CZĘŚĆ I. WYBRANE ZAGADNIENIA BIOCHEMII

Biochemia jest nauką zajmującą się poznaniem budowy chemicznej składników organizmów żywych oraz przemian, jakie w nich zachodzą. Tradycyjnie biochemię dzieli się na dwa działy, a mianowicie:

1) biochemię statyczną 2) biochemię dynamiczną.

Pierwszy z tych działów skupia uwagę na strukturze i właściwościach związków chemicznych znajdowanych w przyrodzie ożywionej i stąd coraz częściej nazywany bywa chemią bioorganiczną.

Z kolei biochemia dynamiczna za pomocą metod chemicznych wyjaśnia istotę procesów przemiany materii i stąd identyfikuje się ją z metabolizmem komórkowym.

Ponieważ każdy organizm ma pewne odrębne właściwości, biochemię w zależności od badanego obiektu dzieli się na:

1) biochemię drobnoustrojów, 2) biochemię roślin 3) biochemię zwierząt.

Z tych trzech podstawowych działów wyodrębnia się dalsze bardziej wąskie specjalistyczne kierunki (np. biochemia człowieka, biochemia bakterii itd.).

W rozdziale tym, w formie zwięzłego kompendium, omówiono jedynie wybrane zagadnienia biochemii związane bezpośrednio z problematyką poruszaną w kolejnych rozdziałach tej książki. Tak, więc, przede wszystkim, ma on ułatwić ich studiowanie, a nie zastąpić podręczników niezbędnych do dokładnego i systematycznego przyswajania wiedzy biochemicznej.

ROZDZIAŁ 1. CHEMIA BIOORGANICZNA

Jak już wspomniano, biochemia zajmuje się m.in. ustaleniem budowy chemicznej składników żywych organizmów. Ustalono, że do najbardziej rozpowszechnionych w organizmach żywych związków należą: sacharydy, białka (w tym enzymy) i tłuszczowce. Wśród innych na uwagę zasługują: kwasy nukleinowe, witaminy, hormony, barwniki (m.in. pirolowe i karotenoidy), glikozydy, alkaloidy i kwasy organiczne. Ich budowa zostanie omówiona w kolejnych rozdziałach. Przy jej rozpatrywaniu, w większości przypadków, konieczne jest uwzględnienie zjawiska izomerii. Dlatego też pierwszy rozdział poświęcony zostanie omówieniu tego niezwykle ważnego zagadnienia.

1. Izomeria

Izomeria polega na występowaniu związków o identycznym składzie atomowym, a różniących się jedynie sposobem, kolejnością lub miejscem powiązania atomów albo ich rozmieszczeniem (lub ich grup) w przestrzeni. Cząsteczki takich związków nazywane są i zo merami . Znanych jest kilka różnych odmian izomerii. Tu zostaną omówione jedynie te odmiany, które mają znaczenie z biochemicznego punktu widzenia, a przede wszystkim będą przydatne przy studiowaniu dalszych rozdziałów podręcznika (m.in. przy nazewnictwie enzymów).

Regioizomery (izomery pozycyjne) to izomery różniące się jedynie rozmieszczeniem tych samych grup atomów (np. grup funkcyjnych, podstawników) w podstawowym szkielecie cząsteczki. Mogą one różnić się właściwościami fizyko-chemicznymi, ale przede wszystkim najczęściej wykazują diametralnie różne właściwości biologiczne. Przykładem regioizomerów może być mieszanina dwu diestrów etylowych glicerolu.

CH2-COOC2H5

CH2-COOC2H5

CH-COOH

CH2-COOC2H5

CH2-COOH

CH-COOC2H5

I IIregioizomery

Tautomery (izomery funkcyjne - różnią się obecnością w cząsteczce odmiennych grup funkcyjnych) to dwa izomery, które przechodzą nawzajem w siebie w wyniku przesunięcia atomu wodoru z jednoczesnym przemieszczeniem układu wiązań w cząsteczce. Zjawisko występowania obok siebie takich izomerów nazywamy t au tomer ią . Stan równowagi pomiędzy tautomerami kwasu pirogronowego można zapisać następująco:

Odmiana ketonowa większości tautomerów jest znacznie trwalsza i stąd stan równowagi reakcji przesunięty jest na jej korzyść.

-izomery to dwa izomery różniące się położeniem podwójnego wiązania (lub kilku takich wiązań) w cząsteczce, np.:

Stereoizomeria

Stereoizomeria, czyli izomeria przestrzenna jest związana z różnym przestrzennym rozmieszczeniem atomów (lub grup atomów) i układem wiązań w cząsteczce. Według klasycznego podziału obejmuje ona izomerię geometryczną i izomery optyczne.

Izomery cis-trans -izomery geo met ryczne , zaliczane do stereoizomerów - różnią się konfiguracją, czyli przestrzennym położeniem wyróżnionych atomów względem wybranej płaszczyzny, przy czym przyjmuje się, że atomy te nie mają możliwości swobodnego obrotu wokół podwójnego wiązania (np. w alkenach) lub – w związkach cyklicznych – wokół wiązania C-C. Izomery, w których takie same lub wyróżnione atomy (albo grupy atomów) znajdują się po tej samej stronie są nazywane odmianami cis, po przeciwnych stronach – odmianami trans. Izomery cis-transmogą różnić się nieco właściwościami fizyko-chemicznymi, natomiast ich właściwości biologiczne są z reguły całkowicie różne.

Izomery optyczne lub ogólnie związki optycznie czynne, tj. skręcające w różny sposób płaszczyznę światła spolaryzowanego Ta właściwość jest konsekwencją obecności w ich cząsteczkach centrum chiralnego. Chiralność, to właściwość obiektu polegająca na tym, iż nie pokrywa się on ze swoim odbiciem w zwierciadle płaskim. Z reguły centrum chiralne izomerów optycznych stanowi asymetryczny (chiralny) atom lub atomy węgla (oznaczone na rysunkach gwiazdką), wokół których może występować różna konfiguracja, czyli przestrzenne rozmieszczenie innych atomów lub grup atomów.

CH2=C-COOH

OH

CH3-C-COOH

O

odmiana ketonowa odmiana enolowa

tautomery

CH3C

CCH3

H

H H

C

C

CH3

H3C

H

cis -buten-2 trans -buten-2

OHOH

cis -cyklopentano--1,2-diol

trans -cyklopentano--1,2-diol

OH

OH

cis-trans izomery

CHO

C*

H

CH2OH

CHO

C*

CH2OH

HOH

OH

aldehyd L(-)-glicerynowy aldehyd D(+)-glicerynowy

CHO

C*

CH2OH

HO H

płaszczyznazwierciadłaCHO

C*

HO H

CH2OH

-izomery - buten

1

CH2=CH-CH2-CH3 - buten

2

CH3-CH=CH-CH3

Izomery optyczne dzieli się na prawoskrętne (+) lub lewoskrętne (-), w zależności od kierunku, w którym skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego. W celu ujednolicenia przedstawiania ich konfiguracji za wzorce przyjęto prawo- i lewoskrętne aldehydy glicerynowe. Grupa aldehydowa jest lokowana na „górze” wzoru, natomiast grupę hydroksylową umieszcza się po lewej stronie (z punktu widzenia patrzącego), otrzymując w ten sposób wzór aldehydu L(-)-glicerynowego, lub po prawej, otrzymując wzór aldehydu D-(+)-glicerynowego.

Enancjomery, to pary prawo- i lewoskrętnych izomerów optycznych, stanowiących wzajemne odbicie w lustrze. Ich właściwości fizyko-chemiczne są identyczne, z wyjątkiem zdolności do kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Natomiast różnią się właściwościami biologicznymi. Np. pleśnie Penicillium glaucum z roztworu racemicznego winianu amonowego zużywają wyłącznie odmianę prawoskrętną.

Racemat (postać racemiczna) to mieszanina równych ilości cząsteczek enancjomerów, nie wykazująca aktywności optycznej (z uwagi na kompensację) oznaczana znakiem (±) lub literami D,L-umieszczanymi przed nazwą lub wzorem związku chemicznego.

Racemizacja, to zjawisko polegające na wzajemnym przekształcaniu się jednego enancjomeru w drugi, aż do ustalenia się równowagi ilościowej pomiędzy obu odmianami.

Diastereoizomery to izomery optyczne nie będące wzajemnymi odbiciami w lustrze. Różnią się właściwościami fizyko-chemicznymi i biologicznymi. Poniżej przedstawione są konfiguracje czterech stereoizomerów kwasu 2,3-dihydroksymasłowego. Wzory (I) i (II) oraz (III) i (IV) przedstawiają pary enancjomerów, które w stosunku do siebie nawzajem są d ia s te reoi zomerami .

Mezo-izomery. Niektóre związki, pomimo obecności asymetrycznych atomów węgla, są nieczynne optycznie na skutek wewnętrznej kompensacji; nazywamy je związkami mezo. Przykładem takiego związku jest kwas mezowinowy, który jest diastereoizomerem w stosunku do swoich odmian prawo- i lewoskrętnej.

* * *Niektóre inne aspekty stereoizomerii poruszone zostaną w następnym rozdziale, przy omawianiu

sacharydów.

C

C

COOH

CH3

H

*

*H OH

OHC

C

COOH

CH3

*

*HO

HO

H

H

OH

C

C

COOH

CH3

*

*

HO

H

OH

HO

HC

C

COOH

CH3

*

*

(I) (II) (III) (IV)

enancjomery enancjomery

diastereoizomery

diastereoizomery

enancjomery

OH

HO

H*

*

C

C

COOH

COOH

OH

HO

H*

*

C

C

COOH

COOH

kwas L(+)-winowy kwas D(-)-winowy

C

C

COOH

H

*

*H OH

OH

COOH

zwierciadlo

180o

kwas mezowinowy

2. Węglowodany (sacharydy)

Duża grupa związków zaliczanych do węglowodanów, zwana jest również sacharydami lub cukrami. Termin „węglowodany” obejmuje monosacharydy (cukry proste), oligosacharydy, polisacharydy oraz związki pokrewne (aminocukry, kwasy uronowe, itp.). Natomiast do innych klas związków chemicznych zalicza się glikozydy aglikonowe (sacharyd połączony wiązaniem glikozydowym z aglikonem – związkiem niecukrowym), np. nukleozydy, glikozydy roślinne, itp. W tabeli wymieniono sacharydy najczęściej spotykane w przyrodzie.

Tabela 1.1. Klasyfikacja sacharydów najczęściej spotykanych w przyrodzie.

MonosacharydyPentozy Heksozy

Oligosacharydy

Polisacharydy Pochodne polisacharydó

waldoArabinozaKsylozaRyboza

ketoRybulozaKsyluloza

aldoGlukozaMannozaGalaktoza

ketoFruktozaSorboza

disacharydySacharozaLaktozaMaltozaCelobioza

trisacharydyRafinoza

pentozanyArabanKsylan

heksozanySkrobiaGlikogenCeluloza

HemicelulozyPektynyAminocukry

W skład węglowodanów wchodzą: węgiel, wodór i tlen. Z chemicznego punktu widzenia są to alkohole wielowodorotlenowe, zawierające w cząsteczce grupę aldehydową (aldozy) lub grupę ketonową (ketozy).

Związki zbudowane z jednej cząsteczki aldozy lub ketozy nazywa się monosacharydami. Ich charakterystyczną cechą jest obecność w cząsteczkach asymetrycznych atomów węgla (oznaczonych na rysunku gwiazdką), co warunkuje istnienie izomerów przestrzennych, czynnych optycznie tzn. skręcających płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo (-) lub prawo (+). Ich konfigurację przestrzenną (wywodzącą się od aldehydu glicerynowego) rozróżnienia się na podstawie układu na przedostatnim węglu, dodając przed nazwą monosacharydu literę D lub L. Izomery D i L różnią się między sobą właściwościami chemicznymi i fizycznymi.

W środowisku alkalicznym monosacharydy występują w formie łańcuchowej, natomiast w kwaśnym lub obojętnym w formie pierścieniowej (półacetalowej): piranozowej (sześcioczłonowy pierścień) lub furanozowej (pięcioczłonowy pierścień).

C*

C O

1

C

*

2

C

CH2-OH

H

H

H

OH

OH

HO3

4

5

6

*

D(-)-fruktozaketoheksoza

CH2-OH

C*

C O1

C

*

2

C

CH2-OH

H

H

H

OH

OH

HO3

4

5

6

*

H

C OHH

D(+)-glukozaaldoheksoza

*

szereg D

C*

CH2OH

H OH C*

CH2OH

HO H

szereg L

-D-fruktofuranoza

6

5

4

3HO

OH

H

H

H

CH2-OH

C

O

2

C

1

C

CHO

CH2-OH

wzór pionowy

C

O

C

CC

HOH2C

H

H

HOH

OH

OH

1

2

34

5

6CH2OH

wzór Hawortha

-D-glukopiranoza

H OHC

HO

OH

H

H

H

CH2-OH

C

O

C

C

1

2

3

4

5

6

H C OH

wzór pionowy

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2OH

HO

HHOH

H

H

H

OH

OH

wzór Hawortha

Pierścień furanozowy jest w zasadzie płaski, natomiast pierścień piranozowy nie leży na płaszczyźnie, lecz na powierzchni pofałdowanej, przypominającej formę krzesełkową cykloheksanu.

Monosacharydy w postaci cyklicznej mają dodatkowo jeden asymetryczny atom węgla więcej, co powoduje powstanie nowych izomerów (tzw. anomerów - i -). Jeśli grupa hydroksylowa przy pierwszym atomie węgla cyklicznej postaci cukru, czyli grypa półacetalowa –OH, jest skierowana przestrzennie tak samo jak grupa wodorotlenowa przy atomie drugim, to izomer (anomer) ten oznaczamy , jeśli jest skierowana przeciwnie, izomer nosi nazwę .

Glukoza wykazuje zjawisko mutarotacji: w odpowiednich warunkach izomery - i - mogą przechodzić jeden w drugi. Związki, w skład których wchodzą izomery - lub - różnią się znacznie między sobą wieloma właściwościami (np. amyloza zbudowana jest z -glukozy, a celuloza w sposób analogiczny z -glukozy).

Grupa hydroksylowa półacetalowa, czyli leżąca przy pierwszym atomie węgla piranozowej postaci cukru lub przy drugim furanozowej postaci, ze względu na swoją reaktywność chemiczną, jest odpowiedzialna za tworzenie wiązań O-glikozydowych, N-glikozydowych i S-glikozydowych.

Dwie aldozy (np. D-glukoza i D-mannoza) różniące się jedynie konformacyjnym położeniem grupy –OH przy drugim atomie węgla (sąsiadującym z grupą aldehydową) nazywa się epimerami. Epimeryzacja to przekształcanie jednej takiej aldozy w drugą.

Uwaga. Przy nazewnictwie enzymów, dla wygody, pojęcie epimeryzacji rozszerzono i dwie aldozy różniące się jedynie przestrzennym położeniem jednej grupy –OH przy którymś z asymetrycznych atomów węgla traktuje się jako epimery. Np. nazwa „4-epimeraza UDP-glukozowa” wskazuje, że enzym może przy czwartym atomie węgla dokonać epimeryzacji (w tym konkretnym przypadku przekształca UDP-1-glukozę w UDP-1-galaktozę).

2.1. Monosacharydy

Związki zbudowane z jednej cząsteczki aldozy lub ketozy nazywa się ogólnie monosacharydami (monozami) lub cukrami prostymi. W zależności od ilości atomów węgla w cząsteczce dzieli się je na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, itd.

Triozy. Spośród trioz w przyrodzie występuje dihydroksyaceton i oba izomery D- i L- aldehydu

glicerynowego.

CC

O

C

CC

HHHO

H OH

H

HCH2OH

HO OH

wzor konformacyjny Reeves`a/

-D-glukopiranoza

OH

OH

H

H

H

OHH

H

HO

CH2OH

C

C O

C

CC

1

23

4

5

6

OH

OH

HH

H

OHH

H

HO

CH2OH

C

C O

C

CC

1

23

4

5

6

* *

-D-glukopiranoza -D-glukopiranoza

dihydroksyacetonaldehyd

L-glicerynowy

CH2-OH

C O

CH2-OH

CHO

C

CH2OH

HO H

CHO

C

CH2OH

H OH

aldehydD-glicerynowy

Związki te w postaci estrów fosforanowych tworzą się w zielonych częściach roślin podczas fotosyntezy, w organizmach zwierzęcych między innymi podczas glikolizy oraz podczas fermentacji alkoholowej.

TetrozySpośród tetroz na uwagę zasługują D-erytroza, która pojawia się w cyklu pentozowym, a także

podczas fotosyntezy w zielonych częściach roślin w postaci estru fosforanowego oraz izomery D- i L-treozy tworzące się podczas degradacji izomerów D- i L- kwasu ksylonowego.

Pentozy

Pentozy występują obficie w przyrodzie. Tworzą się one w organizmach zwierzęcych i roślinnych w znacznych ilościach i to zarówno w stanie związanym, jako O-glikozydy, N-glikozydy lub wielocukry zwane pentozanami, jak i w stanie wolnym.

D-ryboza i D-dezoksyryboza są składnikami kwasów nukleinowych. D-rybuloza, m.in. jest związkiem, który przyłącza CO2 podczas fotosyntezy cukrów, w pierwszej

fazie procesu. L-arabinoza jest jednym z nielicznych L- cukrów występujących w przyrodzie. W postaci

spolimeryzowanej jest składową częścią m.in. śluzów, gum roślinnych, pektyn i hemiceluloz. D-ksyloza, zwana dawniej cukrem drzewnym, występuje w drewnie w postaci polisacharydu

ksylanu, będącego składnikiem hemiceluloz. D-ksyluloza pojawia się w postaci fosforanu podczas wzajemnych przemian pentoz w cyklu

pentozowym.Na uwagę zasługuje również L-ramnoza (uważana za metylopentozę), składnik wielu glikozydów i

antocyjanów.

Heksozy

Obok wymienionych wcześniej glukozy i fruktozy do najszerzej rozpowszechnionych w świecie ożywionym monosacharydów z tej grupy należą: D-mannoza i D-galaktoza.

CHO

CH2OH

CH OH

CH OH

CHO H

CHO H

CHO

CH OH

CH2OH

CH OH

CHO H

CHO H

CH OH

CH

CH OH

CHO H

CHO H

COOH

O

CH2OH

CHO H

HO

OHH

H

C

OC

C

CH2OH

D-mannoza D-galaktoza L-sorboza kwasgalakturonowy

C OHH

CHOCHO

CHO H

CH2OH

CH OH CHO H

CH2OH

CH OH

CHO

CHO H

CH2OH

D-treoza D-erytroza L-erytroza

CH2OH

CH OH

C OHH

CHO

CHO H

D-ksyloza

CH2OH

C O

CH2OH

CH OH

CHO H

D-ksyluloza

CH OH

CH3

CHO H

C OHH

CHO

CHO H

L-ramnoza

CHO H

CH2OH

C OHH

CHO

CHO H

L-arabinoza

CHO

CH2OH

CH OH

CH OH

CH2

D-dezokyryboza

C OHH

CHO

CH2OH

CH OH

CH OH

D-ryboza D-rybuloza

CH2OH

C O

CH2OH

CH OH

CH OH

D -glukoza jest najpospolitszą aldozą. Występuje w stanie wolnym w owocach, kwiatach, miodzie, krwi. Jest częścią składową wielu oligosacharydów (sacharozy, maltozy, laktozy). W olbrzymich ilościach występuje jako składnik polisacharydów, przede wszystkim skrobi, glikogenu, celulozy.

D -f ruktoza , najważniejsza z ketoz, w stanie wolnym występuje w owocach, zielonych częściach roślin, miodzie. Jest częścią składową sacharozy, rafinozy oraz polisacharydów – inuliny, lewanu.

D -ga l aktoza w stanie wolnym spotykana bywa rzadko (m.in. owoce bluszczu). Jest częścią składową disacharydu zwierzęcego – laktozy oraz dwóch innych oligosacharydów – melibiozy i rafinozy. Szczególnie szeroko są rozpowszechnione pochodne zawierające kwas galakturonowy takie,jak: agar, gumy, pektyny oraz polisacharydy otoczek bakteryjnych.

D - mannoza w stanie wolnym występuje raczej wyjątkowo, np. w skórkach pomarańczy. Spotykana bywa natomiast w postaci polisacharydów o budowie glikozydowej, zwanych mannozydami. Do pospolitszych mannozydów należy mannan, występujący w łupinach orzechów, w drożdżach. Polisacharyd zbudowany z kwasu mannurowego (pochodnej mannanu) występuje dość powszechnie w wodorostach morskich.

D - so rboza , również jedna z heksoz zasługująca na uwagę (z uwagi na jej wykorzystanie jako podstawowego surowca do produkcji witaminy C), występuje jako produkt utlenienia sorbitolu obecnego w soku nasion jarzębiny.

2.2. Oligosacharydy

Monosacharydy mogą kondensować tworząc disacharydy (zbudowane z dwóch cząsteczek cukru prostego), trisacharydy, tetrasacharydy, itd. o ogólnej nazwie oligosacharydów (połączenie od 2 do 10 cząsteczek monosacharydów). Charakter i właściwości powstałego cukru zależą od ilości połączonych monosacharydów, samych monosacharydów, z jakich zbudowany jest cukier złożony, rodzaju wiązania glikozydowego z punktu widzenia konfiguracji - lub - i wreszcie od miejsca ich połączenia, tzn. miejsca grupy wodorotlenowej jednego z monosacharydów, która utworzyła wiązanie glikozydowe (połączone mostkiem tlenowym) z grupą hydroksylową półacetalową drugiego monosacharydu.

Disacharydy

Disacharyd może być zbudowany z dwóch jednakowych lub różnych monosacharydów. Jeżeli w wiązaniu glikozydowym wzięły udział obie grupy hydroksylowe półacetalowe połączonych monosacharydów (jak ma to miejsce np. w sacharozie), to taki disacharyd nie wykazuje właściwości redukujących. Jeżeli w utworzonym disacharydzie jedna z grup hydroksylowych półacetalowych jest nadal wolna (np. w maltozie), to taki disacharyd wykazuje właściwości redukujące.

Do najczęściej spotykanych w przyrodzie disacharydów należą: sacharoza, maltoza, laktoza, celobioza, trehaloza.

Sacharoza, zwana również cukrem trzcinowym lub buraczanym, zasługuje na szczególne wyróżnienie wśród disacharydów, z uwagi na szerokie rozpowszechnienie w przyrodzie. Występuje w liściach, łodygach, nasionach, owocach, korzeniach i bulwach różnych roślin. Jej zawartość w łodygach trzciny cukrowej i bulwach buraków cukrowych może dochodzić do 24%. Znaczne jej ilości zawiera miód naturalny.

Zbudowana jest z jednej cząsteczki -D-glukozy i jednej cząsteczki -D-fruktozy połączonych wiązaniem 1-2 i stąd jej nazwa -1-D-glukopiranozylo--2- D-fruktofuranozyd. Jest cukrem nie redukującym.

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

O

CH2OH

HO

HHOH

H

H

H

OH

CH2OH6

5

43

21 OH

OH H

HHHOH2C

C

O

C

CC

sacharoza

rafinoza

6

sacharoza

CH2OH6

5

43

21 OH

OH H

HHHOH2C

C

O

C

CC

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2

OHO

HHOH

H

H

H

OHv

melibioza

6

5

4

3 2

1

CH2OH

HO

H

HOH

H

HH

OH

O

C C

C

OC

C

^

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2OH

HO

HHOH

H

H

H

OH

OH

OH

H

H

H

OHH

H

CH2OH

C

C O

C

CC

1

23

4

5

6

O

,

maltoza

Maltoza cukier słodowy, tworzy się podczas enzymatycznego rozpadu skrobi. Jest -glikozydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem -1,4 i stąd jej nazwa -1,4-D-glukopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Celobioza w stanie wolnym nie znaleziona w przyrodzie. Powstaje podczas enzymatycznej hydrolizy celulozy. Jest -glikozydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem -1,4 i stąd jej nazwa -1,4-D-glukopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Laktoza, czyli cukier mlekowy, jest związkiem dobrze znanym, występującym w mleku ssaków. Zbudowanym jest z galaktozy i glukozy połączonych wiązaniem -1 od strony galaktozy i stąd jej nazwa -1,4-D-galaktopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Spośród innych disacharydów wypada wspomnieć o melibiozie, zbudowanej z galaktozy i glukozy, połączonych wiązaniem -1 od strony galaktozy i stąd jej nazwa -1,6-D-galaktopiranozylo-glukopiranozyd. Jest cukrem redukującym.

Rafinoza, trisacharyd występujący w burakach cukrowych, który podczas ich przeróbki gromadzi się w melasie. Zbudowana jest z galaktozy, połączonej wiązaniem -1,6 z glukozą, a ta wiązaniem -1--2 z fruktozą. Jest cukrem nie redukującym.

6

5

4

3 2

1

CH2OH

HO

HHOH

H

HH

OH

celobioza

OH

OH

HH

H

OHH

H

CH2OH

C

C O

C

CC

O

C C

C

OC

C 1

23

4

5

6

6

5

4

3 2

1

CH2OH

HO

H

HOH

H

HH

OH

OH

OH

H

H

H

OHH

H

CH2OH

C

C O

C

CC

O

C C

C

OC

C 1

23

4

5

6

laktoza

2.3. PolisacharydyPolisacharydy zbudowane są z setek a nawet tysięcy połączonych ze sobą cząsteczek

monosacharydów, tworząc jedną olbrzymią cząsteczkę. Ich skład z reguły przedstawia się wzorem sumarycznym: (C6H10O5)n. Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Niektóre, jak skrobia i celuloza, spotykane są powszechnie u roślin. Do związków pokrewnych polisacharydom zalicza się także hemicelulozy, aminocukry i pektyny.

Skrobia jest szeroko rozpowszechniona w świecie roślinnym; jest zawarta w ziarnach zbóż i bulwach roślin. Skrobia jest mieszaniną dwóch polisacharydów: rozpuszczalnej w wodzie amylozy (około 20%) oraz nierozpuszczalnej w wodzie amylopektyny (około 80%).

A m y l o z a zbudowana jest z reszt α-D-glukopiranoz połączonych wiązaniem α-1,4-glikozydowym. Jej łańcuch jest nie rozgałęziony.

A m y l o p e k t y n a , podobnie jak amyloza, zbudowana jest z reszt glukopiranozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. W przeciwieństwie do amylozy jest jednak rozgałęziona; od jej głównego łańcucha, co 24-30 reszt glukozowych, odchodzą łańcuchy boczne utworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe. Jej budowę można schematycznie przedstawić następująco:

Dekstryny są produktem częściowej hydrolizy skrobi. Biorąc pod uwagę ciężar cząsteczkowy można je uszeregować następująco:

Glikogen, zapasowy węglowodan zwierząt, o bardziej rozgałęzionych łańcuchach aniżeli amylopektyna; co 8-12 reszt glukozowych pojawia się rozgałęzienie utworzone przez wiązanie -1,6-glikozydowe.

Dekstran to wielocukier o masie cząsteczkowej od 40 do 200 kDa, którego budowa przypomina amylopektynę. Większość cząsteczek glukozy połączona jest jednak wiązaniem -1,6-glikozydowym, a tylko nielicznie występują wiązania -1,4 (około 10%).

Inulina, zbudowana podobnie jak skrobia z tym, że jest polifruktozofruktozydem. Reszty fruktofuranozydowe połączone są za sobą wiązaniem -1,2-glikozydowym.

Pulullan, polisacharyd zbudowany z cząsteczek maltotriozy połączonych wiązaniem -1,6-glikozydowym. Schematycznie jego budowę można przedstawić następująco:

Celuloza, szeroko rozpowszechnio-na w przyrodzie, jako główny składnik ścianek komórkowych roślin. Pod względem chemicznym nie jest jednorodnym związkiem, lecz można ją zaklasyfikować do przynajmniej dwóch głównych klas, alfa i beta. -Celuloza rozpuszcza się w 17% roztworze wodorotlenku sodowego, podczas gdy -celuloza w tych warunkach jest nierozpuszczalna. -Celulozę używa się do produkcji sztucznego włókna.

erytrodekstryna achrodekstrynaamylodekstrynaskrobia

pulullan

O OO

O

OOO

O O

O

O - wiązanie -1,6

O OO - maltotrioza (wiązanie -1,4)

O O O O O O O OOO O

O O O O O O OO

O

OOO

O O O O O O O O

amylopektyna O

O

O- wiązanie -1,6

- końcowa redukująca grupa

O O - wiązanie -1,4

O - reszta glukozowa

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2OH

HHOH

H

H

H

OH

O

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CCO

CH2OH

HHOH

H

H

H

OH

O

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CCO

CH2OH

HHOH

H

H

H

OH

amyloza

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2OH

HO

HHOH

H

H

H

OH

NH COCH3

N-acetylo-2-dezoksy-2-aminoglukoza

NH2

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

CH2OH

HO

HHOH

H

H

H

OH

2-dezoksy-2-aminoglukoza

Budową przypomina amylozę z tym, że reszty glukozowe połączone są wiązaniem -1,4-glikozydowym.

Hemicelulozy, niejednorodna grupa polisacharydów występujących, obok celulozy i ligniny, w zdrewniałych tkankach roślin. Wśród hemiceluloz rozróżnia się ksylany (z D-ksylozą), galaktany (z D-galaktozą), arabany (L-arabinozą) oraz mannany (z D-mannozą). W skład hemiceluloz wchodzą również kwasy uronowe.

Ksylan, polisacharyd zaliczany do pentozanów, pochodzący z drewna, otrąb i łupin orzeszka ziemnego. Po hydrolizie daje D-ksylozę Niektóre ksylany, podobnie jak celuloza, mają strukturę liniową, inne – rozgałęzioną i dodatkowo zawierają cząsteczki L-arabinozy lub kwasu D-glukuronowego. Główny łańcuch zbudowany jest z reszt D-ksylopiranozy połączonych wiązaniami -1,4-glikozydowymi, od którego odchodzą liczne rozgałęzienia - głównie przy węglach 2 i 3.

Pektyny zazwyczaj występuje w postaci złożonego kompleksu zwanego protopektyną, którego skład schematycznie można przedstawić następująco:

arabanzmetoksylowany kwas poligalakturonowygalaktan

Główną strukturę stanowi łańcuch zbudowany z reszt kwasu D-galakturonowego, połączonych wiązaniami -1,4-glikozydowymi. Grupy karboksylowe reszt kwasu galakturonowego są w mniejszym lub większym stopniu zestryfikowane alkoholem metylowym. Od węgli 2 i 3 głównego łańcucha odgałęziają się łańcuchy boczne.

Aminocukry. W przyrodzie znaleziono dwie pochodne aminowe cukrów: 2-dezoksy-2-aminoglukozę i 2-dezoksy-2-aminogalaktozę. Reszty N-acetylo-2-aminoglukozy połączone są wiązaniem -1,4-glikozydowym są podstawowym składnikiem chityny. Stąd chitynę uważa się za pochodną aminową celulozy acetylowaną przy azocie. D-Glukozoamina wchodzi również w skład kwasu hialuronowego, podstawowej substancji tkanki łącznej.

celuloza

6

5

4

3 2

1

CH2OH

HHOH

H

HH

OH

OH

HH

H

OHH

H

CH2OH

C

C O

C

CC

O

C C

C

OC

CO 1

23

4

5

6

OH

HH

H

OHH

H

CH2OH

1

23

4

5

6

C

C O

C

CC

O O

reszta celobiozy

6

5

4

3 2

1C

C O

C

CC

COOH

HHOH

H

H

H

OH

O

OH

H

H

H

OHH

H

C

C O

C

CC

COOCH3

1

23

4

5

6

OO

fragment zmetoksylowanego kwasu poligalakturonowego

11

3. Aminokwasy, peptydy i białka 3.1. Aminokwasy

Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład białek mają konfigurację L i należą do grupy aminokwasów, to znaczy mają grupę aminową przy węglu sąsiadującym z grupą karboksylową. Ogólny ich wzór jest następujący:

W organizmach żywych występują również aminokwasy nie będącymi składnikami białek. Poniżej podano wzory najwazniejszych aminokwasów spotykanych w przyrodzie ożywionej.

Aminokwasy spotykane w białkach

C

COO-

R

+H3N HC H

R

COO-

+H3N

lub

hydroksylizyna

C NH2

COOH

CH3

HC NH2

COOH

CH

H

H3C CH3

C NH2

COOH

CH

H

CH3

OH

CH2

COOH

NH2

glicyna

C NH2

COOH

CH2

H

CHH3C CH3

C NH2

COOH

CH

H

CH3H2C

H3C

alanina walina leucyna izoleucyna

N

H

COOH

prolina

C NH2

COOH

CH2

H

OH

C NH2

COOH

CH2

H

S S

C NH2

COOH

CH2

H

cystyna

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

CH2

CH2 NH2

C NH2

COOH

CH2

H

OHseryna treoninatyrozyna

N

H

COOH

HO

hydroksyprolina

C NH2

COOH

CH2

H

SH

cysteina

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

CH2 NH C NH2

NH

lizyna arginina

C NH2

COOH

CH2

H

N

N

H

histydyna

CH2

CH2 NH2

C NH2

COOH

CH2

H

CH OH

C NH2

COOH

CH2

H

fenyloalanina

C NH2

COOH

CH2

H

N

H

tryptofan

C NH2

COOH

CH2

H

CH2 S CH3

metionina

C NH2

COOH

CH2

H

COOH

kwasasparaginowy

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

COOHkwas

glutaminowy

C NH2

COOH

CH2

H

CO NH2

asparagina

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

CO NH2

glutamina

12

Aminokwasy niebiałkowe

Tyroksyna i trijodotyronina pochodne nie występującej w przyrodzie tyroniny, występują jedynie w tyreoglobulinie, hormonalnym białku tarczycy. β-alanina, karnityna oraz N-metylohistydyna są aminokwasami biologicznie czynnymi lub też są składnikami biologicznie czynnych substancji niskocząsteczkowych. Homocysteina i homoseryna są metabolitami pośrednimi przemian metioniny i cysteiny. Kwas β-aminomasłowy jest produktem końcowym rozkładu nukleotydów pirymidynowych. Z kolei ornityna i cytrulina biorą udział w syntezie mocznika.

Aminokwasy o konfiguracji D występują w przyrodzie rzadko i to wyłącznie w związkach względnie prostych, nie będącymi białkami (np. w niektórych antybiotykach pochodzenia bakteryjnego o budowie peptydowej).

W laboratoriach sztucznie otrzymuje się całą gamę aminokwasów nie spotykanych w przyrodzie ożywionej. Z ich wykorzystaniem np. do produkcji leków wiąże się duże nadzieje.

Podział α-aminokwasów

Poszczególne α-aminokwasy różnią się strukturą rodnika. Stosuje się różne kryteria ich podziału Rozróżnia się aminokwasy alifatyczne i aromatyczne, a w zależności od ilości grup aminowych i karboksylowych aminokwasy mono- lub di- aminowe lub karboksylowe. Rodniki aminokwasów cysteiny i metioniny w swojej budowie zawierają atom siarki (są to aminokwasy siarkowe). Rodniki waliny, leucyny i izoleucyny posiadają rozgałęziony łańcuch alifatyczny (aminokwasy rozgałęzione). Prolina jest z kolei iminokwasem (kwasem pirolidyno-karboksylowym).

Często aminokwasy dzieli się biorąc pod uwagę hydrofobowość lub hydrofilowość łańcucha bocznego. Aminokwasy z niepolarnymi rodnikami węglowodorowymi (glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna) lub zawierające grupę funkcyjną o znikomej polarności (prolina, fenyloalanina, tryptofan, metionina i cystyna) zalicza się do aminokwasów hydrofobowych.

Z punktu widzenia wartości pokarmowych (dietetycznych) aminokwasy dzieli się na egzogenne (niezbędne) i endogenne (nie niezbędne). Aminokwasy egzogenne muszą być dostarczone organizmowi zwierzęcemu z zewnątrz (np. z pokarmem), z uwagi na zanik zdolności do ich syntetyzowania. Dla człowieka niezbędnymi aminokwasami są wal ina , l eucyna , i zo l eucyna , f enyloa l an ina , t r yp tofan , t reonina , me t ionina i l i zyna .

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

CH2 NH C NH2

O

C NH2

COOH

CH2

H

CH2

CH2 NH2

ornityna cytrulina

CH2 NH2

CH2

COOH

-alanina

C NH2

COOH

CH2

H

O

OH

J J

J

C NH2

COOH

CH2

H

O

OH

J J

JJ

trijodotyronina tyroksyna

tyreoglobulina

C NH2

COOH

CH2

H

CH2 SH

C NH2

COOH

CH2

H

CH2 OH

homocysteina homoseryna

CH2

COOH

CH

CH3

H2N*

kwas-aminomaslowy

13

3.2. PeptydyGrupa aminowa jednego α-aminokwasu może reagować z grupą karboksylową innego

α-aminokwasu tworząc wiązan i e pep tydowe –CO–NH–, które z chemicznego punktu widzenia jest szczególnym przypadkiem wiązania amidowego (co ma pewne znaczenie, z uwagi na specyficzność działania niektórych enzymów). Związki powstałe z takiego połączenia nazwano peptydami .

Podane wyżej równanie przedstawia jedynie schemat syntezy peptydu i jego uproszczony wzór, nie uwzględniający budowy przestrzennej.

3.2.1. Budowa peptydów - wiązanie peptydowe

Badania krystalograficzne wykazały, że wiązanie C–N w wiązaniu peptydowym jest znacznie krótsze niż zwyczajne pojedyncze wiązanie tego typu. Jest to spowodowane, mezomerycznym charakterem wiązania peptydowego (hybrydyzazja typu sp2). Wynikiem tej mezomerii jest brak swobodnego obrotu wokół wiązania C – N i stąd istnienie tylko dwóch stabilnych konformacji cis i trans. Ogólnie w natywnych peptydach i białkach występuje głównie forma trans.

Zgodnie z tym właściwsze jest przedstawianie wiązania peptydowego za pomocą dwu wzorów granicznych lub wzorem, na którym symbolicznie zaznaczono delokalizację elektronów.

Z badań rentgenograficznych wynika, że konfiguracja wiązania peptydowego nie zależy od rodzaju i właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących wiązanie. Wyjątek pod tym względem stanowi prolina i hydroksyprolina, których grupy iminowe związane są z łańcuchami bocznymi.

Delokalizacja elektronów w wiązaniu peptydowym sprawia, że wszystkie cztery jego atomy:

CONH a również i oba atomy Cα

łańcuchów bocznych, leżą w jednej płaszczyźnie (mówi się o planarności wiązania peptydowego). W konsekwencji wiązanie łączące atom węgla i azotu wykazuje znaczną sztywność właściwą wiązaniu podwójnemu, a swobodny obrót wokół niego wymaga przezwyciężenia oporu około 88 kJ/mol. Na poniższym rysunku przedstawiono perspektywicznie strukturę wiązania peptydowego w hipotetycznym dipeptydzie.

Drugim ważnym wiązaniem kowalencyjnym, spotykanym w cząsteczkach peptydów, jest wiązanie disulfidowe (disiarczkowe), tworzone przez sąsiadujące ze sobą grupy tiolowe – SH pochodzące z reszt cysteiny. Rozróżnia się wewnątrzłańcuchowe wiązania disulfidowe, które występują w tym samym

CHH2N

R1

COOH + CHH2N COOH

R2

H2O

CHH2N

R1

CO NH CH COOH

R2

aminokwas 1 aminokwas 2 dipeptyd

C N

O

C H

C

C N

C H

CO

+

-..

-

+

delokalizacja elektronow w wiazaniu peptydowym

H

H

H

R2H

N

O

CC

H

N

O

C C

CH2N

R1

COOH

R2

14

łańcuchu peptydowym, oraz międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe występujące między dwoma różnymi łańcuchami peptydowymi:

Wewnątrzcząsteczkowe wiązania S – S występują np. w oksytocynie, wazopresynie, w łańcuchu A insuliny i w rybonukleazie. Wiązania te mogą spowodować, że części cząsteczki o zupełnie różnych sekwencjach znajdują się w bezpośrednim zbliżeniu, jak np. w rybonukleazie. W utlenionej formie glutationu dwa identyczne łańcuchy peptydowe połączone są przez kowalencyjne wiązanie disulfidowe. W insulinie w ten sam sposób połączone są dwa różne łańcuchy.

Sąsiadujące ze sobą wiązania peptydowe, np. w dwu równoległych peptydach, mogą tworzyć wiązania wodorowe >CO...HN<, w których odległość atomu tlenu od atomu azotu wynosi nieco mniej niż 0,3 nm.

Oprócz tych wiązań, czynnikami mającymi wpływ na przyjęcie przez cząsteczkę peptydu określonej konformacji są oddziaływania kwasowych, zasadowych, aromatycznych i alifatycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów ze sobą lub z łańcuchem głównym peptydu. Te oddziaływania, zwykle stabilizujące, staja się w pełni efektywne dopiero w białkach, niemniej mają one także znaczenie dla utrzymania odpowiednich efektywnych konformacji wielu polipeptydów biologicznie aktywnych.

3.2.2. Nazwy i wzory peptydów

Nazwy peptydów są tworzone w zależności od liczby rodników aminoacylowych tworzących cząsteczkę peptydu. Peptyd zbudowany z dwu aminokwasów nazywa się dipeptydem, z trzech —tripeptydem, z dziesięciu — dekapeptydem, itp. Peptydy zawierające w cząsteczce do 10 rodników aminoacylowych nazywa się o l igopeptydami , zawierające zaś większą liczbę —pol ipeptydami . Te ostatnie stanowią przejście do białek (zaliczanych do makropeptydów), których cząsteczki są zbudowane ze 100 i więcej rodników aminoacylowych.

Tabela 1.2. Nazwy i symbole najpospolitszych -aminokwasów

Rodnik aminoacylowy

Symbol Rodnik aminoacylowy

Symbol

AlanylArginylAspargilAsparginylCysteilCysteinylFenyloalanylGlicylGlutamilGlutaminylHistydylHydroksylizyl

AlaArgAspAsn lub Asp(NH2)CysCysCys1

Fen (Phe)Gli (Gly)GluGln lub Glu(NH2)HisHyl lub Liz(OH)

HydroksyprolilIzoleucylLeucylLizylMetionylOrnitylProlinaSerylTreonylTryptofanylTyrozylWalil

Hyp lub Pro(OH)Ileu (Ile)LeuLiz (Lys)MetOrnProSerTre (Thr)Try (Trp)TyrWal (Val)

W nawiasach podano symbole zalecane przez Unię Biochemiczną.

1 również Cys Cys

C

HN

CH

C

O

O

NH

CH2 S S H2C

C

HN

O

HC

NH

CO

mostek disiarczkowy

15

Szczegółowe nazwy peptydów są albo zwyczajowe, albo mają charakter systematycznych nazw chemicznych określających je jako aminoacyloaminokwasy. Na przykład tripeptyd zbudowany z glicyny, alaniny i cysteiny nosi nazwę glicyloalanylocysteiny. Nazwa ta podaje skład aminokwasowy peptydu i jednocześnie kolejność łączenia się aminokwasów. I tak tripeptyd wspomniany wyżej jest zupełnie różnym od alanyloglicylocysteiny, peptydu zbudowanego z identycznych aminokwasów, ale połączonych w innej kolejności.

W celu uproszczenia zapisywania wzorów peptydów i uniknięcia długich nazw, ustalono, by rodniki aminoacylowe oznaczać pierwszymi trzema literami nazwy aminokwasu. W tabeli 1.2 podano nazwy i symbole rodników najpospolitszych -aminokwasów.

Przy pisaniu wzorów peptydów symbole łączy się krótką kreską, przy czym lewa strona symbolu odpowiada grupie aminowej, a jego prawa strona - grupie karboksylowej. Wzory przytoczonych wyżej tripeptydów można więc zapisać symbolicznie: Gli-Ala-Cys oraz Ala-Gli-Cys. Jeżeli zachodzi specjalna potrzeba wyraźnego wskazania kierunku, w jakim połączone są ze sobą cząsteczki aminokwasów w peptydzie (np. przy przedstawianiu struktury peptydów pierścieniowych) wówczas zaznacza się strzałką kierunek powstawania wiązań od grupy karboksylowej do aminowej: GliAlaCys. Jeżeli kolejność łączenia się aminokwasów nie jest znana dla jakiegoś fragmentu łańcucha polipeptydowego, to fragment ten ujmuje się w nawiasy, wewnątrz których symbole oddziela się przecinkami, np. Gli-Ala-Cys-(Arg, Tyr, Leu)-Pro-Ala-Fen. Końcowy aminokwas z wolną grupą aminową, tzw. N-terminalny aminokwas, symbolizuje się dopisaniem litery H- lub H2N-, zaś końcowy aminokwas z wolną grupą karboksylową, czyli C-terminalny aminokwas, dodaniem liter -OH lub -COOH: H-Gli-Ala-Cys-OH lub H2N-Gli-Ala-Cys-COOH.

3.2.3. Ważniejsze peptydy naturalne

W ciągu ostatnich 20 lat liczba peptydów znalezionych w materiale zwierzęcym, roślinnym i bakteryjnym ogromnie wzrosła. Większość znajdowanych w przyrodzie peptydów składa się wyłącznie z aminokwasów, które zwykle spotykamy w białkach. Jednak w naturalnych peptydach często występują inne proste aminokwasy, takie jak β-alanina i kwas γ-aminomasłowy.

Najprostszym i jednocześnie najwcześniej poznanym dipeptydem wyodrębnionym z tkanek była ka rnozyna , czyli -alanylohistydyna. Obok niej w mięśniach kręgowców spotyka się także anserynę: -alanylo–N-metylohistydynę. Rola obydwu dipeptydów jest do dzisiaj nie poznana.

Glutation (GSH) jest tripeptydem, który szeroko rozpowszechniony jest w zarówno w tkankach zwierzęcych jak i roślinnych. Zawiera on kwas glutaminowy, cysteinę i glicynę. Był pierwszym znanym peptydem zawierającym wiązanie inne niż α-peptydowe.

Związek ten łatwo ulega odwracalnym przemianom oksydacyjno-redukcyjnym. Reakcja utlenienia jest katalizowana solami Cu i Fe. Redukcja disulfidu i przekształcenie do GSH katalizowane jest przez reduktazę glutationową.

Funkcje biochemiczne glutationu są bardzo różne. Jest to koenzym hydrolazy hydroksyacyloglutationowej, dehydrogenazy formaldehydowej, tautomerazy indolilopirogronianowej, izomerazy maleiloacetooctanowej i innych enzymów. Stanowi on również grupę prostetyczną dehydrogenazy fosfogliceroaldehydowej oraz odgrywa pewną rolę w działaniu dehydrochlorynazy DDT, którą odkryto w odpornych na DDT muchach domowych. Glutation jest także bardzo ważnym związkiem w wielu biologicznych reakcjach redox, ponieważ może stabilizować wolne grupy – SH.

COOH

CH-NH2

CH2

CH2 C N

O

H

CH

CH2

SH

C

O

N

H

CH2 COOH

glutation

Glu

Cys

SH

Gli2 -2H+

Glu

Cys Gli

S

S

Cys Gli

Glu

utlenianie i redukcja glutationu

16

Biosynteza glutationu zachodzi następująco:Glu + Cys +ATP → Glu(Cys) + ADP + H3PO4 IGly + Glu(Cys) + ATP → Glu(Cys-Gly) + ADP + H3PO4 II

Reakcja I jest katalizowana przez syntetazę γ-glutamylocysteinową, a reakcja II przez syntetazę glutationową.

Hormony peptydowe

Hormony są substancjami chemicznymi, produkowanymi w specjalnych organach lub tkankach i przynoszonymi do miejsca działania poprzez układ krwionośny. Ta chemicznie zróżnicowana grupa substancji – regulatorów, między innymi, obejmuje pewną liczbę peptydów i białek. Znaczna liczba hormonów peptydowych i białkowych produkowana jest w gruczołach wydzielania wewnętrznego (podwzgórze, przysadka, tarczyca, przytarczyce, komórki Langerhansa w trzustce, itp.). Pozostała część jest produkowana w specjalnych tkankach. Na tej podstawie rozróżniamy hormony gruczołowe i tkankowe.

Wiele ze znanych hormonów peptydowych ma prekursory białkowe, z których w skutek działania enzymów następuje uwalnianie aktywnych związków. Typowymi przykładami są angiotensyna, bradykinina, kalidyna i insulina. Przypuszcza się, że podobne metaboliczne prekursory istnieją dla wazopresyny, gastryny, glukagonu, hormonu paratyreotropowego i ACTH. Najpierw, na rybosomach zachodzi synteza biologicznie nieaktywnych prekursorów o dużej masie cząsteczkowej. Następnie jeden lub więcej enzymów uwalnia hormony lub prohormony. Okres półtrwania wolnych hormonów nie przekracza zwykle 30 min. Są one dezaktywowane przez różne egzo i endopeptydazy.

Angio tensyna I I zaliczana do oligopeptydów jest oktopeptydem wytwarzanym w nerkach o wzorze: H-Asp-Arg-Wal-Tyr-Ileu-His-Pro-Fen-OH. Hormon ten powoduje wzrost ciśnienia krwi i pobudza wytwarzanie hormonów kory nadnercza. Jest to jeden z najefektywniejszych regulatorów ciśnienia krwi. Związek ten wywołuje silny skurcz naczyń krwionośnych, przez co automatycznie zwiększa się ciśnienie krwi.

Peptydy regulacyjne

Od czasów odkrycia pierwszych hormonów rośnie stale liczba „chemicznych posłańców”, czyli związków niosących określoną informację biologiczną od komórek wydzielniczych do komórek docelowych. Ostatnie 20 lat przyniosło wiele doniesień na temat nieznanych dotąd peptydów o aktywności: hormonalnej, neuromodulacyjnej, immunoregulacyjnej i mitogennej. Wszystkie te peptydy określane są często wspólną nazwą pep tydów regul acyj nych .

Przyjmuje się obecnie trzy podstawowe sposoby przekazywania informacji międzykomórkowej z udziałem peptydów regulacyjnych: endokrynny, parakrynny i autokrynny.

(1) Transport endokrynny, w którym peptyd syntetyzowany przez wyspecjalizowane komórki wydzielany jest do krwioobiegu i przenoszony z krwią do komórek docelowych. Ten sposób transportu jest typowy dla hormonów dokrewnych.

(2) Hipoteza transportu parakrynnego zakłada, że peptydy regulacyjne przenoszone są w drodze dyfuzji międzykomórkowej. Przypuszczalnie wiele peptydów działa lokalnie tą drogą. Podobny sposób transportu (neuroparakrynny) przyjmuje się w przypadku przenoszenia sygnału przez synapsy chemiczne w obrębie układu nerwowego.

(3) Hipoteza regulacji autokrynnej przyjmuje, że komórkami docelowymi są te same komórki, które syntetyzują peptyd regulacyjny. Regulacja autokrynna ma przypuszczalnie istotne znaczenie w kontroli wzrostu komórek neoplastycznych, aczkolwiek autoregulacja jest zjawiskiem stwierdzonym wielokrotnie w hodowlach komórek nietransformowanych.

Antybiotyki o budowie peptydowej peptydowe

Liczne antybiotyki wytwarzana przez mikroorganizmy mają budowę peptydową. Niektóre z nich produkowane są na skalę przemysłowa w oparciu o wgłębną hodowlę bakterii Bacillus. Jako przykład można wymienić gr amicydynę S, pierścieniowy dziesięciopeptyd wytwarzany przez Bacillus brevis. Gramicydynę S stosuje się jako składnik maści i roztworów używanych zewnętrznie do leczenia owrzodzeń oraz zainfekowanych ran i oparzeń.

17

Bakterie Bacillus brevis wytwarzają jeszcze inne antybiotyki, m.in. t yrocydyny A, B i C, będące również cyklicznymi oligopeptydami, zawierającymi -D-fenyloalaninę, podobnie jak gramicydyna S. Znanych jest obecnie ponad 25 antybiotyków wytwarzanych przez różne szczepy tych bakterii.

Innym przykładem antybiotyku o budowie peptydowej jest bacyt racyna , wytwarzana na skalę przemysłową (m.in. w PZF „POLFA” w Pabianicach) w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus subtilis.

Poszczególne szczepy bakterii Bacillus subtilis produkują ponad 65 antybiotyków o budowie polipeptydowej. Z kolei Bacillus polymyxa wytwarza po l imyksyny. Wszystkie te antybiotyki działają na bakterie gramujemne, gramdodatnie i grzyby. Ich działanie jest różne. Niektóre blokują syntezę ściany komórkowej lub zakłócają funkcje błon biologicznych, inne, mniej liczne, zakłócają replikację, transkrypcję lub translację.

Aktynomycyny (nazywane chromopeptydami gdyż zawierają chromofor) są bardzo toksycznymi antybiotykami produkowanymi przez różne gatunki Streptomyces. Wydzielono i wykrystalizowano więcej niż 20 różnych związków należących do tej grupy. Różnią się one jedynie sekwencja aminokwasową układu cyklicznego zbudowanego z dwóch pierścieni laktonowych przyłączonych do aktynocyny wiązaniami amidowymi. W tej grupie antybiotyków, aktynomyc ynaC1 wykazuje najsilniejsze działanie przeciwbakteryjne.

Peni cyl i na jest najstarszym i najlepiej poznanym antybiotykiem - mówi się o niej, że jest prototypem antybiotyków. Jej budowa ma jednak mało wspólnego z peptydami, tym niemniej rozpatruje się ją przy okazji omawiania antybiotyków o budowie peptydowej. W niektórych publikacjach mówi się o pseudopeptydowej budowie penicyliny:

D-Fen L-WalL-Orn

L-Pro

L-Leu

L-LeuL-Wal L-Orn D-Fen

L-Pro

gramicydyna S

aktynocyna

Aktynomycyna C1

O N

CO

CO

H3C

H3C

NH2O

NH

NH

Thr

Thr SarPro Me-Val

D-Val

D-Val

Me-ValPro Sar

Sar = sarkozyna (N-metyloglicyna)Me-Val = metylowalina

cysteina

C

HC N

CHS

C

CH

O

H3C

H3CHOOC

NH CO R

walina

R = CH2

benzylopenicylina

penicylina

N

S CH

NH2

CHCH2-CH3

CH3

CO

D-Glu L-Leu

L-His

D-Fen L-Asp

L-Ile

D-Orn

D-Asn

L-Liz L-Ile

bac ytracy na

18

Wytwarzana jest przez pleśń Penicillium notatum. Biogeneza jej wynika z połączenia waliny oraz cysteiny. W jej cząsteczce występuje silnie napięty czteroczłonowy pierścień -laktamowy oraz drugi pierścień zawierający siarkę. Grupa aminowa cysteiny jest N-acylowana, przy czy rodnik R kwasu acylującego może mieć różną naturę. Np. benzylopenicylina zawiera rodnik benzylowy.

Depsipeptydy

Nazwa deps ipeptyd , jest kombinacją terminów depsyd (ester hydroksykwasu) i peptyd. Nazwę tę zaproponował Szemiakin w 1953 roku w celu określenia związków, które zawierają zarówno wiązania estrowe jak i peptydowe.

R1 R2 R1 R2 R1

│ │ │ │ │ - NH – CH – CO – O – CH – NH – CH - CO – O – CH – CO – NH – CH – CO –

R1- reszty aminokwasuR2 – reszta hydroksykwasu

Związki cykliczne tego rodzaju wykryto w dużych ilościach w mieszaninie produktów metabolizmu bakterii. Wykazują one zadziwiająco duża aktywność antybiotyczną. Szersze zastosowanie tych związków w medycynie jest ograniczone ze względu na to, że wiązania estrowe bardzo łatwo ulęgają rozszczepieniu w warunkach sprzyjających hydrolizie.

Do depsipeptydów, zawierających wyłącznie aminokwasy (często także ich pochodne N-metylowe i D–aminokwasy) i hydroksyaminokwasy, zaliczamy: eniatyny, amidomycynę, walinomycynę, sporydesmolidy, serratomolid i esperynę.

W innych depsipeptydach mogą istnieć wiązania estrowe utworzone z udziałem grup hydroksylowych hydroksyaminokwasów, takich jak seryna i treonina. Depsipeptydy mogą także zawierać skomplikowane jednostki strukturalne, których nigdy nie wykryto w białkach. Do tej grupy należą: pektynomycyny, etamycyna i echinomycyna. Depsipeptydy w zależności od ich struktury dzieli się na O–peptydy, peptolidy i laktony peptydowe.

Najprostszym, występującym w przyrodzie depsipeptydem jest fitopatogenetyczna toksyna z Pseudomonas tabaci. Cząsteczka tego związku składa się z cząsteczek kwasu mlekowego i 2,5-diaminoadypinowego, związanych ze sobą w taki sposób, że powstaje pierścień dioksomorfolinowy:

Struktura innego depsipeptydu, amidomycyn y jest do tej pory nie wyjaśniona. Wiadomo tylko, że depsipeptyd ten składa się z kwasu D–hydrosywalerianowego i D–waliny. Jego działanie antybiotyczne polega na hamowaniu wzrostu niektórych mikroorganizmów wywołujących choroby roślin oraz niektórych typów drożdży.

Walinomycyna , nazywana tak ze względu na dużą zawartość waliny, jest cyklicznym dwunastopeptydem. Działa ona na M.tuberculosis

Serr a tomol id , cykliczny tetradepsipeptyd, oraz e spe ryna zawierają β–hydroksykwasy. W wyniku całkowitej hydrolizy serratomolidu stwierdzono, że zawiera on L–serynę i kwas D-β-hydroksydekanowy.

Protaminy

Do peptydów zalicza się również prot aminy , polipeptydy o masie cząsteczkowej rzędu 16 kDa wyizolowane z jąder plemników ryb. Zawierają one znaczne ilości argininy, przekraczające połowę wszystkich aminokwasów w cząsteczce, stąd wybitnie zasadowe właściwości.

CH

HNC

CH

OC

CH3

O

O

CH2CH2CH

NH2

HOOC

depsipeptyd z Pseudomonas tabaci

19

Toksyny peptydowe

Śmiercionośne toksyny zawarte w kapeluszu muchomora Amanita phalloides dzieli się na fallatoksyny (falloidyna, falloina i fallacydyna) i amatoksyny (α-, β-, γ– amanidyny), które są bardziej toksyczne, ale działają wolniej. Związki te są cyklicznymi siedmiopeptydami.

Fallacydyna zamiast jednostki Ala–D-Thr, wchodzącej w skład falloidyny, zawiera kwas Val-D-erytro–β-hydroksyasparaginianowy.

Amatoksyny, które składają się wyłącznie z L–aminokwasów są także siedmiopeptydami cyklicznymi. Zamiast grupy tioeterowej występuje grupa sulfotlenkowa. O toksyczności stanowi obecność grupy γ – hydroksylowej w łańcuchu bocznym izoleucyny. Amanulina nie zawiera tej grupy hydroksylowej i mimo to, że pod względem struktury jest bardzo podobna do γ–amatyliny, jest nietoksyczna.

Można się całkowicie zabezpieczyć przed działaniem tych toksyn jedynie wtedy, gdy w tym samym czasie, co toksynę spożyje się odpowiednią dawkę antamanidyny. Zabezpieczające działanie antamanidyny i niektórych jej analogów związane jest z ich działaniem na błony. Związki te tworzą kompleksy z jonami K+ i Na+, analogicznie do tworzenia eniatyny i walinomycyny.

Peptydy strepogeninowe

St r epogen iny pobudzają wzrost bakterii, głównie bakterii kwasu mlekowego. Ich obecność stwierdzono np. w ekstraktach z wątroby, soku pomidorowym i częściowych hydrolizatach enzymatycznych, uzyskanych z insuliny, kazeiny, rybonukleazy, itp.

Wzorcową jednostka aktywności strepogeninowej jest przyrost tempa wzrostu Lactobacillus casei, spowodowany przez działanie 1 mg wzorcowego ekstraktu z wątroby. Aktywność strepogeninowa produktów syntetycznych związana jest z obecnością cysteiny. Najwyższą aktywność stwierdzono w przypadku, gdy cysteina jest albo powiązana z N–końcową leucyną, albo umieszczona między dwoma resztami leucynowymi.

Peptydy endorfinowe

Endor f iny to peptydy będące ligandami receptorów opiatowych, tzn. działających podobnie jak morfina. Najważniejsze z nich – enkefa l i ny –są pentapeptydami. Obok naturalnie znajdowanych enkefalin (np. Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), w ostatnim czasie wytwarzane są syntetyczne ich analogi:

syntetyczny analog enkefaliny

Tyr - D-Ala - Gly - Phe - Hse-lakton Hse-lakton =C

CH

O

NH O

H2

lakton homoseryny

N

CH2

S

CH CONH

H2C

CH

NH CO

HO

CH3

CH

CHH

OH

N CO

CO

H3C

NH

CH CO

H

NH CH CH2

CO

R

NH

NH CO

CH3HC

Ala Trp

Ala

D-ThrCys

Hyp

falloidyna: R= C

CH2OH

CH3

OH

C

CH3

CH3

OH

falloina: R=

fallotoksyny

11

3.3. Białka (proteiny)

Białka, w zasadzie, są olbrzymimi polipeptydami (makropeptydami). Jako kryterium podziału pomiędzy polipeptydami a białkami umownie przyjmuje się ilość aminokwasów wchodzących w ich skład. Związki zbudowane z ponad 100 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi zalicza się do białek. Poprawniejsze jest jednak założenie, że masa cząsteczkowa białek jest większa od 10 kDa. Jednakże, w kilku przypadkach, o przynależności do klasy białek decydują właściwości polipeptydu i jego biologiczna funkcja. Ta koncepcja podziału ma coraz więcej zwolenników. Rozwiązuje wiele sprzecznych i problematycznych przypadków. Na przykład, wspomniane w poprzednim rozdziale protaminy, pomimo masy cząsteczkowej od 1000Da do 6000Da, wygodnie i rozsądniej jest rozpatrywać w kategorii białek.

Składnikami większości białek zwykle jest 21 różnych aminokwasów w rozmaitych kombinacjach (a ściślej permutacjach), plus Pro(OH) oraz Liz(OH) w kolagenie. Charakterystyczne jest, że wszystkie aminokwasy występujące w białkach mają konfigurację L. Warto zauważyć, że już z 4 różnych aminokwasów można otrzymać 24 różne peptydy. Różną kolejnością wiązania się poszczególnych aminokwasów (tzw. sekwencją aminokwasów), tłumaczy się zjawisko ogromnej różnorodności białek, zarówno pod względem właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych. Struktura przestrzenna białek zdeterminowana jest właśnie sekwencją aminokwasów (a tak na marginesie, ta z kolei zdeterminowana jest sekwencją nukleotydów w DNA).

Białka można podzielić na dwie zasadnicze grupy: pro te iny i pro te idy .Prote iny to białka właściwe (inaczej, białka proste), wśród których można wyróżnić:

a lbuminy – białka rozpuszczalne w wodzie i w rozcieńczonych roztworach soli; występują w białku jaj ptasich oraz w nasionach roślin strączkowych,

globul iny - występują w surowicy krwi, w nasionach roślinnych oraz tkance mięśni, prol aminy i g lu t e l i ny – to są białka wyłącznie roślinne, skl eroprot e iny –z kolei białka wyłącznie zwierzęce; wśród których dalej można wyróżnić:

ko lagen – zasadniczy składnik białkowy tkanki kostnej, ke ra tyna – główny składnik substancji rogowatych (włosy, paznokcie, skóra), e la s tyna – główny składnik komórek w tkankach elastycznych.

Prote idy to białka złożone, zawierające oprócz aminokwasów składniki chemiczne niebiałkowe (tzw. grupy prostetyczne). Do proteidów zalicza się m.in.:

nukleopro te idy – główny składnik białkowy jąder żywych komórek, gl ikopro te idy – związki białek właściwych z węglowodorami, l ipoprote idy – połączenia białek z tłuszczami, chromoprot e idy – połączenia białek z barwnymi związkami (np. flawoproteidy). meta loprot e idy – połączenie białka z jonami metali.

Wiele białek będących enzymami należy do proteidów. W skład ich centrum katalitycznego wchodzą witaminy lub atom metalu. Enzymy, z uwagi na ich rolę i specyficzne właściwości zostaną omówione oddzielnie w dalszej części podręcznika.

W zależności od budowy p rzes t r zennej cząsteczki białka dzieli się na dwie podstawowe grupy:

1) b ia łka f i bry l a rne (włókienkowe), 2) b ia łka g lobul arne (kuliste).

Umownym kryterium tego podziału jest stosunek liczbowy osi dłuższej (l) cząsteczki białka do osi krótszej (d). Białka, dla których ten stosunek osiowy ma wartość nie większą niż 20 (l/d<20), zalicza się do b ia ł ek g lobu la rnych . Ich rozmiary są rzędu kilku do kilkunastu tysięcy nm. Ich kształt przypomina elipsoidy obrotowe. Kuliste cząsteczki spotyka się rzadko, głównie w przypadku lipoproteidów.

Białka o stosunku osiowym większym od 20 (l/d>20) zalicza się do f i bry l a rnych . Długość ich cząsteczek przekracza nierzadko sto tysięcy nm, przy średnicy włókna nie większej niż kilkaset nm.

12

3.3.1. Zasady organizacji strukturalnej cząsteczek białek

Cząsteczka białka stanowi trójwymiarowe ułożenie jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych. Jej przestrzenna struktura jest hierarchicznie uporządkowana i można w niej wyróżnić cztery poziomy uporządkowania, z których każdy wykazuje odmienność i zależność od różnych typów wiązań między atomami. W latach pięćdziesiątych Lindestrom Lang badając budowę białek wprowadził pojęcie ich struktury pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej później uzupełnione o strukturę czwartorzędową.

Poziom I (czyli struktura pierwszorzędowa) w hierarchicznym skonstruowaniu cząsteczki białkowej determinuje poziomy następne (tzw. strukturę wtórną), czyli strukturę przestrzenną danego białka zwaną też konformacją łańcuchową, która z kolei decyduje o jego funkcji biologicznej.

Struktura I-rzędową mówi o kolejności, czyli sekwencj i aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Ta struktura uwarunkowana jest wiązaniami peptydowymi. W strukturze pierwszorzędowej uwzględnia się również położenie wszystkich innych wiązań kowalencyjnych. Są to głównie wiązania disiarczkowe między resztami cysteiny, sąsiadującymi ze sobą w przestrzeni.

Struktura II-rzędowa białka określa p r zes t r zenne wzaj emne u łożenie p ła szczyzn wiązań pep tydowych (ściśle biorąc, atomów tworzących te wiązania).

Uwarunkowana jest przede wszystkim wiązaniami wodorowymi głównie między grupami karbonylowymi i aminowymi łańcucha polipeptydowego oraz planarnością wiązania peptydowego. Można rozpatrywać tę strukturę jako lokalne uporządkowanie w przestrzeni fragmentów łańcucha peptydowego o identycznej konformacji. Elementami tej konfiguracji w białkach globularnych mogą być: α - he l i s , s t ruktura β - f a łdowa oraz zakrę ty . W kolagenie indywidualnie występuje s t ruktu ra ko lagenu .

Struktury α-helis, β-fałdowa i kolagenu zostaną szczegółowo przedstawione w dalszej części podręcznika przy okazji omawiania białek fibrylarnych. Zakrę t be t a (β-zakręt) jest to element struktury drugorzędowej łańcucha polipeptydowego zapewniający zmianę - odwrócenie - kierunku w jego przebiegu. Ma postać ciasnej pętli, w której tlen z grupy karbonylowej jednego aminokwasu jest połączony wiązaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu. Regiony łańcucha polipeptydowego pozbawione regularnej struktury drugorzędowej chętnie przyjmują postać zakrętu beta. Taką postać może przyjąć nawet połowa łańcucha polipeptydowego typowego białka.

Struktura III-rzędowa cząsteczki białka lub jej podjednostki określa u łożen ie w prze s t r zeni ł ańcucha po l i peptydowego (a ściślej, rozlokowanie w przestrzeni wszystkich jego atomów). To przestrzenne upakowanie łańcucha polipeptydowego wywołane jest wewnątrz cząsteczkowymi wzajemnymi oddziaływaniami łańcuchów bocznych aminokwasów oraz miedzy tymi łańcuchami a cząsteczkami wody. Czynnikami warunkującymi powstawanie i utrzymywanie w białkach struktury III–rzędowej są wiązania chemiczne wszystkich typów, w tym wspomniane wcześniej wiązanie disiarczkowe i wodorowe, a ponadto oddziaływania jonowe, hydrofobowe i siły van der Waalsa.

Struktura drugorzędowa tripeptydu

Kąt ψ odpowiada rotacji wokół wiązania Cα-C,Kąt φ odpowiada rotacji wokół wiązania Cα-N

13

Struktura IV-rzędowa jest to sposób u łożeni a w przes t r zen i k i l ku ł ańcuchów po l ipeptydowych stanowiących podjednostki cząsteczki białka oraz zespół oddziaływań między nimi

Czynniki strukturotwórcze białek

Rola wiązań peptydowych w budowie białek jest oczywista. Omówione teraz zostaną krótko wszystkie pozostałe wiązania i oddziaływania chemiczne ogrywające rolę w powstawaniu i utrzymaniu właściwej konformacji łańcucha polipeptydowego cząsteczki białka. Kolejność ich omawiania wynika z roli i znaczenia, jakie pełnią.

Oddziaływania hydrofobowe (e fekt hydrofobowy). Cząsteczki niepolarne nie zawierają spolaryzowanych wiązań ani atomów - powoduje to, że są one nierozpuszczalne w wodzie. Właściwość tą nazywa się hydrofobowości ą . W środowisku wodnym oddziaływanie z polarnymi cząsteczkami H2O doprowadzi do takiego układu, w którym fragmenty hydrofobowe będą "unikały" kontaktu z wodą grupując się razem, natomiast części hydrofilowe "chętnie" będą z nią oddziaływać. Źródłem energii oddziaływań hydrofobowych jest niechęć cząsteczek wody zwiększenia stopnia organizacji.

Efekt tych oddziaływań sprawia, że syntetyzowany wewnątrz komórki w środowisku wodnym łańcuch polipeptydowy fałduje się spontanicznie w ten sposób, że większość jego hydrofobowych rodników bocznych (przede wszystkim wa l iny , l eucyny, i zo leucyny, a laniny i f enyloa l an iny) zostaje skierowana do wnętrza powstającej struktury, a większość jego polarnych, obdarzonych ładunkiem bocznych łańcuchów znajduje się na powierzchni.

Wiązania disiarczkowe (m o s t k i d i s i a r c z k o w e ). Najsilniejszym wiązaniem (pomijając peptydowe) jest kowalencyjne w i ą z a n i e d i s i a r c z k o w e ( S S ) powstające pomiędzy dwoma grupami —SH sąsiadujących ze sobą w przestrzeni dwóch reszt cysteiny w tym samym łańcuchu lub łącząc dwa różne łańcuchy.

Energia wiązania disiarczkowego wynosi 300 kJ/mol, a odległość między atomami siarki S—S jest nie większa niż 0,15nm.

Wiązanie to odgrywa znaczną rolę jako czynnik strukturotwórczy ke ra tyn , łącząc między sobą sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe, jednocześnie uodparniając te białka na działanie czynników chemicznych. W cząsteczce β-keratyny ilość tych wiązań może sięgać nawet kilkudziesięciu.

Natomiast w białkach globularnych mostek disiarczkowy odgrywa jedynie rolę strukturotwórczą w odniesieniu do pewnych fragmentów łańcucha polipeptydowego. Bez wątpienia usztywnia jednak kształt tych białek i zwiększa ich termostabilność. W wielu enzymach reszty cysteiny tworzące mostki disiarczkowe pełnią rolę aminokwasów pomocniczych (patrz: budowa centrum aktywnego enzymów). Ilość wiązań disiarczkowych w cząsteczce białka globularnego jest rzędu kilku. Znanych jest ponadto wiele białek (zwłaszcza pozakomórkowych enzymów), które nie posiadają mostków disiarczkowych. Ta cecha czyni cząsteczki tych białek bardziej plastycznymi, co ma niewątpliwie znaczenie przy ich sekrecji (wydzielaniu poza komórkę). Do takich enzymów należą rybonukleaza czy subtilizyna

Wiązania jonowe. Wiązania te są wywołane elektrostatycznym przyciąganiem się jonów o przeciwnych znakach. W białkach wiązania jonowe tworzone są pomiędzy dodatnio naładowanymi grupami amoniowymi łańcuchów bocznych lizyny i argininy oraz naładowanymi ujemnie grupami karboksylanowymi kwasu glutaminowego i asparaginowego (—NH3

+....-OOC—). Ponadto udział w powstaniu tego wiązania w pewnym stopniu może mieć dodatnio naładowany rodnik histydyny.

Energia tych wiązań waha się w granicach 14-29 kJ/mol, ich zasięg wynosi ponad 1 nm, a siła oddziaływania jest odwrotnie proporcjonalne do r2. Tak więc, wiązania te są względnie silne. Ich ilość

14

w cząsteczce białka może dochodzić nawet do kilkudziesięciu. Na przykład we wspomnianej subtilizynie (pozakomórkowej proteinazie serynowej z Bacillus subtilis) na powierzchni cząstki enzymu występuje 16 krzyżowych wiązań jonowych stabilizujących skutecznie trzeciorzędową strukturę białka. U enzymów tych brak jest mostków disiarczkowych, a mimo to są one odporne na działanie wielu czynników denaturujących.

Wiązania wodorowe. Tworzą się one pomiędzy atomem wodoru związanym kowalencyjnie z atomem o dużej elektroujemności a atomem z wolnymi parami elektronowymi (np. w białkach najczęściej: >C=O.....H—N< lub —O—H...O=C<). Wiązanie to symbolizowane we wzorach jest kropkowaną linią, jak to widać w prezentowanych układach. Wiązanie wodorowe wykazuje wyraźne ukierunkowanie. Jest ono tym silniejsze, im bardziej linearnie są ułożone wszystkie trzy tworzące je atomy. Dla struktury białek, istotne wiązania wodorowe mają zasięg oddziaływania rzędu 0,26-0,31 nm, a energia pojedynczego wiązania waha się w granicach od 12 do 29 kJ/mol – a więc są to słabe oddziaływania. Wiązania wodorowe mogą powstawać zarówno między atomami tej samej cząsteczki jak i atomami różnych cząsteczek.

Pomimo, że wiązania wodorowego należą do słabych oddziaływań, są one chyba najważniejszymi siłami, które utrzymują przestrzenną konformację cząsteczki białka. Wynika to z faktu, iż w cząsteczce białka występują tysiące wiązań wodorowych, w sumie mają więc one dużą wartość energetyczną.

Ogólnie należy stwierdzić, że wiązania wodorowe są niezmiernie ważnym elementem strukturalnym układów biologicznych. Biorą one udział w tworzeniu struktur cząsteczek białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów. Powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami wody i cząsteczkami substancji rozpuszczonej jest warunkiem rozpuszczania w wodzie wielu związków organicznych. Nadto tworzenie się i rozpad wiązań wodorowych warunkuje szereg tak ważnych biologicznie funkcji, jak np. działanie enzymów.

Siły van der Waalsa są wynikiem wzajemnego oddziaływania elektronów i jąder w cząsteczkach, są więc przykładem oddziaływań elektrostatycznych. Ogólnie biorąc energia wiązań powstałych na bazie sił van der Waalsa jest bardzo mała, rzędu 4-8 kJ/mol. Mechanizm powstawania tych oddziaływań może być różny. Rozróżnia się m.in. efekt dyspersyjny, efekt indukcyjny czy efekt kierunkowy.

Efekt dysper syjny (siły dyspersyjne) pojawia się jedynie wtedy, gdy cząsteczki znajdują się bardzo blisko siebie, tak że prawie się stykają. W wyniku ruchu elektronów walencyjnych gęstość ładunku ujemnego na zewnętrznej powłoce atomów ulega szybkim fluktuacjom wzbudzając podobną fluktuację w powłoce walencyjnej sąsiednich atomów. Powstają szybkozmienne dipole, które wzajemnie przyciągają się zwiększając, w miarę zbliżania się, wzajemną polaryzację elektronową. Siły te występują przez bardzo krótki czas (rzędu 10-9 s) i są bardzo słabe (ok. 4 kJ/mol).

E fekt i ndukcyj ny polega na oddziaływaniu indukowanych dipoli (jego znaczenie jest niewielkie).

E fekt k ie runkowy związany jest z asymetrią elektryczną cząsteczek (dipole) powodującą oddziaływanie orientacyjne i przyciąganie odpowiednio utrwalających się dipoli.

S i ł y van der Waal sa maleją odwrotnie proporcjonalnie z siódmą potęgą odległości (r7) i są one bardzo małe w porównaniu do innych omówionych wiązań. Tym niemniej, sumując się wywołują efekty o dużym znaczeniu dla stabilizacji niektórych struktur białka.

Do czynników strukturotwórczych, według auto ra , można też zaliczyć białka zwane molekularnymi opiekunkami.

15

Molekularne opiekunki (chaperones). Nawet cząsteczki białka, którym udało się uzyskać prawidłowy kształt w fazie posttranslacyjnej (po zakończeniu biosyntezy), mogą w każdej chwili ulec deformacji wskutek działania różnych czynników denaturujących. Od lat zadawano sobie pytania:

Jak ludzkie komórki radzą sobie z rozpoznawaniem białek, które mają złą strukturę przestrzenną? Czy takie źle zwinięte białka mogą powrócić do prawidłowego kształtu? Co dzieje się, kiedy cząsteczka białka jest tak beznadziejnie zniekształcona, że już w żaden sposób

nie może przybrać prawidłowej konformacji? W ostatnich latach częściowo znaleziono odpowiedź na te pytania. Okazuje się, że w tych przypadkach

wkracza do akcji specjalna grupa białek: białka opiekuńcze, zwane też przyzwoitkami. Białka opiekuńcze łączą się z odkształconymi białkami i pomagają im w uzyskaniu odpowiedniej struktury

trójwymiarowej. Często wymaga to zużycia pewnej ilości energii zmagazynowanej w ATP. Następnie komórkowe opiekunki odłączają się od białek, które uzyskały odpowiedni kształt, i zajmują się innymi cząsteczkami białek o nieprawidłowej konformacji. Same białka opiekuńcze są bardzo odporne na denaturację.

Białka opiekuńcze są bardzo wszędobylskie. Można je znaleźć w cytoplazmie (tam biorą udział w nadawaniu kształtu białkom wytwarzanych w procesie translacji oraz w naprawianiu zdeformowanych białek), w jądrze komórkowym, w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej (gdzie uczestniczą w kształtowaniu białek przeznaczonych do wydzielenia przez komórkę) oraz w pobliżu błon białkowo-lipidowych (białka opiekuńcze są potrzebne w procesie transportu innych białek przez błony biologiczne: z jednej strony błony jedna przyzwoitka rozwija białko i wpuszcza je do kanału w błonie, a po przeciwnej stronie błony białkowo-lipidowej inna przyzwoitka odbiera transportowany łańcuch polipeptydowy i nadaje mu odpowiednią konformację). Bez udziału białek opiekuńczych wiele procesów metabolicznych nie mogłoby przebiegać prawidłowo, a naprawienie popsutej cząsteczki białka przekraczałoby możliwości komórki.

16

H

H

H

H

N

O

CC

N

O

C C

CH2NCOOH

R2

H2C

CH2

CH2

H

108o

110o

3.3.2. Białka fibrylarne

Białka fibrylarne (skleroproteiny) to białka o budowie włókienkowej, nierozpuszczalne w wodzie, rozcieńczonych kwasach, alkoholu; odporne na działanie enzymów proteolitycznych i czynników chemicznych. Są głównym składnikiem substancji podporowych i strukturalnych organizmu, np. skóry i kości (kolagen), ścięgien i wiązadeł (elastyna), paznokci, piór, włosów (keratyna), jedwabiu naturalnego (fibroina), rzęsek bakterii (flagellina), pancerzy owadów (sklerotyna). Białka te nie mają wartości odżywczych.

Białka fibrylarne wykazują wysoki stopień regularności i uporządkowania struktury. Obok wiązań peptydowych podstawowym czynnikiem strukturotwórczym białek fibrylarnych są wiązania wodorowe. Długie łańcuchy polipeptydowe tych białek przyjmują najczęściej regularną strukturę drugorzędową, w której szkielet skręcony jest wokół własnej osi, tak że powstaje przestrzenna możliwość utworzenia stabilizujących układ wiązań wodorowych między atomami oddalonych od siebie ugrupowań peptydowych.

Struktura kolagenu. Kolagen jest głównym składnikiem białek skóry, tkanki łącznej (m.in. wiązadła i ścięgna) oraz białek wchodzących w skład chrząstek i kości. Kolagen odznacza się dużą wytrzymałością na rozciąganie. Jego skład aminokwasowy jest następujący: glicyna 33%, prolina 12%, hydroksyprolina 9%, ponadto 9,5% Ala, 3% Wal, l,5% Liz(OH); przy absolutnym braku Cys i Try. Ustalono, że we włókienkowych cząsteczkach kolagenu trzy podstawowe aminokwasy tworzą łańcuch peptydowy układający się wzdłuż linii śrubowej o bardzo dużym skoku (3,3 reszty aminokwasowe na 1 skręt), a trzy takie łańcuchy splatają się ze sobą na kształt liny (rysunek obok). Poszczególne łańcuchy łączą się między sobą wiązaniami wodorowymi tworzonymi przez atomy azotu i tlenu wiązań peptydowych.

O przestrzennej strukturze kolagenu decyduje przede wszystkim jego niezwykły skład aminokwasowy. Periodyczna struktura pierwszorzędowa wygląda następująco: -Gly-X-Y-Gly-X-Y-. X często jest proliną (nigdy hydroksyproliną), Y jest często hydroksyproliną. Należy sobie uświadomić, że wiązania peptydowe utworzone z udziałem proliny i hydroksyproliny są „zdeformowane” (patrz rysunek powyżej) na skutek pierścieniowej budowy tych aminokwasów. Stąd kąt rozwarcia płaszczyzn wiązań peptydowych za proliną wynosi 110, podczas gdy normalnie wynosi on około 100.

Hydroksyprolina (Hyp) i hydroksylizyna (Lys-OH) nie są wbudowywane w łańcuch podczas syntezy. Oba te aminokwasy powstają w gotowych łańcuchach prokolagenu z proliny i lizyny pod działaniem dioksygenaz - enzymów wbudowujących atomy tlenu z wytworzeniem grup hydroksylowych.

Trzy enzymy modyfikują prokolagen: 4-dioksygenaza prokolageno-prolinowa (EC 1.14.11.2), 3-dioksygenaza prokolageno-prolinowa (EC 1.14.11.7) i 5-dioksygenaza prokolageno-lizynowa (EC`1.14.11.4).

- glicyna - prolina

- hydroksyprolina

Struktura II-rzędowa kolagenu

17

CO

H

H

O

NC

R

OC

N

R

H

CN

C N

C

HO

CC

H

H

CO

H

H

O

NC

OC

N

H

CN

C N

C

HO

CC

R

R

CO

H

H

O

NC

R

OC

N

R

H

CN

C N

C

HO

CC

CO

H

H

O

NC

C

OC

N

H

CN

C N

C

HO

CC

R

R

C

Struktura fałdowa. Białka zwane β-ke ra tynami stanowią składniki naskórka, włosów, paznokci, kopyt. Podobnie jak kolagen są nierozpuszczalne wodzie i cechuje je odporność na czynniki chemiczne. Ich cząsteczki są zbudowane głównie z aminokwasów o hydrofobowych łańcuchach bocznych i aminokwasów zasadowych oraz znacznych ilości cysteiny.

Keratyna rozciągniętego włosa (β-keratyna) charakteryzuje się regularną strukturą. Struktura ta zwana jest fałdową, inaczej: strukturą pofałdowanej kartki, harmonijkową lub beta fałdową. Między różnymi łańcuchami polipeptydowych lub różnymi częściami tego samego łańcucha powstają wiązanie wodorowe wytworzone głównie w obrębie wiązań peptydowych. Płaskie wiązanie peptydowe sprawia, że łańcuch przyjmuje postać pofałdowanej kartki z łańcuchami bocznymi znajdującymi się poniżej lub powyżej tej płaszczyzny. Łańcuchy boczne sterczą teraz niemal pionowo w górę, względnie w dół, jak widać na modelu przedstawionym poniżej. Łańcuchy sąsiadujące ze sobą mogą być równoległe lub antyrównoległe zależnie czy przebiegają one odpowiednio: w tym samym kierunku lub kierunku przeciwnym (rysunek poniżej).

A - Struktura fałdowa, B – układ peptydów równoległy, C – układ peptydów antyrównoległy

Struktura α-helisy. Helisa (z grec. heliks, helikos = skręcony) to linia śrubowa, linia leżąca na powierzchni walca (poprawniej: cylindra). Strukturę α-helisy w 1951 roku zaproponowali Pauling i Corey. α-He l i sa w przypadku struktury białek to łańcuch polipeptydowy płaszczyznowo nawijający się na hipotetyczny walec (rysunek poniżej). Sposób jego ułożenia umożliwia utworzenie się wewnątrz łańcuchowych wiązań wodorowych pomiędzy atomami wiązań peptydowych w kolejno po sobie następujących zwojach helisy. Grupa >C=O każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą HN< aminokwasu, zajmującego w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą do przodu o cztery reszty aminokwasowe. Ostatecznie wszystkie grupy >NH i >C=O łańcucha głównego łączą się wiązaniami wodorowymi. Każda reszta aminokwasowa jest przesunięta w stosunku do sąsiedniej o 0,15 nm wzdłuż osi helisy i obrócona o kąt 100° wokół osi. Na jeden obrót helisy przypada więc 3,6 reszt aminokwasowych. W ten sposób, co czwarte reszty aminokwasowe w α-helisie znajdują się przestrzennie blisko siebie. Łańcuchy boczne aminokwasów wystają na zewnątrz cylindra w ułożeniu śrubowym. Prolina „deformuje” α-helisę. Odmiana helisy prawoskrętna jest bardziej stabilna dla łańcuchów polipeptydowych.

R

H

CHC O

HNC R

CONH NH

O CRC

HNOC

CHR

H

CHC O

HNC R

CONHNH

O CRC

HNOC

CH R

H

R

H

C

N

C

N

C

N

R

H

R

H

H

R

H RCC

NH

O

C RHN

CHC

O

CHC O

HNC R

CONH

R

CNH

O

HN

CHC

ONHO C

RCHN

OCCH

C

N

A

B

C

18

- Rodniki hydrofobowe

- Rodniki hydrofilowe

3,6Å

5,4Å

Struktura α-helisy charakterystyczna jest dla niezbyt długich łańcuchów polipeptydowych takich, jakie występują w α -ke ra tyn i e (białko fibrylarne) lub mioglobin i e (białko globularne).

Włókienka α -ke ra tyny zbudowane są z dwóch typów łańcuchów polipeptydowych. Oba mają budowę α-helisy, ale oś jednego (I) jest prosta, drugiego (II) zaś tworzy linię śrubową o znacznie większym skoku aniżeli w α-helisie. Łańcuch typu I stanowi trzon, wokół którego oplata się 6 śrubowych łańcuchów typu II.

3.3.3. Białka globularne

Omawiane poprzednio białka fibrylarne stanowią agregaty wielocząsteczkowe o uporządkowanej budowie. W przeciwieństwie do nich białka globularne w stanie naturalnym to pojedyncze, niezależne od siebie cząsteczki, przypominające „kłębuszki poplątanej wełny”. Łańcuch polipeptydowy białek globularnych jest z reguły nieregularne poskręcany i pofałdowany. Brak w strukturze trzeciorzędowej tych białek wyraźnej regularności i uporządkowania. Na rysunku przedstawiono schematyczny model cząsteczki białka globularnego. Wewnątrz „kłębuszka” znajduje się strefa hydrofobowa, a na zewnątrz strefa hydrofilowa, co decydująco wpływa na właściwości tych białek.

19

Schematyczny model cząsteczki białka globularnego.

W białkach globularnych występują jedynie dwa typy struktur drugorzędowych: α-helisa i β-fałdowa. W wielu białkach globularnych fragmenty łańcucha polipeptydowego o strukturze α-helisy są poprzedzielane strukturą β-fałdową. Ponadto obie te struktury mogą oddziaływać pomiędzy sobątworząc bardziej złożone struktury „ponad” drugorzędowe zwane motywami. Motywy strukturalne, powstają wskutek asocjacji α-helisy lub struktury β-fałdowej. Powszechnie występującym motywem β, czyli powstałym jedynie na bazie struktury β-fałdowej jest motyw „szpilki do włosów”. Ten motyw zbudowany jest z jednego łańcucha polipeptydowego, przyjmującego antyrównoległąstrukturę typu harmonijki. Innym przykładem bardziej złożonej struktury opierającej się na strukturze β-fałdowej jest motyw „klucza greckiego”. Jest to bardziej rozbudowany motyw „szpilki do włosów”, gdzie jeden łańcuch polipeptydowy tworzy ze sobą cztery struktury β-fałdowe ułożone względem siebie antyrównoległe. Struktura α-helisy podobnie jak harmonijkowa tworzy własne motywy strukturalne. Najczęściej jest to motyw „helisa-pętla-helisa". Innym przykładem motywów α, sąstruktury tzw. „suwaków leucynowych”, zbudowanych z dwóch oplecionych ze sobą α-helis, bogatych w leucynę. Oprócz motywów β lub α, występują struktury mieszane typu α / β. Za przykład może posłużyć motyw βαβ, w którym pomiędzy dwoma ułożonymi równolegle łańcuchami struktury β-fałdowej znajduje się α-helisa. Hydrofobowa strona łańcuchów β jest ciasno upakowana i kontaktuje się z hydrofobową stroną α-helisy.

Wszystkie omówione motywy dotyczą białek globularnych zbudowanych jedynie z jednego łańcucha polipeptydowego. Jednakże wiele białek zbudowanych jest z kilku łańcuchów polipeptydowych, fałdujących się niezależnie od siebie i pomiędzy którymi również formują sięswego rodzaju motywy, zwane domenami. Domeny można zdefiniować, jako precyzyjnie splecione ze sobą fragmenty łańcuchów polipeptydowych, tworzących w przestrzeni szczególnie regularne rejony. Zbudowane są one ze 100 do 400 reszt aminokwasowych. Można za przykład podać domenę składającą się z czterech α-helis tworzących złożony motyw „helisa-pętla-helisa", ułożonych wzajemnie równolegle, w ten sposób, że reszty aminokwasowe poszczególnych łańcuchów zazębiająsię między sobą tworząc przestrzeń hydrofobową w centralnej części domeny. Inną, bardzo podobnąstrukturą, charakterystyczną dla białek globularnych jest domena „globinowa”. Powstaje ona w wyniku dopasowania grzbietów jednej α-helisy w grzbiet drugiej. Domeny często są składnikami części funkcjonalnych białek.

20

Niektóre białka mają niezwykle skomplikowaną strukturę trzeciorzędową, nawet z kilkunastoma motywami i kilkoma domenami, jak np. dystrofina.

Dystrofina jest białkiem kodowanym przez gen leżący na chromosomie X. Mutacje tego genu wywołują choroby zwane dystrofiami mięśniowymi Duchenne’a i Becker’a. D y s t r o f i n a zbudowana jest z 3685 aminokwasów (Mcz = 427 kDa). Podzielona jest na cztery domeny - pierwsza domena na N-końcu o masie cząsteczkowej 30 kDa jest homologiem α-aktyniny, domena centralna zbudowana z 25 powtórzonych motywów potrójnych helis podobnych do występujących w spektrynie, domena bogata w cysteiny (280 reszt) oraz C-końcowa domena. C-końcowa domena zawiera kilka charakterystycznych motywów – domenę WW (posiadają dwie konserwatywne reszty tryptofanu), motyw „EF hands”, domenę ZZ (motyw wiążący cynk) oraz dwie α-helisy.

Allosteria (z grec. allos = obcy, inny; stereos = stanowiący bryłę) to innokształtność przestrzenna, czyli zmiana konformacji łańcuchowej. Cząsteczki większości białek globularnych odznaczają się względnie dużą elastycznością. Trzeciorzędowa struktura wielu z nich może ulegać odwracalnym „odkształceniom” na skutek niekowalencyjnego przyłączenia jakiejś innej cząsteczki (tzw. l i gandu ). Takie białka nazywa się b i a łkami a l l o s te rycznymi . E fekt a l l o s te rycznypolega na odwracalnej zmianie konformacji białka w pewnym ściśle określonym obszarze jego cząsteczki na skutek przyłączenia ligandu (efektora allosterycznego) w innym miejscu. Ta zmiana konformacji pociąga za sobą zaburzenia aktywności biologicznej białka. Najlepiej poznanym białkiem allosterycznym jest hemoglobina. Wiele enzymów również jest białkami allosterycznymi. Na zasadzie allosterii działają aktywatory i inhibitory niektórych enzymów.

Hemoglobina zawarta w erytrocytach działa jako przenośnik tlenu we krwi oraz odgrywa decydującą rolę w transporcie dwutlenku węgla i jonów wodorowych (pokrewnym białkiem jest mioglobina, odpowiedzialna za transport tlenu w mięśniach). Kształt cząsteczki hemoglobiny jest zbliżony do kuli o średnicy 5,5 nm. Hemoglobina jest białkiem złożonym. Składa się z dwóch łańcuchów α (po 141 aminokwasów) i dwóch łańcuchów β (po 146 aminokwasów). Łańcuchy te są upakowane w formę czworościanu. Oddziałują ze sobą za pośrednictwem wiązań niekowalencyjnych tworząc charakterystyczny tetramer oznaczany jako α-β-α-β lub α2β2. Oba typy łańcuchów mają bardzo zbliżoną strukturę trzeciorzędowa i zawierają taką samą niebiałkową grupę prostetyczną — cząsteczkę hemu. Grupy hemowe są umiejscowione, pojedynczo w każdej podjednostce, w zagłębieniach na ich powierzchni. Hem jest związkiem kompleksowym, w którym atom żelaza dwuwartościowego (Fe2+) znajdujący się w środku układu porfirynowego tworzy wiązania koordynacyjne z czterema atomami azotu porfiryny. Atom żelaza może przyłączyć cząsteczkę O2 bez zmiany swojej wartościowości, tworząc tzw. utlenowaną formę hemoglobiny (zwaną też oksyhemoglobiną) o jasnoczerwonym kolorze. Cztery miejsca wiązania tlenu są znacznie od siebie oddalone; odległość między dwoma najbliżej położonymi atomami żelaza wynosi 2,5 nm. Przyłączanie tlenu jest odwracalne i zależy od ciśnienia cząstkowego tlenu w narządach.

Przyłączenie tlenu (będącego w stosunku do hemoglobiny ligandem) do jednego z protomerów zwiększa zdolność przyłączania O2 przez pozostałe protomery. W miarę postępującego utlenowania hemoglobiny jej protomery łączą się coraz łatwiej z tlenem na skutek zmian konformacyjnych wywołanych efektem allosterycznym. Utlenowana cząsteczka hemoglobiny jest bardziej upakowana. Na przykład, w wyniku utlenowania odległość między atomami żelaza zmniejsza się z 4,0 do 3,3 nm. Reszty aminokwasów C-terminalne wszystkich czterech łańcuchów mają prawie całkowitą swobodę rotacji. Terminalne grupy karboksylowe i

21

łańcuchy boczne aminokwasów na końcach C tworzą wiązania jonowe, które krępują tetramer. Ze względu na obecność ośmiu wiązań jonowych cząsteczka nieutlenowanej hemoglobiny jest bardziej napięta i skrępowana niż hemoglobiny utlenowanej.

Właściwości białek globularnych

Białka, które posiadają określone właściwości biologiczne (tzn. wypełniają określone funkcje w komórce), i te właściwości nadal zachowują niezależnie od tego, czy są wewnątrz komórki czy też zostały z niej wyizolowane określa się nazwą b ia łka na tywne (rodzime). Białka natywne wykazują kilka charakterystycznych właściwości.

Punkt izoelektryczny. Cechą charakterystyczną każdego białka jest jego punkt i zoe l ekt ryczny . Jest to takie pH, w którym ilość ładunków dodatnich i ujemnych cząsteczki białka jest jednakowa. Taka cząsteczka, oczywiście, nie wędruje w polu elektrycznym.

Denaturacja. Część białek natywnych należy do grupy związków bardzo delikatnych. Pod wpływem wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych, np. wysokiej temperatury, znacznych zmian pH, promieni ultrafioletowych, rozpuszczalników organicznych itp., struktura białek ulega trudno odwracalnym lub całkowicie nieodwracalnym zmianom połączonym z utratą natywnych właściwości biologicznych (m.in. białka będące enzymami tracą swoje właściwości katalityczne). Proces ten nazywa się dena tu rac j ą .

Denaturac j ę b i a łka można więc zdefiniować jako utratę natywnych właściwości biologicznych lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej tego białka spowodowaną zniszczeniem jego struktury wtórnej (przy zachowaniu struktury pierwszorzędowej). W wyniku denaturacji białka mogą wystąpić zmiany rozpuszczalności i przesunięcie punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha peptydowego może prowadzić do wzrostu lepkości, a także zmian absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się również często procesy agregacji i wytrącania, co jest związane ze zmianami stopnia hydratacji i rozpuszczalności zdenaturowanych białek.

Ogólnie biorąc, mechanizm denaturacji związany jest ze zniesieniem oddziaływań czynników strukturotwórczych, które odpowiedzialne są za stabilizację struktury przestrzennej cząsteczki białka. Podczas denaturacji rozrywane mogą być wiązania wodorowe, jonowe, disulfidowe oraz niszczone oddziaływania elektrostatyczne van der Waalsa. I tak:

działanie p odwyższonej t empera tu ry doprowadza do zerwania wiązań wodorowych oraz zniesienia oddziaływań van der Waalsa, co w konsekwencji skutkuje zniszczeniem struktur II-, III- i IV-rzędowej białka,

pod wpływem roztworu moczn ika (6-8 mol/dm3) lub ch lorku guanidyny (4 mol/dm3 ) i innych związków chemicznych silnie polarnych zerwaniu ulegają wiązania wodorowe,

j ony me ta l i c i ężkich (Hg2+, Pb2+, Cu2+, itp.) powodują zerwanie mostków disiarczkowych, a ponadto częściowo wiązań jonowych, co w niektórych przypadkach może prowadzić do wbudowania się tych jonów w cząsteczkę białka,

na skutek działania kwasów lub zasad (wartość pH poniżej 3 lub powyżej 9) zerwaniu ulegają wiązania jonowe i w pewnym stopniu wodorowe, co przede wszystkim skutkuje zniszczeniem III-rzędowej struktury białka,

promien iowanie (nadfioletowe, rentgenowskie i radioaktywne) w skrajnych przypadkach może nawet prowadzić do rozrywania wiązań kowalencyjnych,

22

++

++

--

--

+ -

+ +

innymi czynnikami mogącymi wywoływać denaturację białek są: intensywne mieszan ie , wyt rząsani e l ub dz ia łanie u l t r adźwiękami .

Wpływ pH i stężenia elektrolitu na rozpuszczalność białek globularnych. Ze względu na rozpuszcza lność w wodzie białka globularne dzieli się na dwie grupy:

1) a lbuminy - rozpuszczalne w wodzie, 2) g lobul iny - rozpuszczalne w rozcieńczonych elektrolitach (np. w 0,1-1%-owych roztworach

NaCl).

Białka najmniejszą rozpuszczalność posiadają w punkcie izoelektrycznym. Im pH roztworu jest bardziej oddalone od pI białka, tym lepsza jest jego rozpuszczalność. Zjawisko to można wyjaśnić następująco. W roztworach o pH różnym od pI cząsteczki białka posiadają ładunek (dodatni lub ujemny). Dwa ładunki jednoimienne odpychają się (m.in. tym silniej im większy jest ten ładunek). Nic więc dziwnego, że naładowane cząsteczki białka też się odpychają, co ułatwia ich hydratację i w efekcie zwiększa rozpuszczalność. Podobnie podczas wysalania (o czym będzie mowa poniżej) jednoimiennie naładowane cząsteczki białka znacznie trudniej ulegają agregacji i trudniej wytrącić je w postaci osadu.

0

20

40

60

80

100

3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Ro

zpu

szcz

aln

ość

[%

]

Wpływ pH i stężenia elektrolitu na rozpuszczalność modelowego białek globularnych o pI = 6.

W wielu przypadkach niewielkie stężenie elektrolitu - np. 0,8% wodny roztwór NaCl, czyli sól fizjologiczna - znacznie poprawia rozpuszczalność wielu białek (tzw. proces wsa l ania b i a łek ). Niektóre białka w ogóle nie rozpuszczają się w wodzie i wprowadzenie ich do roztworu wymaga obecności jonów elektrolitu. Mechanizm zjawiska polega na tym, że niezależnie od ogólnego (sumarycznego) ładunku molekuły, cząstkowe ujemne i dodatnie ładunki nie są równomiernie rozmieszczone na powierzchni cząsteczki białka. W efekcie cząsteczki białka są dipolami. W punkcie izoelektrycznym dipol taki posiada znaczny moment, kilkaset razy większy od mementu dipolowego wody. Zjawisko to wpływa na silne, wzajemne przyciąganie pomiędzy molekułami białka. Dodatek NaCl sprawia, że w roztworze pojawiają się jony Na+ i Cl

-, które

neutralizując te cząstkowe ładunki na powierzchni białka znoszą efekt przyciągania się cząsteczek, tym samym ułatwiają ich rozpuszczanie się.

Przekroczenie pewnego progowego stężenia elektrolitu powoduje wytrącanie się białka z roztworu w postaci osadu (tzw. proces wysa l ania b ia ł ek ), co po oddzieleniu od cieczy i wysuszeniu pozwala otrzymać białko w stanie stałym. Dobrym odczynnikiem wysalającym białka jest siarczan amonu. Okazuje się, że zarówno jony

H2O

1%NaCl

40%(NH4)2SO4

20%(NH4)2SO4

wsalanie

wysalanie

pI

H2O

Molekuła białka

- +

- -

23

NH4+, jak i SO4

2- mają bardzo duże powinowactwo do cząsteczek wody i odrywają je od otoczki hydratacyjnej białka.

Frakcjonowane wysalanie białek. Dobierając odpowiednio pH i stężenie elektrolitu można na drodze wysalania z grubsza rozdzielić mieszaninę białek na pojedyncze frakcje, zawierające znacznie podczyszczone indywidualne białka.

24

Wytrącanie białek globularnych rozpuszczalnikami organicznymi. Niektóre rozpuszczalniki organiczne o silnych właściwościach hydrofilowych, takie jak np. etanol, aceton mają zdolność wytrącania białka z roztworu. Związki te mają bardzo silne powinowactwo do wody i wyrywają jej cząsteczki z otoczki hydratacyjnej białka. Niestety, część molekuł białka ulega denaturacji. Skuteczność procesu wytrącania aktywnego biologicznie białka, czyli niezdenaturowanego, można poprawić poprzez obniżenie temperatury wytrącania do 4C, dbania o względnie niskie stężenie rozpuszczalnika wobec cząsteczek białka, (co, m.in. zapewnia dozowanie rozpuszczalnika do roztworu białka!) i maksymalnie możliwe skrócenia czasu kontaktu rozpuszczalnika z cząsteczkami białka. W ten sposób można z dużą wydajnością (sięgającą nawet 86%) skutecznie wytrącać natywne białko z roztworu. Za takim sposobem otrzymywania białka w stanie stałym, w porównaniu z wysalaniem, przemawia łatwość regeneracji odczynnika wytrącającego. [Od autora: siarczan amonowy stosowany do wysalania białek jest trudny do regeneracji, a jego obecność w ściekach powoduje bardzo groźną korozję wszelkich elementów betonowych (umocnień wałów przeciwpowodziowych, filarów mostów, itp.)].

Suszenie rozpyłowe. W ostatnich latach, dzięki zastosowaniu ultrafiltracji, białko w stanie stałym (m.in. enzymatyczne) korzystnie jest otrzymywać z zastosowaniem suszenia rozpyłowego. Wydajność tego procesu sięga nawet 94%, a otrzymane białko w stanie stałym może być jednocześnie znacznie podczyszczone.

Odbiałczanie roztworów. W niektórych sytuacjach nieodzowne jest pozbycie się białka z roztworu wodnego. Można efekt taki osiągnąć stosując odczynniki odbiałczające, m.in. 5% roztwór kwasu trichlorooctowego lub 10% roztwór kwasu sulfosalicylowego. Oba te związki prawie ze 100% skutecznością wytrącają zdenaturowane białko z wodnych roztworów.

Roztwory koloidalne białek. Roztwory wodne białek globularnych mają charakter ko lo idów hydrof i l owych . I jako takie, posiadają charakterystyczne cechy koloidów hydrofilowych, o których naucza chemia fizyczna. M.in. obniżają napięcie powierzchniowe, wykazują znaczną lepkość, są silnie uwodnione, żelatynują, wykazują słabą opalescencję i mały efekt Tyndala, itp.

Dializa. Białka są olbrzymimi molekułami i jako takie nie d i a l i zu j ą , tzn. nie wykazują zdolności do dyfundowania przez błony półprzepuszczalne. Zjawisko to wykorzystuje się m.in. do odsalania roztworów białek. Wszystkie związki niskocząsteczkowe (np. jony, sole, mono- i disacharydy, aminokwasy, peptydy, itp.) ulegają dializie, tzn. dyfundują przez błonę półprzepuszczalną woreczka dializacyjnego do otaczającego go roztworu, natomiast białko pozostaje wewnątrz woreczka.

Elektroforeza. Cząsteczki białka zawieszone w roztworze wodnym o pH różnym od ich pI (punktu izoelektrycznego) posiadają ładunek elektryczny. Oczywiście, ładunek ten jest tym większy, im większa różnica pomiędzy pH roztworu a pI. Takie białko umieszczone w polu elektrycznym zacznie wędrować w kierunku elektrody o przeciwnym znaku, z prędkością tym większą, im większy posiada ładunek.

Punkty izoelektryczne białek są dość zróżnicowane. Istnieje duże prawdopodobieństwo, że w mieszaninie białek zawieszonych w buforze o jakimś dobranym pH, część cząsteczek naładowana zostanie dodatnio, część ujemnie, a nadto znajdą się i takie, które nie będą miały ładunku. Jeżeli taką mieszaninę umieści się w polu elektrycznym, to cząsteczki białek zaczną wędrować w kierunku elektrod o przeciwnych znakach (oczywiście, te bez ładunku pozostaną w punkcie startowym). Umożliwia to na skuteczne rozdzielenie mieszaniny białek. Ogólnie rozpowszechnionymi metodami elektroforezy są elektroforeza bibułowa lub płytkowa cienkowarstwowa.

Oczyszczanie białek. W obecnej dobie istnieje wiele metod pozwalających szybko i skutecznie wyizolować białko z mieszaniny różnych związków (w tym, innych białek) i oczyścić je do stanu homogenności (jednolitości). Metody te opisywane są w fachowej literaturze dotyczącej omawianego problemu.

20

CH2

CH

CH2

O

O

O

CO-R1

CO-R2

CO-R3

4. Tłuszczowce (lipidy)

Do grupy związków objętych nazwą tłuszczowce lub lipidy zalicza się estry wyższych kwasów tłuszczowych z mono- lub wielowodorotlenowymi alkoholami. Są one nierozpuszczalne w wodzie. Dzieli się je na dwie podstawowe grupy:

lipidy proste, w skład których wchodzą wyłącznie alkohole i kwasy, lipidy złożone, zawierające oprócz tych podstawowych składników inne związki.

Lipidy proste dzieli się na:

1) tłuszcze właściwe - estry kwasów tłuszczowych z glicerolem.

Tłuszcze właściwe, zwane w skrócie tłuszczami, stanowią substancje zapasowe żywych organizmów. Są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym, jak i zwierzęcym. Pod względem budowy chemicznej stanowią mieszaninę estrów glicerolu z kwasami tłuszczowymi

gdzie: R-CO- reszta acylowa wyższegokwasu tłuszczowego

ogólny wzór tłuszczów właściwych

Wszystkie kwasy tłuszczowe, wchodzące w skład tłuszczów występujących w przyrodzie, poza nielicznymi wyjątkami, mają parzystą ilość atomów węgla (co jest zrozumiałe, biorąc pod uwagę sposób ich syntezy). W zależności od budowy chemicznej kwasy tłuszczowe dzieli się na 2 grupy:

kwasy tłuszczowe nasycone - nie zawierające wiązań podwójnych, kwasy tłuszczowe nienasycone - zawierające wiązania podwójne.

W przyrodzie tłuszcze występują przeważnie jako glicerydy mieszane, o różnym składzie kwasowym, głównie zawierające trzy różne kwasy tłuszczowe.

Przykłady wyższych kwasów tłuszczowych:C15H31 COOH kwas palmitynowy,C17H35 COOH kwas stearynowy,C17H33 COOH kwas olejowy (kwas nienasycony),

rycynolowy (hydroksylowa pochodna kwasu olejowego), a także inne wielonienasycone linolowy, linolenowy, arachidonowy.

Kwasy wielonienasycone występują szczególnie obficie w olejach roślinnych. Niektóre ssaki nie posiadają zdolności syntetyzowania tych związków i w takim przypadku stanowią one nieodzowny składnik ich pożywienia (tzw. związki egzogenne) i stąd noszą nazwę witaminy F.

2) woski - estry kwasów tłuszczowych z wyższymi alkoholami jednowodorotlenowymi, głównie alifatycznymi, np.

C30H61-CO-O C16H33 melisynian cetylowy

Lipidy złożone również dzielą się na kilka grup w zależności od dodatkowych składników nietłuszczowych, np. fosfolipidy, sfingomieliny, glikolipidy, itp. Do tłuszczowców zalicza się, ze względu na niektóre podobne cechy, również sterydy, które są estrami kwasów tłuszczowych i jednowodorotlenowych wielkocząsteczkowych alkoholi pierścieniowych.

Wśród tłuszczowców złożonych na uwagę zasługują fosfolipidy (zwane też fosfatydami). Głównym reprezentantem tej grupy jest lecytyna (fosfatydylocholina). Zbudowana jest ona z glicerolu, którego dwie grupy wodorotlenowe zestryfikowane są kwasami tłuszczowymi, zaś trzecia - kwasem fosforowym połączonym z choliną.

21

CH2

CH

CH2

O

O

O

CO

CO

R1

R2

P O CH2 CH2 N(CH3)3+

lecytyna

R1 - reszta kwasu tluszczowego nasyconego

R2- reszta kwasu tluszczowego nienasyconego

HO CH2 CH2 N(CH3)3+

cholina

Z kolei wśród sterydów na uwagę zasługuje cholesterol, występujący niemal we wszystkich komórkach ludzkiego organizmu. Jego stężenie we krwi wynosi od 140 do 250 mg%.

* * *

Bardziej szczegółowe informacje dotyczące dotychczas omówionych związków można znaleźć w wielu popularnych, łatwo dostępnych podręcznikach (np. z zakresu chemii organicznej, biochemii, itp.).

HO

cholesterol

Pumownie oznacza fosforan

33

dehydrogenazaglukozo-6-fosforanowa

OH

H

H

OHH

H

HO

C

C O

C

CC

CH2O

O

P

lakton kwasu 6-fosfoglukonowego

glukozo-1-fosforan

OH

H

H

H

OHH

H

HO

C

C O

C

CC

CH2OH

PO

fruktozo-6-fosforan

C

O

C

CCH

H

HOH

OH

OH

CH2OHOH2CP

izomerazaheksozofosforanowa

fosfoglukomutaza

glukozo-6-fosforan

OH

OH

H

H

H

OHH

H

HO

C

C O

C

CC

CH2O P

ROZDZIAŁ 2. ELEMENTY ENZYMOLOGII

Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi zachodzące w przyrodzie ożywionej reakcje chemiczne. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termody-namicznie możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząste-czek substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym nie wchodzi w skład końcowych produktów reakcji i zasadniczo pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji.

Zdecydowana większość dotychczas poznanych enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w przeważającej liczbie przypadków składają się one z części białkowej (apoenzymu ) i niebiałkowej (witamin i ich pochodnych, jonów metali oraz małocząsteczkowych związków organicznych) tzw. grup p ros t e tycznych i koenzymów . Pod nazwą grupa p ros t e tyczna rozumie się różnorodne niebiałkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny) i jony metali luźno związane z apoenzymem oraz silnie związane z częścią białkową koenzymy. Koenzymy są witaminami lub ich pochodnymi. Połączenie koenzymu z apoenzymem określa się mianem ho loenzymu. Trwałość tego połączenia jest różna; bardzo często koenzym łatwo oddysocjowuje od apoenzymu.

Apoenzym jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach.

Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).

2.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów

Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną substratu, działając wyłącznie na jedną z nich – tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie można dokonać w inny znany sposób.

Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji (do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).

Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, drugą – izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza.

34

Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej specyficzności (wysoko specyficzne).

Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.

Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.

Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in. monooksygenazy, które mogą selektywnie wbudowywać atom tlenu w jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji lub oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy, z jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji i Monooksygenazy szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15 i 6 oraz 11.

Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi. Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP–1-glukozę w UDP-1-galaktozę.

2.2. Istota katalizy enzymatycznej

Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada się na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcję taką można zapisać równaniem:

Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli

H2C COOH

H2C COOH

HC

CH

COOH

HOOC

bursztynian fumaran

FAD FADH2

dehydrogenazabursztynianowa

O CH3

Progesteron

C

O

15

11

6

E + S ES E + PEP

35

E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp.

Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel*. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych) dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej. Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako źródło aktywności katalitycznej enzymów: naprężenia steryczne; desolwatację reagentów; optymalne nakładanie orbitali (OS); wiązania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB); efekty dynamiczne; zmiany entropii w wyniku wiązania z enzymem, oddziaływania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.

Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić schematycznie jak na rysunku obok. Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego wyznacza barierę energetyczną dla całej reakcji. Ta bariera dla reakcji enzymatycznej jest wyraźnie niższa (o ∆GE) niż bariera energetyczna dla reakcji niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszając energię swobodną tworzenia stanu przejściowego znacznie przyspieszają przekształcenie substratów w produkty.

2.2.1. Mechanizm działania enzymów

W czasie reakcji enzymatycznej cząsteczka substratu jest wiązana w określonym obszarze do cząsteczki enzymu w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym–substrat. Dzięki specyficznemu rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu rozluźniając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd.

Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem, polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Przykładem może być wiązanie glukozy z heksokinazą.

Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego. Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie, panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej

* [Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns, Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]

+ ES SE

Postęp reakcji

Ene

rgia

sw

obod

na

stan przejściowy

∆GE

produktysubstraty

reakcja enzymatyczna

36

dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe jest rozluźnienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w inne układy wiązań.

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią – dzieli się na cztery kategorie:

1. aminokwas lub aminokwasy bezpośrednio dz i a ła j ące ; w enzymach złożonych ich rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,

2. aminokwasy wspomagaj ące , 3. aminokwasy kon taktowe , zwane również wiążącymi , 4. aminokwasy pomocnicze . Aminokwasy pomocnicze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są

do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego (można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).

Aminokwasy kon t aktowe (wiążące ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i „wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów.

Rola aminokwasu bezpośrednio dz i a ł a j ącego i aminokwasów wspomaga j ącychzostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku).

Mechanizm działania centrum katalitycznego proteinaz serynowych (opis w tekście).

W centrum katalitycznym wszystkich proteinaz serynowych występuje triada aminokwasów. Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu przenosi się poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia się silny ładunek ujemny; w konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony przestrzennie węgiel wiązania peptydowego – naładowany dodatnio – to oba przeciwnie naładowane atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum

Asp

CH2

C

O O-

32His

NNH

CH2

64

Ser221

CH2

OH

Asp

CH2

C

O OH

32His

NN

CH2

H

64

Ser221

CH2

O-

CNH

R2

R1

O -

+

-

Ser221

CH2

O

Ser221

CH2

O C

R2

O

H2O

OH-

R2COOH

R1 NH2

+-

Ser221

CH2

O

37

LipS

S

aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH

- i też

oddzieli się od centrum aktywnego proteinazy.

2.2.2. Koenzymy i grupy prostetyczne.

W enzymach złożonych rolę aminokwasu bezpośrednio działającego pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup chemicznych. Biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego substratu grupę chemiczną, w drugiej oddają ją drugiemu substratowi, odtwarzając się w pierwotnej postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu. Trwałość połączenia apoenzymu z koenzymami jest różna; jeśli koenzym łatwo dysocjuje, reakcje przenoszenia grup chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje układ złożony z 2 enzymów o wspólnym koenzymie; jeśli koenzym jest związany z enzymem trwale (pełniąc rolę grupy prostetycznej), enzym ten katalizuje kolejno obie reakcje. Uogólniając, niebiałkowe składniki enzymów można traktować, jako kosubstraty reakcji enzymatycznej. W tabeli 2.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej.

Tabela 2.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne

Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej Skrót Przenoszone grupy lub charakterystyczna cecha

Koenzymy oksydoreduktaz

Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy

Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego

Dinukleotyd flawinoadeninowy

Mononukleotyd flawinowy

Metaloflawoproteidy

Flawoproteidy transportujące elektrony

Ubichinon

Liponian

Porfiryny

Koenzymy transferaz

Adenozynometionina

Adenozynotrifosforan

Biotyna

Difosfotiamina

Fosforan pirydoksalu

Koenzym A

Koenzym B12

Kwas foliowy

Siarczan fosfoadenilowy

Urydynodifosforan

NAD

NADP

FAD

FMN

Me-Fp

ETF

Q

-

-

ATP

-

DPT

TPP

CoASH

B12

FH4

PAPS

UDP

Atomy wodoru i epimeryzacja

Atomy wodoru

Atomy wodoru i koenzym oksydaz

Atomy wodoru

Transport elektronów

Transport elektronów

Transport elektronów

Atomy wodoru i grupy acylowe

Cytochromy, oksydaza cytochromowa koenzym katalazy i peroksydaz

Grupy metylowe

Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i AMP

CO2 (koenzym karboksylaz)

Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja

Przemiany aminokwasów (w tym deaminacja)

Grupy acylowe

Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie grupy -COOH

Grupy formylowe, hydroksymetylowe, formimidowe

Reszta kwasu siarkowego

Grupy glikozylowe

38

Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz

Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+) lub jego fosforan - NADP+. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te są dinukleotydami zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną pirydyny i jest jedną z witamin z grupy B o nazwie witamina PP.

Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.

Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD+, a jego forma zredukowana NADH + H+. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne zapisy NAD (zamiast NAD+) i NADH2 (zamiast NADH+H+).

Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora). W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraźne. Np. dehydrogenaza alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami:

Zredukowane formy NADH2 – wyjątkowo również NADPH2 - w żywych komórkach regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH2 może też regenerować się w reakcjach, w których staje się donorem wodoru (w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.). Większość reakcji katalizowana przez dehydrogenazy sprzężone z NAD jest odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6). Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1).

Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami

N

CO

NH2

amid kwasunikotynowego

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)i jego fosforan (NADP)

P P

+N

CONH2

HOOH

CH2O

O

O

OH OH

OH2C

( P )

N

N

N

N

NH2

N

Ryb

CONH2

HH

P P Aden

N

CONH2

Ryb P P Aden

+ + H+

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

przez NAD

NAD NADH + H+

NADPH2 + NAD NADP + NADH2transdehydrogenaza

EC 1.6.1.1

NADH+H+ NAD

reduktaza fumaranowa

H2C COOH

H2C COOH

kwas bursztnowy

HC

CH

COOH

HOOC

kwas fumarowy (EC 1.3.1.6)

39

H

ryboflawina

N

N N

NHH3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O

LipS

S

szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej.

Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony metali Mg2+, Zn2+, Mn2+. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg2+ lub Zn2+ odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu alkoholanowego.

Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego „właściwego” działania, czyli utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego d e k a r b o k s y l a c j i . Takiej dekarboksylacji ulegają tylko α-ketokwasy lub α-hydroksykwasy. Utlenianie α-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się α - o k s y d a c j ą i katalizowane jest przez u k ł a d y w i e l o e n z y m a t y c z n e (sprzężone z ,DPT, FAD, CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez d e h y d r og e na z ę p i r og ro n ia no wą ( d ek a rb ok s y l u j ąc ą ) , o czym będzie mowa dalej. Natomiast przykładem dekarboksylacji α-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących: EC 1.1.1.37 – d eh yd r og ena z a j ab ł c za no wa - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do

szczawiooctanu, EC 1.1.1.38 – de h yd ro ge na z a j a b ł c za no wa ( s zc z a w i o oc t an - de k a rb ok s y l u j ą ca ) - sprzężona z

NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.39 – de h y d r og en a za j ab ł c za no wa ( d ek a rb ok s y l u j ąc a ) - sprzężona z NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.40 – de h yd ro ge na z a j a b ł c za no wa ( s zc z a w i o oc t an - de k a rb ok s y l u j ąca ) - sprzężona z NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu.

Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi rybof l awina . Związek ten zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu, pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B2.

Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się, zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.

Fosforan ryboflawiny – mononukleotyd f l awinowy – zapisuje się symbolicznie FMN, a jego połączenie z nukleotydem adeninowym – d inukl eotyd f lawinoaden inowy – oznacza się skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami enzymatycznymi, tworząc f l awoprote idy , będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych.

FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru. Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH2-CH2-→ -CH=CH-. Przykładem może być wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

OH2C

N

N N

NHH3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O P P

40

ubichinon (Q)

O

O

H3C

H3C CH3

)( n H

symbolicznie zapisuje się FADH2. Podobnie jak zredukowany NADH2, zredukowany FADH2 w komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym.

Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen – uaktywnianie cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego enzymu może być oksydaza aminowa zawiera j ąca FAD (EC 1.4.3.4). Reakcję taką symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa się je kofaktorami reakcji utlenienia.

FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego cytochromu P450. Zredukowany FADH2 może z kolei być donorem wodoru dla oksygenaz z podpodklasy EC 1.14.14.

Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe2+, Zn2+ lub Mo2+, które współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu nazywa się metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp. Transportują one przede wszystkim elektrony.

Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). Łańcych boczny zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od źródła pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach drobnoustrojowych waha się od 5 do 13.

Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji pierścienia chinonowego.

N

N N

NHH3C

H3C

O

O

R

Fe2+

metaloflawoproteid

H2O

oksydaza

O2 (FAD)

+ + H2O2CH2 NH2R C

O

HR NH3

aminowa

przez FAD

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

FAD FADH2

N

N N

NHH3C

H3C

O

O

rybitol P P Aden

N

N N

NHH3C

H3C

O

O

rybitol

H

H

P P Aden

Q

O

O

H3C

H3C

R

CH3

QH2

H3C

H3C

R

CH3

OH

OH

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

przez ubichinon

41

Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bądź reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z nielicznych przykładów może być dehydrogenaza NADH (ubi chinonowa) –EC 1.6.5.3, która katalizuje reakcję utlenienia NADH2 do NAD z jednoczesną redukcją ubichinonu do ubichinolu. Ciekawym enzymem jest dehydrogenaza me tano lowa (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ).

Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym ł ańcucha oddechowego .

Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze sobą mostkami metinowymi (=CH–). Przy atomach węgla β (3 i 4) pierścieni pirolowych zamiast atomów wodoru występują różne grupy chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i inne). W celu ujednolicenia zapisu związków tego typu Fisher zaproponował symboliczny, uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczanokodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe literami alfabetu łacińskiego od α do δ, jak to przedstawiono na rysunku obok.

Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i nazwany jest on przez Fishera protopor f i ryną IX . Izomer ten jest prekursorem me ta lopor f i rynwchodzących w skład hemopro te in i ch lorof i l i .

M e t a l o p o r f i r y n y to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi) centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych. Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w hemoprot e inach . Metaloporfiryny z wbudowanym Mg2+ są składnikami ch lorof i l u .

H e mo p r o t e i n y to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę.

H e m to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe2+) z protoporfiryną IX. Hem jest barwną grupą prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierząt, hemoglobina – czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO2 a także jonów wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu.

H e mi n y to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia (Fe3+). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi katalaz i peroksydaz, katalizując procesy utleniania. Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi.

HCN

CH

NN

HC CHN

porfiryna

I

II

III

IV

1 2

5

7

6

8

4

H H

3 3

I

IIIV

III

1 2

4

56

7

8

symboliczny, uproszczonyzapis wzoru porfiryny

M =

P =V =

CH3CH=CH2CH2 CH2 COOH

I

IIIV

III

VM

M

M

M

V

P

P

I

IIIV

III

VM

M

M

M

V

P

P

Fe2+

Fe2+

protoporfiryna IX hem

ferrochelatazaEC 4.99.1.1

enzymatyczna transformacja protoporfiryny IX w hem

42

fragment łańcńucha polipeptydowego

cytochromu c

HisLiz

SS

Cys Ser CysGlu(NH2)

miejsce przyłączenia heminy

N

CH3

HC CH

N

CH3

N

CH2CH2HOOC

H3C

Fe+3

CH3HOOC CH2 CH2

HC CHN

CH2

H2C

CH2

CH2

hemina

cytochrom c

C y t o c h r o my to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza grupy heminowej (z Fe2+ na Fe3+) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz podgrupy (np. cytochromy a3). Kompleks hemoprotein a + a3 jest enzymem znanym jako oksydaza cytochromowa .

O k s y d a za c y t o c h r o mu c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a3, składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego; aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony.

C h l o r o f i l e , pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu zwanego chloroplastyną. Są to metaloporfiryny, zawierające wbudowany w centrum jon magnezu (Mg2+). Połączone są wiązaniem estrowym z fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U wszystkich roślin wyższych i glonów występuje chlorofil a (niebieskozielony, co najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 -liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy której występuje maksimum absorpcji światła). Chlorofil b - żółtozielony, występujący u roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil c — występuje w małych ilościach w czerwono zabarwionych roślinach wodnych (m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach, niektórych okrzemkach i wiciowcach. Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów. Chlorofil a absorbuje głównie światło fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II.

Kwas liponowy (tiooktanowy). Związek ten uczestniczy w transporcie elektronów, a także w przenoszeniu grup acylowych w reakcjach α-oksydacji (oksydacyjnej dekarboksylacji α-ketokwasów). Jest elementem składowym układów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w dehydrogenazie pirogronianowej (dekarboksylującej). Jest to kwas 6,8-ditiolooktanowym. Łatwo ulega odwracalnemu utleenieniu i redukcji.

C20H39

OOCCH3

fityl

chlorofil a

N

CH3

H

C CH

N

CH3

N

HC CHN

CH3 CH

CH3

CH2

CH2

C2H5CH2

CH

OOC

C

O

H

Mg2+

43

CEnzym-NH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH

CH2

S

CH2

SO

liponian

LipS

S

LipS

S H~C

O

CH3DPT

enzym

DPT CH

CH3

OH

enzym

LipS

S

H

H

FADFADH2

CoASH

CH3 C

O

~SCoA

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

CH2SCH2

CH2

CHNH2

COOH

CH3

+

adenozynometionina

H

H

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)

12

34 5 6

789 10

COOH

CH2

CH2

COOH

CH

O

NHNH CCH2

H2N

OH

N

N

N

N

Jak już wspomniano, liponian jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych, jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe.

Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz

Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę –CH3. Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw. „aktywny metyl”). I dlatego, w formie jonu CH3

+, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne (najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach anabolicznych, metylując m.in. grupę aminową (np. w biosyntezie choliny).

Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pterydyny, heterocyklicznego dipierścieniowego związku, do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka dostarczany jest przez bakterie jelitowe.

Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H4folian) -jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:

CH3– HOCH2– –CH2– –CH= HOC– HN=CH–

Miejscem przyłączenia grup C1 są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast źródłem ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.

LipS

S

XH2 X

LipS

S

H

H

liponianuteniony

liponianzredukowany

44

Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy -COO- do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP, który transformuje do aż AMP.

Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany psychomotoryczne: depresję, brak łaknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.

Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3’-fosforanu–5’-pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem peptydowym z cystoaminą. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasłowego i β-alaniny. Symbolicznie koenzym A zapisuje się jako CoASH.

Kwas pantotenowy jest witaminą B5. Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran, zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym źródłem tego związku są drożdże, grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka, mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły, ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę podczas aktywacji i przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH do kwasu karboksylowego katalizują syntetazy, które do swego działania wymagają dostarczenia energii, której źródłem jest ATP. Powstałe wiązanie tioestrowe jest wiązaniem wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych tyldą „~”). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem. Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę zapisuje się jako DPT.

HN NH

O

S C

O

NH-Enzym

biotyna

HN NH

O

S R

biotyna

NH

O

N

RS

HOOCATP AMP+PP

CO2

karboksylaza

karboksybiotyna

adenozyno-3'-fosforan-5`-pirofosforan

koenzym A (CoA-SH)

P O CH2 C

CH3

CH3

CH

OH

C

O

NH CH2 CH2 C

O

NH CH2 CH2 SHPO

OH

CH2

O

N

N

N

N

NH2

P

cysteoaminakwas pantotenowy

ATP AMP+PP

syntetazaX-CoA

CoASH

X COOH ~SCoAX CO

45

N

NH3C NH2

CH2N

SCH2

CH3

CH2 O P P

+

difosfotiamina (DPT)

Tiamina jest w i t a m i n ą B 1 . Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn), zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B1 może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraźną niewydolnością układu krążenia. Etanol powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej do organizmu. Ź ró d ł em t e j w i t a m in y są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby, owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.

Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i semialdehyd bursztynowy.

Jako grupa prostetyczna ke t o l a z , DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo-5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan.

Jako e l e me n t u k ł a dó w wi e lo en zyma t yczn yc h - podczas α-oksydacji - np. pirogronianu lub α-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-transportująca) – EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylację pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (bursztynian-transporująca) – EC 1.2.4.2, dekarboksyluje α-ketoglutaran do semialdehydu bursztynianowego, które dalej przenosi na kwas liponowy.

Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych związków: pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy. Są one pochodnymi pirydyny.

DPT

N

S CH2

CH3R

H CH2 O

+

PP

Enzym

aldehyd3-fosfoglicerynowy

P

CH OH

CH2O

COH

transketolazaksylulozo-5-fosforan

CH2OH

C O

CHHO

CH OH

CH2O P

N

S CH2

CH3

R

CH2 O

+

PP

Enzym

~C

H

HO

CH2OH

aktywny aldehyd glikolowy~DPT

NH3C

HO CH2OH

CH2OH

NH3C

HO CH2OH

CH2NH2

NH3C

HO CH2OH

CO

H

pirydoksyna pirydoksamina pirydoksal

DPT

N

S CH2

CH3R

H CH2 O

+

PP

Enzym

~DPT

CH3

C O

COOHpirogronian

hydroksyetylo

CO2

fragment dehydrogenazypirogronianowej

(dekarboksylującej)

N

S CH2

CH3

R

CH2 O

+

PP

Enzym

~C

OH

H

CH3

46

5 -F o s f o ra n p i r yd o ksa l u (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50 enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na α-ketokwasy i odwrotnie. Jest koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym metabolizm aminokwasów.

Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminą B6. Wszystkie trzy związki ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia, bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B6 wytwarzana jest przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.

Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu noszą nazwę kobal aminy. Zamiast jonu CN-, z kobalaminą może być połączony inny anion, np. hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku związek nosi nazwę nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus.

Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.

Witamina B12, znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, związane z anemią złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć u niektórych mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba. Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu pokarmowego. Źródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane przez normalną dietę.

Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są koenzymami, a właściwie poprawniej definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków bogatych w energię chemiczną; tzw. związków makroergicznych lub inaczej związków wysokoenergetycznych. Wśród nich najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa adenozyno t r i fos foran – ATP. Jest on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7.,

H

+

CN

P

N

N

CH3

CH3

O

OHO

HOH2C

CH3

CHCH2NHCOCH2

Co

H3C

H2NOH2C

H2NOH2CH2C

H2NOH2C CH2

CH3

CH2CH2CONH2

CH3

CH3

CH3

CH2CH2CONH2

CH2CONH2H3CCH3

CH3

N

CHN

C

N

CN

cyjanokobalamina

47

O

OH

CH2

O

O P O

OH

N

N

N

N

NH2

H

adenozyna

AMP

ADP

ATP

O

P O

OH

P

OH

OH

O O

przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz (enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.).

T e r mo d yn a mi ka r e a kc j i e n zyma t yc zn ych . Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii swobodnej ΔG była równa zero lub ujemna. Przykładowo reakcja glukozy z kwasem fosforowym jest reakcją endoergiczną; zmiana energii swobodnej ΔG = 12 kJ/mol. Stąd równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta na lewą stronę; glukozo-6-fosforan praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy ATP do ADP + Pi* jest z kolei silnie egzoergiczna; ΔG = −29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości ΔG jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych reakcji suma energii swobodnej ΔG = −17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P.

W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy –OH rybozy zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi ΔG = −14 kJ/mol. Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym. Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi:

Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną. Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu związku do makroergicznych jest ΔG zbliżone do −29 kJ/mol.

W tabeli 2.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+Pi

wynosi ΔG = −29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o ΔG >−29 kJ/mol. Z tego samego powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się na tej liście powyżej, o ΔG <−29 kJ/mol.

* umownie Pi oznacza fosforan nieorganiczny

ATP G= -29 kJ/molADP + Pi,G= -28 kJ/molADP AMP + Pi

glukoza G= -17 kJ/mol

ATP ADP + Pi

glukozo-6- P

G= -29 kJ/mol

ATP ADP

glukoza + H3PO4 glukozo-6- P-H2O

+H2OG= 12 kJ/mol

48

Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji.

Tabela 2.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów

Nazwa związku ΔG [kJ/mol] 1

Fosfoenolopirogronian

Karbamoilofosforan

1,3-difosfoglicerynian

Fosfokreatyna

Acetylo~SCoA

−62

−51

−49

−43

−34

ATPAMP+PP

ATPADP+P

ADPAMP+P

PP (pirofosforan)

−31

−29

−28

−27

Glukozo-1-fosforan

AMP

Glukozo-6-fosforan

−21

−14

−14

1 cytowane dane są przybliżonymi wartościami ΔG

ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiązania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowa-dzące do powstania ADP, powoduje utratę jednego z nich (ΔG =−29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od ADP prowadzi do powstania AMP (ΔG =−28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o ΔG =−57 kJ/mol*. Ale od ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana energii swobodnej ΔG takiej przemiany równa jest −31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie (ΔG =−27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje ΔG =−58 kJ/mol*. Ta swobodna energia zawarta w PPi jest uwalniana podczas jego enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1).

W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3) przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak to przedstawiono na rysunku obok.

Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg2+. Stąd jony Mg2+ są aktywatorami enzymów współdziałających z ATP.

Reasumując, r o l a AT P j a ko kos ub s t r a t u w reakcjach enzymatycznych jest następująca:

1. ATP jako d on or e ne r g i i s wob od ne j w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PPi. Jak już wspomniano, ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna ΔG =−58 kJ/mol, co wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

* Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP

oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości ΔG.

PPi 2Pipirofosfataza

nieorganiczna

ATP + AMP 2 ADPkinaza

adenylanowa

49

NADH

ADPATP

NADPHkinaza NADH

metionina + ATP

adenozynotransferazametioninowaEC 2.5.1.6

PP + P

adenozynometionina

ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworząca) – EC 6.2.1.13. Wybrano ją celowo, gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego „punktu widzenia” komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA.

2. ATP jako d on or o r t o fo s f o ra nu . Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszą rodnik fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy, glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z NADH katalizowana przez kinazę NADH (EC 2.7.1.86).

Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach źródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem energia swobodna jego hydrolizy ΔG =−27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa (pirofosforanowa) – EC 2.7.2.12, katalizująca przeniesienie fosforanu z PPi na kwas octowy z wytworzeniem acetylofosforanu.

3. ATP jako d on or p i r o fos fo r an u . W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcję katalizują pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza difosfotiaminy z tiaminy. Reakcję katalizuje pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2).

4. ATP jako d on or r od n i ka a de n yl i l o we go . Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PPi. Reakcja ta ma podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy (zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN katalizowana przez adenylilotransferazę FMN (EC 2.7.7.2). Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest przez urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanową (EC 2.7.7.9).

5. ATP jako d on or ade no zyn y . W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazę metioninową (EC 2.5.1.6).

Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano. Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) są koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA

ATP AMP+PP

syntetazaacetylo-CoA

CoASH

~SCoACO

CH3CH3 COOH

ATP ADP+P

CoASH

~SCoACO

CH3CH3 COOH

syntetazaacetylo-CoA

(ADP-tworzaca)

FMN

ATP PPi

FADadenylilotransferaza FMN

tiamina

ATP AMP

pirofosfokinazatiaminowa

difosfotiamina

glukozo-1- P

UTP PPi

urydylilotransferazaglukozo-1-fosforanowa

UDPG

50

(patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod postacią cytydylodifosfocholiny.

Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleotydotrifosforanami występuje zależność:

2.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

S zyb ko ś ć r ea kc j i enzy ma t yc zne j , podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów:

dt

Pd

dt

Sdv

][][ (2.1)

R ó wno wa ga r ea kc j i e n zyma t yc zn ych . Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne (również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v1 jest proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-1 jest proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi:

21 vv ][][11 BAkv ][11 ABkv (2.2)

gdzie: A,B – substraty; AB – produkt; k+1, k-1 – stałe szybkości reakcji

Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz ze wzrostem temperatury reakcji.

Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów spełniają zależność:

KBA

AB

k

k

][][

][

1

1 gdzie: K jest stałą równowagi konkretnej reakcji. (2.3)

Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest stała równowagi reakcji K.

Jeszcze raz należy wyraźnie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1 to reakcja jest spontaniczna.

Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:

Kln -RTG gdzie: R - stała gazowa, T – temperatura bezwzględna (2.4)

Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów i produktów. I odwrotnie: im większe ∆G, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość ∆G jest bardzo duża cały substrat ulega przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna.

Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G (w chemii fizycznej znanej pod słuszną nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:

STHG (2.5)

S zyb ko ś ć po c zą t k owa r e a kc j i en zyma t yc zne j . Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu.

nukleozydotrifosforan + ADP

kinazanukleozydodifosforanowa

nukleozydodifosforan + ATPEC 2.7.4.6

S Penzym

A + B ABv+1, k+1

v-1, k-1

V

[E]

Wpływ stężenia enzymu [E] na szybkość reakcji enzymatycznej V

[S]>>[E]

51

mK [S]

2maxV

maxVV

Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego.

A k t y wn o ś ć e n z y ma t y c z n a . Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu. Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.

Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano ka t a lem (Kat). 1 Kat to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30C.

Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię Biochemiczną, nazwana została mię d zyn a ro do wą j ed nos t ką en zyma t yc zną (w skrócie m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty w temperaturze 30C.

Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów a nawet grup enzymów.

Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swoją koncepcję katalizy enzymatycznej. Model Michaelisa–Menten opiera się na założeniu powstawania przejściowego kompleksu enzymu-substrat:

(2.6)Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom

enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres.

Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną Vmax. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (2.6) wynika, że w stanie równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu:

1221 vvvv (2.7)

][][11 SEkv ][11 ESkv ][22 ESkv ][][21 PEkv (2.8)

Po podstawieniu zależności (2.8) do równania (2.7) i po prostych matematycznych przekształceniach otrzymuje się:

E + S ES E + Pk-1

k1k2

k-2

52

[S]

vVmax

Km2Km1

S1 S2

Vmax

1v

-1Km

1[S]

tgα = Km/Vmax

21

2

21

1 ][][

][

][

kk

Pk

kk

Sk

E

ES(2.9)

Uwzględniając fakt, że na początku reakcji [P] 0 oraz po dalszych prostych przekształceniach równania (2.9), otrzymuje się:

mK

1

21

][

][][

k

kk

ES

SE(2.10)

Wielkość Km nosi nazwę s t a ł e j Mic hae l i s a . J est ona charakterystyczna dla danego układu enzym-substrat. Łatwo zauważyć, że im mniejsza wartość Km, tym większe stężenie kompleksu przejściowego [ES].

Analizując równania (2.6) (2.10) należy zauważyć, że1. stężenie enzymu [E] w równaniu (2.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w

danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E0] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana w ES. Stąd [E]= [E0]-[ES].

2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak naprawdę od szybkości rozpadu kompleksu ES, czyli od v+2. Stąd: v = v+2=k+2 [ES].

3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E0]=[ES] szybkość reakcji enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość Vmax.

Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (2.10) otrzymuje się ró wna n ie ma t e ma t yc zne Mi chae l i s a -M e nte n :

][

][max

SK

SVv

m

(2.11)

Równanie (2.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa Km:gdy: v= 1/2Vmax to Km = [S]

Stała Michaelisa Km jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej Vmax.

Łatwo wykazać, że:1. Jeśli [S]<<Km (czyli przy małych stężeniach substratu), to reakcja jest I rzędu: v= f([S]),2. Jeśli [S]=Km, to v=1/2Vmax

3. Jeśli [S]>>Km, to reakcja jest 0 rzędu i v=Vmax.Odwrotność stałej Michaelisa 1/Km nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu.

Im mniejsza stała Michaelisa Km, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S1 i S2 – przyjęto identyczne szybkości maksymalne reakcji Vmax. Km2>Km1, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S1

aniżeli do S2. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S1 aniżeli S2.

Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji Wykres Lineweavera-Burkaenzymatycznej

Stałe Michaelisa Km dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od 10–2 mola/dm3 do 10–7mola/ dm3.

Stałą Km można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..

53

maxmax

1

][

11

VSV

K

vm

Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znaleźć więcej danych odnośnie tematu.2.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów

Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W późniejszym okresie nazwę enzymu wywodzono od typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.).

Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie s ys t e ma t yc zn ych n a zw en zymó w , składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza, itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w reakcji. Np.:

maltohydrolaza 1,4-α-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo β-amylazą) - EC 3.2.1.2, oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazą alkoholową) - EC 1.1.1.1.

Nazwy systematyczne enzymów są długie i niekiedy bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne jest stosowanie nazw zwyczajowych. Ostatnio (po 2000 roku) pojawiła się koncepcja wprowadzenia tzw. nazw oficjalnych enzymów wywodzących się od nazw zwyczajowych. I tak np. nazwa α-amylaza jest w świetle tej koncepcji nazwą oficjalną enzymu sklasyfikowanego pod numerem EC 3.2.1.1.

Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza, maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania. Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np. tyrozynaza. Nazwa „tyrozynaza” dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną.

W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim.

Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC 1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono na sześć głównych klas:

EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące reakcje odłączania lub przyłączania atomów wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów.

EC.2. Transferazy - enzymy przenoszące grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty cząsteczek itp. EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujące reakcje hydrolizy. EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywające wiązania. EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujące przemiany wewnątrzcząsteczkowe (racemizacja,

izomeryzacja, przenoszenie grup itp.). EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujące, katalizujące tworzenie wiązań.

Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz -typ hydrolizowanego wiązania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.

54

Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature Database) można znaleźć pod adresem http://www.expasy.org/enzyme/. Na następnej stronie przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej – EC 1.1.1.1.

55

Wzór strony ExP ASy dla EC 1.1.1.1 – dehydrogenaza alkoholowa.

Official Name

Alcohol dehydrogenase.

Alternative Name(s)

Aldehyde reductase.

Reaction catalysed

An alcohol + NAD(+) <=> an aldehyde or ketone + NADH

Cofactor(s)

Zinc or Iron.

Comment(s)

Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals. The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols.

Cross-references

Biochemical Pathways; map number(s)

D8 ; E6 ; J10

PROSITE PDOC00058 ; PDOC00059 ; PDOC00060

BRENDA 1.1.1.1

PUMA2 1.1.1.1

PRIAM enzyme-specific profiles

1.1.1.1

Kyoto University LIGAND chemical database

1.1.1.1

IUBMB Enzyme Nomenclature

1.1.1.1

IntEnz 1.1.1.1

MEDLINE Find literature relating to 1.1.1.1

Swiss-Prot

P80222, ADH1_ALLMI; P49645, ADH1_APTAU; P06525, ADH1_ARATH; P41747, ADH1_ASPFL; P12311, ADH1_BACST; Q17334, ADH1_CAEEL; P43067, ADH1_CANAL; P48814, ADH1_CERCA; P23991, ADH1_CHICK; P23236, ADH1_DROHY; P48586, ADH1_DROMN; P09370, ADH1_DROMO; P22246, ADH1_DROMT; P07161, ADH1_DROMU; P12854, ADH1_DRONA; P08843, ADH1_EMENI; P05336, ADH1_HORVU; P20369, ADH1_KLULA; Q07288, ADH1_KLUMA; P00333, ADH1_MAIZE; P80512, ADH1_NAJNA; Q9P6C8, ADH1_NEUCR; P20306, ADH1_ORYSA; P12886, ADH1_PEA; P14219, ADH1_PENAM; P25141, ADH1_PETHY; O00097, ADH1_PICST; Q03505, ADH1_RABIT; P22797, ADH1_RANPE; P14673, ADH1_SOLTU; P80338, ADH1_STRCA; P13603, ADH1_TRIRP; P00330, ADH1_YEAST; Q07264, ADH1_ZEALU; P20368, ADH1_ZYMMO; P42327, ADH2_BACST; O45687, ADH2_CAEEL; O94038, ADH2_CANAL; P48815, ADH2_CERCA; P27581, ADH2_DROAR; P25720, ADH2_DROBU; P23237, ADH2_DROHY; P48587, ADH2_DROMN; P09369, ADH2_DROMO; P07160, ADH2_DROMU; P24267, ADH2_DROWH; P37686, ADH2_ECOLI; P54202, ADH2_EMENI; Q24803, ADH2_ENTHI; P10847, ADH2_HORVU; P49383, ADH2_KLULA;

Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach.

Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy – enzymy

56

wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o „oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym wybudowaniem atomów tlenu”.

Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej klasie enzymów.

EC 1. OksydoreduktazyEC 1.1. działające na grupę –CH2-OH jako donor EC 1.2. działające na grupę –CHO lub >C=O jako donor EC 1.3. odrywające atomy wodoru od –CH2-CH2, prowadząc do –CH=CHEC 1.4. działające na grupę –CH2-NH2 jako donor EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor EC 1.6. działające na NADH lub NADPH EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory EC 1.8. działające na związki siarki jako donory EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory EC 1.11. działające na H2O2 jako akceptor peroksydazy

Są to p e r o k s y d a zy . W tej podklasie brak jest pod-podklas, stąd ich numer zaczyna się od EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do k a t a l a zy .

EC 1.12. działające na wodór jako donor EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagają

dodatkowego donoru wodoru EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowują dwa atomy tlenu EC 1.13.12. monooksygenazy – wbudowują jeden atom tlenu

EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagają dodatkowego donoru wodoru

Schematycznie, reakcje katalizowane przez te enzymy można przedstawić następująco:

EC 1.14.11. dioksygenazy, DH2 = 2-ketoglutran EC 1.14.12. dioksygenazy, DH2 = NADH EC 1.14.13. monooksygenazy, DH2 = NADH EC 1.14.14. monooksygenazy, DH2 = FADH2 lub zredukowany FMN EC 1.14.15. monooksygenazy, DH2 = zredukowane żelazowo-siarkowe białka EC 1.14.16. – EC 1.14.20. monooksygenazy, DH2 = inne zredukowane związki

EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory EC 1.16. utleniające jony metali EC 1.17. działające na grupy =CH lub –CH2 jako donory EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory EC 1.19. – EC 1.21. działające na inne związki jako donory EC 1.97. inne oksydoreduktazy

W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z klasy oksydoreduktaz.

EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP, dehydrogenazy i reduktazy EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy, oksydazy

Oksydazy są flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bądź hemoproteidami. Znane są dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają nadtlenek wodoru.

XH X-OH

O2 DH2 D

H2O

mechanizm działaniamonooksygenazy z podklasy EC 1.14.

XH2

O2 DH2 D

mechanizm działaniadioksygenazy z podklasy EC 1.14.

XOH

OH

XH2

O2

H2O

(koenzym)

X

1/2

oksydazy typu I

XH2

O2 (koenzym)

X

oksydazy typu II

H2O2

57

Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4).

EC 1.x.4. akceptorem są związki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujące) EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon dehydrogenazy EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD) dehydrogenazy

Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla o jaki rodnik chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy.

EC 2. TransferazyEC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C1)

EC 2.1.1. metylotransferazy (CH3) EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (CH2OH, CHO) EC 2.1.3. karboksy i karbamoilotransferazy EC 2.1.4. amidynotransferza (CONH2)

EC 2.2. transportujące grupy aldehydowe lub ketonowe EC 2.3. Acylotransferazy

EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe EC 2.3.2. aminoacylotransferazy EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu

EC 2.4. glikozylotransferazy EC 2.4.1. heksozylotransferazy EC 2.4.2. pentozylotransferazy EC 2.4.99 transportujące inne glikozylowe grupy

EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupyEC 2.6. transportujące grupy z azotem

EC 2.6.1. Transaminazy aminotransferazyEC 2.6.2. Oksymotransferazy EC 2.6.99. transportujące inne grupy z azotem

EC 2.7. transportujące grupy zawierające fosforEC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem kinazyEC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem kinazyEC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupą z azotem jako akceptorem kinazyEC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupą fosforową jako akceptorem kinazyEC 2.7.6. Difosfotransferazy difosfokinazyEC 2.7.7. NukleotydilotransferazyEC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowychEC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów dikinazy

EC 2.8. transportujące grupy zawierające siarkęEC 2.8.1. SiarkotransferazyEC 2.8.2. SiarczanotransferazyEC 2.8.3. CoA-transferazyEC 2.8.4. transportujące grupy tioalkylowe

EC 2.8. transportujące grupy zawierające selen

Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ hydrolizowanego wiązania.

EC 3.HydrolazyEC 3.1. działające na wiązanie estrowe

EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych esterazy, lipazy i laktonazyEC 3.1.2. Hydrolazy tioestrówEC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych fosfatazy i nukleotydazyEC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych fosfolipazy i fosfodiesterazyEC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowychEC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowegoEC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych difosfatazyEC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowychEC 3.1.11. 3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy

EC 3.2. Glikozylazy

58

EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujące O- i S-glikozyleEC 3.2.2. hydrolizujące związki N-glikozylowe

EC 3.3. działające na wiązanie eteroweEC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianoweEC 3.3.2. Hydrolazy eterowe

EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe hydrolazy peptydoweEC 3.4.11. Aminopeptydazy EC 3.4.13. Dipeptydazy EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typuEC 3.4.17 MetalokarboksypeptydazyEC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typuEC 3.4.19 Omega peptydazyEC 3.4.21. Endopeptydazy serynoweEC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinoweEC 3.4.23. Endopeptydazy aspartyloweEC 3.4.24. MetaloendopeptydazyEC 3.4.25. Endopeptydazy treoninoweEC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania

EC 3.5. działające na wiązanie CN, inne niż peptydoweEC 3.5.1. w linearnych amidach m.in. amidazy i deacylazyEC 3.5.2. w cyklicznych amidach EC 3.5.3. w linearnych amidynach EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach

EC 3.6. działające na bezwodniki kwasoweEC 3.6.1. w związkach zawierających fosforanowe bezwodniki m.in. difosfatazyEC 3.6.2. w związkach zawierających sulfonowe bezwodniki EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem

EC 3.7. działające na wiązanie CCEC 3.7.1. w ketonowych substancjach

EC 3.8. działające na halogenkowe wiązaniaEC 3.8.1. w związkach Chalogen

EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotoweEC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotoweEC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforoweEC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkoweEC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe

Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ rozrywanego wiązania.

EC 4. LiazyEC 4.1. Liazy węgiel-węgiel

EC 4.1.1. karboksy-liazy dekarboksylazyEC 4.1.2. aldehydo-liazy EC 4.1.3. liazy ketokwasów EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy

EC 4.2. Liazy węgiel-tlenEC 4.2.1. hydro-liazy dehydratazyEC 4.2.2. działające na polisacharydy EC 4.2.3. działające na fosforany syntazy EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy

EC 4.3. Liazy węgiel-azotEC 4.3.1. amoniako-liazy EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp.EC 4.3.3. amino-liazy EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy

EC 4.4. Liazy węgiel-siarkaEC 4.5. Liazy węgiel-halogenEC 4.6. Liazy fosfor-tlenIzomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej

reakcji. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają izomeryzacji.

EC 5. Izomerazy

59

EC 5.1. Racemazy i epimerazyEC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne EC 5.1.99. działające na inne związki

EC 5.2. cic-trans izomerazyEC 5.3. wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozyEC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe tautomerazy EC 5.3.3. przenoszące wiązania C=C Δ-izomerazy EC 5.3.4. przenoszące wiązania SSEC 5.3.99. inne wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.4.wewnątrzcząsteczkowe transferazy mutazy EC 5.4.1. transportujące grupy acylowe EC 5.4.2. fosfotransferazy fosfomutazy EC 5.4.3. transportujące grupy aminowe EC 5.4.99. transportujące inne grupy

EC 5.5. wewnątrzcząsteczkowe liazy EC 5.99. inne izomerazy

Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest tworzone. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania powstają w wyniku syntezy.

EC 6. LigazyEC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen

EC 6.1.1. ligazy tworzące aminoacylo-tRNA i spokrewnione związki EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka

EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol syntetazy acylo-CoAEC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak syntetazy amidoweEC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas syntetazy peptydoweEC 6.3.3. cyklo-ligazy EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azotEC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem

EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel EC 6.5. tworzące wiązanie fosforowoestrowe EC 6.6. tworzące wiązanie azot-metal chelatazy

Izoenzymy

Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, KM i odczyn immunologiczny. Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem. Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina się o jego odmianach i podaje odpowiednie odnośniki literaturowe.

2.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów

Zaletą enzymów są łagodne pod względem temperatury, pH i ciśnienia warunki działania, co obniża koszt procesów, w których uczestniczą oraz pozwala na zachowanie w otrzymanych produktach cennych, a nieodpornych na drastyczne warunki obróbki, składników. Ponadto przebieg procesów katalizowanych przez enzymy można łatwo regulować, zmieniając stężenie enzymu bądź temperaturę lub pH środowiska reakcyjnego.

Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą: pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów, aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa była już wcześniej. Optymalne pH

60

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

pH

Akt

ywno

ść w

zglę

dna

[%]

pepsynametaloproteinaza B.subtilis subtilizyna

pH środowiska. Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny, metaloproteinazy z Bacillus subtilis oraz subtilizyny.

Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz

Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), metaloproteinaza w obojętnym (optymalne pH 7,3), a subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym. Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej –COO-), która występuje w przewadze w środowisku alkalicznym.

Należy ponadto zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od 6 do 11, to pozostałe dwie proteinazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu na który działają, choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5).

Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samą reakcję enzymatyczną, z drugiej jednak przyspiesza denaturację enzymu, co wiąże się z jego inaktywacją. Na poniższym rysunku przedstawiono wpływ temperatury na aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej granicznej wielkości (w tym przypadku temperatury 60C), szybkość reakcji katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie jak to się dzieje przy wszystkich reakcjach chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada do wartości zerowych. Większość enzymów drobnoustrojowych najefektywniej działa w granicach 60C. Enzymy roślinne i zwierzęce z reguły już powyżej 40-50C ulegają denaturacji. Znane są enzymy z bakterii termofilnych, wykazujące optimum działania nawet w temperaturach sięgających 90C.

Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w subtilizyny stabilność subtilizyny warunkach rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem.

0

20

40

60

80

100

-20 0 20 40 60 80

Temperatura [oC]

Akt

ywno

ść w

zglę

dna

[%]

Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny

61

0

20

40

60

80

100

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH

Akt

ywno

ść w

zglę

dna

[%]

w buforze

Z dodatkiem 1% CaCl2

Preinkubacja: 45C, 60min

Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania, jakkolwiek nie jest to regułą. Na rysunku 3 przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny. Jej optymalne pH (porównaj rys.1) przekracza 10, jednakże obszar stabilności tego enzymu w warunkach przykładowej reakcji (1% kazeiny, 45 C, 60 min.) zawarty jest w zakresie 6.5-9.5, a w pH zbliżonym do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.

Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1% CaCl2

Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy termostabilne otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na rys.4 pokazano wpływ temperatury na zachowanie się subtilizyny podczas przykładowego procesu hydrolizy kazeiny (1% roztwór substratu w buforze o pH 9).

Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl2

Należy wyraźnie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizyko-chemicznych, w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach reakcji prowadzonej w 60 C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70 C enzym ulega już pełnej inaktywacji. Natomiast w 50C po 60 minutach straty enzymu są stosunkowo niewielkie i wynoszą 36%. Oczywiście, ostatecznego wyboru temperatury dokonuje się po szczegółowej analizie wyników wszystkich badań, uwzględniającej aspekty technologiczne i ekonomiczne procesu. Przy tego typu analizach przydatne jest wyznaczenie produktywności reakcji enzymatycznej w kilku wytypowanych temperaturach (rys.5). Wybór optymalnej temperatury skojarzony jest w tym przypadku z czasem procesu, który może być determinowany innym czynnikiem (np. kosztem energii).

0

20

40

60

80

100

0 15 30 45 60 75 90 105 120

cz as [minuty ]

Akt

ywn

ość

wzg

lęd

na

[%]

20C

40C

60C

60C70C

Preinkubacja: w buforze o pH 9

Z dodatkiem

1%CaCl2

62

Rys. 5 Produktywność subtilizyny w hydrolizie kazeiny

Inhibitory, aktywatory, stabilizatory.Oprócz wymienionych wyżej czynników inaktywujących działanie enzymów, istnieje grupa

substancji zdolnych do wybiórczego hamowania ich aktywności katalitycznej (są to tzw. inhibitory specyficzne). W opracowaniu pominięto szczegóły dotyczące tego działu enzymologii. Należy jednak wiedzieć, że tego typu naturalne inhibitory występują w przyrodzie, co może mieć istotne znaczenie dla aplikacji enzymów w niektórych przypadkach. Przykładem mogą być specyficzne inhibitory proteinaz serynowych (w tym subtilizyny) znalezione m.in. w ziemniakach czy soi, które skutecznie blokują aktywność tej grupy enzymów.

Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu. Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również letalne.Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji : - nieodwracalną - odwracalną.

Inhibicję odwracalną można podzielić na: 1) kompetycyjną2) niekompetycyjnąInhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały ,

nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w miejscu aktywnym lub jego pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą udział reszty Ser i Cys mające , odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH . Przykładem może byćzwiązek diizopropylofluorofosforan (DFP) , składnik gazów bojowych (soman) działający na układ nerwowy, reaguje z resztą Ser w miejscu aktywnym enzymu esterazy acetylocholinowej, nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych.

Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu danego enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem aktywnym. Enzym może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiemajednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie. Przy dużych stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką inhibitora o wiązanie się w miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości Vmax enzymu , ale w obecności inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wratośc

63

Km wzrasta. Przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa. Enzum ten używa bursztyniany jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian, który różni się od bursztynianu posiadniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce aktywne i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat, enzym może wiązać albo inhibitor, albo substrat równocześnie. Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość Vmax . W inhibicji niekompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość Km

nie zmienia się . Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepstatyny na enzym reninę .

Na działanie enzymów wpływ mogą wywierać jony obecne w środowisku reakcyjnym. Jony dwuwartościowych metali, jak magnez, wapń, cynk, mangan lub kobalt w specyficzny sposób aktywują wielu enzymów (t.zn. zwiększa- ją szybkość reakcji przez nie katalizowanej). Aktywatorami mogą być też aniony np. amylaza ślinowa jest aktywowana jonami Cl . Jony metali mogą wykazywać również wpływ stabilizujący na enzym (tzn. podwyższać jego stabilność wobec niekorzystnego wpływu m.in. pH i temperatury). Przy- kładem może być wpływ jonów Ca na subtilizynę. Na rys. 3 i 4 pokazano, że jony te podwyższają termostabilność subtilizyny (z 50 do 60 C) i jej trwałość w alkalicznym środowisku (z pH 9.5 do 10.5). Natomiast jony wielu metali ciężkich (np. Hg, Cu, Pb) są

64

silnymi inhibitorami enzymów (tzn. inaktywują one enzym, tym samym hamując reakcję przebiegającą przy jego udziale). Jest to inhibicja niespecyficzna, której podlegają wszystkie znane enzymy. Istnieje ponadto wiele innych substancji mających zdolność niespecyficznej inaktywacji enzymów (związanej ze zniszczeniem naturalnej struktury białka). Do nich zalicza się mocznik, aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor).

Koncentracja wody. W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Należy

bowiem pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza prze- mian, w których woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Wykazano, że stężenie wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie dwufazowym (z rozpuszczalnikiem apolarnym nasyconym wodą), korzystnie z immobilizowaną formą enzymu itp. Obecnie jest to jeden z najbardziej preferowanych kierunków badawczych, m.in. z uwagi na potencjalnie możliwe do uzyskania efekty (również o charakterze aplikacyjnym w wielu procesach przemysłowych).

Charakterystyka biokatalizatorów przemysłowychTermin "biokatalizatory przemysłowe" (używany obecnie w bardzo szerokim znaczeniu) oznacza

katalizatory otrzymywane w skali przemysłowej na drodze biologicznej. Pod tym pojęciem rozumie się zarówno enzymy: natywne, spreparowane rozmaitymi technikami (np. ich immobilizowane formy), ich mikstury, rozmaite proszki zawierające ich dodatek, jak i komórki: całe lub ich fragmenty, żywe i martwe.

Enzymy wyodrębniane są z tkanek zwierzęcych lub roślinnych oraz wytwarzane przez drobnoustroje. Te pochodzące z dwóch pierwszych wymienionych źródeł występują na rynku stosunkowo w małych ilościach i są względnie drogie. Niektóre z nich: renina, pepsyna, trypsyna, papaina i bromelaina są ekstrahowane ze spożywczych surowców.

Tabela 1 Enzymy produkowane przez mikrobiologiczną fermentację (adaptowane z Trampera, 1994).

Enzym Substrat Mikroorganizm

-amylaza Skrobia Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus licheniformis

-amylaza Skrobia Bacillus polymyxa

Amyloglukozydaza (glukoamylaza)

Dekstryny Aspergillus nigerRhizopus niveus

Celulazy Celuloza Phanerochaete chrysosporiumTrichoderma reesei

Izomeraza glukozowa Glukoza Actinoplanes missouriensisStreptomyces murinusStreptomyces olivochromogenus

Oksydaza glukozowa Glukoza Aspergillus niger-glukozydaza Maltoza Aspergillus niger

Bacillus amyloliquefaciensSaccharomyces cerevisiae

65

Lipazy Lipidy Aspergillus nigerCandida rugosaGeotrichum candidumRhizopus arrhizus

Pektynoesteraza Pektyna Aspergillus nigerAspergillus oryzae

Proteinaza alkaliczna (serynowa)

Białka Aspergillus oryzaeBacillus licheniformisBacillus subtilis

Proteinaza kwaśna (pepsyno-podobna)

Białka Aspergillus oryzaeAspergillus saitoi

Proteinaza kwaśna (renino-podobna)

białka Endothia parasitica Mucor michei Mucor pusillus

Proteinaza obojętna białka

Bacillus stearothermophilus Bacillus subtilis

Pullulanaza

Amylopektyna

Aerobacter aerogenes Bacillus cereus var.mycoides

W wyniku rozwoju biotechnologii, mikroorganizmy stanowią podstawowe źródło enzymów. Zastosowanie mutacji i specjalnych technik selekcji drobnoustrojów pozwoliło osiągnąć wysoki poziom produkowanych przez nie enzymów, w niektórych przypadkach sięgający 10% wszystkich wytwarzanych białek . Ponadto użycie dużych fermentorów (do 300 m ) sprawia, że obecnie w krótkim czasie i przy niskich kosztach produkuje się na skalę przemysłową olbrzymie ilości rozmaitych enzymów (tabela 1).

Niezależnie od źródła pochodzenia enzymy mogą katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie muszą posiadać identycznej budowy chemicznej, a tym samym mogą znacznie różnić się optymalnymi warunkami działania. I tak na przykład α -amylaza katalizuje hydrolizę wiązań ŕ-1,4- między cząsteczkami D-glukozy w polisacharydach, takich jak amyloza. α-amylaza trzustkowa posiada optymalne pH około 7 i optymalną temperaturę 37 C, podczas gdy enzym ten wyodrębniony z Aspergillus oryzae - optymalne pH 4,7 i optymalną temperaturę działania 50 C, a z Bacillus subtilis odpowiednio pH 6,5 i 75 C. W zasadzie te dwa parametry (pH i temperatura) decydują o możliwości zastosowania enzymów w procesach produkcji środków spożywczych przebiegających w różnych warunkach (np. w różnych gałęziach przemysłu spożywczego). Fakt ten tłumaczy występowanie na rynku rozmaitych preparatów homologicznych enzymów. Należy jednak mieć na uwadze, że tylko część drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie bioproduktów (w tym enzymów) traktowana jest jako nieszkodliwa dla stosowania w środkach spożywczych (tabela 2).

W ogólnym zarysie proces produkcji enzymów drobnoustrojowych polega na hodowli wyselekcjonowanych kultur mikroorganizmów na specjalnie opracowanych dla każdej z nich pożywkach, z zachowaniem specyficznych warunków fizycznych środowiska hodowlanego, a w następnym etapie wyodrębnieniu wytworzonego enzymu. Jeśli enzym jest nagromadzany pozakomórkowo, to można go wyodrębnić z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub filtracji. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym proce- durom wydzielania i oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie działają ujemnie na własności katalityczne enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi konieczność poddawania ich skomplikowanym i drogim procesom oczyszcza- nia. W dużej mierze przeznaczenie enzymu decyduje o stopniu czystości jego handlowych preparatów. Ogólnie biorąc, preparaty enzymów wykorzystywane dla celów analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością (niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym). Również enzymy stosowane w farmacji posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego nie wymagają już tak wysokiego stopnia czystości. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet wyjaławiane. Coraz częściej dla konkretnego procesu wytwarza się specjalnie przeznaczony preparat enzymu, dobierając jego aktywność tak, aby dodana ilość wynosiła 0.05-0.5 % na kg substratu.

66

Tabela 1 Mikroorganizmy używane dla produkcji enzymów (adaptowane z Gacesa i Hubble, 1987). Grupa A

Mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności (nie wymagające testowania) Bacillus subtilis (włączając szczepy znane jako mesentericus, natto i

amyloliquefaciens), Aspergillus niger (włączając awamori, foetidus, phoenicis, saitoi i usamii), Asp. oryzae (włączając sojae i effesus) Mucor javanicus Rhizopus arrhizus, oligosporus, oryzae Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis, lactis Leuconostoc oenos

Grupa B

Mikroorganizmy uważane za nieszkodliwe w żywności (enzymy wytwarzane przez nie, testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności) Bacillus stearothermophilus, licheniformis, coagulans, megaterium, circulans, Klebsiella aerogenes

Grupa C

Mikroorganizmy nie włączone do grup A i B (ewentualne stosowanie enzymów produkowanych przez nie w produkcji żywności, wymaga specjalistycznych testów) Mucor miehei, pusillus Endothia parasitica Actinoplanes missouriensis Streptomyces albus, olivaceus Bacillus cereus Trichoderma reesei (T. viride) Penicillium dimorphosporum, simplicissium, funiculosum

Zwykle handlowe preparaty zawierają od 2 do 10% suchej masy czystego enzymu. Reszta to zanieczyszczenia pochodzące z podłoża hodowlanego (np. inne białka wytworzone przez rosnącą kulturę, niektóre z nich będące również enzymami) oraz celowo dodane stabilizatory, wypełniacze itp. Z aplikacyjnego punktu widzenia istotna jest zwłaszcza wiedza na temat enzymów stanowiących zanieczyszczenie handlowych preparatów. Niektóre z nich mogą bowiem katalizować niekorzystne, uboczne reakcje chemiczne. Niekiedy jednak gotowe preparaty celowo są mieszaniną kilku enzymów (np. preparaty typu "Protogal" przeznaczone dla detergentów, a otrzymywane w oparciu o technologię opracowaną w Instytucie Biochemii Technicznej PŁ zawierają w swoim składzie proteinazę, ŕ-amylazę i lipazę- wszystkie trzy przydatne w środkach piorących).

Przeznaczenie preparatu enzymatycznego określa jego postać końcową. Mogą być one otrzymywane w postaci ciekłego koncentratu lub ciała stałe- go, o różnym stopniu oczyszczenia, ewentualnie z dodatkiem stabilizatorów. Preparaty enzymatyczne w stanie stałym charakteryzują się znacznie wyższą stabilnością od preparatów ciekłych. Te drugie podatne są na działanie drobnoustrojów, a ponadto w środowisku wodnym enzym ulega łat- wiej denaturacji i dodatkowo narażony jest na działanie enzymów proteolitycznych, których obecność w gotowych preparatach (choćby w nieznacznych ilościach) jest dość powszechna. Preparaty stałe enzymu nie powinny być pyliste (z uwagi na możliwość wywołania reakcji alergicznych u pracowników), stąd najczęściej wytwarzane są w postaci granulowanej.

Zasadniczym przełomem w biotechnologii było zastosowanie enzymów immobilizowanych. W uogólnieniu, immobilizacją enzymu można nazwać za- biegi umożliwiające wielokrotne jego użycie. Jeden ze sposobów immobilizacji polega na unieruchomieniu enzymu na nośniku. Takie formy enzymów w wielu przypadkach wykazują wyższą stabilność od natywnych enzymów, zarówno w

67

trakcie przechowywania jak i w warunkach samej reakcji bio- chemicznej. Jednakże największa korzyść związana jest z możliwością ich wielokrotnego stosowania, w tym w procesach o charakterze ciągłym (np. w reaktorze o działaniu ciągłym z immobilizowaną izomerazą glukozową produkuje się wysoko fruktozowy syrop). Metody stosowane w immobilizacji enzymów mogą być również wykorzystane w unieruchamianiu komórek zarówno martwych jak i żyjących. Unieruchomione biokatalizatory (enzymy i komórki) są szczególnie obiecujące w zastosowaniu do procesów przetwórstwa żywności. Chemiczne katalizatory nie mogą konkurować z enzymami, chociażby ze względu na przepisy sanitarne obowiązujące w produkcji żywności. Najnowszym kierunkiem badań w tym zakresie jest ko-immobilizacja enzymów, czyli jednoczesne unieruchomienie na wspólnym nośniku dwu lub więcej enzymów przeznaczonych do katalizowania pojedynczego procesu.

Cena preparatów enzymatycznych jest bardzo zróżnicowana (od 3 $/kg w przypadku preparatu glukoamylazy przeznaczonego do scukrzania dekstryn, aż do 1 miliona $/kg w przypadku czynnika VIII enzymów trombolitycznych stosowanych w medycynie). Zależy ona od wiele czynników, w tym tak oczywistych jak koszty produkcji (a głównie stopień oczyszczenia enzymu), ale także w dużej mierze zależy od rynkowego zbytu, konkurencyjności i skuteczności działania (ich produktywności w aplikacyjnych warunkach). Ogólnie biorąc, najdroższe są enzymy przeznaczone dla analityki, a naj-tańsze stosowane masowo w różnych gałęziach przemysłu (tabela 3). Przyjmuje się ponadto, że koszt aplikacyjny enzymów przemysłowych powinien stanowić 2-4 % kosztów całego procesu, co w pewien sposób determinuje ich cenę.

Tabela 2 Wielkość produkcji enzymów i ich cena (adaptowane z Trampera, 1994) Typ aplikacji Wielkość produkcji (tony) Cena ($/kg)

Analityka 10-3 - 1 106 – 109

Farmacja 1 – 102 102 – 105

Specjalna 1 – 102 102 – 105

Przemysł masowy 102 – 104 3 – 50

Potencjał aplikacyjny enzymów tkwi w specyficzności i ich katalitycznej wydajności, przy czym działają one w umiarkowanych warunkach pH, temperatury i ciśnienia zapewniając wysoką wydajność nawet w skomplikowanych reakcjach lub ich ciągach. Jednakże z aplikacyjnego punktu widzenia dla każdego konkretnego procesu i enzymu w nim biorącego udział konieczna jest skojarzona optymalizacja temperatury, pH środowiska reakcyjnego, stężenia reagentów oraz innych parametrów technologicznych. Niepowodzenia napotykane niekiedy w stosowaniu enzymów w krajowych technologiach, o których się nieraz słyszy, wynikać mogą z niepełnej wiedzy o właściwościach samych enzymów, ich preparatów lub procesach, w których biorą udział.

68

ROZDZIAŁ 3. BIOCHEMIA GENÓW

RNA

Nukleotyd

DNA

Nukleozyd

H3PO4H3PO4

ryboza deoksyryboza

zasady purynowei pirymidynowe

C

O

C

CC

OH

H

OH

H

HOH2C

HH

OH

3'

4'

5'

2'

1' C

O

C

CC

OH

H

H

OH

H

HOH2C

HH

3'

4'

5'

2'

1'

D-ryboza D-deoksyryboza

N

N

pirymidyna

N

N

N

N

1

12 2

3

34

4 56

789

H

5

6

puryna

N

N

NH2

OH

cytozyna

N

NO

OH

N

NO

OH

CH3

H H

uracyl tymina

N

N N

N

NH2

H

N

N N

N

OH

H2NH

adenina guanina

69

Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla technologii.

70

71

PISMIENNICTWO Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987.Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990.Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie

PZWL, W-wa 1994Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J.,

Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45Galas E.: Wiadomości chemiczne (1984), 11, 11-30 Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24

72

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)i jego fosforan (NADP)

P P

+N

CONH2

HOOH

CH2O

O

O

OH OH

OH2C

( P )

N

N

N

N

NH2

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

N

N N

NHH3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O P adenozynaP

CEnzym-NH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH

CH2

S

CH2

SO

liponian

ubichinon (Q)

O

O

H3C

H3C CH3

)( n H

N

CH2

CH3CH

HC CH

N

CH3

CH

CH2

N

CH2CH2HOOC

H3C

Fe+3

CH3HOOC CH2 CH2

HC CHN

hemina (porfiryna)

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

CH2SCH2

CH3

CH2

CHNH2

COOH

+

adenozynometionina

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 CNH NH

O

CH

COOH

CH2

CH2

COOHH

H

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)

N

NH3C NH2

CH2N

SCH2

CH3

CH2 O P P

+

difosfotiamina (DPT)

NH3C

CH2OHHO

COH

pirydoksal

HN NH

O

S C

O

NH-Enzym

biotyna

adenozyno-5`-fosforan

koenzym A (CoA-SH)

P P O CH2 C

CH3

CH3

CH

OH

C

O

NH CH2 CH2 SH

Dodatek

SLip<S