Artykuł oryginalny/Original research article

Potencjalna przydatność wykrywania krążących komórek raka sterczaw pilotażowej grupie chorych z zaawansowanym rakiem stercza

The potential usefulness of the detection of circulating prostate cancercells in a pilot group of patients with advanced prostate cancer

Karolina Zaleska *Pracownia Radiobiologii, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań, Polska

Otrzymano: 12.03.2014; Zaakceptowano: 17.03.2014Dostępne online: 21.03.2014

Abstract

Prostate cancer is the most common malignancy in developed countries. In recent years, an intense research aimed at finding new markersfor prostate cancer treatment regimen to facilitate the selection and control of its effectiveness. The presence of circulating tumor cellpopulation is postulated as a new prognostic and predictive marker for patients with unresectable prostate cancer. The aim of the study wasto verify the molecular diagnostic method for the evaluation of circulating prostate cancer cells in metastatic patients in clinical stage.© 2014 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.

Słowa kluczowe: rak stercza; komórki krążące; nested PCR

Keywords: Prostate cancer; Circulating cells; Nested PCR

1. Wstęp

Rak stercza jest jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów u mężczyzn w krajach rozwiniętych [1]. 5-letnie przeżyciachorych z rakiem stercza we wczesnym stadium nowotworu wynoszą 88%, jednak w stadium rozsianym jedynie 29% leczonychprzeżywa 5 lat. Najczęściej diagnozowaną lokalizacją zmian przerzutowych nowotworu jest układ kostny [2,3]. Rozwójnowotworu u chorych z rakiem przebiega wieloetapowo, głównie przez rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych drogąnaczyń krwionośnych [4].

W ostatnich latach prowadzone są intensywne badania mające na celu poszukiwanie nowych markerów raka sterczaułatwiających wybór schematu leczenia i kontrolę jego skuteczności. Opracowanie nowych metod monitorowania terapii rakastercza jest szczególnie istotne w przypadku miejscowo zaawansowanego raka stercza, kiedy istnieje znaczne ryzyko wystąpieniaprzerzutów odległych. Kolejną grupą chorych, u których przydatność takich markerów byłaby szczególnie istotna, to chorzy,u których doszło już do wystąpienia pełnoobjawowych klinicznie przerzutów odległych, a u których przewidziane jest leczeniesystemowe. W obu wspomnianych sytuacjach klinicznych poziom PSA w surowicy krwi nie zawsze jest skorelowany z długościączasu do progresji raka stercza (PFS). Ponadto u tych chorych scyntygrafia kości czy inne badania diagnostyczne nie dają pełnejinformacji o prognozowanej drodze progresji nowotworu. Wyniki wielu badań wskazują także na potrzebę poszukiwaniamarkerów molekularnych przydatnych w przedoperacyjnym diagnozowaniu chorych ze zlokalizowanym rakiem stercza [5].

www.elsevier.com/locate/onko

Dostępne online www.sciencedirect.com

ScienceDirect

Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–20

* Adres do korespondencji: Pracownia Radiobiologii, Wielkopolskie Centrum Onkologii, ul. Garbary 15, 61-868 Poznań, Polska. Tel.: +48 618 850 550.Adres email: zaleska.kar@gmail.com

http://dx.doi.org/10.1016/j.onko.2014.03.0031734-0489/© 2014 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.

Komórki krążące nowotworu (circulating tumor cells; CTC) zostały opisane po raz pierwszy już w 1869 roku przezAshwortha, jednak znaczenie CTC w powstawaniu przerzutów nowotworu udowodniono dopiero w ostatnich badaniach.Obecność populacji komórek krążących nowotworu jest sugerowana jako nowy marker prognostyczny i predykcyjnyu chorych z nieoperacyjnym rakiem stercza [6–8]. Najnowsze wyniki badań prowadzonych w wielu ośrodkach na świeciedowodzą, że ilość CTC obecnych w krwi obwodowej chorych może być czynnikiem diagnostycznym, a także może miećznaczenie we wczesnym wykryciu przerzutów [9].

2. Cel

Celem pracy była weryfikacja molekularnej metody diagnostycznej w odniesieniu do oceny krążących komórek rakastercza w grupie chorych w przerzutowym stadium zaawansowania klinicznego.

3. Materiał i metoda

Do analizy włączono 20 chorych z potwierdzonym w badaniu histopatologicznym rakiem gruczołowym stercza, u którychstwierdzono obecność przerzutów odległych. Dominującym miejscem przerzutów był układ kostny. Wszyscy chorzyzakwalifikowani do badania wyrazili zgodę na udział w badaniu. W tabelach I i II przedstawiono charakterystykę badanejgrupy.

4. Metodyka

W planowanym badaniu komórki krążące raka stercza były identyfikowane w oparciu o amplifikację dwóch genów: PSA iPSMA, a także dodatkowo PSCA, metodą nested PCR (gniazdowy PCR) [10–13]. PSMA jest tkankowo-specyficznymantygenem opisanym w linii komórkowej ludzkiego raka prostaty LNCaP. Komórki tej linii wykazują także ekspresję PSA,dlatego RNA izolowane z linii LNCaP stanowiło kontrolę pozytywną, jako kontrola negatywna zastosowane zostało RNAizolowane z krwi obwodowej zdrowych kobiet.

4.1. Izolacja RNA

Próbki krwi obwodowej pobierane były od chorych w dniu włączenia do badania. Krew obwodową pobierano w systemiezamkniętym do probówek z Na2EDTA jako antykoagulantem, zgodnie ze standardową procedurą. Krew obwodowa byłainkubowana z buforem do lizy erytrocytów, zgodnie z protokołem opisanym wcześniej [14]. RNA izolowano w dniu pobrania,zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta (TRI Reagent BD, Sigma Aldrich) [15]. Do 0,2 ml krwi obwodowej

Tabela ICharakterystyka chorych z zaawansowanym rakiem stercza – analiza 20 pacjentów

Table ICharacteristics of patients with advanced prostate cancer – an analysis of 20 patients

Wiek 58–84 lat średnia 69 lat

Stopień złośliwości nowotworu Gleason Ilość pacjentów [%]<7 2 107 7 35>7 11 55

Paliatywna RT Ilość pacjentów [%]Tak 13 65Nie 7 35

Paliatywna CT Ilość pacjentów [%]Tak 5 25Nie 15 75

Stosowanie leków przeciwbólowych Ilość pacjentów [%]Tak 12 60Nie 8 40

K. Zaleska / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–2016

Przerzut: Ilość pacjentów [%]Jednoogniskowy 11 55Wieloogniskowy 9 45

Radykalna prostatektomia Ilość pacjentów [%]Tak 2 10Nie 18 90

dodano 0,75 ml TRI Reagent BD (suplementowanego 20 ml 5N kwasu octowego na każde 0,2 ml). Próbki mieszano, a następniedodawano chloroform (0,2 ml) i wytrząsano na worteksie przez 15 s. Następnie wirowano (15 min, 12 000 x g i 2–88C) i zbieranofazę wodną zawierającą RNA. RNA wytrącano 2-propanolem i przemyto 75% alkoholem etylowym. RNA rozpuszczanow 50 ml wody wolnej od RNaz (DEPC Water, Sigma Aldrich). Ilość i jakość RNA będzie oceniania spektrofotometrycznie przydługości fali l = 260 i l = 280 nm; dodatkowo analiza jakościowa zostanie przeprowadzona za pomocą elektroforezy w żeluagarozowym (Sigma Aldrich).

4.2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR

2 mg całkowitego RNA wyizolowanego z komórek krwi obwodowej pacjentów zostało przepisane na cDNA w reakcjiodwrotnej transkrypcji (SuperScript III, Life Technologies) z wykorzystaniem starterów oligodT, zgodnie z zaleceniemproducenta. Całkowita objętość reakcji wyniosła 25 ml. 5 ml otrzymanego cDNA posłużyło jako matryca do pierwszej reakcjiPCR.

4.3. Reakcja PCR

Mieszanina PCR zawierała 1,0 mM chlorku magnezu, 200 mM trifosforanów deoksyrybonukleotydów, 25 ng każdego zestarterów i 0,6 jednostek polimerazy aTaq (Promega). Mieszaninę inkubowano przez 25 cykli temperaturowych: 948C przez30 s, następnie 668C przez 60 s i 728C, przez 60 s. Do drugiej reakcji PCR (nested PCR) wzięto 2 ml produktu pierwszej reakcjii stosowano taki sam skład mieszaniny reakcyjnej. Startery stosowane w reakcji nested PCR były komplementarne dosekwencji otrzymanej w pierwszej reakcji (Tab. III). Wyniki przedstawiono na rycinie 1.

5. Wniosek

Metoda jest za mało czuła. Należałoby zastosować inne metody detekcyjne, np. poprzez analizę immunologiczne lubanalizę mRNA.

6. Omówienie

Wykazano, że obecność CTC u chorych poddanych radykalnej prostatektomii oraz u chorych z zaawansowanym rakiemstercza jest związana z gorszą prognozą [16,17]. W 2003 roku opublikowano wyniki prospektywnego badania klinicznego

Tabela IICharakterystyka chorych z zaawansowanym rakiem stercza – analiza 20 pacjentów cd

Table IICharacteristics of patients with advanced prostate cancer – an analysis of 20 patients (continued)

Nrpacjenta

Czas od rozpoznaniachoroby do badania CTC

Czas od rozpoczęcia stosowaniahormonoterapii do badania CTC

Czas od daty wystąpienia przerzutudo badania CTC

T-PSA w dniurozpoznania[ng/ml]

OstatniebadanieT-PSA [ng/ml]

Czas Średnia: Czas Średnia: Czas Średnia:

1. 108 miesięcy 34 miesiące 108 miesięcy 24 miesięce 15 dni 6,5 miesiąca 7,6 160,42. 3 miesiące 1 miesiąc 4 miesiące 400 808,23. 16 miesięcy 12 miesięcy 11 miesięcy 500 486,14. 19 miesięcy 19 miesięcy 1 miesiąc 413 285,25. 10 miesięcy 12 miesięcy 2 dni 195,2 51,66. 96 miesięcy 48 miesięcy 8 miesięcy 8,7 6587. 38 miesięcy 24 miesiące 24 miesiące 7,44 0,0038. 3 miesiące 36 miesięcy w tym samym dniu 222,8 0,0859. 1 miesiąc 1 miesiąc 5 dni 2101 60010. 30 miesięcy 30 miesięcy 6 miesięcy 41,7 54,1311. 4 miesiące HT w dniu badania 2 miesiące 40,29 40,2912. 9 miesięcy 7 miesięcy 1 miesiąc 150 186113. 120 miesięcy 60 miesięcy 10 miesięcy 23,53 425,214. 6 miesięcy 5 miesięcy 6 miesięcy 22,14 0,10615. 36 miesięcy 36 miesięcy 30 miesięcy 15,35 722,416. 48 miesięcy 48 miesięcy 3 miesiące 12 337,517. 4 miesiące 2 miesiące 1 miesiąc 94,01 0,6518. 18 miesięcy 18 miesięcy 16 miesięcy 51,8 215,8619. 1 miesiąc 2 miesiące 7 dni Powyżej 100 792,720. 12 miesięcy 13 miesięcy 9 miesięcy 536 10,63

K. Zaleska / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–20 17

pokazujące, że mediana przeżycia chorych, u których obserwowano obecność CTC we krwi obwodowej, wynosiła 11 miesięcy.Mediana przeżycia w grupie chorych bez CTC była blisko dwukrotnie dłuższa (21 miesięcy) [18]. Istnieje wiele doniesieńopisujących różne strategie wykrywania i charakterystyki komórek krążących raka prostaty we krwi obwodowej i w szpikukostnym chorych [19–24]. Uważa się, że najbardziej czułą metodą identyfikacji CTC jest reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR( polymerase chain reaction) polegająca na amplifikacji genu PSA i PSMA [18,25–28]. Wykazano, że za pomocą reakcjiPCR można zidentyfikować obecność jednej komórki krążącej nowotworu na 1–10 milionów komórek prawidłowych. ReakcjaPCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR) stosowana jest do pomiaru ilościowego kopiigenu, transgenu czy genomów wirusowych i bakteryjnych lub poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach. Ilośćkopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowana w każdym cyklu reakcji amplifikacji. Liczba cykli reakcji PCR,po których poziom fluorescencji przekroczy zdefiniowany próg, jest stosowana do obliczenia ilości badanych cząsteczekobecnych w mieszaninie na początku reakcji (wg danych z krzywej standardowej).

Ze względu na konieczność wdrożenia badania poziomu ekspresji genów związanych z CTC w różnych ośrodkach,z których część nie dysponuje specjalistycznym sprzętem do reakcji PCR w czasie rzeczywistym, podjęto próbę analizy tychgenów ogólnodostępną, tanią metodą nested PCR.

Tabela IIIStartery zaprojektowane do reakcji PCR i nested PCR [Zhang i wsp., 2008]

Table IIIPrimers for PCR and nested PCR [Zhang et al., 2008]

Nazwa genu Typ starteru Sekwencja

PSA Forward external ACATCCTTCGATGGAACCTGPSA Reverse external TGCGACTGCGACTGCTATACPSA Forward nested TTGTTTGCCATTCATCTGTCAPSA Reverse nested AATCGAAACCCCTGACCACTPSMA Forward external TCCGACCCTGCTGACTACTTPSMA Reverse external TCTGGTTCCACTGCTCCTCTPSMA Forward nested TTGGAATCTTCCTGGAGGTGPSMA Reverse nested TGCTATCTGGTGGTGCTGAGPSCA Forward external ACTGCGTGGATGACTCACAGPSCA Reverse external CCAAACCTGGCTCAATTCATPSCA Forward nested GTGACACCGACTTGTGCAACPSCA Reverse nested GGGTTAAGGGTGGAAAATGCB-ACTIN Forward GATCATTGCTCCTCCTGAGCB-ACTIN Reverse CACCTTCACCGTTCCAGTTT

K. Zaleska / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–2018

Ryc. 1. Wynik reakcji nested PCR wybranych 10 chorych. Wynik reakcji analizowano w żelu agarozowym 1%; od lewej: marker wielkości, ctr+ – kontrolapozytywna, tj. cDNA otrzymane z komórek linii raka prostaty LNCaP, ctr- – kontrola negatywna, tj. cDNA otrzymane od zdrowej ochotniczki, 1–10 –cDNA od chorych z przerzutowym rakiem stercza

Fig. 1. The result of nested PCR reactions selected 10 patients. Result of the reaction was analyzed in 1% agarose gel; from the left: size marker, ctr+ – positivecontrol, i.e. cDNA derived from prostate cancer cell line LNCaP, ctr– – negative control, i.e. cDNA obtained from healthy volunteers, 1–10 – cDNA frompatients with metastatic prostate cancer

Konflikt interesu/Conflict of interest

Nie występuje.

Finansowanie/Financial support

Nie występuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymiwymaganiami dla czasopism biomedycznych.

Piśmiennictwo/References

[1] P. Milecki, T. Piotrowski, M. Dymnicka, The comparison of radiotherapy techniques for treatment of the prostate cancer: the three-field vs. the four-field,Neoplasma 51 (1) (2004) 64–69.

[2] M. Baczyk, P. Milecki, M. Pisarek, P. Gut, A. Antczak, M. Hrab, A prospective randomized trial: a comparison of the analgesic effect and toxicity of153Sm radioisotope treatment in monotherapy and combined therapy including local external beam radiotherapy (EBRT) among metastatic castrateresistance prostate cancer (mCRPC) patients with painful bone metastases, Neoplasma 60 (3) (2013) 328–333.

[3] P. Milecki, M. Baczyk, J. Skowronek, A. Antczak, Z. Kwias, P. Martenka, Benefit of whole pelvic radiotherapy combined with neoadjuvant androgendeprivation for the high-risk prostate cancer, J Biomed Biotechnol. 2009 (2009) 625394.

[4] K. Jocob, C. Sollier, N. Jabado, Circulating tumor cells: detection, molecular profiling and future prospects, Exp. Rev. Proteomics 4 (2007) 741–756.[5] J.G. Moreno, C.M. Croce, R. Fischer, M. Monne, P. Vihko, S.G. Mulholland, L.G. Gomella, Detection of hematogenous micrometastasis in patients

with prostate cancer, Cancer Res 52 (1992) 6110–6112.[6] T.G. Hernández, A. Vicedo González, J. Pastor Peidro, J.V. Roselló Ferrando, L. Brualla González, D. Granero Cabañero, et al., Radiobiological

comparison of two radiotherapy treatment techniques for high-risk prostate cancer, Rep Pract Oncol Radiother 18 (5) (2013) 265–271.[7] P. Helo, A.M. Cronin, D.C. Danila, S. Wenske, R. Gonzalez-Espinoza, A. Anand, et al., Circulating prostate tumor cells detected by reverse

transcription-PCR in men with localized or castration-refractory prostate cancer: concordance with CellSearch assay and association with bonemetastases and with survival, Clin Chem. 55 (4) (2009) 765–773.

[8] O.B. Goodman, J.M. Fink, J.T. Symanowski, B. Wong, B. Grobaski, D. Pomerantz, et al., Circulating Tumor Cells in Patients with Castration-Resistant Prostate Cancer Baseline Values and Correlation with Prognostic Factors, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 18 (6) (2009) 1904–1913.

[9] R.D. Loberg, Y. Fridman, B.A. Pienta, E. Keller, L.K. McCauleyz, R.S. Taichmanz, K.J. Pienta, Detection and Isolation of Circulating Tumor Cells inUrologic Cancers: A Review Neoplasia 6 (2004) 302–309.

[10] S. Lintula, S. Vesalainen, A. Rannikko, W.M. Zhang, P. Finne, J. Stenman, U.H. Stenman, Quantification of prostate specific antigen mRNA levels incirculation after prostatic surgery and endocrine treatment by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, Scand J Clin Lab Invest 64(2004) 93–100.

[11] M.R. Cardillo, F. Di Silverio, V. Gentile, Reliability of PSA circulating cells as markers of metastatic prostate cancer, Scand J Clin Lab Invest 64 (2004)687–689.

[12] M.R. Cardillo, V. Gentile, F. Di Silverio, Correspondence re: Ghosh A and Heston WDW. Tumor target prostate specific membrane antigen (PSMA)and its regulation in prostate cancer, J Cell Biochem 91 (2004) 528–539, J Cell Biochem 2004;93:641–3.

[13] A. Ghosh, W.D. Heston, Tumor target prostate specific membrane antigen (PSMA) and its regulation in prostate cancer, J Cell Biochem 91 (2004)528–539.

[14] L. Zhang, Wang Ch-Y, R. Yang, J. Shi, R. Fu, L. Chen, et al., Real-time quantitative RT-PCR assay of prostate-specific antigen and prostate-specificmembrane antigen in peripheral blood for detection of prostate cancer micrometastasis, Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations 26(2008) 634–640.

[15] P. Chomczynski, N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal. Biochem 162(1987) 156–159.

[16] C.A. Olsson, G.M. De Vries, M.C. Benson, A. Raffo, R. Buttyan, C. Cama, et al., The use of RT-PCR for prostate-specific antigen assay to predictpotential surgical failures before radical prostatectomy: molecular staging of prostate cancer, Br J Urol 77 (1996) 411–417.

[17] P.W. Kantoff, S. Halabi, D.A. Farmer, D.F. Hayes, N.A. Vogelzang, E.J. Small, Prognostic significance of reverse transcriptase polymerase chainreaction for prostate-specific antigen in men with hormone-refractory prostate cancer, J Clin Oncol 19 (2001) 3025–3028.

[18] S. Halabi, E.J. Small, D.F. Hayes, N.J. Vogelzang, P.W. Kantoff, Prognostic significance of reverse transcriptase polymerase chain reaction for prostate-specific antigen in metastatic prostate cancer: a nested study within CALGB 9583, J Clin Oncol 21 (2003) 490–495.

[19] E. Corey, E.W. Arfman, M.M. Oswin, S.W. Melchior, D.J. Tindall, C.Y. Young, et al., Detection of circulating prostate cells by reverse transcriptase –polymerase chain reaction of human glandular kallikrein (hK2) and prostate-specific antigen (PSA) messages, Urology 50 (1997) 184–188.

[20] P.O. Ts'o, J. Pannek, Z.P. Wang, S.A. Lesko, G.S. Bova, A.W. Partin, Detection of intact prostate cancer cells in the blood of men with prostate cancer,Urology 49 (1997) 881–885.

[21] D.P. Wood, M. Banerjee Jr., Presence of circulating prostate cells in the bone marrow of patients undergoing radical prostatectomy is predictive ofdisease-free survival, J Clin Oncol 15 (1997) 3451–3457.

[22] P. Berteau, F. Dumas, J.L. Gala, P. Eschwege, B. Lacour, M. Philippe, S. Loric, Molecular detection of circulating prostate cells in cancer: II.Comparison of prostate epithelial cells isolation procedures, Clin Chem 44 (1998) 1750–1753.

[23] Y.Z. Grasso, M.K. Gupta, H.S. Levin, C.D. Zippe, E.A. Klein, Combined nested RT-PCR assay for prostate-specific antigen and prostate-specificmembrane antigen in prostate cancer patients: correlation with pathological stage, Cancer Res 58 (1998) 1456–1459.

K. Zaleska / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–20 19

[24] B. Tombal, P.J. Van Cangh, S. Loric, J.L. Gala, Prognostic value of circulating prostate cells in patients with a rising PSA after radical prostatectomy,Prostate 56 (3) (2003) 163–170.

[25] R.A. Badwe, J.S. Vaidya, Haematogenous dissemination of prostate epithelial cells during surgery, Lancet 347 (1996) 325–326.[26] R. Millon, D. Jacqmin, D. Muller, J. Guillot, M. Eber, J. Abecassis, Detection of prostate-specific antigen- or prostate-specific membrane antigen-

positive circulating cells in prostatic cancer patients: clinical implications, Eur Urol 36 (1999) 278–285.[27] N. Hara, T. Kasahara, T. Kawasaki, V. Bilim, Y. Tomita, K. Obara, K. Takahashi, Frequency of PSA-mRNA – bearing cells in the peripheral blood of

patients after prostate biopsy, Br J Cancer 85 (2001) 557–562.[28] T. Deguchi, H. Ehara, Y. Takahashi, Detection of PSA mRNA and PSMA mRNA by RT-PCR, Nippon Rinsho 60 (Suppl 11) (2002) 151–155.

K. Zaleska / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 11 (2014) 15–2020