Postępy Biochemii 55 (1) 2009 21

Benzonaza® — możliwości praktycznych zastosowań

Marcin Olszewski1,

Paweł Filipkowski2

1Katedra Mikrobiologii i 2Katedra Chemii, Technologii i Biotechnologii Żywności, Wy-dział Chemiczny, Politechnika Gdańska, Gdańsk

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Mikrobiologii, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk; tel.: (058) 347 16 05, e-mail: molszewski@pg.gda.pl

Słowa kluczowe: benzonaza, endonukleaza, DNA, DNAza, RNAza, oczyszczanie białek

Wykaz skrótów: EDTA — wersenian dwuso-dowy; DSC — skaningowa kalorymetria róż-nicowa (ang. differential scanning calorymetry); PMSF — fl uorek fenylometylosulfonowy; SDS — dodecylosiarczan sodu; SSB — białka wią-żące się do jednoniciowego DNA (ang. single stranded DNA binding protein)

Podziękowania: Autorzy dziękują fi rmie Merck za udostępnienie produktu do przepro-wadzenia doświadczeń oraz materiałów do przygotowania niniejszej pracy

Merck sp. z o.o., ul. Aleje Jerozolimskie 178, 02-486 Warszawa,http://www.merck.pl,http://www.merckbiosciences.co.uk

STRESZCZEnIE

Benzonaza znajduje zastosowanie w efektywnym obniżaniu lepkości i usuwaniu kwa-sów nukleinowych z roztworów białkowych. Zbadano w praktyce jej możliwości apli-

kacyjne w oczyszczaniu białek rekombinantowych wiążących jednoniciowe dnA (ang. SSB — single stranded Dna binding protein).

WPROWAdZEnIE

Izolacja materiału biologicznego z różnego rodzaju organizmów prokario-tycznych i eukariotycznych wymaga zastosowania odmiennych metod. Ogól-nie, techniki ekstrakcji białek polegają na rozbiciu komórek i ich oddzieleniu od innych struktur komórkowych, głównie cząsteczek DNA i RNA oraz na zabez-pieczeniu ich stabilności i późniejszym oczyszczaniu i zagęszczaniu.

Standardowy proces oczyszczania białka rekombinowanego, uzyskanego w hodowli, składa się z 3 lub 4 etapów: ekstrakcji i klaryfi kacji, oczyszczania wła-ściwego (ang. capture) i doczyszczania (ang. polishing). Czasem wymagany jest etap pośredniego oczyszczania (ang. intermediate purifi cation).

Pierwszy etap oznacza zazwyczaj koncentrację biomasy, dezintegrację ko-mórek w celu uwolnienia produktu, odrzucenie pozostających „resztek” ko-mórkowych oraz koncentrację ekstraktu. Drugi etap, oczyszczanie właściwe, to najważniejszy etap oczyszczania polegający na oddzieleniu produktu od białek gospodarza. Ostatni etap polega na zastosowaniu metod chromatografi cznych (zazwyczaj innych niż na etapie oczyszczania właściwego), które pozwolą na usunięcie resztkowych zanieczyszczeń (endotoksyny, kwasy nukleinowe) oraz substancji podobnych pod względem chemicznym do produktu (enancjomery, agregaty).

Dezintegrację komórek można przeprowadzić metodami fi zycznymi, np. po-przez naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie komórek, przez wywoływanie szoku osmotycznego, zastosowanie ultradźwięków lub metodami chemiczny-mi (np. z zastosowaniem detergentów niejonowych lub jonowych, jak np. SDS, sarkozyl czy Triton X-100, rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicz-nych - głównie wobec komórek bakteryjnych). W przypadku drożdży efektywna jest także dezintegracja mechaniczna, jak np. rozcieranie z tlenkiem glinu lub pe-rełkami szklanymi czy wykorzystanie zjawiska ekstruzji z zastosowaniem prasy French’a. Często stosowany jest także lizozym, lizostafyna, chitynaza lub inne specyfi czne do stosowanych mikroorganizmów enzymy trawiące ścianę komór-kową. Metody te muszą być na tyle “delikatne”, by nie powodować poważniej-szych uszkodzeń, czy denaturacji docelowych białek. Jednocześnie w zasadzie żadna z nich w znaczący sposób nie powoduje usunięcia kwasów nukleinowych w trakcie wstępnych etapów oczyszczania, co wpływa znacznie na obniżenie wydajności na dalszych etapach [1].

Metody stosowane do usuwania kwasów nukleinowych, takie jak ekstrakcja czy precypitacja, nie są metodami specyfi cznymi. Ponadto zarówno denaturacja jak i precypitacja wpływają na obniżenie wydajności oczyszczania białek. Stoso-wanym do tej pory alternatywnym rozwiązaniem było wykorzystanie enzymów DNAzy i RNAzy.

Docelowo podczas izolacji w celu degradacji DNA stosuje się różnego ro-dzaju DNAzy. Ponieważ enzymy te ulegają aktywacji w obecności dwuwarto-ściowych jonów metali, dlatego hydrolizę DNA prowadzi się w obecności tych jonów. Analogicznie, usunięcie kwasu rybonukleinowego z otrzymanych pre-paratów prowadzi się zazwyczaj metodą enzymatyczną przez inkubację próbek

zeszyt.indb 21 2009-03-07 23:17:45

22 www.postepybiochemii.pl

z RNAzą lub poprzez sączenie molekularne czy wirowanie w gradiencie gęstości.

Deoksyrybonukleazy (DNAzy) enzymy hydrolityczne (hydrolazy) katalizujące rozpad łańcucha DNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy, należą do nukleaz, np. DNAza typu I (endonukleaza) wykonuje nacięcia w różnych pozycjach obu nici DNA, generując wolne 3’ końce [2,3].

Rybonukleazy (RNAzy) to enzymy z klasy nukleaz hy-drolizujące cząsteczki RNA na krótsze łańcuchy lub poje-dyncze nukleotydy przez hydrolizę wiązań fosfodiestro-wych. Endorybonukleazy prowadzą reakcję trawienia cząsteczek RNA wewnątrz łańcucha, a egzorybonukleazy odłączają nukleotydy od 3’ lub 5’ końca RNA [4].

CHARAKTERySTyKA EnZyMU

Benzonaza jest otrzymaną na drodze inżynierii genetycz-nej endonukleazą pochodzącą z Serratia marcescens. Enzym składa się z dwóch podjednostek o wielkości 30 kDa każda i wymaga około 1-2 mM jonów Mg2+ do wykazania swojej pełnej aktywności. Degraduje wszystkie formy DNA i RNA (jednoniciowe, dwuniciowe, liniowe i koliste, w tym su-perzwinięte). Nie wykazano preferowania w trakcie hydro-lizy żadnego typu par zasad. Benzonaza, podobnie jak inne endonukleazy, hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe obecne w kwasach nukleinowych. W warunkach optymalnych, wszystkie obecne w roztworze kwasy nukleinowe zostają zredukowane do zakończonych na 5’ końcu monofosfooli-gonukleotydów o długości od 3 do 8 par zasad. Endonukle-aza nie wykazuje aktywności proteolitycznej i charaktery-zuje się wysoką aktywnością właściwą.

Optymalną temperaturą do degradacji kwasów nukleino-wych przez benzonazę jest 37°C. Enzym wykazuje jednak proporcjonalnie niższą aktywność w zakresie od 0 do 42°C. Cechuje się wysoką stabilnością w czasie przechowywania. W zakresie temperatur −20 do −80°C jego aktywność nie ulega znaczącej zmianie w okresie do 45 miesięcy. Enzym wykazuje 90% aktywność po roku w przypadku przecho-wania w 4°C i po około 8 miesiącach w temperaturze 37°C.

Według producenta benzonaza degraduje zarówno DNA jak i RNA w szerokim zakresie warunków: w obecności de-tergentów jonowych jak i niejonowych, czynników reduku-jących oraz mocznika (Tab. 1).

Poza odczynnikami przedstawionymi w Tabeli 1 zbada-no także wpływ jonów manganu, Tritonu X-100, SDS, mocz-nika, siarczanu amonu, PMSF, EDTA, chlorowodorku gu-anidyny na aktywność działania benzonazy (dane dostępne w materiałach producenta).

Benzonaza wykazuje wyższą aktywność właściwą w sto-sunku do DNAz oraz szersze spektrum działania (hydroliza zarówno DNA jak i RNA). Cechuje ją także większa toleran-cją na warunki w jakich prowadzona jest reakcja hydrolizy.

ZASTOSOWAnIA

Podstawową korzyścią w zastosowaniu benzonazy w trakcie oczyszczania białek jest obniżenie poziomu lepko-ści m.in. poprzez efektywną degradację długołańcucho-wych kwasów nukleinowych w roztworze. Efektem tego jest polepszenie wydajności oczyszczania białek z ekstrak-tów komórkowych i możliwość skrócenia czasu procedury oczyszczania. Enzym hydrolizuje kwasy nukleinowe do 5’ufosforylowanych oligonukleotydów o wielkości frag-mentów od 3 do 8 par zasad doskonale nadając się do usu-wania kwasów nukleinowych w trakcie oczyszczania białek rekombinantowych.

Potencjalne zastosowania benzonazy:

obniżenie lepkości próbki w bakteryjnych i drożdżowych ekstraktach bezkomórkowych oraz podwyższenie efek-tywności oczyszczania białka docelowego,

obniżenie lepkości próbek otrzymanych na drodze eks-presji w komórkach owadzich oraz podwyższenie efek-tywności oczyszczania białka docelowego,

zwiększenie wydajności oczyszczania białek z ciałek in-kluzyjnych oraz skrócenie czasu procedury,

zapobieganie tworzeniu skupisk przez komórki ssaków [5],

w metodzie Western Blot i elektroforezie dwukierunkowej (2D) zastosowanie benzonazy ułatwia nanoszenie próbek i polepsza rozdzielczość uzyskanych prążków/punktów na żelach poprzez obniżenie wpływu naładowanych frag-mentów DNA,

wzrost do ok. 25% wydajności na dalszych etapach oczyszczania w warunkach produkcyjnych oraz w przy-padku zastosowania filtracji cross-flow [6-8].

Otrzymana do badań benzonaza może być dostarczona przez producenta w dwóch różnych stopniach czystości 99% i 90%. Produkt nie zawiera stabilizujących białek al-buminy wołowej ani żelatyny i jest zawieszony w 50% roz-

•

•

•

•

•

•

Tabela 1. Optymalne warunki zastosowania benzonazy®.

1)benzonaza wykazuje 90% i więcej aktywności właściwej, 2)benzonaza zachowuje powyżej 15% aktywności właściwej.

Parametr Warunki optymalne1) Możliwy zakres2)

Temperatura 37°C 0–42°C

pH 8,0–9,2 6,0–10,0

Ditiotreitol (DTT) 0–100 mM Powyżej 100 mM

β-merkaptoetanol 0–100 mM Powyżej 100 mM

Stężenie jonów jednowartościowych (np. Na+, K+)

0–20 mM 0–150 mM

Stężenie PO43– 0–10 mM 0–100 mM

Stężenie Mg2+ 1–2 mM 1–10 mM

zeszyt.indb 22 2009-03-07 23:17:45

Postępy Biochemii 55 (1) 2009 23

tworze glicerolu mającym na celu ochronę preparatu przed zamarzaniem w trakcie przechowywania.

Dobór optymalnych warunków do hydrolizy DNA i RNA przez benzonazę polega na zbadaniu wpływu trzech zmiennych: czasu i temperatury inkubacji oraz ilości użytej benzonazy.

MATERIAŁy I METOdy

Postanowiono sprawdzić przydatność enzymu do degra-dacji DNA i RNA w trakcie oczyszczania białek SSB. Biał-ka te ze względu na funkcję pełnioną w komórce (wiązanie jednoniciowego DNA) w przypadku badań oddziaływań termodynamicznych wykazują znacząco inne właściwości w obecności jednoniciowego DNA. Utrudnia to uzyskanie wiarygodnych, porównywalnych wyników, np. w bada-niach skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC, ang. dif-ferential scanning calorymetry).

Rekombinowane białko otrzymywano zgodnie z opraco-waną wcześniej procedurą polegającą na nadekspresji genu w bakteryjnym układzie ekspresyjnym, wydzielaniu biał-ka z zastosowaniem chromatografii jonowej i w kolejnym etapie z zastosowaniem chromatografii powinowactwa do złoża zawierającego jednoniciowe DNA [9].

W celu potwierdzenia i doboru warunków optymalnych hydrolizy DNA i RNA przez benzonazę wyizolowano ge-nomowe DNA E. coli z zastosowaniem zestawu Genomic Mini, zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta. Wyizolowane DNA genomowe zawieszono w 25 mM NaCl i 10 mM buforze fosforanowym o pH 8,0 i 2 mM MgCl2. Wyizolowane DNA poddano reakcji hydrolizy z zastoso-

waniem benzonazy w ilości od 0 do 32 U/mL przez 2 godzi-ny w temperaturze 37°C. Hydrolizaty naniesiono na 2% żel agarozowy. W celu detekcji DNA zastosowano bromek ety-dyny i wizualizowano przy pomocy światła UV. Na podsta-wie dobranych warunków zastosowano roztwór benzonazy w celu usunięcia DNA i RNA w oczyszczonym białku. Tak uzyskany preparat zastosowano w badaniach oddziaływań termodynamicznych białek z użyciem techniki skaningowej mikrokalorymetrii różnicowej.

WynIKI

Wykazano, że w warunkach wymaganych do dalszych badań benzonaza degraduje DNA do poziomu niewykry-walnego za pomocą techniki elektroforetycznej z użyciem bromku etydyny w warunkach hydrolizy prowadzonej w roztworze 25 mM NaCl i 10 mM bufor fosforanowy o pH 8,0 i 2 mM MgCl2, w temperaturze 37°C i czasie inkubacji równym 2 godziny (Ryc. 1, ścieżka 5).

Zbadano także efektywność działania benzonazy w tem-peraturze 8°C i 25°C (dane niepublikowane) — otrzymane wyniki były podobne, z wyjątkiem niższej temperatury, gdzie dla uzyskania takiego samego efektu konieczne było wydłużenie czasu inkubacji do ok. 8 godzin. Nie stwier-dzono także aktywności proteolitycznej otrzymanego pre-paratu benzonazy z zastosowaniem techniki SDS-PAGE i barwienia kumasyną w stosunku do oczyszczanych białek (dane niepublikowane).

Zastosowanie preparatu benzonazy pozwoliło otrzymać wysokiej jakości próbki białek SSB do badań mikrokalory-metrycznych (potwierdzają to wyniki uzyskane w trakcie doświadczeń – dane niepublikowane). Wyniki doświadczeń nad oddziaływaniami termodynamicznymi białek wykona-ne z zastosowaniem skaningowej mikrokalorymetrii różni-cowej zostaną opublikowane w najbliższym czasie.

PIśMIEnnICTWO

1. Dwyer JL (1993) Process purification, W: Franx F (red) Protein bio-technology – isolation, characterization, and stabilization. Humana Press, Totawa, New Jersey, str. 533-572

2. Takeshita H, Mogi K, yasuda T, Nakajima T, Nakashima y, Mori S, Hoshino T, Kishi K (2000) Mammalian deoxyribonucleases I are classified into three types: pancreas, parotid, and pancreas-parotid (mixed), based on differences in their tissue concentrations. Biochem Biophys Res Commun 269: 481-484

3. Jones SJ, Worrall AF, Connolly BA (1996) Site-directed mutagenesis of the catalytic residues of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. J Mol Biol 264: 1154-1163

4. Pizzo E, D’Alessio G (2007) The success of the RNase scaffold in the advance of biosciences and in evolution. Gene 406: 8-12

5. Smith JG, Smith JG, Liu X, Kaufhold RM, Clair J, Caulfield MJ (2001) Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantification of cellular immune responses to Varicell-Zoster virus. Clin and Diagnostic Lab Immuno 8: 871-879

6. Reichert U, Knieps E, Slusarczyk H, Kula MR, Thömmes J (2001) Iso-lation of a recombinant formate dehydrogenase by pseudo-affinity expanded bed absorption. J Biochem Biophys Methods 49: 533-552

7. Fernadez-Lahore HM, Geilenkirchen S, Boldt K, Nagel A, Kula MR, Thömmes J (2000) The influence of cell absorbent interactions on protein absorption in expanded beds. J Chromat 873: 195-208

Rycina 1. Rozdział produktów hydrolizy genomowego DNA E. coli Benzonazą® w warunkach 37°C, 2 godziny. 2% żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny, wizualizowany w świetle UV. ścieżka: 1) rozdział produktów trawienia geno-mowego DNA 2U benzonazy/ml, 2) 4U/ml, 3) 8U/ml, 4) 16U/ml, 5) 32U/ml, 6) nukleotydowy marker wielkości 100-3000 par zasad.

zeszyt.indb 23 2009-03-07 23:17:46

24 www.postepybiochemii.pl

8. Lee CT, Morreale G, Middelberg AP (2004) Combined in-fermen-ter extraction and cross-flow microfiltration for improved inclusion body processing. Biotechnol Bioeng 85: 103-113

9. Kur J, Olszewski M, Długołecka A, Filipkowski P (2005) Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) — sources and applications in molecular biology. Acta Biochim Polon 52: 569–574

Benzonase — possibility of practical applicationMarcin Olszewski, Paweł Filipkowski

Chemical Faculty, Gdansk University of Technology, 11/12 G. Narutowicza St., 80-952 Gdansk, Polande-mail: molszewski@pg.gda.pl

Key words: benzonase, endonuclease, DNA, DNAse, RNAse, protein purificaltion

ABSTRACT

Benzonase nuclease degrades all forms of dnA and RnA while having no photolytic activity. In this study we check possibility of use this reagent to prepare proteins to microcalorymetric experiments.

zeszyt.indb 24 2009-03-07 23:17:48