Andrzej Kasprzak
Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań
Pracownia Genomiki Strukturalnej
prof. dr hab. Bogdan Wolko
Biblioteka BAC Biblioteka BAC genomugenomu
Lupinus angustifoliusLupinus angustifolius
• Konstrukcja biblioteki BACdla genomu Lupinus angustifolius
• Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność
• Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking
Cel pracy
Materiały • DNA Lupinus angustifolius, izolowany z
jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej
• Enzym restrykcyjny HindIII• Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre)• Komórki kompetentne E. coli DH10B• Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG)• Płytki do przechowywania klonów w
temperaturze -80oC, 384-miejscowe
DetektorŹródło światła
Naładowana elektrodaSelekcjonująca krople
Naładowana elektrodaSelekcjonująca krople
Zanieczyszczenia
Frakcja o ładunku dodatnim
Frakcja o ładunku ujemnym
+_
Puls ładujący próbkę
Próbka 1. Izolacja DNA za pomocą
„sortera chromosomów”
2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C)
3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu
PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze 0. 25 x TBE)
Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120°
Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°
4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC)
5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)
6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F)
7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG
Płyta typu BioAssay z transformowanymi
komórkami bakteryjnymi
8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)
9. Sprawdzenie średniej długości insertów- trawienie BAC’ów enzymem NotI- elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s,
16h, 6V/cm, kąt 120°)
5 0 k b p1 0 0 k b p
W e k t o r
Dystrybucja wielkości insertówDystrybucja wielkości insertów
Długość insertu [kbp]Długość insertu [kbp]
Pro
cent
owy
udzi
ał w
P
roce
ntow
y ud
ział
w
bibl
iote
cebi
blio
tece
Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji
nukleotydowej genu w bibliotece BAC- wzór Clarke’a i Carbona
P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece
N - liczba klonów (55 296)
x - średnia długość insertu (100 kpz)
y - wielkość genomu (920 Mpz)
yxNeP /1
10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA
łubinu
Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA
Klucz odczytywania sygnałów
Dwa pozytywne sygnały
na 18 432 klony BAC
11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie
– poszukiwanie genu ENOD4012. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego
klonu BAC
PodsumowaniePodsumowanie
• Skonstruowano pierwszą bibliotekę BACdla genomu Lupinus angustifolius
• Charakterystyka biblioteki: - liczba klonów: 55 296 - średnia wielkość insertu: 100 kbp - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% - pokrycie: 6x
Top Related