Diagnostyka molekularna i terapia genowa Diagnostyka molekularna i terapia genowa

Dr hab. Józef DulakZakład Biochemii Komórki Wydział Biotechnologii UJ

Ul. Gronostajowa 7 30-387 Kraków

Email: jdulak@mol.uj.edu.pl

Odkrywanieprzeznaczenia

KariotypKariotyp ludzki – zestaw wszystkich chromosomów składa się z z 22 par chromosomów autosomalnych i chromosomów płci (XX u kobiety, XY u mężczyzny). Ryc. 1. Barwienie barwnikami specyficznymi dla poszczególnych par chromosomów.

Aberracje chromosomoweUtrata, powielenie lub pęknięcie chromosomów powoduje określone objawy kliniczne. Ryc.2. Kariotyp komórek nowotworowych płuc.

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Choroby genetyczne

Stanowią różnorodną grupę zaburzeń spowodowanych przez mutacje punktowe, duże mutacje i nieprawidłowości chromosomowe

1. Defekty pojedynczych genów (zaburzenia mendlowskie) wywołane przez mutacje, których rezultatem jest synteza uszkodzonych białek lub zaprzestanie syntezy. Mutacje mogą być dziedziczone lub powstawać de novo w rodzicielskich komórkach rozrodczych.

2. Zaburzenia chromosomowe polegają na utracie lub zyskaniu chromosomów, albo na zmianach w ich strukturze. Większość zaburzeń chromosomowych powstaje de novo w rodzicielskich komórkach rozrodczych.

• Nieprawidłowości związane z liczbą chromosomów – dotyczą obecności wielokrotności kopii całego aparatu chromosomów (poliploidy) albo polegają na utracie lub powieleniu pojedynczego chromosomu (aneuploidy)

• Nieprawidłowości strukturalne chromosomów wynikają z pęknięcia chromosomu i obejmują delecje, duplikacje czy rearanżacje chromosomu

3. Zaburzenia wieloczynnikowe spowodowane są przez zespół genów i czynników środowiskowych. Obejmują wiele powszechnych chorób (osteoporoza, choroba wieńcowa)

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Tempo identyfikacji genów sprzężonych z chorobami genetycznymi (1981 do 2000). Do roku 2000 zidentyfikowano 1112 genów, warunkujących choroby. Te dane nie obejmują 94 chorób warunkowanych fuzją genów, będąca wynikiem translokacji. Liczby w nawiasach wskazują „gen-kandydat” podejrzany o sprzężenie z chorobą.

Mutacje DNA

Zmiany sekwencji DNA organizmu spowodowane działaniem czynników chemicznych, fizycznych lub błędami w replikacji DNA.

Mutacje punktowe – zmiana pojedynczej zasady:

Zmiany sensu Nonsensowne Fazy odczytu Miejsc składania

Duże mutacje – zmiana więcej niż jednej zasady:

DelecjeInsercjeInwersje (rearanżacje) Mutacje dynamiczne

Zaburzenia struktury i liczby chromosomów

DelecjeInsercjeRearanżacjeTranslokacje Aneuploidy i poliploidy

OriginOrigin ofof chronicchronic myelogenousmyelogenous leukemia leukemia

OriginOrigin ofof chronicchronic myelogenousmyelogenous leukemia leukemia

OriginOrigin ofof chronicchronic myelogenousmyelogenous leukemia leukemia

http://www.cmlsupport.com/cmlstiresourcecenter.htm

CCT GAG GAGCCT GTG GAG

From Anthony Cerami and Charles M. Peterson, "Cyanate and Sickle-Cell Disease." Copyright ©1975 by Scientific American, Inc. All rights reserved.)

Wykrywanie mutacji w genie β-globiny – anemia sierpowata

Molecular Biology of the Cell

Kopiarka inżyniera genetyka

ILLUSTRATION: TERRY SMITH

Przyspieszony kurs wiedzy nt. Przyspieszony kurs wiedzy nt. replikacjireplikacji DNA... DNA...

5’-CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3’3’-GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5’

Denaturacja

5’-CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3’

3’-GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5’

GGAAGGTGT-5’replikacja DNA

5’-CGTGT GC TTreplikacja DNA

Reakcja łańcuchowa Reakcja łańcuchowa polimerazypolimerazy -- PCRPCR

Reakcja łańcuchowa Reakcja łańcuchowa polimerazypolimerazy -- PCRPCR

Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (1)

1. Izolacja kwasu nukleinowego (nawet z b. małej ilości materiału)2. Umieszczenie w probówce DNA, nukleotydów, starterów,

polimerazy DNA (wszystko w odpowiednim buforze – K+, Mg2+)3. Umieszczenie probówek w termocyklerze

Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (2)

1. Wstępna denaturacja – 94oC – 5 minut 2. Denaturacja – 94oC – 40 sekund3. Przyłączenie starterów – 58oC – 40 sekund 4. Replikacja – 72oC – 40 sekund

Etapy 2-4 powtarzane są 30-35 razy...

Tu mieszka Thermus thermophilus

AnalysingAnalysing ofof DNADNA-- gelgel electrophoresiselectrophoresis

Mutacje – przyczyny chorób

Człowiek chory na mukowiscydozę-zazwyczaj umierado 20 roku życia

Człowiek zdrowy

DIAGNOSTYKA PRENATALNA

PCR 10 eksonu genu warunkującego mukowiscydozę (CF) w rodzinie, w której rodzice są nosicielami mutacji ∆F508

Tor 1 – marker wielkości; tor 2 –kontr. neg; tor 3-homozygota

∆F508; tor 4-prawidłowy DNA; tor – ojciec –nosiciel zmutowanego allelu; tor – matka, nosicielka

zmutowanego allelu, tor- płód - ?

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Diagnostyka molekularnaDiagnostyka molekularnaWykrywanie wirusa HIVWykrywanie wirusa HIV--11

Wykrywanie wirusów jest jednym z najtrudniejszych zadań Wykrywanie wirusów jest jednym z najtrudniejszych zadań diagnostycznychdiagnostycznych

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Diagnostyka molekularnaDiagnostyka molekularnaWykrywanie mutacji w genie Wykrywanie mutacji w genie BRCA1BRCA1

2430T>C2430T>C3232A>G3232A>G3667A>G3667A>G4427T>C4427T>C

do 8%1:10 do 1:20

HRAS1

1%<35 lat1:10 000p53

do 8%1:80 do 1:200

ATM

8%<40lat1%>50lat

1:500 do 1:2000

BRCA1

% nowotworów piersi w

populacji

Częstośćwyst.

defektu u kobiet

Mutacje genu

Molecular Medicine – Trent RJ

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Sekwencja DNA

W Projekcie Sekwencjonowania Genomu Człowieka zastosowano metodę opisaną w 1977 roku przez Freda Sangera. W styczniu 2001 roku przedstawiono 2 700 000 000 par zasad genomu człowieka z czego około 1 000 000 000 z dokładnością 99.99%.

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Mutacje w genie Mutacje w genie DMDDMDSubstytucja Substytucja CC>T >T w w eksonieeksonie 4545

1052 Kontrola

BiochimieBiochimie 79, 1997; Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań79, 1997; Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

MikromacierzeMikromacierze

MikromacierzeMikromacierze DNA/Czujniki DNA/DNA/Czujniki DNA/CzipyCzipy DNA/Genetyczne mikroprocesoryDNA/Genetyczne mikroprocesory

MikromacierzeMikromacierze w badaniu ekspresji genóww badaniu ekspresji genów

MikromacierzeMikromacierze w badaniu ekspresji genóww badaniu ekspresji genów

Fig. 3. Genes distinguishing acutelymphoid leukaemia (ALL) fromacute myeloid leukaemia (AML).The figure shows the 50 geneswith the greatest distinctionbetween ALL and AML, the top panel showing genes more highlyexpressed in ALL and the bottompanel showing genes more highlyexpressed in AML. Each rowcorresponds to a gene, with thecolumns corresponding to expression levels of these genes indifferent patient samples. Expression levels greater than themean are red, and those below themean are blue. The scale indicatesstandard deviations above orbelow the mean. (Adapted withpermission from Golub et al5)

DIAGNOSTYKA PRENATALNA

AMNIOCENTEZA - aspiracja płynu owodniowego za pomocą specjalnej, cienkiej igły i założeniu hodowli komórek owodniowych (diagnostyka molekularna) oraz analizie w kierunku stężenia markerów płodowych, takich jak α-fetoproteina(AFP).

Amniocentezę wykonuje się zwykle w 15-17 tyg. ciąży (są próby w 11-14 tyg.). Wyniki z hodowli uzyskuje się po 2-4 tyg., w zależności od techniki hodowli Powikłania:

- niezaaspirowanie płynu pod wpływem skurczu macicy

- powikłania matczyne polegające na plamieniu i przecieku płynu owodniowego

- poronienia - ryzyko 0,5%- uraz płodu igłą aspiracyjną –

ultrasonograf minimalizuje ryzyko

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Genetyczna diagnostyka pre-implantacyjna

Źródła materiału do badań

• Krew• Nasienie• Ślina• Mocz• Włos• Ząb• Kość• Tkanka

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

DNA satelitarnyDNA satelitarnyDNA satelitarnyDNA satelitarny –– sekwencje DNA składające się z krótkich sekwencje DNA składające się z krótkich

powtarzających się motywów (zwykle od 5powtarzających się motywów (zwykle od 5--200 bp), charakterystyczne dla 200 bp), charakterystyczne dla eukariontóweukariontów. .

DNA DNA minisatelitarnyminisatelitarny to powtórzenia krótszych, to powtórzenia krótszych, kilkunukleotydowychkilkunukleotydowychjednostek, a jednostek, a DNA DNA mikrosatelitarnymikrosatelitarny to powtórzenia sekwencji najwyżej to powtórzenia sekwencji najwyżej czterocztero-- a często a często dwudwu--nukleotydowychnukleotydowych::

Np.Np.--GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA----CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT--

Wiele Wiele mikrosatelitówmikrosatelitów jest polimorficznych, różniąc się u poszczególnych jest polimorficznych, różniąc się u poszczególnych osób liczbą powtórzeń, gdyż podczas osób liczbą powtórzeń, gdyż podczas replikacjireplikacji DNA gubią się lub (rzadziej) DNA gubią się lub (rzadziej) dodają kolejne pary. Pozwala to ustalenie tzw. profilu genetyczndodają kolejne pary. Pozwala to ustalenie tzw. profilu genetycznego, co ego, co wykorzystuje się między innymi w kryminalistyce.wykorzystuje się między innymi w kryminalistyce.

Krótkie tandemowe powtórzenia (STR)

AATG

7 powtórzeń

8 powtórzeń

Region powtórzeń jest zmienny natomiast sekwencje DNA rozpoznawane przez startery są stałe

Homozygota = obydwa allele tej samej długości

Heterozygota = allele różnej długości

(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

??

Analiza DNA Analiza DNA mikrosatelitarnegomikrosatelitarnegopozwala na ustalanie ojcostwapozwala na ustalanie ojcostwa

OKREŚLANIE POKREWIEŃSTWAOKREŚLANIE POKREWIEŃSTWA

1 2 3 4DNA DNA fingerprintingfingerprinting

DNA trawiono enzymem DNA trawiono enzymem HinfIHinfI, a następnie , a następnie rozdzielono w żelu rozdzielono w żelu agarozowymagarozowym i i hybrydyzowano z sondą molekularną hybrydyzowano z sondą molekularną (CAC)5. (CAC)5. Tor 1, matka; tor 2, dziecko I; tor 3, dziecko Tor 1, matka; tor 2, dziecko I; tor 3, dziecko II; tor 4, domniemany ojciec, którego II; tor 4, domniemany ojciec, którego ojcostwo badanie wykluczyło. Dzieci są ojcostwo badanie wykluczyło. Dzieci są bliźniętami bliźniętami dizygotycznymidizygotycznymi

Laboratorium Genetyki Molekularnej, Poznań(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

Frank Frank LeeLee SmithSmith

F.L. F.L. SmithSmith został skazany za gwałt i morderstwo został skazany za gwałt i morderstwo ośmioletniej dziewczynki.ośmioletniej dziewczynki.

Został skazany na dożywocie Został skazany na dożywocie –– zmarł po 14 latach w zmarł po 14 latach w więzieniu w Teksasiewięzieniu w Teksasie

Analiza Analiza mikrosatelitarnegomikrosatelitarnego DNA wykazała, że był DNA wykazała, że był niewinny.niewinny.

1. osoba1. osoba 2. osoba2. osoba

NamnażaNamnaża się fragmenty DNA się fragmenty DNA mikromikro--satelitarnego.satelitarnego.

Analizuje długość otrzymanych Analizuje długość otrzymanych fragmentów.fragmentów.

Im więcej Im więcej namnażanychnamnażanychfragmentów, tym większa czułość fragmentów, tym większa czułość testu.testu.

Jedna z metod:Jedna z metod:

Do kogo jesteśmy podobni?...

Dziedziczenie cech psychicznych

Współczynniki korelacji występowania tych samych cech U bliźniąt jedno- i dwujajowych wychowywanych oddzielnie

Cecha Bliźnięta Bliźnięta jednojajowe dwujajowe

Cechy osobowości łącznie 0,45 0,26

Depresja 0,48 <0,05Wrogość 0,4 0,05Fobie 0,55 0,32

Religijność 0,61 -0,12

Minnesota Twin Studies

Każda cecha ma podłoże genetyczne...Każda cecha ma podłoże genetyczne...

Zdumiewiająca hipotezaF. Crick

Czyli nauka o pochodzeniu duszy

Zmienianie przeznaczeniaZmienianie przeznaczenia

Terapia genowa Terapia genowa

wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków

Genterapeutyczny

Wektor Pacjent Ekspresja genu terapeutycznegoEfekt leczniczy

Białkolecznicze

Jakie choroby można leczyć za pomocą terapii genowej?Jakie choroby można leczyć za pomocą terapii genowej?

Czy terapia genowa jest potrzebna?

Gen HPRT

Komórki HPRT-/-

pożywka HAT

Prof.Wacław Szybalski

McArdle Laboratoryfor Cancer Research, Wisconsin, Madison,

USA

Narodziny terapii genowej - 1962

Pożywka HAT

Komórki HPRT+/+

Choroba Lescha-Nyhana

HPRTHPRT

Konsekwencje braku funkcjonalnego genu HPRTKonsekwencje braku funkcjonalnego genu HPRT

Genetyczne strzykawki

Wektory AAV(wirusy towarzyszące

adenowirusom)Wektory adenowirusoweWektory retrowirusowe

plazmidowy DNA

Wektory retrowirusowe•• Wbudowują Wbudowują transgentransgen do do genomugenomu biorcy biorcy –– zapewniają zapewniają długotrwałą ekspresję genudługotrwałą ekspresję genu

•• wbudowują się w przypadkowe wbudowują się w przypadkowe miejsce chromosomu miejsce chromosomu –– mogą mogą powodować powodować mutagenezęmutagenezę insercyjnąinsercyjną

gag pol envITRITR ITRITR

retrowirusretrowirus

transgenITRITRITRITR

Wektor Wektor retrowirusowyretrowirusowy