Andrzej Kasprzak

Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań

Pracownia Genomiki Strukturalnej

prof. dr hab. Bogdan Wolko

Biblioteka BAC Biblioteka BAC genomugenomu

Lupinus angustifoliusLupinus angustifolius

• Konstrukcja biblioteki BACdla genomu Lupinus angustifolius

• Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność

• Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking

Cel pracy

Materiały • DNA Lupinus angustifolius, izolowany z

jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej

• Enzym restrykcyjny HindIII• Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre)• Komórki kompetentne E. coli DH10B• Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG)• Płytki do przechowywania klonów w

temperaturze -80oC, 384-miejscowe

DetektorŹródło światła

Naładowana elektrodaSelekcjonująca krople

Naładowana elektrodaSelekcjonująca krople

Zanieczyszczenia

Frakcja o ładunku dodatnim

Frakcja o ładunku ujemnym

+_

Puls ładujący próbkę

Próbka 1. Izolacja DNA za pomocą

„sortera chromosomów”

2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C)

3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu

PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze 0. 25 x TBE)

Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120°

Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°

4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC)

5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)

6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F)

7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG

Płyta typu BioAssay z transformowanymi

komórkami bakteryjnymi

8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)

9. Sprawdzenie średniej długości insertów- trawienie BAC’ów enzymem NotI- elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s,

16h, 6V/cm, kąt 120°)

5 0 k b p1 0 0 k b p

W e k t o r

Dystrybucja wielkości insertówDystrybucja wielkości insertów

Długość insertu [kbp]Długość insertu [kbp]

Pro

cent

owy

udzi

ał w

P

roce

ntow

y ud

ział

w

bibl

iote

cebi

blio

tece

Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji

nukleotydowej genu w bibliotece BAC- wzór Clarke’a i Carbona

P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece

N - liczba klonów (55 296)

x - średnia długość insertu (100 kpz)

y - wielkość genomu (920 Mpz)

yxNeP /1

10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA

łubinu

Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA

Klucz odczytywania sygnałów

Dwa pozytywne sygnały

na 18 432 klony BAC

11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie

– poszukiwanie genu ENOD4012. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego

klonu BAC

PodsumowaniePodsumowanie

• Skonstruowano pierwszą bibliotekę BACdla genomu Lupinus angustifolius

• Charakterystyka biblioteki: - liczba klonów: 55 296 - średnia wielkość insertu: 100 kbp - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% - pokrycie: 6x