ANALIZA WIDM MASOWYCH - Uniwersytet Wrocławski

ANALIZA WIDM MASOWYCH

OBSŁUGA PROGRAMU DATA ANALYSIS(Bruker Daltonics)(Bruker Daltonics)

W ramach przedmiotu:

Metody fizykochemiczne (L)

I rok Mgr Chemia biologiczna

Prowadzący mgr Karolina RadziszewskaProwadzący:mgr Karolina Radziszewska

1© 2012 Karolina Radziszewska

DATA ANALYSIS 3.4 (Bruker Daltonics)

Oprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmyOprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmy

Bruker Daltonics

Wymagana licencja użytkownika

Dostęp z komputerów Laboratorium Spektrometrii Mas Wydziału Chemii UWr

(LW‐07)

Pozwala na analizę widm masowych zapisanych w formacie *.bafPo wala na anali ę widm masowych apisanych w formacie .baf


IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF

Każdy folder zawierający widma masowe oznaczony jest rozszerzeniem *.d

Wewnątrz możemy znaleźć następujące pliki:

Zawiera dane dotyczące

metody pomiaru

Główny plik zawierający

widmo masowe

Pliki pomocnicze



Aby otworzyć widmo masowe należy dwukrotnie kliknąć LP myszy na ikonie:

lub zaimportować dane bezpośrednio z poziomu programu uruchamiając go

z Paska programów:z Paska programów:

pojawi się okno startowe


pojawi się okno startowe…


…a następnie główne okno programu



…lub w wersji 4.0



Aby zaimportować widmo masowe klikamy FILE na pasku głównym:

Następnie OPEN:

I z odpowiedniego folderu wybieramyInteresujące nas widmo masowe:


PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE

Zaimportowane widmo masowe zarejestrowane na aparacie micrOTOF‐Q zapisane jest w formie chromatogramu:

Zależność prądu jonowego TIC (ang total ion current)Zależność prądu jonowego TIC (ang. total ion current) od czasu trwania pomiaru



Aby przekształcić chromatogram na uśrednione widmo masowe należy kursor myszy

ustawić na początku osi czasu w obszarze chromatogramu, a następnie trzymając wciśnięty

PP myszy przeciągnąć kursor do końca linii chromatogramu:

droga kursora myszydroga kursora myszy

Miejsce ustawienia kursora

i wciśnięcia PP myszy

Miejsce zwolnienia PP myszy


i wciśnięcia PP myszyy y


Pojawia się dodatkowe okno, w którym znajduje się uśrednione przez nas widmo masowe:



Aby móc przeprowadzić analizę na danym widmie masowym należy najpierw je skopiować.

W tym celu klikamy PP myszy w obszarze widma – pojawia się okno, w którym LP myszy

klikamy COPY TO COMPOUND MASS SPECTRA:



Nasze uśrednione widmo masowe zostało skopiowane:



W tej chwili w programie mamy otwarte cztery okna:

Chromatogram

Lista otwartych plików wraz

ze składowymi

Uśrednione widmo masowe

k i idSkopiowane widmo masowe



Do dalszej pracy zamykamy Chromatogram i Uśrednione widmo masowe:

KLIK



Tak powinno prezentować się główne okno programu:


ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA

Widmo masowe przedstawia zależność m/z czyli masy związku do jego ładunku (oś X) wraz

z intensywnością danego sygnału dla odpowiedniej wartości m/z (oś Y):

Intensywność

Wartości m/z



Na widmie obserwujemy wiele sygnałów (pików) pochodzących od jonów związków

o określonej wartości m/z:

Wartość m/z



Jednak obserwujemy również sygnały o niskiej intensywności, dla których nie ma

przypisanych wartości m/z. Aby je dokładnie obejrzeć musimy powiększyć obszary widma:

Sygnały o niskich yg yintensywnościach



W tym celu możemy skorzystać z narzędzia powiększania na dwa sposoby.

Kliknąć LP myszy w ikonę LUPY na pasku narzędzi – zmiana kursora na krzyżyk z lupą:



Przy pomocy tak zmienionego kursora z wciśniętym LP myszy otaczamy sygnał bądź obszar,

który chcemy powiększyć:



Po czym puszczamy LP myszy i otrzymujemy widmo powiększone w wybranym przez nas

zakresie:



Powiększanie możemy powtarzać wielokrotnie do odpowiadającej nam skali, jednak

za każdym razem należy na nowo uruchomić narzędzie LUPY przez jego zaznaczenie:

Wskazówka:Narzędzie lupy uruchomić można również

poprzez przytrzymanie lewego klawisza Shiftpoprzez przytrzymanie lewego klawisza Shift na klawiaturze. W momencie kiedy go trzymamy narzędzie działa i pozwala

na wielokrotne powiększanie.



Innym sposobem zmiany zakresu na widmie jest przesuwanie osi X.

Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym LP myszy przesuwać się będzie cały zakres:



Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym PP myszy będziemy rozszerzać dany zakres:



Aby powrócić do wcześniejszego widoku całego widma wystarczy w jego obszarze

dwukrotnie kliknąć LP myszy lub po wciśnięciu PP myszy wybrać z listy AUTO‐SCALING:



Wartości m/z podane są z dokładnością do miejsc dziesiętnych. Na takim sygnale ciężko

jest określić wartość ładunku, dlatego należy zwiększyć dokładność m/z.

W tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS a następnie zwiększamyW tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS…, a następnie zwiększamy

wartość w polu MASS PRECISION.

Wskazówka:Podając 3 miejsca ją j

po przecinku możemy poprawnie określić wartość ładunku w danym sygnale y yg

na widmie.



Na widmie masowym pojawiają się wartości z dokładnością do 3 miejsc po przecinku:


ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU

Wybierzmy jeden sygnał na widmie i przypiszmy mu ładunek:



Po powiększeniu danego piku obserwujemy:

Piki izotopowe

Pierwszy pik:

Piki izotopowe

y pPik monoizotopowy



Taki układ pików izotopowych, z których pierwszy pik monoizotopowy nie jest najbardziej intensywny, wskazuje na dużą cząsteczkę (najczęściej polipeptyd lub białko) bądź na układ zawierający dodatek izotopów pierwiastków, np. deuter.

Pierwszy pik:

Piki izotopowe

Pierwszy pik:Pik monoizotopowy



Na pierwszy rzut oka wydaje się, że kolejne piki izotopowe dzieli różnica 0,2. Aby to dokładnie sprawdzić wykorzystujemy narzędzie ANNOTATION >>> ANNOTATE.Przy kursorze pojawia się litera „A”.



Po ustawieniu kursora – trójkąt poniżej kursora, na odpowiednim piku i trzymając wciśnięty LP myszy przesuwamy go na kolejny pik. Po zwolnieniu LP myszy pojawia się wartość –różnica między kolejnymi pikami izotopowymi na widmie.



Wykonując tę czynność na wszystkich pikach uzyskujemy średnią wartość różnicy między pikami izotopowymi jako 0,200.



Aby wyłączyć narzędzie wchodzimy w ANNOTATION i odznaczamy ANNOTATE.

Innym sposobem na uruchamianie narzędzia ANNOTATEw trakcie analizy widma y p ę ymasowego jest wykorzystanie klawisza Alt na klawiaturze. Wciśnięcie i przytrzymanie powoduje aktywność funkcji ANNOTATE. Gdy puścimy klawisz Alt nadal możemy analizować widmo przy użyciu normalnego kursora.

Aby przypisać ładunek musimy widzieć, że różnica między pikami izotopowymi jest od niego ściśle zależna. I tak dla ładunku:

+1 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 1,000












Zatem w naszym przypadku skoro różnica wynosi 0,200 to sygnał odpowiada cząsteczce o ładunku 5+.



Innym sposobem przypisania ładunków sygnałom na widmie masowym jest wykorzystanie odpowiedniego narzędzia, który przypisuje te wartości w sposób automatyczny.W tym calu wchodzimy do zakładki DECONVOLUTE, a następnie PARAMETERS:



Wybieramy zakładkę MASS LIST a w niej typ Peak finder: SNAPNarzędzie to pozwala na przypisanie ładunku dla cząsteczek o naturalnym rozkładzie izotopowym (bez dodatków innych izotopów, np. deuteru).

Pozostawiamy wartości ustawionePozostawiamy wartości ustawione standardowo, jedynie w przypadku

Maximum charge state jeśli spodziewamy się że widmojeśli spodziewamy się, że widmo

masowe przedstawia dużą cząsteczkę wielokrotnie naładowaną, np. białko, warto zwiększyć tę wartość do np. 15.warto zwiększyć tę wartość do np. 15.

Zatwierdzamy parametry klikając OK.y p y ją



Aby wykonać dekonwolucję widma w celu przypisania ładunku w zakładce DECONVOLUTEklikamy w MASS SPECTRA lub wybieramy F4 na klawiaturze.

Po chwili na widmie pojawią się wartości ładunków, jeśli nie wchodzimy w zakładkę MASS LIST klikamy CLEAR a następnie FIND.



Narzędzie automatycznego przypisania ładunku pozwala na analizę całego widma masowego i oszacowanie ilości i rodzaju związków obecnych na widmie.



W tym przypadku mamy do czynienia z widmem masowym jednego związku o wysokiej masie cząsteczkowej ok. 4000 Da. Świadczy o tym charakterystyczna obwiednia, tj. seria sygnałów odpowiadających kolejnym ładunkom od 3+ do 7+.

Wskazówka:Taki układ pików na widmie jest j

charakterystyczny dla widm ESI dużych peptydów lub białek.


ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU

Mając przypisane ładunki do odpowiednich sygnałów na widmie oraz wiedząc, które z nich pochodzą od jednego związku możemy obliczyć średnią masę cząsteczkową.

k dl ś ł d kI tak dla wcześniej wyznaczonego ładunku 5+:Wartość piku monoizotopowego m/z wynosi 824.043Ładunek czyli z wynosi 5

Dla ogólnego równania: m/z = (Mcz+z)/zMcz = m/z*z – z

Zatem:Zatem:Mcz = 824.043*5 – 5 = 4115.215 Da

Aby wyznaczyć średniąmasę cząsteczkową należy obliczyćmasy dla poszczególnychAby wyznaczyć średnią masę cząsteczkową należy obliczyć masy dla poszczególnych ładunków, a następnie wyznaczyć średnią. I tak:

3+ 4115.229 Da3+ 4115.229 Da4+ 4115.220 Da5+ 4115.215 Da6+ 4115.220 Da


7+ 4115.216 Da Mśrednia = 4115.220 Da


Innym sposobem wyznaczania średnich mas cząsteczkowych, w przypadku widm ESI dla peptydów i białek, jest wykorzystanie wzoru:

p1 = (M + z)/z( )/( )p2 = (M + z‐1)/(z‐1)

gdzie: p – oznacza wartość m/z piku danego związku dla kolejnych ładunków

p1

p2



Wyznaczenie średniej masy cząsteczkowej można wykonać automatycznie w programie wybierając metodę dekonwolucji. Powoduje ona przekształcenie widma masowego z zależności od m/z na zależność od masy.

h d kł dkWchodzimy w zakładkę DECONVOLUTE >>> PARAMETERS

Następnie zakładkę CHARGE DECONVOLUTION i bi j MAXIMUM ENTROPYi wybieramy opcję MAXIMUM ENTROPY

Ustalamy zakres mas

Wskazówka:Wcześniejsze oszacowanie masy

na podstawie ładunku pozwoli na wybranie węższego zakresu mas, a co za tym idzie

szybszą dekonwolucję widma.

Z t i d OK


Zatwierdzamy OK.


Aby uruchomić dekonwolucję widma klikamy DECONVOLUTE >>> MASS SPECTRALub z klawiatury F4. Po przeliczeniu pojawia się nowe widmo masowe

d l ść d kprzedstawiające zależność od masy cząsteczkowej:



Po powiększeniu najwyższego sygnału możemy odczytać wartość masy cząsteczkowej:


Jednak wciąż mamy wiele wartości mas, które należy uśrednić.


Aby to zrobić wchodzimy w zakładkę PROCESS >>> SMOOTH MASS SPECTRUM

Narzędzie to służy do wygładzania widma tak, b ł d k ś d śaby tworzyło ono jeden pik o uśrednionej wartościmasy cząsteczkowej.Należy zmienić parametr SMOOTHING WIDTHd t ki j t ś i b id i i ć t lk j ddo takiej wartości, aby na widmie mieć tylko jeden poszerzony sygnał.Zwykle wystarczy już wartość 0.5.

Po zatwierdzeniu OKotrzymujemy wygładzone widmo.



Odczytujemy uśrednioną masę cząsteczkową:


ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE

Na widmie masowym oprócz sygnałów pochodzących od głównego związku obserwuje się także piki pochodzące od innych składników mieszaniny. Często są to zanieczyszczenia wynikające z użytych rozpuszczalników, bądź produkty uboczne wcześniejszych reakcji.

kl h k ś łó d h śćZwykle charakteryzują się one niższą intensywnością sygnałów na widmie – ich zawartość w analizowanej próbce jest mniejsza, bądź mają mniejszą zdolność do jonizacji.


ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE

Często obok pików, odpowiadających głównemu produktowi, znajdują się dodatkowe sygnały pochodzące od adduktów jonów sodu lub potasu do cząsteczki.

Na+ 23 DaK+ 39 Da

Należy pamiętać, że dodanie jonu metalu powoduje jonizację związku bez udziału H+.


ANALIZA WIDM MASOWYCH – INFORMACJE STRUKTURALNE

Typowe widmo ESI‐MS dostarcza informacji o rodzaju, wzorze sumarycznym i masie cząsteczkowej związku. Aby uzyskać informacje na temat jego struktury należy wykonać widma fragmentacyjne MS/MS.

d d ( ll d d d ) fPodstawowym typem są widma CID (ang. collision induced dissociation) – fragmentacji wywołanej zderzeniowo. W wyniku zderzeń obojętnego gazu z cząsteczkami analizowanej substancji, do których dochodzi w komorze kolizyjnej spektrometru mas, otrzymujemy h kt t idcharakterystyczne widmo masowe.



Fragmentacja związków metodą CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych z wcześniej wybranego przez nas jonu obserwowanego na widmie masowym.W wyniku fragmentacji dochodzi do rozerwania wiązań w cząsteczce z utworzeniem y g j ą ąodpowiednich jonów potomnych – fragmentów cząsteczki.

W przypadku peptydów i białek otrzymuje się następujące rodzaje fragmentów:



W przypadku peptydów i białek fragmentacja CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych określonego typu. W ich skład wchodzą reszty aminokwasowe o następujących masach monoizotopowych:


ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE

Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:

Jon prekursorowy



Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:

Jony fragmentacyjne



Możemy wyznaczyć ładunki dla odpowiednich fragmentów stosując wcześniej opisaną procedurę SNAP:



Wykorzystując narzędzie ANNOTATIONmożemy wyznaczyć rodzaje reszt aminokwasowych znajdujących się w łańcuchu. Wystarczy zmienić typ na:

Korzystając z wartości różnic odległości między sygnałamimożemy wyciągać wnioski d ś i b d kiodnośnie budowy cząsteczki

poddanej fragmentacji:

Ob t t t lObecne straty neutralne 17 Da oraz 18 Da.

Obecność resztObecność reszt aminokwasowych

Ala oraz Lys.



Przeprowadzenie analizy fragmentacyjnej pozwala na wyciągnięcie wielu wniosków

odnośnie budowy cząsteczki. Umożliwia m.in.:

określenie sekwencji aminokwasowej w peptydzie,

wskazanie miejsc modyfikacji,

d k kpotwierdzenie struktury związku,

wykrycie produktów ubocznych reakcji i ich zidentyfikowanie.

W zależności od rodzaju związku poddanego analizie otrzymuje się różnego rodzaju jony

fragmentacyjne często charakterystyczne dla danej grupyfragmentacyjne, często charakterystyczne dla danej grupy.

Analiza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzajuAnaliza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzaju

analizowanego związku.


WARUNKI ZALICZENIA

Wykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocyWykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocy programu Data Analysis przedstawione w formie sprawozdania pisemnego.

T i dd i d ń 7 d i d d t j ć l b t j hTermin oddania sprawozdań – 7 dni od daty zajęć laboratoryjnych

POWODZENIAPOWODZENIAPOWODZENIA POWODZENIA ☺☺


ANALIZA WIDM MASOWYCH - Uniwersytet Wrocławski

Documents

Transcript of ANALIZA WIDM MASOWYCH - Uniwersytet Wrocławski