Biochemia Ćwiczenie 7 - biochemia-i-farmakogenomika.wum ... · Biochemia Ćwiczenie 7 Zakład...

Biochemia Ćwiczenie 7 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

___________________________________ Imię i nazwisko

_____________ data

Uzyskane punkty /2

podpis asystenta

_____________ Nr albumu

ĆWICZENIE 7

LIPIDY O ZNACZENIU BIOLOGICZNYM

Wstęp merytoryczny

Pojęciem lipidów określa się zespół heterogennych związków organicznych wykazujących duże podobieństwo

pod względem rozpuszczalności - są one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w niepolarnych

rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform i aceton.

Do lipidów zalicza się:

1. lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z alkoholami (tłuszcze właściwe, woski)

2. lipidy złożone: estry kwasów tłuszczowych z alkoholem zawierające dodatkowe grupy (fosfolipidy, glikolipidy,

sulfolipidy, aminolipidy itp.)

3. Prekursory i pochodne lipidów: kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe, witaminy

rozpuszczalne w tłuszczach itp.

Lipidy o znaczeniu biologicznym:

1. Triacyloglicerole (triglicerydy) – estry glicerolu z kwasami tłuszczowymi, główna forma zapasowa kwasów

tłuszczowych

Rycina 1. Schemat biosyntezy triacyloglicerolu

W przypadku lipidów naturalnie występujących w przyrodzie R’R”R’’’ (zwykle R’ – nasycony kwas tłuszczowy,

R’’ – nienasycony kwas tłuszczowy, R’’’ – nasycony lub nienasycony kwas tłuszczowy).



Triacyloglicerole w podlegają hydrolizie:

Rycina 2. Schemat hydrolizy triacyloglicerolu

2. Kwasy tłuszczowe:

Materiał energetyczny magazynowany w postaci triglicerydów, substrat do biosyntezy innych lipidów (glikolipidów,

fosfolipidów, ikozanoidów, estrów cholesterolu).

Wśród kwasów tłuszczowych wyróżnia się kwasy:

1. nasycone: brak wiązań podwójnych pomiędzy atomami węgla

2. nienasycone: występuje co najmniej jedno wiązanie podwójne pomiędzy atomami węgla, mogą występować

w położeniu cis i trans

jednonienasycone

wielonienasycone

ikozanoidy (eikozanoidy)

Rycina 3. Schemat struktury nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych

Struktura chemiczna przykładowych kwasów tłuszczowych:

Rycina 4. Budowa chemiczna wybranych nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych



Wybrane nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach roślinnych, zwierzęcych oraz błonach

biologicznych:

Nazwa systematyczna Nazwa zwyczajowa Wzór sumaryczny liczba atomów C:liczba wiązań podwójnych

kwas butanowy masłowy C3H7COOH 4 : 0

kwas heksanowy kapronowy C5H11COOH 6 : 0

kwas oktanowy kaprynowy C7H15COOH 8 :0

kwas dodekanowy laurynowy C11H23COOH 12 : 0

kwas tetradekanowy mirystynowy C13H27COOH 16 : 0

kwas heksadekanowy palmitynowy C15H31COOH 16 : 0

kwas heksadeka-9-enowy palmitoleinowy C15H29COOH 16 : 1

kwas oktadekanowy stearynowy C17H35COOH 18 : 0

kwas oktadeka-9-enowy oleinowy C17H33COOH 18 : 1

kwas oktadeka-9,12-dienowy linolowy C17H31COOH 18 : 2

kwas oktadeka-9,12,15-trienowy -linolenowy C17H29COOH 18 : 3

kwas oktadeka-6,9,12-trienowy -linolenowy C17H29COOH 18 : 3

kwas ejkoza-5,8,11,14-tetraenowy arachidonowy C19H31COOH 20 : 4

3. Ikozanoidy (eikozanoidy): pochodne wielonienasyconych 20-węglowych kwasów tłuszczowych o znaczeniu

regulacyjnym

prostanoidy (prostaglandyny, prostacykliny, tromboksany)

leukotrieny

lipoksyny

Rycina 5. Struktura chemiczna wybranych ikozanoidów

4. Fosfolipidy: główne składniki błon komórkowych.

Fosfolipidy to pochodne kwasu fosfatydowego (1,2-diacylo-3-fosfoglicerolu), w których fosforan ulega estryfikacji

odpowiednim alkoholem.

Rycina 6. Schemat ogólny budowy fosfolipidów



Fosfatydylocholiny (lecytyny): składniki błon biologicznych, źródło choliny.

Rycina 7. Schemat budowy przykładowej fosfatydylocholiny

Kefaliny: składniki substancji mózgowej i osłonek mielinowych zakończeń nerwowych.

Rycina 8. Schemat budowy przykładowych kefalin

Sfingomieliny: pochodne sfingozyny (amioalkohol), składniki mózgu i tkanki nerwowej.

Rycina 9. Schemat budowy sfingomieliny

5. Glikolipidy: składniki błon komórkowych (głównie warstwy zewnętrznej)



Rycina 10. Schemat budowy przykładowego glikolipidu

Cholesterol i jego pochodne:

Cholesterol: pochodna steranu występująca we wszystkich tkankach w postaci wolnej lub estrów z kwasami tłuszczowymi. Prekursor kwasów żółciowych, hormonów steroidowych (androgeny, estrogeny, glikokortykoidy, mineralokortykoidy) oraz witaminy D. Z racji na właściwości hydrofobowe, w osoczu krwi transportowany jest w postaci rozpuszczalnych w wodzie kompleksów – lipoprotein. Chylomikrony – lipoproteiny transportujące triglicerydy i cholesterol pokarmowy z jelit do wątroby, LDL – lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z wątroby do tkanek (aterogenne), HDL – lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z tkanek do wątroby (antyaterogenne). Kwasy żółciowe: metabolity cholesterolu. Wśród kwasów żółciowych wyróżnia się kwasy pierwotne (kwas cholowy i kwas chenodeoksycholowy) syntetyzowane de novo w hepatocytach (komórki wątroby) w ilości około 500 mg/dobę oraz kwasy wtórne (kwas deoksycholowy i kwas litocholowy) powstające z pierwotnych kwasów żółciowych pod wpływem enzymów flory bakteryjnej jelit. Sole kwasów żółciowych jako detergenty i aktywatory lipaz trzustkowych uczestniczą w procesie trawienia i wchłaniania lipidów egzogennych w jelicie cienkim. Związki te są także ligandami receptorów wewnątrzkomórkowych uczestniczących w regulacji ekspresji genów zaangażowanych m.in. w ich własny metabolizm, a także regulację przemian węglowodanów i lipidów. Odpowiedni stosunek stężeń cholesterolu i kwasów żółciowych w żółci zapobiega wytrącaniu się cholesterolu w pęcherzyku żółciowym, a w konsekwencji rozwojowi kamicy pęcherzyka żółciowego. Witamina D3: syntetyzowana z 7-dehydrocholesterolu (prowitamina D) gromadzącego się w keratynocytach warstwy kolczystej i podstawnej naskórka.

Pod wpływem promieni UVB( = 290-315 nm) ulega przekształceniu w cholekalcyferol, który transportowany jest do wątroby, gdzie zostaje przekształcony do kalcydiolu (25-hydroksycholekalcyferol). Ostatni etap syntezy aktywnej postaci witaminy D zachodzi głównie w nerkach, gdzie kalcydiol jest przekształcany do kalcytriolu (1,25-hydroksycholekalcyferol). Kalcytriol działa poprzez receptor jądrowy VDR wpływając regulacyjnie m.in. na gospodarkę wapniowo-fosforanową, węglowodanową, układ renina-angiotensyna-aldosteron, śródbłonek naczyń krwionośnych oraz układ immunologiczny. Hormony sterydowe: syntetyzowane w korze nadnerczy, gonadach,

ciałku żółtym oraz łożysku pochodne cholesterolu, wśród których wyróżnia się mineralokortykoidy (regulacja gospodarki wodno-mineralnej, np. aldosteron), glikokortykoidy (regulacja gospodarki węglowodanowej, np. kortyzol) oraz hormony płciowe (męskie – androgeny, np. testosteron oraz żeńskie – estrogeny i gestageny, np. estradiol i progesteron), działające przez receptory wewnątrzkomórkowe. Rycina 11. Przykłady hormonów sterydowych



Doświadczenie 1

Cel: Badanie rozpuszczalności lipidów

Zasada metody: Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast rozpuszczają się w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych. Postępowanie: Przygotuj 4 długie szklane probówki i dodaj do każdej z nich odpowiednie substancje zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniższej tabeli:

Numer probówki

składnik 1 2 3 4

woda 1 cm3 - - -

etanol - 1 cm3 - -

chloroform - - 1 cm3 -

aceton - - - 1 cm3

olej roślinny 4 krople 4 krople 4 krople 4 krople

wytrząsnąć zawartość próbówek za pomocą vorteksu przez 20 sekund

Obserwacje:

Wnioski:



Doświadczenie 2

Cel: Badanie właściwości kwasów żółciowych jako emulgatorów

Zasada metody: Emulsja to układ koloidalny, w którym ośrodek rozpraszający i substancja rozproszona są nie mieszającymi się wzajemnie cieczami. Układ taki powstaje w warunkach intensywnego wytrząsania np. w układzie tłuszcz – woda. Emulsja jest układem termodynamicznie nietrwałym, co prowadzi do szybkiego jego rozwarstwienia z powierzchniowym usytuowaniem tego składnika, który cechuje niższa gęstość. W celu utrwalenia emulsji stosuje się substancje powierzchniowo czynne (surfaktanty) zwane też emulgatorami. Cząsteczki tych substancji są amfifilowe, co oznacza, iż posiadają wyraźnie zróżnicowane pod względem powinowactwa do wody lub innych cieczy polarnych bieguny: hydrofilowy i hydrofobowy. Emulgator to substancja zmniejszająca napięcie powierzchniowe na granicy faz, tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu powierzchni granicznej między wodą i np. tłuszczem. Powstała w ten sposób utrwalona emulsja charakteryzuje się istotnie wyższą stabilnością. Do emulgatorów zalicza się m.in. lecytynę (fosfatydylocholinę), sole estrów kwasu siarkowego i wyższych alkoholi, mydła (sole sodowe lub potasowe kwasów tłuszczowych), kwasy żółciowe.

Rycina 15 Układ detergentów w mieszaninie woda/olej oraz przykładowe detergenty

Utworzenie emulsji w przewodzie pokarmowym ma istotne znaczenie w procesie trawienia lipidów pokarmowych. Sole kwasów żółciowych, będące produktami przemian cholesterolu, wykazują zdolność obniżania napięcia powierzchniowego na granicy faz, a dzięki temu – emulgowania tłuszczów, co ułatwia ich trawienie w przewodzie pokarmowym. Kwasy żółciowe zwiększają powierzchnie kontaktu między fazą wodną, w której występuje lipaza trzustkowa i fazą lipidową, w której zawarte są trawione przez ten enzym triacyloglicerole. Kwasy żółciowe tworzą tym samym w środowisku treści jelitowej układy micelarne, które ułatwiają także dalsze wchłanianie lipidów, produktów ich trawienia oraz rozpuszczonych w lipidach substancji, np. witamin A, D, E i K.

Rycina 16 Kwasy żółciowe jako detergenty

Kwasy żółciowe, jako regulatory ekspresji genów, aktywują receptory jądrowe, m.in. receptor farnezoidowy X (FXR), receptor pregnanu X (PXR) oraz receptor witaminy D (VDR), wpływając nie tylko na własny metabolizm, ale także na metabolizm glukozy i lipidów. Silnie hydrofobowy kwas litocholowy, będący główną formą usuwania nadmiaru cholesterolu z organizmu, może działać toksycznie na komórki.



Etap 1: Postępowanie: Przygotuj 3 długie szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce:

Obserwacje:

Wnioski:

Odczynniki Numer probówki

1 2 3

olej 1.0 cm3 1.0 cm3 1.0 cm3

woda destylowana 5.5 cm3 5.0 cm3 5.0 cm3

wymieszaj zawartość probówek

roztwór deoksycholanu sodowego - 5.0 cm3 -

detergent - - 5.0 cm3

mocno wytrząśnij probówkę



Etap 2: Wykrywanie kwasów żółciowych testem Hay’a Postępowanie: Przygotuj 2 szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce:

Obserwacje:

Wnioski:

Odczynniki Numer probówki

1 2

roztwór żółci 5.0 cm3 -

woda destylowana - 5.0 cm3

siarka sublimowana kilka ziaren kilka ziaren



Doświadczenie 3

Cel: Reakcja zmydlania tłuszczów i badanie właściwości mydeł

Zasada metody: Reakcja zmydlania tłuszczu (hydroliza zasadowa) zachodzi w środowisku zasadowym. Produktami reakcji, poza alkoholem, są mydła, czyli sole kwasów tłuszczowych.

Rycina 16 Hydroliza zasadowa triacyloglicerolu (reakcja zmydlania)

Mydła jako sole słabych kwasów oraz mocnych zasad wykazują odczyn zasadowy. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych (np. H2SO4) dochodzi do wyparcia z mydła słabego kwasu, jakim jest nierozpuszczalny w wodzie kwas tłuszczowy. Mydła charakteryzują się różną rozpuszczalnością w wodzie w zależności od kationu metalu, jaki wchodzi w jego skład. Mydła sodowe i potasowe dobrze rozpuszczają się w wodzie, natomiast mydła wapniowe i magnezowe są trudno rozpuszczalne w wodzie. Mydła rozpuszczalne w wodzie są substancjami powierzchniowo czynnymi. Micele koloidowe tworzone przez mydła utrzymują się w wodzie dzięki otaczającemu je płaszczowi wodnemu.

Rycina 17 Mydło jako detergent

Dodanie elektrolitu o większym powinowactwie do wody np. NaCl powoduje zobojętnienie ładunków elektrycznych na powierzchni, przez co cząsteczki koloidu są pozbawiane otoczki wodnej i wypadają z roztworu. W przebiegu ostrego zapalenia trzustki, dochodzić może do uwolnienia enzymów lipolitycznych trzustki do okolicznych tkanek i uczynnienia lipazy, czego następstwem jest rozwój tzw. martwicy Balsera czyli martwicy tkanki tłuszczowej spowodowanej hydrolizą triacylogliceroli i powstawaniem nierozpuszczalnych mydeł wapniowych tworzących charakterystyczne ogniska w jamie brzusznej.



Postępowanie Etap 1: Otrzymywanie mydła potasowego

Przygotuj suchą długą szklaną probówkę i postępuj wg zamieszczonego niżej schematu.

Odczynnik Probówka

smalec grudka wielkości ziarna fasoli

10% roztwór KOH w metanolu 3 cm3

ogrzewanie przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie schłodzenie w strumieniu zimnej wody

woda destylowana 10 cm3

wytrząsanie w celu rozpuszczenia mydła

Etap 2: Badanie właściwości mydła sodowego

Przygotuj trzy probówki i postępuj zgodnie z poniższym schematem.

odczynnik numer probówki

1 2 3

roztwór mydła 2 cm3 2 cm3 2 cm3

1% roztwór CaCl2 0.5 cm3 - -

woda destylowana 3 cm3 - -

stały NaCl - do wytrącenia osadu -

1 M H2SO4 - - 0.5 cm3

zlać płyn znad osadu i dodać 2 cm3 wody destylowanej, mocno wytrząsnąć

ogrzewać w gorącej łaźni wodnej do rozpuszczenia osadu; ochłodzić w strumieniu zimnej wody

Obserwacje:

Wnioski:

Doświadczenie 4



Cel: Wykrywanie glicerolu

Zasada metody: Tłuszcze właściwe (triacyloglicerole) to estry alkoholu trihydroksylowego – glicerolu oraz jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych. Glicerol, podobnie jak inne alkohole wielowodorotlenowe mające grupy hydroksylowe przy sąsiednich atomach węgla, reaguje z wodorotlenkiem miedzi(II), tworząc charakterystyczny kompleks miedzi(II) o szafirowej barwie.

2NaOH + CuSO4 → Cu(OH)2↓ + Na2SO4

Rycina 18 Reakcja wykrywania glicerolu

Postępowanie: Przygotuj dwie probówki i postępuj zgodnie z zamieszczonym poniżej schematem.

odczynnik Numer probówki

1 2

7% wodny roztwór CuSO4 1 cm3 1 cm3

10% roztwór wodny NaOH 1 cm3 1 cm3


glicerol 1 cm3 -

woda destylowana - 1 cm3


Obserwacje:

Wnioski:

Doświadczenie 5



Cel: Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczach

Zasada metody: Fluorowce podlegają reakcji addycji elektrofilowej do występujących w nienasyconych kwasach tłuszczowych wiązań podwójnych między atomami węgla.

W wyniku reakcji jodu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, odczynnik Hübla (alkoholowy roztwór I2 w HgCl2) odbarwia się. Postępowanie:

Przygotuj 4 probówki postępuj zgodnie z poniższym schematem.


1 2 3 4

tłuszcz olej smalec margaryna masło

chloroform 2.0 cm3 2.0 cm3 2.0 cm3 2.0 cm3

odczynnik Hübla 0.2 cm3 0.2 cm3 0.2 cm3 0.2 cm3

zamieszaj i obserwuj probówki przez 60 sekund

Obserwacje:

Wnioski:



Doświadczenie 6

Cel: Utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych

Zasada metody: Wiązania podwójne w nienasyconych kwasach tłuszczowych łatwo ulegają utlenieniu pod wpływem utleniaczy, np. KMnO4. Dochodzi wówczas do rozerwania łańcucha węglowego w miejscu podwójnych wiązań z jednoczesnym utlenieniem końcowych atomów węgla do grup karbonylowych.

Postępowanie: Dodaj 3-4 krople oleju do suchej probówki, następnie dodaj 3 krople stężonego 12 M wodnego roztworu NaOH i 2 cm3 wody destylowanej. Ogrzewaj roztwór lekko przez kilka sekund. Dodaj 2 krople wodnego roztworu KMnO4, dokładnie wymieszaj po dodaniu każdej kropli. Zwróć uwagę na kolor roztworu. Obserwacje:

Wnioski:



Doświadczenie 7

Cel: Wykrywanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach na przykładzie witaminy E

Zasada metody: Witamina E to nazwa obejmująca grupę związków organicznych występujących w olejach roślinnych, obejmująca tokoferole i tokotienole. Różnią się one liczbą i położeniem grup metylowych. Właściwości redukcyjne nadaje im grupa hydroksylowa w pozycji 6 w pierścieniu 6-chromanolu. Metody oznaczania tokoferolu są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach chemicznych. W reakcji Emmerie-Engla tokoferol reaguje w środowisku etanolu z α,α’-bipirydyną. Powstały związek w obecności jonów żelaza(III) tworzy sól o intensywnie czerwonej barwie. Postępowanie: Przygotuj dwie krótkie probówki i postępuj zgodnie z poniższym schematem:


1 2 3

witamina E 4 krople - -

olej roślinny - 4 krople -

etanol 0.50 cm3 0.50 cm3 0.50 cm3

0,2% roztwór FeCl3 w etanololu 0.25 cm3 0.25 cm3 0.25 cm3

0,5% roztwór ,’-bipirydyny w etanolu 0.50 cm3 0.50 cm3 0.50 cm3

woda destylowana - - 4 krople

pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 5 minut

Obserwacje:

Wnioski:



Doświadczenie 7

Cel: Oznaczanie stężenia cholesterolu w surowicy krwi metodą enzymatyczną

Zasada metody: Metoda enzymatyczna służy do oznaczania całkowitego poziomu cholesterolu w surowicy przy użyciu pojedynczego odczynnika wodnego. Estry cholesterolu są hydrolizowane w celu uwolnienia cholesterolu przez hydrolazę estru cholesterolu (EC 3.1.1.13). Uwolniony cholesterol jest utleniany przez oksydazę cholesterolu (EC 1.1.3.6) do cholest-4-en-3-onu z jednoczesną syntezą nadtlenku wodoru, który reaguje z 4-aminoantypiryną i fenolem w obecności peroksydazy, tworząc chinoniminę (czerwony kolor) wykazującą maksimum absorpcji przy 500 nm.

Postępowanie Przygotuj trzy kuwety i postępuj zgodnie z poniższym schematem:

odczynnik Numer kuwety

1 2 3

surowica 0.01 cm3 - -

wzorzec - 0.01 cm3 -

woda destylowana - - 0.01 cm3

odczynnik roboczy 1.0 cm3 1.0 cm3 1.0 cm3

wymieszaj zawartość kuwet i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37C

zmierz absorpcję wzorca i badanej surowicy względem próby 3 przy długości fali



Wzorzec - roztwór cholesterolu o stężeniu 5.17 mmol/L (200 mg/dl) Masa molowa cholesterolu - 386.65 g/mol Dla celów diagnostycznych stężenie cholesterolu wyraża się w mmol/l i w mg/dl (mg%). Oblicz stężenie cholesterolu całkowitego w mmol/l i dokonaj analizy wyniku na podstawie poniższego zestawienia:

Obliczenia:

Wnioski:



Doświadczenie 8

Cel: Oznaczanie stężenia 17-ketosteroidów w surowicy krwi metodą Zimmermana-Reinchardta

Zasada metody: Reakcja Zimmermana-Reinchardta jest charakterystyczna dla 17-ketosteroidów, które posiadają grupę ketonową w pozycji C-17 i sąsiadującą z nią (w pozycji C-16) grupę metylenową. W środowisku zasadowym m-dinitrobenzen tworzy z 17-ketosteroidem związek kompleksowy o barwie czerwono-fioletowej. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia 17-ketosteroidów w badanej próbie. Postępowanie: Do dwóch suchych kuwet pomiarowych oznaczonych „P” (próba badana) i „O” (próba ślepa) dodaj kolejno:

Odczynnik Oznaczenie kuwety

P O

roztwór DHA (dihydroizoandrosteron) w etanolu 0.2 cm3 -

etanol - 0.2 cm3

roztwór m-dwunitrobenzenu w etanolu 0.2 cm3 0.2 cm3

5 M roztwór KOH w etanolu 0.2 cm3 0.2 cm3

wymieszać zawartość kuwet i pozostawić w ciemności przez 30 minut

etanol 3 cm3 3 cm3

Zmierzyć absorpcję próbki P względem próbki O przy długości fali =520 nm

Obserwacje:

Wnioski:

Biochemia Ćwiczenie 7 - biochemia-i-farmakogenomika.wum ... · Biochemia Ćwiczenie 7 Zakład...

Documents

Transcript of Biochemia Ćwiczenie 7 - biochemia-i-farmakogenomika.wum ... · Biochemia Ćwiczenie 7 Zakład...