Podstawowe strategie i techniki genetyki...

Podstawowe strategie i techniki genetyki molekularnej

Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA – manipulacje DNA in vitro

  izolacja i amplifikacja DNA i cDNA   mapowanie i sekwencjonowanie DNA   tworzenie nowych cząsteczek DNA

  przez rekombinację cząsteczek naturalnych   przez syntezę de novo

  wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów   modyfikacje syntezy białek

  ekspresja heterologiczna

  bioinformatyka

A co nie jest inżynierią genetyczną?   Inżynieria embrionalna (np. klonowanie)

  Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

Zastosowania   Badania podstawowe   Biotechnologia

Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

Podstawowe techniki   Izolacja DNA ze źródeł naturalnych

  komórki i tkanki   mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące

naturalnie   antyczny DNA

  cDNA – izolacja RNA i przepisanie na DNA   Chemiczna synteza DNA de novo

PCR

© 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Elektroforeza DNA i RNA


Hybrydyzacja   Wykorzystanie komplementarności kwasów

nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern)


Hybrydyzacja Northern

  Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu

Podstawowe techniki

  Enzymy restrykcyjne   analiza fragmentów DNA

(mapowanie)   klonowanie

Wektory   Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do

komórek (transformacja, transfekcja)   wektory autonomiczne – zdolne do replikacji (np. plazmidy,

wirusy)   wektory integracyjne   wektory ekspresyjne – umożliwiają ekspresję wprowadzonego

genu (autonomiczne lub integracyjne)   wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) – integracyjne   wektory bifunkcjonalne

Typowy wektor   Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne)   Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym

wektorem – markery selekcyjne   Miejsce do wstawienia klonowanego DNA – linker   Opcjonalnie – sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze

wstawką od wektora „pustego” – marker rekombinacji

Klonowanie molekularne   Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora

autonomicznego

Przykłady zastosowań   Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów,

mutantów)   Diagnostyka molekularna   Ekologia i filogenetyka molekularna   Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i

biotechnologicznych)   „Odwrotna genetyka” – inaktywacja wybranych genów u

organizmów modelowych   Terapia genowa

Sekwencjonowanie

  Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach

3’ ATCGGTGCATAGCTTGT 5’!

5’ TAGCCACGTATCGAACA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGAA* 3’!5’ TAGCCACGTATCGA* 3’!5’ TAGCCACGTA* 3’!5’ TAGCCA* 3’!5’ TA* 3’!

Produkty reakcji A

Matryca

Tradycyjny odczyt sekwencji   Znakowanie radioaktywne,

osobne reakcje A T C G

+

–

CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG

• Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie – każdy innym kolorem

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie automatyczne

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe   Tzw. deep sequencing   Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych

odczytów   Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp)   Zastosowania

  sekwencjonowanie nowych genomów   resekwencjonowanie

  np. analiza zmienności

  badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cDNA

Solexa

= 350 Solexa® Ultra-high-throughput DNA Sequencing Platform

Pirosekwencjonowanie (454)

The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117 - 1124 (2008)

•  Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone

•  Kulki z DNA umieszczone w studzienkach

•  Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją

•  Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases)

Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina)

Slides from http://www.illumina.com •  Wynik: 80-100 milionów odczytów po

~50 bp (~4Gb)!

Solexa (Illumina)

Genomika

  Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów

  Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka

  Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów   Badanie funkcji zawartych w nich genów

Metagenomika   Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie   Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają

się hodować

Metagenomika

  Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu

  Tajemnicza UCYN-A   Sinica (cyjanobakteria)

  Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów)   Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów   Zdolność asymilacji azotu   Symbioza? – tajemnicza ekologia

Genom człowieka

Craig Venter Francis Collins (NIH)

TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT

Co to znaczy?

Mały fragment chromosomu 21

Co to znaczy?   Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania

odpowiedzi na to pytanie   Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych   Możemy badać geny przez “odwrotną genetykę” –

tworzenie mutantów u organizmów modelowych   Porównując genomy możemy wnioskować o biologii

organizmu

Odwrotna genetyka – od genu do funkcji

Genetyka tradycyjna

Funkcja (mutacja, fenotyp)

Klonowanie genu

Analiza sklonowanego genu

Genetyka „odwrotna”

Gen (z sekwencji całego genomu)

Inaktywacja genu

Analiza uzyskanego fenotypu

Odwrotna genetyka – inaktywacja przez rekombinację

Inaktywacja warunkowa

Odwrotna genetyka – interferencja RNA

Odkrycie roku 2002 – regulacyjna rola małych RNA

Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

siRNA - jak to działa?

Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002

Efekt – degradacja mRNA

Zastosowania siRNA

  Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin

  Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) – przykład: obniżenie poziomu receptora LDL („zły cholesterol”) u myszy

Ekspresja heterologiczna

Wektor ekspresyjny Oczyszczanie białka

Fuzje białkowe

  Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie   znaczniki epitopowe   GFP (zielone białko fluorescencyjne)

Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria

wt hPNPaza

-52 hPNPaza

MitoTracker anti-c-myc Nałożenie

Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hPNPazy-myc w komórkach HeLa.

Ekspresja heterologiczna w biotechnologii

Inżynieria przeciwciał – leki przyszłości   W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne

odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową

  W klasycznych metodach wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskiwano przeciwciała zwierzęce

  Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania

  Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych – obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego

  Humanizowane i rekombinowane ludzkie przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów

Terapia genowa   Zastępująca – wprowadzenie genu, którego defekt powoduje

chorobę   Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji,

zwłaszcza dla komórek nie dzielących się   Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi

(np. SCID – gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi – choroba Gauchera)

  Inaktywująca – zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową)   Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (siRNA, modyfikowane

oligonukleotydy)   Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne

leki

Podstawowe strategie i techniki genetyki...

Documents

Transcript of Podstawowe strategie i techniki genetyki...