Biomedycyna i zagadnienia

pokrewne. Tom 1

Biomedycyna i zagadnienia

pokrewne. Tom 1

Redakcja:

Alicja Danielewska

Barbara Wrzyszcz

Lublin 2019

Wydawnictwo Naukowe TYGIEL składa serdecznie podziękowania

dla zespołu Recenzentów za zaangażowanie w dokonane recenzje

oraz merytoryczne wskazówki dla Autorów.

Recenzentami niniejszej monografii byli:

prof. dr hab. n. farm. Jolanta Rzymowska

dr n. med. Agnieszka Bartoszek

dr n. med. Jacek Putz

dr n. farm. Anna Serefko

dr n. med. Dorota Żołnierczuk-Kieliszek

dr Agnieszka Malik

dr Monika Osińska-Jaroszuk

dr Anna Stolecka-Warzecha

dr n. farm. Sylwia Zielińska

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie:

Monika Maciąg

Projekt okładki:

Marcin Szklarczyk

© Copyright by Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o.o.

ISBN 978-83-65932-69-3

Wydawca:

Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o.o.

ul. Głowackiego 35/341, 20-060 Lublin

www.wydawnictwo-tygiel.pl

Spis treści

Michał Wrzecionek, Michał Więcław, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

Nić pajęcza jako biomateriał ..................................................................................................... 7

Renata Wawrzaszek

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej ............................................................................. 17

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach ................... 25

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR) do

oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników

w tetrakainie ............................................................................................................................. 37

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis do badania oddziaływania piracetamu z wolnym

rodnikiem DPPH ..................................................................................................................... 51

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

.................................................................................................................................................. 66

Katarzyna Karolewska, Katarzyna Paraszkiewicz, Beata Sadowska

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B.

subtilis może służyć jako środek do dezynfekcji? ................................................................. 80

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe ................................................................. 90

Sylwia Borkusewicz, Dominika Chrząszcz, Aleksandra Horbowicz, Marta Fiołka

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic ......................................................... 102

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych po promieniowaniu UV

................................................................................................................................................ 111

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym, nieapoptotyczna śmierć

w komórkach prawidłowych i nowotworowych ................................................................. 121

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących .......................................... 137

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-

Szkodny

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej na poziomie międzynarodowym,

europejskim, krajowym i lokalnym ..................................................................................... 147

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana ................................ 158

Jakub Kufel, Jakub Kret, Patrycja Kozik, Maciej Szydziak

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach ........................................ 172

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej

w aspekcie prewencji wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób

zwyrodnieniowych stawów .................................................................................................. 182

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych

z białek grochu ...................................................................................................................... 196

Indeks Autorów ..................................................................................................................... 207

7

Michał Wrzecionek1, Michał Więcław

2, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

3

Nić pajęcza jako biomateriał

1. Wprowadzenie

Przez miliony lat ewolucji niektóre owady nabyły zdolność wytwarzania polimerów o ciekawych właściwościach mechanicznych [1]. Niektóre z nich przewyższają materiały syntetyczne pod kątem elastyczności, czy wytrzymałości. Jednym z takich materiałów jest pajęczyna zbudowana ze specyficznego białka (spindroiny). Nić pajęcza wytrzymałością dorównuje stali, zaś elastycznością kauczukowi [2, 3].

Ludzkość używała pajęczyny jako materiału na długo zanim pojawiła się w centrum badań. W starożytnej Grecji służyła do plombowania krwawiących ran, a w Australii używano pajęczych nici lub całych sieci pajęczych do łowienia ryb [4]. Leczenie ran za pomocą pajęczyny znane było również na terytorium Polski. Henryk Sienkiewicz w swojej powieści „Potop” opisuje wykonywanie opatrunków z chleba i pajęczyny. Serycyna – jeden z budulców pajęczyny – posiada właściwości przeciwbakteryjne [5], dlatego opatrunek pozwalał uniknąć zakażenia.

Różnorodność zastosowań nici pajęczej wynika częściowo z jej wyjątkowo dużej stabilności mechanicznej, biokompatybilności, gładkości i cienkości w porównaniu z innymi dostępnymi materiałami [6]. Ze względu na powyższe właściwości pajęczyna wydaje się być ciekawym materiałem dla inżynierii tkankowej. Biorąc pod uwagę duże zapotrzebowanie na tego typu materiału naukowcy próbują wytworzyć białko pajęczyny w procesach biotechnologicznych z wykorzystaniem modyfikowanych genetycznie organizmów. Pajęczyna może zostać przetworzona w postać filmu, materiału o dużej porowatości, hydrożelu, oraz włókna. W jednej z tych postaci – materiał o dużej porowatości – może zostać zastosowana jako rusztowanie komórkowe w inżynierii tkankowej następujących tkanek: kostnej, chrzęstnej, skórnej. Duża wytrzymałość i elastyczność sprawia, że materiały z nici pajęczej o przekroju walca (postać rurki) mogą być z powodzeniem stosowane jako fragmenty naczyń krwionośnych. Niniejsza praca ma charakter przeglądowy, jej celem jest zebranie i omówienie dotychczas poznanej wiedzy dotyczącej nici pajęczych.

2. Pajęczyna

Do tej pory scharakteryzowano wiele rodzajów pajęczyny, w tym nić z kokonu jedwabnika, Bombyx mori (jedwabnik morowy) i nić z sieci pająków rodziny Nephila (Rys. 1). Jedwab zawiera dwa białka strukturalne spidroinę i serycynę. W skład pajęczyny wchodzi ciężki łańcuch spidroiny (350 kDa), lekki łańcuch (25 kDa), oraz rodzina białek serycyny, która pełni rolę kleju/spoiny. Serycyny są hydrofilowe i łatwo usuwane z nici poprzez gotowanie w wodzie [7].

1 michal.wrzecionek@lpt.ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny,

Politechnika Warszawska 2 mwieclaw3008@gmail.com, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika

Warszawska 3 agadomska@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika

Warszawska

Michał Wrzecionek, Michał Więcła, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

8

Rysunek 1 Organizmy wytwarzające nici A-Bombyx mori (larwa), B-Nephila pilipes [8, 9]

2.1. Struktura pajęczyny

Białka pajęczyny składają się z powtórzeń sekwencji aminokwasów, które

samoorganizują się w strukturę β-kartki, stabilizowaną przez wiązania wodorowe.

Podczas tworzenia tych wiązań powstają trwałe oddziaływań międzycząsteczkowe

łańcuchów białkowych. Struktury β-kartek dalej organizują się w miękkie micele

w sposób, w którym hydrofilowe końce umieszczone są na obwodzie. Wnętrza

struktury zawierają wodę (Rys. 2, niebieskie obszary) ze względu na obecność małych

„elementów dystansowych”, które są bardziej hydrofilowe niż dominujące domeny

hydrofobowe (spidroina). Na tym etapie nie tworzą się struktury wielowarstwowe.

Powstają one w wyniku zwiększenia stężenia spidroiny. Ze względu na niższą

zawartość wody dochodzi do podziału hydrofilowych zakończeń łańcucha na

powierzchnię miceli oraz zmian położenia wewnątrz dużych dominujących domen

hydrofobowych wraz z hydrofilowymi elementami dystansującymi. Systematycznie

zmniejsza się zawartość wody w strukturze. Dalsze oddziaływania hydrofobowe jaki

i obecność serycyny sprzyjają tworzeniu się globul. Ze wzrostem stężenia białka

micele przekształcają się w formy żelopodobne prowadząc do metastabilnych struktur

ciekłokrystalicznych. Inicjatory, takie jak fizyczne ścinanie, lub czynniki środowis-

kowe, np.: niskie pH, metanol, ultradźwięki i pola elektryczne, przekształcają stan żelu

wraz z fazą ciekłokrystaliczną w bardziej stabilną strukturę włókienkową [7, 10].

Proces ten został przedstawiony na Rysunku 2.

Rysunek 2 Proces powstawania włókna nici pajęczej [7]

A B

Nić pajęcza jako biomateriał

9

Przedstawiony powyżej proces zachodzi w wyspecjalizowanych gruczołach osobników zdolnych do wytwarzania nici. Struktura pajęczyny jest bardzo skomplikowana i różni się w obrębie różnych gatunków sekwencją budujących ją aminokwasów [11]. Warto zauważyć, że jeden osobnik jest w sanie wytwarzać różne typy nici różniące się strukturą, a więc i właściwościami mechanicznymi. Jest to podyktowane pełnieniem wielu funkcji nici pajęczej w naturalnym środowisku. W uproszczony sposób strukturę białek budujących nici przedstawiono na Rysunku 3.

motywy

białka (A)4-13 (GA)4-6 GGX GPGXX Spacer Termi

MaSP1

MaSP2

MiSP

Flag

ADF3

ADF4

rola w strukturze pajęczyny

krystaliczność amorficzność elastyczność dystans pamięć montaż

Rysunek 3 Hierarchiczna konfiguracja białek nici pajęczej, X-zmienny aminokwas [12]

2.2. Typy nici pajęczej

Dotąd poznano 7 typów nici pajęczej [6]. Pająki wytwarzają nić dzięki wyspecja-lizowanym gruczołom-kądziołkom przędnym (Rys. 4). Gruczoły znajdują się na spodniej części końca odwłoka, dzięki temu pająki podczas „przędzenia” mogą ukierunkować włókna za pomocom odnóży.

Rysunek 4 Obraz SEM kądziołków przędnych wraz z wydobywającą się nicią pajęczą, pasek skali 50µm [3]

Michał Wrzecionek, Michał Więcła, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

10

Typy nici są związane z ich zastosowaniem przez pająki. Różnią się strukturą,

właściwościami mechanicznymi oraz sposobem wytwarzania przez różne gruczoły.

Podział nici nie jest jednoznaczny i prosty. W wielu pracach naukowych można

znaleźć pewne rozbieżności i nieścisłości. Prawdopodobnie spowodowane jest to słaby

poznaniem budowy nici, nawet w obrębie jednego gatunku pająka. Dużym problem

badawczym jest także wykorzystanie przez organizmy kilku typów nici na raz.

Niepowtarzalny skład mieszaniny znacznie utrudnia charakteryzację materiału.

Na podstawie dostępnych prac anglojęzycznych [6, 11-13] w niniejszej pracy

podjęto próbę nazwania i wskazania typów nici pajęczej w języku polskim. Należy

zaznaczyć, że często nazwa typu nici wynika z nazwy gruczołu wydzielającego ten typ.

Nie jest to poprawne, ponieważ we wszystkich pracach wspomina się o 6 gruczołach

oraz 7 typach nici [11, 13]. Z tego powodu w niniejszej pracy dokonano próby

podziału ze względu na funkcje jaką pełnią nici w środowisku naturalnym. Ciekawym

jest fakt wytwarzania tylko jednego typu nici przez jedwabniki [14]. Z tego powodu

znacznie więcej prac poświęconych jest nie pająkom, a właśnie jedwabnikom.

Wyróżnia się następujące typy nici pajęczej ze względu na pełniące funkcje:

1. nośna – utrzymuje strukturę sieci, oraz wykorzystywana jest do transportu przez

pająka (opuszczanie się z wysokości, asekuracja przy skokach;

2. pomocnicza – buduje strukturę sieci;

3. łowna – buduje spiralę łowną na sieci, jej lepkość utrzymuje ofiarę w sieci;

4. mocująca – przytwierdza sieć do podłoża;

5. kokonowa miękka – wewnętrzna nić kokonu chroniąca jaja, wykorzystywana

również do obwijania ofiary;

6. kokonowa twarda – zewnętrzna nić izolująca kokon od środowiska zewnętrznego;

7. lepka – rodzaj lepkiej pajęczyny wykorzystywany do zbierania kropel wody na

sieci, co umożliwia pająkom uzupełnianie płynów.

Schematy poszczególnych typów nici przedstawiono na Rysunku 5.

Rysunek 5 Typy nici pajęczej, 1 – nośna, 2 – pomocnicza, 3 – łowna, 4 – mocująca, 5 – kokonowa miękka,

6 – kokonowa twarda, 7 – powłoka lepka [12]

Nić pajęcza jako biomateriał

11

2.3. Właściwości nici pajęczej

Jak już wspomniano wcześniej właściwości nici różnią się w zależności od jej typu. Różnice obserwuje się również w obrębie gatunków pająków [15]. Ciężko jest więc mówić o konkretnych właściwościach fizykochemicznych bez wyróżnienia gatunku i typu nici. Jeszcze inne właściwości mogą mieć nici zbudowane z syntetycznej spindroiny. Zdarza się, że naukowcy często chwalą się zbliżonymi do naturalnych właściwościami swoich syntetycznych odpowiedników [16]. W Tabeli 1 przedsta-wiono wartości Modułu Young’a oraz wytrzymałości nici nośnej różnych gatunków organizmów.

Tabela 1. Właściwości mechaniczne nici nośnej różnych gatunków pająków

gatunek Moduł Young’a (GPa)

wytrzymałość (MJ/m3)

Nephila clavipes 7,38-22 80-111,2

Araneus diadematus 4,0-10 131-160

Argiopetri fasciata 6,9-11 90-116,3

Latrodectus hesperus 6-10,2 180,9

Leucauge vnusta 10,6 151

Plectreurys tristis 16,1 112,1

Kukulcania hibernalis 22,2 132,2

Źródło: [15]

Można łatwo zauważyć, że wartości Modułu Young’a i wytrzymałości mogą różnić się nawet w obrębie jednego gatunku (wartości podane w zakresach, Tab. 1). Jak wiadomo polimery naturalne cechują się wysoką powtarzalnością i często polidysper-syjnością równą jedności. Czy w przypadku pająków miałby być inaczej? Sam polimer z pewnością jest powtarzalny, a obserwowane rozbieżności mogą wynikać z używania przez pająki kilku typów sieci na raz. Takie mieszaniny sprawiają, że trudno jest wyizolować tylko jeden typ o pożądanych właściwościach. Z tego powodu coraz częściej bada się nici produkowane przez zmodyfikowane organizmy. Odpowiednie modyfikacje genów pozwalają na uzyskiwanie tylko jednego typu sieci, podobnie jak w przypadku jedwabników. Prezentowane gatunki (Tab. 1) nie zostały wybrane przypadkowo. Najmocniejszą nicią jest nić nośna z tego powodu badane są gatunki, które przędą duże sieci łowne, a nie te które budują naziemne gniazda (np. ptaszniki).

Aby jak najlepiej odzwierciedlić właściwości pajęczyny porównano ją do innych znanych materiałów (Tab. 2) Do porównania wykorzystano takie materiały jak Kevlar, Nylon oraz kauczuk.

Tabela 2. Porównanie właściwości mechanicznych pajęczyny ze znanymi materiałami

materiał elastyczność

(%)

wytrzymałość

(MPa)

energia rozerwania

(MJ/kg)

nić nośna 35 4000 10

nić pomocnicza 5 1000 3

nić łowna 200 1000 10

Kevlar 5 4000 3

Nylon 200 70 6

Kauczuk 600 1 8

Źródło: [17]

Michał Wrzecionek, Michał Więcła, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

12

Jak łatwo zauważyć do rozerwania nici nośnych i łownych potrzeba znacznie

większej energii niż w przypadku Kevlaru, który jest obecnie jednym z najmocniej-

szych włókien wytwarzanych w skali przemysłowej. Nić nośna przy tej samej

wytrzymałości co Kevlar cechuje się znacznie większą elastycznością, co sprzyja

zastosowaniu pajęczyny tego typu w inżynierii tkankowej. Nici łowne o jeszcze

większej elastyczności przewyższają wytrzymałością Nylon.

Nici pajęcze nie tyko są ważne ze względu na ich wytrzymałość. Pajęczyna jest

biokompatybilna, biodegradowana oraz cechuje się bardzo niską immunogennością

[18]. To właśnie te cechy decydują o próbie zastosowania tego materiału zarówno

w medycynie jak i inżynierii tkankowej. Do ciekawych cech naturalnych nici

pajęczych należy zaliczyć także właściwości antybakteryjne oraz przeciwgrzybiczne

[18]. Obecnie białka budujące pajęczynę często wytwarza się dzięki zmodyfikowanym

organizmom. Modyfikując geny można wpłynąć na właściwości nici. Dzięki temu

otrzymuje się pajęczynę o dobrych właściwościach mukoadhezyjnych [19]. Oprócz

modyfikacji genetycznych możliwa jest modyfikacja naturalnie wytworzonej nici na

drodze reakcji chemicznej. W ten sposób zwiększa się powinowactwo pajęczyny do

danego leku, co pozwala na zastosowanie jej jako nośnika leku, lub w systemach

dostarczania leku [20].

3. Zastosowania pajęczyny

Nici pajęcze wykorzystywane są w wielu branżach. Pajęczynę można stosować

w kosmetykach, aby poprawić miękkość i jasność produktów. Pajęczyny mogą być

również wykorzystywane do oceny zanieczyszczenia środowiska przemysłowego

i mieszkalnego. Jest wykorzystywana do produkcji paneli na łodziach i pojazdach

mechanicznych, które mają być odporne na gnicie. Możliwymi przedmiotami

wykonanymi z nici pajęczej mogą być również biodegradowalne bandaże i nici chirur-

giczne [18]. Niniejsza praca skupiać się będzie na zastosowaniach biomedycznych

(Tab. 3). Szczegółowe omówienie wszystkich możliwości jest niemożliwe w tak

krótkiej pracy. Z tego powodu w niniejszej pracy zarysowano jedynie najciekawsze

z nich.

Tabela 3. Przykłady biomedycznego zastosowania nici pajęczej

zastosowanie forma

opatrunki na rany -filmu

-gąbczasta

inżynieria tkankowa kości

-gąbczasta

-hydrożelu

-włókniny

inżynieria tkankowa chrząstki -gąbczasta

-hydrożelu

inżynieria tkankowa ścięgien i więzadeł -włókna

inżynierii tkankowa wątroby -filmu

inżynieria tkanki łącznej -włókniny

inżynieria tkankowa śródbłonka i naczyń

krwionośnych -włókniny

Źródło: [15]

Nić pajęcza jako biomateriał

13

3.1. Wymagania stawiane przed polimerem do zastosowań medycznych

Nić pajęcza prócz niezwykłych właściwości opisanych wyżej musi posiadać szereg

cech, które są nieodzowne w przypadku biomateriałów. Biomateriałem nazywa się

każdy materiał, który pełniąc swoją funkcję ma bezpośrednią styczność z ludzkimi

tkankami i nie wywołuje przy tym niepożądanych efektów. Takim efektem jest np.

odpowiedź immunologiczna organizmu, czyli powstanie stanu zapalnego. Przedsta-

wione niżej wymagania muszą spełniać polimery, której budują np.: soczewki

kontaktowe, osnowy leków, żelowe kapsułki, nici chirurgiczne, rusztowania komór-

kowe. Aby biomateriał mógł zostać wykorzystany w medycynie musi spełniać między

innymi następujące wymagania [21]:

łatwość utrzymania w czystości oraz sterylizacji;

biozgodność – zarówno polimer jak i produkty jego rozpadu są nietoksyczne i nie

wywołują odpowiedzi immunologicznej organizmu;

nie powinny reagować z krwią (tworzenie skrzepów);

czas degradacji materiału powinien być ściśle związany z jego funkcją (krótki

–DDS, dłuższy – implantów);

w etapie syntezy i oczyszczania nie powinno używać się substancji (katalizatory,

rozpuszczalniki), które mogłyby sprawiać zagrożenie dla organizmu w przypadku

pozostania w gotowym wyrobie medycznym

Jak łatwo zauważyć, część powyższych wymagań wpisuje się w listę niezwykłych

właściwości pajęczyny, między innymi – biokompatybilność, biodegradowalność,

niska immunogenność. Nici pajęcze zbudowane z białka degradują na aminokwasy,

które są cennymi dla organizmu substancjami. Wydawałoby się, że jest to więc

materiał idealny. Oczywiście tak nie jest. Pozyskiwanie nici wprost z natury wyma-

gałoby opracowania metody oczyszczania i sterylizacji począwszy od etapu hodowli

pająków. Zwierzęta powinny mieć odwzorowane naturalne warunki, aby rozwijały się

poprawnie. Zastosowanie sterylnych szklanych pojemników nie jest więc możliwe.

W hodowli występuje także wiele innych problemów jak: silne zachowania tery-

torialne i kanibalizm pająków, konieczność podawania „czystego” pokarmu, oraz

niewielki uzysk pajęczyny przy dość dużym nakładzie pracy hodowcy. Z tych

powodów zaczęto produkować pajęczynę biotechnologicznie za pomocą organizmów

modyfikowanych genetycznie. Białko budujące pajęczynę może pochodzić ze

zmodyfikowanych ziemniaków, czy tytoniu [22]. Takie podejście mimo konieczności

opracowania metody przetwarzania otrzymanego biotechnologicznie białka zapewnia

dużą i powtarzalną produkcję. Dzięki temu możliwe staje się wytworzenie bioma-

teriału o spodziewanych właściwościach (np. elastyczność, wytrzymałość, jedno-

rodność) oraz zminimalizowanie ryzyka wystąpienia nieprzewidywalnych problemów

(brak powtarzalności, problemy ze sterylizacją, problemy hodowlane), które mogłyby

wystąpić w przypadku nici pozyskiwanych bezpośrednio od pająków.

3.2. Zastosowania

Jednym z najważniejszych i zaskakujących odkryć na temat nici pajęczych jest ich

biozgodność z żywymi tkankami ludzi. Biozgodność pajęczyny badano u wielu

zwierząt, np. u świń, myszy i szczurów, u których wykazano brak odpowiedzi układu

odpornościowego na obecność polimeru oraz nie obserwowano reakcji zapalnej.

Michał Wrzecionek, Michał Więcła, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

14

Badania te dały jasno do zrozumienia, że pajęczyna nie jest odrzucana przez tkanki,

może być z powodzeniem stosowana w medycynie [18].

Obecnie zastosowanie pajęczyny w medycynie wzrasta. Nici posiadają wyjątkowe

i cenne właściwości lecznicze, to znaczy gojące rany i regenerujące. Można je wyko-

rzystać w regeneracji wielu tkanek i komórek ciała, takich jak skóra, nerw, kość

i chrząstka. Filmy z pajęczyny zapewniają wsparcie strukturalne i indukują regenerację

w tkankach [18]. Sprawia to, że są świetnym materiałem na opatrunki.

Pajęczyna badana jest również pod kątem wytwarzania z niej matrycy podłoża do

hodowli komórkowych. Znane są metody wytwarzania rusztowań komórkowych

o różnych strukturach, od postaci włóknin po struktury gąbczaste. Z powodzeniem

stosowano je w hodowli ludzkich fibroblastów pierwotnych. Komórki wytwarzały

kolagen typu I, co jest dużym sukcesem. Biorąc pod uwagę wytrzymałość mecha-

niczną takich matryc mogą one z powodzeniem być stosowane nie tylko in vitro, ale

także w inżynierii tkankowej [23].

Włókna pajęczyn można również stosować do regeneracji uszkodzonej tkanki

nerwowej. Główne nić nośna wykazuje biokompatybilność i bardzo niską immuno-

genność względem komórek Schwanna człowieka. Okazuje się, że nici pajęcze biorą

udział w powstawaniu mieliny, regeneracji uszkodzonych komórek aksonalnych,

przemieszczaniu komórek Schwanna w nerwie i poprawie transferu impulsów

nerwowych. Wiadomo, że pajęczyna gatunku Nephila clavipes może zostać zastoso-

wana w regeneracji komórek nerwowych ssaków. Zapewnia wsparcie strukturalne

i miejsce wiązania z komórkami tkanki łącznej i komórkami naskórka wytwarzającymi

keratynę. Dotychczas stosowane materiały syntetyczne t.j.: kwas poli-glikolowy (PGA)

i kwas poli-L-mlekowy (PLLA) zostały przebadane pod kątem leczenia chorób układu

nerwowego, jednak eksperymenty nie przynosiły tak dobrych rezultatów jak

w przypadku stosowania pajęczyny [18].

Ze względu na biokompatybilność i właściwości mechaniczne pajęczyny może

znaleźć ona zastosowanie w tworzeniu sztucznych mięśni, ścięgien i więzadeł.

Stosowana w produkcji implantów i protez nić pajęcza nie tylko wypełnia uszkodzony

obszar, ale także wywołuje efekty lecznicze i regeneracyjne w żywych tkankach.

Ponadto ze względu na jej biodegradowalny charakter rozkłada się naturalnie w ciele

bez potrzeby usuwania implantu w procesie chirurgicznym. Dotychczasowe badania

zespołu Tahir’a wykazały również, że pajęczyna (kokon gatunku Nephila edulis) może

być wykorzystywana do projektowania struktur wspierających, które wspomagają

rozwój chondrocytów (tkanki chrzęstnej). Porowate rusztowania przypominające

chrząstkę szklistą zostały z powodzeniem wykonane z nici pajęczych. Te rusztowania

zdawały się wspierać propagację chondrocytów, jak i zapewniać im odpowiednie

podłoże oraz ochronę przed uszkodzeniami mechanicznymi. Spidroina odgrywa ważną

rolę w inżynierii tkanki chrzęstnej, ponieważ jej właściwości mechaniczne są podobne

do właściwości naturalnych chondrocytów [18].

Białka budujące nici pajęcze wykorzystuje się także w systemach dostarczania

leków. Ze względu na konieczność dopasowania nośnika do substancji aktywnej

zwykle nie stosuje się tu naturalnych nici pajęczych tylko konkretne białka będące

naturalnym składnikiem budulcowym pajęczyny, jednak wytworzone laboratoryjnie

(np. eADF4(C16)). Do danej substancji aktywnej dobierane jest odpowiednie białko

Nić pajęcza jako biomateriał

15

pozwalające związać, a następnie uwalniać substancję aktywną w pożądany sposób.

W razie konieczności białka modyfikuje się w celu dopasowania do substancji

leczniczej. W taki sposób możliwe jest wytworzenie leku w formie folii („plastra”),

która uwalnia substancję aktywną przez 90 dni z kinetyką zerowego rzędu [24].

4. Podsumowanie

Nić pajęcza jest jednym z najwytrzymalszych materiałów dotychczas poznanych.

Potrafi wytrzymałością dorównać włóknom Kevlaru, jednego z najwytrzymalszych

syntetycznych materiałów wytwarzanych przemysłowo. Ze względu na swoją

biokompatybilność i biozgodność może zostać z powodzeniem zastosowana

w inżynierii tkankowej i systemach dostarczania leków. Pajęczyna wciąż stanowi

ciekawy temat badawczy. Poszukiwane są nowe zastosowania i sposoby przetwarzania

oraz opracowuje się metody wytwarzania mające szansę zostać wprowadzone w skali

przemysłowej.

Podziękowania

Praca została sfinansowana ze środków Wydziału Chemicznego

Politechniki Warszawskiej.

Literatura

1. Abdalla S., Obaid A., Al-Marzouki F., Bahabri F., Preparation and Characterization of

Artificial Spider Silk Produced through Microchannel Techniques, Journal Of Material

Science & Engineering 2017, 6:5, s.383-389.

2. Wu Y., Shah D., Liu C., Yu Z., Liu J., Ren X., Rowland M., Abell C., Ramage M.,

Scherman O., Bioinspired supramolecular fibers drawn from a multiphase self-assembled

hydrogel, Proceedings of the National Academy of Sciences 2017, 114, s.8163-8168.

3. Gosline J., Denny M., DeMont M., Spider silk as a rubber, Nature 1984, 309, s.551-552.

4. Gerritsen V., The tiptoe of an airbus, Protein Spotlight 2002, 24, s.1-2.

5. Zhang Y., Applications of natural silk protein sericin in biomaterials,

BiotechnologyAdvances 2002, 20, s. 91-100.

6. Heim M., Keerl D., Scheibel T., Spider Silk: From Soluble Protein to Extraordinary

Fiber, Angewandte Chemie International Edition 2009, 48, s.3584-3596.

7. Jin H., Kaplan D., Mechanism of silk processing in insects and spiders, Nature 2004, 424,

s.1057-1061.

8. http://parts.igem.org/Part:BBa_K1763444.

9. https://www.whatsthatbug.com/2013/02/05/golden-web-spider-from-indonesia/.

10. Kluge J., Rabotyagova O., Leisk G., Kaplan D., Spider silks and their applications, Trends

in Biotechnology 2008, 26, s.244-251.

11. Lewis R., Spider silk: ancient ideas for new biomaterials, ChemicalReviews 2006, 106,

s.3762-3774.

12. Eisoldt L., Smith A., Scheibel T., Decoding the secrets of spider silk, Materials Today

2011, 14, s.80-86.

13. Vollrath F., Porter D.,Spider silk as archetypal protein elastomer, Soft Matter 2006, 2,

s.377-385.

14. Zafar M., Al-Samadani K., Potential use of natural silk for bio-dental applications,

Journal of Taibah University Medical Sciences 2014, 9, s.171-177.

15. Vepari C., Kaplan D., Silk as a biomaterial, Progress in Polymer Science 32 (2007) 991-1007.

Michał Wrzecionek, Michał Więcła, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

16

16. Bowen C., Dai B., Sargent C., Bai W., Ladiwala P., Feng H., Houang W., Kaplan D.,

Galazka J., Zang F., Recombinant Spidroins Fully Replicate Primary Mechanical

Properties of Natural Spider Silk, Biomacromolecules Just Accepted Manuscript 2018, 19,

s.3853-3860.

17. Wong Po Foo C., Kaplan D.,Genetic engineering of fibrous proteins: spider dragline silk

and collagen, Advenced Drug Delivery Reviews 2002, 54, s.1131-1143.

18. Tahir H., Zahra K., Zaheer A., Sumiullah K., Spider Silk: an Excellent Biomaterial for

Medical Science and Industry, Punjab University Journal of Zoology 2017, 32,s.143-154.

19. Petrou G., Jansson R., Högqvist M., Erlandsson J., Wågberg L., Hedhammar M., Crouzier

T., Genetically engineered mucoadhesive spider silk, Biomacromolecules 2018, 19,

s.3268-3279.

20. Kucharczyk K., Weiss M., Jastrzebska K., Luczak M., Ptak A., Kozak M., Mackiewicz A.,

Dams-Kozlowska H., Bioengineering the spider silk sequence to modify its affinity for

drugs, International Journal of Nanomedicine 2018, 13, s.4247-4261.

21. Ruśkowski P., Gadomska-GajadhurA., Polilaktyd w zastosowaniach medycznych,

Tworzywa sztuczne w przemyśle 2017, 2, s.32-35.

22. Scheller J., Gührs K., Grosse F., Conrad U., Production of spider silk proteins in tobacco

and potato, Nature Biotechnology 19 (2001) 573-577.

23. Widhe M., Bysell H., Nystedt S., Schenning I., Malmsten M., Johansson J., Rising A.,

Hedhammar M., Recombinant spider silk as matrices for cell culture, Biomaterials 31

(2010) 9575-9585.

24. Agostini E., Winter G., Engert J., Water-based preparation of spider silk films as drug

delivery matrices, Journal of Controlled Release 2015, 213, s.134-141.

Nić pajęcza jako biomateriał

Streszczenie

Pajęczyna była wykorzystywana przez ludzi już w starożytności. Do dziś stanowi ciekawy obiekt

badawczy. Obecne zastosowania są znacznie bardziej zaawansowane niż pierowtne. Dzięki bardzo dobrym

właściwością mechanicznym oraz biozgodności nici pajęcze są jednym z ciekawszych biomateriałów.

Niniejsza praca ma na celu przybliżenie właściwości i procesu tworzenia naturalnej nici pajęczej. Zostaną

także omówione potencjalne zastosowania pajęczyny w medycynie. Praca ma charakter przeglądowy.

Słowa kluczowe:biomateriały, pajęczyna, inżynieria tkankowa

Spider silk as biomaterial

Abstract

Spider silk was used by people in antiquity. It is an interesting research topic until today. Current

applications far outweigh the original ones. Thanks to very good mechanical properties and

biocompatibility, spider threads are one of the most interesting biomaterials. This work aims to

approximate the properties and structure of the spider silk. The potential uses of spider silk in medicine will

also be discussed. The work is a review article.

Keywords: biomaterials, spider silk, tissue engeenering

17

Renata Wawrzaszek1

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej

1. Wprowadzenie

Zdolności regeneracyjne tkanki kostnej są niekiedy ograniczone w wyniku

rozległych ubytków, zabiegów chirurgicznych, ciężkich zakażeń infekcyjnych,

deformacji wrodzonych, urazów powypadkowych. W tym celu aplikowane są

naturalne lub syntetyczne materiały kościotwórcze, które w zależności od budowy

i pochodzenia zostały podzielone na materiały pochodzenia autogennego (własne kości

pacjenta pobierane najczęściej z grzebienia kości udowej, własnej tkanki), allogennego

(dawca i biorca różnią się pod względem genetycznym), ksenogennego (od żywych

organizmów głównie pochodzenia wołowego), materiały izogenne (bliźniak jednota-

jowy lub krewny), alloplastyczne (syntetycznie najczęściej z ceramiki na bazie

fosforanu wapnia, materiały naturalne i syntetyczne) [1-3].

Dostępne na rynku medycznym bioszkła w formie proszków, granul, kształtek,

a także włókien, stanowią rusztowanie kompozytów w inżynierii tkankowej. Zadaniem

szkieł aktywnych biologicznie jest pobudzenie do gojenia się w miejscu ubytku

kostnego. Porowatość oraz odpowiedni kształt pozwalają w warunkach in vitro

i in vivo na zasiedlenie biomateriału odpowiednimi komórkami. Wielkość porów jest

ważnym parametrem regulującym dynamiczny proces waskularyzacji i osteointegracji

biomateriałów zastępczych tkanki kostnej. Nanopory ok. 10-20 nm zapewniają

hydrofilność i kapilarność, penetrację płynu, dostęp do substancji odżywczych.

Makropory 100-300 µm umożliwiają przejście osteoblastów przez macierz kostną.

Idealny materiał na bioszkło powinien charakteryzować się systemem połączonych ze

sobą mikro i makroporów, składem chemicznym sprzyjającym kolonizacji powierzchni

co sprzyja adhezji i kolonizacji komórek kościotwórczych, odpowiedzialnych za

odkładanie się nowej macierzy kostnej, tworzeniem bezpośrednich wiązań z tkanką

kostną. Poznanie mechanizmów tych reakcji pozwala na ukierunkowaną modyfikację

warstwy wierzchniej w celu wywołania określonej reakcji tkanek w zależności od

funkcji jaką ma pełnić biomateriał. Określenie zjawisk zachodzących na powierzchni

implantu zarówno w warunkach in vitro i in vivo wciąż pozostaje otwartym tematem

dyskusji [4-5].

2. Szkło aktywne biologicznie jako materiał kościotwórczy

Wytworzenie bioszkła o zbliżonej funkcjonalności do naturalnej kości ludzkiej jest

trudnym zadaniem. Zagadnienia, z którymi należy się zmierzyć przy projektowaniu

szkieł bioaktywnych dotyczą problemów interdyscyplinarnych z zakresu biotech-

nologii, technologii chemicznej, inżynierii materiałowej oraz medycyny. Zaprojekto-

wanie metodą syntezy zol-żel szkła bioaktywnego obejmuje ustalenie miejsca aplikacji

materiału kościotwórczego, cech geometrycznych na podstawie anatomiczno-

1 r.wawrzaszek@intibs.pl, Instytut Niskich Temperatur i Badań Strukturalnych im. Włodzimierza

Trzebiatowskiego Polskiej Akademii Nauk

Renata Wawrzaszek

18

fizjologicznych warunków, analizę stanu przemieszczeń i stanu naprężeń w układzie

biomateriał – tkanka, opracowanie dokumentacji konstrukcyjnej i technologicznej,

techniki aplikacji biomateriału, właściwości chemicznych i fizycznych biomateriału.

Szkło bioaktywne powinno oferować osteoindukcyjne, trójwymiarowe rusztowanie

zawierające komórki kościotwórcze, wykazywać zdolność aktywacji procesów

osteogenicznych komórek macierzystych do różnicowania się, stymulować regenerację

i promować procesy waskularyzacjne, być spójne strukturalnie z otaczającą tkanką

kostną, resorbować się w sposób kontrolowany, wykazywać obojętność immunolo-

giczną oraz nie inicjować tworzenia zakrzepów i zatorów [6-8].

Po aplikacji do organizmu zwierzęcego czy ludzkiego nie może wywoływać reakcji

toksycznych, generować niekorzystnych reakcji immunologicznych, alergicznych,

kancerogennych, teratogennych, promować namnażania czynników infekcyjnych,

wywoływać martwicy, działać uszkadzającego sąsiednie tkanki, nie wpływać na

krzepliwość krwi i nie inicjować zatorów, wywoływać stanów zapalnych. Wykazywać

odpowiednie własności mechaniczne min. wytrzymałość na ściskanie, moduł

sprężystości, rozciąganie, sztywność, zdolność do nietoksycznej resorpcji w ściśle

określonym czasie po spełnieniu swojej roli [9-11].

3. Mechanizm bioaktywności szkieł

Przebieg procesów zachodzących na powierzchni bioszkła jest związany

z tworzeniem się żelu krzemionkowego na powierzchni szkła aktywnie biologicznego,

adsorpcją jonów, krystalizacją hydroksyapatytu, adsorpcją białek na warstwie

hydroksyapatytu, odziaływaniem makrofagów, adhezją komórek mezenchyma-

tycznych, różnicowaniem komórek, odkładaniem substancji międzykomórkowej oraz

mineralizacją substancji międzykomórkowej [12-14].

Komórki kościotwórcze – osteoblasty wiążą się z powierzchnią zawierającą grupy

OH> COOH> NH2> CH3. Komórki macierzyste częściej różnicują się na osteoblasty

na powierzchniach zawierających grupy aminowe. Metoda zol–żel daje możliwość

uzyskiwania materiałów nanostrukturalnych charakteryzujących się dużą powierzchnią

właściwą. Warunki syntezy zol-żel pozwalają na domieszkowanie biomateriałów

substancjami chemicznymi i biologicznymi oraz modyfikację powierzchni grupami

funkcyjnymi [15, 16].

Produktami syntez zol-żel są produkty złożone z aglomeratów cząstek o wymiarach

nanometrycznych. Bioaktywność jest efektem reakcji zachodzących na granicy faz

biomateriału płyn ustrojowy – komórka/tkanka i procesów takich jak: adsorpcja białek,

wytworzenie wiązań komórka – biomateriał, termodynamika powierzchni a adhezja

komórek, wpływ parametrów termodynamicznych na adhezję komórek. Główny

składnik bioszkieł tlenek krzemu odpowiada za aktywność biologiczną zaprojekto-

wanego biomateriału. W nowych generacjach szkła aktywnego znajdują się m.in.

związki magnezu, potasu i boru, które modyfikują właściwości fizyko - mechaniczne

składników mineralnych tkanki kostnej. Dostępne są także bioszkła o składzie

chemicznym w którym głównymi składnikami są CaO, Na2O z dodatkiem F2, P2O5,

CaF2, MgO, ZrO2, TiO2, CaSiO3, węgliku krzemu, srebra, które wpływają na

właściwości chemiczne, fizyczne i aktywność biologiczną. Mała reaktywność szkła

przyczynia się do niewielkiej ilości wiązań, a tym samym odrzucenia implantowanego

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej

19

biomateriału. Z danych literaturowych wynika że szkło sodowo – wapniowe ulega

związaniu ze strukturą kości po ok. 30 dniach od aplikacji (skład: SiO2 – 45%, CaO

– 23-25%, Na2O 24-25%, P2O5 1-10% oraz modyfikatory w postaci ZnO, B2O3, CaF2).

Otrzymany produkt w procesie zol - żel charakteryzuje się rozwiniętą powierzchnią, na

której obecne są grupy silanolowe sprzyjające krystalizacji hydroksyapatytu i nukleacji

[17, 18].

Biomateriał narażony jest na działanie płynów ustrojowych i krwi, temperaturę 35-

42°C i wartość 7,4 pH utrzymującą się wewnątrz organizmu. W pierwszym etapie

dochodzi do wymiany jonów H+, które są zastępowane jonami Na

+, na powierzchni

tworzy się ciągła warstwa żelu. Kolejny etap to kumulowanie jonów fosforu i wapnia,

mają one znaczący wpływ na stymulację osteoblastów i różnicowanie komórek.

W wyniku krystalizacji hydroksyapatytu, dochodzi do miejscowego wzrostu pH.

Czynniki wpływające na zachowanie komórek to specyfikacja chemiczna – obecność

grup funkcyjnych, hydrofilowość, hydrofobowość, wpływ szorstkości powierzchni,

sztywność podłoża. Niektóre produkty degradacji szkieł bioaktywnych mogą

wspomagać regenerację uszkodzonych tkanek. Modyfikacja składu chemicznego

pozwala kontrolować resorpcję oraz wiązania biomateriału z tkanką oraz aktywować

odpowiednie sekwencje genów, osteoblastów indukując proliferację i produkcję

macierzy mineralizującą kość [19-23].

4. Perspektywy zastosowania w inżynierii tkankowej

Parametry tkanki kostnej są zmienne dla różnych osób i zależne od płci, wieku,

trybu życia. Biozgodność biomechaniczna połączenia bioszkło-kość uwarunkowana

jest zachowaniem prawidłowych wartości naprężeń i odkształceń w tkance kostnej

przy minimalizowaniu niekorzystnych zjawisk biomechanicznych np. resorpcji tkanki

kostnej w wyniku powstawania w kości tzw. bezodkształceniowych stref. Szkła

bioaktywne do odbudowy kości stosowane są zarówno w celu zachowania ciągłości

kości, przy wypełnianiu ubytków kostnych jak i w celu powiększenia ilości kości np.

przed implantacją, przy niekorzystnej topografii kości, różnego rodzaju uszkodzeniach

układu kostnego. Kości „pracujące” charakteryzują się większą zdolnością gojenia

i regeneracji niż kości „niepracujące”, gdzie częstym zjawiskiem jest występowanie

blizn łącznotkankowych. Zaaplikowany w kości implant przenosi w początkowej fazie

część obciążeń co może przyczynić się do spadku gęstości kości, a także doprowadzić

do odsłonienia elementu protezy otoczonej pierwotnie przez tkankę i kontakt materiału

z agresywnym środowiskiem płynów ustrojowych. Szkło aktywne wykazuje działanie

osteostymulacyjne. Materiał jest wchłaniany podczas naturalnego procesu przebudowy

kości z udziałem osteoblastów i osteoklastów [24-33].

Miejscem szczególnej wagi w procesie wgajania się wszczepów jest granica faz

biomateriał – tkanka biorcy. Odczyn tkankowy wokół wszczepów może charakte-

ryzować się reakcją zapalną z udziałem linii monocytarno – makrofagowej, eozynofiów,

bazofiów, komórek tucznych powstałych w wyniku przekształceń jednojądrzastych

komórek w wielojądrzaste komórki olbrzymie. Uwalniane cząsteczki biomateriałów

lub związki chemiczne szczególnie z grupy tworzyw resorbowalnych mogą indukować

liczne mediatory zapalenia. Nie ma zgodnych danych, które z nich odgrywają

kluczową rolę w toczących się procesach zapalnych. Stan powierzchni ma istotny

Renata Wawrzaszek

20

wpływ na zachodzące reakcje. Fibroblasty mają tendencję do kolonizowania powierzchni

gładkich podczas gdy osteoblasty występują na powierzchniach chropowatych.

Wykazano że chropowatość powierzchni in vitro wpływa na osteoblasty ich

różnicowanie i proliferację. Komórkowe kultury hodowlane na powierzchni

chropowatej wykazują większą produkcję pozakomórkowej macierzy. W przypadku

powierzchni gładkich tkanka kostna wzrasta od strony łoża kostnego w kierunku

wszczepu, na powierzchniach chropowatych tkanka kostna wzrasta od powierzchni

chropowatej implantu do łożyska kostnego. Korzystne jest aby materiał kościotwórczy

posiadał pory otwarte o wielkości odpowiadającej strukturom kostnym ok. 50-450 µm

i moduł Younga dostosowany do miejsca implantacji chirurgicznej [34-42].

Występowanie mikroporów <10 μm ułatwia zagnieżdżenie się w strukturze

biorusztowania nowych komórek. Właściwa struktura topograficzna powierzchni

biorusztowania wspomaga migrację komórek do wnętrza bioszkła. Przebudowa kości

jest wynikiem skoordynowanej działalności osteoblastów i osteoklastów. Wielu

autorów dzieli porowatość kości na tak zwane podprzedziały przestrzeni porowej

związane ze strukturą kości. Porowatość kanałowa związana jest z występowaniem

systemu kanałów Haversa i Volkmanna i obejmuje wszystkie kanały kostne w których

znajdują się naczynia krwionośne i nerwy. Promień tych kanałów wynosi ok. 20 µm

i stanowi wymiar charakterystyczny tego podprzedziału przestrzeni porowej kości.

Porowatość jamkowo-kanalikowa związana jest z układem jamkowo-kanalikowym

osteonów i obejmuje cały ten układ, promień kanalika jest rzędu 0,1µm. Porowatość

kolagenowo-apatytowa związana jest z submikroskopowymi przestrzeniami znajdu-

jącymi się pomiędzy włóknami kolagenowymi, a mineralnymi kryształami płytkowymi

apatytu, wymiar porowy jest rzędu 10 nm. Według Cowina kość gąbczasta posiada

trzy przedziały przestrzeni porowej. Pierwszy to przedział makroporowy związany

z występowaniem jamek szpikowych między beleczkami. Charakterystyczny wymiar

porowy w tym przedziale wynosi ok. 1mm. Drugi i trzeci przedział to przedziały

mikroporowe i submikroporowe stanowiące porowatość jamkowo-kanalikową

i kolagenowo-apatytową. W przypadku biorusztowań kości gąbczastej minimalna

porowatość implantu wynosi około 60%, minimalny wymiar porów to ok. 100 μm.

Optymalny wymiar porów warunkujący prawidłową przebudowę tkanki oraz

prawidłowe unaczynienie wynosi 300 μm. Na wytworzenie końcowej struktury

potrzeba 6-12 miesięcy, proces wstępnej mineralizacji trwa około 10 dni. Ludzkie

kości charakteryzują się modułem Younga rzędu 3-20 GPa oraz gęstością 1,8-2,1

g/cm3, wytrzymałość na rozciąganie wynosi 107 MN/m

2, wydłużenie graniczne to ok.

135%, wytrzymałość na ściskanie 159 MN/m2, wytrzymałość na zginanie 160 MN/m

2,

moduł sprężystości poprzecznej 3,14 GN/m2. Materiał wykorzystywany do produkcji

implantu kostnego powinien posiadać zbliżone wartości do modułu sztywności oraz

gęstości tak, aby w analogiczny sposób przenosić obciążenia. W wyniku przebudowy

kostnej mogą pojawić się zaburzenia czynników opóźniających i uniemożliwiających

wygojenie ubytku lub złamania kości. W tkance kostnej zbitej nie obserwujemy

procesu wnikania naczyń krwionośnych przez pierwszych 6 dni od chwili

wprowadzenia przeszczepu. Całkowita rewaskularyzacja przeszczepu jest obserwo-

wana po około 4 miesiącach. W przypadku tkanki kostnej gąbczastej etap wgajania

kończy się po około 2 miesiącach. Istotnym problemem dotyczącym aplikacji

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej

21

biomateriałów jest ryzyko zakażenia bakteryjnego wszczepów i kwestia odrzucania

aplikowanych materiałów przez organizm pacjenta. Odrzucanie przeszczepu jest

najczęściej związane z infekcją bakteryjną, która może być wynikiem błędów

operacyjnych lub osłabieniem organizmu z równoczesną nieprawidłową antybiotyko-

terapią, odrzuceniem przeszczepu z powodu jakości przeszczepianego biomateriału lub

brakiem prawidłowego, stabilnego połączenia pomiędzy tkanką gospodarza,

a biomateriałem przeszczepianym. Nie może być różnic w działaniu przy porównaniu

implantacji krótko i długoterminowej. Na powodzenie zabiegu wpływa także

właściwie dobrana metoda sterylizacji. Udowodniono że dawki promieniowania

poniżej 3 Mrad nie mają skutków ubocznych [39-58].

5. Podsumowanie

Materiały kościozastępcze – szkła aktywne biologicznie odgrywają coraz większą

rolę w codziennej praktyce chirurgicznej. Znajdują zastosowanie w neurochirurgii,

ortopedii, chirurgii plastycznej czy periodontologii. Istnieje wiele miejscowych

uwarunkowań do przeprowadzania tego typu zabiegów: ubytki tkanki kostnej,

wyrostka zębodołowego szczęki, deformacje tkanki kostnej, zanik w wyniku starzenia

się organizmu, zmiany zwyrodnieniowe, uszkodzenie układu kostnego. Z danych

literaturowych wynika że materiał autogenny obecnie jest traktowany jako najlepszy

materiał kostny. Pomimo znacznego zaawansowania w technologii syntezy bioma-

teriałów kościozastępczych, nie udało się dotychczas uzyskać idealnego rusztowania

dla regeneracji tkanki kostnej.

Część prac była finansowana przez Narodowe Centrum Nauki w ramach projektu

nr 2016/22/E/ST5/00530

Literatura

1. Melo Luiz G.N.: Bone healing in surgically created defects treated with either bioactive

glass particles, a calcium sulfate barrier, or a combination of both materials, Clinical Oral

Implants Research, 16, (2005), s. 683-691.

2. Łączka M., Cholewa-Kowalska K., Zamorska L., Sindut R., Czajkowska B.: Bioszkła jako

wypełnienia ubytków kostnych, Ceramika, 80, (2003), s. 217-222.

3. Piatelli M, Favero G, Scarano A, Orsini G, Piatelli A.: Bone reactions to anorganic bovine

bone (Bio-Oss) used in sinus augmentation procedures: a histologic longterm report of 20

cases in humans, The International Journal of oral & maxillofacial implants, 14, (1999), s.

835-840.

4. Vogel M., Voigt C., Gross U.M, Muller-Mai C.M.: In vivo comparison of bioactive glass

particles in rabbits, Biomaterials, 22, (2001), s. 57-362.

5. Wilson J., Clark A.E, Hall M.: Tissue response to Bioglass Rendosseous ridge

maintenance implants, Journal of Oral Implantology, 19, (1993), s. 295-302.

6. Courtney J.M.: Artificial organs and biomaterials, Journal of Medical Engineering &

Technology, 17, (1993), s. 188-190.

7. Davis J.R.: Handbook of materials for medical devices. ASM International, 2003.

8. Deligianni D.D, Katsala N.D, Koutsoukos P.G, Missirlis Y.F: Effect of surface roughness

of hydroxyapatite on human bone marrow cell adhesion, proliferation, differentiation and

detachment strength, Biomaterials, 22, (2001), s. 87-96.

9. Schepers E., de Clercq M., Ducheyne P., Kempeneers R.: Bioactive glass particulate

material as a filler for bone lesions, Journal of Oral Rehabilitation, 18, (1991), s. 439-452.

Renata Wawrzaszek

22

10. Biot M.A.: Theory of propagation of elastic waves in a fluid-saturated porous solid, Low-

frequency range, The Journal of the Acoustical Society of America, 28, ( 1957), s. 179-191.

11. Carter D.R., Hayes W.C.: The compressive behavior of bone as a two-phase porous

structure, The Journal of Bone and Joint Surgery, 59, (1997), s. 954-962.

12. Currey J.D.: Bones: Structure and Mechanics, Princetown University Press, Princeton and

Oxford 2002.

13. Nampa T. i wsp.: A new method for alveolar bone repair using extracted teeth for the graft

material, Journal of Dentistry, 9, (2010), s. 1264-1272.

14. Keole R., Basker H.: Late secondary autogenous bone grafting In cleft patients

comparing mandl· bular (ectomesenchymal) and iliac crest (mesenchymal) grafts,

Craniomaxlllorac, 5, (1987), s. 28-30.

15. Górska R., Konopka T. (red.): Periodontologla wsp6lczesna, Med Tour Press

International, 5, (2013), s. 329-335.

16. Donovan M.G. i wsp.: Autologous calva· rial and iliac on lay bone grafts in miniature

swine, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 51, (1993), s. 898-903.

17. Manolagas S.: Birth and death of bone cells: Basic regulatory mechanisms and

implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis, Endocrine Reviews, 21,

(2000), s. 115-130.

18. Fanghänel J., Bayerlein T., Gedrange C.: Bone functions and the requirements for bone

grafts and substitutes in the orofacial region, Via Medica, 65, (2006), s. 56-58.

19. Bruzzaniti A., Baron R.: Molecular regulation of osteoclast activity, Reviews in Endocrine

& Metabolic Disorders, 7, (2006), s. 123-139.

20. Stawińska N., Ziętek M., Kochanowska I.: Molecular aspects of bone resorption and their

therapeutical capability in the periodontal and therapy, Dental and Medical Problem, 42,

(2005), s. 627-635.

21. Roodman B.G.: Biology of osteoclast activation in cancer, Journal of Clinical Oncology,

19, (2001), s. 3562-3571.

22. Pierre J.M.: Transcription factors controlling osteoblastogenesis, Archives of

Biochemistry and Biophysics, 473, (2008), s. 98-105.

23. Van Heest A., Swiontkowski M.: Bone-graft substitutes, Lancet, 353, (1999) s. 28–29.

24. Majewski S., Majewski P.: Biologiczne mechanizmy przebudowy struktur kostnych i

gojenia tkanek miękkich jamy ustnej po zabiegach implantacyjnych, Poradnik

Stomatologiczny, 9, (2009), s. 230–235.

25. Barrere F., Blitterswijk C.A, Groot K.: Bone regeneration: molecular and cellular

interactions with calcium phosphate ceramics, International Journal of Nanomedicine, 1,

(2006), s. 317-332.

26. Kamiński A., Zasadzka M. Wanyura H.: Demineralizowana macierz kostna –

przygotowanie i zastosowanie w leczeniu stomatologicznym, Magazyn Stomatologiczny,

50, (2007), s. 601-610.

27. Niedźwiecki T., Kuryszko J.J.: Biologia kości. PWN, Warszawa 38-55, s. 2007.

28. Rummelhart J.M., Mellonig J.T., Gray J.L., Towle H.J.: A.comparison of freeze-dried

bone allograft and demineralized freeze-dried bone allograft in human periodontalosseous

defects, Journal of Clinical Periodontology, 60, (1987), s. 655-663.

29. Piętka T., Krzymański G., Domański W., Przybysz J.: Przeszczepy allogennej kości

mrożonej i autogennego szpiku w leczeniu rozległych ubytków kości szczęk, Czasopismo

Stomatologiczne, 60, (2007), s. 312-320.

30. Zhang M., Powers R.M., Wolfinbarger L.: Effect(s) of the demineralization process on the

osteoinductivity of demineralized bone matrix, Journal of Clinical Periodontology., 68,

(1997), s. 1085-1096.

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej

23

31. Strocchi R., Pecora G., Piatelli A.: Bone regeneration with calcium sulfate: evidence for

increased angiogenesis in rabbits, Journal of Oral Implantology, 28, (2002), s. 273-278.

32. Van der Stok J., Van Lieshout E., El-Massoudi Y., Van Kralingen G .H, Patka P.: Bone

substitutes in the Netherlands, A systematic literature review, 7, (2011), s. 739-750.

33. Parikh S.N.: Bone graft substitutes: past, present, future, Postgraduate Medical Journal,

48, (2002), s. 140-142.

34. Albee F.H., Morrison H.F.: Studies in bone growth, triple calcium phosphate as a stimulus

to osteogenesis, Annals of Surgery, 71, (1999), s. 32-35.

35. Moore W.R., Graves S.E., Bain G.I.: Synthetic bone graft substitutes, International Journal

of Surgery, 71, (2001), s. 354-361.

36. Valimaki V.V., Aro H.T.: Molecular basis for action of bioactive glasses as bone graft

substitute, Scandinavian Journal of Surgery, 95, (2006), s. 95-102.

37. Chłopek J.: Kompozyty w medycynie, Kompozyty, 1, (2001), s. 50-541.

38. Tampieri A., Sprio S., Ruffini A., Celotti G., Lesci I.G., Roveri N.: From wood to bone: multi-

step process to convert wood hierarchical structures into biomimetic hydroxyapatite scaffolds

for bone tissue engineering, Journal of Materials Chemistry, 19, (2009), s. 4973-4980.

39. Stavropoulos A.: Deproteinized Bovine Bone Xenograft. In: Orthopedic biology and

medicine: Musculosceletal tissue regeneration. Ed. Pietrzak, W.S. Humana Press 2008.

40. Hammerle C.H., Chiantella G.C., Karring T., Lang N.P.: The effect of a deproteinized

bovine bone mineral on bone regeneration around titanium dental implants, Clinical Oral

Implants Research, 9, (1998), s. 151-161.

41. Fanghänel J., Bayerlein T., Gedrange T.: Bone functions and the requirements for bone

grafts and substitutes in the orofacial region. Via Medica, 65, (2006), s. 56-58.

42. Bruzzaniti A., Baron R.: Molecular regulation of osteoclast activity, Reviews in Endocrine

& Metabolic Disorders, 7, (2006), s. 123-139.

43. Stawińska N., Ziętek M., Kochanowska I.: Molecular aspects of bone resorption and their

therapeutical capability in the periodontal and therapy, Dental and Medical Problem, 42,

(2005), s. 627-635.

44. Roodman B.G.: Biology of osteoclast activation in cancer, Journal of Clinical Oncology,

19, (2001), s. 3562-3571.

45. Pierre J.M.: Transcription factors controlling osteoblastogenesis, Archives of

Biochemistry and Biophysics 473, (2008), s. 98-105.

46. Leda H.: Materiały inżynierskie w zastosowaniach biomedycznych, Poznań 2012.

47. Graziani F., Ivanovski S., Cei S., Ducci F., Tonetti M., Gabriele M.: The in vitro effect of

different PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts, Clinical Oral Implants

Research., 17, (2006), s. 212-219.

48. Pelker H.R, Friedlaender C.E, Markham T.E.: Biomechanical properties of bone

allografts, Clinical Orthopaedics and Related Research, 174, (1983), s. 54-57.

49. Kovoor C.C., Jayakumar R, George V, Padmanabhan V, Guild A, Viswanath S:

Vascularized fibular graft in infected tibial bone loss, Journal of Orthopaedic Research,

45, (2011), s. 330-335.

50. Uygur S., Ozmen S., Kandal S., Lortlar N., Omeroglu S., Arac M., Cenetoglu S..:

Reconstruction of Cranial Bone Defects Using Struthio camelus Eggshell, Journal of

Craniofacial Surgery, 22, (2011), s. 1843-1846.

51. Wenz B., Koch J.: Natürliches Knochenmineral ist umfassend dokumentiert, Medline

search of bone substitutes, Dental Implantology, 8, (2004), s. 6-12.

52. Schlegel K.A., Fichtner G., Schultze-Mosgau S., Wiltfang J.: Histologic Findings in Sinus

Augmentation with Autogenous Bone Chips Versus a Bovine Bone Substitute, The

International Journal of oral & maxillofacial implants, 18, (2003), s. 53-58.

Renata Wawrzaszek

24

53. Proussaefs P., Lozada J., Kleinmann A., Rohrer M., McMillan P.J.: The Use of Titanium

Mesh in Conjunction with Autogenous Bone Graft and Inorganic Bovine Bone Mineral

(Bio-Oss) for Localized Alveolar Ridge Augmentation, International Journal of

Periodontics & Restorative Dentistry, 23, (2003), s. 185-195.

54. Hallmann M., Hedin M., Sennerby L., Lundgren S.: A Prospective 1-Year Clinical and Radio-

graphic Study of Implants Placed After Maxillary Sinus Floor Augmentation with Bovine

Hydroxyapatite and Autogenous Bone, Oral Maxillofac Surgery, 60, (2002) s. 277-284.

55. McAllister B.S, Margolin M.D., Cogan A.G., Buck D., Hollinger J.O., Lynch S.E.:

Eighteen-Month radiographic and histologic evaluation of sinus grafting with anorganic

bovine bone in the chimpanzee, International Journal of Oral & Maxillofacial Surgery, 14,

(1999), s. 361-368.

56. Valerio P, Pereira M.M., Goes A.M., Leite M.F.: The effect of ionic products

frombioactive glass dissolution on osteoblast proliferation and collagen production,

Biomaterials, 25, (2002), s. 2941-2948.

57. Łączka M., Cholewa K.: The surface phenomena in gel-derived glasses and glass-ceramics

materials of the CaO - P2O5 - SiO2 system, Chemical Papers, 51, (1997), s.348-356.

58. Carano R.A., Filvaroff E.H.: Angiogenesis and bone repair, Drug Discovery Today, 8,

(2003), s. 980-900.

Szkła bioaktywne w inżynierii tkankowej

Streszczenie

Ubytki w strukturze kostnej pojawiają się w różnych okolicznościach takich jak uraz, operacja chirurgiczna

choroba. Bioszkła powinny wykazywać biozgodność, stabilność, biofunkcjonalność, nie powinny indu-

kować stanów zapalnych, reakcji toksyczności, alergii, generować niekorzystnych reakcji immunologicz-

nych, wpływać na krzepliwość krwi i tworzyć zatory, działać kancerogennie. Szkła aktywne biologicznie

powinny mieć właściwości osteoindukcyjne, osteogenne, osteokondukcyjne, bioresorbowalność, biokom-

patybilność i porowatość tak by zapewnić podobną do naturalnej kości wytrzymałość na obciążenia.

W niniejszym artykule oceniono aktualne wymagania dotyczące szkieł aktywnych biologicznie, przedsta-

wiono problematykę biotolerancji szkieł aktywnych biologicznie w środowisku tkanek i płynów ustrojowych.

Słowa kluczowe: inżynieria tkankowa, szkła aktywne biologiczne, technologia medyczna, bioaktywność,

materiały kościzastępcze, biomateriały.

Bioactive glasses for tissue engineering

Abstract

Bone structure cavities occur under various circumstances, for example due to a surgery, injury, due to

a surgery, disease. Biologically-active glass should be characterised with biocompatibility, stability,

biofunctionality; it should not induce inflammation, toxicity reactions, allergies, generate adverse immune

reactions, have any effect on blood clotting and create blockages, act carcinogenically. Biologically-active

glass should have osteoinductive, osteogenic, osteoconductive, bioresorbable, biocompatibile as well as

porous properties to provide natural-bone load-bearing capacity This article assesses the current

requirements for biologically-active glass; it covers the problematic aspects of bio-tolerance of

biologically-active glass when found in the environment of tissues and body fluids

Keywords: tissue engineering, biologically-active glass, medical technology, bioactivity, bone replacement

materials, biomaterials.

25

Oliwia Nowakowska-Krol1, Zbigniew Buliński

2

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła

w żywych tkankach

1. Wstęp teoretyczny

Zagadnienie wymiany ciepła w organizmie to bardzo złożony problem. Najczęściej

zjawisko przepływu ciepła w żywych tkankach opisywane jest równaniem Pennes’a.

W rozdziale przedstawiono teorię wymiany ciepła w organizmie człowieka oraz

przedstawiono wady i zalety modelu oraz założenia upraszczające jakie się za nim

kryją. Pokazano również wstępne wyniki zaproponowanego modelu transportu ciepła

opartego na teorii przepływów wielofazowych w ośrodkach porowatych.

2. Znaczenie ciepła w organizmie ludzkim

Człowiek jest organizmem stałocieplnym, dlatego musi zachować równowagę

pomiędzy wytworzeniem odpowiedniej ilości ciepła wewnątrz ciała, a oddawaniem

jego nadmiaru do otaczającego środowiska. Jak pokazano na rysunku 1 w normalnych

warunkach organizm ludzki traci ciepło na kilka sposobów: poprzez promieniowanie

(około 55-65% całkowitych strat), parowanie związane również z oddychaniem (około

20-30% całkowitych strat), konwekcję (około 12-15% całkowitych strat), a także

przewodzenie [1].

Rysunek 1. Wymiana ciepła pomiędzy człowiekiem a środowiskiem [opracowanie własne]

Utrzymanie stałej temperatury ciała jest niezwykle ważne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu i pochłania znaczne ilości energii. Przyjmuje się, że prawidłowy poziom temperatury głębokiej ciała to około 37

oC. Jakiekolwiek

odchylenia wartości tej temperatury niepodlegające mechanizmom termoregulacji powodują zaburzenia czynności wszystkich układów i narządów organizmu [2]. 1 oliwia.nowakowska-krol@polsl.pl, Instytut Techniki Cieplnej, Inżynieria Środowiska i Energetyki,

Politechnika Śląska, www.itc.polsl.pl 2 zbigniew.bulinski@polsl.pl, Instytut Techniki Cieplnej, Inżynieria Środowiska i Energetyki, Politechnika

Śląska, www.itc.polsl.pl

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

26

Zasadniczo wyróżnia się dwa stany organizmu odbiegające od normalnego poziomu temperatury głębokiej: hipotermia i hipertermia. Hipotermia to stan, w którym temperatura głęboka ciała spada poniżej 35

oC. Stan, w którym w wyniku działania

przyczyn zewnętrznych temperatura głęboka ciała wzrasta powyżej około 38oC,

nazywany jest hipertermią [3, 4].

3. Celowana terapia termiczna

Każde znaczące odchylenie temperatury głębokiej ciała od wartości normalnej (zarówno w kierunku hipotermii jak i hipertermii) jest potencjalnie groźne dla organizmu i w ekstremalnych przypadkach może prowadzić do śmierci. Należy jednak zaznaczyć, że stosowanie wysoko- lub niskotemperaturowych wymuszeń jest coraz szerzej stosowane w medycynie, można tutaj wymienić [5-7]:

kriochirurgię, polegającą na niszczeniu chorych tkanek poprzez lokalną aplikację bardzo niskich temperatur;

ablację termiczną wymuszoną falami radiowymi, polegającą na nagrzewaniu chorobowo zmienionych tkanek za pomocą fal elektromagnetycznych o częstotli-wościach radiowych;

resekcję termiczną, polegającą na wycinaniu chorych tkanek za pomocą wysokich temperatur.

Powyższe zabiegi umożliwiają niszczenie tkanek, jednak przeprowadzanie takich operacji wymaga znajomości mechanizmu transportu ciepła w żywych tkankach, aby ocenić zasięg wpływu terapii na zdrowe tkanki komórki organizmu.

Co więcej celowana terapia termiczna może być z dużymi sukcesami stosowana w leczeniu bardzo groźnych stanów chorobowych. Od wielu lat trwają intensywne badania nad wykorzystaniem hipertermii w leczeniu raka, gdyż komórki zmienione nowotworowo są szczególnie wrażliwe na działanie wysokiej temperatury, a dodat-kowo efekt ten wzmacnia się poprzez aplikację wielofunkcyjnych magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (MNP) [8-10]. Prowadzone są również intensywne badania nad możliwością wykorzystania hipotermii w leczeniu pacjentów z zatrzymaniem krążenia [11]. Badania kliniczne przeprowadzone przez dużą grupę lekarzy i naukowców pod kierownictwem M. Holzera pokazały spadek powikłań neurolo-gicznych i wzrost przeżywalności wśród pacjentów poddanych hipotermii terapeutycznej [12]. W wyniku tych badań w dużej liczbie krajów wprowadzono hipotermię jako standardową terapię pacjentów z zatrzymanym krążeniem stosowanym po przywróceniu krążenia [13, 14]. Istnieje jednak wiele znaków zapytania związanych z samą terapią, jej skutecznością i sposobem prowadzenia [15, 16]. Znaczna część tych wątpliwości mogłaby zostać rozwiana z wykorzystaniem nowoczesnych metod modelowania matematycznego transportu ciepła w żywych tkankach. Takie narzędzi obliczeniowe pozwoliłoby na predykcję rozkładu temperatury w tkankach podlega-jących działaniu niskich lub wysokich temperatur w przypadku tego typu terapii. Problem wykorzystania komputerów w praktyce klinicznej już jest szeroko dyskuto-wany w środowisku lekarzy. Wong i Poon wyrażają zdanie, że przy dalszym tak szybkim rozwoju komputerów oraz metod obliczeniowych będzie możliwe wykorzystanie metod obliczeniowych mechaniki płynów (Computational Fluid Dynamics – CFD) w praktyce klinicznej i diagnozowaniu chorób układu krążenia [17].

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

27

4. Równanie Pennes’a

Matematyczne modelowanie transportu ciepła w żywych tkankach nie jest nowym zagadnieniem, a prace nad tym tematem były publikowane już od połowy dwu-dziestego wieku. Jednym z pierwszych modeli był model zaproponowany przez Pennes’a, który został wykorzystany do opisu rozkładu temperatury w ramieniu ludzkim. Badania Pennes’a polegały na pomiarze temperatury w 7 miejscach na przedramieniu ludzkim. Temperaturę krwi tętniczej zmierzono za pomocą czujników termoelektrycznych. Jego badania pokazały, że przepływ krwi nagrzewa wszystkie tkanki między skórą a osią przedramienia, a także powierzchnię skóry. Pennes zaproponował równanie transportu ciepła w organizmie ludzkim, które uwzględniało metabolizm oraz perfuzję krwi [18]. Jednak takie podejście prowadziło do dużego uproszczenia modelu. Najistotniejsze założenia upraszczające obejmują [19]:

pominięcie wymiany ciepła pomiędzy większymi naczyniami a otaczającymi tkankami;

pominięcie kształtu naczyń krwionośnych;

pominięcie faktu, że przepływ krwi w naczyniach krwionośnych jest przeciwprądowy;

założenie izotropowej wymiany ciepła pomiędzy kapilarami a tkanką;

założenie, że temperatura krwi dopływającej do kapilar jest równa głębokiej temperaturze ciała, a temperatura krwi powracającej jest równa temperaturze tkanki.

Choć model zaproponowany przez Pennes’a cechują istotne uproszczenia, to jest jednym z najpowszechniej wykorzystywanych po dziś dzień modeli transportu ciepła w ludzkich tkankach. Jednak w sytuacji tak skomplikowanego układu jak ludzki organizm, gdzie wielkość naczyń krwionośnych jest bardzo szeroka, obok siebie występują tkanki o bardzo różnym ukrwieniu, wszystkie powyższe założenia zdają się prowadzić do istotnych rozbieżności pomiędzy wynikami obliczeń a rzeczywistością. Wydaje się, że jedynym uzasadnieniem powyższych założeń upraszczających było uproszczenie opisu matematycznego zagadnienia przepływu ciepła w ludzkich tkankach, do takiej postaci, że możliwe było rozwiązanie analityczne otrzymanych równań. W dzisiejszych czasach ogromny postęp w rozwoju komputerów i metod obliczeniowych umożliwił rozwiązywanie bardzo złożonych zagadnień, rzędu dziesiątek milionów stopni swobody nawet na powszechnie dostępnych komputerach osobistych. W tej sytuacji wydaje się być nieuzasadnione stosowanie tak ostrych założeń upraszczających. Wcześniejsze prace nad danym tematem pokazały [20], że pole temperatury jest istotnie zmienione w pobliżu dużych naczyń krwionośnych i w takich miejscach stosowanie modelu Pennes’a powoduje wystąpienie istotnych błędów.

5. Inne modele opisujące rozkład temperatury w ciele ludzkim

Modele opracowane w późniejszym czasie eliminowały część z wymienionych założeń upraszczających. Model zaproponowany przez Wulff’a zakłada, że ciepło wymieniane pomiędzy krwią a tkanką jest proporcjonalne do różnicy temperatur pomiędzy tymi ośrodkami [21]. W odróżnieniu od modelu Pennes’a, gdzie ciepło wymieniane pomiędzy krwią a tkanką jest proporcjonalne do różnicy temperatur pomiędzy krwią dopływającą i odpływającą z tkanki. Model zaproponowany przez Klinger’a był bardzo zbliżony do modelu Wulff’a [22]. Chen i Holmes zaproponowali

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

28

jeden z bardziej złożonych modeli przepływu ciepła w żywych tkankach wyko-rzystując tzw. podejście dwuobszarowe i zapisując osobne równania zachowania energii dla obszaru tkanki i krwi [23]. Pomimo wysokiego stopnia zaawansowania model Chen’a i Holmes’a nie uwzględniał przeciwprądowego przepływu krwi w aortach i żyłach – fakt ten został uwzględniony w pracy Weinbaum’a i innych [24, 25].

6. Propozycja modelu numerycznego

Celem projektu jest dążenie do stworzenia modelu, który były wolny od części wad modelu Pennes’a wymienionych wyżej. W tym celu został opracowany wielopolowy model osiowosymetryczny, który został oparty na idei przenikających się obszarów ciągłych. Obszary te są opisane za pomocą równań zachowania masy, pędu i energii. Idea tego podejścia łączy metody przenikających się mediów oraz uśredniania objętościowego równań transportu ciepła i masy, znane z modelowania przepływów wielofazowych i modelowania przepływu przez ośrodki porowate.

Opisywany model matematyczny został zaimplementowany na platformie komercyjnego oprogramowania numerycznej mechaniki płynów Ansys Fluent (oferowanym przez firmę ANSYS Inc. ze Stanów Zjednocznoych). W wyniku zrealizowanych prac został opracowany model matematyczny i narzędzie obliczeniowe pozwalające na analizę procesów przepływu ciepła w ludzkich tkankach.

7. Model osiowosymetryczny 2D

Na etapie budowy modelu matematycznego przyjęto następujące założenia:

równania transportu krwi rozwiązywane zarówno w obszarze dużego naczynia krwionośnego jak i w obszarze tkanki, gdzie krew przesącza się jakby to był ośrodek porowaty;

równanie transportu energii dla krwi oraz tkanki;

model wymiany ciepła pomiędzy krwią a tkanką uwzględniający efektywną powierzchnię wymiany ciepła pomiędzy tymi dwoma fazami.

Aby przetestować przepływ ciepła w modelu nierównowagowym został opracowany bardzo prosty model osiowosymetryczny 2D o długości 25 cm, w którym znajduje się żyła o średnicy 2mm oraz tkanka o średnicy 5 cm. Model ten utworzono w oprogra-mowaniu Ansys Design Modeler (oferowanym przez firmę ANSYS.Inc ze Stanów Zjednoczonych), a następnie wygenerowano dla niego siatkę numeryczną. Obliczenia przeprowadzono w programie Ansys Fluent (oferowanym przez firmę ANSYS.Inc ze Stanów Zjednoczonych).

Rysunek 2. Dwuwymiarowy model osiowosymetryczny – widok ogólny

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

29

8. Tkanka jako porowate medium

Istotnym problemem przy modelowaniu tkanek żywych organizmów są naczynia

włosowate. Jak widać na rysunku 4 naczynia te znajdują się pomiędzy większymi

naczyniami krwionośnymi. Naczynia te mają średnicę między 4 a 15 mikrometrów

[26] i docierają do niemal każdej komórki w ciele. Zadaniem naczyń włosowatych jest

wymiana pomiędzy krwią, a tkaną między innymi gazów, składników pokarmowych

czy witamin.

Rysunek 3. Struktura naczyń krwionośnych [27]

Porowatość jest właściwością materiału, która określa wielkość i ilość pustych

przestrzeni wewnątrz niego. Jako pustą przestrzeń w zaproponowanym podejściu

rozumiemy obszar, który jest wypełniony krwią w odróżnieniu od obszaru stano-

wiącego tkankę, co przedstawiono na rysunku 5. W szczególności jako pustą przestrzeń

traktujemy naczynia włosowate. Czyli w tym kontekście porowatość będzie określała

udział objętości naczyń włosowatych do całkowitej objętości tkanki i naczyń.

Rysunek 4. Schemat ideowy ośrodka porowatego [opracowanie własne]

Dla takiego założenia przed przystąpieniem do obliczeń należało wyznaczyć

gęstość powierzchni międzyfazowej oraz międzyfazowy konwekcyjny współczynnik

przenikania ciepła.

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

30

9. Gęstość powierzchni międzyfazowej

Gęstość powierzchni międzyfazowej jest to powierzchnia styku dwóch sąsia-

dujących faz przypadająca na jednostkę objętości. Przy założeniu, że powierzchnia

styku jest złożona z nieskończonych powierzchni walcowych, wzór na tę wielkość

można zapisać jak poniżej:

(1)

gdzie: A – gęstość powierzchni międzyfazowej [1/m], f – objętość naczyń

włosowatych w objętości tkanki (porowatość tkanki) [-], d – średnica naczyń

włosowatych [m].

Objętość naczyń włosowatych w objętości tkanki obliczono dzięki znajomości

średniej objętości krwi w ciele człowieka przypadającej na jego masę oraz gęstości

krwi. Można przyjąć, że średnio ta wielkość wynosi 0,08.

W pracy uwzględniono w obliczeniach pięć różnych średnic naczyń włosowatych

od 4 do 12µm.

10. Międzyfazowy konwekcyjny współczynnik przenikania ciepła

Międzyfazowy konwekcyjny współczynnik przenikania ciepła wyznaczono ze

wzoru podanego poniżej [28]:

(2)

gdzie: Nu – liczba Nusselta [-], hsf – międzyfazowy konwekcyjny współczynnik

przenikania ciepła dla sferycznych cząstek [W/m2K], d – średnica cząstek naczyń

włosowatych [m], kf – przewodność cieplna [W/mK], Re – liczba Reynoldsa [-], Pr –

liczba Prandtla [-].

W tabeli 1 przedstawiono wartości przedstawionych parametrów w zależności od

średnicy naczyń włosowatych.

Tabela 1. Otrzymane wyniki

Lp.

Średnica naczyń

włosowatych,

d [m]

Gęstość powierzchni

międzyfazowej,

A [1/m]

Międzyfazowy konwekcyjny

współczynnik przenikania ciepła,

hsf [W/m2K]

1 0.000004 123669 376344

2 0.000006 82446 264914

3 0.000008 61834 207858

4 0.000010 49468 172918

5 0.000012 41223 149196

Źródło: Opracowanie własne

W powyższej tabeli można zauważyć, że im większa średnica naczynia włoso-

watego tym gęstość powierzchni fazowej wraz z międzyfazowym konwekcyjnym

współczynnikiem przenikania ciepła maleje.

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

31

11. Model oparty o równanie Pennes’a

Aby częściowo zweryfikować opracowany model nierównowagowy porównano

wyniki obliczeń otrzymane za jego pomocą z wynikami obliczeń przeprowadzonych z

wykorzystaniem równania Pennes’a. Równanie Pennes’a (transportu ciepła w

organizmie ludzkim) uwzględnia metabolizm oraz perfuzję krwi i wygląda

następująco:

(3)

Gdzie ρ jest gęstością tkanki (kg/m3), c to ciepło właściwe tkanki (J/kg· K).

Kolejnymi oznaczeniami są λ(T), czyli współczynnik przewodzenia ciepła tkanki, x

towektor położenia oraz t to czas (s). Dwa pozostałe człony równania to Qperf, czyli

perfuzja krwi (W/m2) oraz Qmet, czylimetabolizm (W/m

3).

Objętościowe wewnętrzne źródło ciepła związane z perfuzją krwi można

wyznaczyć ze wzoru:

(4)

Gdzie ρB jest gęstością krwi (kg/m3), cB to ciepło właściwe krwi (J/kg·K)

nastomiastTB jest temperaturą krwi (K) a GB to współczynnik perfuzji (1/s).

12. Wyniki

Na rysunkach 5-7 zostały pokazane pola temperatur dla modelu nierównowagowego

oraz dla modelu Pennes’a. Na rysunku 5 można zauważyć, że rozkład temperatury dla

różnych średnic naczyń włosowatych jest niemalże identyczny. Dla najmniejszej

średnicy naczynia włosowatego nastąpiło szybsze wychłodzenie się tkanki.

Na rysunku 7 został pokazany rozkład temperatury dla modelu Pennes’a. Można

zauważyć, że jest on zupełnie inny niż dla modelu nierównowagowego. Wynika to

z tego, że model Pennes’a działa na całej powierzchni tkanki uśredniając wyniki.

Porównując rysunek 6 z 7 możemy zauważyć podobieństwo z rozkładem dla modelu

Pennes’a, przy czym dla modelu nierównowagowego wychłodzenie się tkanki

następuje znacznie szybciej.

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

32

Rysunek 5. Pola temperatury dla modelu nierównowagowego

Rysunek 6. Pole temperatury dla modelu nierównowagowego dla średnicy naczynia krwionośnego równego

4µm w przybliżeniu

Rysunek 7. Pole temperatury dla modelu Pennes’a

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

33

Na rysunku 8 zostało pokazane pole prędkości dla modelu nierównowagowego.

Zmiany prędkości w zależności od rozmiaru naczynia włosowatego również są

niemalże niezauważalne.

Rysunek 8. Pole prędkości dla modelu nierównowagowego

13. Wnioski

W pracy zostały przedstawione wyniki analizy przepływu ciepła na prostym

modelu symbolizującym fragment przedramienia. Do opisu transportu ciepła użyto

równań opisujących transport krwi w obszarze dużego naczynia krwionośnego oraz

tkanki zachowującej się jak materiał porowaty. Użyto również równań transportu

energii dla krwi i tkanki. przeprowadzono również odrębne obliczenia w oparciu

o równanie Pennes’a. Dla rozpatrzonych przypadków można było zauważyć, że rozkład

temperatury oraz prędkości w modelu nierównowagowym nie charakteryzował się

znacznymi różnicami w zależności od średnicy naczyń włosowatych. Im naczynie

włosowate miało mniejszą średnicę, tym tkanka nieznacznie szybciej się wychładzała.

Oznacza to, że rozmiar naczyń włosowatych nie ma większego wpływu na rozkład

temperatury i można w dalszych pracach przyjąć uśredniona wartość na poziomie 8 µm.

W przypadku porównania dwóch modeli – nierównowagowego oraz modelu

Pennes’a można zauważyć, że rozkład temperatury był zupełnie inny. Z tego można

wywnioskować, że wpływ naczyń krwionośnych, mimo że średnice takich naczyń są

bardzo małe mają ogromny wpływ na rozkład temperatury, a wychłodzenie się tkanki

następowało o wiele szybciej niż w przypadku modelu Pennes’a Średnica naczyń

włosowatych, a tym samym ilości krwi przepływającej przez tkankę, nie ma większego

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

34

wpływy na rozkład prędkości. Dalsze prace nad projektem będą obejmowały

opracowanie geometrii oraz siatki numerycznej rzeczywistego odcinka przedramienia

oraz głowy człowieka. Geometria ta zostanie opracowana dzięki dostępnym

przekrojom ludzkiego ciała opublikowanych w ramach projektu The Visual Human

Project. Zdjęcia te zostały wykonane przy wykorzystaniu technologii tomografii

komputerowej (CT) oraz rezonansu magnetycznego (MRI). Takie podejście pozwoli

na opracowanie modelu wolnego od wad równania Pennes’a i pochodnych, co

zaoferuje znacznie lepsza dokładność przewidywania rozkładu temperatur wewnątrz

żywego organizmu. Wiarygodny model matematyczny przepływu ciepła w tkankach

ludzkich będzie nieocenioną pomocą w planowaniu wielu zabiegów medycznych jak

np. wykorzystanie hipotermii w leczeniu pacjentów po zawałach czy wykorzystanie

hipertermii w leczeniu zmian nowotworowych skóry, a także narządów wewnętrznych.

Uwagi ogólne

Praca naukowa finansowana ze środków budżetowych na naukę w latach 2017-

2022, jako projekt badawczy w ramach programu „Diamentowy Grant”.

Literatura

1. Krause M., Termoregulacja organizmu człowieka i obciążenie termiczne, Centralny

Instytut Ochrony Pracy, Wrocław, 2004.

2. Zawadzki A., Basiński A., Brongel L., Gajdosz R., Medycyna ratunkowa i katastrof,

wydanie drugie, Wydawnictwo lekarskie PZWL, Warszawa, 2014.

3. Caterino J. M., Kahan S., In A Page Emergency Medicine, Lippincott Williams & Wilkins,

2003

4. 4. Tsuei B., Kearney P., Hypothermia in the trauma patient, Injury, Int. J. Care Injured

(2004) 35, 7-15.

5. Kaźmierowski M., Kriochirurgia nowotworów skóry – możliwości i ograniczenia metody,

Acta Bio-Optica et Informatica Medica. Inżynieria Biomedyczna, Vol. 12, nr. 2, 2006

6. Siekiera J., Mikołajczak W., Kamecki K., Wronczewski A., Petrus A., Zastosowanie

przezskórnej ablacji falami radiowymi (metody organooszczędzającej, minimalnie

inwazyjnej, alternatywnej dla częściowej resekcji) do leczenia chorych z guzami

nowotworowymi nerki, Urologia Polska, 2008/61/Supl. 1.

7. Louis Hinshaw J., Fred T. Lee Jr, Cryoablation for Liver Cancer, Techniques in Vascular

and Interventional Radiology, Volume 10, Issue 1, 2007

8. Cherukuria P., Glazera E., Curley S., Targeted hyperthermia using metal nanoparticles,

Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 62, Issue 3, pp. 339-345, 8 March 2010

9. Chatterjee DK., Diagaradjane P., Krishnan S. Nanoparticle-mediated hyperthermia in

cancer therapy, Ther Deliv., 2(8): 1001-1014, 2011 August 1

10. Kaddi C., Phan J., Wang M., Computational nanomedicine: modeling of nanoparticle-

mediated hyperthermal cancer therapy, Nanomedicine Vol. 8, No. 8, pp. 1323-1333, data

11. Marion DW, Leonov Y., Ginsberg M., Katz LM, Kochanek PM, Lechleuthner A., Nemoto

EM, Obrist W., Safar P., Sterz F., Tisherman SA, White RJ, Xiao F., Zar H., Resuscitative

hypothermia, Crit Care Med, 24(2 suppl):S81–S89, 1996

12. Hypothermia after Cardiac Arrest Study Group: Mild therapeutic hypothermia to improve

the neurologic outcome after cardiac arrest, N Engl J Med, pp. 346:549-556, 2002

13. Bernard SA, Gray TW, Buist MD, Jones BM, Silvester W., Gutteridge G., Smith K.,

Treatment of comatose survivors of out-of-hospital cardiac arrest with induced

hypothermia, N Engl J Med, pp. 346:557-563, 2002

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

35

14. Nolan JP, Morley PT, Hoek TL, Hickey RW, Advancement Life support Task Force of the

International Liaison committee on Resuscitation: Therapeutic hypothermia after cardiac

arrest. An advisory statement by the Advancement Life support Task Force of the

International Liaison committee on Resuscitation, 57:231-235, 2003

15. Nielsen N., Wetterslev J., Cronberg T., et al., Targeted temperature management at 33°C

versus 36°C after cardiac arrest, N Engl J Med 2013. DOI: 10.1056/NEJMoa1310519.

16. Wise P. M., Horn J., Aneman A., Niielsen N., Targeted temperature management after

out-of-hospital cardiac arrest: certainties and uncertainties, Critical Care, 18:459, 2014

17. Wong G., W.S. Poon, Current status of computational fluid dynamics for cerebral aneurysms:

The clinician’s perspective, Journal of Clinical Neuroscience 18 (2011) 1285-1288

18. Pennes H.H., Analysis of Tissue and Arterial Blood Temperatures in the Resting Forearm,

Journal of Applied Physiology, Vol. 1, pp. 93-122, ISSN 1522-1601, 1948

19. Latif M. Jiji, Heat Conduction, Third Edition, Springer, 2009

20. Nowakowska O., Buliński Z., Mathematical modelling of heat transport in a section of

human forearm, CAMES 2015 (22) 4: 347-363.

21. Wulff W., The Energy Conservation Equation for Living Tissues, IEEE Transactions-

Biomedical Engineering, vol. 21, pp. 494-495, 1974

22. Klinger H.G., Heat transfer in perfused biological tissue. I. General theory, Bulletin of

Mathematical Biology, Vol. 36, pp. 403-415, 1974

23. Chen M.M., Holmes K. R., Microvascular Contributions in Tissue Heat Transfer, Annals

of the New York Academy of Sciences, Vol. 335, pp. 137-150, 1980

24. Weinbaum S., Jiji L.M. & Lemons D.E., Theory and experiment for the effect of vascular

microstructure on surface tissue heat transfer. Part I. Anatomical foundation and model

conceptualization, ASME Journal of Biomechanical Engineering, Vol. 106, pp. 321-330, 1984

25. Weinbaum S. & Jiji L.M., A new simplified bioheat equation for the effect of blood flow on

local average tissue temperature, ASME Journal of Biomechanical Engineering, Vol. 107,

pp. 131-139, 1985

26. The Editors of Encyclopaedia Brittannica, Capillary,

https://www.britannica.com/science/capillary, 06.12.2018r.

27. Gair J., Molnar C., Concepts of Biology, 1st Canadian Edition, 2013

28. Kaviany M., Principles of Heat Transfer in Porous Media, Springer, second edition, pp.

403-405, 1991

Wstępna postać wielopolowego modelu wymiany ciepła w żywych tkankach

Streszczenie

Celem pracy było stworzenie nowego podejścia do modelowania transportu ciepła w tkankach ludzkich,

które byłoby wolne od założeń upraszczających, aktualnie szeroko wykorzystywanego modelu Pennes’a.

W ramach projektu stworzono model 2D, będący uproszczeniem fragmentu ludzkiego przedramienia. Na

podstawie siatki, wygenerowanej na modelu 2D, przeprowadzono obliczenia porównujące podejście

Pennes’a oraz podejście bazujące na założeniu obszarów porowatych. W wyniku przeprowadzonych

obliczeń uzyskano rozkłady temperatur dla modelu Pennes’a oraz ośrodków porowatych dla różnych

średnic naczyń włosowatych. Wyniki pokazały, że średnica naczyń włosowatych ma niewielki wpływ na

ogólny rozkład temperatury w modelu. Porównując podejście Pennes’a oraz podejście bazujące na

założeniu obszarów porowatych widoczna jest znaczna różnica pomiędzy uzyskanymi rozkładami

temperatur. Dalsze prace nad tematem będą obejmowały utworzenie modelu obliczeniowego na podstawie

obrazów technologii tomografi komputerowej (CT) oraz rezonansu magnetycznego (MRI) by jak

najwierniej przedstawić wewnętrzną strukturę rozpatrywanego fragmentu ciała.

Słowa kluczowe: równanie Pennes’a, modelowanie matematyczne, przepływ ciepła, ośrodek porowaty

Oliwia Nowakowska-Krol, Zbigniew Buliński

36

Preliminary development of the multifluid model of heat transfer in the living

tissues

Abstract

The aim of the work was to create a new approach to the modelling of heat transport in human tissues,

which would be free from the simplifying assumptions of the currently widely used Pennes model. In the

project a 2D model was created, which is a simplification of a fragment of the human forearm. Based on

the mesh generated on the 2D model, calculations comparing the Pennes approach and the approach based

on the porous medium theory were carried out. As a result of the calculations, temperature distributions for

the Pennes model and porous areas for different capillary diameters were obtained. The results showed that

the diameter of the capillaries has little effect on the overall temperature distribution in the model.

Comparing the Pennes approach and approach based on the porous medium , there is a significant

difference between the obtained temperature distributions. Further work on the subject will include the

creation of a computational model based on computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging

(MRI) images to present the internal structure of the fragment of the body as faithfully as possible.

Keywords: Pennes equation, mathematic modelling, heat transfer, porous material

37

Mateusz Broncel1, Adrian Matysek

2, Paweł Ramos

3, Barbara Pilawa

4

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu

Paramagnetycznego (EPR) do oceny wpływu warunków

przechowywania na powstawanie wolnych rodników

w tetrakainie

1. Wstęp

Tetrakaina jest pochodną kwasu p-butylobenzoesowego mającą powszechne

zastosowanie jako środek znieczulenia dokanałowego oraz miejscowego [1, 2]. Jej

mechanizm działania polega na miejscowy znieczuleniu poprzez powstanie

odwracalnej blokady przewodnictwa włókien nerwowych [2]. Powoduje to wzrost

przepuszczalności błony komórkowej dla jonów sodu, prawdopodobnie za sprawą

wiązania się kompetencyjnego z miejscem odpowiedzialnym za wiązanie jonu

wapniowego [1, 2]. Z racji iż tetrakaina znajduje się od 2015 roku na liście

podstawowych leków Światowej Organizacji Zdrowia jej zastosowanie jest szeroko

rozpowszechnione na całym świecie, istotny jest więc aspekt prawidłowego

przechowywania tego leku [3].

Wpływ promieniowania ultrafioletowego może prowadzić do modyfikacji lub

zniszczenia struktury cząsteczki, proces ten zwany jest fotolizą. Dzieje się tak za

sprawą absorbcji przez cząsteczkę promieniowania ultrafioletowego [4]. W procesie

fotolizy mogą powstawać wolne rodniki [4]. Dostarczanie do cząsteczki energii

w postaci temperatury także wpływa na nią niekorzystnie. Działanie czynnika termicz-

nego na substancje chemiczną może prowadzić do jej rozkładu na rodniki [4, 5].

Wolne rodniki występują w organizmie w warunkach fizjologicznych, są one

niezbędne w procesach łańcucha oddechowego w mitochondriach, w przebiegu reakcji

enzymatycznych które są katalizowane przez oksydazy – NADPH (fosforanu

dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego), przemianach kwasu arachidonowego oraz

w autooksydacji związków biologicznie czynnych. [6]. Z drugiej strony, wolne rodniki

mogą powodować procesy patologiczne w komórkach [4-6]. Ma to miejsce

w przypadku uszkodzenia mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę stężenia

rodników w organizmie, nadmiernego ich wytwarzania, w wyniku dostarczania ich do

organizmu, bądź działania czynników egzogennych [5, 6]. Na szkodliwe działanie

wolnych rodników jest szczególnie narażony materiał genetyczny oraz błony

1 Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec * autor korespondencyjny, e-mail: mateusz_broncel@interia.pl 2 Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec 3 Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec 4 Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

38

(lizosomalne, perosysomalne, mikrosomalne, mitochondrialne) [4, 6]. Reakcje

wolnorodnikowe uwidaczniają się w postaci stanów zapalnych, zmian miażdży-

cowych, cukrzycy, chorób nowotworowych i genetycznych, chorób neurologicznych,

chorób przewodu pokarmowego oraz odpowiadają za starzenie się organizmu [6].

Metodą pozwalająca na wykrywanie wolnych rodników jest spektroskopia

elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) [7-10]. Technika to opiera się

o absorbcję przez próbkę o charakterze paramagnetycznym (tj. taką która posiada

w swojej strukturze np. wolne rodniki) energii w postaci mikrofal umieszczonej w polu

magnetycznym [8, 9]. Zjawisko elektronowego rezonansu paramagnetycznego

wykorzystywane jest w celu analizy substancji pod kątem posiadania przez nią

niesparowanych elektronów [7-10].

Do prawidłowego działania substancji czynnej niezbędne jest jej prawidłowego

przechowywanie [11, 12]. Zgodnie z kartą charakterystyki substancji tetrakainę należy

przechowywać w suchych i chłodnych pomieszczeniach w szczelnych opakowaniach,

z dala od źródeł ciepła i płomieni [13]. Otwarte opakowanie celem jego kolejnego

użycia powinno być ponownie uszczelnione i przechowywane w pozycji pionowej, nie

dopuszczając tym samym do ewentualnego wydostania się substancji [11-13].

Odpowiednia temperatura przechowywania tetrakainy wynosi poniżej 25ºC [13].

Nieprzestrzeganie prawidłowych warunków przechowywania tetrakainy może wiązać

się ze zmianami w strukturze leku. W następstwie może to doprowadzić do zmiany

właściwości farmakologicznych leku [11-13].

2. Cel pracy

Celem pracy było zbadanie wpływu promieniowania ultrafioletowego oraz

podwyższonej temperatury na generowanie wolnych rodników w tetrakainie podczas

jej przechowywania. Jako metodę pomiarową zastosowano spektroskopię EPR.

3. Materia i metody

3.1. Tetrakaina

Tetrakaina pod względem chemicznym jest estrem dimetyloaminoetylowym kwasu

p-butyloaminobenzoesowego [14-16]. Wzór strukturalny tetrakainy przedstawiono na

Rysunku 1 [16]. W medycynie stosowana jest w postaci chlorowodorku [14, 15]. Jej

działanie znieczulające jest 10-krotnie silniejsze oraz 2-3-krotnie dłuższe niż prokainy

[15]. Tetrakaina jest jednak przy tym bardziej toksyczna od prokainy [14, 15].

Tetrakaina szybko wchłania się z błon śluzowych dzięki czemu może być stosowana

do znieczuleń powierzchniowych. Stosuje się ją w stężeniach od 0,1 do 2%

w znieczuleniu nasiękowym, przewodowym oraz rdzeniowym [14-16]. Bezpieczna

dawka tetrakainy, która może zostać maksymalnie zastosowana u pacjenta wynosi

1mg/kg mc [15]. Do doświadczenia użyto tetrakainy, która została zakupiona w firmie

Sigma-Aldrich.

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

39

NH CH3

ON

CH3

CH3 O

Rysunek 1. Wzór strukturalny tetrakainy [16]

3.2. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe

Tetrakaina została poddana wpływowi promieniowania ultrafioletowego z zakresu

UVA ( = 315-380 nm). Naświetlanie badanego leku wykonano za pomocą lampy

Medisun 250 (Schulze & Bohm Niemcy). Lampa ultrafioletowa była wyposażona w 4

promienniki każdy o mocy 40W. Tetrakaina w postaci proszku została umieszona na

szalce Petriego a następnie naświetlano ją z odległości 30 cm od źródła

promieniowania UVA. W doświadczeniu zastosowano dwa czasy naświetlania 30 oraz

60 minut.

3.3. Ekspozycja na podwyższoną temperaturę

Tetrakaina została również poddana działaniu podwyższonej temperatury.

Zastosowano temperaturę 50ºC i 60ºC które utrzymywano przez 60 minut. Ogrzewanie

badanego leku wykonano za pomocą sterylizatora termicznego z wymuszonym

termoobiegiem powietrza (Memmert, Niemcy). Tetrakaina w postaci proszku została

umieszona na szalce Petriego a następnie po osiągnięciu pożądanej temperatury

umieszczona została wewnątrz sterylizatora termicznego na 60 minut.

3.4. Preparatyka tetrakainy do pomiarów za pomocą spektroskopii EPR

W celu wykonania pomiarów za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu

paramagnetycznego (EPR) próbki tetrakainy po ekspozycji na czynniki fizyczne

zostały umieszczone w szklanych rurkach o średnicy zewnętrznej równej 3 mm. Przed

dokonaniem pomiarów rurka szklana została sprawdzona pod kątem występowania

sygnału EPR. Badanie wskazało, że naczynie laboratoryjne nie wykazuje takowej

aktywności. Masy badanych próbek tetrakiny wyznaczono za pomocą wagi

analitycznej CPA (Sartorius, Niemcy).

3.5. Warunki rejestracji widm EPR badanych próbek tetrakainy

W celu dokonania pomiarów próbkę tetrakainy w rurce pomiarowej umieszczano

pomiędzy biegunami elektromagnesu spektrometru EPR. Do badania wykorzystano

spektrometr elektronowego rezonansu paramagnetycznego na pasmo X (9.3 GHz)

(RADIOPAN, Poznań). Modulacja pola magnetycznego podczas doświadczenia

z tetrakainą wynosiła 100 kHz. Widma EPR były rejestrowane w temperaturze

pokojowej i zapisywane w postaci pierwszej pochodnej absorpcji. Do rejestracji otrzy-

manych widm EPR wykorzystano system numeryczny połączony ze spektrometrem

EPR. System komputerowy wyposażony jest w specjalistyczne oprogramowanie

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

40

spektroskopowe SWAMP (JAGMAR, Kraków) oraz oprogramowanie LabView

(National Instruments, USA). Częstotliwość promieniowania mikrofalowego

rejestrowano miernikiem MCM 101 (EPRAD, Poznań).

Maksymalna moc mikrofalowa, która była wytwarzana przez klistron wynosiła 70

mW. Moc ta ulegała zmianie podczas pomiarów. Zmieniano ją w zakresie 2.2-70 mW.

W pomiarach korzystano z wzoru (1) na tłumienie mocy [17]:

Tłumienie dB 0 lg Mo/M) (1)

gdzie:

Mo – całkowita moc promieniowania mikrofalowego wytwarzanego przez klistron

(70 mW),

M – moc promieniowania mikrofalowego stosowana podczas pomiaru widma

EPR.

Parametry otrzymanych widm EPR oraz koncentracja wolnych rodników dla

testowanych próbek tetrakainy zostały porównane dla pomiaru wykonanego przy

tłumieniu 15 dB i odpowiadającej temu tłumieniu mocy mikrofalowej wynoszącej 2.2

mW.

Dodatkowo w pracy zbadano wpływ mocy mikrofalowej (zakres 2.2-70 mW) na

kształt i parametry widm EPR.

3.6. Analizowane parametry widm EPR badanego leku

W doświadczeniu wyznaczono oraz porównano następujące parametry widm EPR

zarejestrowane dla badanej tetrakainy:

amplitudę linii EPR (A [j. wzgl.]) (Rysunek 2). Parametr ten rośnie wraz ze

wzrostem ilości wolnych rodników w próbce [17-20].

szerokość linii EPR (ΔBpp [mT]) (Rysunek 2). Parametr ten jest zależny od

rodzaju oddziaływań magnetycznych w analizowanej próbce [17-20].

intensywność integralną (I [j. wzgl.]). Parametr stanowiący pole powierzchni pod

krzywą absorpcji rezonansowej. Wartość intensywności integralnej otrzymujemy

poprzez dwukrotne całkowanie linii [17-20].

współczynnik rozszczepienia spektroskopowego g. Wartość współczynnika

rozszczepienia spektroskopowego g zależy od rodzaju atomu, na którym jest

zlokalizowany niesparowany elektron [17-20].

Wszystkie analizowane parametry widm EPR zostały wyznaczone przy wyko-

rzystaniu oprogramowania spektroskopowego (JAGMAR, Kraków).

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

41

Rysunek. 2. Przykładowe widmo EPR w postaci pierwszej pochodnej absorpcji. Zaznaczono podstawowe

parametry EPR: amplituda linii (A), szerokość linii (ΔBpp), rezonansowa indukcja magnetyczna (Br) oraz

parametry asymetrii: A1, A2, B1 i B2

3.7. Wyznaczenie koncentracji wolnych rodników

Koncentrację (N) wolnych rodników w badanych próbkach tetrakainy wyznaczono

według wzoru (2):

N = nu(IpAruWu)/(IuArpWpm) (2)

gdzie:

nu – ilość centrów paramagnetycznych we wzorcu (ultramarynie)(nu = 1.2x1019

spin),

Ip, Iu – intensywność integralna linii EPR próbki i ultramaryny,

Arp, Aru – amplituda linii EPR rubinu rejestrowanej przy tym samym wzmocnieniu

dla próbki i ultramaryny,

Wp, Wu – wzmocnienie sygnału EPR próbki i ultramaryny,

m – masa próbki.

Jako wzorzec koncentracji wolnych rodników zastosowano ultramarynę, która

wykazuje dużą stabilność występujących w niej centrów paramagnetycznych. W celu

zwiększenia dokładności pomiaru zastosowano tzw. wzorzec wewnętrzny kryształ

rubinu, który został wprowadzony do rezonatora poniżej badanej próbki za pomocą

goniometru. Dla linii EPR kryształu rubinu wyznaczono amplitudę.

4. Wyniki i dyskusja

Tetrakaina która nie został poddana działaniu promieniowaniu UV oraz czynnikowi

termicznemu nie wykazywała właściwości paramagnetycznych. Dla wyjściowej próbki

tetrakainy nie zostały zarejestrowane widma EPR nawet przy największym

wzmocnieniu wynoszącym 70 mW. Brak rejestracji widma EPR badanej wyjściowej

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

42

tetrakainy potwierdza jej duży stopień czystości paramagnetycznej. Wskazuje to na

brak występowania w wyjściowym leku defektów sieci.

Widma EPR były rejestrowane dla próbki badanego leku poddanego działaniu

promieniowania z zakresu UVA (Rysunek 3) oraz czynnika termicznego (Rysunek 4).

Widma rejestrowano niezależnie od zastosowanego czasu naświetlania

promieniowaniem ultrafioletowym 30 minut (Rysunek 3a) i 60 minut (Rysunek 3b)

oraz niezależnie od zastosowanej temperatury 50ºC (Rysunek 4a) i 60ºC (Rysunek 4b).

Rysunek 3. Widmo EPR tetrakainy poddanej działaniu promieniowania UVA przez (a) 30 minut i (b) 60

minut. Widma EPR rejestrowano przy mocy mikrofalowej 2.2 mW i tłumieniu 15dB

Rysunek 4. Widmo EPR tetrakainy poddanej działaniu temperatury (a) 50ºC i (b) 60ºC przez 60

minut. Widma EPR rejestrowano przy mocy mikrofalowej 2.2 mW i tłumieniu 15dB

Widma EPR zarejestrowano również dla innych leków poddanych działaniu

promieniowania ultrafioletowego tj. dla kwasu salicylowego [21], mocznika [21],

kwasu deoksycholowego [22], ursodeoksycholowego [22], rapamycyny [23],

cyklosporyny A [23], oraz takrolimusa [23]. Widma EPR rejestrowano również dla

leków poddanych działaniu czynnika termicznego m.in. dla wybranych antybiotyków

aminoglikozydowych [24], werapamilu [25], cefakloru [26], klarytromycyny [26],

chloramfenikolu [27], rosuwastatyny [28], kwasu borowego [29], zasadowego

gallusanu bizmutu [30] oraz famotydyny [31].

Uzyskane widm EPR badanych próbek tetrakainy, na którą działano różnymi

czynnikami fizycznymi poddano analizie. Analizowano amplitudę (A), szerokość linii

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

43

(∆Bpp), intensywność integralna (I) oraz współczynnik rozszczepienia spektrosko-

powego g. Wyniki analizowanych parametrów dla leku poddanego ekspozycji na

promieniowanie ultrafioletowe przestawiono w Tabeli I a dla leku poddanego działaniu

podwyższonej temperatury przedstawiono w Tabeli II.

Tabela I. Amplituda (A), szerokość linii EPR(ΔBpp), intensywność integralna (I) oraz współczynnik

rozszczepienia spektroskopowego g wolnych rodników powstałych w tetrakainie naświetlanej

promieniowaniem ultrafioletowym. Dane dotyczą widm EPR rejestrowanych w temperaturze pokojowej, 15

minut po ekspozycji na promieniowanie UVA

Czas ekspozycji

na UVA

A [j. wzgl.]

[+0.01]

Bpp [mT]

[+0.02]

I [j. wzgl.]

[+0.2]

g

[+0,0002]

30 minut 0.14 1.44 10.7 1.9948

60 minut 0.13 1.38 10.2 1.9952

Analizując Tabelę I obserwujemy, że parametr amplitudy, szerokości linii EPR oraz

intensywność integralna przyjmują wartości mniejsze dla leku naświetlanego

promieniowaniem UVA przez 60 minut w stosunku do leku naświetlanego 30 minut.

Odmienne wyniki uzyskano dla mocznika [21], kwasu salicylowego [21], kwasu

deoksycholowego [22] i ursodeoksycholowego [22] poddanych działaniu

promieniowania UV. Jednakże dla parametru szerokości linii EPR również

w przypadku kwasów cholowych rejestrowano mniejsze wartości wraz z wydłużeniem

czasu ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe podobnie jak to jest w przypadku

tetrakainy [22]. Wskazuje to na to, że silniejsze oddziaływania dipolowe występują

w leku naświetlanym 30 minut niż 60 minut.

Tabela II. Amplituda (A), szerokość (ΔBpp) linii EPR, intensywność integralna (I) oraz współczynnik

rozszczepienia spektroskopowego g wolnych rodników powstałych w tetrakainie poddanej działaniu czynnika

termicznego. Dane dotyczą widm EPR rejestrowanych w temperaturze pokojowej, 15 minut po ekspozycji na

podwyższoną temperaturę

Temperatura i

czas ekspozycji

A [j. wzgl.]

[+0.01]

Bpp [mT]

[+0.02]

I [j. wzgl.]

[+0.2]

g

[+0,0002]

50ºC/60 minut 0.12 1.18 6.3 1.9973

60ºC/60 minut 0.21 0.46 1.7 1.9982

Analizując z kolei Tabelę II obserwujemy, że parametr amplitudy przyjmują

wartości większe dla leku poddanego działaniu 60ºC przez 60 minut w stosunku do

przechowywanego w 50ºC przez 60 minut. Podobne właściwości obserwowano dla

streptomycyny [24], paromomycyny [24], famotydyny [31]. Z kolei parametr

szerokości linii EPR oraz intensywność integralna znacznie maleją w badanej

tetrakainie wraz ze wzrostem temperatury 60ºC występuje mniejsza ilość wolnych

rodników w porównaniu z lekiem przechowywanym w temperaturze 50ºC. Również

oddziaływania dipolowe w próbce tetrakaininy przechowywanej w 60ºC są mniejsze

niż dla leku przechowywanego w temperaturze 50ºC. Podobne właściwości

zaobserwowano dla sisomycyny [24], paromomycyny [24], chloramfenikolu [27],

rosuwastatyny [28],zasadowego gallusanu bizmutu [30], famotydyny [31].

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

44

W eksperymencie przeprowadzono analizę koncentracji wolnych rodników

w badanej tetrakainie poddanej działaniu promieniowania UVA oraz działaniu

czynnika termicznego. Wyniki zostały przedstawione na Rycinie 5.

Rysunek. 5. Zmiana koncentracji (N) wolnych rodników w zależności od działającego czynnika fizycznego

oraz czasu jego działania

Analizując Rycinę 5 możemy zauważyć, że zarówno w przypadku wydłużenia

ekspozycji tetrakainy na działanie promieniowania UVA jak i w przypadku

zwiększenia temperatury przechowywania z 50ºC na 60ºC koncentracja wolnych

rodników maleje. Znacznie bardziej jest to widoczne w przypadku działania czynnika

termicznego niżeli promieniowania UVA. Za efekt ten może odpowiadać

rekombinacja powstałych wolnych rodników. Należy pamiętać, że zgodnie z teorią

parametr koncentracji wolnych rodników (Rysunek 5) jest wprost proporcjonalny do

intensywności integralnej (Tabela I, II). Podobne efekty obserwowano również dla

innych leków poddanych działaniu czynnika termicznego takich jak rosuwastatyna

[28], zasadowy gallusan bizmutu [30], famotydyna [31]. Z kolei dla mocznika [21],

kwasu salicylowego [21], oraz kwasów cholowych [22] poddanych działaniu

promieniowania ultrafioletowego obserwowano odmienny efekt niż dla tetrakainy.

W przeprowadzonych badaniach wykonano również ocenę wpływu mocy

mikrofalowej (2,2-70 mW) na parametr amplitudy (A) oraz szerokości linii (∆Bpp)

EPR. Na Rysunku 6 przedstawiono wyniki dotyczące tetrakainy poddanej działaniu

promieniowania ultrafioletowego natomiast na Rysunku 7 przedstawiono wyniki

dotyczące tetrakiny poddanej działaniu czynnika termicznego.

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

45

Rysunek 6. Zależność (a, b) amplitudy (A) oraz (c, d) szerokości (Bpp) linii EPR od mocy mikrofalowej (M)

tetrakainy poddanej działaniu promieniowania UVA przez (a, c) 30 minut i (b, d) 60 minut

Rysunek 7. Zależność (a, b) amplitudy (A) oraz (c, d) szerokości (Bpp) linii EPR od mocy mikrofalowej (M)

tetrakainy poddanej działaniu temperatury (a, c) 50C przez 60 minut i (b, d) 60C przez 60 minut

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

46

Niezależnie od czasu działania promieniowania UVA (Rysunek 6 a, b) oraz zastosowanej temperatury ekspozycji (Rysunek 7 a, b) badanej tetrakainy parametr amplitudy linii EPR rośnie wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej. Świadczy to o szybkich procesach relaksacji typu spin-sieć zachodzących w testowanym leku. Podobne zależności obserwowano dla innych leków takich jak sisomycyna [24], tobramycyna [24], paromomycyna [24], chloramfenikol [30]

Również niezależnie do zastosowanego czasu ekspozycji na promieniowanie UVA (Rysunek 6 c, d) oraz zastosowaną temperaturę ekspozycji (Rysunek 7 c, d) tetrakainy parametr szerokości linii EPR wzrastał wraz ze wzrostem użytej mocy mikrofalowej. Świadczy to o jednorodnym rozmieszczeniu wolnych rodników w badanej próbce leku. Wskazuje to bezpośrednio, że czynnik fizyczny, któremu był poddawany lek działał w całej objętości próbki. Podobne wyniki zarejestrowano dla leków poddanych działaniu promieniowania ultrafioletowego tj. mocznika [21], kwasu salicylowego [21] i kwasów cholowych [22] oraz dla leków poddanych działaniu wysokiej temperatury tj. antybiotyków aminoglikozydowych [24], werapamilu [25], klarytromycyny [26], chloramfenikolu [27] i kwasu bornego [29].

W doświadczeniu z tetrakainą wykonano także ocenę kształtu widma EPR. Analizę tę wykonano w celu potwierdzenia złożoności układu wolnych rodników występu-jących w badanym leku, który był eksponowany na działanie promieniowania ultrafio-letowego oraz temperatury. Na Rysunku 8 przedstawiono wybrane parametry asymetrii (A1-A2, B1-B2) dla tetrakainy poddanej działaniu promieniowania ultrafioletowego 30 minut (Rysunek 8 a, b) oraz 60 minut (Rysunek 8 c, d). Na Rysunku 9 zostały przedstawione wybrane parametry asymetrii (A1-A2, B1-B2) dla tetrakainy poddanej przez 60 minut działaniu czynnika termicznego tj. 50ºC (Rysunek 9 a, b) oraz 60ºC (Rysunek 9 c, d).

Rysunek 8. Zależność parametrów: (a, c) A1-A2, oraz (b, d) B1-B2 widma EPR tetrakainy poddanej działaniu

promieniowaniu UVA przez (a, b) 30 minut i (c, d) 60 minut od mocy mikrofalowej (M). Mo ‒ maksymalna

moc mikrofalowa wytwarzana przez klistron (70mW)

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

47

Rysunek 9. Zależność parametrów: (a, c) A1-A2, oraz (b, d) B1-B2 widma EPR tetrakainy poddanej działaniu

temperatury (a, b) 50ºC przez 60 minut i (c, d) 60ºC przez 60 minut od mocy mikrofalowej (M).

Mo ‒ maksymalna moc mikrofalowa wytwarzana przez klistron (70mW)

Uzyskane wyniki analizy parametrów asymetrii linii EPR wskazują, że kształt

widma EPR zależy od użytej mocy mikrofalowej. Uzyskane zmiany wartości dla

mierzonych parametrów występujące wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej wskazują

na występowanie złożonego układu wolnych rodników w testowanych próbkach

tetrakainy. Złożony układ wolnorodnikowy obserwowano również dla innych

badanych leków poddanych działaniu promieniowania UV takich jak: mocznik [21],

kwasu salicylowego [21], kwas dehydrocholowego [22] i ursodeoksycholowego [22]

oraz leków poddanych działaniu czynnika termicznego takich jak: ampicylina [24],

werapamil [25], cefalkor [26], rosuwastatyna [28] i famotydyna [31].

5. Wnioski

Badania z wykorzystaniem spektroskopii elektronowego rezonansu paramag-

netycznego (EPR) wskazują, że:

Wolne rodniki nie są obecne w tetrakainie niepoddanej działaniu promieniowania

UVA oraz podwyższonej temperatury. Dla tej próbki nie rejestrowano widma

EPR.

Działanie promieniowania UVA przez 30 i 60 minut oraz 60 minut temperaturą

50ºC i 60ºC powoduje generowanie wolnych rodników w badanej próbce

tetrakainy. Dla tych próbek rejestrowane były widma EPR.

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

48

Wraz z wydłużeniem czasu działania promieniowania UVA na tetrakainę

obserwowano spadek koncentracji wolnych rodników oraz intensywności

integralnej w próbce.

Wraz ze wzrostem temperatury ekspozycji tetrakainy obserwowano spadek

koncentracji wolnych rodników i intensywności integralnej w próbce.

Testowane próbki tetrakiny podane działaniu promieniowania UVA oraz

temperatury charakteryzowały się: jednorodnym rozmieszczeniem wolnych

rodników w testowanych próbkach oraz szybkimi oddziaływaniami typu spin–sieć.

Przeprowadzone badania parametrów asymetrii linii EPR dowiodły złożonego

układu wolnych rodników w tetrakainie poddanej działaniu promieniowania

ultrafioletowego oraz podwyższonej temperatury.

Podziękowania

Badania były finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach.

Umowa statutowa nr. KNW-1-106/K/8/O.

Literatura

1. Podlewski J., Chwalibogowska-Podlewska A. Leki współczesnej terapii. Medaical

Tribune, Warszawa 2010.

2. Janiec W., Kompedium farmakologii. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006.

3. WHO model list of essential medicines 19th list. World Helth Organization, Genewa 2015.

4. Bartosz G., Druga twarz tlenu, Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo naukowe

PWN, Warszawa 2003.

5. Kaczmarek H., Sionkowska A. Wolne rodniki w chemii, biologii i medycynie. UMK,

Toruń 2013.

6. Jaroszyk F., Biofizyka, Podręcznik dla studentów. Wydawnictwo lekarskie PZWL,

Warszawa 2001.

7. Kęcki Z., Podstawy spektroskopii molekularnej. PWN, Warszawa 1999.

8. Stankowski J., Hilczer W., Wstęp do spektroskopii rezonansów magnetycznych. PWN,

Warszawa 2005.

9. Stankowski J., Zjawisko elektronowego rezonansu paramagnetycznego w:

Radiospektroskopia ciała stałego. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1975.

10. Stankowski J., Graja A., Wstęp do elektroniki kwantowej. Wydawnictwa Komunikacji i

Łączności, Warszawa 1972.

11. Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych. Farmacopea Polska wydanie XI, Polskie

Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa 2017.

12. Janicki S., Fiebig A., Sznitowska M. Farmacja Stosowana. Wydawnictwo Lekarskie

PZWL, Warszawa 2008.

13. http://galfarm.com.pl/files/upload/tetrakainy_chlorowodorek-aktualizacja.pdf

14. Kostowski W, Herman Z. Farmakologia. Podstawy farmakoterapii. Wydawnictwo

Lekarskie PZWL, Warszawa 2001.

15. Janiec W, Krupińska J. Farmakodynamika. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa

2002.

16. Zejca A, Gorczyca M. Chemia leków. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2009.

17. Kęcki Z. Podstawy spektroskopii molekularnej. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

1999.

18. Wertz JE, Bolton JR. Electron spin resonance: elementary theory and practical

applications. Chapman and Hall, New York, London 1986.

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR)

do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych rodników w tetrakainie

49

19. Stankowski J, Hilczer W. Wstęp do spektroskopii rezonansów magnetycznych.

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.

20. Eaton G R, Eaton SS, Salikhov KM. Foundations of modern EPR. World Scietific, World

Scientific, Singapore, New Jersey, London, Hong Kong 1998.

21. Ramos P, Pilawa B. Electron paramagnetic resonance examination of free radical

formation in salicylic acid and urea exposed to UV irradiation. Intern. J. Photoen. 2016,

Vol. 2016, ID 7235305; 1-7. DOI: 10.1155/2016/7235305.

22. Dołowy M., Ramos P, Pilawa B. Effect of UV irradiation and Temperature on Free

Radical Properites in Dehydrocholix and Ursodeoxycholic Acid: An EPR Study. Intern. J.

Photoen. 2014, Vol. 2014, ID 953619; 1-7. DOI: 10.1155/2014/953619.

23. Stanjek-Cichoracka A, Żegleń S, Ramos P, Pilawa B, Wojarski J. Effect of ultraviolet

irradiation on free radical scavenging activity of immunosuppressants used in lung

transplantation and comparative electron paramagnetic resonance study of kinetics of

their interactions with model free radicals. J. Clin. Pharm. Ther. 2018; 1-8. DOI:

10.1111/jcpt.12668.

24. Ramos P, Pilawa B, Krztoń A, Liszka B. Free radicals in the thermally sterilized

aminoglycoside antibiotics. Pharm. Analyt. Acta 2012, 3 (9); 1-13.

25. Ramos P, Pepliński P, Pilawa B. Free radicals in thermally sterilized verapamil. Eng.

Biomater. 2009,12 (89-91); 162-164.

26. Skowrońska A, Wojciechowski M, Ramos P, Pilawa B, Kruk D. ESR studies of

paramagnetic centers in pharmaceutical materials – cefaclor and clarithromycin as an

example. Acta Phys. Pol. A 2012, 121 (2); 514-517.

27. Ramos P, Pilawa B. Free radical formation in chloramphenicol heated at different

temperatures and the best thermal sterilization conditions – application of EPR

spectroscopy and UV spectrophotometry. Pharm. Dev. Technol. 2016; 1-9. DOI:

10.1080/10837450.2016.1265555.

28. Ramos P, Jarco S, Pepliński P, Pilawa B. Free radical formation in rosuvastatin during

thermal sterilization at different temperatures. Acta Pol. Pharm. Drug Research 2016, 73

(6); 1439-1446.

29. Ramos P, Pilawa B. Free radicals in thermally sterilized acidum boricum and optimization

of the process. Acta Pol. Pharm. Drug Research 2015, 72 (4); 683-689.

30. Ramos P, Pilawa B. Electron paramagnetic resonance study of thermally treated bismuth

subgallate. Bioinorg. Chem. Appl. 2014, Vol. 2014, ID 547032; 1-9. DOI:

10.1155/2014/547032.

31. Ramos P, Pilawa B, Stroka E. EPR studies of free radicals in thermally sterilized

famotidine. Nukleonika 2013, 58 (3); 413-418.

Zastosowanie spektroskopii Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego

(EPR) do oceny wpływu warunków przechowywania na powstawanie wolnych

rodników w tetrakainie

Streszczenie

Leki muszą być produkowane oraz przechowywane zgodnie z ich właściwościami fizyko-chemicznymi.

Podwyższona temperatura lub promieniowanie ultrafioletowe mogą powodować rozpad substancji

leczniczej w wyniku termolizy lub fotolizy. W leku takim mogą również powstawać wolne rodniki, które

mogą być odpowiedzialne za efekty toksyczne powstające w trakcie farmakoterapii. Celem pracy było

zbadanie wpływu podwyższonej temperatury oraz promieniowania UV na generowanie wolnych rodników

w tetrakainie. Do pomiarów zastosowano spektrometr elektronowego rezonansu paramagnetycznego

(EPR). W otrzymanych widmach EPR analizowano amplitudę (A), szerokość (Bpp) oraz intensywność

integralną (I) linii EPR. Przy zastosowaniu wzorców ultramaryny i kryształu rubinu wyznaczono

koncentrację (N) wolnych rodników w badanych próbkach. Analizie poddano również otrzymane

Mateusz Broncel, Adrian Matysek, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

50

parametry asymetrii linii EPR oraz wpływ mocy mikrofalowej na amplitudę i szerokość linii EPR.

Wykonane badania wykazały, że pod wpływem działania podwyższonej temperatury oraz promieniowania

UV w tetrakainie powstają wolne rodniki, które cechują się jednorodnym rozmieszczeniem w próbce

i złożonym charakterem.

Słowa kluczowe: tetrakaina, wolne rodniki, promieniowanie UV, podwyższona temperatura, spektroskopia

EPR

Applications of Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy to study

the effect of storage conditions on the formation of free radicals in tetracaine

Abstract

The drugs must be manufactured and stored in accordance with its physico-chemical properties. Higher

temperature or ultraviolet radiation can cause the disintegration of the drug substance as a result of

thermolysis or photolysis. In this drug, free radicals may also be formed. Free radicals may be responsible

for toxic effects during pharmacotherapy. The aim of the work was to investigate the influence of higher

temperature and UV radiation on the formation of free radicals in tetracaine. For the studies used the

electron paramagnetic resonance spectrometer (EPR). In the obtained EPR spectra were analyzed

amplitude (A), linewidth (Bpp) and integral intensity (I). The concentration (N) of free radicals was

determined using ultramarine and ruby crystal standards. The asymmetry parameters and the effect of

microwave power on the amplitude and linewidth of the EPR line were examined. The studies have shown

that under the influence of higher temperature and UV radiation in tetracaine free radicals are formed. Free

radicals characterized by homogeneous distribution in a sample and complex character.

Keywords: tetracaine, free radicals, UV irradiation, higher temperature, EPR spectroscopy

51

Adrian Matysek1,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis do badania

oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

1. Wstęp

Zgodnie z definicją WHO [1] zespół otępienny to „zespół objawów wywołany

chorobą mózgu, może mieć przebieg przewlekły lub postępujący, charakteryzujący się

klinicznie licznymi zaburzeniami wyższych funkcji korowych, takich jak pamięć,

myślenie, orientacja, rozumienie, liczenie, zdolność do uczenia się, język i ocena.

Ponadto zaburzeniom funkcji poznawczych często towarzyszą zaburzenia emocjo-

nalne, zaburzenia zachowania i motywacji”. Zespół otępienny w znacznie częściej

dotyka osób w wieku podeszłym niż młodszych [1].

Piracetam jest to lek poprawiający metabolizm komórek ośrodkowego układu

nerwowego (OUN) inaczej zwany jest też lekiem nootropowym [2-6]. Do grupy leków

nootropowych możemy zaliczyć również leki psychotoniczne, dynamizujące oraz

energizujące [4, 5]. Grupa leków nootropowych jest zróżnicowana pod względem

struktury chemicznej związków ją twożących oraz cechuje się odmiennym

mechanizmem działania. Wspólnym działaniem leków nootropowych jest poprawa

funkcji poznawczych, bez ośrodkowego działania stymulującego lub też z minimalnym

działaniem [4, 5]. Leki nootropowe w tym piracetam działają na metabolizm neuronów

[2, 4, 5]. Powodują m. in. zmniejszanie zapotrzebowania na tlen tkanki mózgowej,

poprawiają właściwości transportujące błony komórkowej, zwiększenie wykorzystanie

glukozy [2, 5]. Wszystkie te czynniki powodują poprawę sprawności funkcji

mózgowych, zwłaszcza w stanach zmniejszonej koncentracji, pamięci czy procesów

myślenia. Korzystnym wpływem leków nootropowych jest wzmożenie odporności

tkanki mózgowej na niekorzystne czynniki uszkadzające jak np. niedotlenienie, czy też

uszkodzenia mózgu [2, 4, 5]. Piracetam stosowany jest w zaburzeniach procesów

poznawczych w zespołach otępiennych z wyłączeniem choroby Alzheimera [2-6].

Mózg jest szczególnie wrażliwy na uszkodzenia oksydacyjne. Wpływa na to kilka

czynników, m.in. łatwo ulegające peroksydacji reszty wielonienasyconych kwasów

tłuszczowych, w które bogate są fosfolipidy mózgu. Natomiast mózg nie jest bogaty

w enzymy usuwające reaktywne formy tlenu, a zużywając dużo tlenu, uwalnia sporą

ilość anionorodnika ponadtlenkowego. Rodnik ten wytwarzany jest również przez

pełniące funkcje tkankowych makrofagów komórki mikrogleju. Wolne rodniki to

atomy lub cząsteczki posiadające niesparowane elektrony [7]. Wolne rodniki

charakteryzują się na ogół wysoką reaktywnością [7, 8, 10]. Przypuszcza się, że

wytwarzane reaktywne formy tlenu w mózgu mogą prowadzić do postępującego

obumierania neuronów podczas starzenia się organizmu [7-10]. Neurony są

1 Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski

Uniwersytet Medyczny w Katowicach, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec

* autor korespondencyjny, e-mail: adrian.matysek@med.sum.edu.pl

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

52

komórkami nie dzielącymi się, co oznacza, że śmierć neuronu stanowi nieodwracalne

uszkodzenie [7].

Reaktywne formy tlenu (RFT) oraz wolne rodniki odgrywają znaczną rolę

w powstawaniu wielu chorób [7-10]. Skuteczne w leczeniu i zapobieganiu chorób

wywołanych przez wolne rodniki są antyoksydanty [7, 9]. Antyoksydanty inaczej

zwane przeciwutleniaczami to niejednorodna chemicznie grupa związków. Mogą one

być pochodzenia naturalnego jak i syntetycznego. Antyoksydanty chronią organizm

przed szkodliwym działaniem utleniaczy (np. niektórych ksenobiotyków) oraz

negatywnym działaniem wolnych rodników [7, 9]. Są powszechnie uważane za środek

prewencyjny w zapobieganiu licznym chorobom, do których zaliczamy choroby

mózgu [7, 10].

2. Cel pracy

Celem pracy było poznanie zdolności piracetamu do oddziaływania z modelowym

wolnym rodnikiem DPPH. Dodatkowo poddano piracetam działaniu promieniowania

ultrafioletowego o długości fali z zakresu λ = 315-380 nm i zbadano jego zdolność do

oddziaływania z DPPH. Jako metodę badawczą zastosowano technikę spektro-

fotometrii UV-Vis.

3. Materia i metody

3.1. Piracetam – badany lek

Piracetam należy do grupy leków nootropowych czyli aktywujących procesy

poznawcze oraz ochronne ośrodkowego układu nerwowego [4, 5, 11-14]. Pod

względem chemicznym jest on pochodną pirolidonu [4, 14]. Wzór strukturalny

piracetamu pokazano na Rysunku 1 [14]. Mechanizm działania piracetamu nie jest

w pełni poznany [4, 5, 12]. Lek powoduje aktywację procesów metabolicznych

poprzez regulację przekaźnictwa w układzie cholinergicznym oraz glutaminergicznym

[4, 5, 13]. Dodatkowo piracetam zwiększa zużycie glukozy oraz tlenu przez tkankę

mózgową [4, 5]. Działa antyagreagacyjnie i poprawia reologię krwinek co ułatwia

przepływ krwi przez mózg [4, 5, 12]. Piracetam jest wskazany do stosowania

w zaburzeniach świadomości pochodzenia metabolicznego czyli np. w trakcie

rekonwalescencji po przebytym udarze mózgu, stanach zapalnych, urazach głowy oraz

operacjach neurochirurgicznych. Wskazany jest również w zaburzeniach ukrwienia

tkanki mózgu wynikającego z miażdżycy [4, 5]. Piracetam może być stosowany

w zaburzeniach pamięci w wieku podeszłym, zaburzeniach zachowania u dzieci oraz

w zespole abstynencji alkoholowej [4, 5, 11-14]. Piracetam jest stosunkowo

bezpiecznym lekiem, wśród działań niepożądanych obserwowanych po jego

zastosowaniu należą nudności, biegunki oraz wahania ciśnienia krwi [4, 5, 11-14].

Piracetam stosowany w eksperymencie został zakupiony w firmie Sigma-Aldrich.

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

53

NO

NH2

O

Rysunek 1. Wzór strukturalny piracetamu [14]

3.2. Warunki ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe piracetamu

Badana próbka piracetamu została poddana ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe przez okres 30 i 60 minut. Piracetam był poddany działaniu promieniowania z zakresu UVA czyli długość fali na którą była eksponowana próbka

wynosiła = 315-380 nm. Do naświetlania piracetamu zastosowano lampę UV Medisun 250 (Schulze & Bohm, Niemcy). Lampa ta wyposażona jest w 4 promienniki każdy o mocy 40 W. Próbkę naświetlano z odległości 30 cm od źródła światła.

3.3. Wolny rodnik DPPH

W pracy wykorzystano modelowy wolny rodnik DPPH [7, 15-17]. Wolny rodnik DPPH posiada w swojej budowie niesparowany elektron na atomie azotu (Rysunek 2) [15]. DPPH dobrze rozpuszcza się w metanolu oraz etanolu tworząc trwałe roztwory o zabarwieniu fioletowym. DPPH jest stosowany do badania zdolności oddziaływania próbek pochodzenia naturalnego oraz syntetycznego z wolnymi rodnikami. Modelowy wolny rodnik DPPH pod wpływem substancji o potencjalnych zdolnościach do oddziaływania z nim ulega redukcji i przyjmuje elektron w wyniku czego staje się diamagnetyczny [7, 15-17]. Za pomocą spektrofotometrii UV-Vis obserwujemy tę

zależność w postaci spadku wartości absorbancji przy długości fali wynoszącej = 515 nm. (Rysunek 1).

Rysunek 2. Wzór strukturalny [15] oraz widmo absorbancji metylowego roztworu wolnego rodnika DPPH

zarejestrowane w zakresie długości fali 450-650 nm. 515 nm - maksimum absorbancji dla którego mierzono

zmianę badanych próbek

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

54

3.4. Pomiar oddziaływania badanych próbek z DPPH za pomocą

spektrofotometrii UV-Vis

Zdolność do odziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH zbadano przy

użyciu spektrofotometrii UV-Vis Thermo GENESYS 10S (Thermo Scientific, USA).

Widma absorbancji wzorcowego wolnego rodnika DPPH oraz DPPH w kontakcie

z analizowaną próbką piracetamu były rejestrowane w zakresie długości fali

wynoszącym od 450 nm do 650 nm. Do rejestracji i analizy otrzymanych widm

absorbancji UV-Vis zastosowano oprogramowanie spektroskopowe VISIONlite

(Thermo Scientific, USA) oraz oprogramowania Origin 2015 (OriginLab, USA).

W doświadczeniu określano zmianę absorbancji przy długości fali λ = 515 nm [7, 15-17].

W doświadczeniu badano zdolność oddziaływania z wolnym rodnikiem DPPH

próbek piracetamu nie poddanego oraz poddanego działaniu promieniowania

ultrafioletowego. W tym celu dodawano do probówki zawierającej 2,5 ml metylowego

roztworu DPPH (0,5 mM) 20 mg piracetamu. DPPH oraz metanol zakupiono w firmie

Sigma-Aldrich. Masę piracetamu wyznaczano za pomocą wagi analitycznej CPA

(Sartorius, Niemcy). W dalszym etapie probówkę mieszano i przelewano do kuwety

pomiarowej o drodze optycznej wynoszącej 1 cm. Kuwetę umieszczano w gnieździe

pomiarowym spektrofotometru. Dla mierzonych próbek rejestrowano zmianę

absorbancji widma UV-Vis przy długości fali 515 nm w następujących przedziałach

czasowych: 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minucie. Taka rejestracja pozwoliła na

wyznaczenie kinetyki oddziaływania badanych próbek piracetamu z modelowym

wolnym rodnikiem DPPH. Dodatkowo przeprowadzono pomiar w tych samych

warunkach dla kwasu askorbinowego. Pomiar przeprowadzono w celu porównania

działania przeciwutleniającego piracetamu ze znanym antyoksydantem. W tym celu do

probówki zawierającej 2,5 ml metylowego roztworu DPPH (0,5 mM) dodano 20 mg

kwasu askorbinowego. Kwas askorbinowy zakupiono w firmie Sigma-Aldrich.

Następnie probówkę mieszano i przelano do kuwety pomiarowej. Kuwetę

umieszczono w spektrofotometrze i wykonywano pomiar absorbancji przy długości

fali 515 nm w interwałach czasowych takich jak dla piracetamu.

3.5. % inhibicji modelowego wolnego rodnika DPPH

W doświadczeniu wyznaczono korzystając ze wzoru (1) % inhibicji modelowego

wolnego rodnika DPPH dla badanych próbek piracetamu.

%inh. = (A0 – A /A0) x 100 (1)

Gdzie:

A0 – absorbancja wzorcowego wolnego rodnika DPPH

A – absorbancja próbki badanej oddziałującej z wolnym rodnikiem DPPH

% inhibicji przyjmuje większe wartości dla substancji, które wykazują silniejszą

zdolność do redukcji wolnego rodnika DPPH [17]. Parametr % inhibicji jest

parametrem odwrotnie proporcjonalny do parametru absorbancji zarejestrowanego dla

tej samej próbki.

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

55

4. Wyniki i dyskusja

Przeprowadzone w pracy analizy z wykorzystaniem modelowego wolnego rodnika

DPPH oraz piracetamu niepoddanego oraz poddanego 30 i 60 minutowej ekspozycji na

promieniowanie UVA wykazały, że lek poddany działaniu promieniowania ultrafio-

letowego traci zdolność do oddziaływania z wolnym rodnikiem DPPH (Rysunek 5, 7).

Z kolei lek wyjściowy czyli niepoddany ekspozycji na promieniowanie UV cechował

się minimalną zdolnością do redukcji wolnego rodnika DPPH (Rysunek 3). Wybrano

dwa pilotażowe czasy naświetlania 30 i 60 minut. Te same czasy były stosowane

wcześniej w pracy [18] do naświetlania leków dla których badano oddziaływanie

z wolnym rodnikiem DPPH.

Dla piracetamu wyjściowego zarejestrowano małe obniżenie wartości absorbancji

widma UV-Vis przy długości fali λ = 515 nm w porównaniu z absorbancją wzorca co

przedstawia Rysunek 3. Wskazuje to na zdolność do redukcji wolnego rodnika DPPH

piracetamu niepoddanego promieniowaniu ultrafioletowemu. Silniejszymi zdolnoś-

ciami do redukcji wolnego rodnika DPPH cechowały się leki z innych grup m.im.

rapamycyna [18], cyklosporyna A [18], takrolimus [18], analogi ludzkiej insuliny

długo i krótko działającej [19, 20] insuliny o pośredniej szybkości działania [21],

insuliny Insuman Comb 25 [22]. Również silniej redukowały wolny rodnik DPPH niż

piracetam próbki pochodzenia naturalnego takie jak propolis [23], ekstrakty z ziela

widłaka goździstego [24], ekstrakty z ziela rzepiku [25], ekstrakty z kwiatów

dziewanny drobnokwiatowej [26].

Navarro i współpracownicy [27] przy użyciu innych technik badawczych, takich

jak FRAP (metoda oznaczania zdolności redukowania jonów żelaza (III)), ABTS (sól

diamonowa 2,2’-azobis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonianu)) oraz oznaczaniu stężenia

glutationu, wykazali zdolność piracetamu do redukcji stresu oksydacyjnego

u szczurów. Również Verma i współpracownicy [28] wykazali, że komórki neuronalne

linii N2A traktowane piracetamem wykazywały znacznie mniejszą zdolność do

wytwarzania reaktywnych form tlenu.

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

56

Rysunek 3. (a) Widmo absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z piracetamem niepoddanym ekspozycji na

promieniowanie UVA zarejestrowane w przedziale długości fali 450-650 nm. (b) Widmo absorbancji UV-Vis

DPPH oddziałującego z piracetamem niepoddanym ekspozycji na promieniowanie UVA przedstawione

w zakresie absorbancji 1.07-1.18 [j. wzgl.]

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

57

Rysunek 4. Kinetyka oddziaływania DPPH z piracetamem niepoddanym ekspozycji na promieniowanie

UVA. Badana zmiana absorbancji przy długości fali λ = 515 nm mierzona w 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 i 30

minucie oddziaływania.

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

58

Rysunek 5. (a) Widmo absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z piracetamem poddanym ekspozycji na

promieniowanie UVA przez 30 minut zarejestrowane w przedziale długości fali 450-650 nm. (b) Widmo

absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z piracetamem poddanym ekspozycji na promieniowanie UVA

przez 30 minut przedstawione w zakresie absorbancji 1.07-1.18 [j. wzgl.]

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

59

Rysunek 6. (a) Widmo absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z chlorochiną poddanej działaniu

promieniowania UVA przez 30 minut. (b) Kinetyka oddziaływania DPPH z chlorochiną poddanej działaniu

promieniowania UVA przez 30 minut. Badana zmiana absorbancji przy długości fali λ = 515 nm mierzona

w 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minucie oddziaływania.

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

60

Rysunek 7. (a) Widmo absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z piracetamem poddanym ekspozycji na

promieniowanie UVA przez 60 minut zarejestrowane w przedziale długości fali 450-650 nm. (b) Widmo

absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z piracetamem poddanym ekspozycji na promieniowanie UVA

przez 60 minut przedstawione w zakresie absorbancji 1.05-1.17 [j. wzgl.]

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

61

Rysunek 8. (a) Widmo absorbancji UV-Vis DPPH oddziałującego z chlorochiną poddanej działaniu

promieniowania UVA przez 60 minut. (b) Kinetyka oddziaływania DPPH z chlorochiną poddanej działaniu

promieniowania UVA przez 60 minut. Badana zmiana absorbancji przy długości fali λ = 515 nm mierzona

w 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minucie oddziaływania

Piracetam wyjściowy cechował się niską zdolnością do oddziaływania z DPPH co

pokazuje zarejestrowane widmo absorbancji UV-Vis (Rysunek 3). Jednakże analizując

widma absorbancji UV-Vis piracetamu poddanego działaniu promieniowania UVA

zdolność do oddziaływania z modelowym wolnym rodnikiem DPPH praktycznie

całkowicie zanikła (Rysunek 6, 7). Prawdopodobnie za fakt ten odpowiada rozpad

cząsteczki piracetamu pod wpływem promieniowania ultrafioletowego w wyniku

fotolizy [29]. Rozpad cząsteczki leku pod wpływem UV może zmieniać jego

właściwości fizyko-chemiczne w wyniku czego piracetam ma zmniejszoną zdolność

do odziaływania z DPPH. Sahu i współpracownicy [30] zarejestrowali produkty

degradacji piracetamu poddając go działaniu różnych czynnikom fizyko-chemicznym.

Dla testowanego piracetamu rejestrowana była także kinetyka oddziaływania

z modelowym wolnym rodnikiem DPPH. Kinetykę dla leku wyjściowego oraz

poddanego działaniu promieniowania ultrafioletowego przedstawiono odpowiednio na

Rysunkach 4, 6, 8. Dla wszystkich badanych próbek piracetamu zastosowano te same

interwały czasu rejestracji widma absorbancji UV-Vis mianowicie 1, 3, 5, 10, 15, 20,

25 oraz 30 minut. Poddając analizie Rysunki 4, 6, 8 można stwierdzić, że absorbancja

badanych próbek ulega wraz z czasem oddziaływania z rodnikiem DPPH niewielkiemu

obniżeniu. Jednakże porównując Rysunek 4 przedstawiający oddziaływanie

piracetamu wyjściowego z DPPH z Rysunkami 5 i 8 przedstawiającymi oddziaływanie

piracetamu poddanego ekspozycji na promieniowanie UVA przez 30 i 60 minut

z DPPH, możemy zauważyć niższe wartości absorbancji w każdej minucie pomiaru dla

piracetamu wyjściowego. Świadczy to o zdolności leku niepoddanego działaniu

promieniowania ultrafioletowego do silniejszego oddziaływania z wolnym rodnikiem

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

62

DPPH niż leku poddanego działaniu promieniowania UV. Odwrotną zależność

zarejestrowano dla leków immunosupresyjnych [18]. W ich przypadku autorzy

wykazali, że działanie promieniowaniem UV powodowało zwiększenie oddziaływania

tych leków z wolnym rodnikiem DPPH.

Tabela 1. Zmiana absorbancji przy długości fali λ = 515 nm dla piracetamu niepoddanego oraz poddanego

promieniowaniu UVA przez 30, i 60 minut. Wartości dotyczą 30 minuty oddziaływania badanych próbek

leku z wolnym rodnikiem DPPH. Pomiary wykonane w temperaturze pokojowej

Badana

substancja

DPPH Piracetam

niepoddany

działaniu

UVA

Piracetam

poddany

działaniu UVA

przez 30 minut

Piracetam

poddany

działaniu

UVA przez

60 minut

Kwas

askorbinowy*

Absorbancja

[j. wzgl.]

1.161

1.118

1.154

1.156

0.113

% inhibicji

0

3,7

0,6

0,4

90,3

* Pomiar wykonany w tych samych warunkach co dla piracetamu. Kwas askorbinowy zakupiony w firmie

Sigma-Aldrich

Poddając analizie Tabelę 1 możemy zaobserwować, że w ostatniej 30 minucie

pomiaru silniejszym oddziaływaniem z DPPH cechuje się piracetam nieeksponowany

na promieniowanie ultrafioletowe. Z kolei działanie na piracetam promieniowaniem

UVA przez 30 i 60 minut powodowało obniżenie tych zdolności. Również czas

ekspozycji na promieniowanie UVA nie miał większego wpływu na wynik absorbancji

badanych próbek.

Obliczony w Tabeli 1 % inhibicji wolnego rodnika DPPH był największy dla leku

niepoddanego promieniowaniu UV. Dla porównania został wykonany eksperyment dla

kwasu askorbinowego, który był przeprowadzony w tych samych warunkach co

eksperyment z piracetamem. Można zauważyć, że % inhibicji wolnego rodnika DPPH

dla kwasu askorbinowego jest znacznie większy niż uzyskany dla piracetamu (Tabela

1). Wynika z tego, że właściwości do redukcji wolnego rodnika są znacznie większe

dla kwasu askorbinowego niż dla piracetamu. Należ jednak pamiętać, że zdolność do

redukcji wolnego rodnika DPPH przez piracetam nie jest jego priorytetowym

działaniem farmakologicznym. Można by rozważyć łączenie terapii z zastosowaniem

piracetamu z silnymi antyoksydantami w celu polepszenia efektu jego działania.

Podobny synergizm wykazali Alkuraishy i współpracownicy [31]. Udowodnili oni, że

podawanie piracetamu łącznie z wyciągiem z Ginkgo biloba, posiadającym duże

zdolności antyoksydacyjne [32, 33], powodowało polepszenie funkcji poznawczych

i psychomotorycznych w grupie pacjentów przyjmujących te preparaty łącznie

w porównaniu do grupy przyjmującej sam piracetam.

5. Wnioski

Badania z zastosowaniem spektrofotometrii UV-Vis pokazują, że:

Piracetam niepoddany promieniowaniu ultrafioletowemu cechuje się zdolnością

do oddziaływania w wolnym rodnikiem DPPH.

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

63

Poddanie piracetamu ekspozycji na promieniowanie z zakresu UVA powoduje

prawie całkowite zahamowanie zdolności do jego oddziaływania z wolnym

rodnikiem DPPH.

Nie zaleca się przechowywania piracetamu w dostępie do promieniowania

ultrafiletowego.

Wykazano przydatność spektrofotometrii UV-Vis do określenia wpływu

promieniwania ultrafioletowego na piracetam.

Podziękowania

Badania były finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach.

Umowa statutowa nr. KNW-1-106/K/8/O.

Literatura

1. Dementia – a public health priority. World Health Organization, Genewa 2012.

2. Główczewska-Siedleka E. Assessment of the prevalence of nootropic drugs by elderly

patients in geriatric practice. JSHS, 2017, 8; 1531-1539.

3. Slais K. Could piracetam potentiate behavioural effects of psychostimulants? Medical

Hypotheses, 2012, 79 (2), 216-218.

4. Janiec W. Kompendium farmakologii. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2012.

5. Kostowski W, Herman Z. Farmakologia. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa

2006.

6. Zavadenko NN, Suvorinova S. Therapeutic efficacy of nootropil different doses in

attention deficit hyperactivity disorder. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova, 2004, 104

(3), s. 32-7.

7. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004.

8. Jóźwiak Z, Bartosz G. Biofizyka. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.

9. Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. Free radicals, antioxidants and functional foods:

Impact on human health. Pharmacogn Rev. 2010, 4(8); 118-126.

10. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine 4th ed. Oxford

University Press, Oxford 2007.

11. Navaneethan G, Karunakaran K, Elango KP. Stability indicating and simultaneous

determination of cinnarizine and piracetam from capsule dosage form by reversed phase

light performance liquid chromatography. Ind. J. Chem. Technol. 2013, 20; 323-326.

12. Gokhale VS, Bhide SS, Jalgaonkar SV, Marathe PA, Mane Y, Khan FM, Rege NN.

Evaluatio of effect of piracetam in experimental models of depression. Int. J. Pharm. Sci.

Res. 2013, 4 (7); 2667-2672.

13. Kasteleijn-Nolst Trenite DGA, Marescaux C, Stodieck S, Edelbroek PM, Oosting J.

Photosensitive epilepsy: a model to study the effects of antiepileptic drugs. Evaluation of

the piracetam analogue, levetiracetam. Epilep. Res. 1996, 25; 225-230.

14. Zejca A, Gorczyca M. Chemia leków. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2009.

15. Tirzitis G., Bartosz G. Determination of antiradical and antioxidant activity: basic

principles and new insights. Acta Biochim. Pol. 2010, 57(2); 139-142.

16. Bondet V, Brand-Williams W, Berset C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity

using the DPPH free radical method. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 1997, 30; 609-615.

17. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenlpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. 2004, 2 (26); 211-219.

Adrian Matysek,Mateusz Broncel, Paweł Ramos, Barbara Pilawa

64

18. Stanjek-Cichoracka A, Żegleń S, Ramos P, Pilawa B, Wojarski J. Effect of ultraviolet

irradiation on free radical scavenging activity of immunosuppressants used in lung

transplantation and comparative electron paramagnetic resonance study of kinetics of

their interactions with model free radicals. J. Clin. Pharm. Therap. 2018; 43 (3); 385-392.

19. Komosińska-Vassev K, Olczyk P, Ramos P, Mencner Ł, Olczyk K, Pilawa B.

Antioxidative properties of human insulin reference material and rapid-acting and long-

acting insulin analog standards. Acta Pol. Pharm. Drug Research 2018, 75 (1); 33-40.

20. Olczyk P, Komosinska-Vassev K, Ramos P, Mencner Ł, Olczyk K, Pilawa B. Application

of electron paramagnetic resonance spectroscopy for examination of free radical

scavenging properties of insulin analogs. Acta Pol. Pharm. Drug Research 2015, 72 (6);

1133-1140.

21. Olczyk P, Komosinska-Vassev K, Ramos P, Mencner Ł, Olczyk K, Pilawa B. Interactions

of short-acting, intermediate-acting and pre-mixed human insulins with free radicals -

Comparative EPR examination. Intern. J. Pharm. 2015, 490 (1-2); 9-15.

22. Olczyk P, Komosinska-Vassev K, Ramos P, Olczyk K, Pilawa B. Interactions of Insuman

Comb 25 insulin with free radicals - kinetics examination by electron paramagnetic

resonance spectroscopy. Acta Pol. Pharm. Drug Research 2015, 72 (6); 1177-1181.

23. Komosińska-Vassev K, Olczyk P, Ramos P, Mencner Ł, Derkacz A, Waluga E, Krysik K,

Olczyk K, Pilawa B. The influence of storage temperature and UV-irradiation on free

radical scavenging properties of ethanolic extracts of propolis. Acta Pol. Pharm. Drug

Research 2017, 74 (6);1833-1840.

24. Stec M., Ramos P., Pilawa B. Spektroskopowa analiza porównawcza właściwości

antyoksydacyjnych ekstraktów z ziela widłaka goździstego (Lycopodium clavatum L.). Pol.

J. Cosmetol. 2017, 20 (1); 63-66.

25. Stec M., Ramos P., Pilawa B. Zastosowanie spektroskopii EPR do badania oddziaływania

ekstraktów z ziela rzepiku (Agrimoniae herba) z wolnymi rodnikami. Pol. J. Cosmetol.

2017, 20 (2); 153-157.

26. Stec M., Ramos P., Pilawa B. Wpływ promieniowania UV na zdolność wychwytywania

wolnych rodników przez ekstrakt wodny z kwaitów dziewanny drobnokwiatowej

(Verbascum thapsus L.). Pol. J. Cosmetol. 2017, 20 (2); 158-162.

27. Navarro SA, Serafin KGG, Mizokami SS, Hohmann MSN, Casagrade R, Verri Jr. WA.

Analgesic activity of piracetam: effect on cytokine production and oxidative stress.

Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 2013,105; 183-192.

28. Verma DK, Gupta S, Biswas J, Joshi N, Sivarama Raju K, Wahajuddin M, Singh S.

Metabolic enhancer piracetam attenuates the translocation of mitochondrion-specific

proteins of caspase-independent pathway, poly [ADP-ribose] polymerase 1 up-regulation

and oxidative DNA fragmentation. Neurox. Res. 2018, 34 (2); 198-219.

29. Hare CH. The degradation of of coatings by ultraviolet light and electromagnetic

radiation. J. Protect. Coat. Liv. 1992, 5; 1-4.

30. Sahu K, Siddiqui AA, Shaharyar M, Sahu S. Isolation, identification and characterization

of degradation product of piracetam using analytical techniques. Intern. J. Adv. Res.

Chem. Sci. 2014, 1 (7); 8-16.

31. V Alkuraishy HM, Algareeb AI, Albuhadilly K, Almgoter BM. Modulation effects of

piracetam and Ginkgo biloba on the cognitive and working memory functions:

psychometric study. J. Neurol. Neurophysiol. 2014, 5 (5); 1-6.

32. Zahradnikova L, Schmidt S, Sekretar S, Janac L. Determination of the antioxidant activity

of Ginkgo biloba leaves extract. J. Food Nutr. Res. 2007, 46 (1); 15-19.

33. Rojas C, Rojas-Castañeda J, Ruiz-Sánchez E, Montes P, Rojas P. Antioxidant properties of

a Ginkgo bilobae leaf extract (EGb 761) in animal models of alzheimer’s and parkinson’s

diseases. Curr. Top. Nutrace. Res. 2015, 13 (3); 105-120.

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis

do badania oddziaływania piracetamu z wolnym rodnikiem DPPH

65

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis do badania oddziaływania piracetamu

z wolnym rodnikiem DPPH

Streszczenie

Choroby neurodegeneracyjne to schorzenia mózgu cechujące się utratą funkcji intelektualnych oraz

poznawczych. Piracetam jest lekiem nootropowym stosowanym w chorobach otępiennych poza chorobą

Alzheimera. Mechanizm działania tego leku nie jest do końca poznany. Pomocne w łagodzeniu chorób

neurodegeneracyjnych mogą być substancje o charakterze antyoksydacyjnym. W pracy zbadano zdolność

piracetamu do neutralizacji modelowego wolnego rodnika DPPH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl).

Dodatkowo zbadano wpływ promieniowania UV te oddziaływania. Jako metodę badawczą wykorzystano

spektroskopię UV-Vis. Widma absorbancji UV-Vis DPPH oraz DPPH w kontakcie z lekiem rejestrowano

w temperaturze pokojowej w zakresie długości fali od 400 do 650 nm. Zmianę absorbancji badanych

próbek mierzono przy długości fali 515 nm. Uzyskane wyniki różniły się między sobą kinetyką oddzia-

ływania z DPPH. Piracetam po ekspozycji na promieniowanie UVA cechował się mniejszą zdolnością do

oddziaływania z wolnym rodnikiem DPPH.

Słowa kluczowe: piracetam, wolne rodniki, promieniowanie UV, spektrofotometria UV-Vis

Application of UV-Vis spectrophotometry to study the interaction of piracetam

with DPPH free radical

Abstract

The neurodegenerative diseases characterized by loss of intellectual and cognitive functions. Piracetam is

a nootropic drug used in dementia diseases besides Alzheimer's disease. The mechanism of action of this

drug is not fully understood. The antioxidant substances may be helpful in alleviating neurodegenerative

diseases. The study examined the ability of piracetam to neutralize the model of free radical DPPH (1,1’-

diphenylo-2-picrylhydrazyl). In addition, the influence of UV radiation on this properties was

measurements. As a research method was used UV-Vis spectroscopy. Absorbance spectra of UV-Vis

DPPH and DPPH in contact with the drug were recorded at room temperature in the wavelength range

from 400 to 650 nm. The change in the absorbance of the test samples was measured at a wavelength of

515 nm. The results obtained differed from each other with the kinetics of interaction with DPPH.

Piracetam after exposure to UVA radiation has decrease interaction with DPPH free radical.

Keywords: piracetam, free radicals, UV irradiation, UV-Vis spectrophotometry

66

Monika Budnicka1, Joanna Mazurek

2, Monika Szymaniak

3,

Agnieszka Gadomska-Gajadhur4

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych

implantów kości gąbczastej z polilaktydu

1. Wstęp

Inżynieria tkankowa jest interdyscyplinarną dziedziną składającą się z trzech gałęzi

nauk przyrodniczych, medycyny oraz inżynierii materiałowej. Pojęcie inżynierii

tkankowej pojawiło się pod koniec lat osiemdziesiątych XX wieku, jako alternatywa

stosowanych rozwiązań implantologii i transplantologii [1]. W 1993 roku chemik

Robert Langer oraz chirurg Joseph P. Vacanti opublikowali pracę dotyczącą wysiania

komórek tkanki chrzęstnej na rusztowaniach z poli-L-laktydu (PLLA) i kopolimeru

laktydu z glikolidem (PLGA). W pracy zaproponowano definicję inżynierii tkankowej

i tak zapoczątkowano dynamiczny rozwój tej dziedziny [2,3]

Utrata lub uszkodzenie narządu lub tkanki jest powszechnym i kosztownym

problemem w ludzkiej opiece zdrowotnej [4]. Wciąż rosnąca liczba zabiegów

transplantacyjnych doprowadziła do dużego zapotrzebowania na dawców tkanek.

Chociaż skuteczność autologicznych i allogenicznych przeszczepów są udowodnione,

nadal istnieje szereg problemów związanych z tymi zabiegami [5,6]. Jednym z nich

jest możliwość uszkodzenia tkanki w czasie transplantacji. Narządy pochodzenia

zwierzęcego mogą wywoływać problemy na tle immunologicznym bądź wykazywać

niezgodność. Dlatego to biozgodne metale, ceramika i polimery stały się przedmiotem

badań inżynierii tkankowej [2,7,8,9].

Inżynieria tkankowa stawia sobie za główny cel otrzymanie odpowiedniego

materiału biologicznego. Powinien zastępować, przywracać bądź podtrzymywać

podstawowe funkcje zniszczonych tkanek. Otrzymane rusztowanie powinno

przypominać tkankę naturalną pod względem struktury biochemicznej i właściwości

mechanicznych. Nośnik ten ma naśladować ludzką zewnątrzkomórkową macierz (ang.

extracellular matrix, ECM) oraz wspierać wzrost komórek [10]. Możliwe jest

pobudzenie ich wzrostu za pomocą zewnętrznych czynników biologicznych

ulokowanych w rusztowaniu. Takie działanie pobudza tworzenie i regenerację tkanek

wraz z unaczynieniem. Tak powstałe rusztowania są nadzieją dla osób po przebytych

chorobach nowotworowych (resekcjach) bądź złamaniach [11].

1 m.budnicka@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika

Warszawska 2 jtrzas@gmail.com, Polfa Tarchomin S. A. 3 monika.szymaniak.95@gmail.com, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny,

Politechnika Warszawska 4 agadomska@ch.pw.edu.pl, Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika

Warszawska

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

67

W skład odpowiedniego substytutu do regeneracji tkanki kostnej wchodzą:

rusztowanie (rys. 1a), komórki hodowane w środowisku in vitro (rys. 1b), różnego

rodzaju czynniki wzrostu, hormony, witaminy – z pożywek hodowlanych (rys. 1c).

Rysunek 6. Cykl inżynierii tkankowej [opracowanie własne]

Typowy cykl inżynierii tkankowej składa się z kilku etapów (rys. 1):

1. Izolacja komórek macierzystych z ludzkiego ciała.

2. Hodowla komórkowa w celu proliferacji komórek.

3. Wysianie komórek na porowatym rusztowaniu i umieszczenie w nim czynników

wzrostu/hormonów.

4. Kontynuacja hodowli w celu namnożenia komórek i pełnej regeneracji tkanki.

5. Wszczepienie nowopowstałej tkanki w organizm ludzki w miejsce ubytku.

Zaprojektowanie implantu jest procesem wieloczynnikowym, począwszy od

wyboru materiału, przez ustalenie warunków formowania, w celu osiągnięcia

wymogów narzucanych rusztowaniom dedykowanym odpowiedniej tkance [12-14].

2. Cel pracy

Celem badań własnych było otrzymanie porowatego, biodegradowalnego ruszto-

wania komórkowego z polilaktydu pełniącego funkcję rusztowania kostnego. Warunki

stawiane implantom kości to porowatość otwarta przekraczająca 90% (mikro- oraz

makroporowatość). Pory wzajemnie ze sobą połączone, o minimalnej średnicy

wynoszącej około 100 µm (najbardziej pożądane w zakresie 100-300 µm). Taka

struktura umożliwia prawidłowy wzrost i komunikację komórek wraz z dostarczaniem

do nich substancji odżywczych i odprowadzaniem metabolitów. Pożądane jest, aby

otrzymany implant miał strukturę wewnętrzną pozwalającą na wtłoczenie maksy-

malnej objętości osocza bogatopłytkowego, dostarczającego czynników wzrostu nowej

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

68

kości. Do wytwarzania porowatych implantów kości gąbczastej zastosowano metodę

inwersji faz z wariantem freeze extraction [15-17]. Jest to metoda pozwalająca

otrzymać rusztowania o zróżnicowanej i odpowiedniej wielkości porów oraz

stosunkowo dobrej elastyczności. Jako materiał do wytworzenia implantu użyto poli-

L-laktyd, ze względu na jego biozgodność, biodegradowalność i dobre właściwości

mechaniczne.

3. Materiały i metody

W badaniach użyto poli-L-laktydu (PLLA) o Mn 86 000 g/mol, D = 1.91 (Nature

Works NW 2003D). Użytymi rozpuszczalnikami były: 1,4-dioksan (cz.d.a. POCh SA),

metanol (techniczny BUTRA), 2-propanol (cz.d.a. Chempur), etanol bezwodny

(cz.d.a.). Wodę destylowaną otrzymano we własnym zakresie.

3.1. Przygotowanie roztworów implantotwórczych

Roztwory PLLA w 1,4-dioksanie o stężeniu 3, 5 i 7%wag otrzymano poprzez

rozpuszczanie polimeru przez 24 h w rozpuszczalniku organicznym (1,4-dioksan).

Podczas rozpuszczania PLLA w rozpuszczalniku zapewniono ciągłe mieszanie,

ogrzewając mieszaninę do 60ºC przez pierwsze 3 h. Roztwory zawierające porofor

(wodę) otrzymano w analogiczny sposób. Następnie po całkowitym rozpuszczeniu

PLLA i ogrzaniu roztworu do 60ºC dodawano porofor w stosunku objętościowym

porofor : roztwór PLLA w 1,4-dioksanie 0,03; 0.05; 0,08. Po dodaniu porofora,

mieszanie kontynuowano aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny.

3.2. Otrzymanie substytutów kości

Rusztowania komórkowe dla tkanki gąbczastej otrzymywano metodą inwersji faz,

z wariantem freeze-extraction. Sporządzone roztwory PLLA w 1,4-dioksanie

z poroforem bądź bez niego wylewano do form w ustalonej temperaturze (27, 37

i 47ºC) i zamrażano w -18ºC przez 25h. Po zamrożeniu próbki umieszczano w kąpieli

żelującej (metanolu), w celu koagulacji polimeru. Żelowanie prowadzono w tempera-

turze -18ºC przez 5 dni, bez mieszania. Kolejno substytuty umieszczano w kąpieli

płuczącej (wodzie destylowanej). Kąpiel płuczącą prowadzono w temperaturze poko-

jowej, około 3 h. Przy czym kąpiel płuczącą mieszano z szybkością 150 obr/min.

Finalnie substytuty suszono na powietrzu przez 24h. Otrzymane rusztowania miały

kształt walca o średnicy 2,4 cm i wysokości w zakresie 2,4-2,8 cm.

3.3. Metody analityczne

3.3.1. Morfologia rusztowań

Morfologię otrzymanych rusztowań badano przy pomocy dwóch skaningowych

mikroskopów elektronowych: Phenom ProX (ThermoFisher Scientific, Holandia) oraz

Hitachi TM-1000 (Hitachi High-Technologies Corporation, Japonia) wraz z napylarką

K550X (Quorum Technologies, Wielka Brytania). Z odpowiednich stref rusztowania

pobierano próbki o wymiarach: długość 3-4 mm, szerokość 6-7 mm, wysokość 1-2 mm.

Próbki przygotowywano do badań na dwa sposoby. Pierwszy sposób: próbki cięto

z użyciem skalpela na sucho. Drugi sposób: próbki nasycano bezwodnym etanolem

przez 20 minut. Następnie zamrażano w ciekłym azocie i łamano w odpowiednich

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

69

strefach. Po wysuszeniu fragmentów rusztowania na powietrzu, odcinano mniejsze

kawałki do badania SEM przy pomocy skalpela tak, by badana część była po łamaniu

w ciekłym azocie, a nie po odcięciu.

Badania z użyciem aparatu Phenom ProX: przygotowane fragmenty próbek

umieszczano w przystawce do próbek nieprzewodzących (brak konieczności

napylania). Za pomocą dedykowanego oprogramowania rejestrowano obrazy przy

powiększeniu 300x i 600x, stosując napięcie przyspieszające 10 kV.

Badania z wykorzystaniem aparatu Hitachi TM-1000: przygotowane fragmenty

próbek umieszczano w napylarce K550X Sputter Coater. Napylano warstwę złota o

grubości zawierającej się w przedziale 7-10 nm. Za pomocą dedykowanego

oprogramowania rejestrowano obrazy przy powiększeniu 300x i 600x, stosując

napięcie przyspieszające 15 kV.

3.3.2. Porowatość otwarta i nasiąkliwość masowa

Badanie przeprowadzono na całych implantach z użyciem wagi Mettler Toledo XS

104. Porowatość otwartą (Po) i nasiąkliwość masową (Nm) implantów wyznaczono

ważąc suche rusztowania na powietrzu (ms). Następnie próbki nasączano

w izopropanolu w warunkach próżni przez 30 minut. Rusztowania po nasączaniu

ważono w cieczy (izopropanolu) (mww). Ostatecznie ważono mokry implant na

powietrzu (mw). Porowatość otwartą i nasiąkliwość masową wyznaczono ze wzorów 1, 2:

%100

www

swo

mm

mmP

(1)

%100

s

swm

m

mmN

(2)

gdzie: Po – porowatość otwarta, Nm – nasiąkliwość masowa, ms – masa suchego

rusztowania ważonego na powietrzu, mww – masa rusztowania po nasączaniu

w izopropanolu, ważonego w izopropanolu, mw – masa rusztowania po nasączaniu

w izopropanolu, ważonego na powietrzu.

4. Wyniki badań i omówienie

4.1. Wpływ przygotowania próbki do badania SEM na morfologię

rusztowań

Postanowiono sprawdzić, czy sposób przygotowania próbki do badania SEM

wpływa na morfologię uzyskiwanych rusztowań. W tym celu próbki przygotowano na

dwa sposoby: poprzez cięcie skalpelem suchych próbek oraz łamanie próbek w stanie

zamrożenia w ciekłym azocie. Jedynie implanty o stężeniu 3%wag PLLA/1,4-dioksan

były podatne na cięcie skalpelem na sucho, dlatego też na ich przykładzie

przedstawiono różnice badanych powierzchni (Rysunek 7).

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

70

SKALPEL ŁAMANIE

Rysunek 7. Morfologia rusztowania otrzymanego z 3%wag roztworu PLLA/dioksan

o temperaturze wylewania 27°C. Próbki o zmiennym stosunku porofor : roztwór PLLA/dioksan i różnych

sposobach przygotowania: a, c – stosunek odpowiednio 0,05; 0,08 (cięcie skalpelem); b, d – stosunek

odpowiednio 0,05; 0,08 (łamanie po zamrożeniu w ciekłym azocie); powiększenie 300x.

Nie zauważono znaczących różnic w kształcie porów czy regularności ich

rozmieszczenia. Jednakże próbki cięte skalpelem (rys. 2 a,c) charakteryzują się porami

bardziej „pochylonymi”. Nie obserwuje się regularności w kącie nachylenia ścian

porów, co nie występuje w przypadku próbek zamrażanych i łamanych (rys. 2 b,d).

Analiza wnętrza próbki może być obarczona błędnymi wnioskami. Z powodu braku

znaczących różnic można stosować oba sposoby przygotowania próbki. Jednak ze

względu na pochylenie struktury przy cięciu skalpelem, należy stosować jedną

wybraną metodę do porównywania serii próbek.

4.2. Różnice w morfologii wyznaczonych obszarów próbki

Sprawdzono, czy istnieją znaczne różnice w morfologii rusztowań w zależności od

obszaru implantu. Do badań wybrano następujące obszary rusztowania: spód, bok,

przekrój poziomy i przekrój pionowy (rys. 3).

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

71

Rysunek 8. Morfologia rusztowania otrzymanego z 7%wag roztworu PLLA/dioksan,

o stosunku porofor : roztwór PLLA/dioksan 0,08, temperaturze wylewania 47°C. Przedstawiono różne

obszary implantu: a – spód, b – bok, c – przekrój poziomy, d – przekrój pionowy; powiększenie 300x.

Pory znajdujące się na spodzie i z boku próbki posiadają średnicę rzadko

przekraczającą 100 µm. Struktura charakteryzuje się w większym stopniu mikroporo-

watością. W przewadze występują pory o kształcie kulistym, o równomiernym

rozmieszczeniu. Zakres średnic porów na spodzie to 10-120 µm, natomiast z boku

10-150 µm.

Morfologia warstw wewnętrznych cechuje się mikro- i makroporowatością,

z porami otwartymi osiągającymi średnicę nawet ponad 500 µm. Średni rozmiar porów

znajduje się w zakresie: 150–200 µm (pełny zakres: 25-500 µm). W dużym stopniu

pory mają kształt owalny, często bardzo wydłużony i są nieregularnie rozmieszczone.

Na żadnym z zamieszczonych obrazów nie zaobserwowano warstwy naskórkowej.

W przypadku rusztowań kostnych pożądaną cechą jest porowatość otwarta

przekraczająca 90% oraz powierzchnie charakteryzujące się makroporowatością (pory

o wielkości powyżej 100 μm) oraz mikroporowatością (pory o wielkości do ok.100

μm).

Otrzymany układ porów jest właściwy dla prawidłowego namnażania komórek

kościotwórczych, jak i dla migracji składników odżywczych i metabolitów.

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

72

4.3. Różnice w morfologii powierzchni wewnątrz próbek na 2/3 i 1/3 wysokości

Otrzymane implanty kostne przejawiały różnice w morfologii wybranych stref rusztowania. Najbardziej obiecujący rozmiar porów i ich rozmieszczenie występował w warstwach wewnętrznych próbki. Sprawdzono, czy obserwowane są zmiany w przypadku warstw wewnętrznych próbki na różnych jej wysokościach. Informacje te mogą być istotne w momencie wtłaczania osocza bogatopłytkowego do próbek. Różna struktura na innych wysokościach wnętrza implantu mogłaby zaburzyć proces wtłaczania osocza np. w wyniku obecności litych powierzchni.

W tym celu przebadano rusztowanie otrzymane z roztworu PLLA/dioksan o stężeniu wagowym 3%wag, bez dodatku porofora i temperaturze wylewania roztworu do form 27°C. Próbkę podzielono do badań SEM na trzy części. Morfologię powierzchni znajdujących się na 2/3 i 1/3 wysokości implantu zaprezentowano na rys. 4.

1/3 wysokości 2/3 wysokości

Prz

ekró

j pozi

om

y

Prz

ekró

j pio

now

y

Rysunek 9. Morfologia rusztowania otrzymanego z 3%wag roztworu PLLA/dioksan, bez porofora i w temperaturze wylewania 27°C, na różnych jego wysokościach: a, b – przekrój poziomy (odpowiednio 1/3

i 2/3 wysokości); c, d – przekrój pionowy (odpowiednio 1/3 i 2/3 wysokości); powiększenie 300x.

W zbadanych fragmentach na różnych wysokościach próbki w przekroju poziomym nie zaobserwowano dużego zróżnicowania morfologii (rys 4 a,b). Pory charakteryzowały się podłużnym, owalnym kształtem. W przypadku przekroju pionowego (rys. 4 c,d) obie powierzchnie wykazują jednakowe cechy. Zauważalne jest „drabinkowe” ułożenie porów oraz znaczne ich wydłużenie wraz ze zbliżonym zakresem średnic porów. Badania wskazały na brak różnic w morfologii próbki na różnych jej wysokościach. Natomiast morfologia implantu różni się w zależności od

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

73

przekroju. Dlatego do porównywania morfologii próbek należy wybierać jeden z przekrojów.

Szczegółowy opis powstałych porów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 4. Charakterystyka porów występujących we fragmentach rusztowania, zgodnego z Rysunkiem 4

Nr Średni zakres średnicy porów [µm]

Kształt porów Regularność rozmieszczenia

4a 50–230 owalny

regularny (ułożone obok siebie długie pory)

4b 70–330

4c 80–230 owalnokulisty

nieregularny, struktura „drabinkowa”

4d 100–250

Następnie zbadano wpływ trzech istotnych parametrów procesu otrzymywania polilaktydowych implantów kostnych: stężenia roztworu PLLA/dioksan, zawartość porofora, temperatura wylewania na morfologię otrzymywanych rusztowań.

4.4. Wpływ stężenia wagowego PLLA/1,4-dioksan i objętości porofora na morfologię rusztowań przy stałej temperaturze wylewania

Morfologia rusztowań ulega zmianom w przypadku obecności oraz braku porofora przy zmiennym stężeniu wagowym PLLA/1,4-dioksan i tej samej temperaturze wylewania roztworu do form. Różnice przedstawiono na rysunku 5.

Rysunek 10. Morfologia rusztowań PLLA z przekroju pionowego: a–c bez dodatku porofora, d–f z dodatkiem porofora w stosunku do roztworu PLLA/dioksan 0,08; stężenie PLLA/ dioksan: a, d – 3%wag; b, e – 5%wag; c, f

– 7%wag, temperatura wylewania 27°C; powiększenie 300x

W przypadku próbek bez porofora (rys. 5a-c) wraz ze wzrostem stężenia wielkość średnicy porów maleje. Obserwowana jest tu głównie makroporowatość i charakterystyczne drabinkowe ułożenie porów. W przypadku próbek z poroforem (rys. 5d–f) nie ma wyraźnej tendencji do zmniejszania się średnicy porów. Zaobser-wowano tu pożądaną makro- i mikroporowatość struktury. Największe zróżnicowanie wielkości porów wykazuje próbka o stężeniu 5%wag PLLA/1,4-dioksan z dodatkiem porofora w stosunku do roztworu PLLA/dioksan 0,08 (rys. 5e). Rozmiar porów w każdym z wyróżnionych przypadków był odpowiedni dla implantologii kostnej (rozmiar porów przekraczał 100 µm). Natomiast najbardziej odpowiednie warunki do

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

74

wysiewu tkanek przejawiają próbki przedstawione na rys. 5d-f. Szczegółowy opis powstałych porów przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 5. Charakterystyka porów występujących we fragmentach rusztowań, zgodnych z rysunkiem 5.

Nr Średni zakres średnicy porów [µm]

Kształt porów Regularność rozmieszczenia

5a 110–250 owalny

nieregularny, przejawiający się charakter struktury „drabinkowej”

5b 100–330

5c 50–270 kulisty

5d 50–330

5e 25–330 kulistowalny

nieregularny, mikro- i makroporowatość 5f 30–240

4.5. Wpływ dodatku porofora na morfologię rusztowań

Zaobserwowano różnice w morfologii przekroju pionowego wraz ze zmianą zawartości porofora w roztworze PLLA/dioksan przy stałym stężeniu PLLA i tej samej temperaturze wylewania roztworów do form. Różnice te zilustrowano na obrazach SEM czterech różnych rusztowań i ich fragmentów z przekroju pionowego (rys. 6). Rusztowania otrzymano z roztworu PLLA/1,4-dioksan o stężeniu wagowym 5% z różnym dodatkiem porofora w stosunku objętościowym do roztworu PLLA/dioksan: 0, 0,03, 0,08, 1. Temperatura wylewania roztworów do form była stała (27°C).

Rysunek 11. Morfologia rusztowania PLLA z przekroju pionowego próbki otrzymanej

z roztworu o stężeniu wagowym PLLA/1,4-dioksan 5%wag, gdzie stosunek objętościowy porofor/roztwór

PLLA w dioksanie wynosił: a – 0, b – 0,03, c – 0,08, d – 0,1, temperatura wylewania 27°C,

300x powiększenie

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

75

Jedynie struktura rusztowania bez dodatku porofora (rys. 6 a) cechowała się drabinkowym ułożeniem porów, makroporowatością i dużym rozmiarem porów przekraczającym 300 µm. Pozostałe struktury (rys. 6 b-d) zawierały makro- i mikropory, ze średnicą porów nie przekraczającą 200 µm. W przypadku rys. 6d mikroporowatość zaczyna zanikać (widoczne bardzo małe pory zamknięte). Najbardziej optymalne warunki do implantologii kostnej przejawiają próbki przedstawione na rys 6 b, c.

Szczegółowy opis powstałych porów przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 6. Charakterystyka porów występujących we fragmentach rusztowań, zgodnych z rysunkiem 6

Nr Średni zakres średnicy porów [µm]

Kształt porów Regularność rozmieszczenia

6a 100–330 owalny

nieregularny, przejawiający się charakter struktury ,,drabinkowej”

6b 25–210 kulisty regularny, makro- i mikroporowatość

6c 20–330 kulisty nieregularny, makro- i mikroporowatość

6d 36–240 kulisty regularny, makro- i mikroporowatość

4.6. Wpływ temperatury wylewania do form na morfologię rusztowań

Sprawdzono, czy zmiana temperatury wylewania roztworu implantotwórczego do form wpływa na morfologię implantów. Zbadano morfologię rusztowań o zawartości porofora w stosunku objętościowym do roztworu PLLA/dioksan 0,08. Temperatury wylewanych roztworów wynosiły 27 i 47°C. Porównano wpływ temperatury przy dwóch różnych stężeniach roztworu PLLA/dioksan: 3 i 7%wag (rys. 7).

Rysunek 12. Morfologia rusztowań PLLA z przekroju pionowego o stałym stosunku objętościowym porofor/ roztwór PLLA w dioksanie 0,08. Temperatura wylewania: a,c -27°C, b,d - 47°C. Stężenie wagowe roztworu

PLLA/dioksan: a,b - 3%wag , c, d – 7%wag; 300x powiększenie

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

76

W rusztowaniach otrzymanych z 3%wag roztworu PLLA/1,4-dioksan (rys. 7 a,b) wraz ze wzrostem temperatury wylewania obserwuje się wzrost stopnia występowania mikroporów. Rozmiar makroporów nie ulega zmianie. Z kolei dla rusztowań powstałych z roztworów o 7% stężeniu wagowym PLLA/1,4-dioksan (rys 7 c, d) wzrost temperatury wylewania nie prowadzi do znaczących różnic w morfologii.

Szczegółowy opis powstałych porów przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 7. Charakterystyka porów fragmentów rusztowań, zgodnych z rysunkiem 7

Nr Średni zakres średnicy porów [µm]

Kształt porów Regularność rozmieszczenia

7a 30–240 owalny (makropory)

nieregularny, mikro- i makroporowatość

7b 15–300

kulisty (mikropory)

nieregularny, bardzo zauważalna mikro- i makroporowatość (przewaga mikroporowatości)

7c 17–270

7d 15–300 nieregularny, mikro- i makroporowatość

4.7. Badanie porowatości i nasiąkliwości

Zbadano porowatość otwartą i nasiąkliwość masową otrzymanych rusztowań metodą hydrostatyczną. Jako ciecz zastosowano nierozpuszczalnik PLLA – izopropanol (iPrOH). Z punktu widzenia wysiewu tkanek, nasiąkliwość masowa jest istotnym parametrem. Bez jej znajomości nie można przewidzieć, jaką ilość osocza bogato-płytkowego można wtłoczyć do otrzymanego rusztowania. Określenie porowatości otwartej ma znaczenie ze względu na prawidłowy rozwój komórek wewnątrz rusztowania. Dla tkanki kostnej powinna przekraczać 90%.

Wyniki i charakterystykę wybranych próbek, zawarto w Tabeli 5. Gęstość użytego iPrOH wynosiła 0,785–0,787 g/cm

3.

Tabela 8. Charakterystyka wybranych próbek z wyznaczoną porowatością otwartą i nasiąkliwością względem iPrOH

Nr Masa suchej [g]

Masa mokrej w cieczy [g]

Masa mokrej na powietrzu [g]

Porowatość [%]

Nasiąkliwość[%]

1 0,40 0,17 6,27 96,2 1454

2 1,13 0,40 8,32 90,8 636

3 0,54 0,23 8,71 96,3 1507

4 1,12 0,39 7,50 89,8 569

5 1,14 0,48 9,04 92,3 692

6 1,17 0,47 8,52 91,4 631

7 0,87 0,37 9,19 94,3 951

8 0,90 0,37 9,39 94,1 939

9 0,51 0,22 8,97 96,8 1668

10 0,56 0,24 8,37 96,1 1408

11 0,89 0,34 8,96 93,5 903

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

77

Wyniki porowatości otwartej zawierały się w przedziale 89,8–96,2% (średnia

arytmetyczna = 93,8%). Są to wartości bardzo obiecujące, gdyż średnia porowatość

przekracza 90%. Wyniki nasiąkliwości masowej zawierały się w przedziale 569-

1668% (średnia arytmetyczna = 1032%). Wyniki wskazują na to, że istnieje możliwość

wtłoczenia osocza bogatopłytkowego do implantu średnio o ponad 10 razy większej

masie niż masa implantu.

Na podstawie obrazów SEM porównano morfologię próbek o skrajnych

wartościach porowatości otwartej i nasiąkliwości masowej wobec iPrOH (rysunek 8).

Największa porowatość i nasiąkliwość cechowała rusztowanie otrzymane z 3%wag

roztworu PLLA/dioksan, o stosunku porofor/roztwór PLLA w dioksanie 0,08,

temperaturze wylewania 47°C (odpowiednio 96,8%; 1668%). Najmniejsza

nasiąkliwość i porowatość cechowała rusztowanie otrzymane z i 7%wag roztworu

PLLA/dioksan, o stosunku porofor/roztwór PLLA w dioksanie 0,03, w temperaturze

wylewania 27°C (odpowiednio 89,8%; 569%).

Rysunek 13. Morfologia rusztowań PLLA o największej (a) i najmniejszej (b) porowatości otwartej oraz

nasiąkliwości masowej, otrzymanych odpowiednio z: a - 3%wag roztworu PLLA/1,4-dioksan; o stosunku

porofor/ roztwór PLLA w dioksanie 0,08, temperaturze wylewania = 47°C; b - 7%wag, o stosunku porofor/

roztwór PLLA w dioksanie 0,03, temperaturze wylewania 27°C.

Z powyższych obrazów SEM wynika, że rusztowania o większych rozmiarach

porów charakteryzują się większą porowatością otwartą, jak i nasiąkliwością masową.

Obrazy SEM są adekwatne z badaniami porowatości i nasiąkliwości przeprowa-

dzonymi z nierozpuszczalnikiem polimeru

5. Wnioski

Biodegradowalne, porowate rusztowania są coraz częściej poszukiwanym wyjściem

w implantologii kostnej. PLLA, dzięki korzystnym właściwościom fizyko-

chemicznym dla zastosowań jako nośnik tkanki kostnej, został wykorzystany jako

materiał tworzący rusztowanie komórkowe.

Z szerokiego wachlarza znanych metod otrzymywania rusztowań kostnych,

zdecydowano się na wykorzystanie inwersji faz z wariantem freeze-extraction. Dzięki

niej udało się otrzymać rusztowania o potencjalnym zastosowaniu w inżynierii

tkankowej.

Monika Budnicka, Joanna Mazurek, Monika Szymaniak, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

78

Opracowano proces otrzymywania porowatych polilaktydowych implantów

kostnych. Stwierdzono, że struktura i rozmiar porów ulegają zmianom przy zmianie

stężenia wagowego użytego roztworu PLLA/1,4-dioksan i zmianie zawartości

porofora. Najwyższa otrzymana porowatość otrzymywanych rusztowań wynosiła 96%,

zaś nasiąkliwość 1668%. Morfologia wewnętrzna implantów cechowała się mikro-

i makroporowatością, a rozmiar porów zawierał się w zakresie 10–560 µm (średnio

150–200 µm). Próbki uzyskane z roztworu o niższym stężeniu wagowym

PLLA/dioksan, charakteryzowały się wyższą porowatością otwartą i nasiąkliwością

masową, niż próbki uzyskane z roztworu o wyższym stężeniu wagowym PLLA.

Zastosowanie większej objętości porofora i wyższej temperatury wylewania w wielu

przypadkach powiększa wartość porowatości i nasiąkliwości. Rusztowania o takich

właściwościach spełniają warunki do użytku w implantacji kostnej.

Praca została sfinansowana ze środków Wydziału Chemicznego Politechniki

Warszawskiej.

Literatura

1. M. Dziadek, K. Cholewa-Kowalska, Acta Bio-Optica et Informatica Medica, Inżynieria

Biomedyczna, 20, 2014, s.193-203.

2. HY. Mi, X. Jing, LS. Turng, J Cell Plast, 51, 2005, s.165-196.

3. R. Langer, JP. Vacanti, Science, 260, 1993, s.920-926.

4. Goulet, J. A.; Senunas, L.E.; DeSilva, G.L.; Greenfield, M. L. Clin, Orthop, 339, 1997,

s.76-81.

5. Avera S.P., Stampleg W.A., McAllister B.S. Histologic and clinical observation of

resorbable and non resorbable barrier membranes used in maxillary sinus graft

containment, The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants., 12, 1997,

s. 88-90.

6. Blanco J.K., Alcanso A., Sanz M. Long term results and survival rate of implants treated

with guided bone regeneration: a 5 year cases series prospective study. Clinical Oral

Implants Research., 16, 2005, s. 294-301.

7. Ishaug SL, Crane GM, Miller MJ, Yasko AW, Yaszemski MJ, Mikos AG. Bone formation

by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds. J

BiomedMater Res, 36, 1997, s.17-28.

8. Pretzl B., Kim T.S., Holle R., Eickholz P. Long-term results of guided tissue regeneration

therapy with non-resorbable and bioabsorbable barriers. A case series of infrabony

defects after 10 years, Journal of Periodontology., 79, 2008, s. 1491-1499.

9. Fugazzotto P.A. GBR using borine bone matrix and resorbable and non resorbable

membrane. Part 2: clinical results, The International Journal of Periodontics and

Restorative Dentistry., 23, 2003, s. 599-605.

10. Bianco P., Gehron Robey P. Regeneration of two-dimensional (skin) and three-

dimensional (bone) tissues using stem cells, Nature., 414, 2001, s. 118-121.

11. M. Grolik, Zeszyty Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ. Nauki Ścisłe, 3, 2011,

s. 33-41.

12. M. Budnicka, A. Gadomska-Gajadhur, P. Ruśkowski; Wytwarzanie polimerowych

substytutów kości; Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o., 2017, s. 147-161.

13. Ma P.X. Scaffolds for tissue fabrication, Materials Today., 7, 2004, s. 30-40.

14. Ikada Y., Tsuji H. Biodegradable polyesters for medical and ecological applications,

Macromolecules. Rapid Communication., 21, 2000, s. 117-132.

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej z polilaktydu

79

15. Budyanto L., Goh Y.Q., Ooi C.P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds

for tissue engineering using liquid–liquid phase separation and freeze extraction, Journal

of Material Sciences: Materials in Medicine., 20, 2009, s. 105-111.

16. Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Chwojnowski A., Synoradzki L.

Otrzymywanie polilaktydowych rusztowań komórkowych o strukturze gąbczastej

– badania wstępne i optymalizacja, Polimery., 62, 2017, s. 118-126.

17. Buzarovska A., Gualandi C., Parrilli A., Scandola M. Effect of TiO2 nanoparticle loading

on Poly(L-lactic acid) porous scaffolds fabricated by TIPS, Composites Part B., 81, 2015,

s. 189-195.

Otrzymywanie porowatych, biodegradowalnych implantów kości gąbczastej

z polilaktydu

Streszczenie

Dynamiczny rozwój inżynierii tkankowej zapoczątkowany w latach 90-tych XX w wieku przyczynił się

m.in. do ewolucji w implantologii kostnej. Jednym z trendów naukowych w leczeniu kości jest

zastosowanie porowatych, biodegradowalnych implantów kostnych. W niniejszej pracy przedstawiono

doświadczalne wyniki otrzymywania trójwymiarowych, poli-L-laktydowych implantów kości gąbczastej.

Jako metodę otrzymywania zastosowano inwersję faz z wariantem freeze extraction. Zbadano wpływ

stężenia polilaktydu w rozpuszczalniku organicznym, zawartości porofora (wody), temperatury wylewa-

nego roztworu na porowatość otwartą i nasiąkliwość masową otrzymywanych implantów. Otrzymane

materiały są obiecującym nośnikiem dla osocza bogatopłytkowego, które ma wspomagać leczenie

defektów kostnych.

Słowa kluczowe: inżynieria tkankowa, medycyna regeneracyjna, polimerowe implanty kostne.

Preparation of polylactide, porous implants for cancellous bone regeneration

Abstract

Dynamic evolution of tissue engineering was initiated in the 90s of the twentieth century. It contributed,

among others to the evolution of bone implantology. One of the scientific trends in the treatment of bones

is the use of porous, biodegradable bone implants. This paper presents experimental results of obtaining

three-dimensional, poly-L-lactide sponge bone implants. The phase inversion with the freeze extraction

variant was used as the preparation method. The effect of polylactide concentration in organic solvent,

porophore (water) content, temperature of poured solution on open porosity and mass absorption of the

obtained implants was investigated. The obtained materials are a promising carriers for the platelet-rich

plasma, which is intended to support the treatment of bone defects.

Keywords: tissue engineering, regenerative medicine, polymer bone implants.

80

Katarzyna Karolewska1, Katarzyna Paraszkiewicz

2, Beata Sadowska

3

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego

emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis może

służyć jako środek do dezynfekcji?

1. Wprowadzenie

Dezynfekcja jest jedną z doraźnych lub ciągłych procedur wykonywanych głównie

w miejscach pracy, takich jak placówki usług medycznych i kosmetycznych, zakłady

przemysłu spożywczego, laboratoria diagnostyczne czy naukowe, w celach

dekontaminacji przedmiotów, urządzeń, powierzchni użytkowych bądź rąk. Precyzując

nieco definicję dezynfekcji, jest ona rozumiana jako proces eliminacji większości form

wegetatywnych drobnoustrojów z różnego rodzaju powierzchni. W miejscu dezynfe-

kowanym mogą natomiast pozostawać spory bakterii, zarodniki grzybów oraz inne

odporne na warunki środowiskowe formy drobnoustrojów. Dodatkowo istnieje wiele

czynników wpływających na obniżenie skuteczności procesu dezynfekcji, w tym

złożona topografia oczyszczanej powierzchni (powierzchnia nierówna, matowa,

porowata lub zawierająca niedostępne dla środków dezynfekcyjnych fragmenty),

kontaminacja powierzchni związkami organicznymi (często pochodzenia ludzkiego lub

zwierzęcego, np.: surowicą, krwią, białkami) czy tworzenie na powierzchniach

biofilmu przez mikroorganizmy kolonizujące/zanieczyszczające. Sposoby dezynfekcji

są klasyfikowane w zależności od: skuteczności i spektrum działania, używanej

metody (np.: termiczna, chemiczna) czy czasu potrzebnego do aktywnego zadziałania.

Wybór metody jest uzależniony od dezynfekowanej powierzchni (tzn. jej wielkości,

materiału z jakiego jest wykonana lub czym pokryta, wytrzymałości, przeznaczenia

itp.), częstości kontaktu i stopnia narażenia na zanieczyszczenie oraz spodziewanej

liczby drobnoustrojów, a także od dostępnych w danej instytucji środków (w tym

finansowych). Mimo wielu możliwych wariantów, do najczęściej stosowanych drezyn-

fektantów wciąż należą preparaty chemiczne, np.: preparaty na bazie alkoholu, związki

fenolowe, związki chloru, aldehydy, czwartorzędowe związki amoniowe czy preparaty

wzbogacone o nanocząstki srebra. Środki te mogą stanowić zagrożenie tak samo dla

ludzkiego zdrowia, jak i dla środowiska. Wynika to poniekąd z nieumiejętnego ich

zastosowania (pomijanie zaleceń producenta) oraz z oszczędności w kosztach

poniesionych na ich zakup. Użycie w nadmiernym stopniu lub nierozcieńczonych

środków chemicznych do dezynfekcji może skutkować ich akumulacją w środowisku

i w konsekwencji jego długoletnim skażeniem (środki te nie są łatwo biodegra-

1 katarzyna.karolewska@unilodz.eu, Pracownia Biologii Zakażeń, Katedra Immunologii i Biologii

Infekcyjnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl 2 katarzyna.paraszkiewicz@biol.uni.lodz.pl, Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Wydział

Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl 3 beata.sadowska@biol.uni.lodz.pl, Pracownia Biologii Zakażeń, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej,

Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis

może służyć jako środek do dezynfekcji?

81

dowalne). Z kolei użycie środków chemicznych w nadmiernym rozcieńczeniu nie

będzie prowadziło do efektywnego usuwania drobnoustrojów, wręcz przeciwnie

– może skutkować wystąpieniem u nich mutacji genowych i przyczynić się do

pogłębienia zjawiska lekooporności. Dodatkowo może dochodzić do zagrożenia

w sposób pośredni ludzkiego zdrowia, zarówno osób wykonujących dezynfekcję

powierzchni, jak i innych, na co dzień z nich korzystających. Jest to prawdopodobne ze

względu na ekspozycję ciała ludzkiego na składniki chemiczne, a także ich toksyczne

produkty uboczne (np.: amoniak, etanoloamina, związki fenolowe, lotne związki

chloru czy eter glikolu etylenowego). Środki dezynfekujące mogą drażnić układ

oddechowy i podrażniać skórę, znajdują się również na liście wiodących alergenów

człowieka. Szczególnie wysoką cytotoksycznością odznaczają się preparaty w stanie

nierozcieńczonym [1, 2]. Warto więc zadać pytanie: Co mogłoby je zastąpić i sprostać

usunięciu z powierzchni drobnoustrojów stanowiących zagrożenie, pozwalając

jednocześnie na osiągnięcie bezpieczeństwa biologicznego? Wychodząc naprzeciw

potrzebom ludzkim oraz konieczności ograniczenia narażania środowiska naturalnego

na toksyczne działanie dezynfektantów chemicznych podjęliśmy badania nad

poszukiwaniem alternatywnych rozwiązań do wykorzystania w rutynowych zabiegach

higienicznych powierzchni przez próbę stworzenia środka sanityzująco-dezynfek-

cyjnego składającego się z naturalnych składników bioaktywnych.

2. Założenia i cel badań

Poszukiwanie bezpieczniejszych produktów do dezynfekcji powinno skupiać się na

dokładnym określeniu wrażliwości drobnoustrojów na ich działanie, uwzględniając

występowanie zarówno form planktonicznych, jak i trudniejszych do eradykacji form

osiadłych (biofilmów). Kolejne kryteria, jakie powinno się wziąć pod uwagę to:

stopień dodatkowego zanieczyszczenia powierzchni innymi substancjami biologicznymi

oraz bezpieczeństwo preparatu dla komórek eukariotycznych. Wysoką aktywnością

przeciwdrobnoustrojową wyróżniają się lotne produkty metabolizmu wtórnego roślin

– olejki eteryczne [3-5]. Są one produkowane w różnych częściach roślin, zależnie od

gatunku producenta i stanowią unikatowe mieszaniny związków chemicznych z grupy

terpenów, alkoholi, polifenoli, eterów, ketonów i in., co determinuje ich odczuwalny

zapach oraz inne właściwości chemiczne i biologiczne. Do roślin leczniczych i ziół

wydzielających olejki eteryczne należą m.in.: oregano, rozmaryn, szałwia, imbir, gałka

muszkatołowa czy goździk. Olejki eteryczne charakteryzuje zwykle szerokie spektrum

działania bójczego wynikające z aktywności biologicznej związków wchodzących

w ich skład [3-6]. Jednakże ze względu na ich właściwości fizykochemiczne

i biologiczne, tj. duża lotność, a co za tym idzie stosunkowo krótki czas ekspozycji

zanieczyszczonej powierzchni, słaba rozpuszczalność czy wysoka cytotoksyczność dla

komórek eukariotycznych, nie mogłyby zostać użyte jako samodzielne środki do

dezynfekcji. Dotychczasowe rozwiązania problemu przylegania lotnych składników

preparatu biobójczego do powierzchni sugerują możliwość emulsyfikacji chemicznymi

surfaktantami czyli środkami powierzchniowo czynnymi zdolnymi do obniżania

napięcia międzyfazowego [7]. Tymczasem istnieją również surfaktanty pochodzenia

biologicznego, produkowane najliczniej przez bakterie i drożdże, ale również

w mniejszym stopniu przez rośliny i zwierzęta. Noszą one nazwę biosurfaktantów i ze

Katarzyna Karolewska, Katarzyna Paraszkiewicz, Beata Sadowska

82

względu na niższą toksyczność są bardziej bezpieczne dla organizmu człowieka

i środowiska niż ich syntetyczne odpowiedniki [7-9]. Celem prezentowanych badań

była próba opracowania sanityzująco-dezynfekcyjnej mikroemulsji w pełni opartej na

naturalnych składnikach: olejku eterycznym goździkowca korzennego (Syzygium

aromaticum) i biosurfaktantach niechorobotwórczych bakterii Bacillus subtilis

wyizolowanych z przesączy pohodowlanych tych drobnoustrojów.

3. Materiały i metody

3.1. Mikroorganizmy

Do badań wykorzystano szczepy referencyjne Staphylococcus aureus ATCC 29213

i Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, będące własnością Katedry Immunologii

i Biologii Infekcyjnej Uniwersytetu Łódzkiego. Zawiesiny wyjściowe bakterii

w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) (BTL, Polska) z dodatkiem 15% (v/v)

glicerolu przechowywano w stanie zamrożenia w temperaturze -80°C, zaś kultury

wyjściowe na podłożu agarowym TSA w +4°C.

3.2. Linie komórkowe

Fibroblasty ludzkie linii HFF-1 ATCC-SCRC-1041 (LGC Standard Sp zo.o.,

Polska), hodowano w podłożu DMEM (Biowest, USA) z dodatkiem 15% (v/v)

płodowej surowicy bydlęcej (FCS) (Biowest, USA) i antybiotyków (penicylina

i streptomycyna, 1%; Biological Industries, USA).

3.3. Składniki badanego preparatu

Do stworzenia testowego środka do dezynfekcji powierzchni (zwanego dalej

mikroemulsją, ME) użyto olejku goździkowego z pąków (O) (Pollena Aroma, Polska)

oraz odpowiednio jednego z trzech biosurfaktantów Bacillus subtilis I’1a (S1, S2, S3)

pozyskanego we współpracy z Katedrą Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii

Uniwersytetu Łódzkiego lub komercyjnie dostępnego preparatu surfaktyny B. subtilis

(S3523, Sigma-Aldrich, Polska). Opis metodyczny uzyskiwania biosurfaktantów został

przedstawiony w pracy Moryl i wsp. (2015) [9]. Uzyskane przesącze pohodowlane

B. subtilis I’1a przebadano w celu określenia składu chemicznego. Każdy z biosurfak-

tantów zawierał składniki aktywne, tj. surfaktyna i ituryna, jednak występowały one

w różnych ilościach. Preparat komercyjny surfaktyny B. subtilis został włączony do

badań jako związek referencyjny. Olejek eteryczny goździkowca korzennego był

przechowywany w temperaturze +4°C, natomiast biosurfaktanty B. subtilis I’1a

i komercyjna surfaktyna B. subtilis przetrzymywane były w stanie zamrożenia

w temperaturze -20°C.

3.4. Ocena minimalnego stężenia hamującego wzrost drobnoustrojów

(MIC) i bakteriobójczego (MBC) składników ME.

Parametry te zostały oznaczone dla szczepów referencyjnych S. aureus ATCC

29213 i S. epidermidis ATCC 12228. Do oceny MIC wykorzystano metodę mikroroz-

cieńczeń w bulionie Mueller-Hinton (M-H) (Graso Biotech, Polska). W tym celu

przygotowywano zawiesiny gronkowców o gęstości 5x106 CFU/ml i dodawano (1:1,

w objętości 100 µl) do szeregów dwukrotnych rozcieńczeń olejku goździkowego (O)

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis

może służyć jako środek do dezynfekcji?

83

i biosurfaktantów B. subtilis I’1a (S1-S3). Zakres badanych stężeń dla O wynosił

0,024-3,12%, a dla S1-S3 0,78-25%. Równocześnie przygotowywano odpowiednie

kontrole: dodatnią (zawiesina bakterii w podłożu M-H), ujemną (samo podłoże M-H)

i czystości preparatu (O lub S1-S3 w podłożu M-H). Po 24-godzinnej inkubacji

w temp. 37°C oceniano wizualnie wzrost drobnoustrojów (zmętnienie) i największe

rozcieńczenie preparatu, w którym nie było już widocznego wzrostu uznawano za

MIC. Następnie wysiewano liniowo po 10 µl prób na podłoże TSA i po kolejnych 24

godz. inkubacji w takich samych warunkach odczytywano minimalne stężenie

bakteriobójcze (MBC) badanych substancji.

3.5. Ocena cytotoksyczności metodą redukcji MTT

Cytotoksyczność preparatów O, S1-S3 oceniano in vitro na komórkach linii HFF-1

ATCC-SCRC-1041.W płytkach hodowlanych 96-studzienkowych prowadzono

hodowle komórek (1x105

kom/studzienkę, 24 godz., 37°C, 5% CO2), w celu

utworzenia ich monowarstwy. Następnie usuwano stare podłoże hodowlane, do

komórek zaś dodawano świeżego podłoża i roztwory preparatów badanych w zakresie

stężeń ostatecznych: 0,024-3,12% (O) lub 0,098-12,5% (S1-S3) po uprzednim

przesączeniu przez filtry bakteriologiczne o średnicy porów 0,22µm (Merck, Niemcy).

Po 24 godz. inkubacji w warunkach jw. komórki płukano w buforowanym fosforanami

fizjologicznym roztworze soli (PBS) (Biowest, USA). Następnie do komórek

dodawano 100 µl świeżego podłoża hodowlanego oraz 50 µl roztworu MTT (Merck,

Niemcy) o stężeniu 1,5 mg/ml. Komórki z MTT inkubowano 2 godz. w 37°C

w ciemności. W celu rozpuszczenia powstałych kryształów formazanu do studzienek

dodawano 100 µl 20% siarczanu dodecylu sodu (SDS) w mieszaninie 1:1 dimetylo-

formamidu (DMF) z wodą (H2O) i pozostawiono przez noc na kołysce. Następnie

mierzono absorbancję prób przy długości fali 550 nm na wielofunkcyjnym czytniku

Victor 2 (Wallac, Finlandia) i w oparciu o uzyskane wyniki obliczano procent

żywotności komórek w próbach badanych (traktowanych O lub S1-S3) w porównaniu

do żywotności komórek w próbie kontrolnej (komórki w samym podłożu hodowlanym)

uznanej za 100%. Z równań krzywych zależności żywotności komórek od stężeń

preparatów obliczono również ich wartości IC50. Wykonano dwa niezależne

powtórzenia doświadczenia.

3.6. Ocena działania badanych preparatów na tworzenie biofilmu przez

S. aureus na powierzchniach abiotycznych

Do badań wybrano nośniki o średnicy 5 mm, reprezentujące zarówno powierzchnie

porowate: nośniki wykonane z heparynizowanego polietylenu, jak i nieporowate:

nośniki szklane – szkiełko nakrywkowe. Przed użyciem do badań nośniki szklane

poddano autoklawowaniu, a nośniki z heparynizowanego polietylenu sterylizowano

w etanolu (70%, 5 min.) i płukano w PBS oraz wodzie do iniekcji (3) zgodnie

z procedurą B. Sadowskiej. Tworzenie biofilmu przez S. aureus ATCC 29213 na

powierzchni nośników oceniono przy użyciu metody redukcji TTC (Merck, Niemcy)

i testu LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen,

USA). Na tym etapie do badań, oprócz wcześniej wspomnianych trzech biosurfak-

tantów, włączono preparat komercyjny surfaktyny B. subtilis (S4). Po wstępnej ocenie

Katarzyna Karolewska, Katarzyna Paraszkiewicz, Beata Sadowska

84

MIC, MBC oraz cytotoksyczności preparatów względem komórek linii HFF-1 do

dalszych badań stosowano preparaty w następujących stężeniach subinhibicyjnych:

0,02% olejek goździkowy; 1% S1-S3; 0,025% S4. Z preparatów wykonano cztery ME:

O+S1; O+S2; O+S3; O+S4 (oba składniki w stosunku 1:1). Przygotowywano

zawiesinę bakterii o gęstości optycznej OD=0,6 w podłożu TSB z dodatkiem 0,25%

(v/v) glukozy (TSB/Glu). Nośniki (w dwóch powtórzeniach dla każdego układu)

umieszczano w studzienkach płytek polistyrenowych 96-dołkowych (Corning, USA)

zawierających: 100 µl samodzielnych preparatów badanych (O, S1-S3) lub mikro-

emulsji (OS1, OS2, OS3, OS4) i 100 µl zawiesiny z drobnoustrojów. Kontrola

dodatnia zawierała 100 µl zawiesiny bakterii i 100 µl TSB/Glu, a kontrola ujemna 200

µl podłoża TSB/Glu. Próby inkubowano w warunkach statycznych przez 24 godz.

W temp. 37°C. Następnie nośniki kolejno płukano w PBS w celu usunięcia niezwitą-

zanych bakterii. Jeden zestaw nośników barwiono TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetra-

zoliowy), by uwidocznić biofilm S. aureus tworzący się na ich powierzchni. W tym

celu nośniki umieszczano w 2 ml TSB z dodatkiem 20 µl 1% TTC i inkubowano 24

godz. w 37°C. Czynne metabolicznie bakterie związane z powierzchnią nośników

redukowały TTC do barwnego produktu – formazanu, co było możliwe do oceny

wzrokowo. Z drugiego zestawu nośników odzyskiwano drobnoustroje (sonikacja 5

min.) i oceniano ilościowo wykorzystując test LIVE/DEAD BacLight Bacterial

Viability Kit zgodnie z zaleceniami producenta. Na podstawie wartości fluorescencji

prób mierzonych przy długościach fal: em. 485 nm/530 nm, ex. 485 nm/620 nm, na

wielofunkcyjnym czytniku Victor 2 (Wallac, Finlandia) obliczano procent biomasy

biofilmu odzyskanej z powierzchni nośników inkubowanych z bakteriami w obecności

badanych preparatów w stosunku do biomasy biofilmu kontrolnego (tworzącego się na

nośnikach inkubowanych z bakteriami w samym podłożu hodowlanym) uznanej za

100%. Wykonano dwa niezależne powtórzenia doświadczenia.

4. Wyniki

Ocena MIC, MBC i cytotoksyczności preparatów. Wyniki MIC i MBC badanych

preparatów dla referencyjnych szczepów gronkowców zestawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Ocena minimalnego stężenia hamującego wzrost drobnoustrojów (MIC) i minimalnego stężenia

bójczego (MBC) badanych preparatów wobec gronkowców

S. aureus ATCC 29213 S. epidermidis ATCC 12228

[%] O S1 S2 S3 O S1 S2 S3

MIC 1,56 >25 6,25 25 0,78 25 6,25 12,5/25

MBC 3,12 >25 12,5 25 1,56 >25 12,5 12,5/25

Źródło: opracowanie własne

Fibroblasty po 24-godzinnej ekspozycji na działanie preparatów barwiono MTT,

a następnie mierzono spektrofotometrycznie wartość absorbancji prób przy długości

fali 550 nm. Uzyskane wyniki posłużyły do obliczenia żywotności komórek linii HFF-

1 [%] w próbach badanych (traktowanych O lub S1-S3) w porównaniu do żywotności

komórek w próbie kontrolnej (komórki w samym podłożu hodowlanym) uznanej za

100%, którą przedstawiono w Tabeli 2.

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis

może służyć jako środek do dezynfekcji?

85

Tabela 2. Żywotność fibroblastów ludzkich linii HFF-1 po ekspozycji na działanie preparatów badanych,

wyrażona jako procent w stosunku do kontroli wzrostu komórek nietraktowanych

Stężenie

O [%] 3,12 1,56 0,78 0,39 0,195 0,098 0,049 0,024

XO [%] 8,2 5,6 5,1 4,7 25,4 100 100 100

6,3 5,7 4,7 5,1 25,9 100 100 100

Stężenie

S1-S3

[%]

12,5

6,25

3,12

1,56

0,78

0,39

0,195

0,098

XS1 [%] 5,6 5,3 46,6 100 100 100 100 100

5,0 19,7 91,2 91,6 96,8 100 85,4 100

XS2 [%] 6,4 5,6 5,6 10,1 80,8 95,8 96,5 100

5,4 5,1 5,5 13,5 81,1 91,4 95,7 98,6

XS3 [%] 6,4 81,7 83,7 85,7 93,1 96,6 95,4 92,7

7,0 76,8 79,4 79,2 83,4 94,5 91,5 99,5

XO/S1/S2/S3 – żywotność komórek w preparatach, kolejno: O, S1, S2, S3, podana w procentach

Źródło: Opracowanie własne

Następnie określono aktywność cytotoksyczną testowanych związków, obliczając

wartość IC50 czyli stężenie preparatu powodujące 50% spadek żywotności komórek po

ekspozycji na badany preparat w odniesieniu do komórek kontrolnych. Uzyskane

wartości IC50 zestawiono w Tabeli 3.

Tabela 3. Aktywność cytotoksyczna badanych preparatów w stosunku do fibroblastów ludzkich linii HFF-1

[%] O S1 S2 S3

IC50 0,02 3,68 1,45 7,62

0,02 6,03 1,44 7,26

śr. IC50 0,02 4,85 1,44 7,44

Źródło: Opracowanie własne

Dzięki określeniu MIC i MBC, a następnie wartości IC50 dla komórek eukario-

tycznych dla O, S1-S3 możliwe było ustalenie subinhibicyjnych stężeń preparatów

zastosowanych w dalszych badaniach ich właściwości przeciwbiofilmowych.

Działanie preparatów na tworzenie biofilmu przez S. aureus na powierzchniach

abiotycznych. Wygląd nośników z utworzonym biofilmem po barwieniu TTC

oceniano wzrokowo. Uzyskane wyniki przedstawiono na Rysunku1.

Katarzyna Karolewska, Katarzyna Paraszkiewicz, Beata Sadowska

86

Rys. 1. Ocena tworzenia biofilmu S. aureus ATCC 29213 na nośnikach metodą redukcji TTC: a) schemat

rozmieszczenia nośników w studzienkach płytek 24-dołkowych, b) biofilm S. aureus ATCC 29213 powstały

na nośnikach z heparynizowanego polietylenu, c) biofilm S. aureus ATCC 29213 utworzony na nośnikach

szklanych, d) biofilm S. aureus ATCC 29213 na nośnikach szklanych po przedłużonym do 24 godzin okresie

oceny redukcji TTC [opracowanie własne]

Wyniki dotyczące tworzenia się biofilmu S. aureus ATCC 29213 na powierzchni

nośników szklanych i nośników z heparynizowanego polietylenu (H-PE) w obecności

badanych preparatów (olejku, biosurfaktantów i mikroemulsji) przedstawiono w Tabeli

4. W przypadku nośników szklanych nie stwierdzono istotnego wpływu samego

olejku, biosurfaktantu S2 i S4 oraz mikroemulsji OS3 na tworzenie biofilmu gron-

kowców. Niepokojące zjawisko zaobserwowano natomiast w przypadku biosurfak-

tantów S1 i S3, w obecności których nastąpił, odpowiednio ponad 2-krotny i 4-krotny

przyrost biomasy biofilmu gronkowców w porównaniu do biofilmu kontrolnego.

Nasilenie tworzenia biofilmu, choć nie tak intensywne, jak w przypadku samych

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis

może służyć jako środek do dezynfekcji?

87

biosurfaktantów, zanotowano również w obecności mikroemulsji OS1, OS2 i OS4

(Tab. 4). Co ciekawe, mimo silnie stymulującej tworzenie biofilmu gronkowców

aktywności biosurfaktantu S3, mikroemulsja na bazie tego preparatu z olejkiem

goździkowym (OS3) nie wykazywała takich właściwości.

Tabela 4. Tworzenia biofilmu S. aureus ATCC 29213 na powierzchni nośników szklanych i nośników

z heparynizowanego polietylenu (H-PE) w obecności badanych preparatów, oceniane przy użyciu testu

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit

Biofilm [%] O S1 S2 S3 S4 OS1 OS2 OS3 OS4

nośnik

szklany 102 266 101 412 100 151 214 103 172

nośnik H-PE 128 102 101 107 99 94 101 102 102

Źródło: opracowanie własne

Natomiast w przypadku nośników z heparynizowanego polietylenu, poza samym

olejkiem, nie stwierdzono istotnego wpływu badanych preparatów na biomasę

tworzącego się biofilmu gronkowców (Tab. 4). Tym samym nie można przypisać

badanym preparatom (zarówno samodzielnym, jak i utworzonym mikroemulsjom)

zakładanej wcześniej aktywności dezynfekcyjnej i przeciwbiofilmowej, mimo

wykazanej w składzie uzyskanych biosurfaktantów B. subtilis obecności aktywnych

biologicznie składników, takich jak surfaktyna czy ituryna.

5. Wnioski

Składniki mikroemulsji oraz gotowa ME nie hamowały tworzenia biofilmu S.

aureus na badanych nośnikach. Obserwowano nawet nasilenie tworzenia biofilmu na

nośnikach szklanych. Ze względu na stosunkowo wysoką cytotoksyczność oraz brak

skuteczności hamowania wzrostu S. aureus przygotowane preparaty (w każdej

uzyskanej wersji) nie mogą być uznane za środek do dezynfekcji powierzchni skażonej

gronkowcami.

Uwagi ogólne/Podziękowania

Badania finansowane ze Studenckiego Grantu Badawczego 2018 dla K. Karolewskiej

przyznanego przez Rektora UŁ. Podziękowania dla dr hab. Przemysława Bernata,

prof. UŁ z Katedry Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Wydziału Biologii

i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego za wykonanie analizy składu

chemicznego otrzymanych biosurfaktantów.

Literatura

1. Rutala W. A., Weber D. J., the Healthcare Infection Control Practices Advisory

Committee (HICPAC), Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare

Facilities (2008). https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/,

16.11.2018r.

2. Razieh A., Rashid H. M., Somayeh S., Seyed V. M., Hoda J., Iraj P., Kobra H., Negin K.,

Zeinab K., Ali H., Jasem M., Ali N., Eskandar G. P., Mohammad H. M., Mansour A.,

Parasto S., Masomeh A., Farid A. J., Disinfection and general cleaning practices used in

Katarzyna Karolewska, Katarzyna Paraszkiewicz, Beata Sadowska

88

health care centers and hospitals, Journal of Basic Research in Medical Sciences, 1(3),

2014, 1-13.

3. Swamy M. K., Akhtar M. S., Sinniah U. R., Antimicrobial Properties of Plant Essential

Oils against Human Pathogens and Their Mode of Action: An Updated Review, Evidence-

Based Complementary and Alternative Medicine, 2016, 1-21,

http://dx.doi.org/10.1155/2016/3012462.

4. Budzyńska A., Sadowska B., Więckowska-Szakiel M., Różalska B.: Analiza in vitro

skuteczności modyfikowanych olejkami eterycznymi opatrunków absorpcyjnych wobec

Staphylococcus aureus i Candida albicans. Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia,

2013, 65: 77-86.

5. Budzyńska A., Różalska S., Sadowska B., Różalska B.: Candida albicans/Staphylococcus

aureus dual-species biofilm as a target for the combination of essential oils and

fluconazole or mupirocin. Mycopathologia, 2017, 182: 989-995 (DOI 10.1007/s11046-

017-0192-y).

6. Nuñez L., D’ Aquino M., Microbicide activity of clove Essentials oil (Eugenia

Caryophyllata), Brazilian Journal of Microbiology, 43(4), 2012, 1255-1260.

7. Paraszkiewicz K., Kuśmierska A., Biosurfaktanty drobnoustrojów (część 1), Journal of

Health Study and Medicine, 1, 2017, 57-75.

8. Fracchia L., Banat J. J., Cavallo M., Ceresa C., Banat I. M., Potential therapeutic

applications of microbial surface-active compounds, Aims Bioengineering, 2(3), 2015,

144-162.

9. Moryl M., Spętana M., Dziubek K., Paraszkiewicz K., Różalska S., Płaza G. A., Różalski A.,

Antimicrobial, antiadhesive and antibiofilm potential of lipopeptides synthesised by Bacillus

subtilis, on uropathogenic bacteria, Acta Biochimica Polonica, 62(4), 2015, 725-732.

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami

B. subtilis może służyć jako środek do dezynfekcji?

Streszczenie

Wśród metod dezynfekcji, najpowszechniej stosowane są metody z użyciem środków chemicznych.

Generuje to problem toksycznych skutków ubocznych dla środowiska i organizmu człowieka. Poszukuje

się alternatywnych preparatów dezynfekcyjnych do rutynowego stosowania: wykazujących się wysoką

skutecznością, spełniających kryteria bezpieczeństwa biologicznego i adekwatnych do stopnia zagrożenia

mikrobiologicznego. W badaniach podjęto próbę opracowania środka sanityzująco-dezynfekcyjnego

opartego na naturalnych składnikach: olejku eterycznym goździkowca korzennego i surfaktantach

B. subtilis (4 preparaty). Oceniano minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów (MIC) i bójcze

(MBC) składników preparatu dla szczepów referencyjnych Staphylococcus aureus i S. epidermidis, ich

cytotoksyczność dla fibroblastów ludzkich linii HFF-1 oraz działanie przygotowanych mikroemulsji (ME)

na tworzenie się biofilmu S. aureus na powierzchniach abiotycznych z użyciem metody redukcji TTC

i testu LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit. Mimo dostępnych danych literaturowych wskazu-

jących na możliwość wykorzystania olejków eterycznych i biosurfaktantów w celu stworzenia skutecznego

środka do dezynfekcji powierzchni, przeprowadzone badania zweryfikowały negatywnie postawioną tezę.

Badane biopreparaty nie tylko nie hamowały tworzenia biofilmu przez S. aureus na nośnikach abiotycz-

nych, ale obserwowano wręcz nasilenie jego tworzenia na nośnikach szklanych w ich obecności. Tym samym

nie można przypisać badanym preparatom (zarówno samodzielnym, jak i utworzonym mikroemulsjom)

zakładanej wcześniej aktywności dezynfekcyjnej i przeciwbiofilmowej.

Słowa kluczowe: dezynfekcja, olejek eteryczny, biosurfaktanty, surfaktyna, naturalne składniki

Czy olejek eteryczny goździkowca korzennego emulsyfikowany biosurfaktantami B. subtilis

może służyć jako środek do dezynfekcji?

89

Might the clove essential oil emilsified by biosurfactants of B. sutilis be used as

a desinfectant agent?

Abstract

Among the wide range methods of disinfection, the use of chemicals is the most common method. This

generates the problem of toxic side effects for both environment and the human body. That is why the

scientists are looking for alternative disinfecting preparations for routine use which will have high efficacy,

fulfill the criteria of biological safety and will be adequate to the degree of microbiological hazard. In

present study attempt to develop a sanitizing and disinfecting agent based on natural ingredients: essential

oil of clove and surfactants of B. subtilis (4 preparations), has been made. The minimum inhibitory

concentration (MIC) and minimum biocidal concentration (MBC) of tested products against

Staphylococcus aureus and S. epidermidis reference strains, their cytotoxicity to human fibroblasts line

HFF-1 and the effect on S. aureus biofilm formation on abiotic surfaces using TTC reduction method and

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit were assessed. Despite of all the successful

recommendations based on literature data supporting the idea of preparing microemulsions from clove oil

and biosurfactants, prepared products did not inhibit the formation of S. aureus biofilm on tested carriers.

Even the intensification of biofilm formation on glass carriers was observed. Thus, the previously assumed

disinfecting and anti-biofilm activity can not be attributed to tested preparations (both used alone and as

microemulsions).

Keywords: disinfection, essential oil, biosurfactants, surfactin, natural components

90

Marcin Ożarowski1, Karolina Wielgus

2

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa

na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

1. Wstęp

Cannabis sativa L. ma długą historię stosowania, nie tylko jako roślina

przemysłowa, ale również jako roślina lecznicza, której badania miały kluczowe

znaczenie w odkryciu receptorów endokannabinoidowych (CB1, CB2) w mózgu

człowieka. Potencjał terapeutyczny fitokannabinoidów i ekstraktów specjalnych

z C. sativa został zbadany przez kilka grup badawczych, które otrzymały złożone,

a czasami kontrastujące wyniki. W poprzedniej dekadzie sądzono, że preparaty

z C. sativa zawierające delta9-tetrahydrokannabinol (THC) mogą uszkadzać pamięć.

Obecnie istnieje wiele naukowych dowodów na to, że kannabinoidy, a zwłaszcza

kannabidiol (CBD), wywierają pozytywny wpływ na procesy pamięciowe w różnych

modelach chorób otępiennych. Jednak wpływ leczenia kannabinoidami na przebieg

demencji podczas choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona (oraz innych) nie

został jeszcze w pełni wyjaśniony, podobnie jak potencjalne zastosowanie tej terapii

w bólu przewlekłym i neuropatycznym podczas m.in. procesów nowotworowych oraz

w ostrym bólu np. podczas migreny. Powszechnie wiadomo, że układ endokanna-

binoidowy zmienia się w tych chorobach i może mieć związek z procesami

neurodegeneracyjnymi i zapalnymi, jednak aspekty działania farmakologicznego CBD

są o wiele szersze.

2. Uzasadnienie badań w zakresie poprawy pamięci

W przeszłości rośliny lecznicze udowodniły swoją wartość jako źródło molekuł

o potencjale terapeutycznym, a obecnie nadal stanowią ważne źródło do identyfikacji,

oceny i opracowywania nowych potencjalnych leków. Oprócz zdefiniowanych

chemicznie ekstraktów ziołowych, także pojedyncze związki czynne pochodzenia

roślinnego stanowią obiecujące matryce, które przeznacza się do skryningowych badań

biologicznych i farmakologicznych [1]. W tym aspekcie znajduje uzasadnienie

wieloaspektowe badanie cząsteczki kannabidiolu (CBD). Kolejnym argumentem jest

zauważalny wzrost zapotrzebowania na leki z kategorii produktów stosowanych

w leczeniu ośrodkowego układu nerwowego. Jak do tej pory, w lecznictwie stosowa-

nych jest tylko kilka substancji czynnych o działaniu nootropowym i prokognitywnym

w celu poprawy funkcji poznawczych i leczeniu otępień. Motorem wzrostu zapotrze-

bowania na leki tej kategorii są obserwowane wyraźne zmiany demograficzne. Jak

1 marcin.ozarowski@iwnirz.pl, Zakład Biotechnologii, Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich

w Poznaniu, www.iwnirz.pl 2 karolina.wielgus@iwnirz.pl, Zakład Biotechnologii, Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich

w Poznaniu, www.iwnirz.pl

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

91

podaje GUS, w końcu 2017 r. liczba osób w wieku 60 lat i więcej w Polsce wynosiła

ponad 9 mln (ponad 24%) [2]. Wyniki Prognozy ludności na lata 2014-2050 wskazują

na pogłębianie się procesu starzenia społeczeństwa i znamienny wzrost odsetka ludzi

starszych w populacji. Do 2050 r. spodziewany jest systematyczny znaczny wzrost

liczby ludności w wieku 60 lat i więcej. Uważa się, że populacja osób w tym wieku

w Polsce wzrośnie w końcu horyzontu prognozy do 13,7 miliona i będzie stanowiła

ponad 40% ogółu ludności [2]. Wiadomo, że w miarę starzenia się populacji rośnie

liczba osób z zaburzeniami procesów poznawczych, wzrasta też zachorowalność na

chorobę Alzheimera [3, 4]. Do tej pory przeprowadzono już kilka obiecujących badań

in vivo, które świadczą, że cząsteczka CBD może być interesującym związkiem

o działaniu prokognitywnym – poprawiającym pamięć. Oprócz tego ostatnie badania

podkreślają, że CBD jest przydatną i obiecującą cząsteczką, która może pomóc

pacjentom nie tylko z zaburzeniami pamięci, ale również w różnych innych stanach

klinicznych. Przeprowadzane obecnie kontrolowane badania kliniczne dotyczące

populacji pacjentów neuropsychiatrycznych, powinny dostarczyć w bliskiej przysz-

łości ważnych odpowiedzi i udowodnić skuteczność kliniczną CBD [5].

3. Uzasadnienie badań w zakresie działania przeciwbólowego

kannabidiolu

Kolejnym ważnym problemem, zarówno medycznym jak i społecznym, jest

poszukiwanie nowych leków przeciwbólowych. Pomimo, że współcześnie medycyna

dysponuje wieloma syntetycznymi lekami, w tym z grupy opioidowych, jak i nieopici-

dowych leków przeciwbólowych oraz z grupy niesteroidowych leków przeciwza-

palnych, to nie są one pozbawione niebezpiecznych działań niepożądanych. Tym

bardziej ma to znaczenie dla osób starszych, które często cierpią z powodu

nakładających się na siebie objawów licznych chorób i zmuszone są do przyjmowania

wielu leków. Przewlekły ból jest jednym z najczęstszych stanów spotykanych

szczególnie wśród starszych pacjentów (≥65 lat) i ściśle wiąże się ze zmniejszoną

ruchliwością, upadkami, depresją i lękiem, zaburzeniami snu i izolacją [6, 7]. Oprócz

tego, skuteczność dostępnych opcji leczenia farmakologicznego bólu ciągle jest

niezadawalająca, zarówno w terapii bólu o charakterze przewlekłym, neuropatycznym

[8], jak i w migrenowych bólach głowy [9, 10]. Dlatego badanie terapeutycznej

skuteczności i wyjaśnianie mechanizmu farmakologicznego działania cząsteczki CBD

wciąż jest aktualnym i pilnym problemem naukowym polaryzującym na wszystkie

aspekty życia, osiągając szczególne znaczenie wśród pacjentów geriatrycznych.

4. Ogólna charakterystyka kannabidiolu

W ostatnich latach przeprowadzono szereg interesujących badań neurofarmako-

logicznych dotyczących aktywności kannabidiolu (CBD). CBD występuje w konopiach

siewnych (włókniste, przemysłowe) Cannabis sativa wśród 143 fitokannabinoidów

[11], których obecności nie wykryto w innych roślinach. Związki te klasyfikuje się do

11 typów. Cząsteczka CBD jest drugim głównym składnikiem (po delta9-THC),

występującym w konopiach typu włóknistego. Skład chemiczny Cannabis sativa jest

bardzo złożony. Według aktualnych danych, w roślinie występuje 489 związków

chemicznych, między innymi z grupy mono- i seskwiterpenów, węglowodorów,

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

92

węglowodanów, steroidów, flawonoidów oraz heterocyklicznych związków azotowych

[12]. Oprócz CBD, w mniejszym stopniu oceniano aktywność dla kannabinolu (CBN),

kannabigerolu (CBG), kannabichromenu (CBC), delta 9-tertahydrokannabiwaryny

(THCV), kannabidiwaryny (CBDV), kwasu kannabidiolowego [13]. Terpeno-

fenolowy związek chemiczny CBD jest farmakologicznie atrakcyjną cząsteczką

ponieważ wykazuje terapeutyczny potencjał w łagodzeniu objawów i leczeniu głównie

epilepsji [14-18], stwardnienia rozsianego (MS) [19, 20], schizofrenii [21, 22], choroby

Parkinsona [23] oraz choroby Alzheimera [24]. Jedynym dostępnym obecnie

produktem leczniczym jest nabiximol (Sativex®), który stanowi połączenie 2,5 mg

CBD z 2,7 mg THC. Preparat ten jest stosowany z przepisu lekarskiego w celu

poprawy objawów związanych ze sztywnością mięśni występującą w stwardnieniu

rozsianym (MS) [25]. Liczne badania oraz stanowisko komisji eksperckiej

ds. uzależnień od narkotykow Światowej Organizacji Zdrowia [26] wskazują, że

kannabidiol jest dobrze tolerowany i wykazuje dobry profil bezpieczeństwa.

Stwierdzono również, że CBD może zmniejszać, a nawet odracać niepożądane efekty

działania THC [27, 26]. Związek ten, w przeciwieństwie do THC, nie wykazuje

działania halucynogennego (psychomimetycznego) [13, 23, 28].

5. Badania nad molekularnym mechanizmem działania CBD

Wielokierunkowe i złożone działanie cząsteczki CBD oraz przetworów konopi

włóknistych było przedmiotem wielu prac poglądowych podsumowujących dowody na

ich aktywność in vitro oraz in vivo, wskazując szczególnie na działanie przeciwzapalne,

neuroprotekcyjne, antyoksydacyjne, analgetyczne, antypsychotyczne, anksjolityczne

[13, 29 30]. Udowodniono, że CBD wykazuje słabe powinowactwo do receptorów

układu endokannabinoidowego (CB1, CB2) w porównaniu do delta9-THC [13]. CBD

wykazuje aktywność niekompetycyjnego negatywnego allosterycznego modulatora

receptora CB1, tym samym działając jako niekonkurencyjny antagonista efektów THC

oraz pozostałych antagonistów CB1 [29, 31, 32 ]. Natomiast wobec receptorów CB2

związek CBD może wykazywać słabą aktywność agonistyczną, która wskazuje na

receptorowy mechanizm działania przeciwzapalnego CBD [13, 33]. Ponieważ CBD

słabo oddziałuje na receptory układu endokannabinoidowego, w wyjaśnianiu jego

działania w chorobach ośrodkowego układu nerowego, brane są pod uwagę inne

targety molekularne niezależne od tego układu. Stwierdzono, że CBD wykazuje

powinowactwo do receptorów waniloidowych (agonista wobec TPV) oraz do recep-

torów serotoninowych (agonista wobec 5-HT1A), allosterycznie moduluje działanie

receptorów opioidowych (µ i δ) oraz wykazuje działanie wobec receptorów sierocych

związanych z białkiem G (antagonista wobec GPR55 – nowy receptor endokanna-

binoidowy [13, 34, 35]. Najnowsze badania wykazały, że CBD wykazuje aktywność

odwrotnego agonisty wobec receptorów GPR3, GPR6, GPR [36]. Oprócz tego

wykazano, że CBD może wzmacniać działanie anandamidu (endogennego kanna-

binoidu), mającego powinowactwo do receptorów CB1 oraz CB2. Cząsteczka CBD

hamuje wychwyt zwrotny anandamidu oraz aktywność enzymów metabolizujących

rozkład tego związku [35, 37]. W ten sposób oddziałuje pośrednio na układ

endokannabinoidowy. W ostatnich latach wykazano, że układ ten bierze udział

w procesach pamięciowych i neuroplastyczności w hipokampie i jądrze migdałowatym

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

93

[38-40]. Oprócz tego przeprowadzono badania, które świadczą, że układ endokanna-

binoidowy może odgrywać kluczowa rolę w neurogenezie zachodzącej w hipokampie

i komorach bocznych mózgu [5, 41, 42]. Takie działanie wykazano również dla CBD

i było ono związane z jego wpływem na receptory PPARγ, które ulegają zwiększonej

ekspresji u pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) [5, 43].

6. Badania farmakologiczne w aspekcie poprawy w zaburzeniach funcji

kognitywnych/pamięciowych

Liczne badania wykazały, że zaburzenia zdolności poznawczych i rozległe

patofizjologiczne zmiany spowodowane obecnością beta-amyloidu, hiperfosforylo-

wanych białek tau, stresem oksydacyjnym, neurozapaleniem, neurotoksycznością

i neurodegeneracją są ściśle związane z postępem choroby Alzheimera [4, 44-46].

Wykazano w różnych modelach zwierzęcych AD , że CBD odwraca oraz zapobiega

rozwojowi deficytów poznawczych, choć potencjał terapeutyczny CBD w zapobie-

ganiu lub leczeniu tej choroby nie jest szeroko udokumentowany [24]. Stąd

w badaniach nad poznawaniem mechanizmów działania kannabidiolu poprawiającego

pamięć zwracano uwagę na różne targety terapeutyczne in vitro i in vivo w poszuki-

waniu wzajemnych związków przyczynowo-skutkowych [4, 5, 23, 24, 45-49].

Barichello i wsp., [47] przeprowadzili porównanie działania trzech dawek CBD

(2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg i.p.), które podano pojedynczo lub aplikowano przez 9

dni szczurom z indukowanym przez S. pneumoniae pneumokokowym zapaleniem

opon mózgowych. Efekt działania CBD badano na poziomie biochemicznym poprzez

ocenę poziomu i ekspresję neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego

BDNF, prozapalnych cytokinin (IL-1b, IL-6, CINC-1) i czynnika TNF-a w korze

przedczołowej i hipokampie oraz na poziomie behawioralnym u zwierząt, przepro-

wadzając test biernego unikania bodźca awersyjnego w celu oceny wpływu CBD na

pamięć długotrwałą. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że CBD podawany

przez 9 dni w najwyższej testowanej dawce, znacząco wydłużał czas latencji, wobec

tego najefektywniej zapobiegał zaburzeniom pamięci indukowanym zapaleniem opon

mózgowych. Stwierdzono również, że wszystkie dawki CBD obniżały istotnie poziom

TNF-a oraz zwiększały stężenie BDNF w korze przedczołowej, natomiast bez zmian

w hipokampie. Po ostrym (pojedynczym) podaniu CBD wykazano, że związek ten nie

zmieniał stężeń prozapalnych cytokin oraz poziomu BDNF [47].

Badania przeprowadzone przez Cheng i wsp. [45] miały na celu ocenę działania

prokognitywnego związku CBD, który podawano samcom myszy AβPPSwe/PS1ΔE9

(AβPP x PS1) (transgeniczny model AD) w dawce dziennej 20 mg/kg m.c. przez 8

miesięcy. Po przeprowadzeniu testów farmakologicznych oceniających pamięć

i behawior zwierząt oraz po analizie pobranych fragmentów kory mózgowej

i hipokampa stwierdzono, że długotrwałe podawanie CBD zapobiegało deficytom

poznawczym w teście oceniającym pamięć socjalną bez wpływu na lęk i uczenie

asocjacyjne zwierząt. Nie wykazano związku pomiędzy tym efektem a poziomem

beta-amyloidu i stresem oksydacyjnym w tkance nerwowej mózgu. Stwierdzono

jednak, że CBD posiada aktywność hamowania procesu neurozapalnego i wpływa na

poziom cholesterolu.

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

94

Dalsze badania autorów [46] przeprowadzone w tym samym modelu transge-

nicznych myszy polegały na obserwacji 3-tygodniowego podawania CBD (20 mg/kg

m.c, i.p.). Przeprowadzone obserwacje farmakologiczne, przy pomocy testu preferencji

miejsca, testu oceniającego pamięć poznawczą (rozpoznawania nowego obiektu), testu

behawioralnego, pozwoliły potwierdzić wcześniejsze wyniki świadczące o tym, że

CBD odwraca deficyty poznawcze bez wpływu na zachowania związane z lękiem [46].

Kolejne badania [48] nad działaniem prokognitywnym, neuroprotekcyjnym,

przeciwzapalnym, oraz przeciwpsychotycznym CBD były przeprowadzone u młodych

szczurów (Sprague-Dawley), u których indukowano w okresie prenatalnym fenotyp

schizofrenii wraz z zaburzeniami neurokognitywnymi, neurochemicznymi i struktur-

ralnymi. CBD aplikowano dwa razy dziennie w dawce 10 mg/kg (i.p.) przez 3 tygodnie.

Po przeprowadzeniu testu rozpoznawania nowego obiektu, testu labiryntu i testu

zachowań socjalnych oraz analizie porównawczej wyników stwierdzono, że

przewlekłe podawanie CBD może łagodzić zaburzenia pamięci w fenotypowym

modelu schizofrenii. Te nowe odkrycia przedstawiają interesujące implikacje dla

potencjalnego zastosowania CBD w leczeniu deficytów poznawczych i społecznego

wycofania schizofrenii. Kolejne badania sugerują, że CBD wykazuje działanie

antypsychotyczne [22, 50, 51].

W badaniach Peres i wsp. [23] oceniali, czy podawanie CBD (0,5 lub 5 mg/kg, i.p.)

ma wpływ na indukowane rezerpiną zaburzenia ruchowe i poznawcze w szczurów

(Wistar). Przeprowadzony test na aktywność motoryczną (test otwartego pola, ang.

open field test) wykazał, że CBD osłabiał zwiększoną katalepsję i ruchy pyszczkowe,

ale nie zmniejszał nasilonych ruchów zwierząt indukowanych rezerpiną. Natomiast test

oceniający uczenie się i pamięć oraz zachowania lękowe (wariant testu podniesionego

labiryntu krzyżowego, ang. plus-maze discriminative avoidance test) pozwolił

stwierdzić, że CBD w dawce 0,5 mg/kg poprawiał pamięć w tym teście, ale nie

zmniejszał lęku wśród zwierząt, podobnie jak w innych badaniach. Dane te sugerują

zastosowanie CBD w leczeniu zaburzeń ruchowo-kognitywnych w chorobie

Parkinsona.

W jednym z badań [52] testowano wpływ CBD na funkcje poznawcze w innym

farmakologicznym modelu AD. Trzy miesięcznym myszom wstrzyknięto dokomorowo

2,5 μg beta-amyloidu, a następnie podawano śródotrzewnowo CBD w dawce dziennej

20 mg/kg, przez 1 tydzień, a następnie 3 razy / tydzień przez kolejne 2 tygodnie. Do

oceny przestrzennego uczenia się myszy przeprowadzono test w labiryncie wodnym

Morrisa. Analiza wyników potwierdziła, że CBD odwracał u zwierząt deficyty

poznawcze indukowane beta-amyloidem. Stwierdzono przy tym, że CBD wywierał

efekt przez inne mechanizmy niż wpływ na układ endokannabinoidowy. Wykazano, że

CBD hamował ekspresje genu interleukiny IL-6 sugerując udział w modulowaniu

komórek glejowych, co mogło mieć wpływ na wynik testu.

7. Badania farmakologiczne w aspekcie działania przeciwbólowego

Wśród opublikowanych wyników badań najwięcej dowodów naukowych posiada

działanie antynocyceptywne oraz przeciwzapalne wywierane przez CBD [8, 53-59].

Przeprowadzone badania wskazują, że w mechanizmy działania przeciwbólowego

oprócz receptorów CB1/CB2 są zaangażowane także inne układy, w tym receptory

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

95

opioidowe i serotoninowe (5-HT) oraz receptory sieroce związane z białkiem G

(GPR55) [60], receptor N-arachidonylo-glicynowy (NAGly) [60], receptory sieroce

– peroksysomowe aktywowane proliferatorem (PPAR) [61], receptory TRP (TRPV,

TRPA, TRPM) [62]. Wzajemny udział tych receptorów i interakcje z CBD są ciągle

przedmiotem badań farmakologicznych nad mechanizmami łagodzenia bólu.

Wcześniej Evans i wsp. [58] i Formukong i wsp. [59] odkryli, że związek CBD był

bardziej skuteczny w leczeniu bólu niż inne naturalne kannabinoidy w teście wicia

u myszy, które było indukowane fenylobenzochinonem. Uznali, że związek był około

360 razy silniejszy niż aspiryna i 590 razy silniejszy niż THC.

W badaniu przeprowadzonym przez Costa i wsp. [63] w modelu bólu neuro-

patycznego, który indukowano podwiązaniem nerwu kulszowego myszy oraz w modelu

bólu zapalnego, indukowanego wstrzyknięciem adiuwanta Freunda u szczurów,

stwierdzono, że stosowanie CBD w dawce 2,5-20 mg/kg (model neuropatyczny) i 20

mg/kg (model zapalny) znacząco zmniejszało hiperalgezję u zwierząt. Wykazano przy

tym, że CBD zmniejszyło poziom mediatorów prozapalnych: prostaglandyny E2

(PGE2), nadtlenku lipidów i tlenku azotu (NO), które były zaangażowane w powsta-

waniu bólu [63].

Inne badania [64] przeprowadzono w modelu bólu neuropatycznego u szczurów po

podwiązaniu nerwów, u których po 24 dniach wykazano spadek aktywności serotoniny

(5-HT), mechaniczna allodynię oraz nasilenie objawów lękowych stwierdzone

w testach farmakologicznych (m.in. w teście podniesionego labiryntu krzyżowego,

w teście otwartego pola). Podawanie szczurom CBD w dawce 5 mg/kg m.c., s.c. przez

7 dni znacząco zmniejszyło mechaniczną allodynię oraz lęk. Wykazano, że podawanie

niskiej dawki CBD indukuje analgezję głównie poprzez aktywację receptora TRPV1

oraz zmniejsza lęk poprzez aktywację receptora 5-HT1A i poprawę neurotransmisji

serotoninergicznej w warunkach bólu neuropatycznego. W kolejnych badaniach

potwierdzono, że CBD (5-10 mg/kg) zapobiega mechanicznej allodynii u myszy, która

była indukowana paklitakselem [65].

Celem dalszych badań było ustalenie, czy CBD podawany śródstawowo hamuje

stan zapalny i czy w ten sposób może zapobiec rozwojowi bólu w indukowanym

osteoartretyzmie i neuropatii stawów [66]. Szczurom aplikowano CBD w trzech

stężeniach (100, 200, 300 μg w 100 μL), a następnie uzyskane wyniki z oceny

eletrofizjologicznej i behawioralnej pozwoliły stwierdzić, że CBD w najwyższym

stężeniu najwyraźniej zapobiegał rozwojowi bólu oraz hamował dalsze uszkodzenie

nerwów podczas stanu zapalnego stawów.

Casey i wsp. [56] badali efekt interakcji podczas łącznego podawania CBD z THC

w modelu bólu neuropatycznego u myszy. Przy pojedynczym podawaniu THC

zaobserwowano zależne od dawki zmniejszenie mechanicznej i temperaturowej

allodynii, ale również pojawiły się działania niepożądane w postaci katalepsji i sedacji.

Z kolei podawanie samego CBD powodowało mniejszą zależną od dawki redukcję

alodynii, ale nie powodowało skutków ubocznych. Natomiast łączne podawanie

w ustalonym stosunku THC i CBD powodowało dwufazowe, zależne od dawki,

zmniejszenie alodynii. Wykazano, że przy niskich dawkach kombinacja THC z CBD

wykazywała 200-krotny wzrost siły działania przeciwbólowego. Jedynie wysoka

dawka kombinacji THC z CBD wykazywała efekty uboczne, podobne do działania

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

96

samego THC. Wyniki wykazały zatem, że CBD synergiczne wzmacnia działanie

łagodzące ból THC w zwierzęcym modelu bólu neuropatycznego i może łagodzić

działania niepożądane THC. Dalsze badania potwierdziły ten synergiczny efekt

przeciwbólowy podawania dwóch związków kannabinoidowych [67, 68]. Zaobserwo-

wano także synergiczną interakcję pomiędzy CBD a morfiną skutkującą zwiększonym

działaniem przeciwbólowym w modelu zwierzęcym. Maksymalny efekt był obserwo-

wany, gdy podawano CBD 10 min przed morfiną [69]. Efekt tego działania

synergicznego również został potwierdzony [70].

Aktualna analiza wyników badań klinicznych przeprowadzona przez zespół

Cochrane Collaboration [54] dotycząca skuteczności działania przeciwbólowego,

tolerancji i bezpieczeństwa stosowania preparatów na bazie konopi siewnych w postaci

aerozolu (izolowane CBD, THC, wyciągi z ziela, związki syntetyczne) obejmowała 16

kontrolowanych badań klinicznych z 1750 ochotnikami ze zdiagnozowanym bólem

neuropatycznym. W 10 badaniach podawano pacjentom CBD. Wynikiem systema-

tycznego przeglądu było podsumowanie, że potencjalne korzyści wynikające

z zastosowania leków na bazie konopi w przewlekłym bólu neuropatycznym mogą być

większe niż potencjalne działania niepożądane.

8. Podsumowanie

Podsumowując, można uznać, że cząsteczka CBD wykazuje aktywność

przeciwdemencyjną oraz przeciwbólową w różnych modelach in vivo. Konieczne są

dalsze badania nad mechanizmami działania farmakologicznego, a szczególnie

w aspekcie potwierdzenia aktywności w kontrolowanych badań klinicznych.

Podziękowania

Praca powstała w ramach projektów badawczych: 1) "Onkokan" INNOMED

/I/11/NCBIR/2014-2018 finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju

oraz 2) z Programu Wieloletniego RM/171/2017 finansowanego przez Ministerstwo

Rolnictwa i Rozwoju Wsi.

Literatura

1. Atanasov A.G., Waltenberger B., Pferschy-Wenzig E.M. et al., Discovery and resupply of

pharmacologically active plant-derived natural products: A review. Biotechnology

Advances, 33 (2015), s.1582-1614.

2. Główny Urząd Statystyczny, 100 lat polski w liczbach. 1918-2018. Warszawa (2018),

s. 1-109.

3. Niu H., Alvarez-Alvarez I., Guillen-Grima F., Aguinaga-Ontoso I., Prevalence and

incidence of Alzheimer's disease in Europe: A meta-analysis. Neurología (English

Edition), 32(8), (2017), s. 523-532.

4. Robinson M., Lee B.Y., Hane F.T., Recent progress in Alzheimer's disease research, Part

2: genetics and epidemiology. Journal of Alzheimer's Disease, 57, (2017), s. 317-330.

5. Crippa J.A., Guimaraes F.S., Campos A.C., Zuardi A.W., Translational investigation of

the therapeutic potential of cannabidiol (CBD): toward a new age. Frontiers in

Immunology, 9:2009, (2018), s. 1-16.

6. Reid M.C., Eccleston C., Pillemer K., Management of chronic pain in older adults. British

Medical Journal, 350, (2015), h532.

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

97

7. Wickson-Griffiths A., Kaasalainen S., Herr K., Interdisciplinary approaches to managing

pain in older adults. Clinics in Geriatric Medicine, 32(4), (2016), s. 693-704.

8. Ożarowski M., Mikolajczak P.Ł., Bogacz A., et al., Progress in study of Cannabis sativa

leaves extracts without psychotropic cannabinoids in animal model of neuropathic pain.

Journal of Medical Science, 4(83), (2014), 328-335.

9. Ożarowski M., Fitoterapia migrenowych bólów głowy. Naturoterapia w praktyce, 6(10),

(2019), s. 73-80.

10. Lochte BC., Beletsky A., Samuel N.K., Grant I., The use of cannabis for headache

disorders. Cannabis and Cannabinoid Research, 2.1, 2017, s. 61-71.

11. Hanus L.O., Meyer S.M., Munoz E., Taglialatela-Scafati O., Appendino G.,

Phytocannabinoids: a unified critical inventory. Natural Product Reports, 33, 2016,

s. 1357-1392.

12. Fisar Z., Phytocannabinoids and endocannabinoids. Current Drug Abuse Reviews, 2,

(2009), s. 51-75.

13. Pisanti S., Malfitano A.M., Ciaglia E., et al., Cannabidiol: state of the art and new

challenges for therapeutic applications. Pharmacology & Therapeutics, 175, (2017),

s. 133-150.

14. Ali S., Scheffer I.E., Sadleir L.G., Efficacy of cannabinoids in paediatric epilepsy.

Developmental Medicine & Child Neurlogy, 61, (2019), s. 13 - 19.

15. Gaston T.E., Szaflarski J.P., Cannabis for the treatment of epilepsy: an update. Current

Neurology and Neuroscience Reports, 18(73), (2018), s. 1-9.

16. Zaheer S., Kumar D., Khan M.T, Giyanwani P.R., Kiran F., Epilepsy and Cannabis:

a literature review. Cureus, 10(9), (2018), e3278.

17. Perucca E., Cannabinoids in the treatment of epilepsy: hard evidence at last? Journal of

Epilepsy Research, 7(2), (2017), s. 61-76.

18. Reddy D.S., The utility of cannabidiol in the treatment of refractory epilepsy. Journal of

Clinical Pharmacology and Therapeutics, 101(2), 2017, s. 182-184.

19. Rudroff T., Sosnoff J., Cannabidiol to improve mobility in people with multiple sclerosis.

Frontiers in Neurology, 9(183), (2018), s. 1-3.

20. Romero K., Pavisian B., Staines W.R., Feinstein A., Multiple sclerosis, cannabis, and

cognition: a structural MRI study. NeuroImage: Clinical, 8, (2015), 140-147.

21. Leweke FM, Piomelli D, Pahlisch F, et a., Cannabidiol enhances anandamide signaling

and alleviates psychotic symptoms of schizophrenia. Translational Psychiatry, 2(3), 2012,

e94.

22. Iseger T.A., Bossong M.G., A systematic review of the antipsychotic properties of

cannabidiol in humans. Schizophrenia Research, 162(1-3), (2015), 153-161.

23. Peres F.F., Levin R., Suiama M.A., Cannabidiol prevents motor and cognitive impairments

induced by reserpine in rats. Frontiers in Pharmacology, 7(343), (2016), s. 1-10.

24. Watt G., Karl T., In vivo evidence for therapeutic properties of cannabidiol (CBD) for

Alzheimer's disease. Frontiers in Pharmacology, 8(20), (2017), s. 1-7.

25. Turri M., Teatini F., Donato F. et al. Pain modulation after oromucosal cannabinoid spray

(SATIVEX®) in patients with multiple sclerosis: a study with quantitative sensory testing

and laser-evoked potentials. Medicines 5(59), (2018), s.1-12.

26. WHO Expert Committee on Drug Dependence. Cannabidiol (CBD). Pre-Review Report.

Agenda Item 5.2. Thirty-ninth Meeting Geneva, 6-10 November 2017, s. 1-27.

27. Hindocha C., Freeman T.P., Schafer G., Gardener C., Das R.K, Morgan C.J., Curran H.V.,

Acute effects of delta-9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and their combination on facial

emotion recognition: A randomised, double-blind, placebo-controlled study in cannabis

users. European Neuropsychopharmacology, 25, 2015, s. 325-334.

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

98

28. Makowiecka J, Wielgus K, Therapeutic potential of cannabinoids – retr ospective and

historical developments. Journal of Natural Fibers, 11(3), (2014), 185-198.

29. Bloomfield M.A., Hindocha C., Green S.F., et al., The neuropsychopharmacology of

cannabis: A review of human imaging studies. Pharmacology & Therapeutics, 195, (2019),

s. 132-161.

30. Campos A.C., Fogaça M.V., Sonego A.B., Guimar?es F.S., Cannabidiol, neuroprotection

and neuropsychiatric disorders. Pharmacological Research, 112, (2016), s. 119-127.

31. Laprairie R.B., Bagher A.M., Kelly M.E., Denovan-Wright E.M., Cannabidiol is a

negative allosteric modulator of the cannabinoid CB1 receptor. British Journal of

Pharmacology, 172(20), 2015, s. 4790-4805.

32. Khurana L., Mackie K., Piomelli D., Kendall D., Modulation of CB1 cannabinoid receptor

by allosteric ligands: Pharmacology and therapeutic opportunities. Neuropharmacology,

124, 2017, s. 3-12.

33. Pertwee RG. Pharmacological actions of cannabinoids. Handbook of Experimental

Pharmacology, 2005;(168):1-51.

34. Shi Q.X., Yang L.K., Shi W.L ., et al., The novel cannabinoid receptor GPR55 mediates

anxiolytic-like effects in the medial orbital cortex of mice with acute stress. Molecular

Brain, 10(38), (2017), s. 1-11.

35. De Petrocellis L., Ligresti A., Moriello A.S., et al. Effects of cannabinoids and

cannabinoid-enriched Cannabis extracts on TRP channels and endocannabinoid

metabolic enzymes. British Journal of Pharmacology, 163(7), (2011), s. 1479-1494.

36. Laun A.S., Shrader S.H., Brown K.J., Song Z.H., GPR3, GPR6, and GPR12 as novel

molecular targets: their biological functions and interaction with cannabidiol. Acta

Pharmacologica Sinica, 40(3), (2019), s. 300-308.

37. Bisogno T., Hanus L., De Petrocellis L., et al. Molecular targets for cannabidiol and its

synthetic analogues: effect on vanilloid VR1 receptors and on the cellular uptake and

enzymatic hydrolysis of anandamide. British Journal of Pharmacology, 134(4), (2001),

s. 845-852.

38. Hudson R., Rushlow W., Laviolette S.R., Phytocannabinoids modulate emotional memory

processing through interactions with the ventral hippocampus and mesolimbic dopamine

system: implications for neuropsychiatric pathology. Psychopharmacology (Berl). 235(2),

(2018), s. 447-458.

39. Segev A., Korem N., Zer-Aviv M.T. et al. Role of endocannabinoids in the hippocampus

and amygdala in emotional memory and plasticity. Neuropsychopharmacology, 43(10),

(2018), s. 2017-2027.

40. Shoshan N., Segev A., Abush H., et al. Cannabinoids prevent the differential long-term

effects of exposure to severe stress on hippocampal – and amygdala-dependent memory

and plasticity. Hippocampus, 27(10), (2017), s. 1093-1109.

41. Prenderville J.A., Kelly A.M., Downer E.J., The role of cannabinoids in adult

neurogenesis. British Journal of Pharmacology, 172(16), (2015), s. 3950-3963.

42. Jiang W., Zhang Y., Xiao L., et al., Cannabinoids promote embryonic and adult

hippocampus neurogenesis and produce anxiolytic- and antidepressant – like effects.

Journal of Clinical Investigation, 115(11), (2005), 3104-3116.

43. Esposito G., Scuderi C., Valenza M., et al., Cannabidiol reduces A?-induced

neuroinflammation and promotes hippocampal neurogenesis through PPAR? involvement.

PLoS One, 6(12), (2011), e28668.

44. Kinney J.W., Bemiller S.M., Murtishaw A.S. et al., Inflammation as a central mechanism

in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical

Interventions, 4, (2018), s. 575-590.

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

99

45. Cheng D, Spiro AS, Jenner AM, Garner B, Karl T. Long-term cannabidiol treatment

prevents the development of social recognition memory de ficits in Alzheimer's disease

transgenic mice. Journal of Alzheimers Disease, 42(4), (2014a), s. 1383-1396.

46. Cheng D., Low J.K., Logge W., Garner B., Karl T., Chronic cannabidiol treatment

improves social and object recognition in double transgenic APPswe/PS1?E9 mice.

Psychopharmacology, 231, (2014b), 3009-3017.

47. Barichello T., Ceretta R.A., Generoso J.S., et al. Cannabidiol reduces host immune

response and prevents cognitive impairments in Wistar rats submitted to

pneumococcalmeningitis. European Journal of Pharmacology, 697, 2012, s. 158-164.

48. Osborne A.L., Solowij N., Babic I., Huang X.F., Weston-Green K., Improved social

interaction, recognition and working memory with cannabidiol treatment in a prenatal

infection (poly I:C) rat model. Neuropsychopharmacology, 42, (2017), s. 1447-1457.

49. da Silva V.K., de Freitas B.S., Garcia R.C., et al., Antiapoptotic effects of cannabidiol in

an experimental model of cognitive decline induced by brain iron overload. Translational

Psychiatry, 8(176), (2018), s. 1-8.

50. Gomes F.V., Issy A.C., Ferreira F.R., Viveros M.P., Del Bel E.A., Guimaraes FS.

Cannabidiol attenuates sensorimotor gating disruption and molecular changes induced by

chronic antagonism of NMDA receptors in mice. International Journal of

Neuropsychopharmacology, 18, 2014, 1-10.

51. Gomes F.V., Llorente R., Del Bel E.A., Viveros MP, López-Gallardo M., Guimar?es F.S.,

Decreased glial reactivity could be involved in the antipsychotic-like effect of cannabidiol.

Schizophrenia Research, 164, (2015), s. 155-163.

52. Martin-Moreno A.M., Reigada D., Ramírez B.G., et al., Cannabidiol and other

cannabinoids reduce microglial activation in vitro and in vivo: relevance to Alzheimer's

disease. Molecular Pharmacology, 79, (2011), s. 964-973.

53. Bruni N., Pepa C.D., Oliaro-Bosso S., Pessione E., Gastaldi D., Dosio F., Cannabinoid

delivery systems for pain and inflammation treatment. Molecules, 23(2478), (2018), 1-25.

54. Mücke M., Phillips T., Radbruch L., Petzke F., Häuser W., Cannabis-based medicines for

chronic neuropathic pain in adults (Review). Cochrane Database of Systematic Reviews,

3(CD012182), (2018), s. 1-4.

55. Papaseit E., Pérez-Ma?á C., Pérez-Acevedo A.P. et al., Cannabinoids: from pot to lab.

International Journal of Medical Sciences, 15(12), (2018), s. 1286-1295.

56. Casey S.L., Atwal N., Vaughan C.W., Cannabis constituent synergy in a mouse

neuropathic pain model. Pain, 158(12), 2017, s. 2452-2460.

57. Xiong W., Cui T., Cheng K., et al., Cannabinoids suppress inflammatory and neuropathic

pain by targeting alfa3 glycine receptors. Journal of Experimental Medicine, 209(6),

(2012), 1121-1134.

58. Evans F.J., Cannabinoids: the separation of central from peripheral effects on a structural

basis. Planta Medica, 57 [Suppl], 1991, s. 60-67.

59. Formukong E.A., Evans A.T., Evans F.J., Analgesic and anti-inflammatory activity of

constituents of Cannabis sativa L. Inflammation, 12, 1988, s. 361-371

60. Vuckovic S., Srebro D., Vujovic K.S. et al., Cannabinoids and pain: new insights from old

molecules. Frontiers in Pharmacology, 9(1259), (2018), s. 1-19.

61. O'Sullivan, S. E. An update on PPAR activation by cannabinoids. British Journal of

Pharmacology, 173, (2016), s. 1899-1910.

62. Pertwee, R. G., Howlett, A. C., Abood, M. E., Alexander, S. P., Di Marzo, V., Elphick, M.

R., et al. International union of basic and clinical pharmacology. LXXIX. Cannabinoid

receptors and their ligands: beyond CB1 and CB2. Pharmacology Review, 62, (2010), s.

588-631.

Marcin Ożarowski, Karolina Wielgus

100

63. Costa B., Trovato A. E., Comelli F., Giagnoni G., Colleoni M., The non-psychoactive can-

nabis constituent cannabidiol is an orally effective therapeutic agent in rat chronic inflam-

matory and neuropathic pain. European Journal of Pharmacology, 556, 2007, s. 75-83.

64. De Gregorio D., McLaughlin R.J., Luca P., et al., Cannabidiol modulates serotonergic

transmission and reverses both allodynia and anxiety-like behavior in a model of

neuropathic pain. Pain, 160, (2019), s. 136-150.

65. Ward S.J., Ramirez M.D., Neelakantan H., Walker E.A., Cannabidiol prevents the

development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.

Anesthesia & Analgesia, 113, (2011), 947-950.

66. Holly T., Philpott., O'Brien M., McDougall J.J., Attenuation of early phase inflammation

by cannabidiol prevents pain and nerve damage in rat osteoarthritis. Pain, 158(12), 2017,

2442-2451.

67. Britch S.C., Wiley J.L., Yu Z., Clowers B.H., Craft R.M., Cannabidiol-?9-

tetrahydrocannabinol interactions on acute pain and locomotor activity. Drug and

Alcohol Dependence, 175, (2017), s. 187-197.

68. King K.M., Myers A.M., Soroka-Monzo A.J., et al., Single and combined effects of ?

9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in a mouse model of chemotherapy-induced

neuropathic pain. British Journal of Pharmacology, 174(17), (2017), s. 2832-2841.

69. Rodríguez-Muoz M., Onetti Y., Cortés-Montero E., Garzón J., Sánchez-Blázquez P.,

Cannabidiol enhances morphine antinociception, diminishes NMDA-mediated seizures

and reduces stroke damage via the sigma 1 receptor. Molecular Brain, 11(51), (2018),

s. 1-12.

70. Neelakantan H., Tallarida R.J., Reichenbach Z.W., Tuma R.F., Ward S.J., Walker E.A.,

Distinct interactions of cannabidiol and morphine in three nociceptive behavioral models

in mice. Behavioural Pharmacology, 26(3), 2015, s. 304-14.

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu

nerwowego – działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

Streszczenie

Kannabidiol (CBD) jest reprezentatywnym związkiem chemicznym nie wykazującym działania psychozo-

mimetycznego, występującym w konopiach siewnych. W świetle najnowszych badań CBD uważa się za

obiecującą molekułę w opracowywaniu nowych leków kierowanych do pacjentów geriatrycznych. Obecnie

prowadzi się badania nad nowymi terapiami zespołów otępiennych oraz efektywniejszymi środkami

w uśmierzaniu bólu z zastosowaniem CBD. Wynika to z postępujących zmian demograficznych i starzenia

się populacji oraz potrzeby opracowywania nowych rozwiązań profilaktyczno-terapeutycznych. Celem pracy

poglądowej jest omówienie wyników najnowszych badań przeprowadzonych w modelach zwierzęcych,

które dotyczą dwóch aspektów oceny aktywności farmakologicznej CBD, tj.: 1) działanie poprawiające

funkcje kognitywne w tym różne rodzaje pamięci, a także zachowanie, oraz 2) działanie przeciwbólowe

w różnych modelach zwierzęcych. Zwrócono uwagę na zachodzenie interakcji pomiędzy CBD a THC oraz

pomiędzy CBD a morfiną. Przegląd i podsumowanie badań in vivo wykonano na podstawie prac naukowych

dostępnych w bazach medycznych, tj.: PubMed, Medline, EBSCO oraz Scopus, cytując publikacje

z ostatnich lat ze stron konsorcjów wydawniczych, tj. Science Direct, Elsevier, Springer, Thieme, Wiley,

Karger, Taylor & Francis Group, Nature. Przegląd wyników badań pozwala na stwierdzenie, że cząsteczka

CBD wykazuje obiecującą aktywność w aspektach odwracania i hamowania indukowanych zaburzeń

pamięci w modelach tradycyjnych i transgenicznych zwierząt. Mechanizmy tego działania angażują inne

receptory niż CB1 oraz CB2. Oprócz tego stwierdzono, że CBD wykazuje efekt przeciwbólowy w modelu

osteoartretyzmu, modelach bólu neuropatycznego i zapalnego. Konieczne jest porównanie wyników badań

in vivo z rezultatami trwających kontrolowanych badań klinicznych, a także z aktywnością standary-

zowanych ekstraktów z Cannabis sativa. Słowa kluczowe: kannabidiol, zaburzenia kognitywne, ból, modele zwierzęce, mechanizm działania

Wpływ kannabinoidów z Cannabis sativa na czynność ośrodkowego układu nerwowego

– działanie przeciwdemencyjne i przeciwbólowe

101

The effect of cannabinoids from Cannabis sativa on the activity of the central

nervous system – an antiamnestic and analgesic effect

Abstract

Cannabidiol (CBD) is a representative chemical compound that has no psychotomimetic effect and is

found in cannabis. In the light of recent research, CBD is considered a promising molecule in the

development of new drugs for geriatric patients. Currently, researches on new therapies for dementia

syndrome and more effective means for pain relief using CBD are being carried out. It results from the

progressing demographic changes and the aging of the population as well as the need to develop new

preventive and therapeutic strategies. The aim of the review paper is to discuss the results of the latest

studies in animal models on two aspects of the CBD pharmacological activity assessment, i.e. 1) activity

improving cognitive functions including various types of memory, and behavior, 2) analgesic effect in

various animal models. The interactions between CBD and THC and between CBD and morphine were

observed. The review and summary of in vivo studies were performed on the basis of scientific results

available in medical databases, ie: PubMed, Medline, EBSCO and Scopus, citing publications from recent

years from publisher consortia, ie Science Direct, Elsevier, Springer, Thieme, Wiley, Karger, Taylor &

Francis Group, Nature. The review of the studies allows to conclude that the CBD molecule has promising

activity in the aspects of reversing and inhibiting experimental memory impairment in traditional and

transgenic animal models. Mechanisms of this action involve other receptors than CB1 and CB2. In

addition, CBD has been found to have an analgesic effect in the osteoarthritis model, and in neuropathic

and inflammatory pain model. It is necessary to compare the results of in vivo tests with the results of

ongoing controlled clinical trials, as well as with the activity of standardized extracts of Cannabis sativa.

Keywords: cannabidiol, cognitive impairment, pain, animals model, mechanism of action

102

Sylwia Borkusewicz1, Dominika Chrząszcz

2, Aleksandra Horbowicz

3, Marta Fiołka

4

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

1. Wprowadzenie

Dżdżownice należą do typu pierścienic. Są trójwarstwowymi zwierzętami tkanko-

wymi o wyraźnej segmentacji. Posiadają wtórną jamę ciała, zamknięty układ krwio-

nośny oraz układ wydalniczy typu metanefrydialnego. Zaliczamy je do podgromady

skąposzczetów. Z ewolucyjnego punktu widzenia dżdżownice są bardzo starym

gatunkiem. Przeżyły ponad milion lat dzięki przystosowaniu się do zmiennych warun-

ków środowiska. Naturalnym miejscem bytowania dżdżownic są wilgotne gleby,

wzbogacone w substancje organiczne. Od dawna znany jest ogromny wkład dżdżownic

w procesy odpowiedzialne za użyźnianie gleb poprzez napowietrzanie, ułatwienie

mineralizacji substancji organicznych, a przez to lepsze ich nawożenie [1, 2].

Zauważono jednak, że poza tak ważnymi funkcjami, mogą one zostać wykorzys-

tane w odmienny sposób, między innymi w walce z różnego rodzaju patogenami, do

których należą bakterie i grzyby. Stosowanie dżdżownic w postaci różnorodnych

preparatów w medycynie Dalekiego Wschodu zostało spisane w dokumentach

pochodzących z 1340 roku. W Indiach i Birmie dżdżownice były wykorzystywane do

zwalczania wielu chorób, między innymi do leczenia ospy prawdziwej. Znalazły

zastosowanie jako środek terapeutyczny, używany w leczeniu schorzeń dróg odde-

chowych wieku dziecięcego, złamań kości i chorób związanych z krzepnięciem krwi.

Dżdżownicom przypisywano właściwości moczopędne i przeciwgorączkowe. Suszone,

a następnie sproszkowane są używane jako preparat medycyny naturalnej w Chinach,

Japonii, Korei i innych krajach azjatyckich. Udowodniono, że płyn celomatyczny

i jego składniki mają właściwości cytotoksyczne, antykoagulacyjne, proteolityczne,

hemolityczne, przeciwgorączkowe, przeciwnowotworowe i antybakteryjne. Właści-

wości te stanowią odpowiedź na szereg różnych patogennych czynników napotykanych

w środowisku życia dżdżownic [2]. Celem niniejszej pracy jest charakterystyka

substancji o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych pozyskiwanych z wybranych

gatunków dżdżownic: Lumbricus rubellus, Eudrilus eugeniae, Lampito mauritii,

Perionyx excavatus, Eisenia fetida. Praca ta powstała w oparciu o przegląd aktualnie

dostępnej literatury.

1 borkusewiczs@gmail.com, SKN Biotechnologów „Mikron”, Zakład Immunobiologii, Instytut Biologii

i Biochemii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 2 SKN Biotechnologów „Mikron”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 3 SKN Biotechnologów „Mikron”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 4 Zakład Immunobiologii, Instytut Biologii i Biochemii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii

Curie-Skłodowskiej

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

103

2. Charakterystyka czynników przeciwbakteryjnych w organizmie

dżdżownic

W obronie dżdżownic przed bakteriami biorą udział nie tylko bariery mechaniczne,

odpowiedź komórkowa, w którą zaangażowane są celomocyty, ale także czynniki

humoralne [3]. W odpowiedzi humoralnej bierze udział płyn celomatyczny zawierający

związki przeciwdrobnoustrojowe, takie jak: lumbrokinaza, ryboflawina, fetydyny,

lyzenina, eiseniaporyny, lumbrycyna, hemolizyny H1, H2 i H3 [4-6].

Lumbrokinaza – wykazuje działanie antykoagulacyjne. W badaniach udowodniono

jej zdolność do hamowania szlaku krzepnięcia krwi oraz aktywacji fibrynolizyny

poprzez zwiększenie aktywności t – PA (tkankowego aktywatora plazminogenu).

Ryboflawina inaczej nazywana witaminą B2, posiada właściwości przeciwzapalne, zaś

fetydyny to białka o działaniu przeciwbakteryjnym i hemolitycznym. Lyzenina

wykazuje działanie podobne do fetydyny oraz silnie wiąże sfingomielinę. Związek ten

jest produkowany przez chloragocyty, które są zaliczane do dużych celomocytów.

Eiseniaporyna jest to białko o właściwościach cytolitycznych. Białko to uwalniane jest

z ziarnistości cytoplazmatycznych. Dzięki właściwościom cytolitycznym i perfora-

cyjnym, niszczy błony obcych komórek. Lumbrycyna I to białko o działaniu przeciw-

bakteryjnym, bogate w aminokwas prolinę (aktywne wobec bakterii Gram-dodatnich

jak i Gram-ujemnych).Geny dla tego białka ulegają ekspresji tylko u starszych

osobników dżdżownic, dlatego też do pozyskania surowców, które mogą być wyko-

rzystywane do wytwarzania preparatów do zwalczania bakterii są wybierane osobniki

dorosłe. Hemolizyny H1 i H2 wykazują aktywność hemolityczną, natomiast H3 jest

zdolna do hemaglutynacji erytrocytów ssaków [5].

Warto też zwrócić uwagę na aktywność lizozymu. Jego obecność wykryto w płynie

celomatycznym i celomocytach. Lizozym hydrolizuje wiązanie β-1,4-D-glikozydowe,

obecne w peptydoglikanowej ścianie bakterii Gram-dodatnich. Prowadzi do lizy ściany

komórkowej, powodując destrukcję komórki. Bakterie Gram-ujemne wykazują

większą oporność na działanie lizozymu z uwagi na inną budowę ściany komórek [5].

Innym związkiem przeciwbakteryjnym jest prodigiozyna – związek chemiczny,

zawierający w swojej budowie trzy pierścienie pirolowe. Ten związek działa inhibi-

cyjnie na bakterie Gram-dodatnie. Upośledza ich prawidłową aktywność biologiczną,

prowadząc do śmierci komóreki [7].

3. Płyn celomatyczny dżdżownicy jako skuteczny środek przeciwbakteryjny

Celoma to wtórna jama ciała wypełniona płynem celomatycznym. Działanie

komórkowych i humoralnych składników tego płynu determinuje odporność

dżdżownic. Komórki w nim występujące noszą nazwę celomocytów i mogą być

wydzielane z celomy poprzez grzbietowe pory obecne w ścianie ciała, po indukcji

konwulsyjnego ruchu. Płyn celomatyczny jest pozyskiwany laboratoryjnie poprzez

traktowanie dżdżownicy krótkim szokiem elektrycznym bądź zanurzenie w etanolu

o niskim stężeniu. Te zabiegi nie uśmiercają organizmu. Dżdżownice są w stanie

regenerować ubytek płynu celomatycznego. Uzupełnienie płynu i odbudowa

celomocytów może trwać około trzech tygodni [4].

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej płynu celomatycznego dżdżownicy Eisenia

fetida przyniosła ciekawe rezultaty. Na tę aktywność wskazywała inhibicja wzrostu

Sylwia Borkusewicz, Dominika Chrząszcz, Aleksandra Horbowicz, Marta Fiołka

104

bakterii Arthrobacter species, Staphylococcus aureus – bakterii Gram-dodatnich oraz

bakterii Gram-ujemnych: Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa [8]. Kolejne

badania udowodniły również aktywność hamującą wobec innych szczepów bakterii

takich jak: Salmonella i Proteus, a także potwierdziły zbliżone działanie na wzrost

Escherichia coli [9]. Przebadano także płyn celomatyczny uzyskany z innego gatunku

dżdżownicy – Dendrobaena veneta. Wykazywał on hamujące działanie wobec

bakterii: Citrobacter freundii, Bacillus megaterium, Serratia marcescens w badanych

stężeniach (1:10, 1:100, 1:250, 1:500, nierozcieńczony). Natomiast stężony wykazywał

większą aktywność wobec kolejnych pięciu szczepów bakterii: Enterobacter cloacae,

Legionella pneumophila, Klebsiella terrigena, Bacillus pumilus, Stenotrophomonas

maltophilia [10].

Badania prowadzone z wykorzystaniem gatunków dżdżownic: Lampito mauritii,

Megascolex konkanensis, Drawida impertusa i Drawida lennor wykazały obecność

stref hamowania wzrostu na antybiogramie w stosunku do bakterii: Aeromonas

hydrophila, Bacillus subtilis, Vibrio parahaemolyticus [11].

Innym przykładem analizy aktywności przeciwbakteryjnej są badania prowadzone

nad płynem celomatycznym dżdżownicy Eudrilus eugeniae. Strefa inhibicji bakterii

była widoczna w przypadku: Escherichia coli, Bacillus subtilis i Staphylococcus

aureus [12]. Podane przykłady dowodzą aktywności przeciwbakteryjnej płynu

celomatycznego. Powoduje on niszczenie mikroorganizmów pochodzących z gleby.

Szybka reakcja organizmu dżdżownicy, w odpowiedzi na patogeny glebowe, odgrywa

ważną rolę w prawidłowym jej funkcjonowaniu. Sposób destrukcji komórek

bakteryjnych zależy między innymi od ich wielkości [13].

Celomocyty, które biorą udział w odpowiedzi komórkowej i humoralnej są

odpowiedzialne nie tylko za odporność i fagocytozę, ale również za cytotoksyczność.

Fagocytoza zachodzi u dżdżownic w bardzo specyficzny sposób. Ulegają jej obiekty

o niewielkich rozmiarach (np. bakterie), natomiast większe otaczane są przez liczne

komórki różnych rodzajów celomocytów, by doprowadzić do enkapsulacji. Podczas

tego procesu tworzone są tzw. ciała brunatne, które mają postać kapsuły. Jest ona

złożona ze spłaszczonych komórek celomocytów, które są w stanie produkować

usztywniający całość, włóknisty materiał o brunatnym pigmencie. Komórki te mają

swój udział w niwelowaniu procesów zapalnych i wpływają na odrzucanie

przeszczepów. Wśród aktywności, w które są zaangażowane celomocyty można

wyróżnić działanie: przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,

proteolityczne, hemolityczne oraz cytolityczne [4, 14].

Płyn celomatyczny zwalcza bakterie wtedy, gdy zawiodą pozostałe bariery

obronne. Spowalnia on wnikanie mikroorganizmów do miejsca zakażenia (rany)

poprzez naciek celomocytów i tworzenie skrzepu. Wykazano, że substancje zawarte

w płynie celomatycznym, mają zdolność niszczenia bakterii Gram-ujemnych i Gram-

dodatnich. Działanie to wiąże się z funkcją białek, które przyłączają się do receptorów

zlokalizowanych w ścianie komórkowej bakterii. Wskutek tego następuje rearanżacja

struktury błony komórkowej, prowadząc do nieodwracalnych zmian, a tym samym do

destrukcji komórek bakteryjnych [4-6].

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

105

4. Pasta otrzymana z dżdżownic Eudrilus eugeniae i jej aktywność

przeciwbakteryjna

Przygotowanie pasty z dżdżownic rozpoczyna się od głodzenia dojrzałych

dżdżownic Eudrilus eugeniae. następnie zostawia się je na działanie promieni

słonecznych. Wskutek tego zabiegu dżdżownice wydzielają śluz i płyn celomatyczny,

który umożliwia rozkład tych organizmów. Otrzymana jest wtedy masa, którą poddaje

się filtracji i skropleniu w łaźni wodnej, by potem mogła zostać rozcieńczona [15].

Do badań właściwości przeciwbakteryjnych wybrano pięć szczepów bakterii do

których należą: Escherichia coli, Salmonella abony, Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus, Klebsiella pneumoniae. Światowa Organizacja Zdrowia utworzyła specjalną

listę bakterii, charakteryzujących się wysoką patogennością, wśród których znalazły

się m.in. E. coli oraz S. aureus. Wyróżnia je duża oporność na stosowane leki przeciw-

bakteryjne oraz powodowanie szczególnie niebezpiecznych zakażeń u ludzi [15].

Test przeciwbakteryjny wykonywano metodami: dyfuzji krążkowej oraz

studzienkową w trzech powtórzeniach. Po wysianiu bakterii na podłoże stałe

nanoszono, w zależności od próby po 100 μl lub 50 μl roztworu pasty na jałowy

krążek, który był umieszczany na środku płytki Petriego z wyrośniętym szczepem.

Natomiast w metodzie studzienkowej, nanoszono odpowiednią ilość przygotowanego

preparatu do studzienek. W obu metodach jako dodatnią próbę kontrolną zastosowano

roztwór tetracykliny [15].

Otrzymane wyniki potwierdzają nie tylko samą obecność aktywności przeciw-

bakteryjnej, ale również i to, że w stosunku do niektórych szczepów jest ona bardzo

wysoka. Po zastosowaniu pasty rozwój wszystkich szczepów został zahamowany.

Wykazano inhibicję wzrostu mikroorganizmów zależną od zastosowanej dawki. Po

użyciu dawki 100 μl uzyskała ona maksymalną wartość w przypadku bakterii

Staphyloccocus ureus oraz Klebsiella pneumoniae. Najbardziej opornym szczepem

w porównaniu do pozostałych okazał się szczep Salmonella abony [15].

Analogiczne doświadczenie zostało wykonane z użyciem szczepów bakterii Vibrio

cholerae, Vibrio parahaemoliticus, Salmonella typhi oraz szczepów już wcześniej pod

tym kątem przebadanych takich jak: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus oraz

Escherichia coli. Test wykonano wcześniej wspomnianą metodą studzienkową.

Wyniki potwierdziły wcześniej otrzymane rezultaty, ponieważ pasta przygotowana

z dżdżownic ponownie maksymalnie hamowała wzrost Escherichia coli, Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus, natomiast pozostałe szczepy nie wykazywały stref

inhibicji [12].

5. Porównanie aktywności przeciwbakteryjnej pudru uzyskanego

z dżdżownic Lumbricus rubellus, Eudrilus eugeniae, Lampito mauritii,

Perionyx excavatus, Eisenia fetida

Dalsze badania prowadzące do wykazania aktywności przeciwbakteryjnej

dżdżownic sprowadzały się do analizy pudru pozyskanego z tych organizmów. Sposób

jego wytworzenia wykazuje pewne nieznaczne różnice w zależności od gatunków

dżdżownic. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa badana była przy użyciu metody

dyfuzyjno-krążkowej Kirby i Bauera. Polegała ona na umieszczeniu nasączonych

ekstraktem z pudru krążków na płytki z podłożem zaszczepionym drobnoustrojami.

Sylwia Borkusewicz, Dominika Chrząszcz, Aleksandra Horbowicz, Marta Fiołka

106

Następnie badano wielkość strefy inhibicji, przy jednoczesnym wykorzystaniu prób

kontrolnych [16].

Działanie przeciwbakteryjne sprawdzano, stosując puder uzyskany z różnych

gatunków dżdżownic. Puder pozyskany z gatunku dżdżownicy Lumbricus rubellus

wykorzystany był do badań przeciwbakteryjnych, skierowanych przeciwko drobno-

ustrojom lekoopornym, takim jak Pseudomonas aeruginosa oraz metycilinoopornym

– Staphyloccocus aureus. Jednocześnie badano działanie przeciwgrzybicze

na przykładzie szczepu Candida albicans opornego na flukonazol. Puder otrzymany

został po wysuszeniu pasty, a następnie jej rozpyleniu i filtracji. Badania tego

preparatu prowadzono w pięciu różnych stężeniach, porównując z kontrolą negatywną.

Następnie przeprowadzono analizę roztworów za pomocą metody dyfuzyjno-

krążkowej. Inokulum zawieszono w sterylnym 0,9 % NaCl, a gęstość optyczną

zawiesiny mierzono za pomocą spektrofotometru przy długości fali 625 nm dla bakterii

Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus. Testowane mikroorganizmy

zaszczepiono na podłoże. Krążki nasączano roztworem pudru o różnych stężeniach

i układano na płytkach z podłożem. Wyniki wykazały, iż puder ten w każdym stężeniu

hamował wzrost bakterii P. aeruginosa i opornego na flukonazol grzyba C. albicans.

Prowadzone badania wykazały obecność peptydu przeciwbakteryjnego AMP

u Lumbricus rubellus, zwanego lumbrycyną-1, który wykazuje szerokie działanie

przeciwbakteryjne zarówno w stosunku do bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych

jak i grzybów [16].

Innym gatunkiem dżdżownicy, z której pozyskano puder w celu zbadania

aktywności przeciwbakteryjnej była Eudrilus eugeniae. Procedura jego otrzymania

różni się nieco od tego uzyskanego z L. rubellus. Po oczyszczeniu organizmów

umieszczano wcześniej odważone tkanki w homogenizatorze i rozdrabniano je

w mieszaninie chloroform-metanol [17, 18]. Następnie preparat pozostawiano do

odparowania w wyparce i poddano liofilizacji. Badania prowadzone były przy

zastosowaniu 14 różnych szczepów bakterii: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis,

Esherichia coli, Esherichia faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus

vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella paratyphi (A i B), Serratia

marcescens, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes

oraz 5 rodzajów grzybów, również przy użyciu metody dyfuzyjno - krążkowej.

Odmierzoną ilość pudru rozcieńczono w DMSO i nasączone krążki układano na

zaszczepioną powierzchnię na płytkach. Dodatkowo zastosowano tetracyklinę

i erytromycynę jako pozytywne kontrole, zaś 5% DMSO jako kontrolę negatywną. Po

inkubacji obserwowano strefy zahamowania wzrostu. Okazało się, że maksymalna

inhibicja występowała w przypadku S. aureus, natomiast jej brak zaobserwowano

w przypadku E. facealis, S. parathypi (A i B), S. marcences i E. faecalis. Puder

z E. eugeniae może być używany jako antybiotyk przeciw drobnoustrojom m.in. ze

względu na zawartość pewnych związków litycznych. Związki przeciwdrobno-

ustrojowe, takie jak: flawonoidy, fenole i związki lityczne, znajdujące się w płynie

trawiennym dżdżownic, są produkowane w ich ciele, a nie za pomocą mikro-

organizmów glebowych dostających się do ich układu pokarmowego. Flawonoidy

mogą wspomagać przebieg reakcji tlenowych przeprowadzonych przez fagocyty

w procesie zwalczania bakterii B. subtilis, B. thuringiensis, P. vulgaris, S. pyogenes

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

107

i K. pneumnoniae. Badania wskazują na to, że związki te mają zdolność do penetracji

ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych (środowisko hydrofobowe) i Gram-

dodatnich (środowisko hydrofilowe), odpowiadając za aktywność przeciwbakteryjną

i przeciwgrzybiczą [17].

Kolejnym gatunkiem dżdżownicy, użytym do badań był Lampito mauritii.

Organizmy te, po odpowiednim przygotowaniu i oczyszczeniu przetwarzano na puder.

Aktywność przeciwbakteryjna badana była przy użyciu metody dyfuzyjno-krążkowej,

dzięki której określano wielkość strefy inhibicji. Wykorzystano puder w 4 rozcień-

czeniach, oddziałując na 3 różne bakterie: Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,

Aeromonas hydrophila. Jako kontrolę pozytywną zastosowano antybiotyk

– erytromycynę. Ekstrakt etanolowy, przygotowany z pudru z dżdżownicy L. mauriti,

w porównaniu z ekstraktem w eterze naftowym i eterze wodnym przeciwko bakterii

A. hydrophila wykazał maksymalną aktywność. Strefa zahamowania wynosiła 16 mm,

mniejszą aktywność zauważono w przypadku S. typhi. Wykazano, iż dawka 200 µl

jest minimalna do wykazania właściwości przeciwdrobnoustrojowych [2]. Z pozys-

kanego pudru przygotowano ekstrakt wodny oraz ekstrakt w octanie etylu w celu

zbadania ich wpływu na wybrane gatunki bakterii. Innym opisanym w tym zestawieniu

gatunkiem jest Perionyx excavatus. Pozyskany z niego puder testowany był przeciwko

takim bakteriom jak P. aeruginosa, E. coli i S. aureus. Badania wykazały, iż ekstrakt w

octanie etylu z pudru był bardziej efektywny przeciwko bakteriom P. aeruginosa,

podczas gdy ekstrakt wodny działał silniej na E. coli, S. aureus [19].

Ostatnim testowanym gatunkiem dżdżownicy w tych badaniach była Eisenia fetida.

Analizy zostały przeprowadzone z użyciem takich szczepów bakterii jak S. aureus,

E. coli oraz P. aeruginosa. W przeciwieństwie do pozostałych przedstawionych

gatunków dżdżownic, w tym przypadku nie wykazano aktywności antybakteryjnej [18].

6. Wybrane bakterie jelitowe zwalczające inne mikroorganizmy

Mikroorganizmy zasiedlające jelita dżdżownic odgrywają ważną rolę w ich

funkcjonowaniu. Są obecne w przewodzie pokarmowym, by wspomagać przemianę

składników odżywczych. Takie oddziaływania możemy nazwać mutualizmem [20].

Niektóre z gatunków bakterii są w stanie rozmnażać się w świetle przewodu

pokarmowego. Mogą one wnikać do ich ciała przez skórę z zewnątrz. Mają zdolność

do przeżycia w kokonach. Ich liczba i wzrost może być uzależniona od środowiska

w jakim pierścienica przebywa [21, 22]. Dżdżownice muszą być utrzymywane

w jednakowych warunkach, aby można było wyizolować bakterie symbiotyczne.

Jakakolwiek zmiana w odżywianiu bądź warunkach klimatycznych może wpłynąć na

zróżnicowanie wśród mikroorganizmów bytujących w przewodzie pokarmowym

dżdżownic [23].

Jedne z pierwszych badań nad mikroorganizmami w ciele pierścienicy wykazały

obecność bakterii w całym przewodzie pokarmowym, a także fakt ich udziału

w metabolizowaniu pobieranego pokarmu. Przez analizę reakcji rozkładu celulozy

i chityny udowodniono, że mikroflora w jelicie dżdżownicy jest zróżnicowana

ilościowo. Jednak nie wykazano dokładnego składu i ilości mikroorganizmów

jelitowych [24, 7].

Sylwia Borkusewicz, Dominika Chrząszcz, Aleksandra Horbowicz, Marta Fiołka

108

W kolejnych latach przeprowadzono dokładniejszą analizę skupiającą się na

określeniu lokalizacji poszczególnych populacji mikroorganizmów w ciele dżdżow-

nicy, a dokładniej w jelicie Eudrilus eugeniae. Podczas izolacji bakterii barwiono je

oraz przeprowadzano selekcję, polegającą na diagnozowaniu obecności prodigiozyny.

Dzięki badaniom morfologicznym jelita dżdżownicy stwierdzono, że związek ten

występuje w bakteriach Serratia marcescens [7].

Bakterie z rodzaju Mycobacterium wywołują choroby zwane mykobakteriozami.

Mikroorganizmy te nie infekują zdrowych dorosłych osób, natomiast często spotykane

u ludzi z upośledzeniem układu immunologicznego. Mykobakterie cechują się dużą

odpornością zarówno na czynniki środowiskowe jak i na działanie substancji chemicz-

nych. Ze ściany jelita środkowego dżdżownicy Dendrobaena veneta wyizolowano

bakterię symbiotyczną Raoultella ornithinolytica, wytwarzającą metabolity o działaniu

przeciwprątkowym przeciwko: Mycobacterium butiricum, Mycobacterium juho,

Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium phlei. Po inkubacji prątków z ekstraktem

z bakterii R. ornithinolytica obserwowano deformację komórek prątków oraz zaburzenie

podziału komórkowego. Zanotowano istotne obniżenie przeżywalności mykobakterii

poddanych działaniu ekstraktu. Do obrazowania komórek poddanych działaniu

ekstraktu wykorzystano różne techniki mikroskopowe [26].

Badania te wykazały, że ekstrakt wpływał destrukcyjnie na prątki z rodzaju

Mycobacterium. Zaobserwowano wyraźną, stopniową degradację struktury ściany

komórkowej wszystkich badanych szczepów prątków saprofitycznych. W rezultacie

dochodziło do zaburzenia ważnych procesów metabolicznych prątków [25].

Podsumowanie

Badania prowadzone nad dżdżownicami doprowadziły do uzyskania z nich różnego

rodzaju preparatów. Należą do nich m.in.: pozyskiwany z różnych gatunków

dżdżownic puder, pasta czy płyn celomatyczny. Wykazano, iż preparaty pozyskane

z dżdżownic, mogą skutecznie działać na szczepy lekoopornych bakterii. Istotną rolę

odgrywają również bakterie jelitowe dżdżownic. Zawierają one szereg związków,

które działają skutecznie na wybrane patogeny. Biorąc pod uwagę fakt wzrostu

oporności na antybiotyki, aktywność ta ma potencjalne znaczenie aplikacyjne.

Wykazanie efektu przeciwprątkowego metabolitów bakterii symbiotycznych

Dendrobaena veneta może przyczynić się do wykorzystania związków wytwarzanych

przez te mikroorganizmy, a tym samym do opracowania antybiotyków przeciw-

prątkowych.

Literatura

1. Błaszak C. (red.), Zoologia. Bezkręgowce, Wydawnictwo PAN Warszawa, Tom 1, (2013),

635-646.

2. Bhorgin A. J., Uma K., Antimicrobial activity of earthworm powder (Lampito mauritii),

International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 3, (2014), 437-443.

3. Buczek J., Deptuła W., Gliński Z., Jarosz J., Stosik M., Wernicki A., Immunologia

porównawcza i rozwojowa zwierząt, (2000), 87-103.

4. Gliński Z., Jarosz J., Książkiewicz-Kapralska M., Markowska M., Skwarło-Sonta K.,

Immunologia porównawcza, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, 1999, 31-33.

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

109

5. Matejko S., Pocheć E., Homa J., Dżdżownice jako źródło biologicznie aktywnych cząsteczek

– właściwości przeciwnowotworowe białek dżdżownic, Kosmos, 65, (2016), 23-32.

6. Tahseen Q., Coelomocytes: biology and possible immune functions in invertebrates with

special remarks on nematodes, International Journal of Zoology, (2009), 1-13.

7. Sruthy P. B., Anjana J. C., Rathinamala J., Jayashree, S., The role of red pigment

prodigiosin from bacteria of earthworm gut as an anticancer agent, Journal of

Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 4, (2014), 246-251.

8. Pan W., Liu X., Ge F., Zheng T., Reconfirmation of antimicrobial activity in the coelomic

fluid of the earthworm Eisenia fetida andrei by colorimetric assay, Journal of Biosciences,

28, (2004), 723-731.

9. Mohan A., Pandurangan S., Nagalingam. S., An in vitro analysis of earthworm coelomic

fluid against select pathogens, International Journal of Recent Scientific Research, 4,

(2013), 2035-2038.

10. Arslan-Aydoğdu E., Çotuk A., Antibacterial and hemolytic activity of the coelomic fluid of

Dendrobaena veneta (Oligochaeta, Lumbricidae) living in different localities, Istanbul

University Faculty of Science Journal of Biology, 67(1), (2008), 23-32.

11. Kathireswari P., Alakesan A., Abirami P., Sangeetha P., Antimicrobial activity of

earthworm coelomic fluid against disease causing microorganisms, International Journal

of Current Microbiology and Applied Sciences, 3(8), (2014), 608-613.

12. Sethulakshmi K. C., Ranilakshmi K. C., Thomas A. P., Antibacterial and Antifungal

potentialities of earthworm Eudrilus eugeniae paste and coelomic fluid, Asian Journal of

Biology, 5, (2018), 1-7.

13. Gliński Z., Jarosz J., Zjawiska odporności przeciwzakaźnej u bezkręgowców, Wyd.

UMCS, Lublin, 1997, 74-86.

14. Olchawa E., Płytycz B., Hodowla in vitro celomocytów dżdżownic Dendrobaena veneta,

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 498, (2004), 153-158.

15. Vasanthi K,. Chairman K., Ranjit Singh A. J. A., Antimicrobial activity of earthworm

(Eudrilus eugeniae) paste, African Journal of Environmental Science and Technology, 7,

(2013), 789-793.

16. Rinanda T., Octavia R. S., Fhonsa M., Fitra M., Broad spectrum antimicrobial activity of

Lumbricus rubellus powder against drug resistant microbes, AIC Univeritas Syiah Kuala,

4(2), (2014), 113-118.

17. Anitha J., Jayraaj I. A., In-vitro antibacterial activity and evaluation of flavonoid and

phenol in earthworm Power (Eudrilus eugeniae), World Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, 2, (2013), 4917-4928.

18. Ansari A. A., Sitaram K., An Investigation into the anti-microbial and anti-fungal

properties of earthworm powder obtained from Eisenia fetida, American Journal of Food

Technology, 6, (2011), 329-335.

19. Punu P. G., Ansari A., Jaikishun S., Seecharran D., Effect of earthworm (Perionyx

excavatus) powder on selected bacteria and fungi, Journal of Advances in Biology and

Biotechnology, 5, (2006), 1-15.

20. Brito-Vega H., Espinosa-Victoria D., Bacterial diversity in the digestive tract of

earthworms (Oligochaeta), Journal of Biological Sciences, 9 (3), (2009), 192-199.

21. Balamurugan M., Parthasarathi K., Cooper E. L., Ranganathan L.S., Earthworm paste

(Lampito mauritii, Kinberg) alters inflammatory, oxidative, haematological and serum

biochemical indices of inflamed rat, European Review for Medical and Pharmacological

Sciences, 11, (2007), 77-90.

22. Govindarajan B., Prabaharan V., Gut micro-flora of earthworms: a review, American

Journal of Biological and Pharmaceutical Research.;1(3), (2014), 125-130.

Sylwia Borkusewicz, Dominika Chrząszcz, Aleksandra Horbowicz, Marta Fiołka

110

23. Thakuria D., Schmidt O., Finan D., Egan D., Doohan F. M., Gut wall bacteria of

earthworms: a natural selection process, The ISME Journal, 4, (2010), 357–366.

24. Parle J.N., Micro-organisms in the intestines of Earthworms, Journal of General

Microbiology, 31, (1963), 1-11.

25. Fiołka M. J., Zagaja M., Piersiak D. T., Wróbel M., Pawelec J., Gut bacterium of

Dendrobaena veneta (Annelida: Oligochaeta) possesses antimycobacterial activity,

Journal of Invertebrate Pathology, 105, (2010), 63-73.

26. Fiołka M. J., Grzywnowicz K., Mendyk E., Zagaja M., Szewczyk R., Rawski M., Keller

R., Rzymowska J., Wydrych J., Antimycobacterial action of a new glycolipid – peptidee

complex obtained from extracellular metabolites of Raoultella ornithinolytica, APMIS,

123 (12), (2015), 1069-1080.

Analiza aktywności przeciwbakteryjnej u dżdżownic

Streszczenie

Celem pracy była charakterystyka aktywności przeciwbakteryjnej różnych preparatów pozyskiwanych

z organizmu dżdżownic. Przeanalizowano wyniki badań dotyczących ich działania na rożne szczepy,

często też patogenne dla człowieka. Opisano preparaty o aktywności przeciwbakteryjnej takie jak: płyn

celomatyczny, puder, pasta, czy też ekstrakt z bakterii jelitowych. W badaniach były zastosowane metody

dyfuzyjno-krążkowe, studzienkowe oraz mikroskopowe. Analiza substancji pozyskanych z dżdżownic

może przyczynić się do rozwoju antybiotyków o działaniu przeciwbakteryjnym.

Słowa kluczowe: dżdżownice, puder, pasta, płyn celomatyczny, bakterie jelitowe

Analysis of antibacterial activity in earthworms

Abstract

The aim of the work was to characterize the antibacterial activity of various preparations obtained from

earthworms. The results of studies on their effect on various strains, often also pathogenic for humans,

have been analyzed. Formulations with antimicrobial activity, such as: coelomic fluid, powder, paste, or

intestinal bacteria extract were described. Diffusion-disc, well-well and microscopic methods were used in

the research. Analyze of the substances obtained from earthworms may contribute to the development of

antibiotics with antibacterial activity.

Keywords: earthworms, powder, paste, coelomic fluid, intestinal bacteria

111

Sylwia Ciesielska1, Patryk Bil

2, Anna Jama

3

Analiza przeżywalności i żywotności komórek

nowotworowych po promieniowaniu UV

1. Wstęp

Najmniejszą jednostką materii, która może przeprowadzać procesy życiowe jest

komórka. Komórki mogą powstawać na drodze podziału z żyjącej już komórki na dwie

komórki potomne. Różnią się od siebie rozmiarem, kształtem i funkcjami. Składają się

z nich wszystkie organizmy, które mogą istnieć zarówno jako pojedyncza komórka,

jak i współpracujące zespoły komórek. Ich ilość jest różna w zależności od gatunku,

w ludzkim ciele znajduje się około 1013

-1014

komórek 300 różnych typów. Komórki

otoczone są błoną komórkową i składają się w większości z wody. Mogą zawierać

organella występujące w cytoplazmie w różnych proporcjach w zależności od struktury

oraz pełnionej funkcji. Ilość komórek w organizmach wielokomórkowych jest ściśle

kontrolowana. W procesie podziału komórkowego zwanego cyklem komórkowym,

regularnie wytwarzane są nowe komórki. Ich ilość jest regulowana w procesie

zaprogramowanej śmierci – apoptozy, w którym w szczególności stare lub uszkodzone

komórki popełniają samobójstwo i są usuwane z organizmu. Jest to zjawisko naturalne,

a zaburzenia cyklu komórkowego i apoptozy mogą skutkować zaburzeniami

w funkcjonowaniu całego organizmu [1, 2].

Ilość komórek w populacji jest ściśle kontrolowana. W dorosłych organizmach

apoptoza, zaprogramowana śmierć komórki stanowi balans dla cyklu komórkowego.

Komórka organizmu wielokomórkowego jest członkiem zorganizowanej struktury.

Jeśli komórki są niepotrzebne lub uszkodzone popełniają samobójstwo – wchodząc

w program apoptozy, którego kluczowym elementem jest aktywacja prokaspaz.

Apoptoza występuje podczas rozwoju i starzenia się jako mechanizm utrzymujący

homeostazę, ma na celu utrzymanie populacji komórek w tkankach w odpowiedniej

kondycji. Występuje również jako mechanizm ochronny dla organizmu zapewniając

usuwanie uszkodzonych komórek. Jej zaburzenia często towarzyszą procesom

onkogenezy, a w medycynie umiejętność regulacji apoptozy może mieć ogromny

potencjał terapeutyczny Alternatywną śmiercią komórki jest nekroza, która uważana

jest za proces toksyczny, degradujący komórkę. Proces śmierci komórkowej jest

aktywowany przez czynniki zewnętrzne, które wymagają przesłania sygnałów do jądra

oraz cytoplazmy [2, 3]. Promieniowanie UV jest to niewidoczne dla ludzkiego oka, niejonizujące promie-

niowanie elektromagnetyczne, naturalnie emitowane przez Słońce. Podzielone jest umownie na trzy główne frakcje UVA (315-400nm), UVB (280-315nm) i UVC

1 sylwia.ciesielska@polsl.pl, Zakład Inżynierii Systemów, Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki,

Politechnika Śląska 2 patryk.bil@pols.pl, Zakład Inżynierii Systemów, Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki,

Politechnika Śląska 3 anna.jama@polsl.pl, Katedra Informatyki, Wydział Inżynierii Materiałowej i Metalurgii, Politechnika Śląska

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

112

(100-280nm) [4, 5]. Promieniowanie UVA stanowi ok. 95% promieniowania UV docierającego do powierzchni Ziemi [6]. Dociera do warstwy skóry właściwej oraz warstwy podskórnej, jest potencjalnie kancerogenne i bezpośrednio zaangażowane w fotostarzenie się skóry [7]. Zmiany spowodowane UVA obejmują m.in degradację tkanki łącznej czy zmniejszenie ilości włókien kolagenowych. UVA wywołuje indukcję reaktywnych form tlenu. Zarówno DNA, jak i białka absorbują UVA nieznacznie, niemniej jednak UVA wprowadza zmiany w strukturze DNA (Indukcja dimerów pirymidynowych i pojedynczoniciowe pęknięcia DNA). W 1970 roku udowodniono, że ma ono mutagenny wpływ na komórki ssaków [4, 8].

Jednym z elementów pracy było zbadanie żywotności (ang. viability) oraz przeżywalności ludzkich komórek nowotworowych linii HCT116 (nowotwór jelita grubego, ang. Human Colorectal Carcinoma) pod wpływem ekspozycji na różne dawki promieniowania UVA w czasie (0, 6, 12 oraz 24 godziny od napromie-niowania). Przeżywalność pozwala na określenie ile komórek pozostaje żywych w populacji komórkowej po zadziałaniu czynnika. Oznacza się ją między innymi metodą z użyciem barwnika Trypan Blue, który przechodzi przez błony umierających lub martwych komórek i wybarwia je na niebiesko. Pozwala to na procentowe określenie liczby żywych oraz martwych komórek w danej próbce. Żywotność określa intensywność metabolizmu w komórkach wystawionych na działanie danego czynnika. Intensywność aktywności metabolicznej komórek badana jest za pomocą testu MTS, w którym komórki przekształcają sól tetrazolową do formazanu za pomocą dehydro-genazy NADPH zależnej. Zdolność do produkcji formazanu mają zdrowe komórki, dzięki temu możliwe jest określenie procentu funkcjonalnych komórek oraz wpływu badanego czynnika na żywotność danej linii komórkowej. Takie zestawienie testów umożliwia dokładną charakterystykę populacji komórek oraz określenie jaki procent komórek pozostaje funkcjonalny wśród tych, które przeżywają dany stresor, w tym przypadku promieniowanie UVA przy ekspozycji na różne dawki, w różnym czasie od napromieniowania.

2. Materiały i metody

2.1. Komórki i wykorzystywane procedury

Materiał badawczy stanowiły ludzkie komórki nowotworu jelita grubego (Human Colorectal Carcinoma (HCT116)) we wczesnych pasażach. Komórki były hodowane w DMEM:F12 (Dulbecco Modified Eagle Medium) HAM (1:1) (Sigma, Germany) wzbogacone 10-procentową bydlęcą surowicą płodową (PAA/Immuniq, Polska). Komórki były inkubowane w standardowych warunkach 37

oC, 80% wilgotności, 5%

dwutlenku węgla. Około 12 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu i napro-mieniowaniem komórki inokulowano na szalki (Sarstedt, nr kat. #83.3901.300, Nümbrecht) po 10 tysięcy dla komórek przeznaczonych do analizy mikroskopowej z barwnikiem Trypan Blue oraz płytki 96 dołkowe (Sarstedt, nr kat. #83.3924, Nümbrecht) po 10 tysięcy/dołek dla testu MTS. Przed napromieniowaniem zebrano medium oraz zdjęto nakrywki. Konfluencja komórek wynosiła ok. 40-60% w zależ-ności od eksperymentu. Komórki zostały napromieniowane w temperaturze pokojowej (21

oC) dawką 0,5, 10 oraz 30kJ/m

2 UVA urządzeniem CL-100 models, UVP, Upland,

CA, USA. Po napromieniowaniu dodano świeżego medium. Komórki inkubowano przez wyznaczony wcześniej czas 0, 6, 12 oraz 24 godziny w standardowych warunkach.

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych po promieniowaniu UV

113

2.2. Test MTS – żywotność

Test żywotności komórek MTS został przeprowadzony przy użyciu 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium

salt (MTS). (Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)

dla komórek kontrolnych oraz napromieniowanych. Wyniki zostały przedstawione

jako krotność zmiany (ang. fold change) w odniesieniu do kontroli.

2.3. Test z barwnikiem Trypan Blue – przeżywalność

Test przeżywalności został wykonany za pomocą barwnika Trypan Blue (Sigma

Aldrich, nr kat. #T6146-5G, Niemcy), który przechodzi przez błony martwych lub

umierających komórek, wybarwiając je na niebieski kolor. Procent komórek żywych

i martwych obliczany był ze stosunku liczby komórek zaklasyfikowanych do danej

grupy, do ogólnej liczby zliczanych komórek (1000 komórek/próbka).

2.4. Analiza statystyczna

Wyniki przedstawione w pracy dla zostały uzyskane w trzech niezależnych

eksperymentach, a prezentowane dane zostały sprawdzone testem statystycznym

t-Studenta na poziomie istotności p<0,05.

3. Wyniki

Wszystkie ryciny rozdziału 3 przedstawiają uśrednione wyniki z trzech niezależ-

nych eksperymentów zarówno dla testów przeżywalności oraz żywotności metabo-

licznej. Wyniki przeżywalności przedstawione są jako procenty żywych komórek

z populacji komórek kontrolnych lub eksponowanych na różne dawki promieniowania

UVA. Natomiast wyniki żywotności metabolicznej przedstawiają procenty aktywnych

w przetwarzaniu formazanu komórek. Oba testy przeprowadzono na ludzkich

komórkach nowotworowych linii HCT116, napromienianych dawkami: 0,5, 10,

30kJ/m2 i obserwowanych w różnych czasach od napromieniowania

3.1. Wyniki testu MTS

Wyniki testu MTS odzwierciedlają zmiany żywotności komórek w czasie i są

przedstawione na wykresach jako absorbancja w komórkach eksponowanych na

promieniowanie UVA, odniesiona do absorbancji komórek kontrolnych. Wykres 1A

dla dawki 0,5kJ/m2, 1B dla dawki 10kJ/m

2 oraz wykres 1C dla dawki 30kJ/m

2,

natomiast Wykres 2 przedstawia łącznie wszystkie dawki i pozwala na zbiorczą

interpretację wyników. Na wszystkich rysunkach zaznaczono widoczną czarną linią

poziom żywotności komórek kontrolnych.

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

114

Wykres 1. Zmiany absorbancji komórek badane za pomocą testu MTS dla ludzkich komórek HCT116.

A dawka 0,5kJ/m2 . B dawka 10kJ/m2 *istotne statystycznie obniżenie żywotności, p-wartość: 0,03. C dawka

30kJ/m2 . *istotne statystycznie obniżenie żywotności, p-wartość: <0,01 **istotne statystycznie obniżenie

żywotności, p-wartość: 0,02 ***istotne statystycznie obniżenie żywotności, p-wartość: 0,02. Wyniki

przedstawiono w odniesieniu do kontroli oznaczonej na wykresie czarną, poziomą linią.

Źródło: Opracowanie własne

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych po promieniowaniu UV

115

Po napromieniowaniu dawką 0,5kJ/m2 komórek linii HCT116 nie obserwujemy

zmian żywotności w odniesieniu do próby kontrolnej. W 24 godzinie od napromie-

niowania widoczne jest nieznaczne obniżenie żywotności, jednak nie jest znamienne

statystycznie. (Wykres 1A).

Po napromieniowaniu dawką 10kJ/m2 komórek linii HCT116 można zaobserwować

nieznaczne obniżenie żywotności komórek w 6 godzinie oraz znaczne dla 12 godziny

w odniesieniu do kontroli, natomiast w 24 godzinie od napromieniowania żywotność

komórek ponownie wraca do poziomu kontroli (Wykres 1B). Obniżenie żywotności

w 12 godzinie jest istotne statystycznie (p-wartość: 0,03).

W przypadku zastosowania dawki 30kJ/m2 można zaobserwować istotne

statystycznie obniżenie żywotności komórek od razu po napromieniowaniu (p-wartość:

<0,01). W 6 godzinie od napromieniowania obniżenie żywotności utrzymuje się na

poziomie podobnym do 0 godziny, jednak nie jest istotne statystycznie. Dla 12 oraz 24

godziny obserwowane jest znaczne obniżenie żywotności, istotne statystycznie

(p-wartość: 0,02 dla 12 i 24 godziny).

Wykres 2. Zmiany absorbancji komórek badane za pomocą testu MTS dla ludzkich komórek linii HCT116

napromieniowanych promieniowaniem UVA w odniesieniu do nienapromieniowanej kontroli w czasie dla

dawek 0,5, 10, oraz 30kJ/m2. *Istotne statystycznie obniżenie żywotności komórek.

Źródło: opracowanie własne

W zależności od użytej dawki promieniowania UVA 0,5, 10 lub 30kJ/m2 zmienia się

odpowiedź komórek. Komórki reagują w różny sposób na ekspozycję na różne dawki

promieniowania UVA, w sposób niezależny od wzrostu dawki promieniowania.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 6 12 24

Ab

sorb

ancj

a

Liczba godzin od napromieniowania

30kJ

10kJ

0.5kJ

* * * *

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

116

3.2. Przeżywalność komórek narażonych na promieniowanie UVA (wyniki testu z użyciem barwnika Trypan Blue)

Wyniki testu przeżywalności z wykorzystaniem barwnika Trypan Blue przedsta-wiają zmiany przeżycia i śmierci komórek w czasie 0, 6, 12 i 24 godziny od napromieniowania Wykres 3 dla dawki 0,5kJ/m

2, 10kJ/m

2, 30kJ/m

2 oraz kontroli.

Procent komórek żywych w przypadku najniższej dawki promieniowania 0,5kJ/m2 jest

podobny do poziomu kontroli, co wskazuje na brak wpływu promieniowania UVA w tej dawce na komórki linii HCT116. W przypadku dawki 10kJ/m2 procent komórek żywych wzrasta wraz z upływem czasu, w 24 godzinie osiągając poziom podobny do komórek kontrolnych. W przypadku dawki 30kJ/m2 poziom komórek jest znamiennie statystycznie niższy niż w komórkach kontrolnych i nie ulega znacznemu podwyższeniu w ciągu całego czasu obserwacji.

Wykres 3. Procentowy udział żywych komórek linii HCT116, po promieniowaniu UVA w czasie. *istotnie

statystycznie niższy procent komórek żywych niż w komórkach kontrolnych (p-wartość od lewej: 0,01; <0,01; <0,01; <0,01; 0,03; <0,01; <0,01)

Źródło: Opracowanie własne

4. Dyskusja

Zaprezentowane wyniki pokazują różnice występujące pomiędzy żywotnością i przeżywalnością komórek w zależności od dawki promieniowania UVA w czasie dla linii HCT116. Na wykresach 4A, 4B oraz 4C przedstawiono porównanie dla obu tych testów, które pokazuje, że sama przeżywalność nie odzwierciedla żywotności komórek, ale może być z nią powiązana.

W przypadku dawki 0,5kJ/m2 czyli dawki, która może być traktowana jako

stosunkowo niska dawka, wyniki przeżywalności oraz wyniki żywotności pokrywają się. Widoczna na Wykresie 4A nieznaczenie większa żywotność sprawia, że w godzinie 12 występuje poprawa przeżywalności, która przewyższa nawet poziom zmierzony w kontroli. Oznacza to, że dawki z tego zakresu promieniowania mogą wpływać pozytywnie na proliferację komórek i powodować nieznaczne zwiększenie ilości podziałów. Dodatkowo tak niska dawka nie wpływa negatywnie na komórki i nie powoduje ich śmierci.

0

20

40

60

80

100

0H 6H 12H 24H

% K

om

óek

żyw

ych

Liczba godzin od napromieniowania

K 0,5kJ 10kJ 30kJ

*

* *

*

*

* *

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych po promieniowaniu UV

117

Wykres 4. Porównanie żywotności i przeżywalności dla komórek linii HCT116, w czasie 0, 6, 12 oraz 24

godziny od ekspozycji na promieniowanie UVA w odniesieniu do nienapromieniowanej kontroli. A dla dawki

0,5kJ/m2 , B dla dawki 10kJ/m2 , C dla dawki 30kJ/m2 UVA. * istotne statystycznie obniżenie

przeżywalności w stosunku do żywotności. Czarną, poziomą linią oznaczono poziom kontroli.

Źródło: Opracowanie własne

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

118

W przypadku dawki 10kJ/m2 żywotność i przeżywalność nie pokrywają się ze sobą,

występuje pomiędzy nimi odwrotna korelacja. Dawka 10kJ/m2 została przez nas

zaklasyfikowana jako dawka średnia, jednak na Wykresie 4B można zaobserwować, że

duży odsetek komórek nie przeżył takiej dawki promieniowania. Co ciekawe sama

żywotność komórek nie została zmieniona i w pierwszej godzinie utrzymuje się na

poziomie kontroli. Oznacza to, że komórki, które przeżyły muszą bardzo intensywnie

funkcjonować, co w kolejnych chwilach czasu przekłada się na wzrost liczebności

żywej populacji. W 12 godzinie następuje wyhamowanie zintensyfikowanej pracy

komórek, ale ponownie przekłada się to na zwiększoną liczebność populacji. Pomimo,

że dawka spowodowała śmierć połowy populacji bezpośrednio po napromieniowaniu,

po 12 godzinach liczebność wraca do normy.

W przypadku dawki 30kJ/m2 żywotność utrzymuje się na dość wysokim poziomie

jednak w obserwowanym czasie nie powoduje zwiększenia przeżywalności badanej

populacji.

Zjawisko różnej odpowiedzi komórek w testach żywotności i przeżywalności

można wytłumaczyć różną charakterystyką wybranych dawek promieniowania UVA.

Dawki na poziomie 0,5kJ/m2 to dawki niskie opisywane jako dawki, które nie

wpływają na proliferację komórek linii HCT116, dawka 10kJ/m2 to dawka, która

stymuluje proliferację komórek w znaczny sposób, dawka 30kJ/m2 to dawka wysoka,

przy której następuje zahamowanie proliferacji [9].

Odnosząc się do poprzednio uzyskanych przez nas wyników badań, które mają na

celu wyjaśnienie efektu stymulacji proliferacji przez specyficzne dla danej linii dawki

promieniowania [9] oraz łącząc je z eksperymentami przedstawionymi w monografii,

można wysunąć wniosek, że komórki intensyfikują mechanizmy związane z podzia-

łami komórek, ale mechanizmy te nie mają związku z samą żywotnością. W przypadku

dawki 30kJ/m2, która w pierwszych chwilach od napromieniowania powoduje wysoką

śmierć komórek jak i dawka stymulująca 10kJ/m2, pomimo utrzymywania się

żywotności na podobnie wysokim poziomie, komórki nie wracają do poziomu z przed

napromieniowania, a ilość żywych komórek pozostaje mała przez cały okres obserwacji.

Ocena żywotności i przeżywalności może wskazać dalsze kroki do wyjaśnienia jakie

mechanizmy mogą kierować stymulacją proliferacji komórek przez konkretne,

specyficzne dla danej linii dawki promieniowania.

Bardzo często testy MTS oraz Trypan Blue są stosowane zamiennie. Tymczasem

nasze wyniki pokazują, że zaprezentowane przez nas zależności pokazują coś innego

i nie można stosować ich zamiennie.

5. Wnioski

Ocena żywotności metabolicznej i przeżywalności komórek pokazuje różnice

pojawiające w ich odpowiedzi na zadany bodziec, w tym przypadku na ekspozycję na

różne dawki promieniowania UVA. Stosując taką ocenę istotne jest nie tylko zbadanie

wpływu wybranej dawki na żywotność i przeżywalność, ale także wskazanie jakie

długotrwałe efekty może powodować taka dawka (stymulacja/inhibicja proliferacji),

dopiero potem właściwe jest ocenianie samego wpływu żywotności na przeżywalność.

Pomimo obserwowanej stabilizacji komórek po 24 godzinach od napromieniowania

oraz ich odpowiedzi na poziomie kontroli, w zaprezentowanym układzie ekspery-

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych po promieniowaniu UV

119

mentalnym pokazano, że wysoka żywotność nie zawsze odzwierciedla wysoką

przeżywalność albo jej późniejszy wzrost. Fakt, że po zastosowaniu dawki 10kJ/m2,

komórki prezentują kompletnie różne zachowanie niż dla dawek nie wpisujących się

okno stymulacyjne, implikuje istnienie mechanizmów uruchamianych tylko

w przypadku wybranych, specyficznych dawek oraz, że mechanizmy te nie mają

związku z samą żywotnością ocenianą w teście MTS.

Bardzo często dla scharakteryzowania populacji stosuje się zamiennie test MTS

oraz test z użyciem barwnika Trypan Blue. Tymczasem nasze wyniki wskazują, że

w niektórych specyficznych przypadkach (przy niektórych dawkach UVA) komórki są

wydajnie zabijane (niska przeżywalność), ale w komórkach, które pozostają wzrasta

aktywność metaboliczna (brak zmian w teście MTS, przy obniżonej przeżywalności).

Obumieranie komórek jest spowodowane przez czynnik, ale żywotność metaboliczna

się nie zmienia i co najważniejsze wzrost żywotności skutkuje zwiększoną proliferacją.

Podziękowania

Autorzy składają podziękowania prof. dr hab. Joannie Rzeszowskiej-Wolny za

inspirację oraz wsparcie merytoryczne i krytyczne uwagi dotyczące przedstawionego

opracowania. Badania autorów w laboratorium zostały wsparte przez grant

Narodowego Centrum Nauki 2015/19/B/ST7/02984 oraz BKM/508/Rau1/2017.

Literatura

1. Alberts B, Bray D, Hopkin K: Podstawy biologii komórki. Wprowadzenie do biologii

molekularnej. PWN, Warszawa, 1999.

2. Alberts B, Bray D, Hopkin K: Molecular biology of cell, 4th edition. Garland Science,

New York, 2002

3. Elmore S., 2007, Apoptosis: A review of programmed cell death, Toxicol Pathol., Jun,

35(4), s. 495-516.

4. IARC Working Group Reports, vol. 1. Exposure to artificial UV radiation and skin

cancer, 2005, Jun.

5. WHO. Global Solar UV index. 2002.

6. Alberts B., Bray D., Hopkin K., 2005, Podstawy biologii komórki. Wprowadzenie do

biologii molekularnej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

7. Han C.Y., Hien TT, Lim S.C., Kang K.W., 2011, Role of Pin1 in UVA-induced cell

proliferation and malignant transformation in epidermal cells, Biochem Biophys Res

Commun., Jun, 24, 410(1), s. 68-74.

8. Tyrrell R.M., Keyse S.M., 1990, New trends in photobiology. The interaction of UVA

radiation with cultured cells, J Photochem Photobiol B., Mar, 4(4), s. 349-361.

9. Ciesielska S, Bil P, Gajda K, Poterala-Hejmo A, Hudy D, Rzeszowska-Wolny J (2019)

Cell type-specific differences in redox regulation and proliferation after low UVA doses.

PLoS ONE 14(1):e0205215.

Sylwia Ciesielska, Patryk Bil, Anna Jama

120

Analiza przeżywalności i żywotności komórek nowotworowych

po promieniowaniu UV

Streszczenie

Wszystkie organizmy zbudowane są z komórek, których ilość jest ściśle kontrolowana. Nowe komórki

powstają podczas podziałów komórkowych, natomiast stare, uszkodzone komórki usuwane są w procesie

apoptozy. Równowaga pomiędzy powstawaniem nowych, a eliminowaniem starych komórek może zostać

zachwiana przez różne czynniki środowiskowe fizyczne i chemiczne, które mogą powodować wiele

zaburzeń. Jednym z takich czynników jest promieniowanie UV, które jest naturalnie emitowane przez

Słońce. Jest obecne przez cały rok, a na jego działanie narażone są praktycznie wszystkie organizmy.

W przedstawionej monografii prezentujemy jak kształtuje się przeżywalność komórek (liczba martwych

i żywych komórek w badanej populacji), a także ich żywotność (liczba funkcjonalnych komórek) pod

wpływem różnych dawek promieniowania UV frakcji A (UVA: 315-400nm). Do eksperymentu zostały

użyte różne dawki promieniowania UVA 500J/m2 (0,5kJ/m2) – dawka stosunkowo niska, 10kJ/m2 – dawka

średnia oraz 30kJ/m2 – dawka wysoka. Analiza została przeprowadzona w czasie 0, 6, 12 oraz 24 godziny

od napromieniowania dla linii HCT116 (ang. Human Colorectal Carcinoma) nowotworu jelita grubego.

Przeżywalność została zbadana za pomocą testu z użyciem barwnika Trypan Blue, który wybarwia martwe

lub umierające komórki na niebiesko, natomiast do oceny żywotności zastosowano test MTS, w którym

jedynie żywe, w pełni funkcjonalne komórki mogą przetwarzać za pomocą dehydrogenazy NADPH zależnej,

sól tetrazolową do formazanu. Wyniki pokazują, że żywotność nie zawsze pokrywa się z przeżywalnością.

Rozbieżności takie mogą wynikać z istnienia specyficznych dawek promieniowania, które mogą stymu-

lować proliferację komórek, a tym samym zmieniać żywotność powodując późniejsze zmiany w przeży-

walności. Taka analiza może pomóc w zrozumieniu mechanizmów, sterujących procesami podziałów

i śmierci komórek w zależności od zastosowanego czynnika stresującego, a w przypadku samych testów

może pokazać, że wyniki obu testów nie mogą być traktowane zamiennie ze względu na obserwowane

rozbieżności w przypadku niektórych specyficznych dawek.

Słowa kluczowe: analiza żywotności, analiza przeżywalności, promieniowanie UV

Analysis of survivability and viability of cancer cell after UV radiation

Abstract

All living organisms are built from cells, which number is strictly controlled. New cells are produced

during in cell division process while old or damaged cells are excised in process called apoptosis. The

balance between rising new cells and elimination of old cells may be destroyed by different environmental

factors chemical or physical, which can cause many disorders. One of such factors is UV radiation which is

naturally emitted by the Sun. UV is present during whole year and almost all living organisms are exposed

to it. In this manuscript we present how survivability (number of living and dead cells) and their viability

(number of functional cells) after UV radiation of A fraction (UVA: 315-400nm). In experiment we used

different doses of UVA radiation 500J/m2 (0,5kJ/m2) – relatively low dose, 10kJ/m2 – average dose,

30kJ/m2 – high dose. Analysis was performed in 0, 6, 12 and 24 hours after radiation for HCT116 cell line

(Human Colorectal carcinoma) .

Survivability was investigated with use of Trypan Blue dye, which can stain dead or dying cells on blue

color, while to asses viability we used MTS assay in which only healthy fully functional cells can process

using NADPH-dependent dehydrogenase, tetrazolic salt to formazan.

Results show that viability is not always followed by survivability. Such divergence may result from

existence of specific UVA doses which may stimulate proliferation and therefore change viability what

may be followed by further changes in survival of cells. Such analysis may help in understanding of

mechanisms controlling divisions and cell death depending on analyzed factor and in case of tests it shows

that they results are nor exchangeable because of observed differences with usage of some specific doses.

Keywords: analysis of survivability, analysis of viability, UV radiation

121

Małgorzata Adamiec1, Dorota Hudy

2, Daria Gendosz de Carriello

3,

Magdalena Skonieczna4

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem

jonizującym, nieapoptotyczna śmierć w komórkach

prawidłowych i nowotworowych

1. Wprowadzenie

Regulowana śmierć komórki (ang. Regulated Cell Death, RCD) odgrywa znaczącą

rolę w homeostazie organizmu, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patolo-

gicznych. Nadmierna lub niewystarczająca RCD może powodować choroby np.:

neurodegeneracyjne, czy nowotworowe [1]. Regulowana śmierć komórkowa może

przybrać różne formy, w tym apoptozy, nekroptozy czy ferroptozy [2].

Ferroptoza jest rodzajem nieapoptotycznej, programowanej śmierci komórkowej,

zależnej od żelaza. Charakteryzuje się akumulacją produktów peroksydacji lipidów.

Ferroptoza inicjowana jest poprzez niepowodzenia mechanizmów obronnych, w tym

przeciwutleniaczy zależnych od glutationu, w wyniku czego dochodzi do niekontro-

lowanej peroksydacji lipidów i ostatecznie do śmierci komórki [3, 4]. Śmierć ta

inicjowana jest poprzez zubożenie glutationu (GSH) lub utratę aktywności 4-tej

peroksydazy glutationowej (GPX4) (Rysunek 1), którą spowodować może induktor

ferroptozy (1-S,3R)-RSL-3, (RSL-3) [5]. RSL-3 łączy się z enzymem GPx4 i blokuje

jego aktywność, co powoduje wzrost produktów peroksydacji lipidów, a to ostatecznie

skutkuje wejściem komórek na drogę ferroptozy [6]. Oprócz RSL-3 odkryto również

inne substancje mogące wywołać ferroptozę in vitro, są to m.in. erastyna i związki

z rodziny DPI (np. DPI7, DPI12) [6]. Część z nich może blokować syntezę glutationu

(klasa 1, [6]) i w sposób pośrednio wpływać na GPx4 [7], podczas gdy inne działają

bezpośrednio na GPx4 (klasa 2 związków powodujących ferroptozę [6]). Podczas

ferroptozy mitochondria tracą integralność strukturalną oraz zaobserwować można

pęknięcia błony mitochondrialnej [8, 9].

Acyl-CoA-syntetaza 4 (ACSL4) przenosi długie wielonienasycone kwasy tłuszczowe

(PUFA), i jest enzymem niezbędnym w przebiegu ferroptozy [10, 11]. Wykazano, że

w komórkach wrażliwych na ferroptozę jego ekspresja wzrasta, natomiast u niewrażli-

wych na ten rodzaj śmierci, jest ona wyciszona, przez co gen ACSL4 uważany jest za

markerowy dla ścieżki ferroptozy [11, 12].

1 malgorzata.adamiec@polsl.pl; Grupa Biosystemów, Instytut Automatyki, Wydział Automatyki Elektroniki

i Informatyki, Politechnika Śląska w Gliwicach, 2 dorota@hudy.pl; Grupa Biosystemów, Instytut Automatyki, Wydział Automatyki Elektroniki i Informatyki,

Politechnika Śląska w Gliwicach, 3 dgendosz@sum.edu.pl; Katedra i Zakład Fizjologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach; Katedra i Zakład Histologii i Patologii Komórki, Wydział Lekarski z Oddziałem

Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, 4 magdalena.skonieczna@polsl.pl; Grupa Biosystemów, Instytut Automatyki, Wydział Automatyki

Elektroniki i Informatyki, Politechnika Śląska w Gliwicach,

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

122

Żelazo pobierane jest przez komórki ze środowiska pozakomórkowego za

pośrednictwem transferryny poprzez receptor dla transferryny (TFRC) zlokalizowany

w błonach komórkowych. Ekspresja transferyny i receptora transferyny jest także

kluczowa w ścieżce ferroptozy. Poprzez TFRC importowane jest żelazo do komórek,

które w reakcji Fentona powoduje powstawanie reaktywnych form tlenu i w efekcie

dochodzi do utlenienia lipidów, a w konsekwencji do śmierci komórkowej [13].

W komórkach nowotworowych występuje zwiększona ekspresja genu dla TFRC, co

powoduje akumulację żelaza w komórkach, a za pośrednictwem reakcji Fentona

prowadzi to do powstania reaktywnych form tlenu (Rysunek 1) [13, 14].

Rysunek 1. Schemat indukcji ścieżki ferroptozy w komórce, wraz z uwzględnieniem czynników indukujących

(RSL-3) oraz inhibujących (Ferrostatin) [opracowanie własne na podstawie 3, 5, 9, 12]

W przedstawionej pracy badano indukcję ferroptozy w komórkach nowotworowych

i prawidłowych ludzkich linii in vitro pod wpływem induktora RSL-3 oraz

promieniowania jonizującego.

2. Materiały i metody

2.1. Hodowla komórkowa

Badania przeprowadzone zostały w warunkach in vitro na ludzkich liniach

komórkowych, prawidłowych HaCaT (keratynocyty) oraz nowotworowych Me45

(czerniak). Komórki hodowane były w butelkach plastikowych 75 ml, w 15 ml

pożywki DMEM z dodatkiem 10 % surowicy wołowej FBS i antybiotyku. Hodowle

prowadzone były w 37 °C i 5 % stężeniu CO2, przy 60 % wilgotności atmosfery.

Wszystkie pasaże i wymiany medium wykonywane były w sterylnych warunkach

w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Do komórek dodawano Fer-1 oraz RSL-3, w końcowym stężeniu (w/o) 1000 nM.

Po 30 min pre-inkubacji komórki poddawano napromienieniu w dawce 4 Gy,

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

123

(promieniowanie jonizujące X, z użyciem irradiatora Kubtec, USA). Po ekspozycji

komórki zbierano poprzez trypsynizację w czterech punktach czasowych: 1, 6, 12 oraz

24 h. Osady komórkowe zawieszano w Fenozolu (A&A Biotechnology) do ilościo-

wego oznaczania ekspresji genów reakcją real-time PCR. Do oznaczeń cytometrycz-

nych reaktywnych form tlenu (RFT), komórki znakowano przyżyciowo barwnikami

ilościowo obrazującymi poziomy tlenku azotu (DAF-FM; Life Technologies)

i anionorodnika ponadtlenkowego (MitoSox; Life Technologies).

2.2. Real-time PCR

Do izolacji użyto komórki zebrane z płytek hodowlanych, w określonych odstępach

czasowych i zawieszonych w Fenozolu, wykorzystano zestaw do izolacji całkowitego

RNA firmy A&A Biotechnology.

Z uzyskanego RNA wykonano odwrotną transkrypcję, przy użyciu zestawu NG

dART RT kit firmy EURx.

Matrycowe cDNA, uzyskane w reakcji odwrotnej transkrypcji poddano reakcji real-

time PCR, amplifikowano za pomocą specyficznych dla wybranych genów zestawów

starterów:

GPX4:

5’-GCCTTCCC-GTGTAACCAGT-3’

5’-GCGAACTCTTTGATCTCTTCGT-3’;

ACSL4:

5'- GCTATCTCCTCAGACACACCGA-3'

5'-AGGTGCTCCAACTCTGCCAGTA-3';

TFRC:

5’-GGAGACTGTCCCTCTGACTGG-3’

5’- GCTTCACATTCTTGCTTTCTGAG -3’.

Reakcja została przeprowadzona z użyciem Real-Time 2xPCR Master Mix SYBR

A firmy A&A Biotechnology.

2.3. Analiza cytometryczna

2.3.1. Poziom tlenku azotu

Do pomiaru tlenku azotu (NO) w komórkach zastosowano barwnik DAF-FM (Life

Technologiest). Barwnik ten nie wykazuje fluorescencji, dopóki nie zwiąże się z NO,

z którym utworzy związek benzotiazolu, który wykazuje fluorescencję. Detekcja

fluorescencji była przeprowadzona w kanale zielonym dla FITC [15]. Do zebranych

komórek dodano 2,5 µM barwnika i inkubowano przez 30 min w 37 °C. Po odpłukaniu

niezwiązanego barwnika zmierzono poziom fluorescencji przy użyciu cytometru

przepływowego.

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

124

2.3.2. Poziom anionorodnika ponadtlenkowego

Poziom anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach został zmierzony przy

użyciu barwnika MitoSOX (Life Technologiest). Odczynnik ten utlenia się

w kontakcie z anionorodnikiem ponadtlenkowym, wykazując czerwoną fluorescencję,

której detekcję przeprowadzono w kanale PE [16].

Po zebraniu komórek, dodano 2,5 µM barwnika i inkubowano w 37 °C przez 30

minut. Następnie poziom fluorescencji zmierzono przy pomocy cytometru

przepływowego.

Dane z cytomerii przepływowej przeanalizowano za pomocą programu Flowing

Software wersja 2.5.1, dzięki zawartym w nim regularnych narzędzi analitycznych.

Program ten jest projektem badawczym, a jego autorem jest Perttu Terho, Turku

Centre for Biotechnology University of Turku, Finland.

2.3.3. Ocena ekspresji genów w reakcji real-time PCR

Zbieranie danych po amplifikacji, jak również analizę wyników przeprowadzono

przy pomocy programu CFX Manager 3.1 firmy Bio-Rad. Dla odczytanych wartości

progowych Ct w programie, obliczono względny poziom ekspresji dla badanego genu

w komórkach, zarówno kontrolnych, jak i z badanymi czynnikami. W tym celu

wykorzystano metodę R=2-ΔΔCt [17].

2.3.4. MTT – test proliferacji komórek

Poziom żywotności i proliferacji komórek zmierzono przy pomocy testu MTT.

Komórki wysiano po 10 000 na dołek w 96-dołkowej płytce wraz z medium (DMEM

+10% FBS), do części dołków dodano RSL-3 oraz Fer-1 o stężeniu 1000nM, następnie

komórki poddano działaniu czynnika stresującego - promieniowaniu jonizującemu (IR)

i dawce 4 Gy.

2.3.5. Analiza statystyczna

Wyniki pomiarowe w próbach badanych przedstawiono na wykresach jako średnie

z 3 eksperymentów (3 powtórzenia techniczne każdy) w odniesieniu do próby

kontrolnej z 1 h oraz dodano odchylenie standardowe. Za pomocą testu Dixona,

wyeliminowano pomiary odstające.

3. Wyniki i dykusja

3.1. Ekspresja genów markerowych dla ferroptozy

Ekspresja genów markerowych może przekładać się na efekty biologiczne

obserwowane w populacjach komórkowych. Poziom transkruptu nie odzwierciedla

jednak aktywności i poziomu białek enzymatycznych kodowanych przez badane geny.

Przy analizie danych transkryptomicznych należy zatem uwzględnić opóźnienie lub

istnienie pętli zwrotnych (indukujących lub wyciszających) wpływających na procesy

transkrypcji i translacji. W niniejszym rozdziale przedstawiono wyniki z ekspresji

genów będących markerami ferroptozy. Wyniki porównano pomiędzy linią wrażliwą

na ferroptozę – keratynocyty (HaCaT), a oporną na ferroptozę linią czerniaka

złośliwego skóry (Me45).

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

125

3.1.1. Ekspresja genu ACSL4

ACSL4 wykazuje wyższą ekspresję w komórkach wrażliwych na ferroptozę,

natomiast jego ekspresja jest wyciszona w komórkach niewrażliwych na ten rodzaj

nieapoptotycznej śmierci komórkowej. Analizując wyniki uzyskane z reakcji real-time

PCR, przedstawione na Rysunku 2, zaobserwowano, że w przypadku komórek

prawidłowych keratynocytów (HaCaT) nadekspresja genu markerowego występuje

w 6 h od napromienienia. W przypadku komórek nowotworowych czerniaka (Me45)

nie zaobserwowano wzrostu ekspresji. Wyniki te mogą świadczyć o tym, że komórki

nowotworowe należą do komórek z wyciszoną ścieżką ferroptozy.

Rysunek 2. Wykres przedstawiający zmianę ekspresji genu ACSL4, będącej markerem ferroptozy [8]

w komórkach wrażliwych – HaCaT (A) oraz niewrażliwych na ferroptozę - Me45(B) po dodaniu czynnika

indukującego ferroptozę (RSL-3) oraz promieniowania jonizującego

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

126

3.1.2. Ekspresja genu GPX4

Peroksydaza glutationowa (GPX4), ze względu na funkcję pełnioną w komórce,

czyli redukcję nadtlenku wodoru do wody, jak również redukcję utlenionych lipidów,

jest ważnym markerem w ferroptozie. Dodanie do komórek induktora ferroptozy RSL-

3, który powoduje utratę aktywności GPX4, skutkuje wzrostem ekspresji zarówno

w linii wrażliwej (Rysunek 3 A), jak i niewrażliwej na ferrotozę (Rysunek 3 B).

Wynika to z odpowiedzi komórki na podwyższoną ilość utlenionych lipidów i wolnych

rodników w komórce, co aktywuje proces transkrypcji.

Rysunek 3. Wykres przedstawiający zmianę poziomu ekspresji genu peroksydazy glutationowej (GPX4)

w komórkach wrażliwych – HaCaT (A) oraz niewrażliwych na ferroptozę - Me45 (B), po dodaniu czynnika

indukującego ferroptozę (RSL-3) oraz promieniowania jonizującego

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

127

3.1.3. Ekspresja genu TFRC

Rysunek 4. Wykres przedstawiający zmianę poziomu ekspresji genu receptora transferyny TFRC,

sprzyjającego ferroptozie, w komórkach wrażliwych – HaCaT (A) oraz niewrażliwych na ferroptozę – Me45

(B), po dodaniu czynnika indukującego ferroptozę (RSL-3) oraz promieniowania jonizującego

Poprzez receptor transferryny (TFRC) pobierane jest żelazo z otocznia komórki,

prowadząc do aktywacji ścieżki ferroptozy. W komórkach wrażliwych na ten rodzaj

nieapoptotycznej śmierci (Rysunek 4 A), zaobserwowano niewielki wzrost ekspresji

tego genu w 6 i 24 h względem kontroli, po dodaniu czynnika indukującego ferroptozę

RSL-3. W pozostałych punktach czasowych nie zaobserwowano nadekspresji genu

TFRC. W przypadku niewrażliwych na ferroptozę komórek (Rysunek 4 B), obserwo-

wano wzrost ekspresji w każdym punkcie czasowym w porównaniu do kontroli.

Zmiana poziomu ekspresji mogła wynikać z dodania induktora ferroptozy RSL-3, jak

również wpływu promieniowania jonizującego.

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

128

3.2. Poziom reaktywnych form tlenu

3.2.1. Poziom tlenku azotu

Analizując wyniki dla linii komórkowej keratynocytów, wrażliwych na ferroptozę,

wnioskować można, że dodanie czynnika indukującego ferroptozę, RSL-3, powoduje

wzrost poziomu tlenku azotu w 12 h (Rysunek 5 A). W pozostałych punktach

czasowych poziom jest porównywalny z kontrolą lub niższy. W przypadku czerniaka

(Rysunek 5 B) wzrost następuje w 6 oraz 24 h, zarówno po promieniowaniu, jak i po

samym dodaniu induktora ferroptozy. Oznacza to, że w Me45 NO może być ważnym

przełącznikiem ścieżek śmierci (apoptoza/ferroptoza), którego produkcja pojawia się

o 6 h wcześniej niż w przypadku HaCaT.

Rysunek 5. Wykresy przedstawiają poziom anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach wrażliwych

– HaCaT (A) oraz niewrażliwych na ferroptozę – Me45 (B), po dodaniu czynnika indukującego ferroptozę

(RSL-3) oraz poddaniu promieniowaniu jonizującemu. Komórki znakowane były barwnikiem

fluorescencyjnym DAF-FM

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

129

3.2.2. Poziom anionorodnika ponadtlenkowego

Rysunek 6. Wykresy przedstawiają poziom anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach wrażliwych

– HaCaT (A) oraz niewrażliwych na ferroptozę - Me45 (B), po dodaniu czynnika indukującego ferroptozę

(RSL-3) oraz poddaniu promieniowaniu jonizującemu. Komórki znakowane były barwnikiem

fluorescencyjnym MitoSOX

Anionorodnik ponadtlenkowy produkowany jest w komórce na potrzeby własne

komórki, jak również może być markerem stresu oksydacyjnego. Porównując poziomy

tego rodnika, po dodaniu induktora ferroptozy oraz po poddaniu komórek czynnikowi

stresującemu, jakim jest promieniowanie jonizujące, zauważyć można nieznaczny

wzrost poziomu anionorodnika w 6 h w komórkach HaCaT (Rysunek 6 A).

W przypadku komórek Me45 (Rysunek 6 B) wzrost taki obserwowano dopiero w 12 h.

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

130

3.3. Proliferacja oraz apoptoza w komórkach

Rysunek 7. Wykresy przedstawiają żywotność komórek HaCaT (A) i Me45 (B) po dodaniu czynnika

indukującego ferroptozę, RSL-3, i poddaniu komórek stresowi oksydacyjnemu jakim było promieniowanie

jonizujące (IR) w 24h teście MTT

Analiza proliferacji komórek w przypadku obu linii (Rysunek 7) wykazała, że

dodanie induktora RSL-3 powoduje śmierć komórkową niezależnie od dawki.

Świadczyć to może o inaktywacji GPX4 na poziomie białkowym przez dodany

induktor, w wyniku czego enzym traci swoją aktywność i następuje nagromadzenie

utlenionych lipidów, co w efekcie prowadzi to do nieapoptotycznej śmierci komórek,

ferroptozy.

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

131

Rysunek 8. Wykresy przedstawiają poziom apoptozy w komórkach kontrolnych HaCaT (A)

i napromienionych (B). Apoptoza z wykorzystaniem Aneksyny-V

Test z Aneksyną-V dla apoptozy w keratynocytach (HaCaT, Rysunek 8)

potwierdza, że w komórkach apoptoza nie indukuje się, a śmierć komórek następuje

w wyniku innej formy – nieapoptotycznej śmierci komórkowej, którą może być

ferroptoza.

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

132

Rysunek 9. Wykresy przedstawiają poziom apoptozy w komórkach kontrolnych Me45 (A) i napromienionych

(B). Apoptoza z wykorzystaniem Aneksyny-V

W przypadku czerniaka (Rysunek 9) również nie zaobserwowano śmierci na drodze

apoptozy, jednak spadek żywotności w teście MTT spowodowany może być

nieapoptotycznym rodzajem śmierci komórkowej – ferroptozą.

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

133

Rysunek 10. Wykresy przedstawiają żywotność komórek HaCaT (A) i Me45 (B) po dodaniu czynnik

inhibujący ferroptozę, Fer-1, i poddaniu komórek stresowi oksydacyjnemu jakim było promieniowanie

jonizujące (IR) w 24h teście MTT

Dodanie do komórek Ferrostatyny (Fer-1) odpowiedzialnej za inhibicję ferroptozy,

zniosło efekt obserwowany po induktorze RSL-3 (Rysunek 1) i nie obserwowano

obniżonej żywotności komórek. Zarówno dla komórek HaCaT (Rysunek 10 A), jak

i dla czerniaka Me45 (Rysunek 10 B) dodanie Fer-1 spowodowało zatrzymanie śmierci

komórkowej. Wynik ten potwierdza, że śmierć komórkowa nie zachodzi na drodze

apoptozy lecz ferroptozy.

4. Podsumowanie

Enzym syntetazan acylo-CoA 4 (ACSL4) wykazuje podniesioną ekspresję

w komórkach wrażliwych na ferroptozę, natomiast jego ekspresja jest wyciszona

w komórkach niewrażliwych na ten rodzaj nieapoptotycznej śmierci komórkowej [8].

W przypadku keratynocytów (HaCaT) wystąpiła nadekspresja genu ACSL4 w 6 h,

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

134

natomiast w czerniaku jest ona wyciszona względem kontroli w każdym punkcie

czasowym.

Dodanie induktora RSL-3 do komórek powoduje wzrost ekspresji genu peroksy-

dazy glutationowej 4-tej (GPX4), pełniącej w komórce rolę ważnego antyoksydanta,

redukującego utlenione lipidy. Powodem tego może być fakt, że RSL-3 zubaża

komórkę w zredukowaną formę glutationu (GSH) oraz unieczynnia enzym GPX4.

Prowadzi to jednak do wtórnej odpowiedzi komórki, poprzez wzmocnienie ekspresji

genów kodujących białka umożliwiających redukcję antyoksydantów.

Wzrost ekspresji receptora transferryny może mieć kluczowe znaczenie w leczeniu

opornych nowotworów (Rysunek 4), ze względu na kumulację żelaza w komórkach,

które wtórnie poprzez reakcję Fentona napędza mechanizmy produkcji rodników

utleniających lipidy (Rysunek 1).

W komórkach czerniaka Me45 produkcja reaktywnych form tlenu, czyli NO

(Rysunek 5 B) oraz O2·¯

(Rysunek 6 B) różniła się w czasie od zmian zaobserwo-

wanych w komórkach keratynocytów HaCaT (odpowiednio Rysunek 5 A i Rysunek 6

A). Ferroptoza mogła być wyindukowana za pomocą NO, który pojawił się w Me45

znacznie wcześniej. Apoptoza w obu liniach komórkowych nie indukuje się (Rysunek

8 i 9), co świadczy o uruchomieniu innej ścieżki śmierci - ferroptozy.

Bazując na informacjach uzyskanych z literatury oraz z otrzymanych wyników

można wnioskować, że czerniak złośliwy skóry (Me45) należy do komórek niewrażli-

wych na ferroptozę. Potwierdzają to wyciszone ekspresje genów markerowych dla

ACSL4 i GPX4 (Rysunek 2-4) oraz oporność na stymulację ferroptozy poprzez

dodanie induktora RSL-3 (Rysunek 7 B), jak również brak indukcji apoptozy w

komórkach (Rysunek 9). Natomiast keratynocyty (HaCaT) należą do grupy komórek

wrażliwych na ferroptozę, co potwierdzono przeprowadzonymi badaniami.

Zastosowanie induktora ferroptozy RSL-3 może być przełomem w leczeniu

opornych nowotworów skóry, ponieważ włączają one wytłumioną ścieżkę ferroptozy

w tych komórkach poprzez nadekspresję receptorów wychwytu zewnątrz-

komórkowego żelaza. Nagromadzenie w komórce żelaza może również sprzyjać

wtórnej produkcji wolnych rodników i utlenianiu lipidów, co w efekcie może

powodować nieapoptotyczną śmierć w komórkach - ferroptozę.

Podziękowania

Prace sfinansowane zostały przez grant Politechniki Śląskiej w Gliwicach nr

02/010/BK_18/0102.

Literatura

1. Fuchs Y, Steller H. Programmed Cell Death in Animal Development and Disease,

Cell. 147, 2011, 742-758.

2. Yuan JY, Kroemer G. Alternative cell death mechanisms in development and beyond

Genes Dev. 24, 2010, 2592-2602.

3. Yang, W; Stockwell, B. Ferroptosis: death by lipid peroxidation. PubMed Central, 2005

4. Cao, J., Dixon, S., Mechanisms of ferroptosis, Cell Mol Life Sci. 73, 2016, 2195-2209.

5. Yang W. S., Sriramaratnam R., Welsch M. E., Shimada K., Skouta R., Viswanathan V. S.,

et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell 156, 2014, 317-331.

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym,

nieapoptotyczna śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

135

6. H. Yu, P. Guo, X. Xie, Y. Wang, and G. Chen, Ferroptosis, a new form of cell death, and its

relationships with tumourous diseases, J. Cell. Mol. Med. 2017, vol. 21, no. 4, pp. 648-657

7. S. Hao B. Liang Q. Huang Dong S. Wu Z. He W., Shi M., Metabolic networks in

ferroptosis (Review), Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 2018, 5405-5411.

8. Yagoda, N., Von Rechenberg, M., Zaganjor, E., Bauer, A. J., Yang, W. S., Fridman, D. J.,

et al. RAS-RAF-MEK-dependent oxidative cell death involving voltage-dependent anion

channels. Nature 447, 2007, 864-868.

9. Cao JY, Dixon SJ. Mechanisms of ferroptosis. Cell Mol Life Sci.73, 2016, 2195–2209.

10. Doll, S., Proneth, B., Tyurina, Y.Y., Panzilius, E., Kobayashi, S., Ingold, I., Irmler, M.,

Beckers, J., Aichler, M., Walch, A., Prokisch, H., Trumbach, D., Mao, G., Qu, F., Bayir,

H., Fullekrug, J., Scheel, C.H., Wurst, W., Schick, J.A., Kagan, V.E., Angeli, J.P., Conrad,

M., ACSL4 dictates ferroptosis sensitivity by shaping cellular lipid composition. Nature

Chemical Biology. 13(1), 2017, 91-98.

11. Knudsen, J., Jensen, M. V., Hansen, J. K., Faergeman, N. J., Neergaard, T. B., and Gaigg,

B. Role of acylCoA binding protein in acylCoA transport, metabolism and cell signaling.

Mol. Cell. Biochem. 192, 1999, 95-103

12. Yuan H, Li X, Zhang X, Kang R, Tang D. Identification of ACSL4 as a biomarker and

contributor of ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 478 (3), 2016, 1338-1343.

13. Torti SV, Torti FM. Iron and cancer: more ore to be mined. Nat. Rev. Cancer.

13, 2013:342–355.

14. Wang S, Luo J, Zhang Z, Dong D, Shen Y, Fang Y, Hu L, Liu M, Dai C, Peng S, Fang

Z, Shang P. Iron and magnetic: new research direction of the ferroptosis-based cancer

therapy. Am J Cancer Res. 8(10), 2018, 1933-1946.

15. Nitric Oxide Indicators: DAF-FM and DAF-FM Diacetate, Molecural Probes.

16. MitoSOXTM Red mitochondrial superoxide indicator *for live-cellimaging*

17. (M36008), Molecural Probes.

18. Livak K. J., Schmittgen T. D.: Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime

Quantitative PCR and the 2ΔΔCT Method. METHODS, 25, 2001, 402-408.

Ferroptoza – indukowana promieniowaniem jonizującym, nieapoptotyczna

śmierć w komórkach prawidłowych i nowotworowych

Streszczenie

Ferroptoza jest formą nieapoptotycznej śmierci komórkowej, zależnej od żelaza oraz charakteryzującej się

akumulacją produktów peroksydacji lipidów. Proces ten może być wzmacniany poprzez molekuły lub

procesy hamujące biosyntezę glutationu, lub zależnej od glutationu, peroksydazy-4 (GPX4). Celem badań

było określenie wpływu promieniowania jonizującego (IR) w dawce 4 Gy, w obecności induktora ferroptozy

1S,3R-RSL 3 (RSL-3) lub inhibitora tej ścieżki, Ferrostatin-1 (Fer-1), na produkcję reaktywnych form

tlenu (RFT), apoptozę, przeżywalność i ekspresję wybranych genów ze ścieżki ferroptozy w komórkach

nowotworowych (Me45) oraz w zdrowych keratynocytach (HaCaT). Traktowane IR komórki zebrano

w różnych punktach czasowych (1,6,12 i 24h), a następnie cytometrycznie oznaczono w nich poziomy

RFT i apopotozy. Wpływ RSL-3 i Fer-1 pod wpływem IR oceniono po 24h testem MTT. Ekspresję genów

oznaczono RT-qPCR. Stwierdzono, że w komórkach czerniaka Me45 produkcja RFT w czasie, w tym

tlenku azotu (NO) i anionorodnika ponadtlenkowego (O2·¯) różniła się od zmian obserwowanych

w prawidłowych keratynocytach. Radiooporność Me45 demonstrowana była przez niższy poziom RFT

oraz opóźniony w stosunku do HaCaT wybuch O2·¯. Ferroptoza mogła być wyindukowana za pomocą NO,

który pojawił się w Me45 wcześniej. Wyciszona ekspresja genu GPX-4 w Me45 została skorelowana

z wynikami testu MTT, gdzie śmierć komórkowa zaobserwowana została po 24h – świadczy to

o uruchomieniu ścieżki ferroptozy.

Słowa kluczowe: Ferroptoza, RFT, GPX4, antyoksydanty, śmierć komórkowa

Małgorzata Adamiec, Dorota Hudy, Daria Gendosz de Carriello, Magdalena Skonieczna

136

Ferroptosis – non-apoptotic death induced by ionizing radiation in normal

and cancer cell lines

Abstract

Ferroptosis is a non-apoptotic form of regulated cell death, dependent on iron and characterized by the

accumulation of lipid peroxides. This process can be triggered by molecules or conditions leading to

inhibition of glutathione biosynthesis or glutathione-dependent antioxidant enzyme glutathione

peroxidase 4 (GPX4).

The goal of presented research was to determine irradiation (IR, 4 Gy) effect in the presence of the

ferroptosis inducer (RSL-3) or inhibitor (Fer-1) on tumor cells (Me45) and healthy keratinocytes (HaCaT).

Studied cells were collected at different time points following IR: 1, 6, 12 and 24 hours. Level of reactive

oxygen species (ROS) and apoptosis were estimated by flow cytometry. Expression of genes related to

ferroptosis pathway cells were tested by RT-qPCR. The effect of RSL-3 and Fer-1 on cells after IR was

evaluated after 24 hours by MTT test.

It was found that ROS production, including nitric oxide (NO) and superoxide anion radical (O2•¯) was

changing over time for Me45 cells in different manner comparing to HaCaT cells. Me45 presented

radioresistance which was manifested by decreased level of ROS and delayed to HaCaT O2•¯ burst.

Ferroptosis could be initiated in Me45 cells by NO, which appeared sooner compared to keratinocytes.

Additionally, downregulation of GPX-4 gene expression correlated with MTT test results, where cell death

was observed after 24 hours, indicating the initiation of ferroptosis pathway.

Keywords: Ferroptosis, ROS, GPX4, antioxidants, cell death

137

Paweł Kozyra1, Sylwia Talarek

2, Joanna Listos

3

Profil farmakologiczny

wybranych substancji dopingujących

1. Krótka historia substancji dopingujących

Środki dopingujące są to zakazane w sporcie substancje chemiczne, których celem

jest zwiększenie zdolności fizycznych organizmu [1]. Istnieją jednak substancje, które

podnoszą wydolność organizmu, a nie są klasyfikowane jako doping. Jak pokazuje

literatura, naturze ludzkiej od zarania dziejów towarzyszy chęć podnoszenia zdolności

organizmu.

W mitologii nordyckiej czytamy o wojownikach nieznających strachu tzw. Berserkach,

którzy przed walką zażywali bufoteninę, silnie psychostymulujący alkaloid. Substancja

pozyskiwana była z grzyba z rodziny muchomorowatych Amanita citrina Pers.

I ropuchy Bufo marinus.

Grecki lekarz Filostratos opisywał liczne przypadki stosowania mieszanek

roślinnych i pieczywa o właściwościach przeciwbólowych przez zawodników

startujących podczas igrzysk olimpijskich.

Podobnie w starożytnym Rzymie gladiatorzy przyjmowali silne stymulanty przed

wejściem na arenę. Wiadomo też, że słynące z nieludzkiej wytrzymałości, afrykańskie

plemię Kaffir słowem dop nazywało wzmacniający napój. Był to alkoholowy wyciąg

z nasion Cola acuminata i Cola nitida. W 1889 roku w słowniku pierwszy raz pojawiło

się słowo doping [1-3]. XIX wiek to okres wielkich odkryć naukowych, moment

poznania struktury związków chemicznych oraz możliwość ich syntezy. Od tego

momentu rozpoczęło się świadome poszukiwanie substancji chemicznych

o pożądanym działaniu, w tym również substancji poprawiających wydolność fizyczną

organizmu, które trwa do dziś.

Doping można podzielić na farmakologiczny oraz fizjologiczny i genetyczny [1, 4,

5]. Ze względu na zakres niniejszej monografii doping fizjologiczny i genetyczny nie

będzie dalej omawiany.

Jako farmakologiczne środki dopingujące wykorzystywane są związki należące do

różnych grup farmakologicznych, takich jak:

substancje wpływające na układ hormonalny;

substancje psychostymulujące;

substancje pobudzające receptory β2 adrenergiczne;

substancje o działaniu diuretycznym [1].

1 pawekoz@interia.pl , Studenckie Koło Naukowe Katedry i Zakładu Farmakologii z Farmakodynamiką,

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie,

http://www.umlub.pl/. 2 sylwia.talarek@umlub.pl , Katedra i Zakład Farmakologii z Farmakodynamiką, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, http://www.umlub.pl/ 3 joanna.listos@umlub.pl , Katedra i Zakład Farmakologii z Farmakodynamiką, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, http://www.umlub.pl/

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

138

W niniejszej monografii skupiono się na przedstawieniu właściwości farmakolo-

gicznych, mechanizmu działania oraz działań niepożądanych substancji wpływających

na układ hormonalny. Omówienie pozostałych grup substancji przekracza zakres

niniejszej monografii.

Międzynarodową organizacją mającą na celu zwalczanie dopingu na całym świecie

jest Światowa Agencja Antydopingowa (World Anti-Doping Agency (WADA)).

Została ona założona, aby zapewnić zgodność polityki antydopingowej i regulacji

w organizacjach sportowych i rządach na całym świecie. Misją Światowej Agencji

Antydopingowej jest prowadzenie wspólnego światowego ruchu na rzecz sportu bez

dopingu [1, 6-8].

2. Przegląd wybranych grup substancji wpływających na układ

hormonalny stosowanych jako środki dopingujące

Do substancji wpływających na układ hormonalny wykorzystywanych jako środki

dopingujące należą:

3.0. steroidy anaboliczno-androgenne

4.0. inhibitory aromatazy

5.0. selektywne modulatory receptora androgenowego (SARM)

3. Steroidy anaboliczno-androgenne

3.1. Właściwości farmakologiczne

Najpopularniejszą grupą substancji stosowanych do celów dopingowych są steroidy

anaboliczno-androgenne. Obejmują one wiele substancji chemicznych o strukturze

podobnej do testosteronu, endogennego hormonu odpowiadającego za rozwój cech

płciowych męskich. Podobnie jak endogenny testosteron, steroidy anaboliczno-

androgenne wywierają działanie androgenne, które manifestuje się wpływem na

rozwój pierwszorzędowych (jądra) i drugorzędowych (moszna, nasieniowody, prącie)

cech płciowych męskich oraz pojawianiem się trzeciorzędowych cech płciowych

męskich (tj. męski typ owłosienia ciała, męskie umięśnienie i rozmieszczenie tkanki

tłuszczowej, męska budowa ciała (węższe biodra, szersze ramiona itd.), głos) [3, 9-23].

Ponadto steroidy anaboliczno-androgenne, podobnie jak testosteron, indukują efekty

anaboliczne. Objawia się to m.in. jako zwiększenie proliferacji komórek, wzrost syntezy

białek szkieletowych i enzymatycznych oraz wzrost erytropoezy i zwiększenie absorpcji

pierwiastków w organizmie (K, P, Ca, Na, Cl, Mg, inne). Wszystkie te efekty prowadzą

do stymulacji wzrostu kości długich i zwiększenia ich gęstości, zwiększenia masy mięśni

szkieletowych i ich wytrzymałości przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości tkanki

tłuszczowej oraz wzrostu ilości erytrocytów i hemoglobiny we krwi [3, 9-23].

Zarówno endogenny testosteron oraz steroidy anaboliczno-androgenne wpływają na

czynność ośrodkowego układu nerwowego. Zwiększony poziom tych substancji we

krwi koreluje z zachowaniami agresywnymi przy jednoczesnym zmniejszeniu

zachowań depresyjnych. Ponadto substancje te zwiększają wydzielanie z gruczołów

łojowych, co może być przyczyną trądziku (acne vulgaris) [3,9-23].

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących

139

Tabela 1. Szczegółowe zestawienie efektów farmakologicznych testosteronu oraz steroidów anaboliczno-

androgennych opracowane przez Hoffman i Ratamess [10]

Farmakologiczne działanie

steroidów anaboliczno-androgennych:

Zwiększenie beztłuszczowej masy ciała

Zwiększenie przekroju mięśniowego

Zmniejszenie procentu tkanki tłuszczowej

Zwiększenie siły mięśni

Skrócenie regeneracji pomiędzy treningami

Skrócenie regenerację po urazie

Zwiększenie syntezy białek

Zwiększenie wytrzymałości mięśni

Zwiększenie erytropoezy, hemoglobiny i hematokryt

Zwiększenie gęstości mineralnej kości

Zwiększenie magazynowania glikogenu

Zwiększenie lipolizy

Wzrost transmisji nerwowej

Zredukowanie uszkodzenia mięśni

Zwiększenie tolerancji na ból

Modyfikacja zachowania (agresja)

Należy zaznaczyć, że zarówno testosteron, jak i steroidy anaboliczno-androgenne

są wykorzystywane do celów klinicznych. Mogą być stosowane w leczeniu chorób

przebiegających z wyniszczeniem organizmu, np. w zakażeniu ludzkim wirusem

niedoboru odporności (HIV), stwardnieniu rozsianym czy w chorobach nowotwo-

rowych (zwłaszcza rak piersi); oraz w terapii hipogonadyzmu. Te same substancje są

wykorzystywane jako substancje dopingujące, ale, co należy podkreślić, jest to

zastosowanie pozamedyczne [3, 9-23].

3.2. Działania niepożądane

Stosowanie steroidów anaboliczno-androgennych w celach medycznych prowa-

dzone jest pod kontrolą lekarza. Wówczas przyjmowane są w najmniejszej dawce

wywołującej pożądany efekty (dosis therapeutica). Powoduje to ograniczenie

występowania działań niepożądanych leków. Jednak stosowanie steroidów anabo-

liczno-androgennych do celów pozamedycznych często związane jest z przekracza-

niem (niekiedy znacznym) dawki terapeutycznej [24] co przekłada się na występo-

wanie niejednokrotnie poważnych działań niepożądanych.

Najczęstsze działania niepożądane steroidów anaboliczno-androgennych to,

związane z zatrzymywaniem pierwiastków i wody w organizmie, bóle głowy, obrzęki

(szczególnie w kończynach) i nadciśnienie. Ponadto podrażnienie żołądkowo-jelitowe,

biegunka, bóle brzucha a także trądzik [3, 9-23].

Długotrwałe przyjmowanie steroidów anaboliczno-androgennych obejmuje

problemy związane z zaburzeniami gospodarki hormonalnej, zaburzeniami układu

sercowo-naczyniowego, zaburzeniami czynności wątroby i trądzikiem. Szczegółowo

opracował je Kicmann [15].

Zaburzenia hormonalne u mężczyzn obejmują zahamowanie steroidogenezy gonad

prowadzące do zaniku jąder, ginekomastie i powiększone sutki u mężczyzn oraz

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

140

rozrost a nawet nowotwór prostaty. U kobiet pojawiają się zaburzenia miesiączko-

wania i niepłodność, utrzymująca się nawet do 1 roku po zaprzestaniu podawania

substancji. Może wystąpić przerost łechtaczki. Podawanie ich u kobiet w ciąży

wywołuje maskulinizację żeńskiego płodu.

Nadmierne efekty anaboliczne mogą objawiać się jako znaczny rozrost masy

mięśniowej, powstawanie obrzęków, bólu głowy, nadciśnienia i innych chorób

sercowo-naczyniowych. Długotrwałe zwiększenie objętości krwi krążącej prowadzi do

obciążenia serca, przerostu lewej komory, skrócenia odcinku QT w zapisie EKG

(ryzyko arytmii) oraz do rozwoju niewydolności serca. Ponadto, mogą zwiększać

krzepliwość krwi, co może być przyczyną zawału mięśnia sercowego lub udaru

mózgu.

Podawane u dzieci mogą indukować przedwczesne zamknięcie epifizjologii

u dzieci wskutek zahamowania wzrostu liniowego.

Jako substancje o strukturze steroidowej, steroidy anaboliczno-androgenne, mają

niekorzystny wpływ na czynność wątroby. Mogą podnosić poziom transaminaz

wątrobowych, sprzyjają tworzeniu kamicy żółciowej i w związku z tym zwiększają

ryzyko żółtaczki cholestatycznej.

Steroidy anaboliczno-androgenne mają wpływ na skórę, dlatego zarówno u kobiet

jak i mężczyzn mogą wywoływać trądzik oraz łysienie androgenowe; u kobiet mogą

indukować hirsutyzm, tj. nadmierne owłosienie typu męskiego.

Wpływ działania steroidów anaboliczno-androgennych na ośrodkowy układ

nerwowy manifestuje się jako nasilony, niekiedy niekontrolowany wzrost libido

(u kobiet i mężczyzn), ale także jako zwiększona agresja i wrogość, lekkomyślne

i niebezpieczne zachowania, paranoidalna zazdrość, skrajna drażliwość oraz

bezsenność [3, 9-23].

3.3. Mechanizm działania

Mechanizm działania steroidów anaboliczno-androgennych jest skomplikowany

i związany jest z pobudzeniem receptorów androgenowych znajdujących się

w cytoplazmie lub na powierzchni błony jądrowej komórek. Nieaktywne receptory

androgenowe są połączone z białkiem heat shock protein 70 (HSP70) oraz heat shock

protein 90 (HSP90). Przyłączenie endogennego (cząsteczka testosteronu) lub

egzogennego (cząsteczka steroidu anaboliczno-androgennego) – ligandu powoduje

tworzenie się kompleksu receptor androgenowy-ligand, co prowadzi do odłączenia

białka HSP. Powstały kompleks ulega homodimeryzacji i przyłącza drugi taki sam

kompleks. Receptor ulega przemieszczaniu do jądra komórki, w tym czasie podlega

zmianom konformacyjnym. W jądrze komórkowym kompleks receptor androgenowy-

ligand przyłącza się za pomocą domeny wiążącej DNA do określonego fragmentu nici

DNA tzw. „elementu odpowiedzi na androgeny”, co wpływa na procesy transkrypcji

i translacji, a w konsekwencji na syntezę białek w komórce.

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących

141

Tabela 2. Testosteron oraz przykłady substancji anaboliczno androgennych

Nazwa

zwyczajowa

Nazwa chemiczna Wzór chemiczny

Testosteron 17-beta-hydroksy-4-

androsten-3-on

Trenabol 17-beta-acetoksyestra-

4,9,11-trien-3-on

Anapolon Oksymetolon

Oxandrolon Oksandrolon

Opracowanie własne, wzory chemiczne pochodzą z bazy Pubchem

4. Inhibitory aromatazy

Inhibitory aromatazy stanowią kolejną grupę substancji wykorzystywanych

pozamedycznie jako substancje dopingujące. Aromataza jest enzymem uczestniczącym

w endogennym szlaku powstawania hormonów płciowych, odpowiedzialnym za

przekształcanie związków androgenowych do związków estrogenowych [1]. Można je

podzielić na:

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

142

• Inhibitory steroidowe – pochodne androstenedionu, które działają jako inhibitory

kompetencyjne. Należą tu eksemestan i formestan. Jako substancje o budowie

steroidowej wykazują działanie hepatotoksyczne. W Polsce nie są zarejestrowane;

• Inhibitory niesteroidowe – wiążą się poprzez atom azotu do atomu żelaza w hemie

aromatazy. Należą tu anastrozol, letrozol i worozol. Są zarejestrowane w Polsce.

Zahamowanie enzymu aromatazy przez inhibitory aromatazy prowadzi do

zwiększenia poziomu testosteronu oraz obniżenia poziomu estrogenów we krwi.

Inhibitory aromatazy, takie jak, anastrozol, letrozol, eksemestan są wykorzystywane

do celów klinicznych w leczeniu nowotworów estrogenozależnych u kobiet w wieku

pomenopauzalnym, lub w sytuacji, gdy inny lek o podobnym zastosowaniu, tamoksifen,

jest nieskuteczny lub nietolerowany przez pacjentki. U mężczyzn inhibitory aromatazy

są stosowane w leczeniu wybranych przypadków niepłodności męskiej.

Właściwości farmakologiczne inhibitorów aromatazy są także wykorzystywane do

celów pozamedycznych – jako tzw. doping pośredni. Są one stosowane w leczeniu

ginekomastii wywołanej długotrwałym podawaniem steroidów anaboliczno-

androgennych oraz w celu przywrócenia endogennej aktywności wydzielniczej jąder

wynikającej z długotrwałego przyjmowania steroidów anaboliczno-androgennych

[24-26].

Inhibitory aromatazy, podobnie jak steroidy anaboliczno-androgenne, zwiększają

poziom testosteronu we krwi. Analogicznie, mimo różnego mechanizmu działania,

będą wywoływały podobne działania niepożądane. Dlatego ich stosowanie powinno

być ograniczone tylko do celów klinicznych [1, 24-26].

Tabela 3. Inhibitory aromatazy.

Nazwa

handlowa

Nazwa chemiczna Wzór chemiczny

Formestan 4-hydroksyandrost-4-en-3,17-dion

Exemestan 6-Metylenoandrosta-1,4-dien-

3,17-dion

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących

143

Letrozol 4,4'-((1h-1,2,4-triazol-1-

yl)metyleno)dibenzonitryl

Anastrozol 2,2'-(5-((1H-1,2,4-triazol-1-

yl)metylo)-1,3-fenylo)bis(2-

metylopropanonitryl)

Opracowanie własne, wzory chemiczne pochodzą z bazy Pubchem.

5. Selektywne Modulatory Receptora Androgenowego (SARM)

SARM stanowią najnowszą grupę substancji wpływających na receptory andro-

genowe. Ze względu na liczne działania niepożądane steroidów anaboliczno-andro-

gennych, prowadzone są badania, w których poszukiwane są struktury chemiczne,

które będą pobudzały receptory selektywnie (np. w tkance mięśniowej, stymulując tym

samym syntezę aktyny i miozyny), a jednocześnie będą hamowały receptory andro-

genowe zlokalizowane w gruczole krokowym, zapobiegając jego rozrostowi i nowo-

tworzeniu. Czyli substancje te wykazywałyby działanie modulujące (agonistyczno-

antagonistyczne) na receptor androgenowy [1, 27-32].

Ze względu na budowę chemiczną znane substancje należące do SARM dzielą się

na grupy:

• analogi arylo-propionamidu (ostaryna, andaryna);

• pochodne propionoamidowe;

• analogi dwupierścieniowej hydantoiny (np. BMS 564929);

• chinolinony (np. LGD 2226, LGD2491);

• analogi tetrahydrochinoliny (np. S-40503);

• benzoimidazole, imidazolopyrazole, indole oraz pyrazolina i ich pochodne;

• pochodne butanamidów / pochodne azosteroidowe (np. MK-0773);

• pochodne aniliny, benzoksazepinionów i inne.

Selektywne modulatory receptora androgenowego mogłyby być wykorzystane

w chorobach nowotworowych przebiegających z wyniszczeniem organizmu i utratą

mięśni, dystrofii, osteoporozie, nowotworze sutka, a nawet w wysiłkowym nietrzy-

maniu moczu. Wykorzystanie tych substancji w lecznictwie jest sprawą przyszłości.

Obecnie związki pozostają w fazie badań klinicznych i nie są zarejestrowane do

lecznictwa. Mimo to, liczna grupa osób stosuje je do celów pozamedycznych, jako

substancje dopingujące. Warto podkreślić, że w takiej sytuacji należy brać pod uwagę

możliwość wystąpienia wszystkich działań niepożądanych steroidów anaboliczno

androgennych [27-32].

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

144

6. Syntetyczne izoflawony – nowa nadzieja w terapii raka piersi

Nowsze doniesienia [33] pokazują, że substancje pochodzenia roślinnego mogą

również wykazywać działanie anaboliczne. W badanich in vitro potwierdzono wpływ

dwóch syntetycznych izoflawonów, metoksyizoflawonu i ipriflawonu na aktywność

katalityczną wspomnianego wcześniej enzymu -aromatazy (CYP19), który katalizuje

konwersję androgenów do estrogenów. Wstępne wyniki pokazują, że metoksyizo-

flawon i ipriflawon działają jako konkurencyjne inhibitory aromatazy a stopień

hamowania mierzony in vitro podobny do tego, który wywołują inhibitory aromatazy.

Wskazuje to na potrzebę dalszych badań, w celu wykorzystania syntetycznych

pochodnych izoflawonów w terapii raka piersi oraz monitorowania ich poziomu

w kontroli antydopingowej, ponieważ istnieją przesłanki, że mogą być również

wykorzystane do celów pozamedycznych [33].

7. Wnioski

Substancje chemiczne wpływające na układ hormonalny można podzielić na trzy

grupy: steroidy anaboliczno-androgenne, inhibitory aromatazy oraz selektywne

modulatory receptora androgenowego. Stanowią one wartościowe grupy leków

wykorzystywanych w lecznictwie. Jednocześnie są one bardzo często stosowane do

celów pozamedycznych jako środki dopingujące. Wiedza dotycząca ich działań

niepożądanych powinna być popularyzowana, ponieważ niekontrolowane zażywanie

tych substancji może prowadzić do bardzo poważnych konsekwencji zdrowotnych.

Literatura

1. Thieme D., Hemmersbach P., Handbook of Experimental Pharmacology Volume 195,

Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2010.

2. Conti A.A., Doping in sports in ancient and recent times, Medicina nei Secoli-Arte e

Scienza 22(1-3), (2010), 181-90.

3. Barbalhol M., Barreiros F., The Use and Effect of Anabolic Androgenic Steroids in Sports,

International Journal of Sports Science, 5(5), (2015); 171-179.

4. Wells D.J., Gene doping: the hype and the reality, British Journal of Pharmacology

154(3), (2008), 623-631.

5. Miah A., Genetically Modified Athletes Biomedical ethics, gene doping and sport,

Routledge, London 2004.

6. Overbye M., An (un)desirable trade of harms? How elite athletes might react to medically

supervised ‘doping’ and their considerations of side-effects in this situation, International

Journal of Drug Policy 55 (2018) 14-30.

7. Alquraini H., Auchus R.J., Strategies that athletes use to avoid detection of androgenic-

anabolic steroid doping and sanctions, Molecular and Cellular Endocrinology 464 (2018)

28-33

8. Hughes D., The World Anti-Doping Code in sport, Australian Prescriber, 38(5), (2015),

167-170.

9. Kanayama G., Pope H.G.Jr., History and epidemiology of anabolic androgens in athletes

and nonathletes, Molecular and Cellular Endocrinology 464 (2018) 4-13.

10. Hoffman J.R., Ratamess N.A., Medical Issues Associated with Anabolic Steroid Use: Are

They Exaggerated?, Journal of Science and medicine in Sport, 5(2), (2006), 182-193.

11. Huang G., Basaria S., Do anabolic-androgenic steroids have performance-enhancing

effects in female athletes?, Molecular and Cellular Endocrinology 464 (2018) 56-64.

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących

145

12. Birzniece V., Doping in sport: effects, harm and misconceptions,

https://doi.org/10.1111/imj.12629

13. Hoff D., Doping, risk and abuse: An interview study of elite athletes with a history of

steroid use, Performance Enhancement & Health 1 (2012) 61-65.

14. Achar S., Rostamian A., Narayan M.S., Cardiac and Metabolic Effects of Anabolic –

Androgenic Steroid Abuse on Lipids, Blood Pressure, Left Ventricular Dimensions, and

Rhythm, The American Journal of Cardiology, 106, (2010), 893-901.

15. Kicman A.T., Pharmacology of anabolic steroids, British Journal of Pharmacology, 2008

Jun; 154(3): 502-521.

16. Amsterdam J., Opperhuizen A., Hartgens F., Adverse health effects of anabolic

–androgenic steroids, Regulatory Toxicology and Pharmacology 57, (2010), 117-123.

17. Baggish A.L., Weiner R.B., Kanayama G., Hudson J.I., Picard M.H., A.M.Jr., Pope

H.G.Jr., Long-Term Anabolic-Androgenic Steroid Use Is Associated With Left Ventricular

Dysfunction, Circulation: Heart Failure. 3 (2010);472-476.

18. Baggea,A.S.L., Rosénc T., Fahlked C., Ehrnborge C., Erikssonf B.O., Mobergg T., Thiblin

I., Somatic effects of AAS abuse: A 30-years follow-up study of male former power sports

athletes, Journal of Science and Medicine in Sport 20 (2017) 814-818.

19. Westlyea L.T., Kaufmanna T., Alnæsa D., Hullsteinc I.R., Bjørnebekkd A., Brain

connectivity aberrations in anabolic-androgenic steroid users, NeuroImage: Clinical 13

(2017) 62–69.

20. Djordjevic V., Stankovic I., Stipac A.V., Putnikovic B., Neskovic A.N., Short QT Interval

is Unreliable Marker of Anabolic Androgenic Steroid Abuse in Competitive Athletes, Srp

Arh Celok Lek 140(11-12), 2012, 711-716.

21. Nieschlag E., Vorona E., Doping with anabolic androgenic steroids (AAS): Adverse effects

on non-reproductive organs and functions, Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders

16, (2015), 199-211.

22. Hassan N.A., Salem M.F., Sayed M.A.E.L., Doping and effects of anabolic androgenic

steroids on the heart: histological, ultrastructural, and echocardiographic assessment in

strength athletes, Human & Experimental Toxicology 28, (2009), 273-283.

23. Christiansen A.V., Vinther A. S., Liokaftos D., Outline of a typology of men’s use of

anabolic androgenic steroids in fitness and strength training environments, Drugs:

Education, Prevention and Policy, 24:3, (2017), 295-305.

24. Vari C.E., Ősz B.E., Miklos A., Berbecaruiovan A., Tero-Vescan A., Aromatase inhibitors

in men – off-label use, misuse, abuse and doping, Farmacia, Vol. 64, (2016), 6.

25. Favretto D., Snenghi R., Pertile R., Mazloum R., Tucci M., Visentin S., Vogliardi S., Hair

analysis to discriminate voluntary doping vs inadvertent ingestion of the aromatase

inhibitor letrozole, https://doi.org/10.1002/dta.2555

26. Lønning P.E., The potency and clinical efficacy of aromatase inhibitors across the breast

cancer continuum, Annals of Oncology 22(3), (2011) ,503-514.

27. Grata E., Perrenoud L., Saugy M., Baume N., SARM-S4 and metabolites detection in

sports drug testing: A case report , Forensic Science International 213, (2011), 104-108.

28. Thevis M., Schanzer W., Detection of SARMs in doping control analysis, Molecular and

Cellular Endocrinology 464, (2018), 34-45.

29. Narayanan R., Coss Ch.C., Dalton J.T., Development of selective androgen receptor

modulators (SARMs), Molecular and Cellular Endocrinology 465, (2018), 134-142.

30. Zhang X., Allan G.F., Tannenbaum P., Sbriscia T., Linton O., Lai M.T., Johnson D.H.,

Bhattacharjee S., Lundeen S.G., Sui Z., Pharmacological characterization of an

imidazolopyrazole as novel selective androgen receptor modulator, Journal of Steroid

Biochemistry & Molecular Biology 134, (2013) 51-58.

Paweł Kozyra, Sylwia Talarek, Joanna Listos

146

31. Chisamore M.C., Gentile M.A., Dillon G.M., Baran M., Gambone C., Riley S., Schmidt

A, Flores O., Wilkinson H., Alves S.E., Novel selective androgen receptor modulator

(SARM) MK-4541 exerts anti-androgenic activity in the prostate cancer xenograft R–

3327G and anabolic activity on skeletal muscle mass & function in castrated mice, Journal

of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 163, (2016), 88-97.

32. Garg N., Hansson A., Knych H.K., Stanley S.D., Thevis M., Bondesson U., Hedeland M.,

Globisch D., Structural elucidation of major selective androgen receptor modulator (SARM)

metabolites for doping control, Organic and Biomolecular Chemistry 16 ,(2018), 698.

33. Iannone M., Botrè F., Cardillo N., de la Torre X., Synthetic isoflavones and doping:

A novel class of aromatase inhibitors?, Drug Testing and Analysis, (2018), doi:

10.1002/dta.2482. [Epub ahead of print].

Profil farmakologiczny wybranych substancji dopingujących

Streszczenie

WADA (World Anti-Doping Agency) została założona, aby zapewnić zgodność polityki antydopingowej

i regulacji w organizacjach sportowych i rządach na całym świecie. Misją Światowej Agencji Antydo-

pingowej jest prowadzenie wspólnego światowego ruchu na rzecz sportu bez dopingu. Środki dopingujące

są to substancje chemiczne, których celem jest zwiększenie zdolności fizycznych i/lub intelektualnych

organizmu. Jako środki dopingujące wykorzystywane są związki należące do różnych grup farmakolo-

gicznych, np. substancje psychostymulujące, pobudzające receptory β2, diuretyki, i inne. Celem niniejszej

prezentacji jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy na temat substancji dopingujących. Omówione

zostaną substancje wpływające na układ hormonalny, należące do różnych grup farmakologicznych, takich

jak: steroidy anaboliczne, selektywne modulatory receptorów androgenowych czy inhibitory aromatazy.

Przedstawione zostaną ich właściwości farmakologiczne, mechanizmy działania a także działania

niepożądane. Szerzenie wiedzy na temat działań niepożądanych substancji dopingujących, szczególnie

wśród ludzi młodych, ma na celu zmniejszenie przyjmowania tych substancji w celach pozamedycznych.

Słowa kluczowe: SARM, steroidy anaboliczno-androgenne, inhibitory aromatazy, doping

The pharmacological profile of selected doping substances

Abstract

WADA (World Anti-Doping Agency) was founded with the aim of bringing consistency to anti-doping

policies and regulations within sport organizations and governments right across the world. The World

Anti-Doping Agency's mission is to lead a collaborative worldwide movement for doping-free sport.

Doping agents are chemical compounds which increase the physical and/or intellectual capacity of an

organism. Various pharmacological groups are used as doping agents, e.g. psychostimulants, stimulants of

β2 receptors, diuretics, and others. The aim of this presentation is to present the current knowledge about

doping substances. It will be discussed substances affecting the endocrine system, belonging to various

pharmacological groups, such as: anabolic steroids, selective androgen receptor modulators or aromatase

inhibitors. Their pharmacological properties, mechanisms of action as well as side effects will be

presented. Spreading knowledge about the adverse effects of doping agents, especially in young people,

may reduce the intake of these substances for non-medical purposes.

Keywords: SARM, Anabolic-Androgenic Steroids, Aromatase Inhibitors, Doping

147

Monika Kaczoruk1, Anna Pacian

2, Teresa B. Kulik

3, Ewa Kawiak-Jawor

4,

Paulina Kaczor-Szkodny5

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim,

krajowym i lokalnym

1. Wprowadzenie

Cywilizacja z jej oczywistymi osiągnięciami i korzyściami dla ludzkości, stała się

także przyczyną rozwoju nowych zaburzeń stanu zdrowia. Dokonujące się zmiany

poza profitami, zwiększyły również ryzyko eskalacji negatywnych zjawisk. Pojawiły

się nowe schorzenia, których podłożem paradoksalnie stały się dobrodziejstwa

cywilizacji [1]. Po okresie skutecznego opanowania chorób zakaźnych, nastąpił proces

niekontrolowanego rozprzestrzeniania się przewlekłych chorób niezakaźnych, tzw.

chorób cywilizacyjnych. Zgodnie z definicją Światowej Organizacji Zdrowia (WHO);

zdrowie oznacza pełny dobrostan fizyczny, psychiczny i społeczny, pozwalający na

produktywną, sensowną i twórczą aktywność człowieka w życiu społecznym [2].

Zdrowie jako najważniejsza wartość w życiu, jest również istotnym elementem

mającym wpływ na kształt gospodarki, ekonomii i szeroko pojętego życia społecznego.

Ze względu na szerokie spektrum czynników warunkujących zdrowie, odpowie-

dzialność za jego stan nie może spoczywać wyłącznie na sektorze ochrony zdrowia,

pomimo znaczącej i dominującej roli. Zdrowie jako jeden z zasadniczych elementów

rozwoju ludzkości, wymaga uwzględnienia ochrony zdrowia i jego promocji w sferze

działalności publicznej, polegającej na interwencji państwa i wszechstronnej

współpracy wielu podmiotów wszystkich szczebli [3, 4]. Zdrowie jako dobro

publiczne stanowi istotny element ładu społecznego i ekonomicznego [5]. Celem

realizacji tego założenia jest konieczność nawiązywania współpracy wielosektorowej,

wielopoziomowej oraz międzypaństwowej. Obok cywilizacji, istotne znaczenie

w zmianie struktury zachorowalności i rozwoju społeczeństw ma również zjawisko

globalizacji. Zgodnie z definicją globalizacja jest „zespołem zjawisk, na skutek których

życie każdego mieszkańca naszej planety pozostaje przynajmniej częściowo związane

z decyzjami podejmowanymi poza jego własnym krajem, na które on sam ma

ograniczony wpływ [6,7]. Postęp technologiczny, nowoczesne środki transportu

i komunikacji, wzrost światowej wymiany gospodarczej, naukowej i kulturalnej

przyczyniają˛ się do rozwoju cywilizacyjnego, ale także do wzrostu współpracy

między państwami. Współpraca ta staje się niezbędnym warunkiem ich rozwoju.

Jednocześnie pojawiają się nowe wyzwania i zagrożenia o charakterze globalnym, 1 Katedra Zdrowia Publicznego, Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Medyczny w Lublinie,

monika.kaczoruk@umlub.pl 2 Katedra Zdrowia Publicznego, Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 Katedra Zdrowia Publicznego, Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 4 Katedra Zdrowia Publicznego, Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 5 Zakład Biostatystyki, Demografii i Epidemiologii, Instytut Medycyny Wsi w Lublinie

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-Szkodny

148

które nie mogą być rozwiązywane przez jedno państwo, lecz dzięki wspólnej strategii

międzynarodowej [8]. Podobnie jak w przypadku cywilizacji, globalizacja niesie za

sobą również ryzyka zdrowotne dla ludności. W odpowiedzi na nieustanny postęp

cywilizacyjny i tworzenie globalnej społeczności, koniecznym stało się doprecyzo-

wanie międzynarodowej współpracy celem zapewnienia bezpieczeństwa zdrowotnego.

W kwestii zabezpieczenia zdrowotnego istotnego znaczenia nabiera polityka

zdrowotna. Według WHO; polityka zdrowotna to działalność zmierzająca do poprawy

sytuacji zdrowotnej, poprzez określanie priorytetów w obrębie celów oraz wskazy-

wanie głównych kierunków ich realizacji [9, 10]. Polityka zdrowotna jest swoistego

rodzaju scenariuszem, określającym co powinno być zrobione, w jakim okresie, kto

powinien być za to odpowiedzialny oraz wskazuje wymagane zasoby finansowe [11].

Według WHO celem polityki zdrowotnej jest niwelowanie różnic zdrowotnych oraz

dążenie do poprawy stanu zdrowia społeczeństwa poprzez: zapewnienie powszechnego

dostępu do podstawowych usług medycznych; promowanie zachowań prozdrowotnych

i społecznego dobrostanu; osiąganie zadowolenia pacjentów; zapewnienie wysokiej

jakości usług, przy zachowaniu zasady efektywnego wykorzystania zasobów oraz

stabilności finansowej i organizacyjnej systemu [12, 13]. Polityka zdrowotna

realizowana jest w wymiarze lokalnym, regionalnym, krajowym oraz między-

narodowym.

Praca dotyczy analizy dotychczasowych strategii polityki zdrowotnej na poziomie

międzynarodowym, europejskim, krajowym oraz lokalnym (odnoszących się do

działań podejmowanych przez województwo lubelskie i Urząd Miasta Lublin).

Dokonano analizy dokumentów strategicznych polityki zdrowotnej.

W pracy założono przeprowadzenie analizy w zakresie:

Genezy globalnej polityki zdrowotnej, jej strategii i celu;

Podmiotów tworzących politykę globalną;

Strategii europejskiej polityki zdrowotnej;

Strategii krajowej i lokalnej polityki zdrowotnej.

2. Polityka międzynarodowa i europejska

O globalnym wymiarze polityki zdrowotnej mówimy od momentu powołania

Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 1946 roku [14, 15]. Geneza współcześnie

realizowanej polityki zdrowotnej, wynika z postanowień przyjętych w Konstytucji

Światowej Organizacji Zdrowia z 1948 roku [16]. Celem zapisanym w najważ-

niejszym dokumencie WHO, jest osiągnięcie przez wszystkich ludzi możliwie

najwyższego poziomu zdrowia, a rolą jej jest koordynowanie międzynarodowych

działań prozdrowotnych oraz udzielanie wsparcia technicznego, zaś jej struktura

organizacyjna dostosowana jest do zaspokajania potrzeb różnych regionów świata

[17]. Światowa Organizacja Zdrowia, jako lider w działaniach dotyczących polityki

zdrowotnej, stworzyła podstawę do wielu globalnych, regionalnych, a także krajowych

przedsięwzięć na rzecz zdrowia [18]. Potwierdzeniem tego jest globalna strategia

polityki zdrowotnej określona w rezolucji pt. Zdrowie 21. Zdrowie dla Wszystkich

w XXI wieku, przyjęta w maju 1998 roku przez kraje członkowskie Światowej

Organizacji Zdrowia [19]. W działaniach tych wskazano, że zdrowie powinno być

traktowane jako zasadniczy element rozwoju ludzkości.

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym

149

Współczesna strategia globalnej polityki zdrowotnej rozpoczyna swój bieg w roku

2008, kiedy to podczas konferencji w Tallinie, został podpisany przez ministrów

zdrowia z krajów regionu europejskiego WHO-dokument zwany kartą z Tallina [20].

Zawarta w Karcie definicja systemu zdrowotnego wskazuje, że jest to zespół

wszystkich organizacji i instytucji (publicznych i prywatnych) oraz wszelkich

zasobów, które służą poprawie, zachowaniu lub przywracaniu zdrowia, niezależnie od

otoczenia politycznego i instytucjonalnego, w które system jest wpisany. Systemy

zdrowotne to narzędzia służące realizacji strategii polityki zdrowotnej. Głównym

zadaniem jest zapobieganie chorobom, promocja zdrowia oraz nawiązywanie

międzysektorowej współpracy na rzecz zdrowia. Zgodnie z rekomendacjami WHO,

w Karcie Tallińskiej podkreślono przywiązanie do podstawowych praw i wartości,

wskazując, że zdrowie stanowi podstawowe prawo każdego człowieka, a działania

systemów zdrowotnych powinny opierać się na zasadach sprawiedliwości, solidarności

oraz uczestnictwa [21]. Dokument ze stolicy Estonii wzywa do ponadnarodowej

współpracy na rzecz zdrowia ludności globu.

W oparciu o zobowiązania zawarte w Karcie Tallińskiej, został stworzony doku-

ment będący swoistego rodzaju współczesną strategią globalnej polityki zdrowotnej

europejskiego regionu WHO. W dniach 10-13 września 2012 r. odbyła się na Malcie

62. sesja Europejskiego Komitetu Regionalnego Światowej Organizacji Zdrowia [22].

Jednym z jej najważniejszych rezultatów było przyjęcie rezolucji wprowadzającej

nowe strategiczne ramy polityki regionalnej na rzecz zdrowia, pt. Zdrowie 2020.

Europejskie ramy polityczne i strategia na XXI wiek [23]. W dokumencie przedsta-

wione są główne tezy polityki wspomagającej działania rządów i społeczeństw na

rzecz zdrowia i pomyślności. Wskazano w nim, że dobre zdrowie jest nieodzowne dla

rozwoju gospodarczego i społecznego oraz że ma ono ogromny wpływ na życie

każdego człowieka, wszystkich rodzin i innych wspólnot. „Zdrowie 2020”, to

dokument ramowy strategii polityki zdrowotnej dla krajów europejskiego regionu

WHO [23]. Cele polityki zdrowotnej, określone w wyżej wspomnianym dokumencie,

opierają się na wartościach przyjętych w Konstytucji Światowej Organizacji Zdrowia,

gdzie podstawowym prawem każdej istoty ludzkiej jest możliwość korzystania

z najwyższego osiągalnego poziomu zdrowia bez względu na pochodzenie etniczne,

płeć, wiek, status społeczny. Zdrowie 2020 określa cele polityki zdrowotnej na

poziomie międzynarodowym, wskazując na konieczność: poprawy stanu zdrowia

wszystkich obywateli i zmniejszenie nierówności zdrowotnych, jak również

wzmocnienia przywództwa i partycypacyjnego systemu zarządzania na rzecz zdrowia.

Dokument z Malty, określa cztery priorytetowe obszary realizacji polityki zdrowotnej:

inwestowanie w zdrowie w oparciu o podejście uwzględniające uwarunkowania

zdrowia w cyklu życia i upodmiotowienie człowieka;

zapobieganie i zwalczanie chorób niezakaźnych i zakaźnych będących istotnym

wyzwaniem zdrowotnym w Europejskim Regionie WHO;

wzmocnienie systemów ochrony zdrowia skupionych na człowieku, zdolności

działania i gotowość do zapobiegania skutkom klęsk i sytuacji kryzysowych

w obszarze zdrowia publicznego oraz systemów nadzoru i reagowania;

budowanie elastycznych społeczności i wspierających środowisk, posiadających

zdolność adaptacji do zmieniających się warunków życia [22].

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-Szkodny

150

Kontynuacją założeń światowej strategii zdrowia, są projekty regionalne

i narodowe dostosowujące priorytety, cele i środki działania do sytuacji zdrowotnej

oraz potrzeb występujących w danym regionie czy kraju [2, 23]. Z uwagi na fakt

przystąpienia w 2004 roku, Polski do Unii Europejskiej, istotnym elementem analiz,

jest strategia europejskiej polityki zdrowotnej [24]. Artykuł 91 Konstytucji RP

wskazuje na konieczność stosowania, w granicach wynikających z traktatów, prawa

stanowionego przez Unię Europejską [25]. Komplementarnym dokumentem na arenie

europejskiej do strategii Zdrowie 2020 jest strategia Europa 2020 [26,27]. Dokument

w bezpośredni sposób nie odnosi się do spraw zdrowia, ale postrzega je jako środek do

osiągnięcia inteligentnej i zrównoważonej gospodarki, sprzyjającej włączeniu

społecznemu. W obszar strategii włącza: utrzymanie wysokiego poziomu zdrowia,

wykorzystanie innowacji w sektorze ochrony zdrowia, ulepszenie kompetencji

zawodowych i tworzenie nowych miejsc pracy oraz debatę nad postępującym

procesem starzenia się populacji [26,28]. Narzędziami służącymi implementacji

strategii UE w zakresie zdrowia są programy wspólnotowe [29]. Obecnie realizowany

Trzeci Program w dziedzinie zdrowia na lata 2014-2020, ma na celu wspieranie państw

członkowskich, w ich wysiłkach mających na celu poprawę zdrowia obywateli oraz

zapewnienie długotrwałości systemów zdrowotnych, co wpisuje się w strategię Europa

2020, a także wynika z zapisów Karty z Tallina [30]. Celem trzeciego programu

zdrowia jest: uzupełnianie, wspieranie i przyznawanie wartości dodanej politykom

państw członkowskich, aby poprawić zdrowie obywateli Unii i zmniejszyć nierów-

ności w zdrowiu poprzez: promowanie zdrowia, zachęcenie do innowacji w dziedzinie

zdrowia, zwiększanie stabilności systemów zdrowotnych oraz ochronę obywateli Unii

przed poważnymi transgranicznymi zagrożeniami zdrowotnymi [31].

3. Krajowa polityka zdrowotna

Z uwagi na fakt, że każdy z krajów członkowskich charakteryzuje się zróżnicowaną

sytuacją społeczno-ekonomiczną, dla każdego z nich opracowano Krajowy Program

Reform, którego celem jest przełożenie ogólnoeuropejskich zadań na szczegółowe cele

krajowe. Przełomowym dokumentem współcześnie realizowanej strategii polityki

zdrowotnej, jest Policy Paper dla ochrony zdrowia na lata 2014-2020. Krajowe ramy

strategiczne. Dotyczy on strategii polityki zdrowotnej kraju [32,33], ale również

stanowi narzędzie ułatwiające wykorzystanie środków europejskich na potrzeby

realizacji krajowej polityki zdrowotnej, pod warunkiem dostosowania jej do strategii

europejskiej [32]. Policy Paper dla ochrony zdrowia, określa priorytety zdrowotne

państwa, cele, kierunki interwencji, projektowane działania i ich ramy realizacyjne.

Policy Paper jest zgodne z dokumentami Unii Europejskiej i WHO, tj.: Strategia

Europa 2020, Zdrowie 2020 [34]. Celem głównym polityki zdrowotnej Polski,

wskazanym w dokumencie Policy Paper jest zwiększenie długości życia w zdrowiu,

jako czynnika wpływającego na jakość życia i wzrost gospodarczy [32]. Analiza

zawarta w dokumencie Policy Paper wskazuje, że problemem polskiego systemu

ochrony zdrowia jest: niska świadomość zdrowotna społeczeństwa oraz wykrywalność

chorób w zaawansowanych stadiach rozwojowych, co znacznie zmniejsza szanse na

całkowite wyleczenie. Dlatego istotnym krokiem strategii polityki zdrowotnej kraju,

umożliwiającym poprawę zaistniałej sytuacji, jest zintensyfikowanie działań

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym

151

profilaktycznych, służących zwiększeniu dostępu do badań diagnostycznych, ale

również mających na celu podniesienie poziomu wiedzy i świadomości zdrowotnej

społeczeństwa. Znajdzie to odzwierciedlenie w poprawie zachowań ochronnych

i budujących potencjał zdrowotny ludności [35, 36]. Programy polityki zdrowotnej

stanowią narzędzia, które w istotny sposób wpływają na poprawę kondycji zdrowotnej

ludności. Istotne znaczenie ma więc tworzenie nowych, jak również kontynuowanie

dotychczas istniejących programów zdrowotnych oraz programów polityki zdrowotnej,

definiowanych odpowiednio w artykule 5 pkt. 29a i 30 Ustawy z dnia 27 sierpnia 2004

roku o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze środków publicznych [37].

Zaangażowanie podmiotów administracji publicznej jest warunkiem niezbędnym

do poprawy stanu zdrowia społeczeństwa, ale również wynikającym z regulacji

prawnych kraju. Instrumentem służącym realizacji zadań w obszarze zdrowia na rzecz

społeczności lokalnej przez jednostki samorządu terytorialnego jest program polityki

zdrowotnej, definiowany w przedmiotowej ustawie jako zespół zaplanowanych

i zamierzonych działań z zakresu opieki zdrowotnej ocenianych jako skuteczne,

bezpieczne i uzasadnione, umożliwiających osiągnięcie w określonym terminie

założonych celów, polegających na wykrywaniu i zrealizowaniu określonych potrzeb

zdrowotnych oraz poprawy stanu zdrowia określonej grupy świadczeniobiorców,

opracowany, wdrażany, realizowany i finansowany przez ministra albo jednostkę

samorządu terytorialnego [37].

Funkcjonowanie programów polityki zdrowotnej w systemie ochrony zdrowia

naszego kraju, wynika m.in. z zapisów:

Ustawy z dnia 27 sierpnia 2004 r. o świadczeniach opieki zdrowotnej finanso-

wanych ze środków publicznych [37],

Ustawy z dnia 11 września 2015 r. o zdrowiu publicznym [38],

Rozporządzenia Rady Ministrów z dnia 4 sierpnia 2016 r. w sprawie Narodowego

Programu Zdrowia na lata 2016-2020 [39].

Istotne znaczenie odgrywa również Ustawa z dnia 8 marca 1990 r. o samorządzie

gminnym, która wskazuje, że jednym z wielu zadań własnych gminy w zakresie

zaspokajania zbiorowych potrzeb wspólnoty są także sprawy dotyczące ochrony

zdrowia [40]. Rozdział 2 ustawy o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze

środków publicznych, formułuje katalog zadań władz publicznych w zakresie

zapewnienia równego dostępu do świadczeń opieki zdrowotnej [37]. Kolejno; artykuł

7, 8 i 9, tejże ustawy precyzuje zadania własne jednostek samorządu terytorialnego

wszystkich szczebli, w tym zakresie, wskazując m.in. na konieczność opracowywania

i realizacji oraz oceny efektów programów polityki zdrowotnej, wynikających

z rozpoznanych potrzeb zdrowotnych i stanu zdrowia mieszkańców gminy [37].

Zgodnie z Art. 9a. ustawy o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze

środków publicznych, w celu zaspokajania potrzeb wspólnoty samorządowej

w zakresie ochrony zdrowia jednostka samorządu terytorialnego, uwzględniając

w szczególności regionalną mapę potrzeb zdrowotnych, priorytety dla regionalnej

polityki zdrowotnej oraz stan dostępności do świadczeń opieki zdrowotnej na danym

obszarze, może finansować dla mieszkańców tej wspólnoty świadczenia gwaran-

towane [37]. Wpływ na realizację zadań programów polityki zdrowotnej przez

jednostki samorządu terytorialnego ma także ustawa z dnia 11 września 2015 r.

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-Szkodny

152

o zdrowiu publicznym [38]. Ustawa określa katalog działań podejmowanych przez

administrację publiczną, mającą poprawić stan zdrowia populacji. Reguluje także

zasady koordynacji, wspierania i finansowania działań administracji publicznej

i współpracy innych podmiotów w tym zakresie. W artykule 3. wspomnianej ustawy

znalazł się zapis wskazujący, że zadania z zakresu zdrowia publicznego realizują,

współdziałając ze sobą: organy administracji rządowej, zgodnie z kompetencjami

określonymi w ustawie z dnia 4 września 1997 r. o działach administracji rządowej,

państwowe jednostki organizacyjne, w tym agencje wykonawcze, jednostki samorządu

terytorialnego, realizujące zadania własne polegające na promocji lub ochronie zdrowia

[38]. Dodatkowo na podstawie art. 9 ust. 2 ustawy z dnia o zdrowiu publicznym został

powołany Narodowy Program Zdrowia na lata 2016-2020 [39]. Celem strategicznym

Narodowego Programu Zdrowia, jest wydłużenie życia w zdrowiu, poprawa zdrowia

i związanej z nim jakości życia ludności oraz zmniejszenie nierówności społecznych

w zdrowiu. Ustawa o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanej ze środków

publicznych, wskazuje na konieczność doprecyzowania strategii lokalnej polityki

zdrowotnej do celów operacyjnych określonych w Narodowym Programie Zdrowia,

odnoszących się do strategii polityki zdrowotnej na poziomie krajowym [37]. Zgodnie

z ustawą o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze środków publicznych

jednostka samorządu terytorialnego, sporządza projekt programu polityki zdrowotnej

na podstawie map potrzeb zdrowotnych. Wojewoda w porozumieniu z Wojewódzką

Radą do spraw Potrzeb Zdrowotnych na podstawie art. 95 c ustawy z dnia 27 sierpnia

2004 r. o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze środków publicznych

ustala Priorytety dla regionalnej polityki zdrowotnej. Priorytety określa się na okres, na

który sporządza się regionalną mapę potrzeb zdrowotnych.

Aktualnie opracowane Priorytety dla Regionalnej Polityki zdrowotnej dla woje-

wództwa lubelskiego zostały przygotowane na podstawie Mapy Potrzeb Zdrowotnych

w zakresie lecznictwa szpitalnego dla województwa lubelskiego, Map Potrzeb

Zdrowotnych w zakresie kardiologii i onkologii sporządzonych i ogłoszonych przez

Ministra Zdrowia w dniu 31 grudnia 2016 roku. Ponadto uwzględniono dokument

pt. Krajowe Ramy Strategiczne Policy paper dla ochrony zdrowia na lata 2014-2020,

a także stanowiska członków Wojewódzkiej Rady do Spraw Potrzeb Zdrowotnych dla

województwa lubelskiego, ekspertów w poszczególnych dziedzinach medycyny

z terenu województwa lubelskiego oraz dane statystyczne z dostępnych źródeł [41].

W przedmiotowym dokumencie wyodrębniono sześć priorytetowych obszarów

wyznaczających kierunki działań, których nadrzędnym celem jest poprawa efektyw-

ności i organizacji systemu opieki zdrowotnej w województwie lubelskim, tj.:

Racjonalizacja wykorzystania zasobów w systemie ochrony zdrowia;

Wzmocnienie potencjału infrastrukturalnego oraz kadrowego systemu ochrony

zdrowia w dziedzinach priorytetowych dla województwa lubelskiego;

Reorientacja struktury udzielania świadczeń zdrowotnych;

Wzmocnienie opieki zdrowotnej nad osobami starszymi, przewlekle chorymi

i wymagającymi opieki paliatywnej;

Wzmocnienie opieki psychiatrycznej;

Rozwój profilaktyki zdrowotnej [41].

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym

153

4. Lokalna polityka zdrowotna miasta Lublin

Z uwagi na ustawowe zobowiązane jednostek samorządu terytorialnego do

realizacji działań w zakresie programów polityki zdrowotnej, należy wspomnieć

o programie polityki zdrowotnej realizowanym przez Urząd Miasta Lublin [42].

Miasto Lublin, jako gmina i miasto na prawach powiatu, odpowiedzialne za realizację

ustawowo nałożonych zadań z zakresu ochrony i promocji zdrowia aktualnie realizuje

strategię polityki zdrowotnej, określoną w programie pt. Zdrowie dla Lublina na lata

2016-2020. Jest to bazowy dokument służący opracowaniu i wdrażaniu na terenie

Miasta Lublin, lokalnych programów polityki zdrowotnej i projektów służących

poprawie zdrowia mieszkańców Miasta [43]. W pięciu punktach wyznacza główne

kierunki działania Miasta, w sferze promocji i ochrony zdrowia mieszkańców Lublina.

Zaproponowany obszar działań obejmuje zakreślone ustawowo zadania samorządu

zmierzające do poprawy stanu zdrowia i związanej z nim jakości życia mieszkańców.

Program Zdrowie dla Lublina na lata 2016-2020 wprowadzony uchwałą nr

324/IX/2015 Rady Miasta Lublin z dnia 19 listopada 2015 r. w sprawie przyjęcia

Programu Zdrowie dla Lublina na lata 2016-2020, określa strategię w pięciu punktach:

Działania przeciwdziałające zachorowaniom na choroby układu krążenia,

nowotwory, cukrzycę, wady wzroku u dzieci oraz próchnicę zębów,

Tworzenie przestrzeni miejskiej sprzyjającej zdrowiu,

Działania profilaktyczne obniżające występowanie czynników ryzyka chorób

cywilizacyjnych tj. małej aktywności fizycznej, nadwagi i otyłości oraz palenia

tytoniu,

Działania w zakresie opieki geriatrycznej i długoterminowej,

Wzbogacenia działań z zakresu ochrony zdrowia psychicznego, w tym opieki

psychiatrycznej [42, 43].

Czas jego realizacji zaplanowano na lata 2016 - 2020, co pozwoli na zachowanie

zgodności z najważniejszymi dokumentami strategicznymi i programowymi na

poziomie ogólnokrajowym, regionalnym i lokalnym. Program zakłada kontynuację

realizowanych dotychczas przez Miasto programów z zakresu promocji zdrowia

i profilaktyki, tj.:

program zdrowotny szczepień ochronnych przeciw pneumokokom,

program zdrowotny szczepień ochronnych przeciw wirusowi brodawczaka

ludzkiego (HPV),

program zdrowotny szczepień ochronnych przeciw grypie dla osób powyżej 65

roku życia,

program profilaktyki próchnicy zębów dla uczniów uczęszczających do placówek

oświatowo – wychowawczych,

Miejski Program Ochrony Zdrowia Psychicznego,

program zdrowego odżywiania „Jedz z głową”,

program świadczeń zdrowotnych w zakresie sprawowania opieki nad dziećmi

i młodzieżą oraz osobami dorosłymi w stanach terminalnych choroby[42, 43].

Ponadto kontynuowane są działania edukacyjne w zakresie profilaktyki nadwagi

i otyłości oraz wad postawy. Założeniem, które przyjęto przy konstrukcji Programu,

jest kontynuacja dotychczasowych działań w zakresie promocji zdrowia, profilaktyki

i edukacji prozdrowotnej [42]. Jest to podejście właściwe i zgodne z zapisami ustawy

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-Szkodny

154

o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze środków publicznych.

W artykule 48 ustawy wskazano, że programy zdrowotne mogą być realizowane w

ciągu jednego roku lub jako działania wieloletnie.

5. Podsumowanie

Dobre zdrowie jest nieodzowne dla rozwoju gospodarczego kraju, Europy i świata

[23]. Geneza współcześnie realizowanej polityki zdrowotnej wynika z postanowień

przyjętych w Konstytucji Światowej Organizacji Zdrowia z 1948 roku. Podstawowym

kierunkiem w budowaniu strategii polityki zdrowotnej zarówno na poziomie

międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym jest zapewnienie wszystkim

ludziom, bez względu na pochodzenie etniczne, płeć, wiek, status społeczny, możliwie

najwyższego poziomu ochrony zdrowia.

Programy polityki zdrowotnej stanowią narzędzia, które z założenia mają na celu

dążenie do poprawy kondycji zdrowotnej ludności. Należy przypomnieć, że

w ostatnich latach Najwyższa Izba Kontroli (NIK) stwierdziła wiele nieprawidłowości

w realizacji programów polityki zdrowotnej zdrowotnych realizowanych przez

jednostki samorządu terytorialnego [43]. Sformułowane przez NIK zarzuty dotyczyły

przede wszystkim implementacji oraz ewaluacji programów.

Koniecznym jest zatem sprawdzanie skuteczności i racjonalności prowadzonych

działań w zakresie zdrowia. Wiele analiz praktycznych wskazuje, że wymierne efekty

działań w promocji zdrowia i profilaktyce, są zauważalne dopiero po wielu latach od

wprowadzenia programu [44,45]. Wdrażając programy zdrowotne i programy polityki

zdrowotnej należy pamiętać o tym by miały charakter wieloletni i podlegały okresowej

ewaluacji. Sprzyja to bowiem lepszemu zorganizowaniu zadań, efektywniejszemu

gromadzeniu i wykorzystywaniu zasobów materialnych oraz ludzkich, budowaniu

zaufania społecznego oraz tworzeniu realnego kapitału zdrowotnego w społeczeństwie

[46, 47]. Dodatkowo dokonując ewaluacji działań, możliwym jest wypracowanie

skutecznych metod, umożliwiających realizację skutecznej polityki zdrowotnej, opartej

o dowody [44, 48].

Literatura

1. Kulik T., Pacian A., Kaczoruk M., Kaczor-Szkodny P., Dobrodziejstwa cywilizacji

a ryzyko nadmiernej masy ciała u dzieci, [w:] Zdunek B., Olszówka M. (red.), Medycyna

i nauki pokrewne – wybrane zagadnienia, Wydawnictwo Naukowe TYGIEL, Lublin 2016,

s. 31-45.

2. Kawałko Sz., Istota i zadania współczesnej polityki ochrony zdrowia, Studia Gdańskie.

Wizje i rzeczywistość,11, (2014), s. 325-338.

3. Niżnik J., W poszukiwaniu racjonalnego systemu finansowania ochrony zdrowia, Oficyna

Wydawnicza Branta, Bydgoszcz 2004, s.150-210.

4. Jakubowska A., Kapitał zdrowia jako czynnik wzrostu społeczno-gospodarczego

– sytuacja Polski w kontekście epidemii chorób przewlekłych, Zeszyty Naukowe Polskiego

Towarzystwa Ekonomicznego w Zielonej Górze, 5, (2016), s. 42-53.

5. Frąckiewicz-Wronka A., Skrzypczak Z., Organizacja i funkcjonowanie europejskich

systemów zdrowotnych, [w:] Ryć K., Skrzypczak Z. (red.), Ochrona zdrowia na świecie,

Wolters Kluwer Polska, Warszawa 2011, s. 168.

6. Guillochon B., Globalizacja. Jeden świat – różne drogi rozwoju, Mała Encyklopedia

Larousse, Wrocław 2003, s.5.

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym

155

7. Wojtczak A., Globalizacja wyzwaniem dla zdrowia publicznego, Civitas Hominibus:

rocznik filozoficzno-społeczny, 6, (2011), s. 35-43.

8. Kulik T.B., Zdunek K., Pacian A., Polityka zdrowotna w krajach Unii Europejskiej,

Zdrowie Dobrostan, 4, (2013), s. 157-164.

9. Włodarczyk C., Wprowadzenie do polityki zdrowotnej, Wolters Kluwer Polska, Warszawa

2010, s.15-35.

10. Regional Committee for the Western Pacific 030, Formulating strategies for health for all

by the year 2000 : guiding principles and essential issues : preliminary document of the

Executive Board, Manila WHO Regional Office for the Western Pacific, (1979).

11. Magnuszewska-Otulak G., Ochrona zdrowia w polityce społecznej, [w:] Firlit-Fesnak G.,

Szylko-Skoczny M. (red.), Polityka społeczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

2009, s. 201.

12. Samorząd Województwa Lubelskiego, Program edukacyjny z zakresu zdrowia

psychicznego: Profilaktyka zaburzeń depresyjnych wśród młodzieży w wieku 16-17 lat na

lata 2012-2015, Lublin 2012.

13. Konstytucja Światowej Organizacji Zdrowia, Porozumienie zawarte przez Rządy

reprezentowane na Międzynarodowej Konferencji Zdrowia i Protokół dotyczący

Międzynarodowego Urzędu Higieny Publicznej, podpisane w Nowym Jorku dnia 22 lipca

1946 r., Dz. U. 1948 nr 61 poz. 477.

14. Ustawa z dnia 29 stycznia 1948 r. o ratyfikacji konstytucji Światowej Organizacji

Zdrowia, jak również porozumienia zawartego przez rządy reprezentowane na

międzynarodowej konferencji zdrowia oraz protokołu dotyczącego Międzynarodowego

Urzędu Higieny Publicznej, podpisanych w Nowym Jorku dnia 22 lipca 1946 r., Dz. U.

1948 nr 10 poz. 72.

15. Poździoch S., Międzynarodowa polityka zdrowotna, [w:] Czupryn A., Poździoch S., Ryś

A., Włodarczyk C. (red.), Zdrowie publiczne, Vesalius, Kraków 2001, s.169.

16. Galewicz W., Zdrowie jako prawo człowieka, Diametros, 42, (2014), s. 57–82.

17. Menkens J., Wasikowski A., Organizacje międzynarodowe. Prawo instytucjonalne,

Wydawnictwo Wolters Kluwer business, Warszawa 2010, s.120.

18. Cianciara D., Piętka S., Sytnik-Czetwertyński J., Pinkas J., Essential public health operations

in the WHO European Region, Postępy Nauk Medycznych, 5,(2016), s. 316-321.

19. WHO: The Tallinn Charter: Health systems for health and wealth. WHO Regional Office

for Europe. Tallinn, Estonia 25-27 June (2008).

20. Cianciara D., Piętka S., Sytnik-Czetwertyński J., Pinkas J., Essential public health operations

in the WHO European Region, Postępy Nauk Medycznych, 5, (2016), s. 316-321.

21. Opolski J.T, Wysocki M.J., Zdrowie 2020 – nowe założenia polityki zdrowotnej (część

druga), Przegląd Epidemiologiczny,67,4, (2013), s. 735-739.

22. Jakab Z., Tsouros A.D., Zdrowie 2020 – zdrowie i rozwój współczesnej Europy, Przegląd

Epidemiologiczny, 69,1, (2015), s. 105-112.

23. Leowski J., Polityka zdrowotna Polityka zdrowotna – aktualne aspekty międzynarodowe,

[w:] Karski J. B. (red.), Promocja zdrowia, Ignis, Warszawa 1999, s. 42.

24. Denys A., Marmura C., Zagrożenia dla zdrowia związane z rozwojem współczesnej

cywilizacji, [w:] Denys A., Zagrożenia zdrowia publicznego, Wolters Kluwer, Warszawa

2014, s. 25

25. Konstytucja Rzeczypospolitej Polskiej z dnia 2 kwietnia 1997. Dz.U. 2009 nr 114 poz.

946 21.10.2009

26. Szlachta J., Strategia Europa 2020 a europejska polityka po 2013 roku, Prace i Materiały

Instytutu Rozwoju Gospodarczego, Szkoła Główna Handlowa, Warszawa 2012, s.231-253.

Monika Kaczoruk, Anna Pacian, Teresa B. Kulik, Ewa Kawiak-Jawor, Paulina Kaczor-Szkodny

156

27. Sulmicka M., Strategia "Europa 2020" - postlizbońska polityka rozwoju Unii

Europejskiej, Prace i Materiały Instytutu Rozwoju Gospodarczego, Szkoła Główna

Handlowa, Warszawa 2011, s.169-190.

28. Komisja Europejska, Komunikat Komisji Europa 2020 Strategia Na Rzecz Inteligentnego

i Zrównoważonego Rozwoju Sprzyjającego Włączeniu Społecznemu, (2010).

29. Wrześniewska-Wal I., Zdrowie publiczne w regulacjach Unii Europejskiej, Postępy Nauk

Medycznych, 5, (2016), s. 322-326.

30. Borg T., Trzeci program działań w dziedzinie zdrowia promuje optymalną współpracę,

Komisja Europejska Biuletyn „Zdrowie-UE” 126 - W centrum uwagi,

http://ec.europa.eu/health/newsletter/126/focus_newsletter_pl.htm, 02.04.2018.

31. Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 9 listopada 2011 r. w sprawie

ustanowienia programu „Zdrowie na rzecz wzrostu gospodarczego”, trzeciego

wieloletniego programu działań UE w dziedzinie zdrowia na lata 2014–2020. Bruksela,

9.11.2011. [KOM(2011)709].

32. Krajowe ramy strategiczne Policy Paper dla ochrony zdrowia na lata 2014-2020,

Warszawa, (2014).

33. Mądrala A., System ochrony zdrowia w Polsce. Diagnoza i kierunki reformy, Warszawa

2013, s.8-31.

34. Zembala M., Kępowicz M., Krajowe ramy strategiczne Policy Paper dla ochrony zdrowia

na lata 2014-2020, Katowice, 4 lipca 2015 r.

35. Kulik T.B., Pacian A.: Zdrowie publiczne, PZWL, Lublin 2014, s. 3-42.

36. Nowak P.F., Chalimoniuk-Nowak M., Potencjał mediów społecznościowych w edukacji

zdrowotnej, [w:] Wolska-Amczyk A. (red.), Współczesne kierunki działań

prozdrowotnych, Wyższa Szkoła Inżynierii i Zdrowia, Warszawa 2015, s.35-45.

37. Ustawa z dnia 27 sierpnia 2004 r. o świadczeniach opieki zdrowotnej finansowanych ze

środków publicznych, Dz. U. z 2015 r., poz. 581, z późn. zm.

38. Ustawa z dnia 11 września 2015 r. o zdrowiu publicznym, Dz. U. z 2017 r. poz. 2237, 2371

39. Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 4 sierpnia 2016 r. w sprawie Narodowego

Programu Zdrowia na lata 2016-2020, Dz. U. z 2016 r. poz. 1492

40. Ustawa z dnia 8 marca 1990 r. o samorządzie gminnym, Dz. U. z 2017 r. poz. 1875, 2232,

z 2018 r. poz. 130

41. Wojewoda Lubelski, Priorytety dla Regionalnej Polityki zdrowotnej dla województwa

lubelskiego, Lublin 27.02.2017.

42. Uchwała nr 324/IX/2015 Rady Miasta Lublin z dnia 19 listopada 2015 r. w sprawie

przyjęcia Programu Zdrowie dla Lublina na lata 2016 -2020

43. Urząd Miasta Lublin, Program Zdrowie dla Lublina na lata 2016-2020 ,

https://lublin.eu/mieszkancy/zdrowie/programy-zdrowotne/program-zdrowia-dla-lublina/,

02.04.2018.

44. Najwyższa Izba Kontroli, Realizacja programów polityki zdrowotnej przez jednostki

samorządu terytorialnego, https://www.nik.gov.pl/plik/id,12140,vp,14521.pdf,

02.04.2018. 45. Cianciara D., Lewczuk-Wesołowska A., Zalewska E., Dudzik K., Piętka S., Grudziąż-

Sękowska J., Rdzany R., Trwałość samorządowych programów zdrowotnych, Hygeia Public Health, 50,1, (2015), s. 104-111.

46. Sidorowicz W., Maroszek J., Kiedik D., Analiza społeczna w polityce zdrowotnej, Uniwersyteckie wydawnictwo medyczne Vesalius, Kraków 2002, s.27-95.

47. Zalewska E., Cianciara D., Lewczuk-Wesołowska A., Dudzik K., Piętka S., Grudziąż-Sękowska J., Rdzany R., Planowanie samorządowych programów zdrowotnych .Część II. Aspekty finansowe, Hygeia Public Health, 50,1, (2015), s.90-96.

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej

na poziomie międzynarodowym, europejskim, krajowym i lokalnym

157

48. Dudzik K., Cianciara D., Zalewska E., Lewczuk-Wesołowska A., Piętka S., Grudziąż-Sękowska J., Rdzany R., Brzezińska A., Planowanie samorządowych programów zdrowotnych.Część I. Problem zdrowotny, adresaci, Hygeia Public Health, 50, 1, (2015), s.84-89.

Dokumenty strategiczne polityki zdrowotnej na poziomie międzynarodowym,

europejskim, krajowym i lokalnym

Streszczenie

Praca dotyczy analizy dotychczasowych strategii polityki zdrowotnej na poziomie międzynarodowym,

europejskim, krajowym oraz lokalnym (odnoszących się do działań podejmowanych przez województwo

lubelskie i Urząd Miasta Lublin). Geneza współcześnie realizowanej polityki zdrowotnej wynika

z postanowień przyjętych w Konstytucji Światowej Organizacji Zdrowia z 1948 roku. Podstawowym

kierunkiem w budowaniu strategii polityki zdrowotnej zarówno na poziomie międzynarodowym, euro-

pejskim, krajowym i lokalnym jest zapewnienie wszystkim ludziom, bez względu na pochodzenie

etniczne, płeć, wiek, status społeczny, możliwie najwyższego poziomu ochrony zdrowia. Wdrażając

programy zdrowotne i programy polityki zdrowotnej należy pamiętać o tym by miały charakter wieloletni

i podlegały okresowej ewaluacji. Sprzyja to bowiem wypracowaniu skutecznych metod, umożliwiających

realizację racjonalnej polityki zdrowotnej, opartej o dowody.

Słowa kluczowe: Polityka zdrowotna, Światowa Organizacja Zdrowia, Unia Europejska, Polska, Urząd

Miasta Lublin

Strategic documents of health policy at the international, European, national

and local

Abstract

The work concerns the analysis of current health policy strategies at the international, European, national

and local levels (Lublin province and Lublin City Office). The genesis of contemporary health policy

results from the provisions adopted in the Constitution of the World Health Organization from 1948. The

basic direction in building a health policy strategy on the international, European, national and local level is

to provide all people, regardless of their ethnicity, gender, age, social status, the highest possible level of

health protection. Implementtation health programs and health policy programs, it should be remembered

that they have a long-term nature and are subject to periodic evaluation. This benefit to development of

effective methods that enable the implementation of a rational, evidence-based health policy.

Keywords: Health policy, World Health Organisation, European Union, Poland, Lublin City Office.

158

Jakub Kufel1, Aleksandra Kruzel

2, Monika Krzemińska

3

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny

w syndromie Marfana

1. Wprowadzenie

Zespół Marfana (MFS – Marfan syndrome) został po raz pierwszy opisany w 1875 r.

przez amerykańskiego okulistę E. Williamsa [1]. W 1929 A. Carrau użył eponimu

„choroba Marfana” do określenia tej jednostki chorobowej [2, 3]. Dotąd posługiwano się

terminem arachnodaktylia, która oddawała fenotyp osoby cierpiącej na tę jednostkę

chorobową [4]. Klasyczny zespół Marfana występuje u około 1-2 na 100 000 osób.

Częściej chorują mężczyźni, którzy stanowią 58% osób chorych [5]. MFS to choroba

genetyczna, która spowodowana jest mutacją w genie FBN1 kodującym białko macierzy

pozakomórkowej – fibrylinę-1. Mutacja ta w 90% dziedziczy się autosomalnie

dominująco [6], natomiast w 25% przypadków może powstawać de novo [7].

Fibryliny są wielkimi glikoproteinami, które tworzą złożone struktury zewnątrz-

komórkowe zwane mikrofibrylami. Te molekuły zapewniają elastyczność i struktur-

ralne wsparcie tkanek modulując biogenezę sprężystych włókien i homeostazę oraz

regulując biodostępność i aktywność różnych czynników wzrostu, takich jak

transformujący czynnik wzrostu beta.

W genie FBN1, odpowiedzialnym za opisywany zespół, rozpoznano ponad 500

różnych mutacji. Mutacje te prowadzą do zaburzeń syntezy białek fibryny, sekrecji

w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Determinuje to degenerację elastycznej

architektury mikrofibryli, utratę homeostazy tkankowej, a następnie zniszczenie

integralności ECM [8].

2. Objawy kliniczne zespołu Marfana

Objawy występujące w opisywanym zespole są powiązane z defektem włókien

sprężystych oraz występowaniem przesadnie rozciągliwej tkanki łącznej. Zmiany te

dotyczą układu wzrokowego, układu sercowo-naczyniowego oraz układu mięśniowo-

szkieletowego [9, 10]. Głównie obejmują obszar aorty oraz ścięgien, okostnej, więzadeł

podtrzymujących soczewkę [11-14].

1 jakub.kufel@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach 2 aleksandra.kruzel@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach 3 monika.krzeminska@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM,Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

159

2.1. Układ mięśniowo-szkieletowy

Nieprawidłowo rozwijający się układ kostny w dzieciństwie u chorych z zespołem

Marfana może spowodować zmiany w objętości klatki piersiowej, co skutkuje

zmniejszeniem objętości całkowitej płuc. Skolioza, która występuje u 60% chorych

może pogłębiać się w okresach gwałtownego wzrostu. Towarzyszyć mogą temu

dolegliwości bólowe, które dotyczą trzy razy częściej osób dorosłych posiadających

MFS, niż ogółu populacji [15]. Dural ectasia (rozszerzenie opon mózgowych w dolnych

odcinkach kanału rdzenia kręgowego) stanowi charakterystyczny objaw choroby

Marfana, a zarazem kryterium diagnostyczne poza diagnostyką genetyczną [16]. W dural

ektopii charakterystyczny jest ból pleców szczególnie w odcinku lędźwiowym, ból

głowy, ból nóg, ból brzucha, zaburzenia zwieracza, w tym nietrzymanie moczu lub

zaparcia, zaburzenia chodu [17, 18]. Obserwuje się także zmniejszoną gęstość mineralną

kości, szczególnie w okolicach bioder i kręgosłupa [19-21].

2.2. Układ wzrokowy

Ektopia soczewki i krótkowzroczność to najczęstsze powikłania MFS dotyczące

układu wzrokowego [22]. Odwarstwienie siatkówki, także jest spotykane, lecz

u mniejszego odsetka pacjentów [23]. Zmiana długości gałki ocznej zwiększa ryzyko

odklejenia siatkówki jak i jest głównym powodem krótkowzroczności [24]. Innymi

objawami mogą być: spłaszczona rogówka, niedorozwój tęczówki, niedorozwój mięśni

rzęskowych [25]. Stwierdza się także większe ryzyko wystąpienia zaćmy niż

w normalnej populacji [26].

2.3. Układ oddechowy

Lejkowata klatka piersiowa występująca u około 65% pacjentów cierpiących na

zespół Marfana stanowi problem w operacjach kardiochirurgicznych [27, 28]. Gdy

klatka piersiowa jest zniekształcona w znacznym stopniu może utrudniać wentylację

płuc. Zmniejszenie pojemności życiowej oraz całkowitej płuc może wynikać

z nadmiernego rozrostu kości długich kończyn dolnych [29].

Samoistne nawracające epizody odmy opłucnowej dotyczą zaledwie 4-15%

chorych na zespół Marfana [30].

Obturacyjny bezdech senny osób z MFS dotyczy tylko dorosłych i jest związany

z nieprawidłową strukturą twarzoczaszki [31].

2.4. Układ sercowo-naczyniowy

Najczęstszymi powikłaniami, które dotyczą układu sercowo-naczyniowego są:

niedomykalność i wypadanie płatka zastawki aortalnej, poszerzenie tętnicy płucnej,

niewydolność serca, przerost lewej komory serca. Przyczyną zgonów w tej chorobie

jest rozrost korzenia aorty (u około 70% osób z tym zespołem), który ujawnia się

przeciętnie około 30 roku życia. Rozwarstwienie aorty powoduje niedomykalność

zastawki aortalnej, utratę perfuzji rozgałęzień lub/i pęknięcie osierdzia [32]. Ryzyko

zgonu spowodowanego tym powikłaniem wzrasta gdy średnica aorty mierzona na

poziomie zatoki Valsalvy jest większa niż 5 cm [33, 34], gdy poszerzenie korzenia

aorty występuje w wywiadzie rodzinnym oraz rozrost przekracza 1,5 cm w przeciągu

roku [35-37].

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

160

3. Metody leczenia rozwarstwienia aorty

W przypadku zespołu Marfana typowym sposobem diagnostyki i monitorowania

pacjentów jest regularna echokardiografia i pomiar rozmiaru korzenia aorty.

Stworzono normogram – opracowany na podstawie pomiarów korzenia aorty osób

z zespołem Marfana, tej samej płci i wzrostu [38]. Wyniki badań dostarczają informacji

o kondycji i rozmiarze aorty pacjentów. Gdy poszerzenie aorty według wytycznych

przekracza normatywną wartość, lub obserwuje się rozrost korzenia, który budzi

obawy, włącza się terapię mającą na celu zapobieganie rozrostowi. Wybór metody

zależy od szybkości rozrostu, który stwierdza się porównując poprzednie badania

z aktualnymi wynikami. Biorąc pod uwagę fakt, że rozrost korzenia aorty jest

zagrożeniem życia wybiera się najbardziej optymalną metodę leczenia spośród

wszystkich możliwych.

3.1. Leczenie farmakologiczne rozwarstwienia aorty

Blokada receptorów β-adrenergicznych opóźniająca lub zapobiegająca tętniakowi

aorty jest obecnie uważana za standard opieki nad pacjentami z zaburzeniem. Po raz

pierwszy zaproponował ten sposób leczenia w 1971 roku Halpern i jego współ-

pracownicy [39]. Uzasadnieniem tej strategii leczenia jest przede wszystkim

zmniejszenie naprężenia proksymalnego odcinka aorty lub zmiana ciśnienia w czasie

(dP/dT). β-blokery są prawdopodobnie korzystne zarówno poprzez negatywne efekty

inotropowe jak i negatywne efekty chronotropowe. Większość opublikowanych badań

wykazało korzyści z leczenia β-adrenolitykami w zespole Marfana, w tym również

dzieci. [40, 41].

3.2. Leczenie chirurgiczne rozwarstwienia aorty

Gdy aorta przekracza wartość krytyczną (średnica powyżej 4,5 cm, bez uwzględ-

nienia miejsca dokonania pomiaru) zawartą w normogramie, stosuje się prewencyjną

wymianę całej aorty wstępującej z jednoczesną wymianą zastawki [42].

Leczenie operacyjne polega na całkowitej wymianie korzenia aorty wraz

z zastawką (TRR – Total Root Replacement) lub wymianie bez konieczności usuwania

zastawki (VSRR – Valve-Sparing Root Replacement). TRR jest stosowana, gdy płatki

zastawki są nieprawidłowe od urodzenia. Najbardziej trwałym rozwiązaniem jest TRR

z wykorzystaniem zastawki mechanicznej lub biologicznej zastawki pochodzenia

świńskiego. Operacje oszczędzające zastawki są korzystniejsze dla pacjenta.

Techniczny sukces zabiegów jest zazwyczaj osiągnięty, a ryzyko śródoperacyjne jest

zminimalizowane.

Pierwszą metodą stosowaną w operacyjnym leczeniu niedomykalności zastawki

aortalnych była metoda Bentalla opisana po raz pierwszy w 1968 roku przez

brytyjskich kardiochirurgów. Polega ona na zastąpieniu wadliwej zastawki protezą

typu mechanicznego wraz z częścią aorty wstępującej i ponowną implantacją ujść

wieńcowych [43]. Modyfikacją tej metody jest operacja sposobem Davida, która

umożliwia zachowanie płatków zastawki aortalnej. Jest to wycięcie tętniakowatej

części aorty wstępującej i zatok Valsalvy ale pozostawienie płatków zastawki aortalnej

i pewnej części ściany tętniczej w pobliżu lewej komory. Zastawka aortalna jest

ponownie umieszczona wewnątrz zaimpregnowanego kolagenem przeszczepu

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

161

wykonanego z Dacronu. Tętnice wieńcowe są również ponownie wszczepione [44].

Wadą tego zabiegu jest brak zatok Valsalvy, a także wspomniana wcześniej koniecz-

ność przymocowania zastawek wewnątrz protezy. Udoskonaleniem wcześniejszych

metod było wprowadzenie przez Yacouba remodelingu opuszki i aorty wstępującej [45].

Wadą leczenia chirurgicznego jest dożywotnie stosowanie leków antykoagula-

cyjnych. Konieczne jest to celem zminimalizowania ryzyka niepowodzenia zabiegu

w wyniku powstania zakrzepu w miejscu implantacji jak i innych chorób zakrzepowych

spowodowanych zabiegiem. Długoterminowa terapia antykoagulacyjna zmniejsza

niebezpieczeństwo powstania powikłań zakrzepowo-zatorowych oraz śmiertelność

związaną z chorobami układu sercowo-naczyniowego. Im wcześniej rozpoczęta tym

prawdopodobieństwo powikłań po zabiegu zmniejsza się. Według danych European

Society of Cardiology (ESC) dotyczących postępowania z chorymi po operacjach

zastawek serca, leczenie doustnymi antykoagulantami zaleca się [46]:

do końca życia u wszystkich chorych z zastawkami mechanicznymi;

do końca życia u chorych z protezami biologicznymi lub po zabiegach napraw-

czych zastawki mitralnej, których dotyczą inne wskazania do takiego leczenia, na

przykład migotanie przedsionków (AF - atrial fibrillation), niewydolność serca

i upośledzona funkcja lewej komory (frakcja wyrzutowa < 30%);

przez pierwsze 3 miesiące u wszystkich chorych z protezami biologicznymi lub

po zabiegach naprawczych zastawki mitralnej obejmujących plastykę pierścienia

zastawki.

Alternatywną metodą leczenia operacyjnego poszerzenia korzenia aorty jest

Spersonalizowany Zewnętrzny Stent Aortalny (PEARS - Personalised External Aortic

Root Support) [47].

4. Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny

Spersonalizowany stent zewnętrzny aorty jest innowacyjną i alternatywą do

operacji tradycyjnych metodą leczenia chorych z patologicznym rozrostem

i rozwarstwieniem korzenia aorty.

Celem pracy jest przedstawienie tego rozwiązania wraz z jego zaletami i wadami,

zestawienie dotychczas uzyskanych wyników i analiz oraz ocena jego zastosowania.

Ponadto dokonano przeglądu poszczególnych przypadków. W artykule zostały zebrane

informacje z najbardziej aktualnych publikacji.

Pomysł PEARS został po raz pierwszy przedstawiony na spotkaniu członków

Marfan Association w 2000 roku przez inżyniera cierpiącego na tę chorobę. Stent

został bardzo precyzyjnie przygotowany we współpracy z prof. Robertem Andersonem

z Institute of Child Health oraz inżynierami z Imperial College w Londynie. W 2004

roku dokonano pierwszej implantacji u wynalazcy Tala Golesworthy. Rozrost jego

aorty został skutecznie ograniczony, co zostało potwierdzane badaniami radio-

logicznymi [48].

Do 6 listopada 2018 r. zoperowano 172 pacjentów (122 mężczyzn i 50 kobiet)

stosując PEARS. Największy odsetek operowanych osób to pacjenci znajdujący się

w przedziale wiekowym 20-30 lat, wykres 1 [49].

Dokładny wymiar aorty pacjenta jest pozyskiwany na podstawie obrazów

rezonansu magnetycznego wykorzystując sekwencję MRI typu Half-Fourier (typowe

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

162

obrazowanie, czas echa: 1,3 ms, rozmiar piksela: 1,5 mm × 2,0 mm, grubość cięcia

warstw 5-6 mm) (rys. 1). Następnie obraz jest przetwarzany przy użyciu odpowiednich

programów komputerowych w celu stworzenia rekonstrukcji 3D aorty pacjenta.

Obejmuje on obszar od ujścia komory do wyjścia pnia ramienno-głowowego.

Współrzędne X, Y i Z rekonstruowanej aorty są eksportowane do maszyny szybkiego

prototypowania i model aorty pacjenta jest tworzony z materiału termoplastycznego.

Na podstawie modelu wytwarzany jest właściwy stent zewnętrzny wykonany z siatki

polimerowej o zastosowaniu medycznym [50].

Wykres 1. Rozkład wieku pacjentów zoperowanych z wykorzystaniem PEARS do 6 listopada 2018 r.

Opracowanie własne na postawie [49]

Rysunek 1. Projektowanie stentu na podstawie wymiarów aorty uzyskanych drogą rezonansu magnetycznego

w przekroju strzałkowym [47, 50]

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

163

Rysunek 2. Modele korzenia aorty i aorty wstępującej pacjentów zakwalifikowanych do leczenia PEARS [47]

Rozrost korzenia aorty jest inny w każdym przypadku (rys. 2), dlatego

modelowanie CAD i podejście indywidualne jest istotne podczas projektowania

PEARS. W tym tkwi wyższość nad innymi metodami operacyjnymi w których stosuje

się owijanie aorty ad hoc bez wcześniejszego uzyskania stentu [47].

4.1. Technika implantacji PEARS

Głównym wymaganiem do wykonania implantacji jest, aby operujący chirurg znał

szczegółową anatomię chirurgiczną obszaru aorty i powinien dysponować wiedzą

specjalistyczną dotyczącą tego typu zabiegów. Zaleca się, aby chirurg asystował przy

co najmniej jednej operacji i prowadził taką operację pod nadzorem wyszkolonego

specjalisty.

Celem operacji jest umieszczenie stentu wokół aorty od połączenia aortowo-

komorowego do tętnicy ramienno-głowowej z umożliwieniem przejścia tętnic

wieńcowych przez siatkę. Dostęp uzyskuje się za pomocą sternotomii. Pozaustrojowe

krążenie sercowo-płucne nie jest konieczne, ale jest wykorzystywane w sytuacjach

awaryjnych. Było stosowane u pierwszego pacjenta oraz u kolejnego z krótką lewą

główną tętnicą wieńcową. Aorta jest chirurgicznie wypreparowana od połączenia

aortalno-komorowego do miejsca powstawania tętnicy ramienno-głowowej z dysekcją

tętnic wieńcowych. Kontrola ciśnienia tętniczego jest szczególnie istotna.

Gotowy wysterylizowany stent, dostarczany do chirurga występuje na własnej

formie. Wsparcie zewnętrzne aorty składa się z miękkiej tkaniny o porach około 0,7

mm. Po dokładnym potwierdzeniu orientacji zaznacza się położenie wyjścia tętnic

wieńcowych i wykonuje się serię małych promieniowych nacięć w gwiazdkowym

wzorze. Implant posiada pionowy przedni szew, który jest rozcinany w celu

implantacji wokół aorty. Dodatkowo wykonywane są cięcia poprzeczne odchodzące od

szwu pionowego do otworów na tętnice wieńcowe. Powstające w ten sposób frag-

menty są umieszczane poniżej tętnic. Następnie zaszywa się nacięcia na siatce rozcią-

gające się do otworów na tętnice wieńcowe, dolna krawędź jest przymocowywana do

połączenia aortowo-komorowego i zaszywany przedni szew [51].

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

164

4.2. Okres pooperacyjny

Potwierdzone zostało, że termoplastyczna siatka wykorzystywana jako materiał

w PEARS wrasta w ścianę zewnętrzną aorty, co uwidoczniły badania histologiczne

wycinków pobranych podczas jednej z reoperacji [52]. Udowodniono także, iż tkanka

łączna wbudowywuje się w porowate elementy siatki po około pięciomiesięcznym

okresie pooperacyjnym [53].

Zewnętrzny stent wzmacnia ścianę aorty, w pełni integrując się. PEARS dąży do

osiągnięcia korzyści uzyskiwanych w VSRR, ale jako procedura nieablacyjna może

być oferowana wcześniej. Ponieważ implant zachowuje wielkość i konfigurację

korzenia aorty, optymalizuje szansę na utrzymanie funkcji zastawki aortalnej [54].

Wykonywane są również wstępne analizy biomechaniczne dotyczące efektów po

wszczepieniu PEARS. Prześledzono przypadki trzech pacjentów (pacjent 1, 2, 3)

porównując parametry przed i po implantacji zewnętrznego stentu. Zestawiono wyniki

ciśnienia tętniczego, średnicę korzenia aorty oraz aorty wstępującej (tab.1). W badaniu

wykorzystano połączenie obrazowania i modelowania komputerowego. Symulacje

metodą elementów skończonych przeprowadzono przy użyciu specyficznych dla

pacjenta geometrii i ciśnień (przed i po implantacji). Przeanalizowane zostały rozkłady

naprężeń i przemieszczeń w celu oceny wpływu obecności zewnętrznego stentu na

właściwości biomechaniczne aorty.

Wyniki wykazały, że zastosowanie PEARS zmniejszyło przemieszczenia i rozkład

naprężeń w korzeniu aorty (szczególnie jeśli chodzi o zatoki Valsalvy). Zwiększyło się

natomiast naprężenie na styku pomiędzy miejscem, które jest podpierane przez stent

i miejscem nie objętym podparciem – jedną z największych obaw związanych

z wszczepiania PEARS jest powstawanie obszarów wysokiego napięcia w nie podtrzy-

mywanej części aorty.

Po rekonstrukcji zaobserwowano również niewielkie różnice w kształcie i orientacji

aorty (rys. 3). Zróżnicowanie ściany aorty od implantu było trudne, a nawet prawie

niemożliwe ze względu na integrację stentu w ścianie. Materiał wykorzystany

w PEARS jest 2,6 razy sztywniejszy niż ściana aortalna w zespole Marfana. Jest to

również materiał mniej sztywny niż zwykle stosowany materiał wykorzystywany

w metodzie Bentalla. PEARS jest też zaprojektowane w taki sposób, aby wytrzymałość

obręczy tulei była największa na połączeniu aortalno-komorowym i stopniowo

zmniejszała się w kierunku łuku aorty. Badania wykazały, że integracja PEARS

spowodowała zmniejszenie przemieszczenia ściany o 63%, 68% i 62% u badanych

pacjentów i niezależnie od tego w rejonie zatoki Valsalvy oraz dookoła nich.

Zmniejszenie przemieszczenia ściany odpowiadało jednocześnie przesunięciu

przemieszczania maksymalnego w kierunku dystalnym do łuku aorty do granicy

pomiędzy miejscem ustabilizowanym i nieustabilizowanym. Maksymalna wartość tego

przemieszczenia była jednak mniejsza niż maksymalna wartość przemieszczenia przed

wszczepieniem PEARS.

Po integracji PEARS ze ścianą aorty, zmniejszyły się naprężenia w zatokach,

podczas gdy naprężenie szczytowe zostało przesunięte do łuku aorty, szczególnie na

granicy obszaru ustabilizowanego i nieustabilizowanego, z odpowiadającymi im

wzrostami odpowiednio o 183%, 156% i 89% dla pacjentów 1, 2 i 3. Ten wysoce

ogniskowy wzrost naprężenia ściany może prowadzić do dalszego osłabienia ściany

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

165

w tych miejscach. Niemniej jednak, naprężenia szczytowe występujące we wszystkich

przedstawionych tutaj modelach były znacznie poniżej wytrzymałości na rozciąganie

dla rozszerzonych aort wstępujących.

Istotne jest jednak przeprowadzenie dalszych badań, aby wyniki uzyskały wartość

statystyczną i kliniczną [55].

Tabela 1. Zestawienie danych u porównywanych pacjentów

Ciśnienie tętnicze krwi (mmHg): Pacjent 1 Pacjent 2 Pacjent 3

przed po przed po przed po

skurczowe 135 130 110 110 118 110

rozkurczowe 78 70 60 60 84 70

Tętno 57 60 50 50 34 40

Średnica korzenia aorty (mm) 37,0 38,7 39,4 39,7 39,3 39,2

Aorta wstępująca (mm) 22,7 22,9 29,3 27,0 29,0 27,0

Źródło: Opracowanie własne na podstawie [55]

Rysunek 3. Powierzchnia wewnętrzna łuku aorty zrekonstruowana na podstawie MRI przed implantacją

PEARS (strona lewa) i po implantacji PEARS (strona prawa) trzech pacjentów (a,b,c) [55]

4.3. PEARS a inne techniki chirurgiczne

W 2014 roku Tom, Treasure i in. przedstawili przedoperacyjną charakterystykę

i pooperacyjne wyniki pacjentów (n=30) u których zastosowano PEARS w porównaniu

z pacjentami leczonymi za pomocą TRR (n=972) i VSRR (n=413). Wzięte do analizy

wyniki dwóch ostatnich grup pochodziły z publikacji Benedetto [56]. U pacjentów,

u których zastosowano PEARS, zarówno średnia wieku jak i średnica korzenia aorty

była niższa. Nie występowało u nich rozwarstwienie aorty ani przed ani po operacji.

Metaanaliza opublikowanych wyników dotyczących zastąpienia korzenia aorty

wykazała, że ryzyko zdarzenia związanego z zastawkami (choroba zakrzepowo-

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

166

zatorowa, zapalenie wsierdzia, reoperacja zastawki aortalnej) u pacjentów z TRR

wynosiła 1,3%, dla VSRR 1,9%. Na szczególną uwagę zasługuje wskaźnik

reinterwencjii w VSRR wynoszący 1,3% . W PEARS nie obserwowano powyższych

problemów (tab. 2.).

Efekt rozszerzenia aorty poza granicą wsparcia jest mniej prawdopodobny przy

użyciu PEARS. Dzieje się tak, ponieważ siła obręczy wzdłuż stentu zmniejsza się,

natomiast w TRR i VSRR występuje zespolenie pozostałej części aorty z graftem.

Zestawienie tych trzech grup pacjentów ma pewne ograniczenia, gdyż niektórych

czynników nie można ze sobą porównywać (np. niektórzy pacjenci u których

wykonano TRR nie są kandydatami do PEARS). Pozwala ono jednak zauważyć iż

stosowanie PEARS niesie ze sobą znaczne korzyści.

Techniczne intencje PEARS mogą zostać osiągnięte – stabilizuje on rozmiar

i kształt korzenia aorty i zatok. Eliminuje się: użycie krążenia pozaustrojowego,

zatrzymanie krążenia i serca. Ponadto czas operacyjny i pobyt w szpitalu są

proporcjonalnie zmniejszone.

Jednak żadna operacja korzenia aorty nie eliminuje wszystkich zagrożeń i to ogólny

wynik jest miarą skuteczności [57].

Tabela 2. Porównanie PEARS z TRR i VSRR

PEARS TRR VSRR

Charakterystyka przedoperacyjna:

średni wiek (lata) 31 35 33

średnia średnica korzenia aorty przedoperacyjnie

(mm) 46,2 61 52

odsetek pacjentów z rozwarstwieniem - 0,30 0,18

Wyniki pooperacyjne:

wczesna śmiertelność (%) - 4,1 3,2

reoperacja zastawki aorty (%/rok) - 0,3 1,3

zdarzenie zakrzepowo – zatorowe (%/rok) - 0,7 0,3

zapalenie wsierdzia (%/rok) - 0,3 0,2

Zdarzenia związane z zastawką (%/rok) - 1,3 1,9

Źródło: Opracowanie własne na podstawie [57]

4.4. Inne zastosowanie PEARS

Jak przedstawia raport z dnia 6 listopada 2018 większość pacjentów u których

zastosowano stent (119 pacjentów) cierpiało na zespół Marfana. Ponadto prezento-

wany implant znalazł również zastosowanie w następujących przypadkach [49]:

dwupłatkowa zastawka aortalna (12 pacjentów);

choroby zastawki aortalnej – procedura Rossa (11 pacjentów włączenie z 2

osobami z zespołem Turnera);

zespół Loeysa-Dietza (7 pacjentów);

tetralogia Fallota (1 pacjent);

transpozycja dużych tętnic (2 pacjentów);

przyczyny idiopatyczne (15 pacjentów);

mutacja w genie ACTA2 (1 pacjent).

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

167

5. Podsumowanie

Spersonalizowany Zewnętrzny Stent Aortalny znalazł zastosowanie w chorobach,

w których rozrost aorty stanowi poważne zagrożenie życia. Najczęściej wykorzys-

tywany jest jednak w rozroście korzenia aorty w przebiegu choroby Marfana. Po

dotychczas stosowanych metodach operacyjnych (np. TRR i VSRR) w leczeniu tego

typu defektów konieczne było stosowanie leków antykoagulacyjnych do końca życia,

wykorzystanie krążenia pozaustrojowego oraz niekiedy usunięcie części aorty lub/i

zastawki aortalnej. Operacje z wykorzystaniem PEARS eliminują wszystkie wyżej

wymienione utrudnienia podczas i po zabiegu. Zastosowanie tej metody zmniejsza

więc ryzyko chorób zakrzepowo-zatorowych oraz ryzyko związane z zastosowaniem

krążenia pozaustrojowego podczas samego zabiegu.

Jedną z najważniejszych zalet PEARS jest jego indywidualizm. Implant zostaje

specyficznie dopasowany do anatomii każdego pacjenta na podstawie dokładnych

badań obrazowych i późniejszych analiz komputerowych. Jest to możliwe dzięki

spójnej pracy lekarzy i inżynierów.

Dzięki użyciu specjalnego, porowatego materiału możliwe jest połączenie graftu

z ścianą naczynia. Już po około 5 miesiącach odróżnienie stentu od tkanki było bardzo

trudne. Integracja ta wzmacnia aortę i zmniejsza ryzyko pęknięcia aorty, co stanowi

największe ryzyko u chorych z zespołem Marfana. Właściwości te powodują

opóźnienie postępu choroby, co może wydłużyć ich życie.

PEARS może być także stosowany w leczeniu pacjentów m.in. z dwupłatkową

zastawką aortalną czy z chorobami tej zastawki. Rozwiązanie to daje nam zupełnie

nowe spojrzenie na możliwości wykorzystania stentów zewnętrznych.

Zastosowanie PEARS ma wiele zalet, posiada jednak pewne wady. Jest to nowa

metoda, która nadal wymaga badań, by móc określić efekty długoterminowe. Nie

prowadzi ona do wyleczenia pacjenta, ponieważ jest to leczenie objawowe. Zmniejsza

wprawdzie ryzyko ciągłego rozrostu aorty przez co niweluje związane z tym

powikłania, ale powoduje zmiany w naprężeniach i przemieszczeniu maksymalnym

części aorty znajdującej się poza graftem. Aby być poddanym implantacji trzeba

spełniać pewne kryteria, dlatego nie każdy pacjent może zostać poddany operacji. Jest

to leczenie osób we wczesnych stadium zmian naczyniowych w chorobie Marfana.

Literatura

1. Williams E., Rare Cases, with Practical Remarks, Transactions of the American

Ophthalmologic A. B., Marfan: his life and times. Europ J Pediat, 155, (1996), s.725-726.

2. Carrau A., Sur la dolichostenomelie: maladie de Marfan, Le Nourrisson, 17, (1929), s.82-92.

3. Achard A., Arachnodactylie. Bull Mem Soc MMd H6p, Paris 1902.

4. Chiu H. H., Wu M. H., Chen H. C., Kao F. Y. i Huang S. K., Epidemiological profile of

Marfan syndrome in a general population: a national database study, Mayo Clinic

proceedings (89) (1), (2014), s. 34-42.

5. Xiao Y., Liu X., Guo X., Liu L., Jiang L., Wang Q. i Gong B., A novel FBN1 mutation

causes autosomal dominant Marfan syndrome, Molecular medicine reports (16) (5) 2017,

s. 7321-7328.

6. Hendren N. S., Rao S. i Mody P., Acute onset heart failure due to Marfan syndrome,

CRIM (3) (4), (2016), s. 78.

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

168

7. Grewal N., Gittenberger-de Groot A. C., Pathogenesis of aortic wall complications in

Marfan syndrome, Cardiovascular Pathology 33, (2018), s. 62-69.

8. Beighton P., de Paepe A., Danks D., Finidori G., Gedde-Dahl T., Goodman R., Hall J. G.,

Hollister D. W., Horton W. i McKusick V. A., International Nosology of Heritable

Disorders of Connective Tissue, Berlin, 1986, American journal of medical genetics (29)

(3), (1988), s. 581-594.

9. Takeda N., Yagi H., Hara H., Fujiwara T., Fujita D., Nawata K., Pathophysiology and

management of cardiovascular manifestationsin Marfan and Loeys-Dietz syndromes, Int

Heart J, (2016), 57:271-7.

10. Wypasek E., Potaczek D. P., Hydzik M., Stapor R., Raczkowska-Muraszko M., Weiss J.,

Maugeri A. i Undas A., Detection and a functional characterization of the novel FBN1

intronic mutation underlying Marfan syndrome: case presentation, Clinical chemistry and

laboratory medicine (56) (4), (2018), s. 87-91.

11. Dietz H. C. i in., Mutations in the human gene for fibrillin-1 (FBN1) in the Marfan

syndrome and related disorders, Human Molecular Genetics, 4, 1995.

12. Dietz H. C., Cutting R. H., Pyeritz R. E., Maslen C. L., Sakai L. Y., Corson G. M., i wsp.,

Marfan syndrome caused by a recurrent de novo missense mutation in the fibrillin gene,

Nature 352 (6333), (1991), s. 337-339.

13. Loeys B., de Backe J., van Acker P., Wettinck K., Pals G., Nuytinck L. i wsp.,

Comprehensive molecular screening of the FBN1 gene favors locus homogeneity of

classical Marfan syndrome, Human mutation 24 (2), (2004), s. 140-146.

14. Pyeritz R. E., Francke U., The second international symposium on the Marfan syndrome,

Am J Med Genet, (1993), 47: 127–135.

15. Altman A., Uliel L., Caspi L., Dural ectasia as presenting symptom of Marfan syndrome,

The Israel Medical Association journal, IMAJ 10 (3), (2008), s. 194–195.

16. Nallamshetty L., Nicholas U. A., Uri M. A., Nallamshetty S. H., Rose P. S. Buchowski J.

M., Sponseller P. D., Dural ectasia and back pain: review of the literature and case

report, Journal of spinal disorders & techniques 15 (4), (2002), s. 326–329.

17. Ahn N. U., Sponseller P. D., Ahn U. M., Nallamshetty L., Kuszyk B. S. i Zinreich S.,

Dural ectasia is associated with back pain in Marfan syndrome, Spine (25) (12), (2000),

s. 1562-1568.

18. Le Parc J. M., Molcard S. i Tubach F., Bone mineral density in Marfan syndrome,

Rheumatology (Oxford, England) (40) (3), (2001), s. 358-359.

19. Giampietro P. F., Peterson M., Schneider R., Davis J. G., Raggio C., Myers E. i wsp.,

Assessment of bone mineral density in adults and children with Marfan syndrome,

Osteoporosis international: a journal established as result of cooperation between the

European Foundation for Osteoporosis and the National Osteoporosis Foundation of the

USA 14 (7), (2003), s. 559-563.

20. Giampietro P. F., Peterson M. G. E., Schneider R., Davis J. G., Burke S. W., Boachie-

Adjei O. i wsp., Bone mineral density determinations by dual-energy x-ray absorptiometry

in the management of patients with Marfan syndrome--some factors which affect the

measurement, HSS journal: the musculoskeletal journal of Hospital for Special Surgery 3

(1), (2007), s. 89-92.

21. Maumenee I. H., The eye in the Marfan syndrome, Transactions of the American

Ophthalmological Society (79), (1981), s. 684-733.

22. Chandra A., Ekwalla V., Child A., Charteris D., Prevalence of ectopia lentis and retinal

detachment in Marfan syndrome. Acta ophthalmologica 92 (1), (2014).

23. Pyeritz R. E., McKusick V. A., The Marfan syndrome: diagnosis and management, The

New England journal of medicine 300 (14), (1979), s. 772-777.

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

169

24. Judge D. P., Dietz H. C., Marfan's syndrome, The Lancet 366 (9501), (2005), s. 1965-

1976.

25. Sandvik G. F., Vanem T. T., Rand-Hendriksen S., Cholidis S., Saethre M. i Drolsum L.,

Ten-year reinvestigation of ocular manifestations in Marfan syndrome, Clinical &

experimental ophthalmology, (2018).

26. Yeung J. C., Marcuzzi D., Peterson M. D., Ko M. A., Management of severe asymmetric

pectus excavatum complicating aortic repair in a patient with Marfan's syndrome,

Interactive cardiovascular and thoracic surgery 22 (5), (2016), s. 674-675.

27. Nisanoglu V., Battaloglu B., Erdil N., Ozgur B., Kuzucu A., Surgical approach for

Stanford type A aortic dissection in a patient with Marfan syndrome and pectus

excavatum, Texas Heart Institute journal 34 (2), (2007), s. 240-243.

28. Streeten E. A., Murphy E. A., Pyeritz R. E., Pulmonary function in the Marfan syndrome,

Chest 91 (3), (1987), s. 408-412.

29. Wood J. R., Bellamy D., Child A. H., Citron K. M., Pulmonary disease in patients with

Marfan syndrome, Thorax 39 (10), (1984), s. 780-784.

30. Cistulli P. A., Gotsopoulos H. i Sullivan C. E., Relationship between craniofacial

abnormalities and sleep-disordered breathing in Marfan's syndrome, Chest (120) (5),

(2001), s. 1455-1460.

31. Pepper J., John Chan K., Gavino J., Golesworthy T., Mohiaddin R. i Treasure T., External

aortic root support for Marfan syndrome: early clinical results in the first 20 recipients

with a bespoke implant, Journal of the Royal Society of Medicine (103) (9), (2010),

s. 370-375.

32. Roman M. J., Rosen S. E., Kramer-Fox R. i Devereux R. B., Prognostic significance of the

pattern of aortic root dilation in the Marfan syndrome, Journal of the American College of

Cardiology (22) (5), (1993), s. 1470-1476.

33. Cistulli P. A., Gotsopoulos H. i Sullivan C. E., Relationship between craniofacial

abnormalities and sleep-disordered breathing in Marfan's syndrome, Chest (120) (5),

(2001), s. 1455-1460.

34. Shores J., Berger K. R., Murphy E. A. i Pyeritz R. E., Progression of aortic dilatation and

the benefit of long-term beta-adrenergic blockade in Marfan's syndrome, The New

England journal of medicine (330) (19), (1994), s. 1335-1341.

35. Groenink M., Lohuis T. A.,Tijssen J. G., Naeff M. S., Hennekam R. C., van der Wall E. E.

i Mulder B. J., Survival and complication free survival in Marfan's syndrome: implications

of current guidelines, Heart (British Cardiac Society) (82) (4), (1999), s. 499-504.

36. Meijboom L. J., Timmermans J., Zwinderman A. H., Engelfriet P. M. i Mulder B. J. M.,

Aortic root growth in men and women with the Marfan's syndrome, The American journal

of cardiology (96) (10), (2005), s. 1441-1444.

37. Takeda N., Yagi H., Hara H., Fujiwara T., Fujita D., Nawata K., Inuzuka R., Taniguchi Y.,

Harada M., Toko H., Akazawa H. i Komuro I., Pathophysiology and Management of

Cardiovascular Manifestations in Marfan and Loeys-Dietz Syndromes, International heart

journal (57) (3), (2016), s. 271-277.

38. Halpern B. L., Char F., Murdoch J. L., Horton W. B. i McKusick V. A., A prospectus on

the prevention of aortic rupture in the Marfan syndrome with data on survivorship without

treatment, The Johns Hopkins medical journal (129) (3), (1971), s. 123-129.

39. Salim M. A., Alpert B. S., Ward J. C. i Pyeritz R. E., Effect of beta-adrenergic blockade

on aortic root rate of dilation in the Marfan syndrome, The American journal of

cardiology (74) (6), (1994), s. 629-633. 40. Rossi-Foulkes R., Roman M. J., Rosen S. E., Kramer-Fox R., Ehlers K. H., O'Loughlin J.

E., Davis J. G. i Devereux R. B., Phenotypic features and impact of beta blocker or

Jakub Kufel, Aleksandra Kruzel, Monika Krzemińska

170

calcium antagonist therapy on aortic lumen size in the Marfan syndrome, The American journal of cardiology (83) (9), (1999), s. 1364-1368.

41. Rimington H. i in., “Echokardiografia. Praktyczny podręcznik wykonywania i opisywania badania”, Wydawnictwo Czelej, 2011.

42. Bentall H. i de Bono A., A technique for complete replacement of the ascending aorta, Thorax (23) (4), (1968), s. 338-339.

43. David T. E., Feindel C. M., An aortic valve-sparing operation for patients with aortic incompetence and aneurysm of the ascending aorta, The Journal of thoracic and cardiovascular surgery (103) (4), (1992), 617-21.

44. Kuśmierski K., Brzozowski P., Kołsut P., Operacje naprawcze zastawki aortalnej, Kardiologia w Praktyce kwartalnik dla lekarzy praktyków (4), (2010).

45. Kuligowska-Jakubowska M., Neubauer-Geryk J., Bieniaszewski L., Leczenie przeciwzakrzepowe u pacjentów po zabiegach kardiochirurgicznych, Choroby Serca i Naczyń czasopismo lekarzy praktyków, (2010).

46. Pepper J., Petrou M., Rega F., Rosendahl U., Golesworthy T. i Treasure T., Implantation of an individually computer-designed and manufactured external support for the Marfan aortic root, Multimedia manual of cardiothoracic surgery MMCTS, (2013).

47. Treasure T., Pepper J., Personalised External Aortic Root Support (PEARS) Compared with Alternatives for People with Life-Threatening Genetically Determined Aneurysms of the Aortic Root, Diseases (3) (1), (2015), s. 2-14.

48. Golesworthy T., ExoVasc® Personalised External Aortic Root Support (PEARS). Project Status – 6 November 2018, Patient Numbers & Demographics, 2018.

49. Campbell M., Fabricated future: The sceptic's guide to 3D printing, New Scientist (2895), (2012), s. 46-9.

50. Pepper J., Golesworthy T., Utley M., Chan J., Ganeshalingam S., Lamperth M., Mohiaddin R. i Treasure T., Manufacturing and placing a bespoke support for the Marfan aortic root: description of the method and technical results and status at one year for the first ten patients, Interactive cardiovascular and thoracic surgery (10) (3), (2010), s. 360-365.

51. Cohen O., Odim J., de La Zerda D., Ukatu C., Vyas R., Vyas N., Palatnik K. i Laks H., Long-term experience of girdling the ascending aorta with Dacron mesh as definitive treatment for aneurysmal dilation, The Annals of thoracic surgery (83) (2), (2007), s. 780-4.

52. Verbrugghe P., Verbeken E., Pepper J., Treasure T., Meyns B., Meuris B., Herijgers B. I Rega F., External aortic root support: a histological and mechanical study in sheep, Interactive cardiovascular and thoracic surgery (17) (2), (2013), s. 334-339.

53. Pepper J., Goddard M., Mohiaddin R. i Treasure T., Histology of a Marfan aorta 4.5 years after personalized external aortic root support, European journal of cardio-thoracic surgery official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery (48) (3), (2015), s. 502-505.

54. Singh S. D., Xu X. Y., Pepper J., Treasure T. i Mohiaddin R. H., Biomechanical properties of the Marfan's aortic root and ascending aorta before and after personalised external aortic root support surgery, Medical engineering & physics (37) (8), (2015), s. 759-766.

55. Benedetto U., Melina G., Takkenberg J. J. M., Roscitano A., Angeloni E. i Sinatra R., Surgical management of aortic root disease in Marfan syndrome: a systematic review and meta-analysis, Heart (British Cardiac Society) (97) (12), (2011), s. 955-958.

56. Treasure T., Takkenberg J. J. M., Golesworthy T., Rega F., Petrou M., Rosendahl U., Mohiaddin R., Rubens M., Thornton W., Lees B. i Pepper J., Personalised external aortic root support (PEARS) in Marfan syndrome: analysis of 1-9 year outcomes by intention-to-treat in a cohort of the first 30 consecutive patients to receive a novel tissue and valve-conserving procedure, compared with the published results of aortic root replacement, Heart (British Cardiac Society) (100) (12), (2014), s. 969-975.

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

171

Spersonalizowany zewnętrzny stent aortalny w syndromie Marfana

Streszczenie

Spersonalizowany stent zewnętrzny aorty (ang. Personalised External Aortic Root Support – PEARS) jest

innowacyjną, alternatywną metodą leczenia chorych z patologicznym rozrostem i rozwarstwieniem

opuszki aorty, które może doprowadzić do śmierci. Schorzenie to najczęściej występuje w zespole Marfana

– chorobie uwarunkowanej genetycznie, która spowodowana jest mutacją genu FBN1 zlokalizowanego na

ramieniu długim chromosomu 15. Obecnie powszechnie stosowaną metodą terapii jest operacyjna

wymiana tej części naczynia. Przy zastosowaniu metod komputerowych, na podstawie obrazów

powstałych po wykonaniu rezonansu magnetycznego serca, zaprojektowano i stworzono osobisty

zewnętrzny stent aorty. Prototyp 3D jest wykonywany w odpowiednim programie komputerowym (np.

CAD). Przy produkcji stentu używa się siatki polimerów o medycznym zastosowaniu. Sięga on od

korzenia aorty do dalszego końca wyjścia pnia ramienno-głowowego. Technika ta niesie niskie ryzyko

i oszczędza zarówno zastawki jak i biologiczny styk krew - śródbłonek aorty. Ponadto podczas operacji nie

jest stosowane krążenie pozaustrojowe, co zmniejsza ryzyko komplikacji. Dzięki tej metodzie zostaje

zmniejszona liczba reoperacji kardiologicznych oraz eliminowana jest konieczność przyjmowania leków

przeciwzakrzepowych. Rozwiązanie to niestety wymaga udoskonalenia. Newralgicznym problemem jest

dokładne ustalenie położenia tętnic wieńcowych. Błędne określenie lokalizacji tych naczyń przysparza

często problemów okołooperacyjnych. W literaturze stwierdza się, że PEAR nie jest doskonałą metodą

leczenia, lecz skutecznie zapobiega dalszemu rozrostowi aorty. Po dalszych modyfikacjach można jednak

wiązać z nią wielkie nadzieje.

Słowa kluczowe: syndrom Marfana, stent, aorta, PEARS

Personalised External Aortic Root Support in Marfan syndrome

Abstract

Personalised External Aortic Root Support (PEARS) is an innovative, alternative method of treatment for

patients with pathological growth and dissections of aortic root, which could result in death. Nowadays

a commonly used therapeutic method is replacing these vessels surgically. This disorder is mainly present

in the Marfan syndrome – a genetically determined disease, which is caused by a mutation of the FBN1

gene located on the long arm of chromosome 15. Nowadays a commonly used therapeutic method is

replacing these vessels surgically. Using computer methods a personal external aortic stent was designed

and created based on the heart magnetic resonance images. Medical polymer mesh is used in the

production of the stent. It covers the aorta from the aortic root to the distal end of the brachiocephalic trunk

ostium. This technique brings low risk and saves both valves and biological contact blood – membrane of

the aorta. In addition, during the operation the extracorporeal circulation is not used, which reduces the risk

of complications. Thanks to this method the number of cardiac reoperations is reduced and it eliminates the

need to take anticoagulant. Unfortunately the solution must be improved. The main problem is the accurate

positioning of the coronary arteries. The incorrect identification of the location of these vessels often

causes perioperative problems. The scientific articles say that PEAR is not perfect method of treatment but

successfully prevents further proliferation of the aorta. However, further modification can make this

method very hopeful.

Keywords: Marfan syndrome, stent, aorta, PEARS

172

Jakub Kufel1, Jakub Kret

2, Patrycja Kozik

3, Maciej Szydziak

4

Telemedycyna

– przegląd zastosowania w wybranych krajach

1. Wprowadzenie

Celem pracy jest przegląd wykorzystania i rozwoju telemedycyny na przestrzeni lat

w wybranych krajach oraz regionach świata. W ostatnich latach nastąpił ogromny

wzrost liczby pacjentów korzystających z tej gałęzi medycyny na całym świecie

(wykres 1). Największy odsetek stanowiły wirtualne wizyty (e-wizyty). Lucas Mearin

z Computerworld donosi, że e-wizyty stanowiły 75 milionów spośród 600 milionów

wizyt lekarskich w USA i Kanadzie w samym 2013 roku. Większość z tych usług nie

przyjmuje formy spotkania “twarzą w twarz”, tak jak wizyty prowadzone za pomocą

telemedycyny zwykło się wyobrażać. Są to jednak inne typy komunikacji między

pacjentem, lekarzem czy innym personelem medycznym. Stosuje się tutaj proste

rozwiązania typu wiadomości głosowe lub wideo, które najpierw są zapisywane na

urządzeniu (komputerze, smartfonie) pacjenta, a dopiero później są wysyłane na

urządzenie odbiorcze lekarza lub innej osoby, z którą chce skontaktować się pacjent.

Rozmowy telefoniczne wspomagane informacjami przekazywanymi jednocześnie

online także stanowią wysoki odsetek usług szerokiego wachlarza możliwości, które

oferuje telemedycyna [1].

Amerykańskie Stowarzyszenie Medycyny (ATA) precyzyjnie definiuje termin

telemedycyny, według ATA jest to: „wykorzystywanie informacji medycznych

wymienianych między witrynami za pośrednictwem komunikacji elektronicznej w celu

poprawy klinicznego stanu zdrowia pacjenta” [2]. Używanie połączenia telekomuni-

kacyjnego, e-maila, wiadomości SMS czy innych aktualnie powszechnie używanych

narzędzi można byłoby zdefiniować jako telemedycyna. A co za tym idzie śmiało

powiedzieć, że telemedycyna, w najprostszej formie stosowana jest aktualnie

codziennie w każdym nawet najmniejszym szpitalu czy przychodni.

1 jakub.kufel@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach 2 jakub.kret@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze Biofizyki

ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w

Katowicach 3 patrycja.kozik@med.sum.edu.plStudenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach 4 maciej.szydziak@med.sum.edu.pl, Studenckie Koło Naukowe im. Prof. Zbigniewa Religi przy Katedrze

Biofizyki ŚUM, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach

173

Opis: Logarytmiczny wzrost liczby pacjentów korzystających z usług telemedycyny w latach 2012 -2018 [1]

Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS) definiuje telemedycynę nieco

inaczej: „świadczenie usług klinicznych pacjentom przez praktyków z dystansu za

pośrednictwem komunikacji elektronicznej”, jednak CMS precyzuje definicję do

„dwukierunkowej interaktywnej komunikacji w czasie rzeczywistym. Między

pacjentem, a lekarzem na odległej stronie z wykorzystaniem interaktywnego sprzętu

telekomunikacyjnego, który obejmuje, co najmniej, sprzęt audio i wideo” [3]. Ta

definicja zawęża możliwość nazywania telemedycyną komunikacji za pomocą SMS,

e-maila czy innych asynchronicznych form komunikowania się z pacjentem. Standar-

dowe połączenie telefoniczne zgodnie z zaznaczeniem w definicji sformułowanej przez

CMS użycie co najmniej „audio i wideo”, także zostało wykluczone z usług, które

mogą być nazywane telemedycyną.

2. Aspekty etyczne telemedycyny

Telemedycyna ma zarówno swoich zwolenników jak i przeciwników. Ci pierwsi

podnoszą następujące argumenty takie jak: otwieranie nowych kanałów dostępu do

opieki zdrowotnej i oferowanie nowej możliwości opieki skoncentrowanej na

pacjencie [4-7]. Przeciwnicy krytykują to rozwiązanie będąc bardziej ostrożni w tej

dziedzinie. Wyrażają zaniepokojenie dotyczące poufności, prywatności, ograniczeń

technologicznych, możliwych zaburzenień prowadzonej czynności co przyniesie

nieoczekiwane skutki [8-11].

Obowiązek prywatności i poufności pozyskanych informacji od pacjenta

w telemedycynie jest tak samo ważny jak w tradycyjnym lecznictwie ambulatoryjnym

czy szpitalnym.

Komunikacja między pacjentem a lekarzem z wykorzystaniem telemedycyny

wymaga większej ingerencji i obecności osób trzecich w porównaniu do tradycyjnych

spotkań „twarzą w twarz”. Wiąże się to głównie z obecnością usługodawców, którzy

pełnią nadzór nad techniczną częścią przedsięwzięcia, czasami także ich partnerów

biznesowych [7].

Jakub Kufel, Jakub Kret, Patrycja Kozik, Maciej Szydziak

174

3. Telemedycyna nie dla każdego

To czy telemedycyna jest odpowiednia dla pacjenta zależy od tego, jaki dostęp do

opieki zdrowotnej ma potencjalna osoba zainteresowana tą formą usług. Niektórzy

pacjenci w danych sytuacjach nie mogą uzyskać opieki osobiście. Gdy istnieje

możliwość uzyskania opieki zdrowotnej nad pacjentem za pomocą telemedycyny,

w takich sytuacjach, mimo iż wskazane są badania diagnostyczne, lekarskie (badanie

fizykalne), lepszym rozwiązaniem będzie skorzystanie z telemedycyny. Wówczas taka

osoba zostanie objęta jakąkolwiek opieką.

Telemedycyna nie będzie odpowiednim narzędziem dla każdego pacjenta i każdej

jednostki chorobowej [8]. Po pierwsze pacjent musi dysponować odpowiednim

zapleczem technologicznym wystarczającym do korzystania z takich usług. Musi

istnieć odpowiedni specjalista z danej dziedziny, który jest w stanie współpracować

w taki sposób z pacjentem, by swoją wiedzą i doświadczeniem mógł mu pomóc oraz

jest przeszkolony do pracowania z urządzeniami zapewniającymi łączność [12].

Telemedycyna nie jest wskazana w przypadkach, gdzie istotny jest fizyczny kontakt

pacjenta z lekarzem, musi zostać przeprowadzone badanie wymagające bezpośred-

niego kontaktu (np. badanie fizykalne). Mówiąc inaczej, telemedycyna nie jest

wskazana w przypadkach, gdy technologia nie pozwala na spełnienie ustalonych

kryteriów i standardów klinicznych w leczeniu i diagnostyce.

4. Zastosowanie telemedycyny – przykłady

Prowadzenie leczenia pacjentów przewlekle chorych, z długim wywiadem,

rozpoznaną chorobą, znaną historią nie zawsze wymaga przeprowadzania badania

fizykalnego. Siegel donosi, iż zastosowanie telemedycyny u pacjentów gastroentero-

logicznych w zakresie telemonitorowania, teleedukacji, telekonsultacji i teleopieki

przyczynia się do zmniejszenia kosztów leczenia jak i poprawie opieki zdrowotnej tych

pacjentów [13].

Telemedycyna znalazła także zastosowanie w terapii i leczeniu uzależnień.

Największą zaletą zastosowania tego narzędzia w tym przypadku jest zniesienie

bariery w postaci czasu i odległości. Oferuje duży potencjał w zakresie poprawy

leczenia i powrotu do zdrowia osób uzależnionych od różnych substancji (w tym

narkotyków, alkoholu). Zapewnia także większy kontakt lekarza z pacjentem w trakcie

trwania terapii jak i po niej [14].

Szybka diagnostyka w zakresie chorób sercowo-naczyniowych zagrażających życiu

u dzieci w szczególności wykorzystanie takich technologii jak: teleechokardiografia

noworodkowa i płodowa, programy pulsoksymetryczne, zdalny monitoring elektro-

fizjologiczny stanowi potencjalne drogi rozwoju dla telemedycyny w pediatrii. Według

American Heart Association telekonsultacje, monitorowanie zdalne także z domu

pacjenta oraz wykorzystanie telemedycyny w intensywnej terapii noworodków także

są ważnym aspektem leczenia, które może przyczynić się do rozwoju tej dziedziny

medycyny [15].

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach

175

5. Telemedycyna w Chinach

W Chinach telemedycynę stosuje się w celu umożliwienia konsultacji i wsparcia

placówek o wyższej referencyjności z szpitalami wiejskimi, gdzie brakuje specjalistów.

W latach 2002-2013 w rejonie Syczuan (zachodnie Chiny) wdrożono projekt, który

obejmował swoim zasięgiem 249 małych szpitali, które mieściły się w 120 wsiach lub

mniejszych miastach z wysoko wyspecjalizowanymi szpitalami miejskimi koncen-

trując się na 40 specjalizacjach. W ciągu tego okresu przeprowadzono 11 987

telekonsultacji, głównie poświęconych diagnozie onkologicznej, chorobom układu

sercowo-naczyniowego oraz urazom. W raporcie opisującym projekt autorzy wskazują

na skuteczność telemedycyny w tych przypadkach: 39,8% diagnoz zostało zmienio-

nych po telekonsultacji a 55% oryginalnych terapii zostało zmodyfikowanych po

telekonsultacji. Autorzy także zaznaczają, iż projekt przyniósł 2,3 miliona USD

oszczędności dla pacjentów (zdiagnozowani pacjenci w mniejszych szpitalach nie

musieli być transportowani do ośrodków o wyższej referencyjności) [16].

5.1. Telemedycyna w Afryce

Znaczna część populacji żyjącej w regionie Subsaharyjskim Afryki jest dotkniętych

HIV/AIDS (około 70% spośród 40 milionów ludzi na całym świecie cierpiących na tę

chorobę żyje w tym regionie Afryki). Malaria stanowi także poważny problem na tym

obszarze. Zabija ponad 1 milion dzieci rocznie. Stosunek lekarza do liczby miesz-

kańców wynosi od 1:5000 do 1:30 000, podczas gdy w krajach rozwiniętych typowy

stosunek wynosi 1:300.

Główne projekty w regionie Subsaharyjskim Afryki dotyczyły: transmisji obrazu do

czterech głównych szpitali w Senegalu; planowania konsultacji i kierowania do

specjalistów w Etiopii; udostępniania literatury dotyczącej infekcji cholery w Zambii;

zapewnienia miejscowym lekarzom w Ghanie edukacji w zakresie leczenia malarii ze

szpitali w Londynie, Wielkiej Brytanii i Genewie, Szwajcarii; zapewnienia pacjentom

w Kongu zdalnej pomocy w diagnozowaniu, leczeniu i obserwacji przez lekarzy

szpitala Luigi Sacco w Mediolanie we Włoszech oraz wymianę dokumentacji

medycznej i zdjęć między dwoma głównymi szpitalami w Mozambiku za pomocą

bezpośredniego krótkofalowego łącza naziemnego ustanowionego przez ITU

(International Telecommunication Union) w 1998 r [17].

5.2. Telemedycyna w Egipcie

W Egipcie w latach 2002-2012 przeprowadzono kilka projektów telemedycznych,

które zajmowały się: diagnozą istotnych patologii (międzyszkolny projekt telekon-

sultacyjny utworzony w 2002 r. między włoskim szpitalem Umberto I w Kairze

a szpitalem ARNAS-Civic w Palermo we Włoszech, uwzględniający zarówno obrazy

biomedyczne, jak i sygnały EKG dla drugiej usługi opiniotwórczej, zarówno w czasie

rzeczywistym oraz w trybie offline); zapobieganiem i leczeniem powszechnie

panujących chorób w krajach uczestniczących w tym projekcie, w tym w Egipcie,

Etiopii, Jordanii, Libii, Mali, Maroku, Sudanie, Tunezji i Ugandzie w 2006 r.; Egyptian

Telemedicine Network (ETN), zapewnia egipskiej ludności szereg usług medycznych,

w tym teleradiologię, elektroniczny stetoskop, telepatologię i EKG; poprawę usług

opieki zdrowotnej dla dzieci, poprzez zapewnienie telekonsultacji oprócz kształcenia

Jakub Kufel, Jakub Kret, Patrycja Kozik, Maciej Szydziak

176

zawodowego przez całe życie lekarzy za pośrednictwem technik e-learningowych

w 2009 r.; usługi telekonsultacyjne w zakresie diagnozowania i leczenia chorób

zakaźnych, takich jak zapalenie wątroby, w regionach o słabym dostępie do medycyny

w Egipcie w 2009 r.; projektem Pan Africa zapewniający usługi telekonferencyjne

poprzez przeprowadzanie wideokonferencji między organizacjami opieki zdrowotnej

w Aleksandrii (Egipt) i 12 szpitalami w Indiach w 2009 roku.; projekt jednostki

mobilnej dla kobiet w służbie zdrowia w 2007 r., służący do oglądania kobiet powyżej

45 lat za pomocą stacjonarnych i mobilnych urządzeń do obrazowania mammo-

graficznego; Egipt krajowy PACS w 2010 r., ustanawiający scentralizowany system

archiwizacji i komunikacji obrazu (PACS) obejmujący sześć głównych szpitali

w Egipcie [18].

5.3. Telemedycyna na Pacyfiku i Mikronezji

Na Wyspach Pacyfiku i Mikronezji pierwsze telemedyczne narzędzia wprowa-

dzono już w 1996 roku. Dotyczyły one wyłącznie edukacji medycznej. Od tamtego

czasu nie donoszono o innych projektach w tym zakresie medycyny. Można to

tłumaczyć bardzo niskim PKB oraz jeszcze niższym procentem przeznaczanym na

opiekę zdrowotną [19].

5.4. Telemedycyna w Amazonii

Amazonia w Peru to obszar dwa razy większy od Belgii, pokryty jest wioskami,

w których liczba mieszkańców często nie przekracza 100 osób. Brak w tym obszarze

linii telefonicznej jak i dróg gruntowych. Jedyny transport zapewniony jest drogą

rzeczną. Główny projekt telemedyczny rozpoczął się w 2001 roku, kiedy to

postanowiono połączyć 39 obiektów służby zdrowia na tym terenie drogą e-mailową

z szpitalem w Limie. Połączenia te oparte są na kanałach radiowych VHF i znacznie

pomogły w skróceniu czasu ewakuacji pacjenta (średnia wartość 8,6 godziny do nawet

5,2 godziny). Całkowite koszty tego projektu są ograniczone. Główne wydatki

spożytkowane są na energię elektryczną oraz konserwację i naprawę już istniejących

urządzeń radiowych [20].

5.5. Telemedycyna w Szwajcarii

W Szwajcarii głównym dostarczycielem usług telemedycznych jest firma Medgate,

która zatrudniała w 2017 roku około 100 lekarzy. Ponad 900 000 pacjentów otrzymało

pomoc z udziałem telemedycyny w roku 2016. Według Gossler i Klauser połowę

pacjentów da się leczyć za pomocą telemedycyny, w pozostałych przypadkach kieruje

się dalej w celu postawienia diagnozy, wdrożenia leczenia, którego nie da się zapewnić

za pomocą tego narzędzia. Telemedycyna ma zatem na celu ograniczanie kosztów

leczenia. Autorzy podkreślają, iż odpowiednio skonstruowane procesy, oparte na

dowodach wytyczne medyczne, jak i również regularne kontrole jakości są niezbędne

w celu zapewniania wysokiej jakości usług. W Szwajcarii dla wielu osób teleme-

dycyna jest pierwszym miejscem, do którego się zwracają, odgrywa więc ona rolę

analogiczną do lekarza rodzinnego. Podkreśla się, że to rozwiązanie jest już w tym

państwie niezbędne od kilku lat [21].

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach

177

5.6. Telemedycyna w USA

Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych definiuje telezdrowie jako „wykorzystanie elektronicznych technologii informacyjnych i telekomunikacyjnych do wspierania i promowania opieki medycznej na odległość, edukacji zdrowotnej, zdrowia publicznego i administracji” [21]. Według danych pozyskanych przez firmę Medicaid, wśród 45233602 pacjentów w latach 2008-2009 ok 1% korzystało z świadczeń telemedycznych. 16,4% z nich stanowiła grupa wiekowa 45-64 lat. Większość stanowili ludzie rasy białej, głównie mężczyźni, zamieszkujący tereny wiejskie. Około 28,1% to ludzie w podeszłym wieku, niepełno-sprawni bądź niewidomi. 95% zarejestrowanych przypadków dotyczyło zaburzeń behawioralnych, takich jak afektywna choroba dwubiegunowa, czy nadpobudliwość psychoruchowa. W latach od 2003 do 2010 wzrosła liczba placówek wykorzystujących telemedycynę w wypadku oddziałów intensywnej terapii (OIT) z 16 (0,4% ogółu) do 213 (4,6% ogółu). Liczba łóżek na OIT objętych telemedycyną wzrosła z 598 (0,9% ogółu) do 5 799 (7,9 % całości) [23]. Pacjenci preferują kontakt z własnym lekarzem w zakresie świadczeń telemedycyny (52% ankietowanych), co odpowiada zaleceniom American College of Physicians [24]. Wzrasta zainteresowanie wykorzystaniem technik telemedycznych w placówkach pediatrycznych czy okulistyce [21, 14]. Wprowadza się także tą gałąź technologiczną w przypadku leczenia uzależnień, dając wielki potencjał w zakresie poprawy leczenia i powrotu do zdrowia zwiększenie kontaktu z uzależnionym pacjentem podczas i po leczeniu [26].

6. Telemedycyna morska

Mimo że używane rozwiązania telemedycyny różnią się pomiędzy rodzajami statków (handlowe, pasażerskie) to od dwudziestego wieku jest znormalizowana na całym świecie przez kilka krajów i organizacji międzynarodowych. Standardy pomiędzy typami statków wynikają z faktu, iż na pokładach statków pasażerskich obecni są zarówno lekarze okrętowi, jak i pasażerowie posiadający kwalifikacje medyczne. Telemedical Maritime Assistance Service (TMAS) jest obecnie jednym z nich, jest podstawowym elementem świadczenia pomocy medycznej na morzu i jest uznawany przez Organizację Narodów Zjednoczonych za pośrednictwem Międzyna-rodowej Organizacji Morskiej w ramach standardowych procedur ratowniczych [22]. Telemedycyna morska w porównaniu z lądową rozwija się znacznie wolniej. Istnieje dużo różnic w funkcjonowaniu tych dwóch narzędzi stosowanych w medycynie między innymi dlatego że stosuje się ją do innych celów. Zazwyczaj na morzu znajduje zastosowanie w sytuacjach awaryjnych, natomiast interwencje telemedyczne na lądzie są planowane z wyprzedzeniem. Należy nadmienić, że nagłe wypadki są obsługiwane w inny sposób na statkach handlowych i pasażerskich z uwagi na obecność wyszkolonego personelu medycznego. Drugą i najważniejszą zarazem różnicą pomiędzy telemedycyną morską a lądową jest transfer danych, który utrudniony jest w warunkach morskich, ponieważ zasięg oraz przepustowość może być ograniczona. Trzecią różnicą jest fakt, iż komunikacja na lądzie za pomocą dostępnych narzędzi odbywa się pomiędzy lekarzami czy innymi wykształconym personelem (w sytuacjach kryzysowych). Natomiast na morzu kontaktują się ze sobą marynarze, którzy nie zawsze mają przeszkolenie medyczne (znów pojawia się wyjątek związany z załogą na statkach pasażerskich) [23].

Jakub Kufel, Jakub Kret, Patrycja Kozik, Maciej Szydziak

178

7. Telemedycyna w stomatologii

Smartfony stosowane powszechnie w telemedycynie, mogą także być wykorzys-

tywane w telestomatologii. Pomimo, że za pomocą dokonywanych przez nie fotografii,

nie jesteśmy w stanie wykryć początkowych jak i średnio zaawansowanych zmian

próchniczych, lecz jak najbardziej jest możliwe rozróżnić zdrowe powierzchnie

zębowe od rozległych zmian próchniczych. Obecnie zaleca się używanie aparatu

z wymiennymi obiektywami jako źródło w wyższym stopniu dokładniejsze oraz

wiarygodne. Problem stanowią jednak jego rozmiar i koszt [27]. Zastosowanie takiej

fotografii przyczyniłoby się do znacznej poprawy w edukacji dentystycznej i analizie

przypadków, ponieważ umożliwiłoby omawianie sytuacji klinicznych na odległość

poprzez dzielenie się wynikami badań z profesjonalistami w różnych lokalizacjach

[28]. Warto także zwrócić uwagę na możliwość archiwizacji zdjęć jamy ustnej oraz ich

bezproblemowy transfer pomiędzy pacjentem zamieszkałym w daleko położonych

rejonach a stomatologiem. Połączenie programów teledetekcyjnych i szkolnych

programów stomatologicznych może być bardzo korzystnym krokiem do polepszenia

opieki zdrowotnej najmłodszych [29]. W tym celu można zastosować kamerę

wewnątrzustną jako przyrząd służący do przeprowadzenia badań przesiewowych. Poza

próchnicą, może posłużyć do oceny kamienia nazębnego, plam nazębnych, zużycia

zębów i fluorozy dentystycznej. Może być ponadto przydatny w ocenie innych

schorzeń, takich jak zmiany przednowotworowe, nawracające afty, recesja dziąseł

i wad zgryzu. Oprócz tego możliwe jest przeprowadzenie konsultacji w czasie

rzeczywistym [30].

8. Podsumowanie

Telemedycyna jest stosunkowo nowym narzędziem stosowanym w medycynie.

Połączenie telekomunikacji, informatyki i innych technicznych dziedzin nauki pomaga

w komunikacji, łączności pomiędzy jednostkami leczniczymi czy w końcu w samym

leczeniu. W Chinach telemedycynę stosuje się w celu umożliwienia konsultacji

i wsparcia placówek o wyższej referencyjności z szpitalami wiejskimi, gdzie brakuje

specjalistów. W Afryce została masowo wykorzystana do prowadzenia zdalnych

szkoleń dla lekarzy. Egyptian Telemedicine Network (ETN), zapewnia egipskiej

ludności takie usługi jak teleradiologia, elektroniczny stetoskop, telepatologia i EKG.

Dzięki tej dziedzinie poprawiła się także jakość świadczeń zdrowotnych dla

najmłodszych. Także techniki e-learningowe i usługi telekonferencyjne, zyskały tutaj

na znaczeniu. W Szwajcarii, gdzie telemedycyna stoi na wysokim poziomie, stała się

ona nieodzownym elementem lecznictwa. W przyszłości taka sytuacja może mieć

miejsce w innych regionach świata, na przykład w Amazonii, czy Mikronezji. Wiązać

się z tym będzie rozwój nauk i technologii wspomagających medycynę. W USA

telemedycyna zyskała na znaczeniu na oddziałach intensywnej terapii, w psychiatrii,

pediatrii oraz okulistyce. Rozwój telemedycyny umożliwił wymianę informacji

pozwalającą na wzrost jakości usług medycznych na całym świecie.

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach

179

Literatura

1. Voran D., Telemedicine and beyond, Missouri medicine, (2), (2015), s. 129-135.

2. About Telemedicine - ATA Main, http://www.americantelemed.org/main/about/about-

telemedicine [udostępniono: 27.12.2018].

3. Telemedicine, Medicaid.gov,

https://www.medicaid.gov/medicaid/benefits/telemed/index.html [udostępniono:

27.12.2018].

4. Health Online 2013, http://www.pewinternet.org/2013/01/15/health-online-2013/

[udostępniono: 27.12.2018].

5. Uscher-Pines L. i Mehrotra A., Analysis of Teladoc use seems to indicate expanded access

to care for patients without prior connection to a provider, Health affairs (Project Hope),

(2), (2014), s. 258–264.

6. Agha Z., Schapira R. M., Laud P. W., McNutt G. i Roter D. L., Patient satisfaction with

physician-patient communication during telemedicine, Telemedicine journal and e-health

the official journal of the American Telemedicine Association, (9), (2009), s. 830-839.

7. Ackerman M. J., Filart R., Burgess L. P., Lee I. i Poropatich R. K., Developing next-

generation telehealth tools and technologies: patients, systems, and data perspectives,

Telemedicine journal and e-health the official journal of the American Telemedicine

Association, (1), (2010), s. 93-95.

8. Miller T. E. i Derse A. R., Between Strangers: The Practice Of Medicine Online, Health

Affairs, (4), (2002), s. 168-179.

9. Hall J. L. i McGraw D., For telehealth to succeed, privacy and security risks must be

identified and addressed, Health affairs (Project Hope), (2), (2014), s. 216-221.

10. Cotet A. M. i Benjamin D. K., Medical regulation and health outcomes: the effect of the

physician examination requirement, Health economics, (4), (2013), s. 393-409.

11. Miller E. A., The technical and interpersonal aspects of telemedicine: effects on doctor-

patient communication, Journal of telemedicine and telecare, (1), (2003), s. 1-7.

12. Brennan D., Tindall L., Theodoros D., Brown J., Campbell M., Christiana D., Smith D.,

Cason J. i Lee A., A blueprint for telerehabilitation guidelines, International journal of

telerehabilitation, (2), (2010), s. 31-34.

13. Siegel C. A., Transforming Gastroenterology Care With Telemedicine, Gastroenterology,

(5), (2017), s. 958-963.

14. Molfenter T., Boyle M., Holloway D. i Zwick J., Trends in telemedicine use in addiction

treatment, Addiction Science & Clinical Practice, (2015).

15. Satou G. M., Rheuban K., Alverson D., Lewin M., Mahnke C., Marcin J., Martin G. R.,

Mazur L. S., Sahn D. J., Shah S., Tuckson R., Webb C. L. i Sable C. A., Telemedicine in

Pediatric Cardiology: A Scientific Statement From the American Heart Association,

Circulation, (11), (2017).

16. Wang T.-T., Li J.-M., Zhu C.-R., Hong Z., An D.-M., Yang H.-Y., Ren J.-C., Zou X.-M.,

Huang C., Chi X.-S., Chen J.-N., Wang W.-Z., Xu C.-G., He L., Li W.-M. i Zhou D.,

Assessment of Utilization and Cost-Effectiveness of Telemedicine Program in Western

Regions of China: A 12-Year Study of 249 Hospitals Across 112 Cities, Telemedicine

journal and e-health the official journal of the American Telemedicine Association, (11),

(2016), s. 909-920.

17. Meso P., Mbarika V. W. A. i Sood S. P., An Overview of Potential Factors for Effective

Telemedicine Transfer to Sub-Saharan Africa, IEEE transactions on information

technology in biomedicine a publication of the IEEE Engineering in Medicine and Biology

Society, (5), (2009), s. 734-739.

Jakub Kufel, Jakub Kret, Patrycja Kozik, Maciej Szydziak

180

18. Hussein R, Khalifa A. Telemedicine in Egypt: SWOT analysis and future trends. GMS

Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie 2012; 8(1): 1-16.

19. Norton S. A., Floro C., Bice S. D., Dever G., Mukaida L. i Scott J. C., Telemedicine in

Micronesia, Telemedicine journal the official journal of the American Telemedicine

Association, (3), (1996), s. 225-231.

20. Martínez A., Villarroel V., Seoane J. i del Pozo F., A study of a rural telemedicine system

in the Amazon region of Peru, Journal of telemedicine and telecare, (4), (2004), s. 219-225.

21. Sasangohar F., Davis E., Kash B. A. i Shah S. R., Remote Patient Monitoring and

Telemedicine in Neonatal and Pediatric Settings: Scoping Literature Review, Journal of

medical Internet research, (12), (2018), e295.

22. Douglas M. D., Xu J., Heggs A., Wrenn G., Mack D. H. i Rust G., Assessing Telemedicine

Utilization by Using Medicaid Claims Data, Psychiatric services (Washington, D.C.), (2),

(2017), s. 173-178.

23. Kahn J. M., Cicero B. D., Wallace D. J. i Iwashyna T. J., Adoption of ICU telemedicine in

the United States, Critical care medicine, (2), (2014), s. 362-368.

24. Welch B. M., Harvey J., O'Connell N. S. i McElligott J. T., Patient preferences for direct-

to-consumer telemedicine services: a nationwide survey, BMC health services research,

(1), (2017), s. 784.

25. Rathi S., Tsui E., Mehta N., Zahid S. i Schuman J. S., The Current State of

Teleophthalmology in the United States, Ophthalmology, (12), (2017), s. 1729-1734.

26. Ahmad I., Digital dental photography. Part 4: choosing a camera, British dental journal,

(11), (2009), s. 575-581.

27. Kohara E. K., Abdala C. G., Novaes T. F., Braga M. M., Haddad A. E. i Mendes F. M., Is

it feasible to use smartphone images to perform telediagnosis of different stages of

occlusal caries lesions?, PloS one, (9), (2018), e0202116.

28. T S., Anandan V. i Apathsakayan R., Use of a Teledentistry-based Program for Screening

of Early Childhood Caries in a School Setting, Cureus, (7), (2017), e1416.

29. Pentapati K. C., Mishra P., Damania M., Narayanan S., Sachdeva G. i Bhalla G.,

Reliability of intra-oral camera using teledentistry in screening of oral diseases - Pilot

study, The Saudi dental journal, (2), (2017), s. 74-77.

Telemedycyna – przykłady zastosowanie w wybranych krajach

Streszczenie

W ostatnich latach telemedycyna zyskuje coraz większy udział w opiece zdrowotnej. Największą liczbę

usług stanowią wirtualne wizyty. Są to w większości formy komunikacji takie jak nagrania głosowe

i wideo przesyłane pomiędzy pacjentem a personelem medycznym. Stwierdza się, że wykorzystywana jest

obecnie prawie w każdej placówce zdrowotnej. Telemedycyna budzi wiele nadziei, ale też obaw. Niesie

nowe możliwości opieki zdrowotnej i pomocy, ale też większe ryzyko wycieku poufnych danych. Ta

metoda nie może być wykorzystana do przypadków, w którym niezbędny jest fizyczny kontakt lekarza

z pacjentem. Zarówno pacjent jak i lekarz muszą dysponować odpowiednim komunikacyjnym zapleczem

technicznym, aby mogło dojść do konsultacji. Jako przykładowe zastosowanie telemedycyny można

przytoczyć leczenie pacjentów przewlekle chorych z długim wywiadem, w terapii i leczeniu uzależnień

oraz w szybkiej diagnostyce chorób sercowo-naczyniowych u dzieci. W Chinach umożliwiono konsultacje

pomiędzy szpitalami wiejskimi a ośrodkami wyższej referencyjności. W Regionie Subsaharyjskim

umożliwiła dokształcanie miejscowych lekarzy oraz zdalne konsultowanie pacjentów. Projekty w Egipcie,

które zajmowały się diagnozą różnych patologii oraz usługami opiniotwórczymi. 39 obiektów służby

zdrowia w Peru zostało połączonych z głównym szpitalem w Limie co skróciło znacznie czas oczekiwania

pacjenta na konsultację u specjalisty. Szwajcaria z kolei jest krajem, w którym e-wizyta zastąpiła wizytę

u lekarza rodzinnego. W USA następuje dynamiczny rozwój tej gałęzi medycyny, której wykorzystanie

rozszerza się na coraz nowsze dziedziny medycyny. Na morzu w stosunku do lądu jej rozwój jest

ograniczony z powodu przyczyn technicznych i braku stałego dostępu do przeszkolonego personelu.

Telemedycyna – przegląd zastosowania w wybranych krajach

181

W stomatologii umożliwia zdalną ocenę ogólnego stanu zębów. Telemedycyna jest stosunkowo nowym

działem medycyny, który jednak dynamicznie się rozwija ze względu na duże spektrum możliwości, które

niesie za sobą jej wykorzystanie.

Słowa kluczowe: telemedycyna, telekomunikacja, informatyka, zdrowie publiczne

Telemedicine – examples of application in selected countries

Abstract

In recent years, telemedicine has been gaining more and more importance in healthcare. The largest

number of services are virtual visits. These are mostly communication forms such as voice and video

recordings sent between the patient and the medical staff. It is currently used in almost every health facility.

Telemedicine raises many hopes but also fears. It brings new opportunities for health care but also a greater

risk of confidential data leakage. This method can not be used for cases in which physician's physical

contact with the patient is necessary. Both the patient and the physician must have the appropriate technical

background of communication to carry on consultation. An example of the use of telemedicine, can be

treatment of chronically ill patients with long history, in therapy and addiction treatment and in the rapid

diagnosis of cardiovascular diseases in children. In China, it allows consultations between rural hospitals

and centers of higher reference. In the Sub-Saharan Region, it enables training of local doctors and remote

consultations of patients. Projects in Egypt dealt with the diagnosis of various pathologies and opinion-

forming services. 39 health care facilities in Peru have been connected to the main hospital in Lima, which

significantly shortened the patient's awaiting time for specialists’ consultations with. Switzerland is the

country where the e-visit replaced a visit to the family doctor. In the USA, there is a dynamic development

of this branch of medicine, the use of which is extended to new areas of medicine. At sea with respect to

land, its development is limited due to technical reasons and lack of permanent access to trained personnel.

In dentistry, it enables remote evaluation of the general condition of teeth. Telemedicine is a relatively new

branch of medicine, however, it is dynamically developing due to large spectrum of possibilities that it

provides.

Keywords: Telemedicine, Telecommunication, Computer science, Public health

182

Lidia Kościelny1, Magdalena Wilk-Frańczuk

2, Bożena Latała

3

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów

po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób

zwyrodnieniowych stawów

1. Wstęp

Prawidłowe żywienie jest jedną z najważniejszych metod profilaktyki chorób

układu sercowo-naczyniowego i choroby zwyrodnieniowej stawów. Właściwie

dobrana dieta umożliwia obniżenie stężenia lipidów, ciśnienia tętniczego krwi,

poziomu cukru we krwi. Wpływa na utrzymanie prawidłowej masy ciała, lub jej

obniżenie przy BMI >30, co ostatecznie poprawia wydolność fizyczną i przywraca

witalność. Dieta zbilansowana z obniżoną ilością nasyconych kwasów tłuszczowych

i nienasyconych kwasów tłuszczowych trans, na korzyść nienasyconych kwasów

tłuszczowych cis w sposób istotny wpływa na poziom całkowitego cholestrolu

i poszczególne frakcje lipidogramu. Wg Raportu Światowej Organizacji Zdrowia

(WHO), co rocznie umiera 16 mln ludzi na świecie, przedwcześnie z powodu chorób

układu krążenia [1].

W Polsce główną przyczyną zgonów są nadal choroby układu sercowo-

naczyniowego. Stanowią one 46% przyczyny zgonów [2]. Od kilku lat obserwuje się

powolny, ale systematyczny spadek przedwczesnych zgonów z powodu chorób układu

krążenia. Zapewne jest to wynikiem prewencyjnej opieki medycznej, ale także

budowania świadomości i odpowiedzialności za swoje zdrowie i życie. Podstępną

chorobą układu krążenia jest miażdżyca, która rozwija się przez wiele lat

bezobjawowo. Czynnikiem odpowiedzialnym za powstanie miażdżycy jest nieprawid-

łowy profil lipidowy, ze wzrostem poziomu „cichego zabójcy XXI wieku” jakim jest

frakcja LDL – lipoproteina o niskiej gęstości. Przestrzeganie należnej kaloryczności

diety (w zależności od trybu życia, wieku, płci) oraz zastosowanie zrównoważonej

diety ze zwiększeniem ilości białka roślinnego i tłuszczów roślinnych nie modyfi-

kowanych, zmniejszeniem ilości cukrów prostych obniża ryzyko wystąpienia

miażdżycy. Wykazano, że taką dietą jest dieta zbliżona do diety śródziemnomorskiej,

która zmniejsza ryzyko wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego 8 krotnie

[3]. Utrzymanie prawidłowej masy ciała, wspieranej aktywnością fizyczną stanowi

ochronę dla stawów obciążanych osiowo (głównie stawów kolanowych) oraz stawów

kręgosłupa.

1 lidia.koscielny@uj.edu.pl, Klinika Rehabilitacji, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, 30-219

Kraków, ul. Koło Strzelnicy 3. 2 magdalena.wilk-franczuk@uj.edu.pl, Klinika Rehabilitacji, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński,

30-219 Kraków, ul. Koło Strzelnicy 3. 3 bozena.latala@uj.edu.pl, Klinika Rehabilitacji, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, 30-219

Kraków, ul. Koło Strzelnicy 3.

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

183

2. Choroby związane z nieprawidłowym profilem lipidowym

Nadal statystycznie najczęstszymi chorobami układu sercowo-naczyniowego stanowiącymi zagrożenie życia są ostre incydenty wieńcowe, będące wynikiem choroby niedokrwiennej serca. Choroba niedokrwienna serca może być wynikiem działania nieprawidłowego odżywiania i przekarmiania, braku aktywności ruchowej, czego konsekwencją są ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne wywołujące obniżenie wydolności organizmu.

2.1. Miażdżyca tętnic

Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalno-fibroproliferacyjną ściany naczyń tętniczych. Indukcja powstania i progresja miażdżycy jest procesem złożonym. Czynnikami sprzyjającymi powstawaniu blaszki miażdżycowej w błonie naczynia tętniczego są między innymi podwyższony poziom lipoproteiny LDL oraz wysoki poziom homocysteiny. Początkowo dochodzi do uszkodzenia śródbłonka tętnicy przez czynniki biologiczne, chemiczne, mechaniczne. W uszkodzonym śródbłonku gromadzą się makrofagi, limfocyty T i komórki zapalne. Makrofagi gromadzą lipidy, w tym głównie lipoproteiny o niskiej gęstości i cholesterol tworząc komórki piankowate. Prowadzi to do pogrubienia wewnętrznej ściany naczynia i powstania blaszki miażdżycowej. Blaszki podlegają progresji, co ostatecznie zaburza przepływ krwi i zmniejsza utlenowanie tkanek. Zwężenie średnicy światła naczynia przez blaszkę miażdżycową o 50-60% nie upośledza przepływu spoczynkowego. Zwężenie naczynia o 80-90% upośledza przepływ spoczynkowy [4].

Zwężenie naczynia przyspiesza rozwój nadciśnienia tętniczego krwi, co stanowi czynnik sprawczy pęknięcia blaszki miażdżycowej. Wzrost stężenia homocysteiny we krwi może być wynikiem nadmiernego spożywania mięsa i jego przetworów będących źródłem metioniny. Towarzyszy temu niedobór witaminy B6, B12, oraz kwasu foliowego. Homocysteina zmniejsza elastyczność błony wewnętrznej naczynia, co przyspiesza włóknienie i kalcyfikację błony wewnętrznej. Wpływa także na zwięk-szenie zlepiania się cząsteczek LDL [5]. Stopień regresji miażdżycy jest regulowany przez transport zwrotny cholesterolu do wątroby dzięki lipoproteinom HDL. Wzrost stężenia HDL o 6% powoduje zmniejszenie śmiertelności z powodu ostrego zespołu wieńcowego o 21%. Zwiększenie frakcji HDL o 1% zmniejsza ryzyko incydentu wieńcowego o 2-3% [6].

2.2. Nadciśnienie tętnicze

Choroba nadciśnieniowa stanowi istotny czynnik ryzyka choroby wieńcowej serca. Za prawidłowe maksymalnie ciśnienie tętnicze uważa się 140/90 mmHg. Udowod-niono, że obniżenie ciśnienia o 5-6 mmHg istotnie zmniejsza ryzyko incydentu wieńcowego (w 50%), udaru mózgu (w 30-40%) [7]. Wysokie ciśnienie uszkadza śródbłonek naczynia, oraz odpowiada za pęknięcie istniejącej blaszki miażdżycowej, stanowiąc mechanizm indukcji ostrego zespołu wieńcowego. Uszkodzenie śródbłonka naczynia wiąże się z aktywacją czynników prozapalnych takich jak angiotensyna II, substancje biologicznie czynne jak białka adhezyjne, endotelina. Zwiększa to aktywność naczynioskurczową z jednoczesną dysfunkcją wazorelaksacji zależną od śródbłonkowego tlenku azotu. Z nadciśnieniem często występuje otyłość, aterogenna dyslipidemia, upośledzona tolerancja glukozy [18,19].

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

184

2.3. Choroby metaboliczne

Cukrzyca jest chorobą metaboliczną. Cukrzyca typu II występuje głównie

w krajach rozwiniętych czynnikami predysponującymi są nadwaga i otyłość. Cukrzyca

zwiększa 2-4 krotnie ryzyko chorób naczyniowych, miażdżycy [20]. Stany hipergli-

kemii prowadzą do wzrostu powikłań naczyniowych, z częstszym występowaniem

nadciśnienia tętniczego i zaburzeń lipidowych o charakterze dyslipidemii cukrzycowej.

Stan ten charakteryzuje się wzrostem stężenia trójglicerydów, spadkiem stężenia HDL,

oraz wzrostem stężenia LDL. Istotą zaburzeń w cukrzycy jest kumulowanie aterogen-

nych lipoprotein LDL, z jednoczesnym spadkiem ochronnych lipoprotein HDL. Celem

terapii w cukrzycy jest obniżenie poziomu LDL<100 mg/dl (2 mmol/l) [21].

Otyłość stanowi narastający problem w krajach wysoko rozwiniętych, jest wynikiem

zbyt małej aktywności fizycznej w stosunku do spożywanej wysokokalorycznej diety.

Otyłość charakteryzuje się zwiększeniem masy ciała u kobiet powyżej 30% prawid-

łowej masy ciała, u mężczyzn powyżej 25% prawidłowej masy ciała [22]. Popularnym

wskaźnikiem określającym masę ciała jest wskaźnik BMI (Body Mass Index). Za

wartość prawidłową przyjmuje się 18,5-24,99 kg/m2. Wartość 25-29,9 kg/m

2 jest

wynikiem nadwagi. BMI 30-34,99 kg/m2 jest wynikiem otyłości I stopnia. Otyłość II

stopnia występuje dla wartości 35-39,99 kg/m2. BMI>40 kg/m

2 oznacza skrajnie

ciężką otyłość. Innym wskaźnikiem określającym otyłość jest WHR (waist-hip-ratio),

powyżej 1 u mężczyzn i powyżej 0,85 u kobiet oznacza otyłość typu wisceralnego

(brzusznego). Otyłości brzusznej towarzyszy wzrost LDL, wzrost trójglicerydów,

spadek HDL. Dochodzi do powstania hiperinsulinemii, w której następuje wzrost

syntezy lipoproteiny zwiększającej ryzyko zakrzepowo-zatorowej [22,23]. W Polsce

wg Głównego Urzędu Statystycznego nadwaga występuje u 40,3% kobiet i 28,4%

mężczyzn. Otyłość występuje u 24% kobiet i 21% mężczyzn [8].

2.4. Mała aktywność fizyczna

Brak lub mała aktywność fizyczna zwiększa ryzyko chorób układu krążenia.

Dobroczynny wpływ wysiłku fizycznego zapobiega otyłości, wpływa korzystnie na

profil lipidowy krwi (powoduje spadek trójglicerydów, spadek LDL, wzrost HDL),

obniża ciśnienie tętnicze krwi, zwiększa aktywność części przywspółczulnej układu

wegetatywnego, co wpływa korzystnie na rytm serca. Aktywność fizyczna jest lekiem

XXI wieku w prewencji chorób układu sercowo-naczyniowego [24,25].

2.5. Choroba zwyrodnieniowa stawów

Jednym z ważnych czynników zapoczątkowujących uszkodzenie powierzchni chrzęstnej stawu jest biomechaniczny nacisk osiowy, w przebiegu nadwagi i otyłości. Dotyczy to głównie stawów kolanowych, biodrowych i kręgosłupa, a więc stawów umożliwiających samodzielne przemieszczanie się. Stwierdza się zależność między BMI, a objawami klinicznymi i radiologicznymi charakterystycznymi dla choroby zwyrodnieniowej [9]. Wzrostowi BMI o 1 kg/m

2 powyżej progu 27 kg/m

2 towarzyszy

wzrost wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych i biodrowych o 15%, głównie u kobiet [8]. Wykazano zależność przy BMI>30 kg/m

2 aż siedmio-

krotnie częstsze wystąpienie choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych, jak przy BMI<25 kg/m

2 [10]. Wtórna choroba zwyrodnieniowa stawów występująca <60 roku

życia może być przyczyną silnych dolegliwości bólowych, destabilizacji stawu,

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

185

niemożności prawidłowej lokomocji i prowadzi do konieczności wymiany stawu na sztuczny. Choroba zwyrodnieniowa stawów biodrowych i kolanowych jest trzecią pod względem niesprawności w populacji świata [11].

3. Cel badania

Celem pracy było udowodnienie związku pomiędzy redukcją masy ciała, a zwiększeniem sprawności fizycznej i poprawy wydolności układu sercowo naczyniowego. Badano poziom poszczególnych frakcji lipidogramu zakładając, że ze spadkiem masy ciała wiąże się zmiana profilu lipidowego. Opierano się na badaniu wskaźnika BMI i spadku masy ciała, badaniu lipidogramu przed i po zakończeniu leczenia dietetycznego. Obserwowano wydolność układu krążenia poprzez pomiar ciśnienia tętniczego i tętna w czasie pobytu w ośrodku oraz oceniano poziom glukozy we krwi. Celem badania było: określenie wpływu zmniejszenia masy ciała na profil lipidowy, określenie zależności między spadkiem aterogennej frakcji LDL, a wzrostem aktywności fizycznej, oznaczenie poszczególnych frakcji profilu lipidowego.

4. Materiał

Badania rozpoczęto po uzyskaniu zgody Komisji Bioetycznej. Prowadzone były w ośrodku „Oaza Życzliwości – Przytkowice 292”. Kwalifikacji dokonał lekarz specjalista pracujący w ośrodku. Osoby zakwalifikowane wyraziły zgodę na badanie, z możliwością rezygnacji z udziału, niezależnie od powodu. Prowadzone badanie w żaden sposób nie zaburzało terapii i nie narażało pacjentów na zagrożenie życia i zdrowia. Przeprowadzono badania w grupie 111 osób z nadwagą lub otyłością. Osoby badane dobrowolnie poddały się leczeniu dietą restrykcyjną przez okres 14 dni. Codziennie stosowano zajęcia fizyczne i ćwiczenia ogólnorozwojowe.

5. Metodyka

5.1. Charakterystyka diety restrykcyjnej

Dieta restrykcyjna jest dietą redukcyjną, niskokaloryczną (600-800 kcal/dobę) z eliminacją tłuszczów zwierzęcych, białka zwierzęcego i cukrów prostych. Jest dietą warzywno-owocową. Składa się z 3 regularnych posiłków w ciągu dnia (godzina 8 – 13 – 18). Każdy posiłek zawiera: sok warzywno-owocowy, surówkę warzywną, ciepłe warzywo pieczone lub duszone, owoce o niskim indeksie glikemii. Zalecane jest wypijanie wody mineralnej 1,5-2 litrów dziennie (w ośrodku zalecana jest woda mineralna Muszynianka) oraz dowolnej ilości herbat ziołowych.

5.2. Zajęcia fizyczne

Codziennie prowadzone były dodatkowo zajęcia aktywności fizycznej, po śniadaniu godzinny marsz z kijkami Nordic Walking. Po obiedzie prowadzone były ćwiczenia ogólnorozwojowe z fizjoterapeutą, trwające 45 minut.

5.3. Plan badania

Pierwsza grupa -pacjenci z nadwagą i otyłością poddający się diecie redukcyjnej. Czas trwania kuracji 14 dni. Liczba osób 111, przedział wieku 25-75 lat.

5.4. Rodzaj badania

Badanie przeprowadzono w pierwszym i czternastym dniu pobytu. Badano: masę ciała (Waga 1, Waga 2), wzrost, wskaźnik BMI (BMI 1, BMI 2), test aktywności fizycznej (test z krzesłem: test K1, test K2), pobierano próbkę krwi do oznaczenia lipidogramu (Cholesterol 1, TG 1, LDL 1, Cholesterol 2, TG 2, LDL 2)

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

186

Test z krzesłem: pacjent samodzielnie wstaje z krzesła bez przytrzymywania

w czasie 30 sekund. Ilość powtórzeń świadczy o sprawności fizycznej pacjenta. Test

z krzesłem (30-second Chair Stand Test) jest jednym z 6 testów Senior Fitness Test

stworzonym w 1997 roku. Pozwala ocenić poziom aktywności ruchowej i sprawności

fizycznej osób starszych. Liczba powtórzeń jest wyznacznikiem badania [26].

Pacjenci pozostający na terapii nie przyjmowali leków obniżających poziom

cholesterolu.

6. Analiza statystyczna materiału badanego

Analizę statystyczną wykonano przy pomocy pakietu STATISTICA. Do porównań

dwóch średnich zastosowano test t-Studenta dla zmiennych zależnych. W celu

porównania więcej niż 2 średnich użyto test Anova. Założenia testów dotyczące

normalności rozkładu sprawdzono testem Shapiro-Wilka. Związek między zmiennymi

sprawdzono wyliczając współczynnik korelacji Pearsona.

Średnia wieku w badanej grupie wynosiła 59,8 lat, najmłodsza osoba miała 26 lat

a najstarsza 93. Średnia wieku badanych kobiet (n=89) wynosiła 59,4 a mężczyzn

(n=22) 61,5 lat.

Tabela 1. Statystyki opisowe dotyczące wieku [lata]

Tabela 2. Statystyki opisowe dotyczące wieku [lata] w zależności od płci

Parametr

KOBIETY MĘŻCZYŻNI

ŚREDNIA WIEKU

LICZEBNOŚĆ

59,4 61,5

89 22

Tabela 3. Podstawowe statystyki badanych parametrów – na początku diety

Statystyki opisowe

Parametr

Średnia Mediana Odchylenie

standardowe

Współczynnik

zmienności

Min. Maks.

WAGA1

CHOL.1

LDL1

HDL1

TG1

TEST K1

BMI

81,69 79,00 18,16 22,23 46,40 145,0

6,07 5,98 1,52 25,07 2,91 11,9

3,72 3,73 1,14 30,72 1,23 6,5

1,51 1,41 0,46 30,28 0,67 3,4

1,48 1,30 0,79 53,53 0,60 4,8

12,89 13,50 3,17 24,56 6,00 17,0

29,81 30,00 5,63 18,88 19,50 49,2

Statystyki opisowe ( Przytkowice)

Parametr LICZEBNOŚĆ Średnia Minimum Maksimum Odch.std

wiek 111 59,84685 26,00000 93,00000 13,04342

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

187

Tabela 4. Podstawowe statystyki badanych parametrów – na końcu diety

Statystyki opisowe

Parametr

Średnia Mediana Odchylenie

standardowe

Współczynnik

zmiennośc

Min. Maks.

WAGA2

CHOL.2

LDL2

HDL2

TG2

TEST K2

BMI2

77,67 74,40 17,11 22,03 45,40 133,6

5,03 5,03 1,23 24,51 2,48 7,9

3,09 3,11 1,13 36,66 0,84 6,3

1,27 1,18 0,37 29,48 0,57 3,1

1,07 1,00 0,39 36,43 0,50 2,9

18,00 18,00 5,11 28,41 7,00 29,0

28,45 28,30 5,32 18,71 18,60 49,0

Tabela 5. Podstawowe statystyki dla różnicy badanych parametrów na początku i na końcu terapii

Statystyki opisowe

RÓŻNICA

Średnia Mediana Odchylenie

standardowe

Współczynni

k

zmienności

Min. Maks.

WAGI

CHOLESTEROLU

LDL

HDL

TG

K

BM I

4,021 3,80 2,06 51,15 0,00 12,40

1,053 0,91 0,92 87,24 -0,61 4,29

0,632 0,51 0,82 129,23 -1,21 2,95

0,240 0,20 0,23 97,50 -0,33 0,90

0,403 0,20 0,58 144,74 -0,80 2,90

-5,107 -4,50 3,06 -59,90 -12,00 -1,00

1,458 1,40 0,70 47,84 0,00 3,90

7. Wyniki badania

Na podstawie przeprowadzonej analizy stwierdzono istotny wpływ stosowanej

diety restrykcyjnej na spadek stężenia całkowitego cholesterolu, frakcji LDL, stężenia

trójglicerydów.

Średnia stężenia całkowitego cholesterolu z wartości początkowej 6,08 mmol/l

obniżyła się do wartości 5,03 mmol/l, czyli nastąpił spadek cholesterolu o 17,4%.

Podobnie średnia stężenia frakcji cholesterolu LDL spadła o 17% z wartości 3,72

mmol/l do 3,09 mmol/l. Również zauważono istotny spadek stężenia trójglicerydów

TG o 28%, ze średniej wartości 1, 48 mmol/l do 1,07 mmol/l. Najniższy spadek

wartości zanotowano dla wskaźnika masy ciała BMI i wynosił 5%. Wskaźnik

z wielkości 29,93 kg/m2 obniżył się do 28,5 kg/m

2, był też istotny statystycznie

(p<0,001). Wyniki analiz zebrano w tabeli 6 i na poniższych wykresach.

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

188

Tabela 6. Wyniki porównań testem t-Studenta parametrów* na początku i na końcu diety

* Jednostki zmiennych (parametrów) – cholesterol – mmol/l, LDL i TG – mmol/l, BMI – kg/m2,

Test K – ilość powtórzeń ćwiczeń/30 sekund

Największą poprawę wyników pomiędzy pierwszym a drugim badaniem

zaobserwowano w teście z krzesłem oceniającym sprawność i kondycję fizyczną

badanych. Średnia wyniku testu K1 wynosiła 12,89 powtórzeń ćwiczeń/30 sekund,

a po 2 tygodniach wzrosła o 40% i wynosiła 18 powtórzeń ćwiczeń/30 sekund. Ten

duży wzrost nastąpił być może nie tylko dzięki diecie, ale zwiększonej aktywności

pacjentów przebywających w tym ośrodku.

Wykres ramka-wąsy

test K1 wz. test K2

Średnia Średnia±Błąd std Średnia±1,96*Błąd std test K1 test K2

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Tes

t K

- i

lość

pow

tórz

eń ć

wic

zeń/3

0 s

ekund

Wykres 1. Średnie wartości testu K1 i K2

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

189

Wykres ramka-wąsy

LDL1 wz. LDL2

Średnia

Średnia±Błąd std

Średnia±1,96*Błąd std LDL1 LDL22,8

3,0

3,2

3,4

3,6

3,8

4,0

stę

że

nie

LD

L [m

mo

l/l]

Wykres 2. Średnie wartości LDL1 i LDL2

Analizując wyniki pacjentów stwierdzono, że nie u wszystkich wskutek stosowanej

diety nastąpił spadek frakcji LDL, wskazuje na to różnica tej frakcji LDL, która

przyjmuje wartości LDL < 0 lub LDL > 0. Badanych podzielono na dwie grupy

w zależności od wartości LDL. Porównano jak wyglądała różnica zmiany innych

parametrów w tych dwóch grupach (LDL wzrosło – LDL <0 oraz LDL zmalało

–LDL > 0).

Tabela 7. Wyniki porównań testem t-Studenta parametrów dla grupy, gdy LDL<0 oraz ·LDL>0

Testy t; Grupująca:zmiana LDL

Grupa 1: LDL wzrosło

Grupa 2 LDL zmalało

Zmienna

Średnia

2

Średnia

1

t p

RÓŻNICA BM I

RÓŻNICA K

RÓŻNICA TG

RÓŻNICA HDL

RÓŻNICA CHOLESTEROL

1,45 1,43 0,10 0,91893

-5,29 -4,00 -0,78 0,44473

0,34 0,62 -2,04 0,04420

0,25 0,20 0,94 0,34683

1,24 0,19 5,29 0,00000

Szczególne warte uwagi jest porównanie sprawności fizycznej. W grupie gdzie

LDL>0, wzrost sprawności był niższy niż w grupie, u których nastąpił spadek

cholesterolu frakcji LDL. Różnica ta nie jest statystycznie istotna.

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

190

Wykres ramka-wąsy: RÓŻNICA K: =V18-V19

Średnia

Średnia±Błąd std

Średnia±1,96*Błąd std

LDL zmalało LDL wzrosło

zmiana LDL

-7,0

-6,5

-6,0

-5,5

-5,0

-4,5

-4,0

-3,5

-3,0

-2,5

-2,0

RÓ

ŻN

ICA

K

Wykres 3. Srednie K 1 i K 2 dla LDL<0 i LDL>0

W celu określenia zależności pomiędzy zwiększeniem sprawności fizycznej K,

a spadkiem masy ciała, spadkiem parametrów lipidowych oraz wiekiem wyznaczono

macierz korelacji liniowej Pearsona (tabela 8).

Tabela 8. Macierz korelacji badanych zmiennych

MACIERZ KORELACJI N=107

Oznaczone wsp. korelacji są istotne z p < ,05000

Zmienna

WIEK RÓZNIC

A

WAGA

RÓŻNICA

CHOLES

TEROL

RÓŻNICA

LDL

RÓŻNICA

HDL

RÓŻNICA

TG

RÓŻNICA

BMI

WIEK

RÓZNICA WAGA

RÓŻNICA CHOLESTEROL

RÓŻNICA LDL

RÓŻNICA HDL

RÓŻNICA TG

RÓŻNICA BMI

RÓŻNICA K

-0,200 0,012 -0,048 -0,039 0,087 -0,083

-0,120 0,172 0,145 0,139 0,124 0,958

0,012 0,172 0,808 0,256 0,258 0,221

-0,048 0,145 0,808 0,121 -0,086 0,162

-0,039 0,139 0,256 0,121 -0,108 0,189

0,087 0,124 0,258 -0,086 -0,108 0,157

-0,083 0,958 0,221 0,162 0,189 0,157

-0,123 0,063 -0,317 -0,472 -0,069 0,197 0,092

W tabeli korelacje istotnie statystycznie (p<0,05) zaznaczono na czerwono

Współczynnik korelacji liniowej pomiędzy wiekiem i większością analizowanych

parametrów był niski i nie przekraczał wartości 0,1. Jedynie zależność pomiędzy

wiekiem a spadkiem masy ciała oraz zwiększeniem sprawności fizycznej była niewiele

większa, wynosiła r = - 0,12, lecz nie była istotna statystycznie (czyli brak korelacji).

Natomiast istotna statystycznie okazała się zależność pomiędzy zwiększeniem

sprawności fizycznej (K), a spadkiem cholesterolu frakcji LDL (LDL). Współ-

czynnik korelacji wynosił -0,47 (p = 0,01). Oznacza to, że wraz z wzrostem sprawności

fizycznej (K1<K2, K = K1-K2) następuje widoczny spadek LDL (LDL= LDL1-

LDL2).

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

191

Powiązanie między zmiennymi ilustruje poniższy wykres oraz równanie liniowe

przedstawione nad wykresem (wykres 4).

Istotna zależność występuje także pomiędzy spadkiem stężenia cholesterolu

całkowitego (CHL), a spadkiem frakcji cholesterolu LDL (LDL), frakcji (HDL),

stężenia trójglicerydów (TG) oraz spadkiem wskaźnika BMI (BMI).

Wykres 4. Prosta regresji dla zależności Różnica LDL vs Różnica K

Przeprowadzono także analizę zmian testu sprawności fizycznej w zależności od

grupy wiekowej. Podzielono badaną próbę na 4 grupy wiekowe i porównano zmianę

sprawności fizycznej między grupami.

Tabela 9. Średni wzrost sprawności fizycznej w 4 grupach wiekowych.

Największą różnicę sprawności fizycznej K=K1-K2 zaobserwowano (-6,33) dla

przedziału wiekowego 60 – 70 lat, najmniejsza różnica wystąpiła w grupie powyżej 70

roku życia (-3,4). Różnica średniej zmiany aktywności fizycznej w grupach

wiekowych okazała się statystycznie nieistotna (test ANOVA, p=0,21).

WIEK 4 PRZEDZIAŁY RÓŻNICA KŚrednie

RÓŻNICA KOdch.std

poniżej i =50 r -3,50 2,517

(50-60] r -5,14 2,035

(60-70] r -6,33 3,473

powyżej 70 r -3,40 2,881

Ogół -5,11 3,059

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

192

Wykres 5. Zmiana średnich różnic K w różnych przedziałach wiekowych

8. Podsumowanie

Nadwaga i otyłość stanowią istotny problem wśród dzieci, młodzieży i osób

dorosłych. Pomimo profilaktyki zdrowego stylu życia rośnie liczba osób dotkniętych

tym problemem. Otyłość jest stanem patologicznym, prowadzącym do wystąpienia

chorób będących przedmiotem pracy i do pogorszenia stanu zdrowia. Wysoko-

przetworzona i wyokokaloryczna (wysokobiałkowa i wysokowęglowodanowa) dieta

stanowi podstawę do rozwoju nadwagi i otyłości. Nadmierna masa ciała wiąże się

z ryzykiem wystąpienia dyslipiedmii, miażdżycy, chorób układu sercowo naczyniowego,

w tym zawału serca czy udaru mózgu, nadciśnienia tętniczego. Dieta zbilansowana,

zawierająca 30% białka zwierzęcego i tłuszczów zwierzęcych, na korzyść w 70%

białka roślinnego i tłuszczów roślinnych niezmodyfikowanych, z ograniczeniem

przetworzonych cukrów prostych, istotnie poprawia funkcję układu sercowo naczy-

niowego, zmniejsza dolegliwości ze strony układu narządu ruchu poprzez zwiększenie

sprawności fizycznej. Rezygnacja z hiperalimentacji diety wdrożenie aktywności

fizycznej (Światowa Organizacja Zdrowia zaleca aktywność fizyczną 30 minutową 5x

w tygodniu dla utrzymania sprawności fizycznej) chroni przed nadwagą i otyłością,

przed chorobami układu sercowo naczyniowego oraz przed chorobą zwyrodnieniową

stawów. Chroni także przed koniecznością przyjmowania leków obniżających poziom

cholesterolu, glukozy, ciśnienia tętniczego.

W pracy analizowano wpływ diety i aktywności fizycznej na redukcję masy ciała.

Zaobserwowano, że wdrożona dieta i znaczący wzrost aktywności fizycznej koreluje

z obniżeniem BMI. Analizowano także lipidogram przed i po zakończeniu terapii

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

193

odchudzającej. Istotnie obniżył się poziom frakcji LDL i całkowitego cholesterolu po

zakończeniu diety restrykcyjnej.

Znamienna statystycznie okazała się także zależność pomiędzy zwiększeniem

sprawności fizycznej (K), a spadkiem cholesterolu frakcji LDL (LDL).

Uwarunkowania tej zależności mogą być jednak na tyle złożone, że zachęcają do

dalszych obserwacji.

9. Wnioski

Po wdrożeniu diety ubogokalorycznej i stymulowaniu aktywności fizycznej przez

okres 14 dni w badanej grupie (111 osób) uzyskano wyniki pozwalające na wyciąg-

nięcie poniższych wniosków:

nastąpiło obniżenie poziomu cholesterolu całkowitego o 17,4%;

nastąpiło obniżenie wskaźnika BMI o 5%;

nastąpił spadek frakcji LDL o 17%;

nastąpił spadek TG o 28%;

nastąpił wzrost aktywności fizycznej o 40%.

zaobserwowano istotną korelację pomiędzy wzrostem sprawności fizycznej

a spadkiem frakcji LDL.

Literatura

1. Raport WHO: Co roku przedwcześnie umiera 16 mln ludzi na świecie, nauka

wpolsce.pap.pl// news%2C403481%Craport-who-co-roku-przedwczesnie-

umiera,22.01.2015

2. Strzelecki Z, Szymborski J.(red.), Zachorowalność i umieralność na choroby układu

krążenia a sytuacja demograficzna Polski,81gp. rrl,2015 monografia kardiologia.pdf

3. Sofi F, Abbate R, Gensini GF, Casini A., Accuring evidence on benefits of adherence to

the Mediterranon diet on health: an updated systematic review and meta-analysis, The

American Journal of Clinical Nutrition, 11(2010), 1189-1196

4. Dłużnieweski M. (red), Choroba niedokrwienna serca. Co lekarz wiedzieć powinien?

Servier, Warszawa 1998

5. Naruszewicz M. (red), Czynniki ryzyka. Kwartalnik Polskie Towarzystwo Badań nad

Miażdżycą, Medical Education 2007

6. Dłużniewski M, Mamcarz A, Krzyżak P. (red), Kardiologia Praktyczna dla lekarzy

rodzinnych i studentów medycyny. Akademia Medyczna Warszawa 2003

7. Łysoń P. (red), Zdrowie i Ochrona Zdrowia w Polsce w 2011 roku.

https://stat.gov.pl/cps/rde/xbcr/gus/20_zdrowie_i_ochrona_zdrowia_w_2011.pdf

8. Flegal KM, Carrol MD. Prevelance and obesity and trends in the distribution of body

mass index. JAMA (2)2012,1;307(5):491-497. Doi: 10.1001/jama2012.39 Epub2012

Jan17

9. Klimiuk P, Kurliszyn-Moskał A. Wytyczne/zalecenia. Choroba zwyrodnieniowa stawów.

Reumatologia 2016,supl (1), 111-113. Doi: https://doi.org/10.5114/reum.2016.60012

10. Bronuver GM. Associety between valus at varus aliqument and the develop, and

progression of radiographie OA of the knee. Arthritis & Rheumatology 2007, 56(4), 1204-

1211

11. Toivanen AT, Heliovaara M, Impivaara O, Arokoski J et al.: Obesity, physically

demanding work and traumatic knee inujry are major risk factors for knee osteoarthritis-a

population-based stufy with a follow up of 22 years. Rheumatology vol.46, Issue2,

(2)2010, 308-314. https://doi.org/10.`093/rheumatology/kep388, publ. 27.11.2019

Lidia Kościelny, Magdalena Wilk-Frańczuk, Bożena Latała

194

12. Giec L. (red), Choroba niedokrwienna serca. Wyd. PZWL Warszawa 1999

13. Tatoń J, Czech A. Kliniczna definicja nadwagi i otyłości. Warszawa. PZWL 2007, 26-41

14. Szybiński Zbigniew. Insulinemia w zespole metabolicznym. Wydawnictwo Medyczne

Kraków 2003

15. Olszanecka M, Zahorska Markiewicz M. Otyłość jako choroba zapalna. Postępy Higieny

Medycyny Doświadczalnej 2008,62, 249-257

16. Klop B, Elte JWF,Caberas MC. Dyslipidemia in obesity: Mechanisms and potential

targets. Nutrients 2013, 5(4), 1218-1240. https://doi.org/10.3390/nu5041218

17. Jarosz M. (red), Żywność żywienie w prewencji i leczeniu. Dietetyka Instytut Żywności

i Żywienia 2017

18. Czech A, Tatoń J, Bernas M. Otyłość. Zespół metaboliczny. PZWL 2007

19. Pacholczyk M, Ferenc T. Zespół metaboliczny. Definicja i kryteria rozpoznawania zespołu

metabolicznego. Epidemiologia oraz związek z ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych i

cukrzycy typu drugiego. Postępy Higieny Medycyny Doświadczalnej 2008, 62, 530-542

20. Cusi K. The role of adipose tissue and lipotoxicity in the pathogenesis of type 2 diabetes.

Current Diabete Reports. 2010, (4)10, 306-315. Doi:10.1007/s11892-010-0122-6x

21. Perk J, De Backer G, Gohlke H, Graham J, Reiner Z et al. European Guidelines on

cardiovascular disease prevention in clinical practice (version 2012). The fifth joint task

force of the European Society of cardiology and other societies on cardiovascular disease

prevention in clinical practice (constituded by representatives of nine societies and by

invited experts. Eur Heart Journal 2012, (13)33, 1635-1701. Doi:

10.1093/eurheartj/ehs092. Epub 2012, May3

22. Yusuf S, Hawken S. Obesity and risk of myocardial infarct. A casa control study. Lancet

2005, 366,1640-49

23. Kurth T, Gaziano M. Body Mass Index and the Risk of Stroke in Men. Jama 2002,162,

2557-62

24. Kałka D, Sobieszczańska M, Marciniak W. Aktywność fizyczna jako element prewencji

chorób sercowo-naczyniowych u osób w podeszłym wieku. Polski Merkuriusz Lekarski

2007, 12 (127), 48-53

25. Krzysztofiak H, Mamcarz A. Aktywność fizyczna w profilaktyce choroby niedokrwiennej

serca, recepta na wysiłek. Kardiologia w praktyce. Wyd. Czelej. Lublin 2007 1(39), 265-77

26. Rikli RE, Jones CJ. Measuring functional. The Journal on Active Aging (3-4) 2002.

www.dnbm.univr.it/dommenti/OccorenzaIns/matdid/matdid182478.pdf

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety

restrykcyjnej, w aspekcie prewencji wtórnej chorób układu sercowo-

naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów.

Streszczenie

Celem pracy było udowodnienie związku między redukcją masy ciała przy zastosowaniu diety restryk-

cyjnej, a zwiększeniem sprawności fizycznej. Przeprowadzono badania na grupie 100 osób – ochotników,

przebywających na leczeniu odchudzającym w Ośrodku „Oaza Życzliwości – Przytkowice 292”,

stosujących dietę restrykcyjną przez okres 2 tygodni. Lekarz pracujący w ośrodku zakwalifikował osoby

pozostające dobrowolnie na diecie do badania. Dieta restrykcyjna jest dietą ubogokaloryczną,

z wykluczeniem nasyconych kwasów tłuszczowych, białka zwierzęcego i cukrów prostych. W 1 i 14 dniu

przeprowadzono badanie lipidogramu, z uwzględnieniem frakcji LDL i trójglicerydów. W 1 i 14 dniu

obliczono wskaźnik BMI oraz test aktywności fizycznej (test krzesła). Zaobsrwowano u pacjentów istotny

spadek masy ciała, zmniejszenie aterogennych LDL i trójglicerydów. Ponadto ocena wydolności fizycznej

testem z krzesłem wykazała zwiększenie sprawności fizycznej poprzez zwiększenie ilości powtórzeń

samodzielnego wstawania z krzesła w ciągu 30 sekund. Wdrożenie diety restrykcyjnej, z eliminacją

tłuszczów zwierzęcych na korzyść nienasyconych kwasów tłuszczowych prowadzi do istotnego spadku

Ocena aterogennej frakcji LDL i trójglicerydów po wdrożeniu diety restrykcyjnej w aspekcie prewencji

wtórnej chorób układu sercowo-naczyniowego i chorób zwyrodnieniowych stawów

195

BMI (o 5%, p<0,001), spadku najbardziej miażdżycorodnej frakcji LDL (o 17%, p<0,001), spadku

poziomu trójglicerydów (o 28%, p<0,001). Spadek masy ciała po zastosowaniu diety restrykcyjnej

prowadzi do zwiększenia aktywności fizycznej w teście z krzesłem o 40% (p<0,001).

Słowa kluczowe: dieta, aterogenne LDL, aktywność fizyczna

Assessment of atherogenic LDL and triglycerides after implementation

of the restriction deities, in the aspect of cardiac vascular pre-progression and

osteoarthritis

Abstract

The aim of the study was to prove the relationship between weight reduction, using a restrictive diet and

increasing physical fitness and reducing join pain. Tests were carried out on a group of 100 people-

volunteers staing on a slimming treatment at the resort of “Oaza Życzliwości – Przytkowice 292” using

a restrictive diet for twoo weeks. The phisican working in the center has made the selection of the group of

respondents qualitied. The restriction diet is a low-calorie diet excluding saturated fatty acids, animal

protein and processed simple sugars. On the first and 14th day the BMI index and the physical activity test

(chair test) were calculated. A significant decrease in body weight, a decrease in atherogenic LDL and

triglycerides was observed in patients. In addition, the assessment of physical performance with a test with

a chair showed an increase in physical fitness by increasing the number of repetition of standing up from

the chair in 30 seconds. Implementation of a restrictive diet with elimination of animal fats in favor of

unsaturated fatty acids leads to a significant decrease in BMI (by 5%, p<0,001), decrease of the most

atherosclerotic LDL fraction (by 17%, p<0,001), decrease of triglyceride level (by 28%, p<0,001). Weight

loss after using a restrictive diet leads to increased physical activity in the test with a chair by 40%

(p<0,001).

Keywords: diet, atherogenic LDL, physical activity

196

Katarzyna Łupina1, Dariusz Kowalczyk

2, Justyna Bochniak

3, Barbara Baraniak

4

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu

na właściwości filmów jadalnych

otrzymanych z białek grochu

1. Wstęp

Opakowania jednostkowe wytwarzane z klasycznych polimerów petrochemicznych

pomimo, że posiadają wiele zalet, stały się obecnie dużym problemem dla środowiska.

Trudności z recyklingiem plastiku sprawiają, że co roku miliony ton odpadów

z tworzyw sztucznych trafia na wysypiska śmieci, a także do oceanów. Europejska

strategia na rzecz tworzyw sztucznych [1] obliguje kraje członkowskie do ograniczenia

wytwarzania sztucznych opakowań, stąd też wzrost zainteresowania opinii publicznej

opakowaniami przyjaznymi środowisku. Za poszukiwaniem alternatywy dla plastiku

przemawiają ponadto zmniejszające się zasoby ropy naftowej.

W chwili obecnej opracowanych i wdrożonych jest wiele proekologicznych

materiałów opakowaniowych. Zdaniem ekspertów, polimery otrzymywane z odna-

wialnych surowców, a wśród nich polimery ulegające biodegradacji stanową ważną

grupę materiałów mogących rozwiązać problemy zarówno surowcowe, jak i środo-

wiskowe. Przemysł opakowań do żywności jest jednym z poważniejszych źródeł

odpadów komunalnych. W zależności od rodzaju użytych składników i metody

przetwarzania, opakowania do żywności mogą być biodegradowalne, a także jadalne.

Dzięki takiej unikatowej formie można je zastosować wszędzie tam gdzie wykorzys-

tanie polimerów syntetycznych jest ograniczone, np. do mikrokapsułkowania,

zabezpieczania i fortyfikacji powierzchni żywności oraz leków, izolowania poszcze-

gólnych komponentów produktu. Białka, ze względu na swą budowę, pełnią w organizmach żywych różnorodne

funkcje, czego odzwierciedleniem jest ich wykorzystanie w wielu dziedzinach życia. Uniwersalność protein doceniła także branża opakowań spożywczych. Kolagen od dawna stosowany jest do produkcji osłonek do wędlin, a żelatynowe kapsułki są efektywną postacią farmaceutyczną wielu leków i suplementów diety. Wiele białek wykazuje właściwości filmotwórcze. Groch jest najważniejszym surowcem białkowym uprawianym w krajach UE [2]. Ten stosunkowo tani surowiec, pozbawiony jest modyfikacji genetycznych i nie figuruje w wykazie produktów będących najczęstszą przyczyną alergii i nietolerancji pokarmowych [3]

1 katarzyna.lupina@gmail.com, Katedra Biochemii i Chemii Żywności, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl/ 2 dariusz.kowalczyk@up.lublin.pl, Katedra Biochemii i Chemii Żywności, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl/ 3 just.bochnak@gmail.com, Katedra Biochemii i Chemii Żywności, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl/ 4 barbara.baraniak@up.lublin.pl, Katedra Biochemii i Chemii Żywności, Wydział Nauk o Żywności

i Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, http://www.up.lublin.pl/

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych z białek grochu

197

Proteinowe folie charakteryzują się niską przepuszczalnością tlenu [4], jednakże z uwagi na hydrofilowy charakter nie stanowią skutecznej bariery dla pary wodnej oraz mają ograniczoną wytrzymałość mechaniczną. Poprawę właściwości filmów białko-wych można osiągnąć poprzez fizyczną, chemiczną i enzymatyczną modyfikację struktury protein. Wyniki dotychczasowych badań wskazują, że pożądane właściwości użytkowe filmów otrzymanych z białek grochu uzależnione są od składu surowcowego (m.in. rodzaju i ilości zastosowanego plastyfikatora, obecności polisacharydów i/lub lipidów) oraz sposobu i warunków formowania (m.in. pH, obróbki termicznej) [4, 5, 6]. Wśród chemicznych metod modyfikacji właściwości białek dobrze poznane jest ich inter- i intramolekularne sieciowanie przy użyciu aldehydów. Zwiększenie wytrzy-małości mechanicznej filmów obserwowano po sieciowaniu białek m.in. aldehydem mrówkowym, glutarowym i glikolowym [7, 8]. Toksyczność tych związków wyklucza jednak ich użycie w produkcji opakowań jadalnych. Z tego powodu prowadzone są badania nad możliwością wykorzystania enzymów do modyfikacji właściwości filmów. Najczęściej stosowana jest transglutaminaza (TG) (EC 2.3.2.13), która

polimeryzuje białka poprzez tworzenie wiązań -(-glutamylo)lizyno-amidowych [9]. Filmy otrzymane z żelatyny modyfikowanej TG posiadały o ~35% obniżoną przepuszczalność pary wodnej oraz o ~20% niższą rozpuszczalność w porównaniu z filmami kontrolnymi [10]. Do modyfikacji białka sojowego wykorzystano także peroksydazę chrzanu (PCH) (EC 1.11.1.7), która katalizuje utlenianie reszt tyrozyny z utworzeniem dityrozyny [11] (rys.1)

Ryc. 1. Utlenianie tyrozyny katalizowane peroksydazą (sieciowanie białek) [12]

Dodatek enzymu do filmów z białek soi spowodował wzrost ich wytrzymałości na zerwanie, nie wpływając na szybkość przenikania pary wodnej (WVP) [6].

Celem niniejszej pracy badań było określenie wpływu modyfikacji PCH na właściwości użytkowe filmów jadalnych otrzymanych z izolatu białka grochu (IBG).

2. Materiały i metody badań

Do badań wykorzystano IBG Propulse (Nutri-Pea Limited, Kanada), PCH (25kU/138,1mg), glicerol (GLI) oraz sorbitol (SOR) (Sigma-Aldrich).

2.1. Modyfikacja enzymatyczna białek

PCH wprowadzano do 10% (m/m) roztworów IBG w ilości 0, 10, 100 i 1000 U/g białka. Reakcję prowadzono w 50mM rozworze H2O2 przez 24h h w temp. 37°C i pH 7. Po termicznej inaktywacji (85

oC, 10 min) enzymu, roztwory ochłodzono do

temperatury 25oC.

CH2

OH

CH

H2O2peroksydaza

CH2

OH

CH

OH

CH2

CH

tyrozyna

dityrozyna

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

198

2.2. Rozdział elektroforetyczny

Przeprowadzono elektroforetyczny rozdział białek w warunkach denaturujących na

żelu poliakrylamidowym (SDS/PAGE). Białka zagęszczano w 4% żelu, a następnie

rozdzielano w 12% żelu, przy stałym napięciu 50V (Mini-PROTEAN 3 Cell and

Systems, BioRad Laboratories, USA). Elektoforegramy wybarwiano kumazyną.

2.3. Otrzymywanie filmów

IBG zhomogenizowano (14 000 obr./min, 2 min) w 50 mM rozworze H2O2

i ogrzano (90oC, 20 min). Następnie do ochłodzonej mieszaniny wprowadzono PCH

w ilości 1000 U/g białka. Reakcję prowadzono przez 24h w temperaturze 37°C i pH 7.

Po inaktywacji enzymu (85oC, 10 min) do ochłodzonych (do 25

oC) roztworów

dodawano GLI lub SOR w ilości odpowiednio 4% i 5% (m/m). Roztwory

filmotwórcze (11 g) wylewano na polistyrenowe płytki Petriego (145 cm2, Nunc,

Dania). Po wysuszeniu (25oC, 24h) uzyskane warstewki oddzielano od płytek. Filmy

kontrolne uzyskano z pominięciem dodatku PCH. Grubość wyciętych próbek

określano z dokładnością do 2 µm przy użyciu grubościomierza (model 7327,

Mitotuyo, Japonia). Próbki aklimatyzowano w komorze (MLR 350H, Sanyo Electric

Biomedical, Japonia) przez 48 h w temperaturze 25oC przy wilgotności względnej

powietrza (RH) 50%.

2.4. Badania właściwości filmów

2.4.1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)

Mikrostrukturę przełomów odwodnionych sublimacyjnie roztworów film otwór-

czych (cryo-SEM) oraz topografię filmów obserwowano przy użyciu skaningowego

mikroskopu elektronowego LEO 1430VP (LEO Electron Microscopy, Wielka

Brytania). Przed obserwacją próbki napylano złotem.

2.4.2. Oznaczenie barwy

Barwę filmów określono przy użyciu odbiciowego spektrofotometru sferycznego

X-RiteColor 8200 (X-Rite, USA). Pomiary wykonano w trzech powtórzeniach przy

zastosowaniu czarnego tła (L*= 25,63; a*= -0,12; b*= -0,47).

2.4.3. Określanie przepuszczalności światła i nieprzezroczystości

Próbkę filmu (10 x 20 mm) umieszczano w szczelinie spektrofotometru (Lambda

40, Perkin-Elmer, USA) i mierzono transmitancję przy zakresie 200-700 nm.

Nieprzezroczystość filmów obliczono na podstawie wzoru (1) podanego przez Han

i Floros [13]:

O = -logT600/x (1)

gdzie: O – nieprzezroczystość (A600/mm), T600 – transmitancja przy λ=600 nm,

x – grubość próbki (mm).

Pomiary wykonano w trzech powtórzeniach.

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych z białek grochu

199

2.4.4. Oznaczanie szybkości przenikania pary wodnej (WVP)

WVP oznaczono na podstawie PN-ISO 2528:2000 [14X]. Naczynka pomiarowe

zawierające 10 g bezwodnego chlorku wapnia przykryto próbką filmu o średnicy 100

mm, szczelnie zamknięto i umieszczono w komorze klimatycznej (25oC, RH=50%).

Następnie wykonano kolejne ważenia naczynek z dokładnością do 0,001 g w 2 h

przedziałach czasu przez 10 h. WVP obliczono ze wzoru (2):

WVP m · 4 · x A · Δp (2)

gdzie: m – przyrost masy (g/h), x – grubość filmu (mm), A – powierzchnia

przenikania pary wodnej (m2), Δp – różnica ciśnienia pary wodnej w komorze

klimatycznej i w naczynku pomiarowym (kPa).

Pomiary wykonano w trzech powtórzeniach.

2.4.5. Oznaczenie właściwości mechanicznych przy statycznym rozciąganiu

Wytrzymałość na zerwanie (σmax) i wydłużenie względne (εb) filmów określono na

podstawie PN-EN ISO 527-1,2,3:1998 [15, 16, 17] przy użyciu analizatora tekstury

TA-XT2i (Stable Micro Systems, Wielka Brytania). Próbkę folii (zmodyfikowany

kształt typu B1) [16] poddano jednokierunkowemu rozciąganiu z prędkością 1 m/s.

Pomiary wykonano w sześciu powtórzeniach. σmax obliczono według wzoru (3):

σmax = Fmax/A (3)

gdzie: Fmax – maksymalna siła zrywająca (N), A – początkowy przekrój odcinka

pomiarowego próbki (mm2)

εb próbek obliczono następująco:

εb = ΔL L · 00 (4)

gdzie: ΔL – przyrost odległości między zaciskami (mm), L – początkowa

odległość między zaciskami (mm).

2.4.6. Oznaczenie wytrzymałości na przebicie

Filmy po zamocowaniu (pomiędzy dwoma płytkami z otworami ϕ = 30 mm)

w analizatorze tekstury TA-XT2 przebijano sondą zakończoną metalową kulką (ϕ = 2

mm) poruszająca sie z prędkością 1m/s. Pomiary wykonano w czterech powtórzeniach.

Odporność na przebicie obliczono według wzoru (5):

PS = Fmax/A (5)

gdzie: PS – wytrzymałość na przebicie (MPa), Fmax – siła w momencie przebicia

próbki (N), A – przekrój poprzeczny próbki (mm2)

2.5. Analiza statystyczna

Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu programu

STATISTICA 13. Istotność różnic między wartościami średnimi weryfikowano testem

Fisher’a na poziomie istotności α=0,05.

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

200

3. Wyniki badań

Rozdziały elektroforetyczne IBG poddanego działaniu wzrastających dawek PCH posłużyły ustalaniu właściwego stosunku enzym/substrat. Zaobserwowano, że usieciowanie białek grochu z wytworzeniem wysokocząsteczkowych polimerów (≥116 kDa), przy jednoczesnym zaniku intensywności pasm odpowiadających poszcze-gólnym frakcjom białkowym, nastąpiło po 24h reakcji przy dodatku enzymu w ilości 1kU/g białka (rys. 2). Zastosowanie mniejszej ilości PCH (10-100 U/g) nie skutkowało efektywnym łączeniem cząsteczek białkowych. Optymalne warunki sieciowania (temp. 37°C, pH 7, przez 24h, przy stężeniu enzymu 1000 U/g ) wykorzystano do otrzymania filmów z IBG.

Zastosowanie techniki cryo-SEM umożliwiło wizualizację szkieletu polimerowo-hydrożelowego powstałego w wyniku odwodnienia roztworów filmotwórczych. Porowata matryca złożona była ze sferycznych cząstek preparatu białkowego (rys. 3). Drobniejsze nieregularne kształty utworzone były prawdopodobnie przez rozpuszczoną część preparatu. Dodatek PCH spowodował widoczne zmiany w architekturze szkieletu odwodnionych roztworów filmotwórczych, zawierających zarówno glicerol (rys. 3), jak i sorbitol (rys. niezamieszczony). Powstałe zmodyfikowane struktury charakteryzowały się mniejszą ilością cząstek o rozmiarze ≥20 µm oraz większym stopniem usieciowana. Badanie cryo-SEM wykazało zatem efektywność PCH jako czynnika powodującego agregację białek grochu w roztworach filmotwórczych. Analiza mikroskopowa topografii filmów otrzymanych z enzymatycznie modyfikowanych białek także ujawniła ich bardziej drobnoziarnistą i upakowaną mikrostrukturę w porównaniu do filmów kontrolnych (rys. 4). Zdjęcia mikroskopowe wykazały, iż otrzymane filmy stanowią zlepek nie w pełni rozpuszczonych cząstek IBG, Przyczyną był najprawdopodobniej neutralny odczyn roztworów filmotwórczych znacząco ograniczający rozpuszczalność białek grochu [18]

Z uwagi na obecność pigmentów karotenoidowych w IBG, otrzymane filmy charakteryzowały się żółto-pomarańczową barwą. Modyfikacja za pomocą PCH nie spowodowała zmiany wyróżników barwy filmów uplastycznianych GLI (p>0,05) (tab. 1). W przypadku filmów z dodatkiem SOR, sieciowanie białka spowodowało nieznaczny wzrost jasności (L*) oraz udziału barwy czerwonej (a*). Niezależnie od rodzaju zastosowanego plastyfikatora, jak i przeprowadzonego sieciowania badane filmy nie różniły się pod względem udziału barwy żółtej (b*).

Ryc. 2. Rozdział elektroforetyczny białek grochu modyfikowanych peroksydazą chrzanu: (1) bez enzymu, (2)

10U/g białka,(3) 100U/g białka, (4) 1000U/g białka [opracowanie własne]

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych z białek grochu

201

Ryc. 3. Fotografie cryo-SEM roztworów białkowo-glicerolowych: (A) niemodyfikowanych, (B) poddanych

działaniu peroksydazy chrzanu [opracowanie własne]

Ryc. 4. Fotografie SEM topografii filmów białkowo-glicerolowych: (A) niemodyfikowanych, (B) poddanych

działaniu peroksydazy chrzanu [opracowanie własne]

Tab 1. Wpływ peroksydazy chrzanu (PCH) na wyróżniki barwy (L*a*b*), przezroczystość (OP), szybkość

przenikania pary wodnej (WVP), wytrzymałość na zerwanie (σmax), wydłużenie względne (εb) oraz

wytrzymałość na przebicie (PS) filmów otrzymanych z izolatu białka grochu, uplastycznianych glicerolem

(GLI) i sorbitolem (SOR) [opracowanie własne]

Właściwości użytkowe GLI SOR

PCH (-) PCH (+) PCH (-) PCH (+)

L* 37,34±0,81b 37,92±0,21b 33,50±2,97a 37,54±0,86b

a* -0,43±0,04b -0,53±0,01b -0,97±0,18a 0,50±0,04b

b* 0,23±0,12b 1,23±0,35a 1,56±1,53a 0,91±0,61a

OP (A600/mm) 0,75±0,03a 1,04±0,19b 0,86±0,05a 1,62±0,08c

WVP (g mm m-2 d-1 kPa-1) 15,36±0,22b 15,05±1,05b 2,02±0,10a 1,78±0,32a

σmax (MPa) 3,23±0,19a 3,40±0,30a 5,36±0,31b 5,49±0,48b

εb (%) 78,51±23,8b 74,031±19,2b 11,99±3,97a 9,60±6,82a

PS (MPa) 1,98±0,04a 1,75±0,14b 1,84±0,13b 2,02±0,03c

Analiza transmitancji widmowych wykazała, że filmy z IBG posiadały bardzo

dobrą zdolność blokowania promieniowania UV (rys. 5). Spowodowane jest to

obecnością w białkach chromoforów absorbujących UV, głównie tyrozyny i tryptofanu

oraz w mniejszym stopniu fenyloalaniny i wiązań -S-S- [19]. Wiele niepożądanych

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

202

zmian składników żywności inicjowanych jest przez ww. promieniowanie, dlatego

otrzymane filmy mogą stanowić skuteczny filtr ochrony dla żywności wyekspo-

nowanej na działanie światła. Enzymatyczne sieciowanie białek spowodowało

zmniejszenie przepuszczalności światła w zakresie λ=350 -700 nm (rys. 5).

W konsekwencji obserwowano spadek przezroczystości filmów (tab. 1), prawdo-

podobnie na skutek rozpraszania światła przez powstałe agregaty białko – białko.

Porównanie przenikalności światła przez enzymatycznie modyfikowane materiały,

wykazało że filmy plastyfikowane SOR charakteryzowały się mniejszą przezro-

czystością aniżeli te zawierające GLI (tab. 1).

Rys. 5 Wpływ dodatku plastyfikatora i PCH na przepuszczalność światła (T %) filmów z IBG

[opracowanie własne]

Wbrew oczekiwaniom enzymatyczna modyfikacja nie poprawiła właściwości

barierowych filmów w stosunku do pary wodnej (tab.1). Wartość WVP filmów

z dodatkiem SOR była około osiem razy mniejsza aniżeli warstewek plastyfikowanych

GLI (p<0,05), co potwierdza wyniki uprzednio przeprowadzonych badań [2]. Nie

zaobserwowano także poprawy właściwości mechanicznych (σmax, εb) oznaczonych

w teście osiowego rozciągania próbek filmów. Z kolei test wytrzymałości na przebicie

wykazał nieznaczną poprawę wytrzymałości mechanicznej po przeprowadzeniu

enzymatycznej modyfikacji (p<0,05). Przyrosty PS wyniosły 10,76 i 9,78%,

odpowiednio dla filmów plastyfikowanych GLI i SOR (tab. 1). Folie z dodatkiem SOR

wykazywały większą wytrzymałość mechaniczną, w porównaniu do próbek z GLI.

Z kolei odwrotną zależność zaobserwowano w przypadku podatności na rozciąganie

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

200 300 400 500 600 700 800

T [

%[

Długość fali [nm]

GLI PCH- GLI PCH+ SOR PCH- SOR PCH+

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych z białek grochu

203

(tab. 1). Przypuszczalne przyczyny zróżnicowania właściwości filmów otrzymywanych

na bazie białek grochu i różnych plastyfikatorów zostały już omówione we

wcześniejszych publikacjach [2, 5].

W dostępnej literaturze niewiele jest informacji na temat wpływu PCH na

właściwości funkcjonalne białek. Wykazano, że peroksydazy rożnego pochodzenia są

przydatne w sieciowaniu wielu białek żywności, w tym sojowych, żelatyny, kazeiny

[20], β-laktoglobuliny [21, 22], owoalbuminy [21] i gliadyny [23]. Badania elektro-

foretyczne wykonane w niniejszej pracy wskazują, że PCH może również katalizować

reakcję polimeryzacji białek grochu (rys.2). Mechanizm działania peroksydazy oparty

jest na utlenianiu reszt tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru, co prowadzi do

dimeryzacji tego aminokwasu [24, 11]. Wiązanie -C-C- powstające pomiędzy grupami

fenolowymi jest stosunkowo trwałe i ma głównie intermolekularny charakter.

Dityrozyna była izolowana z hydrolizatów białek strukturalnych, w tym z resiliny [25]

występującej w wyspecjalizowanych obszarach naskórka większości insektów. Białko

to ma właściwości elastomeru, co niektórym stawonogom np. pchłom daje zdolność do

niesamowicie długich skoków (do 150 razy przekraczających długość ciała),

a owadom pomaga latać [26, 27]. Dr Chris Elvin, pracownik CSIRO Livestock

Industries stwierdził, że „…przez setki milionów lat resilina wyewoluowała do

najefektywniejszej elastycznej substancji jaką znamy…” [26]. Niezwykłe właściwości

elastyczne, odporność mechaniczna, a przy tym nierozpuszczalność w wodzie są

prawdopodobnie uwarunkowane odpowiednim rozmieszczeniem łańcuchów

polipeptydowych połączonych wiązaniami di- i tri-tyryzynowymi w wielokrotnie

zwinięte struktury [26]. Interdyscyplinarny zespół doktora Elvin’a [26] uzyskał

ekspresję genu resiliny muszki owocowej u Escherichii coli. Resilina może stać się

zatem wysokowydajną biogumą mającą wszechstronne zastosowanie m.in.

w medycynie (implanty dysków międzykręgowych i zastawek serca), przemyśle

tekstylnym (odzież dla sportowców), mikroelektronicznym i innych gałęziach

przemysłu.

W kontekście właściwości resiliny formowanie di-tyrozynowych wiązań

w białkach wydaje się atrakcyjną metodą modyfikacji właściwości użytkowych filmów

białkowych. Cechy filmów otrzymanych z izolatu białek sojowych poddanego

działaniu PCH były przedmiotem badań Stuchell i Krochta [18]. Autorzy wykazali, że

filmy z modyfikowanych białek były sztywniejsze i bardziej kruche w porównaniu do

filmów uzyskanych z natywnych białek. Wydłużenie względne filmów po

przeprowadzeniu sieciowania zmniejszyło się z 15,4 do 3,8%. Obserwowane zmiany

były przypuszczalnie związane z polimeryzacją białek soi. Podobnie jak w niniejszej

pracy (tab. 1), enzym nie miał wpływu na WVP, moduł elastyczności i wytrzymałość

na rozciąganie filmów z białek soi. Michon i wsp. [23] zbadali z kolei właściwości

mechaniczne filmów z gliadyny pszenicy poddanej działaniu peroksydazy pochodzenia

grzybowego (Phanerochaete chrysosporium). Modyfikacja spowodowała wzrost

wytrzymałości na rozciąganie z 1,65 do 14,8 MPa i spadek wydłużenia względnego

z 243,0 do 21,0%.

Wyniki zaprezentowane w niniejszej pracy wskazują, że modyfikacja białek grochu

przy użyciu PCH tylko nieznacznie poprawia wytrzymałość filmów na przebicie,

skutkując jednocześnie pogorszeniem ich przejrzystości. Uzasadnione jest zatem

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

204

prowadzenie dalszych badań mających na celu optymalizację warunków modyfikacji

enzymatycznej IBG i uzyskanie jadalnego materiału opakowaniowego o pożądanych

właściwościach użytkowych i zwiększonych możliwościach aplikacyjnych.

4. Wnioski

1) Dodatek PCH na poziomie 1kU/g białka powoduje usieciowanie białek grochu

z wytworzeniem wysokocząsteczkowych agregatów.

2) Dodatek PCH zwiększa stopień upakowania mikrostruktury filmów.

3) Usieciowanie matrycy białkowej skutkuje nieznacznym wzrostem wytrzymałości

na przebicie oraz zmniejszeniem przeźroczystości filmów.

4) Filmy plastyfikowane SOR charakteryzują się niższą WVP i wyższą

wytrzymałością mechaniczną w porównaniu do filmów z GLI.

Literatura

1. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/PL/TXT/?uri=CELEX:52018DC0028

2. Kowalczyk D., Baraniak B.: Effect of plasticizers, pH, and heating of film-forming solution

on the pea protein isolate films. Journal of Food Engineering, 105, (2011), s. 295-305

3. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/PL/TXT/PDF/?uri=CELEX:32007L0068&from=en

4. Kowalczyk D., Baraniak B: Wpływ wybranych polisacharydów na właściwości

fizykochemiczne filmów jadalnych otrzymanych na bazie białek grochu. Żywność. Nauka.

Technologia. Jakość, 5, 2012, s. 99-112

5. Kowalczyk D., Gustaw W., Świeca M., Baraniak B.: A study on the Mechanical

Properties of Pea Protein Isolate Films. Journal of Food Processing and Preservation, 38,

(2013), s. 1726-1736.

6. Kowalczyk D., Gustaw W., Zięba E., Lisiecki S., Stadnik J., Baraniak B.: Microstructure

and functional properties of sorbitol – plasticized pea protein isolate emulsion films:

Effect of lipid type and concentration. Food Hydrocolloids, 60, 2016, s. 353-363

7. Marquié C., Aymard C., Cuq J.L., Guilbert S.: Biodegradable packaging made from

cottonseed flour: Formation and improvement by chemical treatments with gossypol,

formaldehyde, and glutaraldehyde. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43,

(1995), s. 2762-2767.

8. Hernandez-Munoz P., Villalobos R., Chiralt A.: Effect of cross-linking using aldehydes on

properties of glutenin-rich films. Food Hydrocolloids, 18, (2004), s. 403-411.

9. Folk J.E.: Transglutaminases. Annual Review of Biochemistry, 49, (1980), s. 517-531.

10. Carvalho R.A., Grosso C.R.F.: Characterization of gelatin based films modified with

transglutaminase, glyoxal and formaldehyde. Food Hydrocolloids, 18, (2004), s. 717-726.

11. Aeschbach R., Amadò R., Neukom H.: Formation of dityrosine cross – links in proteins by

oxidation of tyrosine residues. Biochemica et Biophysica Acta, 439, (1976), s. 292-301.

12. Heck T., Faccio G., Richter M., Thöny – Meyer L.: Enzyme – catalyzed protein

crosslinking, 97, (2013), s. 461-475.

13. Han J.H., Floros J.D.: Casting antimicrobial packaging films and measuring their physical

propertiesand antimicrobial activity. Journal of Plastic Film & Sheeting,13, (1997), s.

287-298.

14. PN-ISO 2528:2000. Materiały w postaci arkuszy -- Oznaczanie szybkości przenikania

pary wodnej -- Metoda wagowa (miseczkowa)

15. PN-EN ISO 527-1:2012. Tworzywa sztuczne -- Oznaczanie właściwości mechanicznych

przy statycznym rozciąganiu -- Zasady ogólne.

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych otrzymanych z białek grochu

205

16. PN-EN ISO 5272:1998. Tworzywa sztuczne. Oznaczanie właściwości mechanicznych

przy statycznym rozciąganiu. Warunki badań tworzyw sztucznych przeznaczonych do

prasowania, wtrysku i wytłaczania.

17. PN-EN ISO 527-3:1998. Tworzywa sztuczne. Oznaczanie właściwości mechanicznych

przy statycznym rozciąganiu. Warunki badań folii i płynów.

18. Stuchell Y.M., Krochta J.M.: Enzymatic treatments and thermal effects on edible soy

protein films. Journal of Food Science, 59, (1994), s. 1332-1337.

19. Aitken A., Learmonth M.P.: Protein determination by UV absorption. In: The Protein

Protocols Handbook, Walker J.M. (Ed.), second ed. Human Press, Totowa, NJ, 2000, pp.

s. 3-6.

20. Matheis G., Whitaker J.R.: Peroxidase-catalyzed cross-linking of proteins. Journal of

Protein Chemistry, 3, (1984), s. 35-48.

21. Stahmann M.A., Spencer A.K., Honold G.R.: Cross linking of proteins in vitro by

peroxidase. Biopolymers.,16, (1977), s. 1307-1318.

22. Færgemand M., Otte J., Qvist K.B.: Crosslinking of whey proteins by enzymatic oxidation.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, (1998), s. 1326-1333.

23. Michon T., Wand W., Ferrasson E., Guéguen J.: Wheat prolamine crosslinking through

dityrosine formation catalysed by peroxidases: Improvement in the modification of a

poorly accessible substrate by indirect catalysis. Biotechnology and Bioengineering, 63,

(1999), s. 499-458.

24. Gross A.J., Sizer L.W.: The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by

peroxidise. The Journal of Biological Chemistry, 259, (1959), s. 1611-1614.

25. Andersen S.O.: The cross-links in resilin iden- tified as dityrosine and trityrosine.

Biochemica et Biophysica Acta , 93, (1964), s. 249-262.

26. Elvin C.M., Carr A.G., Huson M.G., Maxwell J.M., Pearson R.D., Vuocolo T., Liyou

N.E., Wong D.C., Merritt D.J., Dixon N.E.: Synthesis and properties of crosslinked

recombinant pro-resilin. Nature, 437, (2005), s. 999-1002.

27. Bennet-Clark H.: The first description of resilin. Journal of Experimental Biology, 210,

(2007), s. 3829-3881.

Wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu na właściwości filmów jadalnych

otrzymanych z białek grochu

Streszczenie

Określono wpływ modyfikacji peroksydazą chrzanu (PCH) na właściwości fizykochemiczne jadalnych

filmów białkowych. Filmy otrzymywano z roztworów izolatu białka grochu (10% m/m) zawierających

dodatek plastyfikatora, glicerolu (GLI) lub sorbitolu (SOR). Roztwory wylewano cienką warstwą

i suszono. Analiza fizykochemiczna filmów obejmowała pomiar szybkości przenikania pary wodnej

(WVP), właściwości mechanicznych i optycznych. Badanie elektroforetyczne ujawniło podatność białek

grochu na modyfikację PCH. Usieciowanie z wytworzeniem wysokocząsteczkowych agregatów (≥ 116

kDa), przy widocznym zaniku pasm odpowiadających poszczególnym frakcjom białkowym, nastąpiło po

24 h reakcji, przy dodatku PCH na poziomie 1kU/g białka. Efektywność usieciowania potwierdziły

dodatkowo obserwacje roztworów białkowych przy użyciu techniki krio-SEM. Badanie topografii filmów

otrzymanych z enzymatycznie modyfikowanych białek ujawniło ich bardziej drobnoziarnistą i upakowaną

mikrostrukturę w porównaniu do filmów kontrolnych. Usieciowanie matrycy białkowej spowodowało

nieznaczny wzrost wytrzymałości na przebicie (p < 0,05), spadek przepuszczalności światła w zakresie

λ=350-700 nm oraz zmniejszenie przeźroczystości filmów, prawdopodobnie na skutek rozpraszania

światła przez konglomeraty białkowe. Modyfikacja PCH nie zmieniła WVP, wytrzymałości na zerwanie

i rozciągliwości filmów. Filmy z SOR charakteryzowały się niższą WVP i wyższą wytrzymałością

mechaniczną w porównaniu do filmów plastyfikowanych GLI.

Słowa kluczowe: filmy jadalne, białka grochu, peroksydaza chrzanu, sieciowanie enzymatyczne

Katarzyna Łupina, Dariusz Kowalczyk, Justyna Bochniak, Barbara Baraniak

206

The effect of horseradish peroxidase-induced modification on the properties

of edible pea protein-based films

Abstract

The effect of horseradish peroxidase (PCH) on the physicochemical properties of edible protein films was

determined. The films were prepared from 10% w/w pea protein isolate solutions containing plasticizers,

glycerol (GLI) or sorbitol (SOR). The solutions were cast as a thin layer and dried. Physicochemical

characterization of the films included water vapor permeability (WVP), mechanical and optical properties

measurements. Gel electrophoresis revealed the susceptibility of pea proteins to PCH-induced cross-

linking. Formation of high molecular protein aggregates (≥ 116 kDa), with simultaneous disappearance of

bands corresponding to individual protein fractions, occurred after 24 h reaction, at a PCH level of 1 kU/g

protein. Moreover, the cross-linking was confirmed by cryo-SEM micrographs of protein solutions.

Examination of the film surface topography showed that the films based on enzymatically-modified

proteins exhibited more fine-grained and packed microstructure compared to the control film. Cross-

linking of the protein matrix resulted in a slight increase in the puncture strength (p<0.05), decreased light

transmission in the range of λ=350-700 nm, and reduced film transparency, probably due to light scattering

by protein conglomerates. PCH modification did not affect WVP, tensile strength and stretchability of the

films. The films with SOR had lower WVP and higher mechanical strength compared to the films

plasticized with GLI.

Keywords: edible films, pea proteins, horseradish peroxidase, enzymatic cross-linking

207

Indeks Autorów

Adamiec M. ...................................... 121

Baraniak B. ....................................... 196

Bil P................................................... 111

Bochniak J. ........................................ 196

Borkusewicz S. ................................. 102

Broncel M. .................................... 37, 51

Budnicka M. ....................................... 66

Buliński Z............................................ 25

Chrząszcz D. ..................................... 102

Ciesielska S. ...................................... 111

Fiołka M. ........................................... 102

Gadomska-Gajadhur A. .................. 7, 66

Gendosz de Carriello D. ................... 121

Horbowicz A. .................................... 102

Hudy D. ............................................. 121

Jama A. ............................................. 111

Kaczor-Szkodny P. ........................... 147

Kaczoruk M. ..................................... 147

Karolewska K. .................................... 80

Kawiak-Jawor E. .............................. 147

Kościelny L. ...................................... 182

Kowalczyk D. ................................... 196

Kozik P.............................................. 172

Kozyra P. .......................................... 137

Kret J. ................................................ 172

Kruzel A. .......................................... 158

Krzemińska M. ................................. 158

Kufel J. ...................................... 158, 172

Kulik T.B. ......................................... 147

Latała B. ............................................ 182

Listos J. ............................................. 137

Łupina Ł. .......................................... 196

Matysek A. ................................... 37, 51

Mazurek J. .......................................... 66

Nowakowska-Krol O. ........................ 25

Ożarowski M. ..................................... 90

Pacian A. ........................................... 147

Paraszkiewicz K. ................................ 80

Pilawa B. ....................................... 37, 51

Ramos P. ....................................... 37, 51

Sadowska B. ....................................... 80

Skonieczna M. .................................. 121

Szydziak M. ...................................... 172

Szymaniak M. ..................................... 66

Talarek S. .......................................... 137

Wawrzaszek R. ................................... 17

Wielgus K. .......................................... 90

Więcław M. .......................................... 7

Wilk-Frańczuk M. ............................ 182

Wrzecionek M. ..................................... 7