Wyklad 9

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych

Globalny rynek enzymów

Wielkość rynku – około 3 mld $Tempo wzrostu – 12% rocznieIlość firm – około 400

Największe: Novozymes (Dania) 45%Danisco/Genecor (Dania/USA) 17%DSM (Holandia) 5%BASF (Niemcy) 4%

Sektory rynku enzymów: techniczny (63%), żywnościowy (31%), paszowy (6%)

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA


Podstawy Biotechnologii

Wytwarzanie enzymów

Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące sięwarunkami:

1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celówprzemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes)

2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości

Obecne tendencje w produkcji enzymów:

1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przezenzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkachnadprodukcji

2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojówekstremofilnych

3. Zastosowanie inżynierii białka – enzymy o zmienionych właściwościach



Izolacja enzymów ze źródeł naturalnych90% z bakterii i grzybów. Inne źródła: roślinne i zwierzęce

Enzymy izolowane z roślin Źródło Enzym Zastosowanie Fasola (Canavalia ensiformis) Owoce papaya (Carica papaya) Figi (Ficus carica) Ananas (Ananas comosus) Chrzan (Armoracia rusticana) Migdały (Amygdalus communis) Pszenica (Triticum aestivum) Jęczmień (Hordeum vulgare) Soja (Glycine max)

Ureaza Papaina Ficyna Bromelanina Peroksydaza β-glikozydaza Esteraza β-amylaza β-amylaza

Diagnostyka Piekarnictwo, mleczarstwo, garbarstwo, kruszenie mięsa, usuwanie zmętnienia piwa Kruszenie mięsa Piekarnictwo Diagnostyka Badania naukowe Hydroliza estrów i synteza Piekarnictwo, syropy maltozowej.w.

Enzymy izolowane z tkanek zwierzęcych

Źródło Enzym Cielęta, bydło rzeźne, owce, trzoda chlewna Jaja kurze Mocz

Diastaza (amylaza), esteraza, lipaza, pepsyna, trypsyna, fitaza, chymozyna (renina), fosfolipaza Lizozym Urokinaza



Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości, produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia Enzymy do celów technologicznych, wytwarzane w dużych ilościach (bulk)

Enzymy wysokiej czystości

Niewielki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki masy Surowe preparaty, często poniżej 10% białka Obecność innych enzymów Preparaty otrzymane w wyniku suszenia rozpyłowego lub stężone roztwory Brak stabilizatorów Niewiele etapów oczyszczania Próbki dostępne nieodpłatnie Minimalne zamówienie 1-2 kg

Wysoki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki aktywności enzymu Wysoka czystość, często powyżej 90% Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność określona ilościowo Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze siarczanu amonu Obecne stabilizatory Wiele etapów oczyszczania, w tym techniki chromatograficzne Brak takich próbek Szeroki zakres dostępnych ilości (poczynając od bardzo niewielkich)

Produkcja enzymów



Enzymy używane do celów przemysłowych

Bacillus subtillisAspergillus oryzae,

Aspergillus nigerBacillus amyloliquefaciensTrichoderma, AspergillusAspergillus nigerStreptomyces lividansA. oryzae, A. nigerBacillus lichenoformisAspergillusA. oryzae, A. nigerB. lichenoformisA. oryzae, A. nigerB. LichenoformisA. niger, B. lichenoformis

BacillusAspergillus

BacillusTrichoderma reeseiAspergillus nigerStreptomycesCandida, FusariumBacillusAspergillusAspergillusBacillusŻołądki cieląt, MucorBacillusActinomadura

Browarnictwo (B)Piekarnictwo (P), B, Przemysł skrobiowy (PS)PSP, B, przemysł detergentów (PD)PSPS – syropy wysokofruktozoweP, przemysł mleczarski (PM)Przemysł owocowo-warzywny (PO)POPrzemysł paszowyPDPMPSPrzemysł drzewny i tekstylny

Dekarboksylaza acetylomleczanowaAmylaza

AmylazaCelulazaGlukoamylazaIzomeraza glukozowaLipazaLiaza pektynowaPektynazaFitazaAlkaliczna proteazaKwaśna proteazaPululanazaKsylanaza

Producent ekspresyjnyPierwotny producent

ZastosowanieRodzaj enzymu



Ideowy schemat produkcji preparatów enzymatycznych



Dezintegracja komórek - problemy

Komórki zwierzęce – brak ściany; duże rozmiary; łatwość rozbiciaKomórki roślinne – ściana komórkowa (celuloza/ligniny/woski)

duże rozmiary; polifenole obecne w wakuolach Bakterie - sztywna ściana komórkowa + błona zewnętrzna (tylko Gram-);

niewielkie rozmiary; komórki sferyczne – szczególne problemykomórki rekombinowane – możliwe tworzenie ciał inkluzyjnych

Grzyby - bardzo sztywna ściana (chityna/glikan); aktywne enzymyproteolityczne

Problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmu w momencie rozbicia komórek; efekty cieplne związane z zastosowaniemmetod mechanicznych



Prasa Frencha

Zasada działania:

W wyniki parcia wywieranego na zawartość komory przez tłok naciskany za pośrednictwem prasy hydraulicznej, rośnie ciśnienie w komorze oraz ciśnienie wewnętrzne w komórkach. Podczas uwalniania zawartości komory przez wąską dyszę, następuje gwałtowny spadek ciśnienia w zawiesinie (na zewnątrz komórek) do atmosferycznego. Ciśnienie wewnątrzkomórkowe także spada, ale wolniej. W efekcie, gradient ciśnienia po dwóch stronach błony cytoplazmatycznejpowoduje jej pęknięcie, a w efekcie uwolnienie cytoplazmy.



Zatężanie roztworów białek

- w wyniku dodania do roztworu ziaren suchego, porowatego polimeru. Wielkość porów musi być tak dobrana, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek (Sephadex G-25, glikol polietylenowy - PEG);

-w wyniku usunięcia nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek poprzez dyfuzję przez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja, dializa wobec suchego Sephadex-u lub PEG);

-w wyniku usunięcia wody w niskiej temperaturze pod zmniejszonym ciśnieniem (liofilizacja);

- poprzez wytrącenie białka z roztworu (wysalanie, dodanie rozpuszczalnika organicznego i rozpuszczenie osadu w mniejszej objętości roztworu wodnego)

- poprzez oddzielne białka wytraconego w postaci ciał inkluzyjnych i jego naturację



Naturacja białek z ciał inkluzyjnych

Problem tworzeniaagregatów podczasfałdowania białek

Mogą się tworzyćw bakteryjnychsystemach ekspresji

1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie wroztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa



Wytrącanie białek

Wytrącanie poprzez wysalanie

Wytrącanie poprzez dodatek rozpuszczalnika organicznego

Białka są wytrącane w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą, niedenaturującychrozpuszczalników organicznych.Najczęściej stosowane: aceton, etanol, rzadziej eter dietylowyOperacje prowadzi się w temperaturach poniżej 0° C.

Wytrącanie poprzez zmianę pH roztworu



Chromatograficzne metody separacji białekPodstawą separacji są różnice we właściwościach fizykochemicznych białek:

polarność chromatografia adsorpcyjnachromatografia hydrofobowa

charakter jonowy chromatografia jonowymiennachromatoogniskowanie

rozmiary cząsteczki chromatografia rozmiarów wykluczającychaktywność biologiczna chromatografia powinowactwa

W oczyszczaniu białek stosuje się techniki chromatograficznenisko-, średnio- i wysokociśnieniowe.

LPLC < 5 bar

MPLC 6 – 50 bar

HPLC > 50 bar

1 bar = 0.1 MPa



Materiały stosowane jako nośniki (matryce) dla złóż chromatograficznych wykorzystywanych dla oczyszczania białek

tylko zawiesina

j.w.

2 – 12

2 – 12

3 - 14

2 – 14

2 – 11

bez ograniczeń

epichlorohydryna

epichlorohydryna

2,3-dibromopropanol

kopolimer dekstranu I agarozy

produkt polikondensacji

diwinylobenzen

Celuloza

Dekstran

Agaroza

Sepharose

Poliakrylamid

Polistyren

UwagiZakres stabilności (pH)Czynnik sieciującylub skład kopolimeru

Matryca



Chromatografia jonowymienna białek

Rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony)kationity (wymieniają kationy)



Chromatografia adsorpcyjna

Hydroksyapatyt: Ca10(PO4)6(OH)2- krystaliczny- sferoidalny- ceramiczny

Mechanizm adsorpcji: Wiązanie na powierzchni złoża, w którym uczestniczą jony Ca(II) i fosforanowe złoża oraz naładowane grupy funkcyjnebiałek

Warunki adsorpcji: bufor fosforanowy Na/K (<20 mM)pH obojętne

Warunki elucji: rosnący gradient skokowy lub ciągły buforu fosforanowego (zwykle 10 – 500 mM)



Chromatografia hydrofobowaInertne matryce funkcionalizowane grupami arylowymi lub alkilowymi.Matryce podstawione grupami alkilowymi są ogólnie bardziej hydrofobowe, niż matryce podstawione grupami arylowymi

Mechanizm wiązania białek: wykorzystuje się obecność domen hydrofobowych na powierzchni cząsteczek białka; siła napędowa – wzrostentropii układu; jest potęgowana w roztworach o dużej sile jonowej.

Złoża do chromatografii hydrofobowej FPLC

Parametry próbki nanoszonej na kolumnę:środowisko buforu o dużej sile jonowej;

Elucja: a/ bufor o zmniejszającej się sile jonowej;b/ gradient rozpuszczalnika organicznego(alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne) lubdetergentu niejonowego, np. Triton X-100



Chromatografia rozmiarów wykluczających

Zasada: Porowate ziarna złoża z materiału całkowicie inertnego (Sephadex,Sepharose, Superose, Superdex, poliakrylamid. Pory w ziarnach o kontrolowanej średnicy. Cząsteczki białek, w zależności od swoich rozmiarów wnikają do porów

(są zatrzymywane) lub przepływają obok.



Chromatografia powinowactwaPodstawą separacji są wysoce selektywne, specyficzne oddziaływania białko: ligand związany trwale ze złożem.

Ligandem może być np.: analog substratu, koenzymu, inhibitor kompetytywny, inhibitor allosteryczny.

Istnieje możliwość indywidualnego zaprojektowania i otrzymania złoża specyficznego wobec danego białkalub zakupu jednego z kilkuset komercyjnie dostępnych złóż o różnej specyficzności.

W niektórych przypadkach możliwe efektywne oczyszczenie białka w jednym etapie.



Schemat granulatora do otrzymywania granulatów enzymatycznych



Etapy procesu wytwarzania enzymu przemysłowego



Schemat biosyntezy enzymów przemysłowych



Rodzaje białek terapeutycznych- białka stymulujące powstawanie komórek krwi- czynniki krzepliwości krwi i białka trombolityczne- interferony i cytokiny- hormony- enzymy- przeciwciała i ich pochodne- szczepionki (podjednostkowe)

Białka należące do czterech pierwszych grup można izolować ze źródeł naturalnych:krew ludzka i zwierzęca, organy zwierzęce. Wady – możliwość przenoszenia czynników infekcyjnych (wirus HIV, priony), ograniczony dostęp do zasobów

Obecnie wszystkie w/w białka są wytwarzane jako białka rekombinowane- produkty heterologicznej ekspresji genów kodujących białka ludzkie i znakomita ich większość jest w swojej ostatecznej postaci identyczna bądź też prawie identyczna z białkami występującymi w organizmie zdrowego człowieka lub z ich fragmentami.



Białka terapeutyczne - przykłady

Białka stymulujące powstawanie komórek krwiErytropoetyna

Etapy ERYTROPOEZY

a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO) d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki



Białka terapeutyczne - przykładyBiałka stymulujące powstawanie komórek krwi

ErytropoetynaLudzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem• sekwencji aminokwasów, • pozycji 2 mostków disiarczkowych, • 4 miejsc glikozylacji,• struktury drugorzędowej.

Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa cząsteczkowa - 30,4 kDa.

Białko zbudowane jest z 4 alfa-helis, które tworzą ścisłą pofałdowana strukturę białka.

Rekombinowane produkty nie różnią się pod względem budowy, można jednak zauważyć ilościowe różnice w glikozylacji.



Białka terapeutyczne - przykładyBiałka stymulujące powstawanie komórek krwi

ErytropoetynaKomórki ssaków transfekowanegenem EPO

Produkcja EPO rekombinowanejgenetycznie (rHu-EPO) in vitro

Komórki jajnika chińskiego chomika (CHO) są obecnie najbardziej powszechnie używane do produkcji rHu-EPO w skali przemysłowej.

rHu-EPO z całkowitą aktywnością biologiczną in vivo może być również otrzymywana z innych kultur komórek ssaków modyfikowanych genetycznie, takich jak komórki nerek młodych chomików BHK-21, albo komórki sutka myszy C127.



Białka terapeutyczne – przykładyHormony

InsulinaProdukowana w trzustce przez komórki β wysp trzustkowych

hormon o strukturze małego białka

Insulina obniża poziom glukozy we krwi, zwiększa zawartośćglikogenu w wątrobie, wzmaga biosyntezę aminokwasów, białek oraz kwasów tłuszczowych, wpływa na wnikanie glukozy do komórek mięśni i tkanki tłuszczowej

Cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów peptydowych A i B, połączonych ze sobą dwoma mostkami disiarczkowymi. ŁańcuchA zawiera 21, a łańcuch B 30 reszt aminokwasowych (w sumie 51reszt aminokwasowych)



Insulina

Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast ThrCzęściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana



Gensulin (BIOTON)

Konstrukcja genu: sekwencja kodująca: Peptyd B-Lys-Arg-Peptyd A-Lys-peptyd nośnikowy

Ekspresja w Escherichia coliProdukt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnychEtapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacjaPółprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymiObróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem AOczyszczanie: chromatografia kolumnowaDalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazyProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacjaProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%



Wytwarzanie przeciwciał i leków opartych na przeciwciałach

Podstawowa struktura immunoglobuliny G (IgG)H – łańcuchy ciężkie; L – łańcuchy lekkie; Fab – region wiążący antygen; Fc – region krystalizowalny

Dwa główne typy odpowiedziimmunologicznej:

a/ odpowiedź humoralna –główny element: limfocyty Bb/ odpowiedź komórkowa –główny element: limfocyty T

Przeciwciała wytwarzane są przez limfocyty B

Struktura immunoglobuliny typu GVH, VL – domeny zmienne; CH1, CH2, CH3 – domeny stałe

Model struktury przestrzennej IgG



Produkcja przeciwciał przez organizm immunizowany antygenem



Przeciwciało monoklonalne – przeciwciało specyficzne wobec danego antygenu, o zdefiniowanej sekwencji łańcuchów polipeptydowych; wytwarzane przez komórkiklonalne (jednego genotypu) w hodowli tkankowej

Przeciwciała poliklonalne – zestaw przeciwciał monoklonalnych wiążących dany antygen, wytwarzanych przez immunizowany organizm zwierzęcy



ZASTOSOWANIA PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH

A. Oczyszczanie biomolekuł1. Immunochromatografia2. Immunoprecypitacja

B. Zastosowania diagnostyczne3. Testy ELISA4. Immunocytochemia5. Mikroskopia transmisyjna i konfokalna

C. Zastosowania terapeutyczne6. Immunotoksyny – chemoterapia przeciwnowotworowa7. Immunosupresja



Przeciwciało (immunoglobulina)Przeciwciało (immunoglobulina)

Przeciwciałem nazywa się specyficzny rodzaj Przeciwciałem nazywa się specyficzny rodzaj białekbiałek wydzielanych przez wydzielanych przez komórki komórki plazmatyczneplazmatyczne (czyli pobudzone (czyli pobudzone limfocyty Blimfocyty B) w ) w przebiegu przebiegu odpowiedzi immunologicznejodpowiedzi immunologicznej, które , które mają zdolność do swoistego rozpoznawania mają zdolność do swoistego rozpoznawania antygenówantygenów. .



Kompozycja przeciwciał stosowanych jako leki

Przeciwciała chimeryczneprodukty genów rekombinowanych kodujących regiony zmienne mysich i regiony stałe ludzkich przeciwciał;Przeciwciała humanizowaneregiony CDR mysie + reszta ludzka

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii


Humanizowane przeciwciała Humanizowane przeciwciała -- lekileki

TrastuzumabTrastuzumab ((HerceptinHerceptin)) –– lek, lek, w którym substancją czynną jest w którym substancją czynną jest przeciwciało humanizowane przeciwciało humanizowane skierowane przeciwko receptorom skierowane przeciwko receptorom HER2 (naskórkowy czynnik wzrostu). HER2 (naskórkowy czynnik wzrostu). Skuteczny w leczeniu nowotworu Skuteczny w leczeniu nowotworu płuc. płuc.

AlemtuzumabAlemtuzumab ((CampathCampath)) –– lek, w którym lek, w którym substancją czynną jest humanizowane substancją czynną jest humanizowane ludzkie przeciwciało monoklonalne ludzkie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko glikoproteinom CD52 skierowane przeciwko glikoproteinom CD52 obecnym na powierzchni limfocytów. obecnym na powierzchni limfocytów. Skuteczny w leczeniu białaczki limfocytowej.Skuteczny w leczeniu białaczki limfocytowej.



Immunotoksyny - leki

GemtuzumabGemtuzumab ((MylotargMylotarg)) –– lek, w którym substancją czynną lek, w którym substancją czynną jest przeciwciało połączone z substancją antybiotyczną jest przeciwciało połączone z substancją antybiotyczną ––kalichemicynąkalichemicyną ((oligosacharydoligosacharyd tworzącytworzący dwuniciowe dwuniciowe pęknięcia w DNA), wiążące się z glikoproteiną CD33. pęknięcia w DNA), wiążące się z glikoproteiną CD33. Skuteczny w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.Skuteczny w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.

Ibritumomab TiuxetanIbritumomab Tiuxetan ((ZevalinZevalin). ). ImmunokoniugatImmunokoniugat mysiego mysiego przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni zmienionych nowotworowo limfocytów B zzmienionych nowotworowo limfocytów B z tiuksetanemtiuksetanem, , selektywnym selektywnym chelatoremchelatorem InduIndu--111 oraz Itru111 oraz Itru--90.90.Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu o radioaktywne izotopy.o radioaktywne izotopy.



Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciukomórek hybrydowych



Hodowle tkankowe komórek ssaczych

Sposoby prowadzenia hodowli komórek ssaków




Hodowla komórkowa w butelkach obracanych (roller bottles)

Hodowla komórkowa na tacach w komorach inkubacyjnych




Trójstopniowa instalacja przemysłowa do hodowli komórkowych




Reaktory typu air-lift – szczególnie przydatne do przemysłowejhodowli komórek ssaczych



Etapy procesu otrzymywania immunobiofarmaceutyku



Enzymy stosowane w przemyśle skrobiowym

Etapy produkcji amylazy

1. Fermentacja Aspergillus awamori2. Ekstrakcja wodą podłoża z grzybnią3. Wytrącenie etanolem z 0,2% CaCl2, 5°C4. Odwirowanie osadu, przemycie etanolem5. Suszenie próżniowe do 90% s.m.6. Zmielenie, dodanie wypełniacza

Skrobia

Zawiesina skrobi

woda

Upłynnianie

Para wodna α-amylaza

Maltodekstryny

Scukrzanie

Glukoamylaza/pululanaza

Izomeryzacja

Syrop maltozowySyrop glukozowy

Izomeraza glukozowa

Syrop fruktozowy

Rafinacja

Oczyszczanie

Syrop rafinowany

Syrop oczyszczony

Mieszanie

Materiał roś linny

Termostabilne amylazy – możliwośćdziałania w temperaturze bliskiej 100 °C

Produkcja izomerazy glukozowej

1. Fermentacja Bacillus lub Streptomyces2. Odwirowanie lub filtracja3. Rozbicie komórek4. Odwirowanie osadu5. Wytrącenie enzymu z roztworu6. ImmobilizacjaSchemat enzymatycznego rozkłądu skrobi

Wyklad 9

Documents

Transcript of Wyklad 9