Oksygenazy hemowe –nowe funkcje starych...

Biochemia stresu oksydacyjnego

Literatura:Grzegorz Bartosz „Druga twarz tlenu”

Barry Halliwell & John Gutteridge „Free radicals in biology and medicine”

Oksygenazy hemowe – nowe funkcje starych enzymów

Wykład 5

Tlenek węgla

Dulak et al. Circulation 2008

Abraham et al. Pharmacol Rev, 2008

Oksygenazy hemowe

Dulak et al. Circulation 2008

Functions of heme oxygenase

HO-1Fe2+

antioxidant anti-inflammatory

anti-apoptoticpro-angiogeniccytoprotection

ACTIVITYPRODUCT MECHANISM

ferritin synthesis

iron ATP-ase pump

ROSBVR

activation of sGC leadingto cGMP production

p38 MAPK regulation

BILIVERDIN

BILIRUBIN

CO

ROS scavenging

Inhibition of complement

anti-apoptoticanti-proliferative anti-thrombotic

anti-inflammatorypro-angiogeniccytoprotection

antioxidant anti-inflammatory

anti-apoptoticcytoprotection

HEME

others

Degradacja hemu

Grochot-Przeczek et al. Thromb haemost

Bilirubina reaguje z rodnikiem hydroksylowym, tlenem singletowym i anionorodnikiem ponadtlenkowym

Vascular lesion formation at 14 days after a wire-injury of femoralarteries in the wild-type and HO-1-/- mice

(Duckers et al. Nature Med 2001)

WT mice HO-1-/- mice

HO-1 deficiency augments neointima formation in mice

Białka hemowe są wszędzie…

mioglobina

cytochromy, peroksydazy, katalazy, syntazy tlenku azotu, oksydazy NADPH…..

hemoglobina

Mechanisms of blood vessels formation

Carmeliet, Nature 2000

Waskulogeneza

Grochot-Przeczek et al. Thromb haemost

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Mobilizacja EPC ze szpiku

- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka- VEGF: vascular endothelial growth factor- MMP-9: matrix metalloproteinase-9- eNOS: endothelial nitric oxide synthase

SDF-1EPC

EPC


Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji


Regulacja mobilizacji EPC w hipoksji

- W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji eNOS przez kinazy PI3K/Akt,przez co zmniejsza się produkcja NO.

- Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnikaponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO-) izmniejszenia dostępności NO.

- W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływkomórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się doupośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie.

- Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku.

WT db/db

Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC)

WT

db/db

EPC

wt db0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

*

% k

omór

ekPeripheral blood

CD45(-), Sca-1(+), KDR(+)

% o

f ce

lls

Kotlinowski et al. In preparation; Grochot-Przeczek et al. PLoS One 2009

db/db WT

Day 1

Day 3

Day 8

Day 17

Day 0

Wounded skin

Proangiogenne komórki progenitorowe% o

f ce

lls

Num

ber

of

cells

Num

ber

of

connect

ions

Tota

l le

ngth

of

spro

uts

proliferation migration tube formation

control diabetic

Num

ber

of

connect

ions

paracrine angiogenic activity

empty medium

growthy medium

WT db/db

spheroid outgrowthtube formationmigration

control db/dbdb/db

Kotlinowski et al., in preparation

spheroid outgrowth

control control db/db

Odtwarzanie krążenia w mięśniu myszy z cukrzycą

Ebrahimian et al. Am J Pathol 2006

diabetes diabetes + NAC

diabetes + NAC diabetes

NAC - N-acetylocysteina

How to improve EPC function in diabetes?

Abraham et al. Pharmacol Rev, 2008

*

Aktywność oksygenaz hemowych

oksygenaza hemowa

Ferritin

uszkodzenie tkanek

białkahemowe

Fe2+uszkodzenie tkanek

bilirubina ochronabiliwerdyna

CO

ochrona

rozpuszczalna cylaza guanylanowa

cGMPGTP

pompa żelazowa

ochrona

Hem

ochronap38

BvR

Skutki braku HO-1 u myszy

Na istotność HO-1 wskazuję skutki jej braku u myszy: zwiększonaperoksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwójgonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.

- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.

After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.

0

100

200

300

400

HO-1+/+

Enhanced free radicals production by murine HO-1-/- fibroblasts

% F

luore

scene o

f untr

eate

d c

ells

cells treated with 50 µM hemin for 24 h

0

20

40

60

80

100

Reduced survival of murine HO-1-/- fibroblasts

cells treated with 100 µM hemin for 24 h

% S

urv

ival

HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-

*

*

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych

lesion

lesion

lipid accumulations

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 u człowieka

U dwóch znanych pacjentów pozbawionych HO-1:

* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL)we krwi

* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia

Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjnyprowadzą do:

* poważnych uszkodzeń śródbłonka

* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych wtętnicach

Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez aktywację promotora

(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003

VEG

F [

% o

f contr

ol]

0

50

100

150

200

250

300

*

VEGF protein

control b-gal HO-1

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

VEG

F/G

APD

H r

ati

o

*

VEGF mRNA

control b-gal HO-1

Lum

inesc

ence [

% o

f contr

ol]

0

100

200

300

400

b-gal HO-1

*

VEGF promoter activity

pGL2-VEGF

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007

HO-1

CO

cGMP

p38

PKG CREB

PKA

AP-1AP-1

PI3K Akt

VEGF HO-1 cDNA

ββββgal cDNA

VEGF +

VEGF + VEGF + CORM

Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1 jest konieczna do proangiogennego działania SDF-1

Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.

Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC

[PCNA staining]

EPC WT EPC KOVEGF VEGFcontrol control

*

*

0

20

40

60

80

100

Control

% o

f posi

tive c

ells

WT

KO

VEGF30 ng/ml

*

*

Grochot-Przeczek, ARS 2013, Deshane et al. J Exp Med, 2007

WT

KO

WT

KO

0

10

20

30

40

50

num

ber

of

cells

control SDF-1 CM

*

**

control SDF-1 CM

HO-1 ułatwia migrację EPC

Control H2O2 50 uM

Annexin

V p

osi

tive c

ells

[% o

f contr

ol]

*

** #

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900HO-1 +/+

HO-1 -/-

Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny

Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.

Apoptosis[Annexin V staining]

HO-1+/+

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1-/-

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Wpływ braku HO-1 na aktywność EPC

Taha et al. ATVB, 2010

HO-1 efficacy is variable in human population because of (GT)n promoter polymorphism

(GT)n

Exon 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

allele

fre

quency

number of GT repeats

S M L

Promoter polymorphism and HO-1 expression

Taha et al., ATVB 2010.

*

***

0

0.004

0.008

0.012

S M L

0

0.06

0.12

0.18

S M L

**

***

control

H2O2

0

0.2

0.4

0.6

S M L

CoPP

***

0

0.4

0.8

1.2

1.6

S MHem

e o

xygenase

-1 m

RN

A e

xpre

ssio

n (

HO

-1/E

F2)

15d-PGJ2

***

L

H2O2 [uM]

control 100 200 400 800

***

*** *** ***

*******

*

0

20

40

60

80

100

120

MT

T [

% o

f contr

ol]

S M L

*

0

5

10

15

20

25

S M L

GSH

: G

SSG

[nm

ol/

mg]

GSH : GSSG

viability

***

**

0

100

200

300

400Brd

U r

educti

on [

% o

f contr

ol]

S M Lcontrol

Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka

VEGF

Taha et al. ATVB 2010.

[ELISA]

IL-1ββββ

#

#

*

*

0

50

100

150

200

250

S M L

IL-1

β[p

g/m

l]

Allele

#

#

Control

LPS

Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną

Taha et al. ATVB 2010.

cell proliferation

proinflammatory cytokines production

oxidative stress resistance

number of GT repeats

HO-1 expression and activity

Polimorfizm promotora HO-1

Grochot-Przeczek et al. Clinical Science

Częstość (GT)n w populacji

Kaneda et al. ATVB 2002

Chen et al. Eur Heart J 2004

Częstość (GT)n w populacji

Rewaskularyzacja: HO-1 i cukrzyca

d0 d7 d280.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

day after surgery

bloo

d pe

rfus

ion

[isc

hem

ic:n

on-i

sche

mic

]

**

$

d0 d7 d28

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

day after surgery

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

*

**

* *

###

###

Oksygenaza hemowa-1

Skutki indukcji HO-1:

• Cytoprotekcja (oporność na stres oksydacyjny)

• Immunomodulacja(zahamowanie zapalenia, regulacja komórek Treg)

• Modulacja angiogenezy

heme

HGF

inflammatory cytokines

oxidants hypoxia

irradiation

chemo-

therapy

after Otterbein et al. 2003

heme

Berberat et al. Clin Cancer Res 2005

Ekspresja HO-1 w nowotworze trzustki

Nowis et al. Oncogene 2006.

HO-1 jest indukowana przez PDT linii C26 adenocarcinomy

DMBA PMA

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

Red - PCNA Blue - DAPI Green - lectin

Waś et al. Free Radicals Biol Med. 2011


10 20 300

100100

125

150

* * ** * *

***

*** *

Time [weeks]

Weig

ht

incre

ase

[%

] +/++/--/-

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

10 20 300

25

50

75

100

w 4 w 6

w17 w 26 w 27

Time [weeks]

Mic

e w

ith t

um

ors

[%]

+/++/--/-

10 20 300

25

50

75

100

Time [weeks]

Surv

ival [%

]

+/++/--/-



papilloma

carcinoma

papilloma

carcinoma

HO-1 +/+

HO-1 -/+

HO-1 -/-



Was et al. Am J Pathol 2006, Was et al. in preparation

HO-1 overexpression in B16(F10) melanoma cells

mRNA

0

40

80

120

0 25 50 100 200 400 800

% o

f livin

g c

ells

H2O2 [µµµµM]

HO-1

control

β-gal

* **

*

viability

Endothelial cells incubated in conditioned media

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

control

Pro

life

rati

on [

OD

] proliferation*

H2O2

[50 µM]

*

#

Serum Tumor

Was et al. Am J Pathol 2006

Unaczynienie czerniaków B16(F10) i B16(F10)-HO1

0

20

40

60

80

0 1 2 3weeks after injection

num

ber

of m

etas

tase

s WT

HO-1

p=0.054

*

*

HO-1 zwiększa liczbę przerzutów w płucach

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

*

*

Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka

Day of experiment

0

20

40

60

80

10 20 30 40 50

Surv

ival ra

te [

%]

WT

HO-1

100

P=0.017

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka na przeżywalność myszy

HO-1 increases metastatic potential of melanomas

Was et al. in preparation

0

100

200

Mig

rati

on [

% o

f contr

ol]

control

*

HO-1

Migration

0

100

200

Invasi

on [

% o

f contr

ol]

*

control HO-1

Invasion

control HO-1

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

control HO-1

mela

nin

[m

g/1

x106

cells]

melanin content

ROS and melanogenesis

0

10

20

30

40

50

60

control controlNAC

HO-1 HO-1NAC

RLU

/ µµ µµg p

rote

in

*

Effect of HO-1 on ROS production Effect of H2O2 on melanin content

Mela

nin

[m

g/1

06

cells]

0

0.002

0.004

0.006

0.008

control 0.5 5.0

H2O2 [µM]

*

*

Effect of NAC on melanin content

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

control 1.0 5.0

NAC [mM]

Mela

nin

[m

g/1

06

cells]

ctrlNAC-1

NAC-5

*

*

0

20

40

60

80

100

control 1 5

NAC [mM]

Tyr/

EF2

Effect of NAC on tyrosinase expression

*

Was et al. in preparation

HO-1 may promote progression of melanoma throughincreased cell survival and proliferation under oxidativestress, increased angiogenesis, and by formation of lessmature and more invasive cells, what can be associated withreduced production of ROS.

Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012

Effect of HO-1 on viability and proliferation of C2C12 cells

HO

-1/E

F2

*

Tubulin

HO-1

0

3

6

9

12

WT Luc-GFP Luc-GFP-HO1

Luc-GFP Luc-GFP-HO1WT

HO-1DAPI

NCHO-1

Luc-GFP-HO1

*

0

300

600

900

1200

HO

-1 a

cti

vit

y

[% o

f contr

ol]

Luc-GFPWT Luc-GFP-HO1

*

+NAC

*

0

40000

80000

120000

**

Luc-GFP Luc-GFPHO-1

fluore

scence [

AU

]

+NAC

LD

H r

ele

ase

[% o

f contr

ol]

* #

#

0

200

400

600

800

0.5 1.0 2.0

Luc-GFP

Luc-GFP-HO1

H2O2 [mmol/L]

0

40

80

120

PC

NA p

osi

tive c

ells

[%]

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

*

ROS

mortality

proliferation

HO-1 overexpression and survival of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

C2C12-Luc-GFP

day 2

day 11

day 22

C2C12-Luc-GFP-HO1


HO-1 overexpression and survival of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

*

*

0

4000000

8000000

12000000

16000000

20000000

0 2 11 22

tota

l lu

cif

era

se a

cti

vit

y[R

LU

]

Luc-GFP

Luc-GFP-HO1

days after transplantation

Muscles *

0

1000000

2000000

3000000

4000000

Luc-GFP

Lucif

era

se a

cti

vit

y[R

LU

/mg o

f pro

tein

]

Luc-GFP-HO1

Lungs

0

4

8

12

16

20

Luc-GFP

*

Luc-GFP-HO1

Lucif

era

se a

cti

vit

y[R

LU

/mg o

f pro

tein

]


HO-1 overexpression and growth of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

**

0

2

4

6

8

10

GFP-Luc

Num

ber

of

mit

ose

s/fi

eld day 11

day 22

GFP-Luc-HO1

Luc-GFP-HO1

Luc-GFP day 22

day 11 day 22

day 11

mitotic index

PCNA staining

H&E staining


GFP staining

Luc-GFP

HO-1 overexpression and growth of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

negative control

Luc-GFP-HO1


Expression of HO-1, SDF-1, MyoD and myogenin in C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

HO-1 *

0

0.04

0.08

0.12

0.16

0.2

GFP-Luc

HO

-1/E

F2

GFP-Luc-HO1

*

0

0.01

0.02

0.03

0.04

SD

F-1

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

*

0

0.01

0.02

0.03

0.04

MyoD

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO10

0.01

0.02

Myogenin

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

SDF-1

MyoD Myogenin


HO-1 overexpression reduces formation of myotubes by C2C12 cells

Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 10% FBS (control medium)

Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 2% Horse Serum (differentation medium)

C2C12 WT

C2C12 WT

C2C12-Luc-GFP

C2C12-Luc-GFP

C2C12-Luc-GFP-HO1

C2C12-Luc-GFP-HO1


HO-1 inhibits myoblast differentiation

#

0

0.02

0.04

0.06

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Mef2

/EF2

Mef2 #

0

0.01

0.02

0.03

0.04

Myf5

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Myf5

#

0

0.02

0.04

0.06

MyoD

/EF2

*#

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

*

MyoD

*

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

Myf6

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Myf6

#

*#0

0.1

0.2

0.3

Myogenin

/EF2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

myogenin

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

MH

C/E

F2

0.0005 #

* *#

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

MHC

Growthmedium

Differentiationmedium

MyoD myogenin Myf6

Myf5Myf6

CPK, MHCMef2


Effect of HO-1 can be reversed by siRNA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

HO-1 Luc-GFP HO-1 sc HO-1siRNA

mio

geni

na/E

F2

Miogenina

FBS

HS

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

HO-1 Luc-GFP HO-1 sc HO-1siRNA

Myo

D/E

F2

MyoD

FBS

HS


miRNA processing

Viswanathan et al. 2010

Effect of HO-1 on myomirs

0

2

4

6

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

#

* *

miR

-1/U

6

#

* *0

0.002

0.004

0.006

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

miR

-133a/U

6

0

2

4

6

miR

-133b/U

6

#

* *

Luc-GFP Luc-GFP-HO10

10

20

30

miR

-206/U

6

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

#

* *

miR-1 miR-133a

miR-133b miR-206

Growth medium

Differentiation medium


Myoblast differentation is inhibited by HO-1 products

#

##

0

0.02

0.04

0.06

0.08

Luc-GFP CoPP bilirubin biliverdin FeCl3 iCORM CORM

MyoD

/EF2

# #

0

0.04

0.08

0.12

0.16

myogenin

/EF2



#

#

#

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

MH

C/E

F2

Growthmedium

Differentiationmedium

MyoD

myogenin

MHC


HO-1 and muscle differentiation

CO

c/EBPδ

CO


Slajdy dost ępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

Zapraszam na wykład 6

Oksygenazy hemowe –nowe funkcje starych...

Documents

Transcript of Oksygenazy hemowe –nowe funkcje starych...