SKRYPT Biochemia Harper

7/24/2019 SKRYPT Biochemia Harper

1/158

BIOCHEMIASkrypt dla studentw medycyny

opracowany na podstawieBiochemii Harpera

Michu

Wrocaw 2008Wersja 1.0


2/158

- -2


3/158

- -3

SPIS TRECI

Rozdzia I Aminokwasy, peptydy, biaka

1.

Aminokwasya) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) wa ciwoci fizyczne, f) waciwocichemiczne reakcje aa, g) techniki rozdziau

2. Peptydya) synteza i waciwoci wizania peptydowego, b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw,c) przykady peptydw aktywnych biologicznie

3. Biakaa) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fadowanie, d) rozdzia i okrelanie strukturybiaek, e) zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych

Rozdzia II Struktura i funkcje enzymw1.

Ogle waciwoci enzymwa) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy bdce ich

prekursorami, d) swoistodziaania enzymw, e) aktywnoenzymw, jednostki aktywnoci,f) kompartmentacja komrkowa enzymw, g) izoenzymy, h) izolacja enzymw2. Mechanizmy dziaania enzymw

a) typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach, b) mechanizm dziaania chymotrypsyny,

c) mechanizm dziaania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm dziaania transaminaz, e) katalizakwasowo zasadowa (k-z), f) enzymy wymagajce atomw metali

3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

a) oglne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynnikiwpywajce na szybkoreakcji enzymatycznej, c) wpyw stenia substratu na szybkoreakcji,d) zjawisko kooperatywnoci, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna

4. Regulacja aktywnoci enzymwa) regulacja iloci enzymu, b) regulacja aktywnoci katalitycznej enzymu

5. Znaczenie diagnostyczne pomiarw aktywnoci enzymw

a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczciej oznaczane w praktyceklinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii

Rozdzia III Transport przez bony i utleniania biologiczne1. Budowa i funkcje bon biologicznych

a) skad bon, b) funkcje bon

2. Transport przez bony biologiczne klasy biaek transportujcycha) kanay jonowe, b) przenoniki transbonowe translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki

3. Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne

a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszce protony i elektrony4. Transport atomw wodoru przez bonmitochondrialn5.

acuch oddechowy6. Fosforylacja oksydacyjna

7.

Reaktywne formy tlenu (RFT)8. Utlenianie mikrosomalne

9. Cykl kwasw trjkarboksylowych (TCA)a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powizania z innymi szlakami amfibolicznocyklu, d) regulacja cyklu

10. Kompleks oksydazy -ketokwasw

Rozdzia IV Wglowodany1. Budowa chemiczna, waciwoci i funkcje cukrw prostych i zoonych

a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy2.

Trawienie wglowodanw i jego zaburzenia3. Wchanianie i transport wglowodanw

a) transport aktywny i bierny, biaka transportujce, b) zrnicowanie tkankowe transportu, c) rola

insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydw4. Metabolizm glukozy


4/158

- -4

a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP),d) niektre zaburzenie przemian glukozy

5. Metabolizm glikogenua) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy

6. Inne szlaki metabolizmu monosacharydwa) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy

7.

Metabolizm heteroglikanwa) aminocukry heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy

8.

Regulacja przemiany wglowodanwa) zrnicowanie tkankowe przemiany wglowodanowej i integracyjna rola wtroby,b) kontrola stenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu wglowodanw

Rozdzia IV Lipidy1. Budowa chemiczna, podzia i rola tuszczw prostych i zoonych

a) funkcje tuszczw, b) podzia lipidw, c) kwasy tuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy,f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy

2. Trawienie i wchanianie lipidw3.

Transport lipidw w chonce i w osoczu

a) budowa lipoprotein, b) transport lipidw w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu

lipoproteinowego, d) rola wtroby w metabolizmie lipidw4. Tkanka tuszczowa rola w metabolizmie lipidwa) metabolizm adipocytw, b) regulacja, c) brunatna tkanka tuszczowa

5. Utlenianie kwasw tuszczowych

a) lokalizacja komrkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) -oksydacjanasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT

6. Lipogeneza synteza kwasw tuszczowych

a) lokalizacja i transport substratw, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT,d) metabolizm eikozanoidw

7. Synteza trjglicerydw

a) lokalizacja tkankowa i komrkowa, b) przebieg syntezy8. Cholesterol

a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchanianie cholesterolu, c) rwnowaga cholesterolu i

endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miadyca9. Kwasy ciowe10. Kalcyferole

11. Hormony sterydowe

Rozdzia VI Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny

1. Trawienie biaek w przewodzie pokarmowyma) enzymy i ich specyficzno, b) transport azotu pomidzy tkankami

2. Oglna przemiana aminokwasw i metabolizm grupy aminowej

a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja3. Metabolizm poszczeglnych aminokwasw

a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe,

n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile

4.

Przemiana nukleotydwa) trawienie kwasw nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydw,

c) biosynteza nukleotydw purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydwpirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydw

5. Metabolizm porfiryn

a) synteza hemu, b) rozkad hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn

Rozdzia VII Biochemia funkcjonalna tkanek

1. Endogenne regulatory procesw metabolicznycha) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaniki wtrne,b) eikozanoidy budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne

2. Gospodarka wapniowo fosforanowa w organizmie i jej regulacjaa) rola wapnia oraz biaek wicych wap, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu

nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powizania z gospodarkwapniow3. Gospodarka elazem w organizmie wchanianie, regulacja, zaburzenia przemiany


5/158

- -5

4. Biochemia krwia) biaka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytw, c) budowa i metabolizm leukocytw na

przykadzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytw, e) hemostaza osoczowa5. Biochemia wtroby

a) rola tkanki wtrobowej, b) przemiana wglowodanowa, lipidowa i azotowa w wtrobie, c) wtrobajako gruczo zewntrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji

6.

Biochemia nereka) funkcje i regulacja, b) skad i waciwoci moczu w normie i w patologii

7.

Biochemia minia) budowa i charakterystyka biaek mini, b) mechanizm skurczu minia

8. Biochemia tkanki czneja) skadniki tkanki cznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu reakcje i regulacja procesu,c) biochemia koci

9. Biochemia zmysu wzroku

a) rola i przemiany karotenoidw w organizmie czowieka,b) reakcje zachodzce w procesie fotorecepcji

Rozdzia VIII Kwasy nukleinowe i biosynteza biaek

1. Budowa i waciwoci kwasw nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny

a) elementy skadowe kwasw nukleinowych zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowaprzestrzenna i waciwoci DNA, c) budowa, waciwoci i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny,e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzajce; mutacje dynamiczne; konwersja genu,g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom,

i) transpozony; geny przeksztacone, j) motywy funkcjonalne biaek wicych siz DNA2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komrkowy i jego regulacja

a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komrkowy, e) naprawa DNA

3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacjea) transkrypcja u Procariota, b) rnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snRNA;skadanie mRNA, d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA, e) transkrypcja genw

tRNA i rRNA4. Translacja biosynteza biaek

a) kod genetyczny, b) budowa tRNA i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomw, d) etapy

translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje biaek5. Mitochondrialne DNA (mtDNA)


6/158

- -6


7/158

- -7

ROZDZIA I AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAKA

1. Aminokwasy

a)

budowa

Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, naledo dwufunkcyjnych pochodnychwglowodorw, zawierajcych w czsteczce grupkarboksyloworaz aminow. Oglnie rzecz biorc, wzgldnepooenie obu tych grup moe bydowolne, jednak zdecydowanie najwiksze znaczenie posiadaj-L-aminokwasy, ze wzgldu na to, iwchodzw skad peptydw i biaek. Okrelenie -aminokwasy oznacza, iobie gwne grupy funkcyjne przyczone sdo tego samego, I-rzdowego atomu wgla; wynika std ich wzroglny postaci: H2N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla kadego aa idecydujcym o jego waciwociach. Aa mogrwnieulegaw organizmie rozmaitym modyfikacjom, np.hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (-karboksy-Glu), metylacji, formylacji,acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym.

b) nazewnictwo i wzory

Kady aa biakowy posiada nazwsystematyczn, wynikajcz jego budowy chemicznej, jak rwniezwyczajow. W praktyce posuguje siwycznie tymi drugimi, jak rwnieich skrtami trj- orazjednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa biakowych, ich skrty oraz wzory strukturalne przedstawia poniszatabela.

Lp. Nazwa zwyczajowa i skrty Wzr strukturalny

1. glicyna, Gly, G

2. alanina, Ala, A

3. walina, Val, V

4. leucyna, Leu, L

5. izoleucyna, Ile, I

6. seryna, Ser, S

7. treonina, Thr, T

8. cysteina, Cys, C


8/158

- -8

9. metionina, Met, M

10. kwas asparaginowy, Asp, D

11. asparagina, Asn, N

12. kwas glutaminowy, Glu, E

13. glutamina, Gln, Q

14. arginina, Arg, R

15. lizyna, Lys, K

16. histydyna, His, H

17. fenyloalanina, Phe, F

18. tyrozyna, Tyr, Y

19. tryptofan, Trp, W

20. prolina, Pro,

c)

klasyfikacja

Aa klasyfikuje size wzgldu na rozmaite kryteria: Ze wzgldu na udzia w syntezie peptydw wyrnia siaa biakowe i niebiakowe. Kady aa biakowy

posiada co najmniej jeden kodon kodujcy go ukad 3 nukleotydw w mRNA; list20 aa biakowychzawiera powysza tabela. Aa niebiakowe nie szawarte w informacji genetycznej, powstajzawwyniku modyfikacji aa biakowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnoszsiwycznie do aabiakowych.


9/158

- -9

Ze wzgldu na polarnorodnika (R) aa biakowe dzieli sina: aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F, aa z R polarnym niejonizujcym: S, T, Y, C, M, Q, N, W, aa z R polarnym jonizujcym:

kwane: D, E, zasadowe: K, R, H.

Ze wzgldu na budowchemicznR: aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I, aa z R zawierajcym gruphydroksylow: S, T, Y, aa z R zawierajcym atom siarki: C, M, aa z R zawierajcym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q, aa z R zawierajcym grupy zasadowe: K, R, H, aa z R zawierajcym pierciearomatyczny: F, Y, W, H, aa o charakterze iminokwasw: P.

Ze wzgldu na zdolnoorganizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli sina endo- i egzogenne. Aa endogenne ssyntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagajdostarczania ich z

pokarmem. Naledo nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q. Aa egzogenne (niezbdne, niezastpione) nie ssyntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecnoi

odpowiednie stenie w biakach spoywczych decyduje o ich wartoci odywczej. Sto: V, L, I, F, T,

M, W, K, R, H (histydyna jest niezbdna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbdna dla dorosych).

Ze wzgldu na produkty metabolizmu wyrnia si: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorwwglowodanw oraz aa ketogenne, metabolizowane do cia ketonowych. (patrz rwniepunkt V-3)

d)

funkcje

Najwaniejszfunkcjaa jest wzajemne czenie si, w wyniku czego powstajczsteczki o wyszychpoziomach organizacji peptydy, polipeptydy oraz biaka (tworzenie wizania peptydowego omwione jestdalej). Ponadto aa biorudzia w takich procesach fizjologicznych jak: przekanictwo w ukadzie nerwowym(Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesw wzrostu komrki (Phe i Tyr substraty do syntezy T3/4), biosyntezazasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnaw

wewntrzkomrkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr).

e)

waciwoci fizyczne

W warunkach naturalnych aa majpostakrystalicznych cia staych; nie absorbujwiata widzialnego,dlatego sbezbarwne (mona je wybarwii uwidocznispecjalnymi metodami, o czym pniej).

Z wyjtkiem glicyny wszystkie -aa wykazujczynnooptyczna, tzn. ich roztwory skrcajpaszczyznwiata spolaryzowanego. Wykazujrwnieizomerioptyczn, tworzc szeregi konfiguracyjne D i L.Skadnikami biaek swycznie L-aa, co oznacza, inumeracja podstawnikw przy chiralnym atomie wgla(C) wg kryterium masy ronie przeciwnie do ruchu wskazwek zegara. Chowykazano wystpowanie D-aa(Ser, Asp), w ukadzie nerwowym ssakw, to nie wchodzone w skad peptydw i biaek; ponadto D-aawystpujw cianach komrkowych niektrych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach.

Wikszoaa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w ktrych wykazuje charakter naog obojtny. Dziki obecnoci w czsteczce zarwno grupy karboksylowej o charakterze kwanym, jak iaminowej o charakterze zasadowym, aa mogtworzywewntrzne sole wystpowaw postaci jonwobojnaczych (H3N+-CH(R)-COO-) i tworzykrysztay jonowe. Tumaczy to polarni krystalicznstrukturaa, zczego wynikajwysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkadu).

Moliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujcych przedstawione sponiej:R-CH(N

(+)H3)-COOHK1R-CH(N

(+)H3)-COO

-K2R-CH(NH2)-COO

-

(I) pH < pI (II) pI (III) pH > pIKrzywa miareczkowania takiego aa skada siz dwch sigmoidalnych czci, rozdzielonych punktemizoelektrycznym:pH = pK1+ log [II]/[I] dla pH < pI

pK2+ log [III]/[II] dla pH < pIPrzez punkt izoelektryczny (pI) rozumiemy wartopH, w ktrej aa wystpuje niemal w caoci w postaci jonuobojnaczego, nie wdruje w polu elektrycznym i cechuje siminimalnmoliwrozpuszczalnociw wodzie. pIto innymi sowy wartopH w punkcie pomidzy wartociami pK po obydwu stronach form izojonowych (jonuobojnaczego) std dla aa z R niepolarnym pI = x (pK1+ pK2).


10/158

- -10

Jeeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizujcym, sytuacja przedstawia siodmiennie dla kwasworaz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z wasnej reszty karboksylowej, nastpnie z grupybocznej, a na samym kocu z wasnej grupy aminowej; wobec tego pI oblicza sipodobnie jak dla aa z Rniepolarnym, czyli: pI = x (pK1+ pK2). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z resztykarboksylowej, nastpnie z grupy bocznej, a ostatecznie z wasnej grupy aminowej; wyraenie opisujce pIprzyjmuje zatem posta: pI = x (pK2+ pK3).

f) waciwoci chemiczne reakcje aa

Aa posiadajkilka grup funkcyjnych -aminow, -karboksyloworaz reaktywne grupy w obrbie R(niektre aa) dziki czemu mogulegawielu rozmaitym przemianom.

Reakcje grupy karboksylowej:

dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada):

H2N-CH(R)-COOH OH-H2N-CH(R)-COO

-

H2N-CH(R)-COOH + NaOH H2N-CH(R)-COONa (sl sodowa aa) tworzenie estrw (aa + alkohol):

H2N-CH(R)-COOH + R1-OH H2N-CH(R)-CO-O-R1 tworzenie amidw tworzenie bezwodnikw kwasowych

dekarboksylacja (pod wpywem ogrzewania lub enzymatycznie):H2N-CH(R)-COOH T, -CO2R-CH2-NH2

Reakcje grupy aminowej: dysocjacja i tworzenie soli:

H2N-CH(R)-COOH H+H3N

+-CH(R)-COOH

H2N-CH(R)-COOH + HClCl-H3N

+-CH(R)-COOH = HCl

.H2N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa)

estryfikacja, acylacja, N-formylacja

dezaminacja (g. enzymatyczna):

H2N-CH(R)-COOH R-CO-COOH (ketokwas) Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) estryfikacja

Grupa sulfhydrylowa (Cys):

utlenianie do cystyny: 2 Cys-SH -2HCys-S-S-Cys

do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrwkowy):CysHCOOOHHO2S-CH2-CH(NH2)-COOH

alkalizacja

Jeeli grupa aminowa znajduje siw dalekim pooeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przyC4-C6), wwczas w wyniku ogrzewania nastpuje wewntrzna cyklizacja i powstajcykliczne amidy laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, bdcy surowcem do produkcjipoliamidw.

Jak wczeniej wspomniano, aa majpostabezbarwnych cia staych. Mona jej jednak wybarwipoprzez reakcjz ninhydryn. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalajca na ich identyfikacj. Jejproduktami saldehydy poch. od aa oraz zoony barwnik, ktrego anion posiada intensywniepurpurowbarw.

Reakcja powstawania i charakterystyka wizania peptydowego patrz punkt I-2-a.


11/158

- -11

g) techniki rozdziau

Skad mieszaniny aa, np. pochodzcej z hydrolizy peptydu, mona okreliza pomocchromatografii lubelektroforezy.

Istotchromatografii jest rozdzia skadnikw midzy fazstacjonarna ruchom, spowodowany ichsilniejszym wizaniem siz jednz tych faz. Istnieje kilka rodzajw chromatografii.

Chromatografia bibuowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdynie wymaga specjalnego sprztu.Kroplroztworu zawierajcaa nanosi sina pasek bibuy (std nazwa), ktry nastpnie umieszcza siw szczelnym naczyniu, tak ikoniec paska styka siz rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wdrujewzdupaska, wcigany przez higroskopijnstrukturbibuy. Po przepywie rozpuszczalnika dokoca pasek suszy sioraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny powstajw ten sposb purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwocichromatograficzn, zaley od jego wzgldnej polarnoci aa z R niepolarnymi i dugimi wdrujnapasku dalej niaa z R krtszymi lub polarnymi. Dla kadego aa mona wyznaczyjego wzgldnruchliwo(Rf), definiowanjako stosunek odlegoci przebytej przez dany aa do odlegoci przebytejprzez czoo rozpuszczalnika.

Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli sina podziaow(partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjn(adsorption TLC = ATLC).

W PTLC wykorzystuje sirozdzia skadnikw mieszaniny pomidzy fazstacjonarnoraz ciek

ruchom, ktre dodatkowo rnisipolarnoci. W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, zarozpuszczalnik zawiera zarwno

skadniki polarne, jak i mao polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nonikiem zmieniasiskad rozpuszczalnika, gdyjego bardziej polarne skadniki wisiz polarnymi grupamihydroksylowymi celulozy wskutek tego przesuwajce siczoo rozpuszczalnika staje sistopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC sabiej polarne skadniki mieszaniny

wdrujwic dalej od polarnych podobnej wielkoci. W PTLC w fazie odwrconej polarnofaz oraz szybkowdrwki skadnikw prby s

odwrotne nipowyej faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swojpolarno. Dlatego polarne skadniki mieszaniny wdrujz czoem rozpuszczalnika, a mniejpolarne pozostajz tyu.

W ATLC wykorzystuje siadsorpcjskadnikw prby na praonym elu krzemionkowym. Fazaruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane skadniki, wspzawodniczce o miejsce wizania na elu

skadniki sabiej zwizane wymywane sw pierwszej kolejnoci. Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypenionej

ciliwym zoem, w warunkach wykluczajcych stosowanie wysokich cinie; ogranicza tomaksymalnszybkoprzepywu rozpuszczalnika, a tym samym szybkocaego procesuchromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. highperformance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej,wypenionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi czsteczkami nieciliwego wymiennika jonowego,sita molekularnego lub zoa stosowanego w chromatografii oddziaywahydrofobowych. Bywarwnieokrelana jako wysokocinieniowa, gdywartoci uywanych cinieosigajwartoci 5 10tys. psi. Do jej zalet naley znaczne skrcenie czasu rozdziau, co ogranicza dyfuzjboczni zapewnialepszy rozdzia skadnikw prby. Rozdzia aa metodHPLC uwzgldnia ich reakcjz odczynnikiemumoliwiajcych ich identyfikacji ocenilociow. Reakcjtprzeprowadza sialbo przed (pre-column) albo po (post-column) waciwej chromatografii. Przy barwieniu post-column uywa siznanej juninhydryny, ktra tworzy barwne zwizki indygowe (pochaniajce promieniowanie zzakresu wiata widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column uywa siodczynnika okrelanegoskrtem AQC, ktry wykazuje zdolnofluorescencji aa identyfikuje siwic przez owietlenielampUV.

Elektroforeza wysokonapiciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) suy do rozdzielaniamieszanin amfolitw, czyli czsteczek, ktrych wypadkowy adunek zaley od pH otoczenia.Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Prbki nanosi sina nonikzwilony buforem o odpowiednim pH i nastpnie umieszcza w polu elektrycznym. Wwczas kationywdrujdo katody, a aniony do anody, przy czym szybkowdrwki skadnikw zaley od ichadunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy czsteczkowej (odwrotnieproporcjonalnie). Po zakoczeniu rozdziau produkty uwidacznia (wybarwia) siodpowiednimodczynnikiem.

Rozdzia aa prowadzi sina bibule lub cienkowarstwowej pytce pokrytej sproszkowanceluloz, awybarwia roztworem ninhydryny.

Rozdzia polipeptydw i biaek prowadzi sina usieciowanym elu poliakrylamidowym (PAG).


12/158

- -12

Do rozdziau oligomerw nukleotydowych uywa siagarozy i PAG, do wybarwiania produktw suyzabromek etydyny (identyfikacja w wietle UV).

2. Peptydy

a)

synteza i waciwoci wizania peptydowego

Tworzenie wizania peptydowego jest najistotniejszreakcjaa z biologicznego punktu widzenia. Polegaono na kondensacji dwch aa, a dokadniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminowdrugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja czsteczki wody:

...-COOH + H2N-...-H2O...-CO-NH-...Staa rwnowagi powyszej reakcji jest przesunita na korzyhydrolizy wizania peptydowego. Jego

powstanie musi byzatem poprzedzone aktywacjgrupy karboksylowej laboratoryjnie osiga sito przezprzeksztacenie aa w chlorek kwasowy, zaw organizmach ywych aa ulega kondensacji z ATP, tworzcaktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b).

Wizanie peptydowe moe wystpowaw formie ketonowej (-CO-NH-), bdenolowej (-CO(-)=N(+)H-),ktre wzajemnie w siebie przechodz(zjawisko to okrelane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacjarezonansowa wizania peptydowego nadaje mu charakter czciowo (ok. 40%) wizania podwjnego. Ma todaleko idce konsekwencje wie sibowiem ze skrceniem dugoci i usztywnieniem wizania oraz

zablokowaniem wok niego rotacji przylegych atomw. Sprawia to, iwszystkie 4 atomy tworzce wizanie(C, O, N, H) znajdujsiw jednej paszczynie (tzn. skoplanarne) i pozbawione smoliwoci wzajemnegoruchu. To z kolei umoliwia wystpowanie izomerii geometrycznej wzgldem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E),przy czym fizjologicznie wyranie dominuje ta druga. Rotacja moe odbywasijedynie wok wizaC-Coraz N-C. Charakter tej rotacji opisujilociowo tzw. kty torsyjne: (C-C) i (N-C). Majone okrelonewartoci dla uporzdkowanych struktur II-rzdowych (por. dalej).

Wizanie peptydowe nie posiada adunku w adnym istotnym fizjologicznie pH. Pomimo to peptydy swfizjologicznym pH obdarzone adunkiem elektrycznym dziki adunkom ich grup kocowych (karboksylowej iaminowej) oraz polarnych grup R. Wartotego adunku zaley od wartoci pK i otoczenia grup dysocjujcychoraz od pH otoczenia. Podobnie jak kademu aa mona przyporzdkowapI, tak kademu peptydowi odpowiadapunkt izojonowy wartopH, przy ktrej liczba protonw zwizanych z grupami zasadowymi jest rwnaliczbie protonw odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrwnanie liczby adunkw). Wasnota dotyczyczystych peptydw, a wartojest dla danego zwizku staa i charakterystyczna.

Wizanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, totenie nadaje zawierajcymje zwizkom barwy. Pochania natomiast promieniowanie UV z zakresu = 220-230 nm.

Obecnowizania peptydowego, poczwszy od trjpeptydw, mona wykazaza pomocreakcjibiuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H2N-CO-NH-CO-NH2) najprostszego zwizku dajcego pozytywnywynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza sijdodajc do prby zasadowego roztworu siarczanu miedzi(CuSO4) wynik pozytywny objawia siintensywnie fioletowym zabarwieniem.

b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw

W kadym peptydzie wyrniamy dwa koce aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zalenie od rodzajuwystpujcej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeli chodzi o nazewnictwo, obowizuje zasada podawaniakolejnoci aa od N-koca do C-koca. Peptydy traktuje sijako acyloaminokwasy, wic kocwknazwy aa,ktrego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia sina -ylo. Jedynie aa znajdujcy sina C-kocu z

wolngrupkarboksylow zachowuje niezmienionnazw. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna.Wiele naturalnych peptydw zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wizania.

Ze wzgldu na iloreszt aa wchodzcych w skad peptydu, wyrniamy: oligopeptydy (3-10; 3 trjpeptydy, 4 tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz biaka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy)peptydy o masie


13/158

- -13

c) przykady peptydw aktywnych biologicznie

Nie tylko wielkoczsteczkowe biaka o skomplikowanej i wielorzdowej strukturze, ale prosteoligopetydy, zoone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mogpeniw organizmie wane i niezastpionefunkcje. Omwione zostanwg liczby reszt aa.

Istotnymi biologicznie dwupeptydami s: karnozyna, homokarnozyna i anseryna.

Karnozyna, czyli N-(-alanylo)histydyna, w znacznych ilociach wystpuje w miniach

szkieletowych wyszych krgowcw i czowieka. Wzmaga aktywnoATP-azy miozynowej orazchelatuje jony Cu2+i pobudza pobieranie zwizkw miedzi. Homokarnozyna, czyli N

-(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem orodkowego ukadu

nerwowego, wystpujcym w tkance mzgowej, ktrego funkcja nie jest znana. Anseryna, czyli -metylokarnozyna lub N-(3-aminopropionylo)--metylohistydyna, wystpuje w

miniach szkieletowych wyszych krgowcw, ktre odznaczajsiszybkczynnociskurczow, np.minie koczyn krlika lub minie piersiowe ptakw. Brak anseryny w miniach czowieka. Uniszych krgowcw, np. u ryb kostnoszkieletowych wystpuje ona w znacznych ilociach, wporwnaniu ze ladowilocikarnozyny.

Aktywnym trjpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) produkowana przez podwzgrze stanowi czynnikuwalniajcy tyreotropinz przedniego pata przysadki. Jej pena nazwa to:piroglutamylohistydyloprolinoamid. Skada siz reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym N-

kocowy kwas glutaminowy ulega wewntrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, zaC-kocowagrupa karboksylowa proliny wystpuje jako amid kwasowy.

Innym aktywnym trjpeptydem, penicym rolbiologicznego ukadu redox, jest glutation, czyli -glutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu czy siz Cyswizaniem nie--peptydowym wizanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przyasymetrycznym C1, lecz przy C3. Glutation wystpuje w komrkach w stosunkowo duych ilociach rzdu 5 mM. Obecny jest w postaci dwch form utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jestzazwyczaj okoo 500 razy wicej. Glutation peni rolbuforujcstanowic bufor hydrosulfidowy.Peni rwnierole odtruwajc, poniewajest przeciwutleniaczem reagujcym z nadtlenkiem wodoru inadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiajc te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu.


14/158

- -14

Do aktywnych piciopeptydw zaliczamy enkefalinmetioninowi leucynow. Pierwsza ma posta:Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga za: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu rnisizatem jedynie C-kocowymaminokwasem, uwzgldnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (, , ) gruppolipeptydw o 20-30resztach aminokwasowych stanowione naturalne peptydy opioidowe, przeciwblowe, o dziaaniupodobnym do morfiny, lecz silniejszym 18-20 razy.

Aktywnym omiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstajca z osoczowegoangiotensynogenu pod wpywem reniny wydzielanej w nerkach, a nastpnie pod wpywem dziaaniaenzymu konwertujcego. Skutkiem dziaania reniny na angiotensynogen jest powstaniedziesiciopepetydu angiotensyny I, z ktrej pod wpywem wspomnianego enzymu powstajeangiotensyna II. Ma ona struktur: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwa naczyniakrwionone i jest najsilniejszym czynnikiem podwyszajcym cinienie krwi. Pobudza kornadnerczydo syntezy aldosteronu, ktry zwiksza resorpcjzwrotnjonu Na+w nerkach, przeciwdziaajc ichutracie z moczem.

Bradykinina to dziewiciopeptyd rozszerzajcy naczynia krwionone i obniajcy cinienie krwi, dziaazatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest rwnieza uczucie blu towarzyszcezranieniu skory. Ma posta: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowakininpowstajcze specjalnych biaek, kininogenw, nalecych do 2-globulin osocza pod wpywemswoistych enzymw proteolitycznych, zwanych kalikreinami.

Dziwiciopeptydami wykazujcymi aktywnoklasycznych hormonw swazopresyna i oksytocyna,produkowane w podwzgrzu, a magazynowane w tylnym pacie przysadki. Majprawie identycznsekwencje aminokwasow, rnisijedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywoujpewne wsplne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwikszawchanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobr ADH prowadzi do

moczwki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mini gadkich macicy (przez co rozpoczyna akcjporodow) i gruczou sutkowego.

Niektre peptydy wykazujaktywnobiologicznantybiotykw. Antybiotyki peptydowe majbardzocharakterystyczncykliczna strukturi mogzawieraD-aminokwasy.


15/158

- -15

Penicylina jest produkowana przez plePenicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, ktre tworz4-czonowy piercie-laktamowy i 5-czonowy piercietiazolidynowy. Do pierwszego z nichprzyczana jest wizaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), ktra moe byrna i przez towyrniamy rne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny piercie-laktamowy zawierajcywizanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydazglikopeptydow kluczowy enzym wsyntezie cian komrkowych bakterii. W praktyce najczciej uywa sipenicyliny G.

Symbol Nazwa penicyliny Wzr R

F pentylopenicylina -CH2-CH=CH-CH2-CH3

G benzylopenicylina -CH2-C6H5

K heptylopenicylina -(CH2)6-CH3

V fenoksymetylopenicylna -CH2-O-C6H5X hydroksybenzylopenicylina -CH2-C6H4-OH

Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grupbarwnikow(kwas fenoksazonodikarboksyowy), ktra poczona jest wizaniami peptydowymi z dwomapiciopeptydami. Kocowe grupy karboksylowe obu piciopeptydw tworzmakrocyklicznepiercienie laktonowe. W piciopeptydach wystpuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznyminhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarwno w komrkach prokariotycznych, jak i

eukariotycznych, dlatego czsto jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna Dwie sispecyficznie z 2-niciowym DNA, uniemoliwiajc jego uycie jako matrycy w syntezie RNA.Obnienie stenia mRNA prowadzi do hamowania syntezy biaka. Pierciefenoksazonowyaktynomycyny interkaluje, czyli wlizguje sipomidzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiastcykliczne polipeptydy wystajjeden ponad, a drugi pod piercieniem fenoksazonowym Symetriaaktynomycyny D dokadnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto

aktynomycyna D ma dziaanie cytostatyczne, czyli hamuje podzia komrek, w tym komrek szybkodzielcych si, dlatego znalaza zastosowanie w leczeniu niektrych nowotworw.

Walinomycyna ma strukturcykliczn, utworzonz aminokwasw i hydroksykwasw poczonych naprzemian wizaniami estrowymi i peptydowymi. Skada siz trzykrotnie powtrzonego elementu, wskad ktrego wchodzreszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny.

Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nonikowym, pod wpywem ktrego bonybiologiczne stajsiprzepuszczalne dla jonu K+. Organizmy znajdujce sipod wpywem


16/158

- -16

antybiotykw jonoforowych pozbawione smoliwoci kontroli nad wymianskadnikw zotoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wie jon K+z 6 atomami tlenu reszt walin centralnejprzestrzeni czsteczki i jako nonik przenosi je na drugstronbony.

Gramicydyna S jest cyklicznym dziesiciopeptydem, w strukturze ktrego wystpuj2 reszty D-fenyloalaniny.

Gramicydyna A jest rwniepolipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15naprzemiennie wystpujcych reszt L- i D-aminokwasowych, ktry na N-kocu posiada grupformylow. Przyjmuje struktur-helisy. Poprzez N-formylowe koce dwa takie polipeptydy czsi,tworzc dimeryczny, funkcjonalny kana jonowy dla kationw jednowartociowych, np. Na+, lecz niedla dwuwartociowych. Kana ten spontanicznie otwiera sii zamyka, przepuszczajc w cigu sekundyponad 10

7kationw. Por tego kanau wycielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a

hydrofobowe acuchy boczne ustawione sna obwodzie kanau. Uoenie to umoliwiajzestawionenaprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe.

3. Biaka

a) klasyfikacja

Ze wzgldu na ksztat czsteczki i rozpuszczalnow wodzie biaka dzieli sina: globularne o wspczynnikach osiowych 3-4, a wic w przyblieniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie,

fibrylarne o wspczynnikach osiowych > 10 (ksztat wyduony), nierozpuszczalne w wodzie. Ze wzgldu na stan skupienia dzieli sibiaka na: stae (kolagen, elastyna), ppynne

(cytoplazmatyczne) oraz pynne (biaka osocza).

Ze wzgldu na budowczsteczki obecnododatkowych skadnikw na: biaka proste (proteiny) zbudowane wycznie z aa i nie posiadajce dodatkowych elementw, m. in.:

albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny,

biaka zoone (proteidy) zawierajce dodatkowe skadniki niebiakowe, np. czsteczkiwglowodanw (glikoproteiny), lipidw (lipoproteiny), resztkwasu fosforowego (fosfoproteiny), atommetalu (metaloproteiny), czsteczkbarwnika (chromoproteiny) lub zwizane z kwasem nukleinowym(nukleoproteiny).

Ze wzgldu na penione w organizmie funkcje:

enzymatyczne np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT),

cyklooksygenaza (COX), hormonalne np. hormony przedniego pata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony

trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH), strukturalne np. kolagen, elastyna, keratyna, transportowe np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC),

zapasowe np. mioglobina, ferrytyna, odpornociowe np. immunoglobuliny, biaka ukadu dopeniacza (C), biaka ostrej fazy, kurczliwe lub porednio biorce udzia w ruchu np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina, toksyny np. tcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery. Biaka pokarmowe dzieli size wzgldu na przydatnodla organizmu na: penowartociowe

zawierajce aa egzogenne oraz niepenowartociowe zoone z aa endogennych.


17/158

- -17

b) identyfikacja

Obecnobiaka w rodowisku mona wykazaza pomockilku reakcji: Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos ty, proteina biako) polega na dziaaniu na prb

stonym kwasem azotowym (HNO3). Jeeli w prbie tej znajduje sibiako zawierajce aaaromatyczne, to ulegnone reakcji nitrowania, dajc produkty dysocjujce do to-pomaraczowego

anionu, np.:Tyr + HNO3T, -H2O3-nitrozotyrozyna

Reakcja biuretowa bierze swojnazwod biuretu (dwumocznika: H2N-CO-NH-CO-NH2) najprostszego zwizku dajcego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecnoci wizaniapeptydowego, poczwszy od trjpeptydw wzwy. Przeprowadza sijdodajc do prby zasadowegoroztworu siarczanu miedzi (CuSO4). Jeeli w prbie znajduje sizwizek zawierajcy dwa ssiadujcewizania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) poczenie kompleksowe o intensywniefioletowym zabarwieniu. Naley jednak zaznaczy, ipozytywne miano nie potwierdza obecnoci wprbie zwizkw aminokwasowych.

Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie biaek zawierajcych wizania dwusiaczkowe (S-S).Przeprowadza sijw rodowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli oowiu, np. octanu.Pod wpywem wysokiego pH nastpuje rozpad wspomnianych wizaz uwolnieniem anionuwodorosiarczkowego:

Cys-S-S-Cys + H2O + OH-2 CH3COCOOH + 2 NH3+ HS-+ S ,ktry czy siz kationem oowiu, prowadzc do strcenia czarnego osadu siarczku oowiu:

Pb(CH3COO)2+ HS-CH3COOH + CH3COO

-+ PbS .

c) poziomy organizacji i fadowanie

Biaka naledo najbardziej zoonych zwizkw chemicznych wystpujcych w przyrodzie. Ich budowawykazuje pewne poziomy organizacji, std dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojcie struktury I, II, III iIV-rzdowej. Metody laboratoryjne okrelania kolejnych struktur nieznanych biaek opisane zostandalej.

Przez strukturI-rzdowrozumiemy liczb, budowi kolejno(sekwencj) poczonych ze sobreszt aa tworzcych dane biako, wraz ze wskazaniem miejsc wystpowania wizadwusiarczkowych(S-S). Struktura I-rzdowa opisuje wic konfiguracjpeptydu. Przez konfiguracjrozumiemypowizania geometryczne midzy danym zbiorem atomw, ktrych zmiana wie siz zerwaniem iponownym uformowaniem wizakowalencyjnych.

Struktura II-rzdowa okrela sposb skrcenia acucha polipeptydowego, czyli jego konformacj.Konformacja to trjwymiarowa architektura czsteczki, inaczej przestrzenne powizania midzyatomami; moe ona ulec zmianie przez reorganizacjstabilizujcych jwizaniekowalencyjnych(wizania kowalencyjne zostajzachowane por. wyej). Czsteczka biaka o okrelonej konfiguracji(strukturze I-rz.), wobec moliwoci swobodnej rotacji wok duej czci (ok. 2/3) wizagwnegoacucha polipeptydowego, moe posiadanieproporcjonalnie duliczbmoliwych konformacji,chozwykle tylko niektre z nich umoliwiajczsteczce penienie funkcji biologicznych. Liczba taograniczona jest czciowo podwjnym charakterem wizania peptydowego, jak rwnierodzajem iksztatem grup bocznych (R) aa. Kty rotacji i muszwic przyjmowatakie kombinacje wartoci,aby wykluczyprzestrzenne konflikty midzy poszczeglnymi atomami czsteczki, a ich znajomopozwala na jednoznaczne okrelenie konformacji wszystkich atomw g. acucha polipeptydowego.Dozwolone wartoci obejmujkonformacje regularne -helis, -kartk, zwrot , superheliskolagenu oraz nieregularne ptle i zwoje.

Oglnie rzecz biorc, kada helisa (zwj) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skrcajcy sirwnomiernie wok kadego atomu C. Istniejrne typy helis, rnice simidzy sobrozmiaramii kierunkiem skrtu. Budowhelisy opisuje siwic przez podanie: liczby reszt aa przypadajcych najeden skrt (n) oraz skoku ruby (p) lub odlegoci midzy ssiednimi skrtami. Helisy polipeptydowezabudowane z aa chiralnych srwniechiralne, tzn. prawo- bdlewoskrtne, przy czym wnaturalnych biakach wystpujniemal wycznie te pierwsze. Taki kierunek skrtu zdeterminowanyjest przez fakt budowy czsteczki z enancjomerw L: w wyniku przycigania siatomw wizaniapeptydowego lejsza grupa N-H zblia siw stronciszej grupy C-O wanie w prawo.-helisa cechuje sikorzystnymi wartociami ktw rotacji oraz ukadem stabilizujcych wizawodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 50 (r. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm.Rwnowane atomy z ssiednich reszt acucha gwnego oddalone so 0,15 nm (mierzone wzduosi). Grupy R skierowane sna zewntrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. Wewntrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dziki maksymalnej liczbie wizawodorowychjest to konformacja o najniszej energii i tym samym najwikszej stabilnoci, dlatego formuje siona


18/158

- -18

spontanicznie. Wizania wodorowe wystpujmidzy atomem N wizania peptydowego oraz atomemO wchodzcym w skad czwartego kolejnego wizania peptydowego tego samego acucha (wizaniawewntrzacuchowe); majone optymalnodlego0,28 nm. Dodatkowfunkcjpeniwizaniavan der Waalsa (por. dalej), zwaszcza dziaajce poprzecznie do osi helisy, pomidzy ciasnoupakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie moe uformowawizaniawodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy w innym miejscu wytwarza on zgicie.

-helisy wystpujzwykle na powierzchni czsteczek biaek, chociamogbyrwnieczciowo lubcakowicie schowane w ich wntrzu. Szczeglny przypadek stanowihelisy amfipatyczne, w ktrych aapolarne i niepolarne zmieniajsize sobco 3 4 reszty w ten sposb mogone kontaktowasizerodowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne wystpujm.in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w

kinazie biakowej regulowanej kalmodulin. Struktura nazywana jest inaczej -kartk, -harmonijklub pofadowanym arkuszem. Nazwy te

odnoszsido jej ksztatu, obserwowanego wzdukrawdzi Ci zwizane z nimi R wystpujnaprzemiennie nieco powyej i poniej paszczyzny gwnego acucha polipeptydowegom ktry jestniemal w peni rozcignity. -kartka posiada powtarzajce sico do wartoci kty i oraz jeststabilizowana maksymalnilociwizawodorowych. Te jednak, w przeciwiestwie do -helisy,majcharakter midzyacuchowy wystpujmidzy atomami N i O wizapeptydowychssiadujcych pasm acuchw peptydowych; w ich tworzenie zaangaowane sodcinki o dugoci 5

10 aa z rnych regionw struktury I-rz.Struktury mogbyrwnolege lub antyrwnolege (przeciwrwnolege, przeciwbiene); wpierwszym przypadku ssiednie acuchy peptydowe biegnw tym samym kierunku, w drugim za wprzeciwnym. Z wyjtkiem pasm granicznych tworzsiwszystkie moliwe wizania wodorowe. Wstrukturze antyrwnolegej pary wizawodorowych wystpujna przemian raz blisko, a raz daleko odsiebie, a zorientowane smniej wicej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturzerwnolegej wizania wodorowe srozmieszczone rwnomiernie, ale lewzgldem siebie ukonie i wzmiennych kierunkach. Powszechne sregiony poczenia struktur rwnolegych i antyrwnolegych,wiele acuchw moe tewystpowaw obrbie jednej kartki (chociastruktury rwnolege zoone z< 5 acuchw snieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasmaharmonijki szwinite prawoskrtnie, tworzc centralny rdzewielu biaek globularnych.

Zwrot (zagicie , -skrt) to ukad umoliwiajcy zmiankierunku przebiegu struktury , czstoczcy koce dwch przylegych pasm antyrwnolegych. Zwrot umoliwiajcy zmiankierunku

acucha o 180o

skada siz 4 aa, z czego pierwszy tworzy wizania wodorowe z czwartym. Ponadtoczsto zawiera glicyn z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolin gdyok. 6 % jej wizapeptydowych posiada konfiguracjcis. Jest to struktura regularna, czsto obecna na powierzchni biaek.

W typowym biaku globularnym jedynie ok. poowa aa wchodzi w skad struktur i , podczas gdyreszta wystpuje w postaci struktur nieregularnych, tj. ptli i zwojw. Szczeglnie dotyczy to obukocw (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary ptli warunkujgwnie waciwoci powierzchniczsteczek biaek. Bezadna struktura wie siz gitkocii atwocidopasowania, przy czym wieleobszarw bezadnych ulega organizacji pod wpywem specyficznych ligandw; z tego powodu regionynieregularne czsto wystpujw miejscach interakcji czsteczek biaek z innymi czsteczkami(ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymw, czy na powierzchni biaek odpornociowych,gdzie ksztatujobszary oddziaywania przeciwciaa z antygenem. Ptle o ksztacie spinki do woswspinajssiadujce antyrwnolege struktury .

Struktury II-rz. mogtworzymotywy naddrugorzdowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwjny,

motyw czy -spink(antyrwnolege pasma zespolone krtkptl). Struktura III-rz. okrela przestrzenne powizania midzy elementami struktury II-rz. (helisami,

kartkami, innymi), jak rwniewzajemne oddziaywania midzy domenami, sposoby fadowania orazoddziaywania stabilizujce takie uoenie.

Struktura III-rz. stabilizowana jest przez rnorodne rodzaje wizaniekowalencyjnych: wizania wodorowe wytwarzane przez polarne R aa

oddziaywania hydrofobowe wystpujpomidzy niepolarnymi R aa oddziaywania elektrostatyczne (mostki solne) tworzsimidzy przeciwnie naadowanymi

grupami, np. kocami N i C peptydw bdR polarnymi jonizujcymi (np. Lys i Asp) siy van der Waalsa sbardzo sabe i dziaajjedynie na niewielkie odlegoci, rwne sumie

promieni van der Waalsa atomw pomidzy ktrymi wystpujBiaka mogbydodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wizaniami dwusiarczkowymi (S-S);rozwizanie takie wystpuje w niektrych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy

biakach strukturalnych (keratyna).


19/158

- -19

Struktury II-rz. i motywy naddrugorzdowe, zwaszcza w duych biakach, mogbyzorganizowane wpoczone ze sobfragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnieniezalene jednostka fadowania biaka, zwizana z nim jednak wizaniami kowalencyjnymi. Domenareprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadtointeresujce jest, isekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny mona spotkaw innych,podobnych domenach tego samego biaka lub w innych biakach. Domeny czsto nadajbiakom w

ktrych wystpujzdolnopenienia specyficznych funkcji, np. wizania swoistych ligandw(nukleotydw, polisacharydw). Przestrzemidzy domenami wyznacza czsto centrum aktywnebiaka, a powierzchnia kontaktu midzy nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmwallosterycznych.

Zaburzenia struktury II/III-rz. biaek stanowiistotchorb prionowych (TSE) zmiany w konformacjibiaek powodujzastpienie -helisy przez -kartkoraz wystpienie opornoci na proteolizenzymatyczn.

Struktura IV-rz. okrelona jest w przypadku biaek oligomerycznych, tj. zoonych z 2 acuchwpolipeptydowych zwanych protomerami lub podjednostkami poczonych siaminiekowalencyjnymi. Opisuje ona sposb uoenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze soboddziaywujcych acuchw. Cechuje siponadto najwikszzoonoci, a zarazem jest najsabiejpoznana.Ze wzgldu na liczbpodjednostek wyrniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery

skadajsiz kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery z rnych; rneprotomery biaek heterooligomerycznych penizazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne,regulacyjne czy rozpoznajce ligandy. Waciwoci chemiczno-biologiczne biaek podjednostkowychzaleod przestrzennej orientacji ich podjednostek.

W odpowiednich warunkach mona pozbawibiako struktur wyszych rzdw. Denaturacja polega na zniszczeniu wizaniekowalencyjnych biaka, a tym samym na trwaej utracie

jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywnoci biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpywem tzw.czynnikw denaturujcych, do ktrych zaliczamy: wysoktemperatur, silnie polarne (kwane lubzasadowe) rodowisko oraz okrelone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metalicikich (gwnie oowiu, rtci i srebra), SDS.

W przeciwiestwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci biakapod wpywem dziaania soli metali lekkich, np. NaCl, NH4Cl. Sole te, dziki waciwociomhigroskopijnym, wii pozbawiajbiako pewnej iloci wody, wskutek czego naturalny ppynny zol

biakowy zmienia postana pstay el. Dodanie do skoagulowanego biaka wody powodujeprzywrcenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa sipeptyzacj.

Natywne biaka nie majpostaci prostych acuchw, lecz sw skomplikowany sposb zwinite lub inaczej mwic sfadowane. Fadowanie biaek nie odbywa sina drodze prb i bdw, o czymwiadczy chociaby paradoks Levinthala czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej strukturysfadowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byby teoretycznie duszy niszacowany wiekwszechwiata. Oczywiste jest zatem, ifadowanie biaek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowanyproces.

Proces fadowania skada siz kilku faz: formowania krtkich fragmentw struktury i ich wzrostu uformowania domen (w biakach wielodomenowych poczonych w tzw. stopionglobul) zmiankonformacyjnych nadajcych strukturIII-rz.osignicia natywnej struktury (na tym koczy sifadowanie biaek monomerycznych) ew. czenia podjednostek i formowania oligomerw.

acuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych biaek spontanicznie (bez zewntrznej interwencji,same z siebie) zwijajsipowtrnie w warunkach in vitro, cznie z przywrceniem aktywnocibiologicznej, chotrwa to o wiele duej niw warunkach in vivo; zjawisko to okrela simianemrenaturacji.

In vivo procesy fadowania przebiegajo wiele szybciej i swyranie ukierunkowane, m. in. dzikiobecnoci specyficznych enzymw: izomeraza dwusiarczkowa biaek (ang. protein disulphide isomerase PDI) uatwia przetasowanie

wizadwusiarczkowych (S-S) przez zwikszenie szybkoci wzajemnej wymiany mostkw S-S, izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase PPI) katalizuje

izomeryzacjwizapeptydowych X-Pro z formy trans do cis (przeksztaceniu ulega ok. 10 %wiza),

chaperony (biaka opiekucze, m. in. tzw. biaka szoku cieplnego ang. heat shock protein = Hsp)przyspieszajproces fadowania przez zapewnienie biaku ochronnego rodowiska oraz preferencjeprzemian powstrzymujcych niewaciwe interakcje midzy powierzchniami komplementarnymi iuatwiajcych waciwe interakcje.


20/158

- -20

d) rozdzia i okrelanie struktury biaek

Aby mc badastrukturbiaek, naley je wpierw wyizolowaw stanie czystym, tzn. pozbawizanieczyszczei oddzieliod innych biaek. Do najczciej stosowanych technik oczyszczania i izolacjibiaek nale:

Chromatografia jonowymienna i HVE stosowane sdo aa i polipeptydw; podstawrozdziau jest

adunek elektryczny. Filtracja elowa z uyciem wysokich ste(1-4M) kwasu mrwkowego lub octowego stosowana do

wielkoczsteczkowych hydrofobowych peptydw; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie iwymywanie peptydw z porw sita molekularnego (Sephadex).

HPLC w odwrconym ukadzie faz (niepolarny nonik + polarny rozpuszczalnik) stosowana j.w.,czasem w poczeniu z poprzednio omwiona metod do oczyszczania zoonych mieszaninpeptydw, otrzymywanych przez czciowe trawienie biaek.

HVE na sitach molekularnych (sczenie molekularne) technicznie przeprowadza sina skrobii,agarozie lub elu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje sidopolipeptydw i polinukleotydw. Prbkw buforze nanosi sina pytklub do rurki, rozdzielaelektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje peptydy bkitem brylantowym Coomassie lub solamisrebra, zapolinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje siodmiantej metody wwarunkach denaturujcych (mocznik, SDS) acuch peptydowy ulega wwczas rozprostowaniu,

dodatkowo wic na powierzchni adunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkoci (waciwie doiloci wizapeptydowych), wic rozdzia elektroforetyczny opiera situ porednio na masieczsteczkowej. MetodPAGE-SDS stosuje siwic do okrelania masy czsteczkowe biaek przezporwnanie ich ruchliwoci elektroforetycznej z ruchliwociami wzorcw o znanych masach.

Po uzyskaniu czystego biaka mona przystpido stopniowego okrelania jego struktury. Wiele biaekskada siz 2 acuchw polipeptydowych poczonych wizaniami niekowalencyjnymi lub przezmostki dwusiarczkowe, ktre muszbyrozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwrbadanego biaka traktuje siczynnikami denaturujcymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), ktrerozbijajwizania wodorowe i niektre niekowalencyjne oraz czynnikami redukujcymi lubutleniajcymi, ktre pozbawiajpeptydy mostkw dwusiarczkowych czynniki utleniajce, np. kwasnadmrwkowy (HCOOOH), utleniajreszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO3

-), natomiast

czynniki redukujce, np. 2-merkaptoetanol, redukujje do cysteiny (Cys-SH). Polipeptydy wielkoczsteczkowe rozbija si, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o dugoci

20-60 aa. Do tego celu uywa sinastpujcych odczynnikw (w nawiasach podano rodzaj rozbijanegowizania): bromocyjan CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X),hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), agodnahydroliza kwana (Asp-Pro).

Przed rozpoczciem sekwencjonowania biaka okrela sijego skad aminokwasowy poprzez poddaniego kwanej hydrolizie (6M HCl, 11oC, 1-4 doby), a nastpnie rozdzielenie i identyfikacjwolnych aametodHPLC, chromatografii jonowymiennej bdelektroforetyczn. Wadtakiego postpowania jestzniszczenie struktury wielu aa przez agresywne rodowisko cakowicie niszczone sTrp i Cys,czciowo Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wi zania Val-Val,Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazujopornona ten rodzaj hydrolizy. Aby tego unikn, wykonuje sikilka zabiegw:

Cys utlenia sido kwasu cysteinowego opornego na dziaanie kwanego rodowiska, obecnoTrp oznacza sipo hydrolizie zasadowej (ktra za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys),

okrela sitempo spadku poziomw Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje sido czasu 0, obecnoaa rozgazionych oznacza sipo 96 h hydrolizy, obecnoaa kwanych oraz ich amidw okrela sicznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn). Po okreleniu procentowego udziau poszczeglnych aa w budowie badanego biaka, mona przystpi

do jego sekwencjonowania, czyli okrelenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod: Najstarsze metody sekwencjnowania opierajsina przeprowadzeniu N-kocowego aa peptydu w

okrelonpochodn, hydrolizpeptydu oraz identyfikacjpowstaej pochodnej aa. Taka jest m. in. ideametody Sangera uywa siw niej odczynnika Sangera DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), ktryreaguje wycznie z N-kocowymi resztami aa, po czym prowadzi sihydrolizi identyfikacj.

Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikacjN-kocowychreszt aa peptydw w postaci pochodnych. Wykorzystuje situ odczynnik Edmana fenyloizotiocyjanian, ktry reagujc z kocem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy,ktry w rodowisku kwanym i obecnoci niehydroksylowych rozpuszczalnikw (np. nitrometanu)rozpada sina fenylotiohydantoinowpochodnaa oraz peptyd skrcony o jeden N-kocowy aa. Wprzeciwiestwie do metody Sangera, po usuniciu N-kocowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.


21/158

- -21

Pochodne aa identyfikuje simetodHPLC, po czym opisany cykl powtarza si30 80 x w jednymcigu operacyjnym.

Oznaczenie struktury I-rz. wszystkich peptydw otrzymanych ze wstpnej hydrolizy prbki pozostawiado wyjanienia jedynie kolejnoich uoenia. Dlatego naley otrzymai zsekwencjonowadodatkowepeptydy o nakadajcych siresztach N i C-kocowych (techniki rozrywajce polipeptyd w innychmiejscach).

W celu oznaczenia pooenia wizadwusiarczkowych rozdziela sizarwno peptydy pochodzce zhydrolizy prbki pierwotnej, jak i zmodyfikowane metodami utleniania / redukcji za pomocchromatografii dwuwymiarowej lub chromatografii i elektroforezy.

Metoda Maxima i Gilberta prezentuje inne podejcie do problemu opiera sina szybkimsekwencjonowaniu DNA genu kodujcego dane biako i okreleniu sekwencji aa na podstawie tabelikodu genetycznego. Jej wadjest brak ujawniania miejsc wizadwusiarczkowych oraz obecnociposttranslacyjnych modyfikacji aa (hydroksylacja, metylacja, fosforylacja, estryfikacja, izoprenylacja).Stosowana jest w identyfikacji labilnych pre- lub prepropeptydw istotnych w katalizie lub w badaniu

kierowania peptydw do okrelonych organelli komrkowych. Alternatywnym sposobem sekwencjonowania krtkich (do ok. 25 aa) peptydw jest szybkie

bombardowanie atomowe (FAB) ze spektroskopimasow(MS) w dwch poczonychspektrometrach. Szybkie bombardowanie atomami gazw szlachetnych (Ar lub Xe) daje w efekcie

kationy peptydw. W pierwszym spektrometrze oddzielane szanieczyszczenia, po czym jony

peptydw zderzajsiw komorze z atomami He, ulegajc fragmentacji do wielu jonw ozmniejszajcych sirozmiarach, ktrych masy czsteczkowe oznaczane sw drugim spektrometrze porwnanie jonw z rosncymi masami pozwala na identyfikacjwszystkich reszt aa i ich kolejnoci.Metoda FAB-MS umoliwia identyfikacjaa zmodyfikowanych posttranslacyjnie oraz wprzeciwiestwie do metody Edmana umoliwia sekwencjonowanie peptydw z zablokowanym (np.zacylowanym) kocem aminowym.

Trjwymiarowstrukturbiaek mona badametodami krystalografii rentgenowskiej oraz MRS. Krystalografia rentgenowska ujawnia statyczny obraz biaka krystalicznego. Wymaga duych,

doskonale uporzdkowanych krysztaw biaka, zawierajcych szereg powtarzajcych siregularnieidentycznych czsteczek, silnie zaamujcych promienie X. Obraz powstay w wyniku zaamaniawizki promieni na krysztale biaka pozwala na odtworzenie struktury pojedynczej czsteczki.Krysztay biaek hoduje sitechnikwiszcej kropli, po czym eksponuje na monochromatyczne (ojednej, staej i okrelonej dugoci fali) promieniowanie X i obraza w celu uzyskania wszystkich

moliwych odwzorowadyfrakcyjnych. Promienie X swwczas rozpraszane i tworzobraz zalenyod gstoci elektronowej w rnych czciach biaka. Maksima dyfrakcji sanalizowane komputerowo,aby na tej podstawie skonstruowamapy gstoci elektronowej (amplitudy i fazy). Reprezentujoneserirwnolegych przekrojw przez biako, co z kolei pozwala na konstrukcjtrjwymiarowych mapgstoci elektronowej i dalej model fizyczny lub przyblione dopasowanie struktury I-rz. Dokadnewyznaczenie pooeatomw moliwe jest jedynie po zsekwencjonowaniu badanego biaka.

Spektroskopia jdrowego rezonansu magnetycznego (ang. magnetic resonance spectroscopy = MRS)jest technikdostarczajcinformacji o strukturze biaka w roztworze. Parametrami bezporedniomierzonymi jest otoczenie chemiczne jder atomowych wykazujcych moment magnetyczny albo spin(gwnie

1H), co dostarcza informacji o odlegoci atomw w czsteczce przesuniciach

chemicznych. Dwuwymiarowa MRS analizuje skomplikowane widma otrzymywane z biaekzmieniajcych siw czasie, dlatego jest wykorzystywana do badania tworzenia struktur przejciowychw procesie zwijania acuchw biakowych.

Do metod badania struktury IV-rz. biaek i oznaczania ich mas czsteczkowych zaliczamy m. in.: Ultrawirowanie analityczne pomiar szybkoci sedymentacji biaka przy wirowaniu z przyspieszeniem

ktowym 10 tys. x wikszym niprzyspieszenie ziemskie. Wirowanie w gradiencie gstoci (zwykle 5 20 % roztworu zbuforowanej sacharozy) porwnanie

poziomu biaka w prbwce w odniesieniu do poziomw biaek o znanych masach czsteczkowychprzy wirowaniu w powyszych warunkach.

Filtracja elowa masczsteczkownieznanego biaka oblicza siz porwnania jego objtocielucyjnej z analogicznymi objtociami biaek wzorcowych.

PAGE rozdzia biaek w elach o zmiennej porowatoci i wykrywanie bkitem brylantowym lubsolami srebra. PAGE-SDS stosowane jest do okrelania rozmiarw podjednostek oligomerw.

Mikrofotografia elektronowa obrazowanie kompleksw makromolekularnych wirusw,

kompleksw enzymatycznych czy oligomerw.


22/158

- -22

e) zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych

Biaka fibrylarne cechujsim. in. wyduonym ksztatem i brakiem rozpuszczalnoci w wodzie.Penione funkcje biaek strukturalnych w skrze, tkance cznej oraz rnego rodzaju wknach(wosy, jedwab, wena). Czsto zawierajatypowe sekwencje aa lub zmodyfikowane aa, co przekadasina strukturII i III-rz. i konsekwentnie dalej na waciwoci mechaniczne. Przykadami biaek

fibrylarnych s: kolagen (patrz punkt VII-9-b), elastyna (VII-8-a), miozyna (VII-7-a), keratyna,fibroina. Keratyna nie jest pojedynczym biakiem, lecz carodzin, wrd ktrej mona wyrnitzw. keratyny

twarde i mikkie. Oglnie cechujsione wysokodpornocina czynniki fizyczne, chemiczne idziaanie proteaz oraz wysokzawartociaa zawierajcych siark Cys (17%) i Met(0,5%).Wykazano istnienie ok. 10 izoform keratyn twardych, obecnych w rozmaitych wytworachnaskrka zwierzt paznokciach, pirach, rogach, wenie i innych. W ludzkich komrkachnabonkowych zidentyfikowano ok. 20 izoform cytokeratyn (40-70 kDa), nalecych do keratynmikkich. Cytokeratyny stanowinajwikszi najbardziej zrnicowangrupfilamentw porednich,wchodzcw skad cytoszkieletu komrkowego. Podjednostki keratyn zbudowane swedugwsplnego planu wyrniamy w nich -helisowdomencentralnoraz globularne domeny N i C-kocowe. Ta pierwsza posiada wysoce konserwatywny charakter i skada siz 310-315 reszt aa, zadomeny terminalne liczod 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn, asocjujc w struktury wyszego

rzdu, tworzkolejno: dimery protofilamenty protofibrylefilamenty porednie. Wprzeciwiestwie do cytokeratyn, keratyny twarde sstrukturami dwufazowymi, w ktrych wknakeratyny szatopione w bezpostaciowej macierzy zbudowanej z biaek o duej zawartoci siarki.Enzymy proteolityczne zdolne do hydrolizy keratyny to wystpujce u krgowcw kaspazy degradujcecytokeratyny (udzia w procesie apoptozy) lub syntetyzowane przez mikroorganizmy keratynazy.

Fibroina stanowi gwne biako jedwabiu. 85% jej skadu stanowi Gly, wystpujca na zmianz Ser lubAla. acuchy polipeptydowe formujszereg rozcignitych antyrwnolegych pasm , tak igrupyboczne (R) Gly wyaniajsiz jednej powierzchni, zaSer lub Ala z drugiej. W ten sposb ukadstabilizowany jest nie przez wizania wodorowe, lecz przez oddziaywania hydrofobowe. Wtrcone copewien odcinek aa z duym R (Val, Tyr) zaburzajregularnstrukturi zwikszajgitkocaocikonstrukcji.

Jednz grup globularnych biaek zoonych schromoproteiny, reprezentowane w ludzkim ustroju g.

przez biaka hemowe nazwane tak od doczonego do acucha peptydowego barwnika hemu. Rolabiaek hemowych polega na transporcie i magazynowaniu tlenu oraz transporcie elektronw. Ichzdolnowizania tlenu uwarunkowana jest obecnocijonu Fe2+, zlokalizowanego w centrum grupyhemowej, stanowicej grupprostetycznhemoglobiny i mioglobiny. Grupa hemowa wystpujerwniew wielu enzymach cytochromach, katalazie (CT), syntazie tlenku azotu (NOS), 2,3-dioksygenazie tryptofanowej i innych.

Hem jest cyklicznym tetrapirolem skada siz 4 grup pirolowych poczonych 4 mostkamimetinowymi midzy atomami C(ukad porfiny), zaprzy atomach Cobecne scharakterystycznepodstawniki. Ukad wielu sprzonych wizapodwjnych nadaje czsteczce paski ksztat (piercieniepirolowe, atomy C mostkw metinowych i jon Fe2+lepraktycznie w jednej paszczynie) orazwarunkuje pochanianie wiata w niskim zakresie wiata widzialnego, dziki czemu ma ona a przezto rwnieHGB i krew barwczerwon. Przy atomach Cwystpujgrupy: metylowe (M wpozycjach 1, 3, 5, 8), winylowe (V 2 i 4) oraz propionowe (P 6 i 7). Te ostatnie, stanowic jedyne

polarne acuchy boczne hemu, szwrcone w stronpowierzchni hemoprotein. Jak wczeniejwspomniano, jon elaza zajmuje centralne miejsce w czsteczce hemu, wic sidwoma wizaniamikowalencyjnymi oraz dwoma koordynacyjnymi z czterema atomami N tetrapirolu. Pozostae (5. i 6.)wizania koordynacyjne jonu elaza leprostopadle do paszczyzny porfiny odpowiednio nad i podukadem tetrapirolu.

Funkcjmioglobiny (MGB skrt nieformalny) jest magazynowanie tlenu w miniach czerwonych.Jej czsteczka zoona jest z pojedynczego acucha polipeptydowego (masa ok. 17 kDa), zoonego ze153 reszt aa. Zewntrzna czczsteczki jest polarna, zawewntrzna niepolarna, co ma zwizek zrozpuszczalnociw wodzie. Wyjtkowo we wntrzu czsteczki znajdujsidwa aa polarne His wice gruphemowdo czci polipeptydowej. Czsteczka mioglobiny ma ksztat w przyblieniukulisty, pomimo nieregularnej i niesymetrycznej budowy. Poszczeglne -helisy, struktury i ptleokrela siza pomocliter i cyfr. Aok. 75 % acucha wystpuje w formie 8 prawoskrtnych -helis,o dugociach 7 20 reszt aa, oznaczonych literami od A do H, poczwszy od N-koca. Fragmentymidzyhelikalne oznacza siliterami dwch odcinkw helikalnych przez nie poczonych. Pojedyncze


23/158

- -23

reszty aa oznacza sipodajc literoznaczajchelisoraz liczb pozycjaa w danej helisie,poczwszy od N-koca. Aa zajmujce odlege miejsca w strukturze I-rz. mogw wyniku skomplikowanego fadowania

znalesiblisko siebie w strukturze III-rz., np. His F8 i His E7. Informacja zawarta w strukturzeI-rz. apomioglobiny jest odpowiedzialna za prawidowe i swoiste upakowanie biaka w obecnocihemu. Grupa hemowa znajduje siw zagbieniu midzy helisami E i F, jon elaza wie si5.

wizaniem koordynacyjnym z piercieniem imidazolowym His F8 (tzw. His proksymalna). Poprzeciwnej stronie paszczyzny hemu (w stosunku do His F8) znajduje siHis E7 (tzw. Hisdystalna), ktra nie zajmuje jednak 6. pozycji koordynacyjnej Fe2+. W odtlenowanej MGB jon Fe2+jest lekko (0,03 nm) wysunity poza paszczyznhemu w kierunku His F8, natomiast w MGButlenowanej gdy czsteczka O2zajmuje 6. pozycjkoordynacyjn wysunicie to jest 3 xmniejsze, wynoszc 0,01 nm. Zwizaniu czsteczki tlenu towarzyszy wic ruch jonu elaza i HisF8 w stronpaszczyzny porfiryny, co daje zmiany konformacyjne czsteczki biaka.

W utlenowanej MGB wizanie Fe2+ O jest prostopade do paszczyzny porfiryny, natomiast 2.atom tlenu przyczony jest pod pewnym ktem (skonie). Z kolei tlenek wgla (CO) preferujeprzyczanie siw caoci prostopadle do tej paszczyzny taka orientacja jest jednak moliwajedynie w wyizolowanym hemie, bowiem fizjologicznie w MGB His dystalna stanowi przestrzennzawaddla wizania CO pod tym ktem. Zatem otoczenie hemu w MGB zmniejsza powinowactwoCO do elaza hemowego, ktre w przypadku czystego hemu jest a25 tys. razy wiksze ni

powinowactwo O2do tego elaza. Dziki opisanemu mechanizmowi czsteczka CO zmuszona jestdo wizania siw mniej korzystnej konfiguracji, co obnia wzgldne powinowactwo do ok. 200. MGB jest biakiem magazynujcym, a nie transportujcym tlen. IloO2zwizanego przez biako

(nasycenie, saturacja) zaley od stenia (cinienia) tego gazu pO2. Nie jest to jednak zalenoliniowa, lecz obrazuje jkrzywa dysocjacji tlenowej. Dla MGB krzywa ta ma ksztat hiperboli, cooznacza, ioddaje ona tlen dopiero przy znacznym spadku pO2, co ma miejsce przy duymdeficycie tlenowym w warunkach wysokiej aktywnoci fizycznej. MGB nie mogaby penifunkcjitransportu tlenu z puc do tkanek, gdyprzy granicznych w tych warunkach wartociach pO2oddaje ona jedynie znikomczzmagazynowanego O2.

Hemoglobina (HGB) spenia funkcjtransportu gazw oddechowych O2z puc do tkanek oraz CO2iH

+w kierunku przeciwnym.

HGB jest tetramerem zoonym z pary dwch typw acuchw polipepydowych, oznaczanych ,, , , S itd. acuchy te stanowipodjednostki HGB posiada ona zatem strukturIV-rz., dziki

czemu zyskuje nowe waciwoci, ktrych nie prezentuje MGB. acuch skada size 141 resztaa, a ze 146, oba skodowane przez odmienne geny. Znanych jest wiele typw HGB, jednakdo najwaniejszych nale: HbA (22; podstawowa fizjologiczna HGB dorosych), HbA2 (22;fizjologiczna HGB dorosych, stanowi ok. 2,5 %), HbF (22; podowa), HbS (2S2; wystpuje wsierpowatych erytocytach).

MGB i podjednostki HbA wykazujpraktycznie identycznstrukturII i III-rz., podobna jestrwnielokalizacja grup hemowej i odcinkw helikalnych, choHbA posiada ich tylko 7.

Hem kadej podjednostki HGB przycza 1 czsteczkO2, wic caa HGB wie cznie 4czsteczki tlenu. Co wicej, przyczenie O2do jednego hemu uatwia wizanie kolejnych O2przezpozostae grupy hemowe okrela sito jako kooperatywne wizanie O2z HGB. Zjawisko topozwala na zwizanie maksymalnej iloci tlenu w pucach oraz uwalnianie moliwie najwikszejiloci tlenu w tkankach. Zjawisko kooperatywnoci powoduje, e krzywa dysocjacji tlenowej HGBma ksztat sigmoidalny (wygity jak litera S). Wniosek jest taki, ipoczenie acuchw

polipeptydowych w tetramer pozwala na zwikszenie wydajnoci transportu tlenu. Rne typy HGB cechujsiodmiennym powinowactwem do O2. Jego ilociowmiarjest

wskanik P50, tj. wartopO2, przy ktrej HGB jest wysycona tlenem w 50 %. P50dla HbA wynosi26 mmHg, a dla HbF 20 mmHg oznacza to, iHbF silniej wie O2(przy danej prnoci jestwysycony w wikszym stopniu) waciwota pozwala na przekazywanie tlenu z HbA na HbF wobrbie oyska. Po porodzie odsetek HbF szybko maleje, gdyjego obecnonie jest juuzasadniona puca pracuj, a wysokie powinowactwo HbF do tlenu utrudnia jego oddawanie wtkankach. Na jego miejsce syntetyzowana jest HbA. Nagy rozpad duych iloci HbF wie sizpowstaniem duych iloci bilirubiny (por. punkt VI-5-b/c), co jest przyczyntaczkinoworodkw.

Przyczeniu O2towarzyszy rozerwanie wizapoprzecznych (niekowalencyjnych elektrostatycznych) midzy kocami C wszystkich podjednostek HGB, co zmienia jej strukturII,III i IV-rz. Jedna para podjednostek +wykonuje obrt o ok. 15ow stosunku do drugiej pary, w

wyniku czego podjednostki zbliajsido siebie i wzrasta powinowactwo do tlenu. Struktura IV-rz. HGB czciowo utlenowanej okrelana jest jako stan naprony (T), zaHGB cakowicie


24/158

- -24

utlenowanej jako stan rozluniony (R). Podczas utlenowania HGB atomy Fe, lece 0,06 nmpoza paszczyznporfiryny w HGB pozbawionej tlenu, wsuwajsibliej tej paszczyzny,pocigajc za sobHis F8 i ssiadujce z nireszty aa. Prawdopodobiestwo przejcia TRwzrasta wraz z przyczaniem olejnych czsteczek O2do HGB, gdywizanie O2osabia i rozbijawizania poprzeczne utrzymujce HGB w stanie T. Rwnowaga TR znajduje sipod wpywemtakich czynnikw jak: H+, CO2, Cl

-, BPG, ktre zwikszajilozwizanego O2wymaganego do

przejcia TR. Po oddaniu O2HGB wie CO2, transportujc go do puc w ten sposb przenoszonych jest ok.15% cakowitego CO2transportowanego przez krew. CO2wchodzi w reakcjz N-kocamiacuchw HGB, dajc karbaminiany:

HGB-NH3++ CO2HGB-NH-COO

-+ 2 H

+.

Powstajce w tej reakcji protony odpowiedzialne sza efekt Bohra. Zmiana adunkw N-kocwHGB umoliwia tworzenie wizapoprzecznych pomidzy podjednoskami tak jak w formienieutlenowanej. W pucach utlenowaniu HGB towarzyszy odczenie i wydalenie CO2. CO2docierajcy do krwi przeksztacany jest przez anhydrazwglanow(CA) do H2CO3, ktrysamorzutnie dysocjuje do H

++ HCO3

-. Protony wisiz HGB (Hb .2 H+), zaaniony

wodorowglanowe stanowigwnformtransportu CO2przez krew. Przez efekt Bohra okrelasizmniejszenie powinowactwa tlenu do HGB wraz ze spadkiem pH dziki temu w tkankachnastpuje bardziej efektywne oddawanie O2, a krzywa dysocjacji tlenowej HGB przesuwa si

przez to w prawo. Zjawisko odwrotne, tj. zwikszenie oddawania CO2pod wpywem wizania O2nosi nazwefektu Haldena. Efekt Bohra jest charakterystyczny dla tetramerycznej HGB, zaleybowiem od interakcji pomidzy grupami hemowymi, czyli kooperatywnoci wizania O2 niewykazuje go zatem MGB. Dziki zdolnoci wymiany protonw z otoczeniem, HGB peni funkcjukadu buforowego krwi.

Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powstajw wyniku rozerwania wizapoprzecznychpodczas utlenowania formy T, pochodzgwnie z atomw N piercieni imidazolowych C-kocowych reszt His acuchw (HC3; His 146). Z kolei odczenie O2i zwizane z tymtworzenie wizapoprzecznych wymaga przyczenia H+do w/w miejsc. Obecnoprotonw wtkankach uatwia wic tworzenie wizapoprzecznych poprzez protonacjC-kocowych reszt Hisacuchw , a odtwarzanie tych wizasprzyja przejciu RT, czyli oddawaniu O2.

2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) powstaje w tkankach w wyniku niedoboru O2, jako modyfikacjapodstawowego szlaku glikolizy. BPG wie siz HGB w stosunku stechiometrycznym 1:1, w

miejscu pomidzy podjednostkami w centrum czsteczki. Rozmiar tej wnki odlegopomidzy helisami H acuchw odpowiada BPG jedynie w formie T. BPG tworzy wizaniapoprzeczne w obrbie acuchw (z N-kocem ValNA1, Lys EF6 i His H21), przez costabilizuje i preferuje formT, zwiksza zatem oddawanie O2przez HGB w tkankach. BPG o wielesabiej dziaa w przypadku HbF, gdyposiada ona w pozycji H21 Ser zamiast His, w zwizku zczym nie tworzy wizapoprzecznych. Adaptacja organizmu do duych wysokoci polega m. in.na zwikszeniu syntezy BPG, co zmniejsza P50, a zwiksza uwalnianie tlenu do tkanek.

Stany patologiczne zwizane z HGB: Hemoglobinopatie sto zaburzenia funkcji biologicznej HGB, bdce nastpstwem mutacji

genw kodujcych jej acuchy polipeptydowe (i ). Znanych jest kilkaset hemoglobinopatii,jednak ogromna wikszowystpuje rzadko i ma agodny przebieg, tak e wiksze znaczenieposiada zaledwie kilka z nich.

HbM: His F8 Tyr Mutacja taka powoduje stabilizacjelaza hemowego w formie Fe3+,

gdytworzy ono trwae poczenie z anionem fenolanowym Tyr. Powoduje tomethemoglobinemi podobnie jak sulfonamidy lub stany obnienia aktywnocireduktazy methemoglobiny i zwizany z tym spadek zdolnoci HGB do wizania itransportu O2. Przy wariantach HbM dotyczcych acuchw wystepuje preferencjaformy T, obnienie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra; natomiast przywariantach dotyczcych acuchw przejcie RT nie zostaje zakcone, podobnie jakefekt Bohra.

HbS: Glu A2(6)Val Mutacja powoduje powstanie na powierzchni HGB lepkichmiejsc, komplementarnych do odpowiednich miejsc na powierzchni nieutlenowanejHGB (zarwno A, jak i S). Komplementarnooddziaujcych powierzchni powodujepolimeryzacjnieutlenowanej HbS powstajw ten sposb helikalne wkna HGB, ktrewytrcajsii znieksztacajerytrocyty, ktre przyjmujksztat sierpowaty, posiadajobnionopornohemolitycznoraz wiksztendencjdo agregacji i zlepiania. Objawy

anemii sierpowatokrwinkowej pogbiajsiprzy obnieniu pO2 polimeryzuje przecieforma T, czyli nieutlenowana. Barieri zatrzymanie polimeryzacji powoduje przyczenie


25/158

- -25

prawidowej HbA zarwno w formie R i T, gdypomimo istnienia miejsckomplementarnych, nie posiada ona lepkich kocw.

Talasemie sto choroby, ktrych istotjest zmniejszona synteza acuchw HGB (lub ), cojest przyczynanemii.

HGB glikowana (HbA1c) jest to HGB poddana procesowi glikacji. Glikacja jest procesemnieenzymatycznej glikozylacji biaek w tym przypadku HGB zachodzcym w warunkach

podwyszonego poziomu glukozy w rodowisku, np. cukrzycy. Anomeryczna grupa hydroksylowaglukozy reaguje z grupaminowLys oraz aa N-kocowych. HbA i HbA1cmona rozdzielistosujc chromatografijonowymiennlub elektroforez. HbA1cstanowi fizjologicznie < 5 %HGB i jest proporcjonalne do redniego stenia glukozy we krwi w okresie 1,5 3 miesicypoprzedzajcych badanie (dugofalowa kontrola terapii cukrzycy).

Mioglobinuria jest stanem wydalania z moczem MGB pochodzcej z rozlegego uszkodzeniamini szkieletowych (w mniejszym stopniu serca), przez co mocz ma barwciemnoczerwn. Stantaki moe prowadzido ostrej niewydolnoci nerek (ONN).


26/158

- -26

ROZDZIA II STRUKTURA I FUNKCJE ENZYMW

1. Ogle waciwoci enzymw

a)

klasyfikacja i nazewnictwo

Podstawklasyfikacji enzymw jest typ i mechanizm katalizowanej przez nie reakcji. Kady enzymposiada swj kod o postaci: EC xx.xx.xx.xx, gdzie litery x oznaczajcyfry arabskie. Symbol EC zaznacza, edalsza czkodu to numer w midzynarodowym katalogu enzymw (ang. Enzyme Commission, fr. EnzymeCatalogue). Sam numer skada siz 4 czonw:

pierwszy okrela gwnklas, charakteryzujctyp katalizowanej reakcji; system zawiera 6 klasenzymw i katalizowanych przez nie reakcji: 1 oksydoreduktazy katalizujreakcje utleniania i redukcji (redox; patrz punkt III-3) 2 transferazy katalizujreakcje przenoszenia grup funkcyjnych 3 hydrolazy katalizujreakcje rozpadu pod wpywem wody (hydrolizy) 4 liazy katalizujreakcje rozpadu bez udziau czsteczek wody 5 izomerazy katalizujreakcje zmian pooenia grup chemicznych z zachowaniem szkieletu

6 ligazy katalizujreakcje tworzenia wizakowalnecyjnych

drugi okrela podklas, charakteryzujczazwyczaj rodzaj wizania lub grupy, ktrej dotyczy reakcja trzeci okrela podpodklas, ktra moe zawiera: dokadniejszspecyfikacjwizania, grupzwizkw

do ktrej naley substrat, nazwdonora lub akceptora

czwarty wskazuje na okrelony enzym przez podanie nazwy substratu reakcji.Nazwa enzymu jest dwuczciowa czpierwsza, zakoczona przyrostkiem -aza, okrela typ

katalizowanej reakcji, druga substrat(y) reakcji.

b) centrum katalityczne

Enzymy posiadajzdolnoprzyczania substratw i miejscowego zwikszania ich stenia, przez coprzyspieszajprzebieg katalizowanej reakcji. Zazwyczaj czsteczka biaka enzymatycznego jest wielokrotniewiksza (nawet o kilka rzdw wielkoci) od czsteczki substratu, co sugeruje istnienie ograniczonego obszaru centrum katalitycznego bezporednio wicego substrat.

Model miejsca katalitycznego wg Fishera przedstawia je jako sztywnkonstrukcj, a interakcjzsubstratem jako przestrzenne uoenie dopasowanych do siebie geometrycznie (niczym klucz do zamka)czsteczek. Koncepcja ta wyjania specyficznopoczeE-S, nie tumaczy jednak dynamicznych zmiantowarzyszcych procesom katalitycznym.

W przeciwiestwie do w/w, model indukowanego dopasowania, zaproponowany przez Koshlanda,zakada ibliskosubstratu indukuje zmiany konformacyjne w czsteczce enzymu, tak e moe nastpipoczenie pasujcych do siebie powierzchni. Z chemicznego punktu widzenia polega to na przyjciuodpowiedniej konformacji przez grupy funkcyjne czsteczki enzymu, co umoliwia interakcjz czsteczksubstratu i waciwkataliz. Reszty aa znajdujce siw miejscu katalitycznym mogbyod siebie znacznieoddalone w strukturze I-rzdowej, lecz przestrzennie zblione w strukturze III-rzdowej.

Miejsca aktywne (katalityczne) enzymw zoonych z pojedynczej podjednostki sczsto zlokalizowane

w bruzdach czsteczki enzymu, natomiast w oligomerach znajdujsizazwyczaj przy powierzchniach midzypodjednostkami. Wykazano, iw skad miejsca katalitycznego wchodzi wiele reszt aa, a gwnrolw katalizieodgrywajpewne okrelone reszty w szczeglnoci aa z boczngrupsulfhydrylow(Cys) lub hydroksylow(Ser, Thr, Tyr) oraz kwane (Asp, Glu) i zasadowe (Lys, His, Arg), poniewaich acuchy boczne stanowiczynniki nukleofilowe katalizatory kwane lub zasadowe bdakceptory grupy ulegajcej przeniesieniu.Wszystkie formy enzymu, katalizujce okrelonreakcj(lub typ reakcji), posiadajjednakowy i uniwersalnymechanizm, wystpujcy w caej przyrodzie. Zwizany jest z tym fakt, ireszty aa istotne w procesiekatalitycznym, jak rwnieich najblisze otoczenie w czsteczce enzymu, wykazujwysokkonserwatywno,zachowani utrwalonw procesie ewolucji. Poniewajednak dany motyw struktury III-rz. moe byutworzonyprzez rne kombinacje struktur I-rz., toteta pierwsza wykazuje zdecydowanie wikszkonserwatywno.

c) koenzymy i witaminy bdce ich prekursorami

Wiele enzymw do przeprowadzenia reakcji wymaga, poza substratem, obecnoci dodatkowej substancjiniebiakowej, okrelanej jako koenzym. Wwczas sambiakowczenzymu nazywamy apoenzymem, apoczenie apoenzym z koenzymem holoenzymem. Koenzymy zwikszajmoliwoci katalityczne enzymw


27/158

- -27

poza te wynikajce z obecnoci grup funkcyjnych reszt aa. Koenzymy cile zwizane z enzymami okrela simianem grup prostetycznych. Obecnoci koenzymw wymagajgeneralnie enzymy katalizujce reakcje redox,przenoszenia grup, izomeryzacji i tworzenia wizakowalencyjnych (klasy EC 1, 2, 5 i 6), nie potrzebujichnatomiast enzymy lityczne hydrolazy i liazy (EC 3 i 4). Czsto koenzym bywa rozpatrywany jako kolejnysubstrat reakcji po pierwsze poniewazmienia siwraz z podstawowym substratem, po drugie gdyczsto towanie jego przemiany sfizjologicznie istotne. Prekursorami wielu koenzymw switaminy, g. z grupy B

(por. niej). W zalenoci od przenoszonej grupy, koenzymy dzieli sina: przenoszce protony: NAD(P)+, FMN, FAD, CoQ, kwas liponowy, przenoszce inne grupy: fosforany sacharydw, CoA, DPT, PLP, koenzymy folianowe, biotyna,

koenzymy kobalaminowe, kwas liponowy.W tabeli poniej przedstawiono najwaniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, witaminy bdce ich

prekursorami oraz przykady zawierajcych je enzymw.

koenzymLp. grupa

skrt(y) pena nazwawitaminy przykad enzymu odnoniki

1.NAD

+,

NADHdinukleotyd

nikotynamidoadeninowydehydrogenaza

mleczanowa

2.

nukleotydyadeninowe NADP

+,

NADPHfosforan dinukleotydu

nikotynamidoadeninowego

PP dehydrogenazaglukozo-6-

fosforanow

3. FMN mononukleotyd flawinowydehydrogenaza

NADH

4.

nukleotydyflawinowe

FADdinukleotyd

flawinoadeninowy

B2(ryboflawina) oksydaza -

aminokwasw

III-3

5. - -kwas liponowy

(lipoinowy)-

oksydaza -ketokwasw

III-10

6. - CoA1 koenzym A

kwaspantotenowy

syntetaza kwaswtuszczowych

III-9 i 10,V-5 i 6

7. - CoQ koenzym Q, ubichinon - -2 III-5

8. cytochromyb, c, c1,

a, a3cytochrom - -

3 III-3, III-5

9. - - biotyna Hkarboksylaza

pirogronianowa IV-4-b

10. - DPT difosfotiamina B1(tiamina)dekarboksylaza

pirogronianowaIII-10

11. - PLP fosforan pirydoksaluB6

(pirydoksal)transaminaza

alaninowaVI-2-a

12. -THF,FH4

tetrahydrofolian kwas foliowyhydroksymetylo-

transferaza

serynowa

VI-4-h

13. - - kobalaminaB12

(kobalamina)

mutazametylomalonylo-

CoAIV-4-b

1 CoA = {P} + ryboza + adenina + 2 {P} + kwas pantotenowy + merkaptoetanoloamina

kwas pantotenowy = kwas pantoinowy + -alanina2 CoQ peni funkcjprzenonika elektronw midzy metaloflawoproteinami a cytochromami w acuchuoddechowym3 cytochromy sprzenonikami elektronw w acuchu oddechowym

d) swoistodziaania enzymw

W przeciwiestwie do katalizatorw nieorganicznych czy prostych katalizatorw organicznych,enzymy charakteryzuje wysoka swoistosubstratowa i aktywnokatalityczna, bdce wynikiemwyksztacenia miejsc katalitycznych dostosowanych do szybkiej i selektywnej katalizy indywidualnychreakcji.

Jednz najwaniejszych cech enzymw jest ich zdolnodo swoistej katalizy tylko jednej reakcji (ew.jednego typu reakcji), dziki czemu szybkoprocesw metabolicznych moe byregulowana przez

modyfikacjaktywnoci odpowiednich enzymw (por. punkt II-4).


28/158

- -28

Enzymy sstereoswoistymi katalizatorami; wikszosubstratw tworzy z nimi 3 wizania, przez coczsteczki symetryczne pod wzgldem budowy chemicznej mognabywacech asymetrii (por. punktV-1-d kwasy tuszczowe w pozycjach 1 i 3 glicerolu).

Enzymy wykazujabsolutnswoistooptyczndla przynajmniej jednej czsteczki substratu gwniedla form D wglowodanw i form L aa. Wyjtkiem sepimerazy racemazy.

Enzymy (poza pewnymi wyjtkami) wykazujrwnieswoistowobec okrelonego koenzymu, nawet

jeli przenoszenie danej grupy moe siodbywaz udziaem innego (por. wyej).

e) aktywnoenzymw, jednostki aktywnoci

Z powodu zazwyczaj bardzo maej iloci enzymw w materiale biologicznym czsto okrela sinie ilosamego biaka enzymatycznego, lecz jego aktywnokatalityczn. Zakada siprzy tym, e w warunkachbadania szybkoreakcji katalizowanej przez enzym zaley proporcjonalnie od iloci tego enzymu. Wobec tegoiloenzymu w prbce mona okrelina podstawie tempa ubytku substratw lub pojawiania siproduktw wrodowisku reakcji. Wyniki podaje siodpowiednich jednostkach:

IU midzynarodowa jednostka aktywnoci enzymu, oznaczajca takjego ilo, ktra przemienia1 mol reagentu w cigu 1 min.

Katal (kat) jednostka SI aktywnoci enzymw i innych katalizatorw, oznacza ilokonwertujc1 mol reagentu w czasie 1 s. Zwizek midzy katalem a IU przestawia sinastpujco: 1 kat = 60 mlnU). Katal jest zatem jednostkwzgldnie du, dlatego w praktyce uywa sikat i nkat.

Liczba obrotw enzymu iloczsteczek substratu, ktre mogzostaprzeksztacone przez enzym wprodukt w cigu 1 sekundy. Zwykle wynosi ona od kilku tysicy do kilku milionw.

Aktywnospecyficzna jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jakposiada jednostkowa masa biakaenzymatycznego, np. 1 U/mg oznacza, e 1 mg biaka posiada aktywno1 IU.

Aktywnocakowita jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jakposiada jednostkowa masa lubobjtomateriau biologicznego, z ktrego ten enzym jest izolowany, np. 1 U/ml oznacza, e 1 mlpynu ustrojowego posiada danaktywnoenzymatyczno wartoci 1 IU.

Wyjtkowo w przypadku pewnych enzymw oznacza siich bezwzgldnilometodamiimmunochemicznymi (por. punkt II-5-c CK-MB mass).

f)

kompartmentacja komrkowa enzymw

Enzymy, ich substraty i koenzymy nie wystpujzazwyczaj jednorodnie w obrbie komrki, lecz w jejokrelonych przestrzeniach, zwanych kompartmentami. Rozmieszczenie to mona badametodamihistochemicznymi. Kompartmetacja komrki umoliwia wzajemnizolacjjej przedziaw i zachodzenie w nichprzeciwstawnych procesw biochemicznych, np. syntezy i degradacji tej samej grupy zwizkw.

Rozmieszczanie w komrce przykadowych, kluczowych dla jej funkcjonowania, enzymw:

cytoplazma: aldolaza, izomeraza fosfoheksozowa, dehydrogenza mleczanowa, aminotransferaza

alaninowa, dehydrogenaza sorbitolowa,

mitochondria: enzymy cyklu Krebsa, oksydazy, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza

asparaginianowa,

ER: esterazy, reduktazy, acetylazy, GGTP,

rybosomy: enzymy syntezy biaek, ceruloplazmina, cholinesteraza,

lizosomy: proteazy, fosfatazy, kolagenazy

g) izoenzymy

Izoenzymy (izozymy) sto fizycznie odmienne formy tej samej aktywnoci katalitycznej, innymi sowy biaka o odmiennej strukturze, lecz katalizujce przebieg tej samej reakcji. Poszczeglne izoenzymy pojedynczejaktywnoci mogwystpowaw rnych kompartmentach subkomrkowych lub nawet w odmiennych typachkomrek (tkankach std teczsto pochodzich nazwy), rnic sidodatkowo powinowactwem dosubstratw (por. punkt IV-4-a aldolaza A i B).

Izoenzymy sproduktami ekspresji blisko spokrewnionych genw. Enzymy oligomeryczne z rnymiprotomerami mogwystpowaw kilku postaciach, ponadto jedna tkanka moe produkowajeden rodzajprotomeru, druga zainny. Jeli protomery mogczysiw rny sposb, aby utworzyaktywny enzym,tworzsiwwczas tzw. izoenzymy rzekome danej aktywnoci. Okrela sije jako rzekome, gdystoprodukty asocjacji mniejszej liczby rodzajw protomerw. Np. dla LDH z 2 produktw translacji (posiadajcych

odmienne mRNA) powstaje 5 izoenzymw rzekomych (patrz punkt II-5-b). Izoenzymy prawdziwe rnisinatomiast tym, e kady z nich jest produktem translacji innego mRNA.


29/158

- -29

Znane sizoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, transaminaz, fosfataz i proteaz. Rozdzia iidentyfikacja izoenzymw okrelonych aktywnoci ma istotne znaczenie diagnostyczne (por. punkt II-5).

h) izolacja enzymw

Enzymy mogbyotrzymywane przez oczyszczanie z komrek ywych organizmw, w ktrych

naturalnie wystpuj, bdmetodami rekombinacji DNA z komrek, gdzie fizjologicznie ich brak. Ze wzgl duna szybki wzrost uywa sido tych celw komrek drody i bakterii. Ponadto techniki ukierunkowanejmutagenezy pozwalajna manipulacjskadem aa rekombinowanego enzymu, np. w celu okrelenia rolistrukturalno funkcjonalnej pewnych jego regionw (czy nawet pojedynczych reszt aa).

Do technik oczyszczania enzymw z materiau biologicznego zaliczamy: strcanie solami o rnychsteniach ((NH4)2SO4, Na2SO4) lub rozpuszczalnikami (aceton, etanol), rnicowdenaturacjciepln,denaturacjspowodowanzmianami pH, wirowanie rnicowe, elektroforez, filtracjelow, chromatografijonowymienn(jonity: A DEAE/C, K CMC), sczenie na sitach molekularnych oraz chromatografipowinowactwa (z uyciem substratw, pochodnych koenzymw lub barwnikw organicznych, ligandwhydrofobowych). Homogennobiaka (tu enzymu) potwierdza sitechnikPAGE SDS lub elektroforezdwuwymiarow.

Technologii rekombinacji DNA skada siz kilku etapw: sklonowanie genu kodujcego enzym zsekwencjonowanie genu wprowadzenie do wektorw plazmidowych lub fagowych umieszczenie w

docelowym genomie. Ostatecznie gen enzymu powinien znalesipod kontrolsilnego promotora, najlepiej zmoliwocijego kontroli przez specyficznie chemicznie induktor wwczas podanie tego ostatniego dopoywki wzrostowej spowoduje produkcje enzymu w ilociach wielokrotnie wikszych ninaturalnie.Technologia ta moe bystosowana do otrzymywania zmodyfikowanych tzw. fuzyjnych biaek. W tym celudo oryginalnego genu docza sitaksekwencj, aby powstay biakowy produkt by odpowiednim ligandemdla specyficznego nonika w chromatografii powinowactwa, po czym po rozdzieleniu usuwa sidodanyfragment (tzw. domenfuzyjn).

2. Mechanizmy dziaania enzymw

a) typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach

Chorozwaania dotyczce reakcji enzymatycznych najprociej jest przedstawii zrozumiew sytuacji

pojedynczy substrat : pojedynczy produkt, to w rzeczywistoci wikszoreakcji obejmuje dwa lub wicejsubstratw i produktw. Ich liczbokrela siterminami: uni-, bi-, ter-, quad- itd., zarodzaj reakcji ze wzglduna liczbreagentw przez podanie terminw okrelajcych ilosubstratw i produktw. Bardzo czstospotykane sreakcje typu BiBi, tzn. posiadajce 2 S i 2 P. Mogone zachodzina kilka sposobw:

reakc

SKRYPT Biochemia Harper

Documents

Transcript of SKRYPT Biochemia Harper