatorowych.

Mitochondrium

L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

Reakcje w matriks mitochondrialnej- Pirogronian produkowany podczas glikolizy jest transportowany do matriks, dekarboksylowany oksydacyjnie i przyłączany do Co-A (powstaje CO2, acetylo-CoA i NADH).

- Grupa acetylowa przyłączana jest do szczawiooctanu (C4), tworząc cytrynian (C6). Izomer cytrynianu jest następnie dekarbokylowany oksydacyjnie do -ketoglutaranu (C5) i bursztynianu (C4), z którego regenerowany jest szczawiooctan. Przy tym 3 jony wodorowe (6 e-) są przenoszone na NAD+, a para atomów wodoru (2 e-) na FAD.

- W cyklu Krebsa powstają 2 cząsteczki CO2, czemu towarzy-szy produkcja 3 cząsteczek NADH i 1 cząsteczki FADH2. Powstaje też 1 wysokoener-getyczne wiązanie fosforanowe, a 9 kolejnych ATP może powstawać podczas utleniania NADH i FADH2 za pośred-nictwem łańcucha oddechowego.

- Elektrony z NADH mogą byćtransportowane z cytoplazmy przez czółenko jabłczanowo-asparaginowe lub czółenko glicerolo-3-fosforanowe

6C

GDP+PiGTP

- Przyjmuje elektrony z NADH, i przenosi je przez liczne kofaktory do pierwszego ruchliwego nośnika elektronów, utlenionego koenzymu Q. Uzyskana w ten sposób energia jest wykorzystywana do przeniesienia czterech protonów z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej.

- Koenzym Q otrzymuje elektrony także z kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej) oraz dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerolu.

- Zredukowany koenzym Q przekazuje elektrony na kompleks III, skąd trafiają na cytochrom c, ulokowany w przestrzeni międzybłonowej. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia czterech protonów do przestrzeni międzybłonowej.

- Z cytochromu c elektrony przenoszone są na kompleks IV (oksydazy cytochromu c), gdzie cząsteczkowy tlen redukowany jest do wody. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia dwóch elektronów do przestrzeni międzybłonowej.

Łańcuch oddechowy

Łańcuch oddechowy

- Przepływ elektronów z NADH lub FADH2 do O2 poprzez łańcuch oddechowy powoduje wypompowywanie protonów z macierzy. Wytworzona siła protonomotoryczna obejmuje dwie składowe: gradient pH (gradient protonowy) i transbłonowy potencjał elektryczny.

- W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III.

L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

Łańcuch oddechowy


Łańcuch oddechowy z zaznaczonymi wartościami standardowego potencjału redukcyjnego.

- standardowy potencjał redukcyjny O2/O2'- wynosi -0.16 V, więc przeniesienie elektronu może być mediowane przez wiele związków).

Związki ułatwiające identyfikację miejsc tworzenia reaktywnych form tlenu

Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

Produkcja O2'- w kompleksie I łańcucha oddechowego


Kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon)- Jest transbłonowym kompleksem enzymatycznym, który:

* utlenia NADH, przekazując elektrony na ubichinon* jest połączony z pompą protonową, a jego aktywność przyczynia się do powstania

gradientu protonów* stanowi jedno z dwóch głównych miejsc pobierania równoważników redukcyjnych

(drugie miejsce to kompleks II)* jest głównym źródłem ROS w komórce w warunkach fizjologicznych

Centra Fe-S

semichinon/rodnik semichinonowy

Flawina

Koenzym Q (ubichinon)

Quinzee & Hirano. Dev Disabil Res Rev 2010.

- Ubichinon jest kluczowym transporterem elektronów w łańcuchu oddechowym i ważnym antyoksydantem

- Niedobór lub dysfunkcja ubichinonu prowadzi do różnorodnych efektów klinicznych:

* encefalomiopatii* niemowlęcej choroby wieloukładowej* ataksji móżdżkowej* izolowanej miopatii mitochondrialnej* zespół nerczycowy

Dehydrogenaza bursztynianowa

Rutter et al. Mitochondrion 2010.

- Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) jest zarówno częścią łańcucha oddechowego jak i cyklu Krebsa, w którym utlenia bursztynian do fumaranu

- SDH zbudowana jest z czterech jednostek, wszystkie kodowane są przez geny jądrowe

- Jest jedynym kompleksem łańcucha oddechowego, który nie pompuje protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną

- Zaburzenia funkcji SDH są bardzo rzadkie (2-4% zaburzeń łańcucha oddechowego) i prowadzą do:

* zespołu Leigha (choroba neuro-degeneracyjna rozwijająca się u niemowląt)

* rodzinnej paragangliomy (przy-zwojaka, nowotworu układu współ-czulnego lub przywspółczulnego)


utlenianie pirogronianu

utlenianie samego

bursztynianu

NAD O2

Odwrotny transport elektronów

Odwrotny transport elektronów

- Kiedy mitochondria utleniają pirogronian, elektrony sąprzekazywane z NADH do chinonu (Q) poprzez FMN i centra Fe-S. Powstający QH' jest redukowany do chinolu (QH2).

- Kiedy mitochondria utleniają jedynie bursztynian (przy braku innych substratów) elektron przenoszony jest wbrew potencjałowi redoks ze zredukowanego chinonu (chinol, QH2) na NAD+, zamiast w stronę O2.

Produkcja O2'- w kompleksie III łańcucha oddechowego


Kompleks III (oksydoreduktazakoenzym Q:cytochrom c)

- Budowa kompleksu III:* zewnętrzne miejsce chinonowe (Qo)* wewnętrzne miejsce chinonowe (Qi)* cytochrom b566 (cyt b566)* cytochrom b562 (cyt 562)* białko Rieske (z kompleksami Fe-S)* cytochrom c1* cytochrom c

- Działanie kompleksu III:* Ubichinon jest redukowany do QH2 po

stronie wewnętrznej (Qi) i migruje do strony zewnętrznej (Qo) uwalniając 2H+ i przenosząc 1 e- na cyt c1 za pośrednictwem białka Rieske. Powstaje przy tym QH' i Q.

* Drugi e- redukuje cytochrom b, dzięki czemu elektrony są przenoszone na wewnętrzną stronębłony, gdzie redukują chinon do QH2.

* cyt c i cyt c1 przyjmują tylko pojedynczy e-, dlatego pełna redukcja Q wymaga utlenienia dwóch cząsteczek QH2 w dwóch kolejnych cyklach.

Produkcja O2'- w kompleksie III łańcucha oddechowego


- Inhibitory kompleksu III:* Myxothiazol: blokuje miejsce Qo

uniemożliwiając przeniesienie elektronu z QH2 do centrów Fe-S i cytochromu b.

* Stigmatellin: blokuje przeniesienie pierwszego elektronu na centrum Fe-S.

* Antimycin A: wiąże się do miejsca Qii blokuje przeniesienie drugiego elektronu do miejsca Qi. Dzięki temu hamuje powstawanie QH2 i nasila tworzenie O2'-.

- Wydaje się, że O2'- tworzony na kompleksie III jest uwalniany do przestrzeni międzybłonowej (czyli jest dysmutowany głównie przez CuZnSOD). To wciąż jednak nie jest jasne.

- Cyt-c jest zakotwiczony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej za pośrednictwem kardiolipiny.

- W obecności ROS kompleks cyt-c/kardiolipina działa jak peroksydaza kardiolipiny, tworząc wodoronadtlenki kardiolipiny, o zmniejszonym powinowactwie do cyt-c. Uwalnianie cyt-c jest jednym ważnych etapów wczesnej apoptozy.

- Uwalnianie cyt-c jest procesem dwuetapowym:* utrata kontaktu z wewnętrzną błoną mitochondrialną (hamowane przez NO)* uwalnianie do cytozolu przez uszkodzoną zewnętrzną błonę mitochondrialną

(nasilane przez Bid, Bax, lub Bak – dezintegrujące błonę).

Uwalnianie cytochromu c

Łańcuch oddechowy

Detekcja reaktywnych form tlenu

Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009; Ishizaki et al. J Physiol 2009

Widmo EPR uzyskane z mitoplastów po zastosowaniu DMPO (pułapki spinowej) -wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego

DMPO

DMPO + antymycyna A

Wykorzystanie fluorescencji DCF (dichlorofluoresceiny) do wykrywania H2O2 w mikronaczyniach siatkówki

DMPO + + antymycyna A+ SOD

Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego


- Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H2O2 w komórkach hodowanych in vitro.

kontrola stymulacja

- Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H2O2 w mitochondriach izolowanych z kardiomiocytów świnki morskiej. Aktywność łańcucha oddechowego stymulowana bursztynianem.

- CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone): czynnik rozprzęgający- rotenon: inhibitor kompleksu I- AA (antymycyna A): inhibitor kompleksu III- bursztynian: substrat oddechowy- pirogronian: substrat oddechowy

Rozwój blaszki miażdżycowej


Endothelium

Vessel LumenLDL

LDL Readily Enter the Artery Wall Where They May be Modified

LDL

Intima

Modified LDL

Modified LDL are Proinflammatory

Hydrolysis of Phosphatidylcholineto Lysophosphatidylcholine

Other Chemical Modifications

Oxidation of Lipidsand ApoB

Aggregation

Ross R. N Engl J Med 1999


LDLLDL

LDLLDLEndotheliumEndothelium

Vessel LumenVessel Lumen

IntimaIntima

MonocyteMonocyte

Modified LDLModified LDL

MCPMCP--11



LDLLDL


Vessel LumenVessel Lumen

IntimaIntima

MonocyteMonocyte


Modified LDL PromoteModified LDL PromoteDifferentiation ofDifferentiation ofMonocytesMonocytes intointoMacrophagesMacrophages

MCPMCP--11

MacrophageMacrophage



LDLLDL


Vessel LumenVessel LumenMonocyteMonocyte


MCPMCP--11

AdhesionAdhesionMoleculesMolecules

Foam CellFoam Cell

Modified Modified LDL Taken LDL Taken

up by up by MacrophageMacrophage

IntimaIntima



LDLLDL


Vessel LumenVessel LumenMonocyteMonocyte



MCPMCP--11

AdhesionAdhesionMoleculesMolecules

CytokinesCytokines

IntimaIntima



Korn et al. J Thor Cardiovasc Sur 2002

Ischemia i reperfuzja - ultrastruktura mitochondriów

kontrola - zdrowy mięsień

Ischemia-reperfuzja w mięśniu przywodzącym łydki królika

rozjaśnienie macierzy, utrata granul

puchnięcie mitochon-driów, fragmentacja grzebieni

Wpływ hipoksji na produkcję ROS w izolowanym sercu


- MnTbap: SOD mimetic- CG: katalaza + glutation- MCG: MnTbap + CG- L-NAME: inhibitor NOS

- Produkcja ROS zwiększa się w niedotlenieniu.* komórki w zasadzie nigdy nie są anoksyjne - tlen jest zawsze dostępny* mitochondria oddychają normalnie w bardzo niskim pO2. Gdy pO2

spadnie poniżej wartości progowej, oddychanie zaczyna się obniżać, a produkcja ROS spada.

Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego


- Pomiar produkcji O2'- za pomocą DHE (dihydroethidium), przekształcanej do 2-OH-E+ (2-hydroksyethidium) w izolowanym sercu świnki morskiej.

- Pomiar produkcji ONOO- za pomocą diTyr(dityrosine), przekształcanej z tyrozyny w izolowanym sercu świnki morskiej.

BDM (butanedione monoxime): inhibitor skurczów kardiomio-cytów

MnTBAP: mimetyk SOD

L-NAME (N-nitro-L-argininemethyl ester): inhibitor NOS

manadione: inhibitor transportu elektronów

Regulacja produkcji O2'- w mitochondriach


- Cykliczne lub ciągłe chłodzenie izolowanego narządu (tu: serce świnki morskiej) prowadzi do wzrostu poziomu ROS. Jest to spowodowane:

* zwiększoną produkcją ROS* zmniejszoną aktywnością enzymów

antyoksydacyjnych, przede wszystkim MnSOD.

Ischemia i reperfuzja- Uszkodzenie tkanek po ischemii i reperfuzji jest powodowane przez wzrost produkcji ROS (szczególnie istotne przy transplantacji narządów):

* Podawanie zmiataczy O2'- i H2O2 (ale nie jedynie O2'-) zmniejsza uszkodzenia

* Nadekspresja enzymów antyoksydacyjnych (CuZnSOD, MnSOD, HO-1) zmniejsza uszkodzenia

* Po reperfuzji dochodzi do zwiększonej produkcji O2'- i ONOO-.

- Większość ROS w ischemii i reperfuzji jest produkowana w łańcuchu oddechowym, zwłaszcza przez kompleks III.

- Bardzo istotna jest rola oksydoreduktazy ksantynowej.

- Schłodzenie narządu przed przeszczepem nasila produkcję ROS.

nabłonek jelitowy

kontrola

I/R

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/stomach/salmonella.jpg

G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

- Białko UCP (UCP1) zostało po raz pierwszy opisane w brunatnych adipocytach, odpowiedzialnych za termogenezę bezdrżeniową.

- UCP pozwala na powrót elektronów do matriksmitochondrialnej bez produkcji ATP (może więc zachodzić przy niedoborze ADP, zmniejszając ryzyko nadmiernej akumulacji H+ w przestrzeni między-błonowej). Towarzyszy temu produkcja ciepła.

- UCP2 odgrywa rolę w regulacji wydzielania insuliny.

- UCP3 ulega ekspresji głównie w mięśniach i ma działanie antyoksydacyjne.

- UCP4 i UCP5 produkowane są głównie w układzie nerwowym i mają działanie antyoksydacyjne.

Białka rozsprzęgające (UCP)

UCP w łańcuchu oddechowym

Wolkow & Isner. Aging Res Rev. 2006.

Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

Mechanizmy termogenezy

Termogeneza zwiększa się w odpowiedzi na stymulację adrenergiczną, prowadzącą do wzrostu cAMP i aktywację PKA.

Termogeneza bezdrżeniowa- Termogeneza bezdrżeniowa:

* produkcja ciepła w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT)* głównie u zwierząt hibernujących i u noworodków (wyjątek: świniowate)* u szczurów: 3 g BAT zużywa 2 x więcej tlenu niż podstawowy metabolizm (BMR)

reszty ciała (czyli 350-400 g)* u ludzi jest ok. 50 g BAT, które mogą zużywać ok. 20% tlenu niż BMR

Buffy et al. Br J Canc 2011.

Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

BAT

- BAT u gryzoni:* odpowiada za termogenezę

bezdrżeniową* zwiększa wydatki energe-

tyczne* zmniejsza otyłość* zmniejsza tworzenie białych

adipocytów

- BAT u ludzi:* jest obecny przez całe życie,

ale w niewielkich ilościach (wykrywalny w PET/CT), głów-nie między łopatkami (u nowo-rodków) lub nad obojczykami (u dorosłych

Białka rozprzęgające (UCP)

- Homologi UCP u roślin odgrywają rolę w dojrzewaniu owoców i w termogenezieroślin

Chan et al. Diabetes 2004.

Philodendron selloum

UCP-1- Kluczowym białkiem w termogenezie bezdrżeniowej jest UCP-1. Funkcja innych białek UCP jest mniej istotna.

- Transport protonów przez UCP-1 zależy od pary histydyn, których nie ma w innych UCP.

- Jest eksprymowany w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT)

- Ekspresja UCP-1 jest indukowana przez kwasy tłuszczowej (prawdopodobnie poprzez aktywację czynnika PPAR)


UCP-2


UCP-2


- Jest eksprymowane w różnych tkankach, w tym w komórkach -trzustki

- Ekspresja UCP-2 koreluje odwrotnie z poziomem ATP, głównego regulatora produkcji insuliny w komórkach .

- Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez kwasy tłuszczowe (poprzez PPAR), co może chronić komórki przed lipotoksycznością.

- Ekspresja UCP-2 jest indukowana przez ROS (np. w makrofagach).

Funkcje UCP2

Zdrowe komórki


Komórki dysplastyczne i nowotworowe

Funkcje UCP2


Produkcja insuliny w komórkach

Fajans SS. Nat Med. 2004

UCP w łańcuchu oddechowym

- Niedobór UCP może zwiększać produkcję ATP w mitochondriach.

- W komórkach trzustki:* pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego

i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny.

* Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny.

- Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.

Freeman & COX: Hum Mol Genet 2006.

- Zmiany w metaboliźmiekomórek prowadzą do zmian w wydzielaniu insuliny:

* Wzrost poziomu glukozy zwiększa poziom metabolizmu komórek i podnosi poziom komórkowego ATP.

* To prowadzi do zamknięcia kanałów KATP, depolaryzacji błony, aktywacji zależnych od potencjału kanałów Ca2+, napływu Ca2+ do cytoplazmy.

* Wzrost poziomu Ca2+ jest bezpośrednim sygnałem uwalnia-nia insuliny.

Stres oksydacyjny w cukrzycy

Regulacja produkcji insuliny przez ROS

Newsholme et al. J Physiol 2007

UCP3

Argyropoulos & Harper. J Appl Physiol 2002.

- Ulega ekspresji głównie w mięśniach szkieletowych

- UCP-3 może nasilać utlenianie kwasów tłuszczowych.* współdziała tioesterazą mitochondrialną (MTE), nasilając transport kwasów

tłuszczowych (produkowanych przez MTE) z macierzy mitochondrialnej, dzięki czemu uwalnia CoA.

* uwolnienie CoA pozwala na utrzymanie wysokiego tempa utleniania kwasów tłuszczowych

Białka rozprzęgające (UCP)


- Homologi UCP znane są również u Drosophila melanogaster i Caenorhabditiselegans

- Ewolucyjnie najstarszą formą UCP jest prawdopodobnie UCP-4 (u ssaków – obecny w mózgu)

- Funkcje białek UCP:* regulacja termogenezy (UCP-1)* regulacja metabolizmu kwasów tłuszczowych (UCP-2 i UCP-3)* zmniejszenie produkcji ROS (UCP-1, UCP-2, UCP-3, UCP-4, UCP-5)* zahamowanie wydzielania insuliny (UCP-2)* regulacja apoptozy (UCP-4)

- Myszy UCP KO mają normalny fenotyp, ale:* UCP-1 KO – wrażliwe na zimno, podatne na tycie * UCP-2 KO – zwiększona produkcja ROS* UCP-3 KO – zwiększona produkcja ROS, zmniejszone utlenianie kwasów

tłuszczowych

Dziękuję

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

Biochemia stresu oksydacyjnegobiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AJ/wyklad_02.pdfProdukcja O...

Documents

Transcript of Biochemia stresu oksydacyjnegobiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AJ/wyklad_02.pdfProdukcja O...