Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe...

Wybrane substancje:

znaczenie dla organizmu

oraz możliwe zastosowania

Wybrane substancje:

znaczenie dla organizmu

oraz możliwe zastosowania

Redakcja:

Monika Olszówka

Kamil Maciąg

Lublin 2015

Recenzenci:

dr Artur Banach

dr n. med. Anna Irzmańska-Hudziak

dr Monika Jach

dr hab. Andrzej Junkuszew

dr hab. n. med. Tomasz Kocki

dr hab. inż. prof. WSOSP Grzegorz Koralewski

dr Konrad Kubiński

dr n. med. Marta Łuczyk

dr Maciej Masłyk

dr Anna Pytlak

dr Anna Szafranek-Nakonieczna

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie:

Ilona Żuchowska

Projekt okładki:

Agnieszka Ciurysek

© Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ISBN 978-83-65272-02-7

Wydawca:

Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL

ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin

www.fundacja-tygiel.pl

5

Spis treści

Joanna J. Sajkowska, Paweł Kozielewicz, Katarzyna Paradowska

Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów ................... 7

Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda

Antynowotworowe właściwości witaminy D3 ........................................... 27

Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda

Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel

w terapii nowotworów ............................................................................... 41

Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz

Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach .................. 51

Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke Maciej Gawroński

TNF-α – budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych

oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych ........................ 61

Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz

Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach .............................................. 70

Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka

Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne

w diagnostyce infekcji wirusowych? ......................................................... 84

Anna Machnikowska, Aleksandra Jarosz, Lidia Kotuła

Możliwości farmakologiczne w zaburzeniach syntezy neuroprzekaźników

w autyzmie ................................................................................................ 94

Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz

Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki

i leczenia chorób ..................................................................................... 103

Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła

Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne ........................... 121

Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka,

Krzysztof Grzywnowicz

Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic ...................... 132

Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając

Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących

na terenie polskich lasów ........................................................................ 144

6

Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz

Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich ............................. 156

Blanka Bukowska

Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia:

problemy pediatryczne u psów ................................................................ 170

Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka

Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej ....................... 179

Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk

Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych ...................... 194

Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa

Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały ... 208

Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja

Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji

komórek śródbłonka ................................................................................ 225

7

Joanna J. Sajkowska1, Paweł Kozielewicz

2, Katarzyna Paradowska

3

Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy

D i jej niedoborów

Opublikowane w ostatnich latach prace sugerują, że niedobory witaminy D mają nie tylko negatywny wpływ na układ mięśniowo-szkieletowy,

ale również są czynnikiem współtowarzyszącym wielu chorobom

m.in. sercowo-naczyniowym, autoimmunologicznym, kilku rodzajom

nowotworów, cukrzycy typu 1 oraz zaburzeniom psychicznym. Badanie poziomu witaminy D nie jest przeprowadzane rutynowo. Ponadto

świadomość społeczeństwa na temat tej molekuły jest niewystarczająca.

Wydaje się, iż działania podejmowane przez środowiska naukowe powinny

skutkować lepszym poznaniem obszarów i skutków działania witaminy D.

1. Wprowadzenie

Historycznie witamina D kojarzona była głównie z prewencją chorób

szkieletu i wpływem na gospodarkę wapnia i fosforu. Liczne badania

naukowe ostatnich lat wskazują na obecność receptora dla witaminy

D (VDR) w różnych komórkach poza układem mięśniowo-szkieletowym,

m.in. miocytach, śródbłonka naczyniowego, β-trzustki, neuronach i układu

immunologicznego. Z roku na rok przybywa doniesień literaturowych

ukazujących potencjalnie niekorzystny wpływ hipowitaminozy D

na rozwój chorób układu sercowo-naczyniowego, zespołu metabolicznego

czy depresji [1-4]. Obecnie w wielu jednostkach naukowych na świecie

trwają badania eksperymentalne nad skutecznością witaminy D i jej

analogów w leczeniu m.in. wyżej wymienionych schorzeń.

Pierwsze naukowe doniesienia dotyczące witaminy D datowane

są na XVII wiek. Jednak przełom w badaniach nad jej poznaniem przypadł

na wiek XX, kiedy to amerykański uczony Elmer V. McCollum odkrył

w tranie frakcję odpowiedzialną za działanie przeciwkrzywicze i nazwał

ją witaminą D (była to czwarta w kolejności odkryta witamina).

Na Uniwersytecie w Göttingen w Niemczech w laboratorium profesora

Adolfa Windausa określono chemiczną strukturę molekuły i niedługo

potem na rynek farmaceutyczny została wprowadzona jej syntetyczna

1 [email protected], Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 [email protected], School of Clinical and Experimental Medicine, College

of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham 3 [email protected], Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska

8

forma [5]. Od lat 70-tych obserwowany jest intensywny rozwój badań

nad witaminą D. Coraz więcej wiemy na temat mnogości kierunków

jej działania oraz skutkach niedoborów. Według bazy Web of Science

na temat witaminy D w 1985 roku ukazało się 856 prac, z czego jedynie

9% stanowiły artykuły przeglądowe. W 2013 roku ogólna liczba prac

odnoszących się do witaminy D wynosiła 9357, w tym 1056 przeglądowych

(Wykres [1]). Zainteresowanie molekułą jest duże i ciągle rośnie, podobnie

jak nadzieje na to, że dzięki lepszemu poznaniu samej witaminy D możliwe

będzie skuteczniejsze prowadzenie farmakoterapii wielu chorób

o charakterze zarówno ostrym czy przewlekłym.

Hasło "vitamin D" w bazie Web of Science

rok

liczb

a p

ub

likacji

1985 1995 2009 2011 201380

1080

2080

3080

4080

5080

6080

7080

8080

9080

10080

wszystkie artykuły prace przeglądowe

Wykres 1. Występowanie hasła ”vitamin D” w bazie Web of Science [opracowanie własne]

2. Witamina D i jej niedobory – bieżący stan wiedzy

Około 2,5 tysiąca dorosłych osób (2091 kobiet, 596 mężczyzn) wzięło

udział w pierwszej części Ogólnopolskiego Programu Bezpłatnych Badań

Poziomu Witaminy D przeprowadzonej na przełomie lutego i marca

2014 roku w 10 miastach Polski. Jedynie 8,4% osób miało optymalne

stężenie, czyli 30-50 ng/ml 25(OH)D we krwi. Ponad 90% dorosłych

Polaków charakteryzował zbyt niski poziom witaminy D [6]. Wyniki

otrzymane przez profesora Płudowskiego i współpracowników są zgodne

z danymi dla innych społeczeństw europejskich oraz amerykańskich.

Pod koniec 2007 roku amerykański tygodnik TIME na liście dziesięciu

najważniejszych (Top Ten) „przełomów medycznych” roku umieścił

„korzyści z witaminy D”. W chwili obecnej zasadne wydaje się prowa-

dzenie profilaktyki zdrowia z uwzględnieniem aktualnego stanu wiedzy na

temat metabolizmu i działania witaminy D, zwłaszcza że wykracza on

Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów

9

znacznie poza gospodarkę kostno-mineralną. Z roku na rok przybywa

opinii eksperckich podkreślających, iż zapewnienie właściwego

zaopatrzenia organizmu człowieka w witaminę D powinno zredukować

częstość występowania wielu powszechnych stanów patologicznych.

Tabela 1. Przykłady badań dokumentujących związek pomiędzy stężeniem 25(OH)D

a optymalizacją stanu zdrowia [7]

Badany efekt Typ badania Badane stężenie

25(OH)D Wynik

Piśmienn

ictwo

Wystąpienie

raka piersi

Meta-analiza 5

przypadków

30 ng/ml vs 10

ng/ml

Iloraz

szans =

0.44

[8]

Nowotwór

jelita grubego

Meta-analiza

10

przypadków i

badanie

kohortowe

30 ng/ml vs 5

ng/ml

Iloraz

szans =

0.40

[9]

Choroby

układu

krążenia

Badania

prospektywne

30 ng/ml vs <

15 ng/ml

Hazard

względny

= 1.62

[1]

Choroby

układu

krążenia

Meta-analiza

badań

prospektywny

ch

Najniższe vs

najwyższe

Ryzyko

względne

= 1.86

[10]

Cukrzyca typu

II

Meta-analiza

badań

prospektywny

ch

>25 ng/ml vs

< 14 ng/ml

Iloraz

ryzyka =

0.57

[3]

Cukrzyca typu

II

Obserwacyjne

badania

prospektywne

30.1 ng/ml vs

12.8 ng/ml

Hazard

względny

= 0.72

[11]

Zaburzenie

funkcji

poznawczych

Kobiety

powyżej 70.

roku życia

< 10 ng/ml vs >

30 ng/ml

Iloraz

szans =

1.60

[12]

Spadek

funkcji

poznawczych

Kobiety

powyżej 70.

roku życia

< 10 ng/ml vs >

30 ng/ml

Iloraz

szans =

1.58

[12]

Zakażenia

dróg

oddechowych,

ostre

wirusowe

Zakażenie

jesienne i

zimowe

>38 ng/ml vs

< 38 ng/ml

Ryzykowe

względne

= 0.51

[13]


10

2.1. Drogi zaopatrzenia organizmu człowieka w witaminę D

Jak wiadomo organizm człowieka otrzymuje witaminę D z dwóch źródeł:

z absorpcji jelitowej oraz z syntezy skórnej. W wyniku działania obydwu

procesów w układzie krążenia pojawia się witamina D, która

po przekształceniu w aktywną formę 1,25(OH)2D (kalcytriol, 1,25-dihy-

droksywitamina D) wykazuje różnokierunkowe działanie biologiczne [7, 14].

2.1.1. Źródła witaminy D

Ze wszystkich naturalnych źródeł witaminy D najbogatszym jest mięso

ryb i tran. Jednostką międzynarodową (IU) witaminy D jest 0,025 mg

czystego kalcyferolu [14]. W zależności od pochodzenia tran może

zawierać od 100 IU (z soli szarej) do 4 500 000 IU/100 g (w przypadku

tuńczyka). Znacznie mniej witaminy D występuje w mięsie wieprzowym,

żółtku jaja kurzego, żółtym serze lub w mleku matki (1,5-8 IU/100 ml)

Tabela [2].

Tabela 2. Zawartość witaminy D w niektórych surowych produktach żywnościowych [7, 15]

Nazwa produktu Zawartość witaminy D [IU/100 g]

Węgorz 1024

Sandacz 984

Śledź 616

Łosoś 496

Żółtko jajka 312

Dorsz 280

Mięso wieprzowe 80

Wątróbka, wołowina 32

Żółtko jaja kurzego 20-50

Masło 12

Żółty ser 7-28

Działaniem podejmowanym w obecnym czasie, mającym na celu

zapobieganie wystąpienia ewentualnych niedoborów witaminy D, jest

uzupełnianie w nią niektórych produktów spożywczych. W Polsce

w witaminy A i D obligatoryjnie wzbogacane są margaryny oraz odżywki

dla dzieci i niemowląt. W innych krajach europejskich dodatkowo płatki

śniadaniowe. W Stanach Zjednoczonych wśród tych produktów są: mleko

i jogurty, płatki śniadaniowe, soki pomarańczowe oraz margaryny.


11

2.1.2. Absorpcja jelitowa witaminy D

Witamina D należy do związków rozpuszczalnych w tłuszczach, wobec

czego przyswajanie jej po podaniu drogą doustną jest możliwe dzięki

dyspersji w wodnej treści jelita. Proces ten zachodzi dzięki występującym

w przewodzie pokarmowym człowieka naturalnym detergentom jakimi

są kwasy żółciowe. Tworzą one struktury micelarne, co ułatwia rozpuszczanie

związków niepolarnych, takich jak cholesterol lub witaminy A, D, E i K.

Analizując mechanizm absorpcji jelitowej witaminy D, widać,

iż podstawowym warunkiem, od którego zależy wydajność tego procesu,

jest obecność żółci w przewodzie pokarmowym. Jej brak w jelicie cienkim

spowodowany różnego rodzaju zaburzeniami (m.in. wydzielania,

dyskinezami dróg żółciowych, resekcją fragmentu jelita), tak jak dieta

niskotłuszczowa, skutkuje zanikiem absorpcji witaminy D [16].

Przesadna ilość tłuszczów w pokarmie również może mieć negatywny

wpływ na sprawność opisywanego procesu. Powstające w wyniku działania

lipaz kwasy tłuszczowe dostają się do wnętrza miceli zwiększając

rozpuszczalność witaminy D. To powoduje, iż nie przechodzi ona do błon

komórkowych. Ponadto zbyt duże micele trudniej migrują do komórek

jelita [16, 17].

Po dostaniu się do wnętrza enterocytu witamina D zostaje włączona

do powstających tam chylomikronów (dużych lipoprotein o kulistej

budowie), po czym razem z nimi przemieszcza się do strumienia limfy.

W przewodach limfatycznych 90% witaminy D nadal jest związane

z frakcją chylomikronową, 9,5% z białkową, jedynie około 0,5%

z lipoproteinami niskiej (LDL) i wysokiej gęstości (HDL). Tuż po

zmieszaniu się limfy z krwią pod wpływem działania lipazy chylomikrony

rozpadają się, witamina D transportowana jest do frakcji białkowej

surowicy i równocześnie powstają tzw. Resztki chylomikronów. Na skutek

tego około 40% podanej puli witaminy D związane jest z białkami –

głównie α-globulinami, a pozostała część z lipoproteinami wywodzącymi

się z resztek chylomikronów [17].

Witamina D stosunkowo krótko przebywa w krwioobiegu, skąd

przechodzi do wątroby, gdzie podlega procesom aktywacji lub magazy-

nowana jest w tkance tłuszczowej [18].


12

2.1.3. Skórna synteza witaminy D

Rys. 1. Budowa skóry (zmodyfikowano wg [19])

Naturalnym i bezpiecznym źródłem witaminy D dla człowieka jest

jej synteza skórna zachodząca pod wpływem promieniowania UVB (290-

315 nm). W szlaku tych przemian biochemicznych prekursorem witaminy

D jest czteropierścieniowy związek steroidowy: 7-dehydrocholesterol

(7DHC). Prewitamina D występuje głównie w warstwie kolczystej

i podstawnej naskórka, mniejsze zasoby znajdują się w zewnętrznych

warstwach naskórka czy skórze właściwej (Rysunek [1]) [14, 15, 18].

Biosynteza przebiega w dwóch etapach. W pierwszym zachodzącym

na skutek działania promieniowania po zaabsorbowaniu fotonu dochodzi

do pęknięcia pierścienia B między węglami C9 i C10, w efekcie powstaje

pochodna 6,7-cis-heksatrienowa, czyli prewitamina D (Rysunek [2]).

Następnie pod wpływem temperatury ciała w ciągu kilku godzin ulega

izomeryzacji w 5,6-cis-izomer – witaminę D (Rysunek [3]) [14].

Rys. 2. Fotoizomeryzacja 7-dehydrocholesterolu do prewitaminy D3 [opracowanie własne]


13

Rys. 3. Izomeryzacja prewitaminy D3 do witaminy D3 [opracowanie własne]

Witamina D, która powstaje w głębszych warstwach naskórka

w sąsiedztwie naczyń krwionośnych i limfatycznych, przyłączana jest

do białka wiążącego witaminę D (DBP) znajdującego się we krwi.

W tej postaci przebywa w układzie krążenia, skąd pobierana jest przez

wątrobę, gdzie podlega procesowi przekształcenia w 25-hydroksywitaminę

D (25(OH)D), po czym ponownie trafia do krwi i w kompleksie

z DBP transportowana jest do nerek, w których zachodzą kolejne etapy

jej metabolizmu.

Prekursory i produkty uboczne biosyntezy witaminy D charakteryzują się

niewielkim powinowactwem do DBP, tak więc w organizmie człowieka

występuje specyficzna translokacja powstającej witaminy przez białko

wiążące. Zgodnie z regułą przekory Le Chateliera-Brauna usuwanie

produktu reakcji ze środowiska skóry do układu krążenia napędza tworzenie

kolejnych cząsteczek witaminy D z powstałej wcześniej prewitaminy.

Sposób transportu witaminy D pobranej drogą absorpcji jelitowej

i otrzymanej w wyniku syntezy skórnej istotnie się różni. Witamina

D związana z resztkami chylomikronów wychwytywana jest przez wątrobę

znacznie szybciej niż ta występująca w kompleksie z DBP, aczkolwiek

wydajność przekształcenia w 25(OH)D z drugiego substratu jest większa.

Pobudzenie biosyntezy skórnej witaminy D skutkuje łagodniejszym

wzrostem stężenia 25(OH)D w układzie krążenia niż po wprowadzenie

do krwi tej samej dawki witaminy D drogą absorpcji jelitowej.

http://pl.wikipedia.org/wiki/Henri_Louis_Le_Chatelier

http://pl.wikipedia.org/wiki/Karl_Ferdinand_Braun


14

Rys. 4. Witamina D: skórna synteza, metabolizm i jeden ze szlaków jej dezaktywacji

(zmod. [20])

Wytwarzanie w szlaku biosyntezy witaminy D też jej nieaktywnych

metabolitów (tachysterol i lumisterol) skutkuje tym, że nawet przy zbyt

długiej ekspozycji na światło słoneczne, nie pojawia się ryzyko

przedawkowania [21].

Jednym z głównych czynników wpływających na ilość powstającej

w skórze witaminy D jest długość fal padającego promieniowania UVB.

Z największą intensywnością proces ten zachodzi przy fali o długości

295 ± 2 nm, zaś przy równej 320 nm jego szybkość spada do zera.

Promieniowanie o długości fali 260 nm indukuje powstawanie

największych ilości tachysterolu, zaś 310 nm – lumisterolu [21]. Pracujące

w Polsce solaria zazwyczaj wyposażone są w lampy emitujące promie-

niowanie powyżej zakresu 290-310 nm, a więc promieniowanie UVA,

które zamiast syntezy witaminy D doprowadza do jej rozkładu [15].

Kolejnym ważnym czynnikiem wpływającym na biosyntezę witaminy D

jest czas naświetlania. Już po 10-15 minutach zawartość Prewitamina D

osiąga swoje maksimum (około 20% wyjściowej ilości 7DHC), po czym

znacznie się obniża. Zatem w celu zaopatrzenia organizmu w odpowiednio

dużą dawkę witaminy D, powinno się zrezygnować z długich ekspozycji na

słońce, co ma miejsce zwłaszcza w czasie letniego wypoczynku.

Znaczenie mają również: pora roku, stosowanie filtrów przeciw-

słonecznych (krem z filtrem nr 15 zmniejsza skórną syntezę o 99,9%),

grubość warstwy ozonowej (absorbuje UVB) stopień zanieczyszczenia

powietrza, szerokość geograficzna, ubranie, wiek (wraz z wiekiem zmniejsza


15

się zawartość 7DHC w keranocytach) oraz intensywność pigmentacji.

Obecność melaniny pochłaniającej promieniowanie ultrafioletowe sprawia,

że u osób z fenotypem skóry VI (ciemnobrązowa lub czarna skóra)

wymagana jest 6-krotnie większa dawka naświetlania niż u przedstawicieli

fenotypów I-III (skóra biała), aby stężenie witaminy D we krwi było

podobne (wydajność jej syntezy jest odwrotnie proporcjonalna do

zawartości melaniny). Dla skóry o jasnej karnacji maksymalne stężenie

Prewitamina D osiągane jest na równiku po 15-30 minutach, zaś na

wysokości Bostonu (południk 42,2ºN) po 30-60 minutach. Należy

podkreślić, iż nadmiernie intensywne naświetlanie nie ma korzystnego

wpływu na poziom zaopatrzenia organizmu w witaminę D i dodatkowo

zwiększa ryzyko powstania nowotworów skóry. Zaleca się zatem krótkie,

regularne ekspozycje na działanie światła słonecznego, najbardziej skuteczne

również z punktu widzenia wydajności biosyntezy witaminy D [6, 7].

Ważna jest także temperatura ciała – gdy jest równa 37ºC, to 50%

przemian zachodzi w ciągu 28 godzin, a po 4 dniach osiągany jest stan

równowagi reakcji (80% prowitaminy zostaje przekształcone w witaminę

D). Wraz z obniżeniem temperatury wydłużeniu ulega czas, np. przy 25ºC

dla przeprowadzenia 50% przemian potrzeba 48h [21].

Zachowując zatem zasady racjonalnej ekspozycji na słońce (odsłonięte

przedramiona i częściowo nogi) w Polsce w od maja do września, kiedy

promieniowanie ultrafioletowe pada pod kątem większym niż 30º (warunek

zachodzenia procesu), możliwe jest prawidłowe zaopatrzenie organizmu

w witaminę D [7, 21]. Jej biosynteza odbywa się jeszcze w ciągu kilku dni

od zakończenia ostatniego naświetlania skóry.

2.2. Metabolizm witaminy D

Przez lata uważano, że metabolizm witaminy D odbywa się nieomal

wyłącznie w wątrobie i nerkach. Nowe doniesienia wskazują także na inne

organy ludzkiego organizmu. Z wyjątkiem nieenzymatycznej biosyntezy

witaminy D w skórze, kolejne przemiany „słonecznej witaminy” wymagają

obecności enzymów. Są nimi hydroksylazy należące do klasy oksydoreduktaz.

Pierwszy etap biosyntezy aktywnej postaci witaminy D zachodzi

w wątrobie: jest nim hydroksylacja przy węglu 25-tym. Następnie

25-hydroksywitamina D (25(OH)D, kalcyfediol) ulega w nerkach 1-hydro-

ksylacji. Otrzymany kalcytriol (1,25-dihydroksywitamina D, 1,25(OH)2D)

także w nerkach ulega hydroksylacji przy 24-tym atomie węgla [18].

2.2.1. Hydroksylacja w pozycji ‘25’

Pierwszy etap aktywacji metabolicznej witaminy D, czyli hydroksylacja

przy 25-tym atomie węgla, zachodzi w wątrobie we frakcji mikrosomalnej


16

oraz mitochondrialnej hepatocytów pod wpływem zespołu 25-hydroksylaz.

Enzymy te zawierają cytochrom P450, lecz charakteryzują się odmiennymi

wartościami stałej Michaelisa-Menten (Km) – stężeniami substratu, przy

którym szybkość prowadzonej reakcji enzymatycznej jest równa połowie

szybkości maksymalnej (Vmax) tej reakcji. Enzymy frakcji mikrosomalnej

mają wyższe powinowactwo do substratu (Km~0,1 µM) i niższą wartość

Vmax niż mitochondrialnej (Km~3-10 µM przy wysokim Vmax). Dlatego

uważa się, że w warunkach fizjologicznych hydroksylaza mikrosomalna

pełni kluczową rolę. Po przedawkowaniu witaminy D uaktywniają

się enzymy mitochondrialne, wzrasta stężenie jej metabolitów we krwi

i występują objawy zatrucia [20, 22].


Kluczowym miejscem metabolizmu witaminy D są nerki. Powstaje

tu najbardziej aktywna ze wszystkich forma witaminy D jaką jest kalcytriol

– 1,25(OH)2D. Hydroksylacja przy atomie C1 przeprowadzana jest

w kanalikach nerkowych (ich proksymalnej i dystalnej części). Substratem

jest postać 25(OH)D.

U pacjentów z niewydolnością nerek, zwłaszcza w zaawansowanym

stadium choroby odnotowano stężenia 1,25(OH)2D na granicy

wykrywalności. Uznaje się zatem, że te hydroksylazy działają jedynie

w miejscach ich występowania. Dodatkowo produkowana porcja kalcytriolu

nie jest uwalniana do układu krążenia, lecz wiąże się z lokalnym

zapotrzebowaniem na ten hormon np. koniecznością zahamowania

proliferacji i pobudzeniem różnicowania komórek albo stymulacją

wytwarzania innych hormonów. Wyjątkiem od sytuacji gdy 1-hydroksylacja

na obwodzie nie zwiększa całkowitego poziomu 1,25(OH)2D we krwi, jest

wystąpienie schorzenia, w przebiegu którego dochodzi do silnej aktywacji

układu odpornościowego, głównie limfocytów, np.: gruźlica, sarkoidoza.

Komórki te znacznie zwiększają ilość 1-hydroksylaz, co powoduje

zwiększenie ilości aktywnej postaci witaminy D we krwi. Nadmiar

kalcytriolu może spowodować zachwianie homeostazy mineralnej

i wystąpienie hiperkalcemii. Obecnie hydroksylazom obwodowym

przypisuje się rosnącą rolę w oddziaływaniu witaminy D na organizm ludzki,

zwłaszcza w kontekście jej nowo odkrywanych funkcji [14, 15, 20, 22].

Proces 1-hydroksylacji podlega regulacji i jest zależny od stężenia

w surowicy krwi: wapnia, fosforanów i parathormonu (PTH). Jeżeli

stężenie PTH jest podwyższone albo stężenie wapnia lub fosforanów

obniżone, to PTH pobudza 1-hydroksylazę do przekształcania kalcyfediolu

w kalcytriol i jednocześnie wzrasta ilość wapnia wchłanianego przez nerki.

Natomiast w przypadku wystąpienia nadmiaru 1,25(OH)2D dochodzi


17

do hamowania zwrotnego 1-hydroksylazy, by zapobiec dalszemu

powstawaniu kalcytriolu i w efekcie spada stężenie wapnia we krwi [22].


Kolejny etap metabolizmu witaminy D, hydroksylacja przy atomie

C24, również zachodzi w nerkach (głównie w kanalikach proksymalnych).

24-hydroksylaza, podobnie jak wcześniej omówione biokatalizatory,

zawiera cytochrom P450 i jest enzymem multikatalitycznym

hydroksylującym boczne łańcuchy różnych metabolitów witaminy

D. Substratami są zarówno 25-hydroksy, jak i 1,25-hydroksy pochodne.

Wzrost stężenia 1,25(OH)2D zwiększa aktywność enzymu i jednocześnie

obniża stężenie 1-hydroksylazy. Z uwagi na fakt, iż hydroksylacja

w pozycji ‘24’ zapoczątkowuje jeden ze szlaków katabolicznych witaminy

D, 24-hydroksylaza jest jednym z najważniejszych czynników

kontrolujących poziom kalcytriolu w organizmie [15, 20, 22].

2.3. Mechanizm działania witaminy D

Witamina D i jej metabolity wykazują działanie za pośrednictwem

specyficznych receptorów (VDR, ang. Vitamin D receptor) należących

do rodziny receptorów jądrowych (NR1ǀ1). Gen kodujący VDR zlokali-

zowany jest na długim ramieniu chromosomu 12 w locus 12q13.11. [23]

Receptory dla witaminy D występują one w wielu typach komórek: kościach,

jelicie, nerkach i przytarczycach, ale również w komórkach nabłonka

naczyniowego, miocytach, kardiomiocytach, komórkach β-trzustki,

neuronach, komórkach układu immunologicznego [1-3].

W wyniku pierwszych kluczowych etapów metabolizmu witaminy

D powstaje forma 1,25(OH)2D, która krąży we krwi głównie w postaci

związków kompleksowych z DBP w równowadze z niewielką ilością

wolnej formy. Metabolit witaminy D dyfunduje do błony komórkowej,

dochodzi do jego odłączenia od DBP, po czym jako samodzielna

cząsteczka 1,25(OH)2D przechodzi przez dwie warstwy lipidowej błony

i trafia do jądra komórkowego, gdzie wykazuje duże powinowactwo

do VDR – silnie się z nim sprzęga tworząc kompleks transkrypcyjny.

Przyłączony ligand powoduje zmianę konformacji receptora, w wyniku

czego może on związać się z receptorem kwasu 9-cis retinojowego (RXR)

tworząc heterodimer, do którego przyłączają się dwa dodatkowe

koaktywatory. Kompleks VDR-RXR-koaktywatory wzajemnie oddziałuje

z ogólnym aparatem transkrypcyjnym (GTA), by zainicjować lub dokonać

supresji transkrypcji około 200 genów [15, 23, 24].


18

Rys. 5. Synteza 1,25(OH)2D3 i molekularny mechanizm działania (zmod. [24])

2.4. Witamina D i gospodarka wapniowo-fosforanowa

Szeroko znaną, często intuicyjnie wymienianą funkcją witaminy D jest

jej wpływ na regulację homeostazy mineralnej w organizmie. I faktycznie

witamina D to zwiększa efektywność jelitowej absorpcji jonów wapnia

(Ca2+

) oraz fosforanów (PO43-

), w celu utrzymania kalcemii w wąskich

granicach normy (2,2-2,6 mmol/l albo 9,0-10,5 mg/l), do czego niezbędny

jest również współudział PTH i kalcytoniny. 1,25(OH)2D zwiększa

przenikalność wapnia do wnętrza enterocytu, zwiększa szybkość przepływu

Ca2+

przez cytozol komórki,a także jego translokację do układu krążenia.

W intensyfikacji transportu fosforanów ważną rolę odgrywa zależny

od „słonecznej witaminy”co-transporter sodowo-fosforanowy. Jednocześnie

znaczna część jonów PO43-

przemieszcza się z jelita do krwi w sposób

niezwiązany z witaminą D [15].


19

Witamina D jest niezbędna dla zapewnienia prawidłowej mineralizacji

kości – czyni to właśnie poprzez zapewnienie odpowiedniego poziomu

jonów Ca2+

i PO43-

we krwi. Wapń osoczowy występuje w dwóch

odmianach: w 40% w formie nierozpuszczalnej – związanej z białkami

osocza i w około 50% w postaci rozpuszczalnej (przesączalnej), która

prawie w całości jest zjonizowana – tylko ta frakcja wykazuje aktywność

fizjologiczną (jest to około 50% całkowitej puli wapnia w osoczu). Wapń

w każdym momencie może być pobierany z rezerwuaru kostnego, dzięki

czemu organizm jest niezależny od zmiennej podaży w przyjmowanym

pokarmie. U dorosłego człowieka uwalnia się około 500 mg wapnia

w ciągu doby i równocześnie tyle samo pierwiastka odkłada się w formie

kryształów hydroksyapatytów w nowotworzonych beleczkach kostnych.

Jednym z czynników pobudzających wytwarzanie przez osteoblasty

kolagenu, na którym odkładają się powstające cząsteczki hydroksyapatytów

o wzorze 3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2, jest również 1,25(OH)2D. Jednakże

w obecności podwyższonego poziomu PTH aktywna forma witaminy D

aktywuje osteoblasty do produkowania limfokin o różnej funkcji – część

z nich stymuluje osteoklasty do wzmożonej resorpcji kości, pozostałe

powodują fuzję prekursorów osteoklastów i tworzenie dojrzałych form

komórek kościogubnych. W efekcie nasilonej resorpcji kości dochodzi do

podwyższenia stężenia wapnia i fosforanów w układzie krążenia.

Nerka jest kolejnym narządem biorącym udział w regulacji gospodarki

mineralnej organizmu. Wyprodukowana w komórkach kanalików

nerkowych (na skutek działania PTH) 1,25(OH)2D hamuje swoją własną

syntezę i aktywuje 24-hydroksylazę, wynikiem czego jest wzmożona

produkcja 24,25(OH)2D. [15]

W utrzymaniu homeostazy mineralnej w organizmie istotną rolę

odgrywają też przytarczyce. Gruczoły te zawierają VDR – za jego

pośrednictwem aktywna forma witaminy D hamuje syntezę i wydzielanie

PTH, którego produkcja wzrasta w przypadku obniżenia poziomu wapnia

w układzie krążenia. Zatem hipowitaminoza D powoduje zmniejszenie

absorpcji wapnia z przewodu pokarmowego i następczą hipokalcemię.

Ta zaś odpowiedzialna jest za wywołanie wtórnej nadczynności

przytarczyc. Wobec tego zarówno nadczynność gruczołów przytarczycznych,

jak i deficyt 1,25(OH)2D leżą u podstaw zwiększenia nerkowego klirensu

fosforanowego oraz nadmiernie nasilonej demineralizacji kości [15].


20

2.5. Witamina D w leczeniu nowotworów

W 1981 roku Colston i współ. Pokazali, że kalcytriol hamował wzrost

złośliwych komórek czerniaka [25]. Abe i inni wykazali, że kalcytriol

powoduje różnicowanie komórek ostrej białaczki szpikowej HL60

w kierunku makrofagów [26, 27]. Od tego czasu w ośrodkach naukowych

na świecie trwają intensywne badania nad przeciwnowotworowym

działaniem witaminy D, zarówno in vitro, jaki i in vivo na

różnych modelach.

Wykazana różnorodna aktywność witaminy D może wynikać z wpływu

jej aktywnej formy na transkrypcję wielu genów, które pośredniczą

w procesach nowotworowych. Wykazano, że kalcytriol reguluje

specyficzne ścieżki sygnałowe w tkankach piersi, okrężnicy oraz gruczołu

krokowego. Działanie witaminy D w komórkach raka jelita grubego

hamuje szlak β-kateniny, a tym samym przeciwdziała nieprawidłowej

aktywacji ścieżki Wnt β-kateniny, która to ścieżka jest aktywna podczas

rozwoju procesu nowotworowego jelita [28].

Efekty witaminy D w zmniejszeniu ryzyka zachorowania na raka

badano często na przykładzie raka jelita grubego, który jest drugą

najczęstszą przyczyną zgonów w Europie i USA. W 2005 roku zbadano

zależność między spożyciem witaminy D, jej poziomem w surowicy

i rakiem jelita grubego. U osób przyjmujących codziennie witaminę

D w ilości przynajmniej 1000 IU lub u których poziom tej witaminy

w surowicy wynosił 33 ng/ml, stwierdzono 50% mniejsze ryzyko

raka odbytnicy [29].

Badacze przeanalizowali także kilka czynników żywieniowych

w stosunku do nawrotu polipów w okrężnicy, które mogą być zwiastunem

raka jelita grubego. Niskie spożycie wapnia i witaminy D było powiązane

ze zwiększonym ryzykiem nawrotu choroby.

Przeprowadzone próby kliniczne sugerują, że witamina D i jej analogi

mogą być przyszłością w terapii różnych nowotworów. Uważa

się, że aktywna forma witaminy D m.in. promuje różnicowanie

i hamowanie proliferacji, inwazyjności i przerzutów ludzkiego raka

prostaty. W jednym z badań sprawdzana była zależność pomiędzy

ekspozycją na słońce a zapadalnością na raka prostaty. Porównując grupę

450 mężczyzn ze zdiagnozowanym rakiem prostaty (stadium

zaawansowane) z tak samo liczebną grupą zdrowych mężczyzn, okazało

się, że osoby, u których obserwowano dostatecznie wysoką ekspozycją

na słońce, były o 50% mniej narażone na raka prostaty niż mężczyźni

z niską ekspozycją na słońce. Naukowcy uważają, że promieniowanie

słoneczne pomaga chronić mężczyzn przed rakiem prostaty poprzez

promowanie skórnej syntezy witaminy D. Pomimo związku pomiędzy


21

ekspozycją na słońce i niektórymi nowotworami skóry, naukowcy

zauważają, że „zwiększenie spożycia witaminy D z diety i suplementów

może być najbezpieczniejszym rozwiązaniem w celu osiągnięcia

odpowiedniego poziomu witaminy D” [30].

Działanie analogów kalcytriolu polegające na hamowaniu wzrostu

nowotworów badano szeroko na modelach zwierzęcych. Naukowcy chcieli

w ten sposób ocenić efekty in vivo, a także monitorować poziom wapnia.

Dane z różnych zwierzęcych modelów raka pokazały że suplementacja

witaminą D i jej analogami istotnie zmniejsza tempo wzrostu nowotworów.

Myszy pozbawione receptora witaminy D (VDR) są bardziej podatne

na rozwój indukowanego nowotworu. Badania te wykazały, że obecność

VDR jest niezbędna w obliczu rakotwórczych czynników stresogennych.

2.6. Witamina D i cukrzyca

Witamina D odgrywa też rolę w cukrzycy. Już w 1980 roku

dowiedziono, że niedobór witaminy D hamuje wydzielanie trzustkowe

i gospodarkę insuliną, powodując upośledzoną tolerancję glukozy.

Stwierdzono istnienie korelacji pomiędzy niskim promieniowaniem

UVB, a częsty występowaniem cukrzycy typu 1. W regionach, gdzie

stopień tego promieniowania jest duży występowanie cukrzycy 1 jest

zdecydowanie niższe [31].

2.7. Witamina D i stwardnienie rozsiane

Stwardnienie rozsiane (SM) jest chorobą autoimmunologiczną, w której

następuje infiltracja komórek układu odpornościowego do układu

nerwowego i stopniowe niszczenie osłonki mielinowej. Wyniki

przeprowadzonych analiz jednoznacznie wskazały na związek pomiędzy

czasem ekspozycji na promienie słoneczne (szczególnie w okresie

dzieciństwa) a ryzykiem rozwoju stwardnienia rozsianego. Prawdopodo-

bieństwo zachorowania na SM jest większe, gdy w wieku dziecięcym czas

ekspozycji na słońce był ograniczony. Powyższy wniosek został

sformułowały na podstawie wyników badania przeprowadzonego wśród

chorych na SM i w grupie kontrolnej [32].

Poziom witaminy D u kobiet ciężarnych jest ważnym aspektem.

Parametr ten jest szczególnie istotny dla ciężarnych, u których

zdiagnozowano stwardnienie rozsiane. Pomiar witaminy D w tej grupie

kobiet jednoznacznie pokazał, iż u 73% badanych występowały bardzo

duże niedobory tej witaminy. Opisane zagadnienie z pewnością wymaga

kolejnych badań [32].


22

2.8. Oznaczenie witaminy D we krwi

Podstawowym metabolitem witaminy D jest 25(OH)D. Oznaczenie jego

stężenia najdoskonalej pozwala ocenić stan zaopatrzenia organizmu

w witaminę D pochodzącą zarówno z diety, jak i zsyntetyzowanej

w skórze.

Okres półtrwania 25(OH)D w porównaniu z innymi metabolitami jest

długi i wynosi około 21 dni. Jednocześnie 25(OH)D występuje w najwyż-

szym stężeniu (w zależności od autora w granicach 20-80 ng/ml) spośród

pozostałych form (np. okres półtrwania 1,25(OH)2D to 1-7 godzin, stężenie

0,034 ng/ml) i znacząco koreluje z wieloma klinicznymi parametrami tkanki

kostnej np. BMD [33, 34].

Należy mieć na uwadze istnienie jednostek chorobowych, w których

powinno się oznaczać poziom 1,25(OH)2D zamiast 25(OH)D

lub oba związki. Przykładem jest niewydolność nerek – w wyniku

zmniejszenia filtracji kłębuszkowej dochodzi do upośledzenia nerkowej

produkcji 1-α-hydroksylazy i spadku stężenia 1,25(OH)2D przy jednocześnie

wysokim stężeniu 25(OH)D. Przeciwnie dzieje się w przypadku sarkoidozy

lub gruźlicy, w których dochodzi do nadmiernej pozanerkowej 1-α-hydro-

ksylacji witaminy D w makrofagach i ziarniniakach, w wyniku czego rozwija

się hiperkalcemia [15, 20].

2.9. Zalecenia dotyczące profilaktyki niedoborów witaminy D

Zapotrzebowanie na witaminę D jest różne w zależności od wieku

i pory roku. Obowiązkowo należy suplementować dietę niemowląt,

dla których do 6 miesiąca nie jest wskazana bezpośrednia ekspozycja

na słońce. Osobom powyżej 65 roku także zaleca się suplementację.

Wynika to głównie z faktu zmniejszonej u nich zdolności syntezy skórnej.

Ponadto seniorzy stosunkowo rzadziej przebywają na świeżym powietrzu.

Ostatnie wytyczne dotyczące profilaktyki niedoborów witaminy

D wskazują, iż jej suplementacja u zdrowych osób dorosłych powinna być

prowadzona w miesiącach od września do kwietnia, a dawka dobowa

powinna wynosić 800 – 2000 IU (Tabela 3). Takie działanie zapewnienia

w surowicy krwi poziom 25(OH)D powyżej 30 ng/ml, czyli poziom

optymalny Stężenie nie powinno spadać poniżej 20 ng/ml [7, 14].


23

Tabela 3. Zalecenia suplementacji witaminy D dotyczące osób zdrowych [7]

Grupa docelowa Rekomendacje

Noworodki

i niemowlęta

(0-12 miesięcy)

Suplementacja od pierwszych dni życia,

niezależnie od sposobu żywienia dziecka (karmienie

piersią czy mlekiem modyfikowanym) w dawce:

* 400 IU/dobę do 6. Miesiąca życia

* 400-600 IU/dobę między 6. A 12. Miesiącem

życia w zależności od podaży witaminy D w diecie

Dzieci i młodzież

(1-18 lat)

600-1000 IU/dobę (zależnie od masy ciała)

w miesiącach wrzesień-kwiecień lub przez cały rok,

jeśli nie jest zapewniona efektywna skórna synteza

witaminy D w miesiącach letnich.

Dorośli

(18-65 lat)

800-2000 IU/dobę (w zależności od masy ciała)

w miesiącach wrzesień-kwiecień lub przez cały rok,

jeśli nie jest zapewniona efektywna skórna synteza

witaminy D w miesiącach letnich.

Seniorzy

(>65 lat)

800-2000 IU/dobę (w zależności od masy ciała)

przez cały rok, ze względu na obniżoną efektywność

skórnej syntezy witaminy D.

Osobne rekomendacje dotyczą dzieci przedwcześnie urodzonych, kobiet

ciężarnych i karmiących piersią, osób otyłych, mających ciemną karnację oraz

pracujących w nocy.

3. Podsumowanie

W artykule przedstawiona została charakterystyka działania witaminy

D. Racjonalna ekspozycja na promieniowanie słoneczne powinna zapewnić

efektywną produkcję związku w wyniku syntezy skórnej. Grupą wiekową

charakteryzującą się optymalnymi stężeniami witaminy D w organizmie

są niemowlęta do około 6 miesiąca życia. Jest to efekt odpowiedzialnego

prowadzenia przez rodziców i służby zdrowia profilaktyki przeciw-

krzywiczej polegającej na regularnej suplementacji tej substancji. Wraz z

wiekiem rośnie odsetek osób z niedoborem witaminy D.

W ostatnich latach obserwowany jest wzrost liczby doniesień

naukowych istotnych dla rozumienia wpływu hipowitaminozy D

na zdrowie człowieka. Coraz więcej wiemy na temat syntezy skórnej,

metabolizmu i mechanizmu działania witaminy D, co zostało opisane

w niniejszej pracy. Należy podkreślić, że niedobory witaminy D mają

negatywny wpływ na funkcjonowanie układu mięśniowo-szkieletowego,

ale ponadto mogą leżeć u podłoża cukrzycy typu I i stwardnienia


24

rozsianego. Witamina D i jej analogi wykazały również aktywność

przeciwnowotworową głównie w modelach in vitro. Niezwykle ważne jest

prowadzenie akcji sprzyjających lepszemu poznaniu szerokich wpływów

tej witaminy na zdrowie przez społeczeństwo oraz nieustawanie

w badaniach nad skutkami działania witaminy D.

Literatura

1. Anderson J.L., May H.T., Horne B.D., Bair T.L., Hall N.L., Carlquist J.F.,

Lappé D.L., Muhlestein J.B., Intermountain Heart Collaborative (IHC) Study

Group, Relation of vitamin D deficiency to cardiovascular risk factors, disease

status, and incident events in a general healthcare population. Am J Cardiol,

2010. 106: p. 963-968

2. Holick M.F., Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007. 357(3): p. 266-281

3. Mitri, J., Muraru, M.D., Pittas, A.G., Vitamin D and type 2 diabetes:

a systematic review. Eur J Clin Nutr, 2011. 65: p. 1005-1015

4. Zittermann A., Vitamin D and disease prevention with special reference

to cardiovascular disease. Prog Biophys Mol Biol, 2006. 92(1): p. 39-48

5. Sajkowska J.J., Paradowska K., Multiple activities of vitamin D. Biul. Wydz.

Farm. WUM, 2014. 1: p. 1-6

6. Pludowski P., Jaworski M., Niemirska A., Litwin M., Szalecki M.,

Karczmarewicz E., Michalkiewicz J., Vitamin D status, body composition

and hypertensive target organ damage in primary hypertension. J Steroid

Biochem Mol Biol, 2014. 144 Pt A: p. 180-184

7. Pludowski P., et al., Practical guidelines for the supplementation of vitamin

D and the treatment of deficits in Central Europe - recommended vitamin

D intakes in the general population and groups at risk of vitamin D deficiency.

Endokrynol Pol, 2013. 64(4): p. 319-27

8. Grant W.B., A review of the evidence regarding the solar ultraviolet-B–

vitamin D–cancer hypothesis. Standardy Med, 2012. 9: p. 610-619

9. Grant W.B., Relation between prediagnostic serum 25-hydroxyvitamin D level

and incidence of breast, colorectal, and other cancers. J Photochem Photobiol

B: Biol, 2010. 101: p. 130-136

10. Wang L., Song Y., Manson J.E., Pilz S., März W., Michaëlsson K., Lundqvist

A., Jassal, S.K., Barrett-Connor, E., Zhang, C., Eaton, C.B., May, H.T.,

Anderson, J.L., Sesso, H.D., Circulating 25-hydroxy-vitamin D and risk

of cardiovascular disease: A meta-analysis of prospective studies.

Circ Cardiovasc Qual Outcomes, 2012. 1(5): p. 819-829

11. Pittas A.G., Nelson J., Mitri J., Hillmann W., Garganta C., Nathan D. M., Hu

F. B., Dawson-Hughes B., Plasma 25-hydroxyvitamin D and progression

to diabetes in patients at risk for diabetes: an ancillary analysis

in the Diabetes Prevention Program. Diabetes Care, 2012. 35(3): p. 565-573

12. Slinin Y., Paudel M., Taylor B.C., Ishani A., Rossom R., Yaffe, K., Blackwell

T., Lui L. Y., Hochberg M., Ensrud K. E., Association between serum 25(OH)

vitamin D and the risk of cognitive decline in older women. J Gerontol A Biol

Sci Med Sci, 2012. 67(10): p. 1092-1098


25

13. Sabetta J.R., DePetrillo P., Cipriani R. J., Smardin J., Burns L. A., Landry M.

L., Serum 25-hydroxyvitamin d and the incidence of acute viral respiratory

tract infections in healthy adults. PLoS One, 2010. 5(6): p. e11088

14. Marcinowska-Suchowierska E., Walicka M., Tałałaj M., Horst-Sikorska W.,

Ignaszak-Szczepaniak M., Sewerynek E., Vitamin D supplementation in adults

- guidelines. Endokrynol Pol, 2010. 61(6): p. 723-729

15. Karczmarewicz E., Łukaszkiewicz J., Lorenc R., Vitamin D - metabolism,

action, requirements and treatment strategies. Standardy Med., 2007.

4: p. 137-142

16. Lukaszkiewicz J., Ryzko J., Socha J., Lorenc R. S., Endogenous, cutaneous

vitamin D synthesis stimulation as an effective way of improving the vitamin

D status in children with hepatobiliary malfunctions. Digestion, 1989.

42(3): p. 158-162

17. Dueland S., Pedersen J. I., Helgerud P., Drevon C. A., Absorption,

distribution, and transport of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in the rat.

Am J Physiol, 1983. 245(5 Pt 1): p. E463-467

18. Jones G., Expanding role for vitamin D in chronic kidney disease: importance

of blood 25-OH-D levels and extra-renal 1alpha-hydroxylase in the classical

and nonclassical actions of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3). Semin Dial,

2007. 20(4): p. 316-324

19. Zimmerli R.C. Forever Young Skin Care System. 2000

20. Dusso A.S., Brown A. J., Slatopolsky E., Vitamin D. Am J Physiol Renal

Physiol, 2005. 289(1): p. F8-28

21. Webb A.R., Holick M. F., The role of sunlight in the cutaneous production

of vitamin D3. Annu Rev Nutr, 1988. 8: p. 375-399

22. Holick M.F., McCary L.C., DeLuca H.F., Vitamin D: Physiology, Molecular

Biology and Clinical Applications. 1999: Humana Press

23. Rochel N., Wurtz J. M., Mitschler A., Klaholz B., Moras D., The crystal

structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand.

Mol Cell, 2000. 5(1): p. 173-179

24. Malloy P.J., Pike J. W., Feldman D., The vitamin D receptor and the syndrome

of hereditary 1,25-dihydroxyvitamin D-resistant rickets. Endocr Rev, 1999.

20(2): p. 156-188

25. Colston K., Colston M. J., Feldman D., 1,25-dihydroxyvitamin

D3 andmalignant melanoma: the presence of receptors and inhibition of cell

growth in culture. Endocrinology, 1981. 108(3): p. 1083-1086

26. Abe E., Miyaura C., Sakagami H., Takeda M., Konno K., Yamazaki T.,

Yoshiki S., Suda T., Differentiation of mouse myeloid leukemia cells induced

by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. 78(8):

p. 4990-4994

27. Krishnan A.V., Feldman D., Molecular pathways mediating the anti-

inflammatory effects of calcitriol: implications for prostate cancer

chemoprevention and treatment. Endocr Relat Cancer, 2010. 17(1): p. R19-38

28. Feldman D., Krishnan A. V., Swami S., Giovannucci E., Feldman B. J.,

The role of vitamin D in reducing cancer risk and progression. Nat Rev

Cancer, 2014. 14(5): p. 342-357


26

29. Gorham E.D., Garland C. F., Garland F. C., Grant W. B., Mohr S. B., Lipkin

M., Newmark H. L., Giovannucci E., Wei M., Holick M. F., Optimal vitamin

D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta analysis. Am J

Prev Med, 2007. 32(3): p. 210-216

30. John E.M., Schwartz G. G., Koo J., Van Den Berg D., Ingles S. A., Sun

exposure, vitamin D receptor gene polymorphisms, and risk of advanced

prostate cancer. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5470-5479

31. Mathieu C., Gysemans C., Vitamin D and cancer. Av Diabetol., 2006. 22(3):

p. 187-193

32. Schmitz K., Barthelmes J., Stolz L., Beyer S., Diehl O., Tegeder I., "Disease

modifying nutricals" for multiple sclerosis. Pharmacol Ther, 2014

33. Szechinski J., Aktywbe postaci witaminy D3 i ich funkcja w leczeniu różnych

schorzeń. Swiat Med. i Farm., 2007: p. 23-27

34. Napiórkowska L., Franek E., Rola oznaczania witaminy D w praktyce

klinicznej. Chor. Serca Naczyn., 2009. 6(4): p. 203-210

Current state of knowledge about vitamin D and its deficiency

Abstract

The data published in recent years have suggested that vitamin D deficiency not only has

a negative effect on the musculoskeletal system but can also be a factor in many diseases including cardiovascular and autoimmune disorders, several types of cancer, type 1 diabetes

and mental disorders. The determination of vitamin D serum levels is not performed

routinely. Moreover, public awareness about this molecule is insufficient. It seems that the

actions taken by the scientific community should lead to a better understanding how vitamin D works.

27

Jerzy Potyka1, Jakub Rok

2, Elektra Sliupkas-Dyrda

1

Antynowotworowe właściwości witaminy D3

Witaminę D tworzy grupa związków sekosteroidowych, zwanych kalcyferolami. Istotne znaczenie mają tu: witamina D2 (ergokalcyferol) oraz

powstająca w organizmach zwierząt i ludzi witamina D3 (cholekalcyferol).

Sam cholekalcyferol nie posiada żadnej aktywności biologicznej i aby mógł

skutecznie działać na tkanki i narządy docelowe, ulega przemianie do postaci aktywnej – kalcytriolu (1,25-dihydroksycholekalcyferol,

1,25-(OH)2D3). Najbardziej jest on znany z wpływu na różnicowanie

i specjalizację komórek tkanki kostnej, prawidłowy rozwój kośćca u małych

dzieci jak również za prawidłową jego budowę i funkcjonowanie u osób dorosłych. Kalcytriol i jego pochodne mogą też wpływać bezpośrednio

lub pośrednio na funkcjonowanie komórek niezwiązanych z gospodarką

wapniowo – fosforanową. Dzięki obecności w komórkach 1α-hydroksylazy

oraz receptorów witaminy D (VDR), powstały 1,25-(OH)2D3 może regulować ich cykl komórkowy, proliferację, apoptozę i różnicowanie oraz

ekspresję cytokin, czynników wzrostu, enzymów i hormonów.

To wielokierunkowe działanie budzi ogromne zainteresowanie w aspekcie

terapii nowotworów. Wskazuje się tu między innymi na wzrost ekspresji genów kodujących inhibitory kinazy zależnej od cyklin – CDK2: CDKN1A

(koduje białko p21/WAF1/CIP1) i CDKN1B (koduje białko p27/KIP1) oraz

represję genów kodujących cykliny: D1, D3, A1 i E1, wpływ na poziom

białka p53, p73 czy GADD45γ. Kalcytriol może też hamować wzrost komórek poprzez wpływ na ścieżki sygnałowe związane z kinazami: ERK

1/2, Akt oraz MEKK-1. Badania prowadzone na różnych liniach nowo-

tworowych (gruczolakorak piersi, glejak, czerniak) potwierdzają cyt otok-

syczne i antyproliferacyjne działanie kalcitriolu oraz wpływ na ekspresję

TP53 i stosunek ilościowy produktów ekspresji genu BAX i BCL-2

w badanych komórkach. Zmiany ekspresji BCL-2 i BAX mogą prowadzić

do uwolnienia z mitochondriów białek aktywujących wewnętrzny szlak

apoptozy. Do indukcji apoptozy może tu też prowadzić destabilizacja mRNA odwrotnej transkryptazy telomerazy TERT (telomerase reverse

transcriptase) wywołana obecnością 1,25-(OH)2D3.

1 [email protected], Zakład Biologii Komórki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem

Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Katedra i Zakład Chemii i Analizy Leków, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem

Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

mailto:[email protected]


28

1. Witamina D3

Witamina D3 (cholekalcyferol) to naturalnie występujący

w organizmach zwierzęcych związek należący do sekosteroidów.

Syntetyzowany jest pod wpływem promieniowania UV z 7-dehydro-

cholesterolu obecnego w skórze. Sam cholekalcyferol nie posiada żadnej

aktywności biologicznej i aby mógł skutecznie działać na tkanki i narządy

docelowe, musi ulec przemianie do postaci aktywnej [1]. Aktywacja ta

polega na dwustopniowej hydroksylacji. W pierwszym etapie, przy udziale

25-hydroksylazy – enzymu monooksygenazy zależnej od cytochromu P-450

– powstaje 25-hydroksycholekalcyferol (kalcydiol) (reakcja zachodząca

głównie w komórkach wątroby i w mniejszym stopniu w skórze, jelitach oraz

nerkach). Następnie przy udziale 1α-hydroksylazy 25-hydroksywitaminy D3

(monooksygenaza 1-kalcydiolowa) – enzymu zlokalizowanego w wewnętrznej

błonie mitochondrialnej, należącego do rodziny cytochromów P-450 –

CYP1α (CYP27B1) – powstaje 1α,25-dihydroksycholekalcyferol

(1,25(OH)2-D3, kalcytriol) [2]. Jest to najbardziej aktywny naturalny

metabolit witaminy D.

Powstały aktywny metabolit odpowiada za prawidłowe różnicowanie

i specjalizację komórek tkanki kostnej, prawidłowy rozwój kośćca

u małych dzieci jak również za prawidłową jego budowę i funkcjonowanie

u osób dorosłych i w podeszłym wieku [3]. Niski poziom aktywnej formy

witaminy D3 powoduje zniekształcenie i osłabienie kości oraz ich wykrzy-

wianie się pod wpływem ciężaru ciała szybko rosnącego dziecka. Kości

i nadgarstki stają się powiększone, klatka piersiowa zaczyna przypominać

pierś gołębia, u dzieci powstają opóźnienia we wzroście zębów. Dziecko

częściej poci się i staje się nadpobudliwe. U osób dorosłych zaburzona

gospodarka wapniowo-fosforanowa oraz związane z tym nieprawidłowości

w modelowaniu i mineralizacji kości skutkują osteomalacją i nasilonym

postępowaniem osteoporozy [4].

2. Mechanizm działania witaminy D3

Witamina D3 może się łączyć z receptorami błonowymi, wywołując

szybką odpowiedź, jednak głównie oddziałuje na komórki poprzez receptor

wewnątrzkomórkowy VDR (vitamin D receptor), który należy

do nadrodziny receptorów jądrowych zależnych od ligandów,

tzn. działających jak aktywowane przez ligand białkowe czynniki

transkrypcyjne [3]. Receptor ten reguluje ekspresję genów zaangażo-

wanych w gospodarkę wapniowo-fosforanową w komórkach tkanki

kostnej, nabłonka jelit, kanalików nerkowych i przytarczyc, ale znajduje się

również w wielu innych komórkach nie powiązanych bezpośrednio

z gospodarką mineralną organizmu. Znaczne ilości tych receptorów odkryto


29

w komórkach należących do różnych linii komórek nowotworowych [5, 6,

7]. Fakt ten wydaje się bardzo istotny, ze względu na możliwość

wykorzystania witaminy D do regulacji ekspresji genów w tych komórkach.

Obecnie największe zainteresowanie spośród nieklasycznych działań

witaminy D3 wzbudza aktywność przeciwnowotworowa oraz możliwość

modulacji funkcjonowania układu immunologicznego. Powinowactwo liganda do VDR zależy od typu komórki, w której

receptor się znajduje. Za wiązanie liganda odpowiedzialna jest domena wiążąca ligand LBD (ligand binding domain) na końcu karboksylowym receptora [8]. Kluczowym elementem cząsteczki witaminy D3 odpowie-dzialnym za przyłączenie do VDR jest pierścień A, zawierający grupę hydroksylową w pozycji 1α. Przyłączenie się liganda skutkuje przemieszczeniem VDR z cytoplazmy do wnętrza jądra komórkowego. W odpowiedzi na ligand, VDR ulega fosforylacji przez kinazy, która może wpłynąć zarówno pozytywnie jak i negatywnie na aktywację VDR [9].

Do genów aktywowanych przez kalcytriol zalicza się CYP24A1 (gen kodujący enzym katabolizujący witaminę D), BGLAP (koduje osteokalcynę), oraz geny białek stojących na straży cyklu komórkowego, takich jak p21 czy GADD45. Hamowanie ekspresji przez kalcytriol zaobserwowano w przypadku takich genów jak: PTH (koduje hormon przytarczyc) oraz CYP2B1 (koduje enzym przekształcający kalcydiol w kalcytriol) [10, 11]. Ligandy VDR hamują też ekspresję protoonkogenu MYC, genów cytokin IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ, a także genu receptora dla błonowego czynnika wzrostu EGFR (epidermal growth factor receptor). Produkty tych genów działają prozapalnie i pobudzają proliferację [12].

Opisano też wiele przypadków blokowania, bądź aktywacji protoonkogenów i genów supresorowych przez kalcytriol, ale tylko nieliczne z tych genów zawierają swoiste sekwencje DNA w obszarze promotorowym, do których przyłącza się VDR tzw. VDRE (vitamin D response element), co sugeruje, że kalcytriol może wywoływać swoje działanie również inną drogą [10]. Wytłumaczeniem tego zjawiska w części przypadków może być wspominana wcześniej droga aktywacji receptora błonowego. Wykazano bowiem, że równolegle do wywoływania efektu komórkowego przez związanie z receptorem VDR, witamina D, w przeciągu kilku minut lub nawet sekund, może pobudzać różne szlaki wewnątrzkomórkowe. W ten sposób pobudzany jest ruch jonów wapnia, szybka aktywacja kinazy białkowej C (PKC), fosfataza zasadowa, 29iog, metabolizm fosfoinozytolu [9]. Tą drogą, przez wzrost stężenia wapnia w komórce może dojść do aktywacji MAPK (kinaza białkowa aktywowana mitogenami), nazywanej też ERK, odpowiedzialnej za wzrost komórki. MAPK może zwiększyć aktywność transkrypcyjną VDR [10].


30

3. Witamina D3 i nowotwory

Niedobór witaminy D dotyka ok. 1 miliarda ludzi na świecie i jest

spowodowany głównie niewystarczającą ekspozycją na światło słoneczne.

W związku z wielokierunkowym działaniem witaminy D, jej niedobór

wiąże się z niekorzystnym wpływem na większość tkanek i narządów,

nie wykluczając

zwiększonego ryzyka do występowania wielu chorób przewlekłych

i nowotworów [13]. Już w 1941 roku Frank Apperly odnotował odwrotną

zależność pomiędzy śmiertelnością z powodu nowotworów w Ameryce

Północnej a ekspozycją na światło słoneczne. Z kolei w roku 1980 bracia

Frank i Cedric Garland po raz pierwszy zasugerowali, że witamina D może

pełnić ochronną rolę przed rakiem okrężnicy. Przeprowadzone przez nich

badania wykazały większą śmiertelność z powodu tego nowotworu wśród

populacji zamieszkujących obszary Stanów Zjednoczonych, na których

w ciągu roku występuje mniejsza ekspozycja na światło słoneczne,

a tym samym obniżony poziom witaminy D w organizmach ludzi.

Późniejsze odkrycia wielokrotnie wykazały zależność pomiędzy

odpowiednią ekspozycją na promieniowanie UV i właściwym poziomem

witaminy D oraz niższym ryzykiem wystąpienia chorób nowotworowych.

Obecnie istnieją dowody na ochronną rolę promieniowania UV w stosunku

do zachorowalności na czerniaka, białaczkę złośliwą, raka płuc, jajników,

mózgu, pęcherza moczowego, prostaty i trzustki [13]. Wykazano również

odwrotną zależność pomiędzy stężeniem 25-(OH)D3 we krwi a ryzykiem

wystąpienia raka piersi, jelita grubego i odbytu, prostaty, płuc oraz

chłoniaków nieziarniczych [14, 15, 16, 17, 18]. Dane epidemiologiczne

wskazujące na przeciwnowotworowe działanie witaminy D, skłaniały

do przeprowadzenia prób klinicznych w kierunku zastosowania kalcytriolu

i jego pochodnych w leczeniu i zapobieganiu chorób nowotworowych.

Pierwsze takie badania odbyły się w latach dziewięćdziesiątych

i obejmowały pacjentów z ostrą białaczką szpikową i zespołem

mielodysplastycznym. Od tamtej pory kalcytriol był wykorzystywany

w licznych badaniach, zarówno jako pojedynczy czynnik terapeutyczny

i w skojarzeniu z innymi lekami przeciwnowotworowymi, jak np.: cispla-

tyna, karboplatyna, cytarabina, fludarabina doksorubicyna, docetaksel,

paklitaksel, gefitinib i mitoksantron [6, 19, 20].

Aktywność przeciwnowotworowa witaminy D i jej pochodnych została

także potwierdzona w licznych badaniach in vitro przeprowadzonych

na hodowlach komórkowych. Mechanizm tego działania jest złożony.

Ogólnie przyjmuje się, że związany jest przede wszystkim z wpływem

na cykl komórkowy, proliferację, różnicowanie i apoptozę komórek

nowotworowych oraz hamowaniem procesu angiogenezy w obrębie guza.


31

Wymienione właściwości zależą głównie od aktywacji receptora VDR

i regulacji za jego pośrednictwem ekspresji genów docelowych.

4. Działanie antyproliferacyjne

Antyproliferacyjne działanie kalcytriolu związane jest z jego wpływem

na poziom ekspresji genów kodujących białka regulujące przebieg cyklu

komórkowego. Do takich białek należą m.in. cykliny, kinazy zależne

od cyklin – CDK (cyklin-dependent protein kinases) oraz inhibitory tych

kinaz – CKI (CDK inhibitors). Cykliny, CDK oraz CKI tworzą wspólnie

układ kontrolujący cykl komórkowy. Cykliny są białkami, których poziom

ekspresji w komórkach jest zależny od fazy cyklu komórkowego,

co przekłada się na cykliczne zmiany ich stężenia. Same cykliny

nie posiadają aktywności enzymatycznej; jednak łącząc się z kinazami

CDK powodują ich aktywację. Aktywne kompleksy typu cyklina-kinaza

CDK fosforylują i aktywują kolejne białka uczestniczące w regulacji cyklu

komórkowego, co skutkuje przejściem komórek przez tzw. punkty

kontrolne cyklu komórkowego i rozpoczęciem fazy S lub M. Jednym

z elementów hamujących progresję cyklu komórkowego są inhibitory

CDK, które łączą się z cyklinami, kinazami CDK lub kompleksami

cyklina-CDK, doprowadzając do utraty ich aktywności. Badania przepro-

wadzone na ludzkich komórkach raka piersi MCF-7 poddanych działaniu

kalcytriolu wykazały wzrost ekspresji genów kodujących inhibitory CDK2:

CDKN1A (koduje białko p21/WAF1/CIP1) i CDKN1B (koduje białko

p27/KIP1) oraz represję genów kodujących cykliny: D1, D3, A1 i E1.

Indukujący wpływ kalcytriolu wykazano również w stosunku do ekspresji

CDKN1A w ludzkich komórkach mielomonocytowych U937 (linia

komórek białaczkowych) i raka prostaty LNCaP oraz CDKN1B

w komórkach raka kolczystokomórkowego skóry (SCC, squamous cell

carcinoma) oraz komórkach ludzkiej białaczki promielocytarnej HL-60

[17, 21, 22, 23, 24]. Taki profil działania 1,25-(OH)2D3 powoduje

zahamowanie aktywności kinazy CDK2, co z kolei zapobiega fosforylacji

białka RB. Nieufosforylowane białko RB wiąże czynnik transkrypcyjny

E2F, który odpowiada za transkrypcję genów uczestniczących w replikacji

materiału genetycznego. Utworzenie kompleksu RB-E2F uniemożliwia

przyłączenie się E2F do DNA i progresję cyklu komórkowego –

rozpoczęcie fazy S. Kalcytriol ponadto aktywuje ekspresję inhibitorów

kinazy CDK4 – INK4, które są odpowiedzialne za zatrzymanie cyklu

komórkowego w fazie G1 oraz hamuje ligazę ubikwitynową SKP2

(S-phase kinase-associated protein 2) kierującą CKI do proteasomów.

1,25-(OH)2D3 wykazuje także działanie represyjne w stosunku do ekspresji


32

genów syntazy tymidylanowej TYMS oraz kinazy tymidynowej TK1, przez

co może również wpływać na proces replikacji DNA [22].

5. Regulacja cyklu komórkowego

Hamowanie przez kalcytriol cyklu komórkowego związane jest również

z jego wpływem na poziom białka p53. Białko to jest fosfoproteiną

jądrową, która funkcjonuje jako tzw. „strażnik genomu” i jest kodowana

przez gen należący do grupy genów supresorowych nowotworu. Poziom

aktywnego białka p53 wzrasta w komórce w odpowiedzi na uszkodzenia

DNA, hipoksję lub zaburzenia szlaku sygnałowego RB. Białko p53

powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G1/S

m.in. poprzez stymulację transkrypcji genu kodującego białko p21.

Zahamowanie cyklu komórkowego pozwala na naprawę materiału

genetycznego, a w przypadku gdy reperacja DNA nie jest możliwa, białko

p53 kieruje komórkę na drogę apoptozy. Badania in vitro przeprowadzone

na linii komórkowej MCF-7 wykazały zwiększony poziom białka p53

pod wpływem kalcytriolu [3]. 1,25-(OH)2D3 spowodował również wzrost

stężenia białka p73 (homologu p53) w komórkach raka pęcherza

moczowego (linia T74 i UMUC3) i kolczystokomórkowego skóry oraz

białka GADD45γ (growth arrest and DNA damage-inducible gene gamma)

w komórkach raka prostaty LNCaP [6, 25]. GADD45γ jest białkiem

zależnym od p53. Jego ekspresja wzrasta pod wpływem działania

czynników stresowych i uszkodzenia materiału genetycznego. GADD45γ

należy do białek hamujących cykl komórkowy oraz stymulujących

apoptozę. Mechanizm tego działania jest złożony i obejmuje pośrednictwo

w aktywacji ścieżki kinazy p38/c-Jun, interakcję z jądrowym antygenem

komórek proliferujących - PCNA (proliferating cell nuclear antygen)

i p21/WAF1/CIP1 oraz hamowanie aktywności kompleksu cyklina

B1-CDK1. Na skutek interakcji z PCNA i p21/WAF1/CIP1 białko

GADD45γ uczestniczy w zatrzymaniu cyklu komórkowego w fazie G1.

Z kolei inhibicja kompleksu cyklina B1-CDK1 prowadzi do zatrzymania

cyklu w punkcie kontrolnym G2-M [25, 26]. W przypadku badanych

komórek raka prostaty, w których doszło do ekspresji GADD45γ

pod wpływem kalcytriolu, stwierdzono kumulację komórek będących

w fazie G1 [25].

Kalcytriol może hamować wzrost komórek również poprzez wpływ

na ścieżki sygnałowe związane z kinazami: ERK 1/2 (extracellular signal-

related kinase 1/2), Akt, znaną także jako kinaza białkowa B (PKB -

protein kinase B) oraz MEKK-1 (MEK kinase-1). Kinazy ERK 1/2 należą

do grupy kinaz serynowo-treoninowych aktywowanych przez mitogen –

MAPK (mitogen-activated protein kinases). W wyniku zewnątrz-


33

komórkowej stymulacji, ulegają one fosforylacji przez kinazy MEK

(mitogen-activated protein kinase kinase) do aktywnej formy P-ERK 1/2.

W tej postaci przemieszczają się z cytoplazmy do jądra komórkowego,

gdzie aktywują czynniki transkrypcyjne stymulujące podziały komórkowe

np.: c-Myc, c-Jun, c-Fos czy Ets [27]. Z kolei Akt to cytoplazmatyczna

kinaza serynowo-treoninowa biorąca udział w regulacji ścieżek i mecha-

nizmów związanych m.in. z przeżyciem i proliferacją komórek. Aktywna,

ufosforylowana postać kinazy Akt działa stymulująco na cykl komórkowy.

Hamuje ona ekspresję oraz fosforyluje inhibitory kinazy CDK2 – p27/KIP1

oraz p21/WAF1/CIP1, uniemożliwiając im translokację do jądra

komórkowego. Kinaza Akt ponadto inaktywuje, poprzez fosforylację,

kinazę GSK3 (glycogen synthase kinase 3), co z kolei zapobiega

fosforylacji i inaktywacji cykliny D, cykliny E oraz czynników transkryp-

cyjnych c-Jun i c-Myc [28]. Przeprowadzone doświadczenia na komórkach

poddanych działaniu kalcytriolu wykazały spadek ilości ufosforylowanej

formy ERK 1/2 przy zachowaniu stałego poziomu ERK 1/2 oraz

zahamowanie ekspresji i fosforylacji Akt. Inhibicja fosforylacji kinaz ERK

1/2 związana jest z proteolitycznym rozpadem kinaz MEK pod wpływem

kaspaz [6, 20, 23, 29].

Kalcytriol może ponadto wpływać na poziom i aktywność kinazy

MEKK-1. Kinaza ta ulega ekspresji i aktywacyjnej fosforylacji

pod wpływem działania czynników stresu komórkowego oraz czynników

genotoksycznych. Powstała aktywna forma MEKK-1 może następnie ulec

proteolitycznemu rozpadowi pod wpływem kaspazy 3 do regulatorowej

domeny N-końcowej oraz aktywnej katalitycznie domeny C-końcowej.

Kinaza MEKK-1 uczestniczy w szlaku sygnalizacyjnym stresu

komórkowego oraz prowadzi do aktywacji kinaz MAPK: kinazy c-Jun N-

terminalnej – JNK (c-Jun N-terminal kinase) oraz p38 i stymulacji procesu

apoptozy. Badania in vitro przeprowadzone na komórkach SCC wykazały

zdolność kalcytriolu do indukcji ekspresji kinazy MEKK-1, dzięki czemu

może przyczynić się do zahamowania cyklu komórkowego i uruchomienia

mechanizmów programowanej śmierci komórki [6, 20, 30].

6. Apoptoza

Indukcja apoptozy jest jednym z głównych mechanizmów

przeciwnowotworowego działania kalcytriolu i jego pochodnych. Apoptoza

zwana inaczej programowaną lub samobójczą śmiercią komórki, jest

fizjologicznym procesem zachodzącym w stanie prawidłowo funkcjo-

nującego organizmu, który pozwala m.in. na eliminację starzejących się

i patologicznie zmienionych komórek [3]. Proces apoptozy jest uruchamiany

poprzez aktywację szlaku zależnego od mitochondriów (szlak wewnętrzny)


34

lub szlaku zależnego od tzw. receptorów śmierci z rodziny TNF (tumor

necrosis factor) (szlak zewnętrzny). Oba wymienione szlaki prowadzą do

aktywacji kaspaz, które z kolei są odpowiedzialne za proteolizę białek

niezbędnych do właściwego funkcjonowania komórek [31]. Jednym z takich

białek jest polimeraza poli-ADP-rybozy – PARP (poly-ADP-ribose

polimerase) – enzym, który rozpoznaje i naprawia uszkodzenia DNA.

Badania przeprowadzone na szczurzych komórkach raka prostaty wykazały

zdolność kalcytriolu do indukcji rozkładu enzymu PARP. Procentowa

wartość tego rozkładu wyniosła 90 – 100% przy zastosowaniu kalcytriolu w

stężeniu 10 µmol/l, co stanowiło wartość IC50 [23]. Proteolityczną degradację

PARP pod wpływem 1,25-(OH)2D3 wykazano także w przypadku badań

z wykorzystaniem komórek SCC. Stwierdzono ponadto, że rozkład PARP

może być jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za zwiększenie

wrażliwości SCC na działanie cisplatyny [6].

Apoptoza zależna od mitochondriów związana jest ze zwiększeniem

przepuszczalności błon mitochondrialnych i uwolnieniem do cytoplazmy

białek aktywujących kaskadę apoptotyczną np.: cytochromu c lub czynnika

indukcji apoptozy AIF (apoptosis inducing factor). Przepuszczalność błony

mitochondrialnej jest regulowana m.in. przez białka z rodziny BCL-2.

Białka BCL-2 są produktami onkogenów, które regulują proces śmierci

komórkowej. Do rodziny BCL-2 należą zarówno białka o działaniu

proapoptotycznym, np.: BAX i BAK; oraz antyapoptotycznym, np.: BCL-2,

BCL-XL i MCL-1 [32]. Podczas procesu apoptozy występujące

w cytoplazmie białka proapoptotyczne zmieniają swoją konformację,

a następnie wbudowują się do zewnętrznej błony mitochondrialnej.

Tam ulegają oligomeryzacji oraz przyłączają się do kanałów anionowych

zależnych od napięcia VDAC (voltage dependent anion channel)

powodując uwolnienie białek indukujących apoptozę [31]. Z kolei białka

antyapoptotyczne działają m.in. poprzez tworzenie z białkami

proapoptotycznymi heterodimerów, co ogranicza ich zdolność do oligome-

ryzacji. Antyapoptotyczne białko BCL-2 może ponadto łączyć się

z kanałami VDAC i zamykać ich światło [33]. Przeprowadzone badania

wykazały hamujący wpływ kalcytriolu na ekspresję BCL-2 w przypadku

komórek raka żołądka SNU1, przewodów żółciowych HuCCT, piersi

MCF-7, prostaty ALVA-31 oraz białaczki promielocytarnej HL-60

[22, 34, 35]. Proapoptotyczne działanie kalcytriolu potwierdziła również

indukcja ekspresji BAX w komórkach inwazyjnego raka sutka SUM-159PT

[24] oraz BAX i BAK w przypadku raka prostaty oraz gruczolaka i raka

jelita grubego [22]. Kalcytriol, wpływając przeciwstawnie na ekspresję

BCL-2 i BAX, zmienia wzajemny stosunek ich ilości w komórkach

na korzyść białka BAX, co w konsekwencji prowadzi do uwolnienia

z mitochondriów białek aktywujących wewnętrzny szlak apoptozy.


35

Badania z wykorzystaniem komórek raka trzustki Capan-1 wykazały

ponadto zdolność 1,25-(OH)2D3 do aktywacji kaspazy 9 oraz znaczny

wzrost aktywności kaspazy 8, 6, 9 i 3 w przypadku połączenia kalcytriolu

i gemcytabiny [36].

Kolejny mechanizm działania kalcytriolu, który może prowadzić

do apoptozy komórek nowotworowych, związany jest z odwrotną

transkryptazą telomerazy TERT (telomerase reverse transcriptase). TERT jest

białkiem kodowanym przez gen, którego ekspresja w komórkach ludzkich po

urodzeniu zostaje zahamowana, co skutkuje inaktywacją telomerazy

i skracaniem się telomerów po każdym podziale komórki, aż do momentu

całkowitego zahamowania aktywności proliferacyjnej. Wyjątek od tej reguły

stanowią komórki macierzyste i nowotworowe, posiadające aktywną

telomerazę. Zastosowanie 1,25-(OH)2D3 w terapii komórek nabłonkowych

raka jajnika spowodowało destabilizację mRNA TERT, co w konsekwencji

doprowadziło do zahamowania aktywności telomerazy, skrócenia telomerów

i indukcji apoptozy [37]. Z kolei w komórkach raka prostaty pod wpływem

kalcytriolu i kwasu 9-cis-retinowego doszło do zahamowania ekspresji TERT

w wyniku bezpośredniego oddziaływania heterodimeru receptorów VDR/RXR

z promotorem tego genu, co w konsekwencji skutkowało spadkiem aktywności

telomerazy [38].

Zdolność kalcytriolu do indukcji apoptozy komórek endotelialnych

pozwala na ograniczenie tworzenia się nowych naczyń krwionośnych

w obrębie tkanki nowotworowej, a co za tym idzie hamowanie wzrostu,

inwazyjności i możliwości tworzenia przerzutów przez guz. Warto zaznaczyć,

że tylko komórki endotelialne otrzymane z nowotworu – TDECs (tumor

derived endothelial cells) podlegają takiemu działaniu. Ma to

prawdopodobnie związek z ich większą wrażliwością na 1,25-(OH)2D3

z powodu epigenetycznego wyciszania genu dla CYP241A, odpowie-

dzialnego za przekształcenie kalcytriolu do 24-hydroksypochodnej o niskim

poziomie aktywności biologicznej [22].

7. Działanie antyangiogenne

Mechanizm antyangiogennego działania kalcytriolu związany jest z jego

wpływem na czynniki stymulujące tworzenie nowych naczyń

krwionośnych: czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF (vascular

endothelial growth factor) oraz interleukinę 8 (IL-8). Czynnik VEGF jest

jednym z kluczowych regulatorów angiogenezy. W stosunku do komórek

śródbłonka naczyniowego wykazuje działanie mitogenne oraz stymuluje

ich migrację oraz elongację. Badania przeprowadzone przez Mantel i wsp.

Wykazały zdolność kalcytriolu do hamowania elongacji oraz proliferacji

komórek endotelialnych BAEC (bovine aortic endothelial cell)


36

stymulowanych VEGF. 1,25-(OH)2D3 hamował również formowanie

się sieci wydłużonych komórek śródbłonka w żelu kolagenowym

3D. Antyangiogenne właściwości kalcytriolu zostały także potwierdzone

w badaniach in vivo z wykorzystaniem myszy, którym wszczepiono

komórki raka piersi MCF-7 oraz MDA-435S. Ośmiotygodniowa terapia

kalcytriolem badanych zwierząt skutkowała mniejszą waskularyzacją

guzów w porównaniu do grupy kontrolnej, która nie otrzymywała leku [39].

8. Prozapalne działanie

IL-8 jest chemokiną, która oprócz zdolności do rekrutacji i stymulacji

przemieszczania się leukocytów do miejsca zapalenia, posiada

m.in. właściwości pobudzające patologiczną angiogenezę, wzrost guzów

nowotworowych i tworzenie przerzutów. Badania z wykorzystaniem

normalnych (HPr-1, RWPE-1) oraz złośliwych androgenoniezależnych

(PC-3, DU145 Pca) i androgenozależnych (LNCaP) komórek epitelialnych

prostaty wykazały ich zdolność do ekspresji i wydzielania IL-8. Profil

ekspresji był skorelowany ze stopniem agresywności badanych komórek:

najwyższy poziom mRNA IL-8 odnotowano w przypadku komórek

androgenoniezależnych [34]. Poddanie opisanych komórek działaniu

kalcytriolu spowodowało w każdym przypadku obniżenie poziomu mRNA

i białka IL-8. Mechanizm tego działania związany jest z blokowaniem

translokacji do jądra komórkowego białka p65, które stanowi podjednostkę

czynnika transkrypcyjnego NF-κB, odpowiedzialnego za ekspresję IL-8 [40].

9. Podsumowanie

Witamina D3 bierze udział w regulacji wielu procesów metabolicznych

organizmu. Jej klasyczne działanie to wpływ na gospodarkę wapniowo-

fosforanową organizmu. Doniesienia z ostatnich lat wskazują jednak

również na istotny wpływ witaminy D3 i pochodnych na proliferację

i dyferencjację komórek oraz modulację odpowiedzi immunologicznej.

W świetle tych informacji związki te budzą ogromne nadzieje w aspekcie

poszukiwań nowych leków antynowotworowych.


37

Literatura

1. Holick M.F. Vitamin D: a millennium perspective, J Cell Biochem., 88 (2003),

pp. 296-307

2. Prosser E., Jones G. Enzymes involved in the activation and inactivation

of vitamin D, Trends Biochem Sci., 29 (2004), pp. 664-673

3. Pełczyńska M., Jaroszewicz I., Świtalska M., Opolski A. Właściwości

biologiczne kalcytriolu i jego nowych analogów – potencjalne zastosowania

terapeutyczne, Postepy Hig Med Dosw., 59 (2005), pp. 129-139

4. Tukaj C. Właściwy poziom witaminy D warunkiem zachowania zdrowia,

Postepy Hig Med Dosw., 62 (2008), pp. 502-510

5. Doroszko A., Gronowicz E., Niedzielska E. Cholekalcyferol a procesy wzrostu

i różnicowania komórek - znaczenie w terapii onkologicznej, Onkol Pol.,

1 (2008), pp. 15-18

6. Ma Y., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D in combination cancer treatment,

J Cancer., 1 (2010), pp. 101-107

7. Trump D.L., Muindi J., Fakih M., Yu W.D., Johnson C.S. Vitamin

D compounds: clinical development as cancer therapy and prevention agents,

Anticancer Res., 26 (2006), pp. 2551-2556

8. Kopij M., Rapak A. Rola receptorów jądrowych w procesie śmierci komórek,

Postepy Hig Med Dosw., 62 (2008), pp. 571-581

9. Brown A.J. Mechanisms for the selective actions of vitamin D analogues, Curr

Pharm Des., 6 (2000), pp. 701-716

10. Trump D.L., Deeb K.K., Johnson C.S. Vitamin D: considerations

in the continued development as an agent for cancer prevention and therapy,

Cancer J., 16 (2010), pp.1-9

11. Mathiasen I.S., Lademannm U., Jäättelä M.Apoptosis induced by vitamin

D compounds in breast cancer cells is inhibited by Bcl-2 but does not involve

known caspases or p53, Cancer Res., 59 (1999), pp. 4848-4856

12. Rostkowska−Nadolska B., Latocha M., Gawron W., Kutner A., Bochnia M.

Badanie wpływu kalcitriolu i tacalcitolu na proliferację fibroblastów

otrzymanych z polipów nosowych, Adv Clin Exp Med., 16 (2007), pp. 213-219

13. Arends J. Vitamin D in oncology, Forsch Komplementmed., 18 (2011),

pp. 176-184

14. Molica S., Digiesi G., Antenucci A., Levato L., Mirabelli R., Molica M.,

Gentile M., Giannarelli D., Sperduti I., Morabito F., Conti L. Vitamin

D insufficiency predicts time to first treatment (TFT) in early chronic

lymphocytic leukemia (CLL), Leuk Res., 36 (2012), pp. 443-447

15. Swami S., Krishnan A.V., Feldman D. Vitamin D metabolism and action

in the prostate: implications for health and disease, Mol Cell Endocrinol.,

347 (2011), pp. 61-69

16. Yaghjyan L., Colditz G.A. , Drake B.Vitamin D and mammographic breast

density: a systematic review, Cancer Causes Control., 23 (2012), pp. 1-13

17. Ramnath N., Kim S., Christensen P.J. Vitamin D and lung cancer, Expert Rev

Respir Med., 5 (2011), pp. 305-309


38

18. Lazzeroni M., Gandini S., Puntoni M., Bonanni B., Gennari A., DeCensi A.

The science behind vitamins and natural compounds for breast cancer

prevention. Getting the most prevention out of it, Breast., 20 (2011), pp. 36-41

19. Woloszynska-Read A., Johnson C.S., Trump D.L. Vitamin D and cancer:

clinical aspects, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab., 25 (2011),

pp. 605-615

20. Beer T.M. Development of weekly high-dose calcitriol based therapy

for prostate cancer, Urol Oncol., 21 (2003), pp. 399-405

21. Zittermann A. Vitamin D in preventive medicine: are we ignoring

the evidence?, Br J Nutr., 89 (2003), pp. 552-572

22. Deeb K.K., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D signaling pathways

in cancer: potential for anticancer therapeutics, Nat Rev Cancer., 7 (2007),

pp. 684-700

23. Johnson C.S., Hershberger P.A., Bernardi R.J., McGuire T.F. , Trump

D.L. Vitamin D receptor: a potential target for intervention, Urology.,

60 (2002), pp. 123-130

24. Kuryłowicz A., Bednarczuk T., Nauman J. Wpływ niedoboru witaminy

D na rozwój nowotworów i chorób autoimmunologicznych, Pol J Endocrinol.,

58 (2007), pp. 140-152

25. Flores O., Burnstein K.L. GADD45gamma: a new vitamin D-regulated gene

that is antiproliferative in prostate cancer cells, Endocrinology., 151 (2010),

pp. 4654-4664

26. Liebermann D.A., Hoffman B. Gadd45 in stress signaling, J Mol Signal.,

(2008), pp. 3-15

27. Chang F., Steelman L.S., Lee J.T., Shelton J.G. , Navolanic P.M., Blalock

W.L., Franklin R.A., McCubrey J.A. Signal transduction mediated

by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors totranscription

factors: potential targeting for therapeutic intervention, Leukemia., 17 (2003),

pp. 1263-1293

28. Mitsuuchi Y., Johnson S.W., Selvakumaran M., Williams S.J., Hamilton T.C.,

Testa J.R. The phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signal transduction

pathway plays a critical role in theexpression of p21WAF1/CIP1/SDI1

induced by cisplatin and paclitaxel, Cancer Res., 60 (2000), pp. 5390-5394

29. McGuire T.F., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D(3)-induced apoptosis

of murine squamous cell carcinoma cells. Selective induction of caspase-

dependent MEK cleavage and up-regulation of MEKK-1, J Biol Chem.,

276 (2001), pp. 26365-26373

30. Hershberger P.A., McGuire T.F., Yu W.D., Zuhowski E.G., Schellens J.H.,

Egorin M.J., Trump D.L., Johnson C.S. Cisplatin potentiates

1,25-dihydroxyvitamin D3-induced apoptosis in association with increased

mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKK-1) expression,

Mol Cancer Ther., 1 (2002), pp. 821-829

31. Stańczyk M., Majsterek I. Apoptoza – cel ukierunkowanej terapii

przeciwnowotworowej, Post Biol Kom., 35 (2008), pp. 467-484


39

32. Rupniewska Z., Bojarska-Junak A. Apoptosis: mitochondrial membrane

permeabilization and the role played by Bcl-2 family proteins, Postepy

Hig Med Dośw., 58 (2004), pp. 538-547

33. Hordyjewska A., Pasternak K. Apoptotic death of the cell, Adv Clin Exp Med.,

14 (2005), pp. 545-554

34. Baek S., Lee Y.S., Shim H., Yoon S., Baek S.Y., Kim B.S., Oh S.O. Vitamin

D3 regulates cell viability in gastric cancer and cholangiocarcinoma, Anat

Cell Biol., 44 (2011), pp. 204-209

35. Guzey M., Kitada S., Reed J.C. Apoptosis induction by 1alpha,25-

dihydroxyvitamin D3 in prostate cancer, Mol Cancer Ther., 1 (2002), pp. 667-677

36. Yu W.D., Ma Y., Flynn G., Muindi J.R., Kong R.X., Trump D.L., Johnson

C.S. Calcitriol enhances gemcitabine anti-tumor activity in vitro and in vivo

by promoting apoptosis in a human pancreatic carcinoma model system, Cell

Cycle., 9 (2010), pp. 3022-3029

37. Jiang F., Bao J., Li P., Nicosia S.V. , Bai W. Induction of ovarian cancer cell

apoptosis by 1,25-dihydroxyvitamin D3 through the down-regulation

of telomerase, J Biol Chem., 279 (2004), pp. 53213-53221

38. Ikeda N., Uemura H., Ishiguro H., Hori M., Hosaka M., Kyo S., Miyamoto K.,

Takeda E., Kubota Y. Combination treatment with 1alpha,25-

dihydroxyvitamin D3 and 9-cis-retinoic acid directly inhibitshuman

telomerase reverse transcriptase transcription in prostate cancer cells, Mol

Cancer Ther., 2 (2003), pp. 739-746

39. Mantell D.J., Owens P.E., Bundred N.J., Mawer E.B., Canfield A.E. 1α,25-

dihydroxyvitamin D3 inhibits angiogenesis in vitro and in vivo, Circ Res.,

87 (2000), pp. 214-220

40. Bao B.Y., Yao J., Lee Y.F. 1α,25-dihydroxyvitamin D3 suppresses interleukin

8 –mediated prostate cancer cell angiogenesis, Carcinogenesis., 27 (2006),

pp. 1883-1893

Antitumor effect of the vitamin D3

Vitamin D is a group of seco-steroid compounds called calcitoferols. The most important here are: vitamin D2 (ergocalciferol) and resulting in the bodies of animals and humans,

vitamin D3 (cholecalciferol). Cholecalciferol itself has no biological activity and to be able

to act effectively on target tissues and organs, is converted to its active form - calcitriol

(1,25-dihydroxycholecalciferol, 1,25 (OH) 2D3). It is the most known for its influence on the differentiation and specialization of bone tissue, normal skeletal development

in young children as well as for the proper functioning of its construction and adults.

Calcitriol and its derivatives may also directly or indirectly affect the functioning of cells

unrelated to calcium-phosphate homeostasis. Due to the presence in the cells of 1α-hydroxylase, and vitamin D receptors, VDR, the resulting 1,25 (OH) 2D3 can regulate

the cell cycle, proliferation, differentiation and apoptosis and the expression of cytokines,

growth factors, enzymes and hormones. This multidirectional action raises great interest

in tumor therapy. Reference is made to increase the expression of genes encoding inhibitors of cyclin-dependent kinase CDK2: CDKN1A (encodes a protein p21/WAF1/CIP1)

and CDKN1B (encodes a protein p27/KIP1) and the repression of the genes encoding cyclin

D1, D3, A1, and E1, the influence on the protein levels of p53, p73 or GADD45γ. Calcitriol


40

may also inhibit cell growth by interfering with the signaling pathways associated with

kinases: ERK 1/2, Akt and MEKK-1. Research conducted on different tumor lines (breast

adenocarcinoma, glioblastoma, melanoma) confirm the cytotoxic and antiproliferative

effects of calcitriol and the effect on the expression of TP53 and the ratio of the products of gene expression of BAX and BCL-2 in the test cells. Changes in the expression of BCL-2

and BAX may lead to the release of mitochondrial proteins internal activating the apoptotic

pathway. To induce apoptosis can also be carried out by telomerase reverse transcriptase

TERT mRNA destabilization caused by the presence of 1,25 (OH) 2D3.

41

Monika Pilecka1, Maciej Berbecki

2, Katarzyna Wojewoda

3

Receptor programowanej śmierci PD-1

jako potencjalny cel w terapii nowotworów

Ciągle doskonalona o nowe doniesienia i przesłanki wiedza na temat molekularnych mechanizmów rządzących odpowiedzią immunologiczną

ustroju na nowotwór prowadzi do identyfikacji „gorących punktów”

(ang. checkpoint- punkt krytyczny) na ścieżkach sygnałowych

zaangażowanych w ograniczanie immunologicznej odpowiedzi antynowo-tworowej ustroju. Jednym z rozpoznawanych jako najbardziej kluczowe

punktem, odpowiedzialnym za pośredniczenie w powstawaniu indukowanej

nowotworzeniem supresji układu immunologicznego, jest ścieżka receptora

programowanej śmierci PD-1, która w warunkach prawidłowych odpowiada za tolerancję immunologiczną ustroju i zapobiega niszczeniu tkanek

w warunkach przewlekłych zapaleń. Receptor programowanej śmierci PD-1

wykazuje nadmierną ekspresję w aktywowanych limfocytach T i hamuje

funkcje tych limfocytów do momentu związania ze swoimi ligandami B7-H1 (PD-L1) i B7-DC (PD-L2). Wiele nowotworów litych wykazuje

ekspresję ligandu PD-1 (PD-L1) co często koreluje z gorszym rokowaniem.

Limfocyty naciekające guz wyizolowane od pacjentów z nowotworem, który

typowo wykazuje ekspresję PD-1 posiadają upośledzone mechanizmy antynowotworowe. Dowody takie płyną z analizy kilku badań przed-

klinicznych, w których blokada PD-1 lub PD-L1 poprawiały funkcje

limfocytów T i podnosiły skuteczność lizy komórek nowotworu. Aktualnie

trzy przeciwciała monoklonalne przeciwko PD-1 oraz jedno przeciw PD-L1 przeszły fazę pierwszą badań. Wszystkie cztery czynniki wykazują wstępnie

obiecujące właściwości, a ewaluacja na szerszej grupie badanych przynosi

zachęcające informacje odnośnie bezpieczeństwa leków. Jeśli kolejne

doniesienia potwierdzą wstępne rezultaty, czynniki blokujące szlak PD-1/PD-L1 staną się wartościową pozycją w arsenale leków immuno-

terapeutycznych w walce z nowotworami.

[email protected], Katedra i Zakład Gastroenterologii z Pracownią

Endoskopową Uniwersytetu Medycznego w Lublinie [email protected], Staż podyplomowy Szpital MSW w Lublinie

[email protected], Katedra i Zakład Ortopedii i Traumatologii Narządu Ruchu

Uniwersytetu Medycznego w Lublinie





42

1. Wstęp

Wraz z rosnącą liczbą zachorowań na nowotworowy złośliwe medycyna

XXI wieku staje nie tylko przed problemem szybkiej i skutecznej

diagnostyki ale również profilaktyki pierwotnej, wyłaniania grup

o wysokim stopniu narażenia oraz poszukiwania nowoczesnych rozwiązań

w leczeniu radykalnym i paliatywnym. Nowoczesna genetyka molekularna

w walce z nowotworami analizuje różnorodne szlaki patogenetyczne,

z których istotne znaczenie w onkogenezie okazują się mieć: cytokiny

zapalne, infekcje, mutacje oraz wyłamywanie się spod nadzoru

immunologicznego. Przykładami stanów przednowotworowych są min.:

metaplazja Barretta, polipy jelita grubego, zespoły polipowatości rodzinnej,

pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, choroba

Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, przewlekłe

zapalenie trzustki. W wyżej wymienionych przypadkach nowoczesnym

wymiarem profilaktyki byłaby identyfikacja molekularnego czynnika/-ów

progresji stanów przedrakowych do nowotworu inwazyjnego, wyłonienie

markera klinicznie użytecznego i wdrożenie skutecznej immunoterapii

jeszcze przed diagnozą „carcinoma in situ”. Bowiem stosowane obecnie

metody predykcji (markery, antygeny) nie są wystarczająco skuteczne

dla określenia kierunku i dynamiki rozwoju takich zmian [8].

Ciągle doskonalona wiedza na temat molekularnych mechanizmów

rządzących odpowiedzią organizmu na nowotwór prowadzi do identyfikacji

„gorących punktów” sygnałowych na ścieżkach zaangażowanych

w funkcjonowanie prawidłowej antynowotworowej odpowiedzi immuno-

logicznej. Okazuje się, że kontrola rozwijającej się odpowiedzi immuno-

logicznej jest niezwykle istotnym aspektem regulacji mechanizmów układu

odpornościowego. Ta wysoce czuła i wielostopniowa selekcja umożliwia

niszczenie obcych antygenów i jednocześnie tolerancję na antygeny własne.

Wyróżnia się tolerancję centralną, dzięki której już w fazie dojrzewania

eliminowane są komórki autoreaktywne oraz tolerancję obwodową, której

podlegają komórki, które nabyły autoreaktywność w późniejszych stadiach

rozwoju. W sytuacjach gdy mechanizmy tolerancji pozostają nieszczelne lub

działają nieprawidłowo dochodzi do rozwoju zaburzeń autoimmuno-

logicznych [1, 2, 6]. Udowodniono, że niektóre z zabu-rzeń o podłożu

autoimmunologicznym predysponują do rozwoju nowotworów.

Dowiedziono również, że oprócz zaburzeń tolerancji immunologicznej

do rozwoju procesu nowotworowego przyczynia się nabycie przez

patologicznie zmienione komórki cech, które pozwalają im na modulację

odpowiedzi immunologicznej. Komórki takie posiadają zdolność zmiany

fenotypu (dysplasia), generowania antygenów (markery nowotworowe)

oraz modulowania sygnałów swojego mikrośrodowiska celem ucieczki

Receptor programowanej śmierci

PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów

43

spod nadzoru immunologicznego. Okazuje się, że u podstaw, zarówno

zaburzeń tolerancji jak i modulacji odpowiedzi immunologicznej

prowadzących do utrzymywania się zmienionych patologicznie/nowotworowo

komórek leżą zaburzenia szlaku sygnałowego receptora programowanej

śmierci PD-1 (ang. Programmed cell-death-1 receptor) i jego ligandów:

PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (B7-DC). Receptor programowanej śmierci PD-1

(CD279), należący do rodziny CD28 jest tzw. negatywnym receptorem

zlokalizowanym na powierzchni limfocytów [3,4]. Negatywne receptory

ulegają pobudzeniu w odpowiedzi na ligand podczas kontaktu limfocytu

z komórką prezentującą antygen (ang. antigen presenting cell – APC)

[9,10,13]. Ich zadaniem jest generowanie sygnału hamującego aktywację,

proliferację i funkcje efektorowe limfocytów, tak aby w momencie

zakończenia roli limfocytu w zwalczaniu antygenu nie nabrał on cech

niepożądanych, autoreaktywnych lub nowotworowych. Receptor ten

odpowiada za zachowanie tolerancji, zapobiega rozwojowi chorób

autoimmunologicznych, a także kontroluje uszkodzenia tkanek zdrowych

podczas infekcji [7]. W przypadkach utrzymywania się stanu stymulacji

antygenem (przewlekłe infekcje, przewlekłe zapalenia) dochodzi do

przedłużającej się i wysokiej ekspresji PD-1 na limfocytach. Limfocyty

takie określane są mianem „wyczerpanych” (ang. exhausted), a ich funkcje

cytotoksyczne są upośledzone [11]. Wysoka ekspresja liganda

i/lub pobudzenie ekspresji receptora PD-1 może hamować odpowiedź

przeciwnowotworową; dodatkowo wysoki poziom ekspresji PD-1 promuje

utrzymywanie się ognisk przewlekłego zapalenia w organizmie i tolerancji

na obce antygeny przyczyniając się do rozwoju procesu nowotworowego

[6, 7, 12, 14,16, 17]. Bardzo istotne znaczenie szlaku PD-1/PD-1L wynika

z faktu jego powszechnej ekspresji w organizmie i dużej możliwości

indukcji- to zdecydowanie wyróżnia receptor PD-1 na tle innych cząsteczek

z rodziny CD28, w tym także innej immunosupresyjnej cząsteczki CTLA-4

(ang. cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) [7, 14].

Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko składowym szlaku

PD-1/PD-L1 jest obiecującym przykładem translacji badań nad układem

immunologicznym do celów terapeutycznych. Dotychczas dokonany

postęp w dziedzinie immunoterapii nowotworów z zastosowaniem

przeciwciał przeciwko cząsteczkom PD-1 oraz PD-1 pozwala sądzić,

że ich wykorzystanie będzie coraz powszechniejsze w przyszłości.


44

2. Receptor programowanej śmierci PD-1 jako kolejny „gorący

punkt” w immunoterapii nowotworów

2.1. Charakterystyka funkcji receptora PD-1 i jego ligandów

Rodzina sygnałowych cząsteczek CD28 (B7), do której należy receptor

programowanej śmierci PD-1 (CD279) odgrywa kluczową rolę w prawid-

łowej aktywacji limfocytów T w odpowiedzi komórkowej. Cząsteczki tej

rodziny dostarczają krytycznego sygnału zarówno w aktywacji jak

i hamowaniu limfocytów T. Poprzez aktywację limfocytów przyczyniają się

do wzrostu ich populacji, różnicowania i zwiększenia produkcji cytokin;

poprzez negatywny sygnał „usypiają” funkcję limfocytów [16, 25].

Receptor PD-1 został po raz pierwszy opisany w latach 90. XX wieku

przez Ishida i współpracowników [5]

. Od tamtej pory trwają intensywne

badania molekularne nad ekspresją PD-1 w różnorodnych nowotworach.

Aktualnie pojawiają się obiecujące doniesienia o efektach prób

przedklinicznych, z przeciwciałami monoklonalnymi hamującymi

ekspresję PD-1/PD-1L [8, 22, 23, 24, 26, 28, 29]. Receptor PD-1 jest

glikoproteiną o budowie charakterystycznej dla typu I transbłonowych

protein. Najistotniejszym funkcjonalnie elementem struktury receptora jest

ogon cytoplazmatyczny, który zawiera dwa motywy tyrozynowe (ITSM),

do których przyłączane są fosfatazy odpowiedzialne za przekazywanie

sygnału immunosupresyjnego [7, 27].

Do ekspresji receptora PD-1 dochodzi na komórkach prezentujących

antygen: głównie limfocytach B i T (poprzez szlak sygnałowy TCR

i BCR), a także komórkach dendrytycznych i monocytach [7, 19].

Aktywacja PD-1 zachodzi w momencie związania jednego z jego

ligandów: PD-1L (B7-H1) i PD-2L (B7-DC). Na większości komórek

ludzkiego organizmu stwierdza się ekspresję PD-L1, zaś PD-L2- głównie

na komórkach dendrytycznych i monocytach [27]. Po aktywacji receptora

PD-1 zostaje do niego przekazany negatywny sygnał, który hamuje szlaki

receptorów TCR/BCR, czego efektem jest spadek produkcji cytokin, białek

antyapoptotycznych (np. Bcl-2) oraz wzrost syntezy IL-10, która hamuje

odpowiedź zapalną [12, 20]. Ekspresja PD-1 jest podtrzymywana tak

długo, jak długo utrzymuje się stymulacja antygenem. W sytuacji

przedłużającego się stanu stymulacji antygenem (przewlekłe infekcje,

zapalenia) mamy do czynienia z wysoką ekspresją PD-1 na limfocytach,

których funkcje ulegają stopniowemu upośledzeniu i wyczerpaniu (fenotyp

limfocytów „wyczerpanych”, opisywany min. w przewlekłej białaczce

limfocytowej) [21]. W efekcie dochodzi do upośledzenia komórkowych

mechanizmów obrony organizmu i zaburzenia homeostazy ustroju, które

mogą skutkować osłabieniem „czujności” immunologicznej [6]. Obserwuje



45

się swego rodzaju dezorganizację informacyjną w obrębie komórek:

z jednej strony wysoka ekspresja PD-1 wskazuje na konieczność

wzmożonej aktywności przeciwko obcym antygenom, z drugiej zaś strony

wygasanie cytokinowej reakcji zapalnej hamuje migrację komórek żernych

i aktywność cytotoksyczną. Kaskada reakcji unieczynniających antygen nie

może zostać zakończona pełną eliminacją, a reakcja zapalna całkowitym

wygaszeniem ognisk zapalenia.

2.2. Charakterystyka ekspresji receptora PD-1 i jego ligandów

Ekspresja ligandów receptora programowanej śmierci PD-1 jest

zróżnicowana. Na większości komórek organizmu obserwuje się ekspresję

PD-L1, zaś PD-L2 ogranicza się do komórek dendrytycznych i monocytów

[14]. Oba ligandy współzawodniczą o wiązanie się do receptora,

z tym że PD-L2 wykazuje średnio trzykrotnie większe powinowactwo

do PD-1 niż PD-L1 [15]. Ekspresję PD-L1 stwierdzono w rakach: płuc,

okrężnicy, żołądka, nerki, piersi, pęcherza moczowego, nowotworach

głowy i szyi oraz czerniaku [14,18,19,29]. Podwyższenie ekspresji PD-L1

w badaniach nad chorymi z rakiem nerki, przełyku, trzustki oraz jajnika

została powiązana z krótszym czasem przeżycia. Opisano ekspresję PD-1

i PD-L1 w chłoniakach ziarniczych jak i nieziarniczych.

Do tej pory nie poznano mechanizmu, na drodze którego komórki

nowotworowe wzbudzają ekspresję PD-L1 na własnych komórkach, bądź

PD-1 na limfocytach naciekających zmianę. Wydaje się, że znaczący

wpływ na poziom ekspresji szlaku PD-1/PD-L mają warunki

mikrośrodowiska komórek nowotworu, co potwierdza fakt iż ekspresja

PD-L1 na świeżo izolowanych komórkach nowotworowych jest wyższa

niż w analogicznych komórkach pochodzących z hodowli komórkowej.

2.3. Rola szlaku PD-1 w odpowiedzi przeciwnowotworowej

Z analizy piśmiennictwa wynika że szlak sygnałowy PD-1/PD-1L jest

jednym z istotniejszych w odpowiedzi przeciwnowotworowej organizmu.

Komórki nowotworowe wykorzystują szlak PD-1 w następujących

mechanizmach:

hamowanie odpowiedzi przeciwnowotworowej poprzez wysoką

ekspresję liganda lub/i pobudzenie receptora PD-1;

hamowanie odpowiedzi zapalnej poprzez nasilenie negatywnego

sygnału ko stymulującego;

nabywanie przez komórki nowotworowe właściwości

antyapoptotycznych;

nasilenie apoptozy limfocytów atakujących komórki nowotworowe

wykazujące podwyższoną ekspresję PD-L1;


46

modyfikacja warunków mikrośrodowiska, w którym rozwija

się nowotwór: umiejętność wzbudzania ekspresji PD-L1 na

komórkach nowotworowych oraz limfocytach naciekających zmianę

(mechanizmy niewyjaśnione).

3. Potencjał kliniczny przeciwciał anty-PD-1 i anty-PD-L1

3.1. Badania przedkliniczne- blokada receptora PD-1 i jego

ligandów

Blokada zarówno receptora PD-1, jak i jego ligandów wykazała jednolity

efekt immunostymulujący w fazie badań przedklinicznych. Przeciwciała

przeciwko PD-1 i PD-L1 mogą zwiększać lub odbudowywać efektorowe

funkcje limfocytów T, włączając w to cytolityczną aktywność skierowaną

przeciwko komórkom nowotworowym. Dodatkowo, blokada PD-L1 promuje

naciek guza limfocytami CD8+ o właściwościach antynowotworowych, co

udowodniono na mysim modelu raka trzustki. Przeciwciała anty-PD-1

hamują przerzutowanie w czerniaku oraz raku jelita grubego na modelu

mysim. Eksperyment na mysich limfocytami pozbawionych PD-1 wykazał

zahamowanie rozsiewu guza drogą krwio-pochodną poprzez mechanizmy

potęgujące proliferację i cytotoksyczność limfocytów T. Badania dowiodły

również synergizm efektów chemioterapii i działania przeciwciał anty-PD-

L1. Te obserwacje mają istotne implikacje dla rozwoju potencjalnych

strategii leczniczych u pacjentów znowotworami.

3.2 Badania kliniczne z zastosowaniem przeciwciał anty-PD-

1/anty-PD-L1 [26, 28,29]

3.2.1. Przeciwciała anty-PD-1

NIVOLUMAB (BMS-936558)

Nivolumab, ludzkie IgG4 przeciwciało anty-PD-1, ex vivo wykazywał

wzrost proliferacji i produkcji cytokin limfocytów T, które dodatkowo

charakteryzowały się wzmożonym powinowactwem i właściwościami

litycznymi w stosunku do komórek czerniaka w hodowli. Także myszy

z czerniakiem i nowotworem przełyku przeżywały dłużej po terapii

nivolumabem i GM-CSF.

Pierwsza faza badań klinicznych z użyciem różnych dawek

(0,3-10 mg/kg) nivolumabu u pacjentów w zaawansowanym stadium

czerniaka, raka nerki, raka niedrobnokomórkowego płuc i raka odbytu

rozpoczęto w 2010 roku. W badaniu tym zaobserwowano jedną całkowitą

remisję dla raka odbytu i 2 częściowe odpowiedzi na leczenie

dla pacjentów z czerniakiem i rakiem nerki. Na limfocytach T uzyskanych



47

z krwi obwodowej pacjentów, w drodze analizy za pomocą cystometrii

przepływowej, stwierdzono długotrwałe utrzymywanie się większości

receptorów PD-1 nawet po 3 miesiącach od zastosowania pojedynczej

dawki nivolumabu. W późniejszym badaniu kohortowym stosowano dawki

10 mg/kg uzyskując dobrą odpowiedź u pacjentów z czerniakiem i rakiem

nerki oraz nie obserwując toksycznych działań niepożądanych. Jeden

z uczestników badania, pacjent z nowotworem nerki, po aplikacji 3 dawek

nivolumabu osiągnął częściową regresję guza utrzymującą się przez ponad

16 miesięcy [26, 28].

Zachęcające wyniki badań z zastosowaniem pojedynczych dawek

przeciwciał anty-PD-1 sugerowały konieczność zastosowania dwutygod-

niowego harmonogramu podawania substancji (nivolumab co 2 tygodnie

w 8-tygodniowych cyklach). Uzyskano ORs (ang. objective response rate)

u 20/122 pacjentów z rakiem niedrobnokomórkowym płuc, 33/106

z czerniakiem i 10/34 z rakiem nerki.

Nivolumab jest aktualnie przedmiotem badań kilku badań klinicznych

z udziałem pacjentów z rakiem nerki, czerniakiem i innymi nowotworami.

PIDILIZUMAB (CT-011)

Humanizowane przeciwciało anty-PD-1 pod nazwą pidilizumab

w badaniach przedklinicznych wykazało właściwości stymulujące

odpowiedź komórkową przeciwko komórkom szpiczaka mnogiego.

Rozpoczęto badania w grupie chorych na szereg nowotworów

hematologicznych, uzyskując odpowiedź na leczenie u 1/3 chorych.

Obecnie trwają badania nad aktywnością przeciwnowotworową

pidilizumabu w guzach litych [26].

LAMBROLIZUMAB (MK-3475)

Lambrolizumab to humanizowane przeciwciało IgG4 skierowane

przeciwko receptorowi PD-1, którego efekt działania oceniono u chorych

z różnymi nowotworami litymi obserwując do tej pory dwie częściowe

remisje w przypadku czerniaka [26,29].

Bez randomizowanych badań wspomnianych wyżej substancji, oceny

bezpieczeństwa i profilu aktywności a także porównania wyników

z zastosowaniem przeciwciał anty-PD-1 oraz anty-PD-L1, żadne ostateczne

zestawienia nie mogą być uważane za pełne. Z dotychczasowych wyników

wynika, że stosowanie leków będących przeciwciałami anty-PD-L1 może

wiązać się z mniejszą toksycznością narządową, podczas gdy blokowanie

z użyciem przeciwciał anty-PD-1 wydaje się przekładać na lepszą

skuteczność kliniczną.


48

3.2.2. Przeciwciała anty-PD-L1

BMS-936559 to przeciwciało nad którym w 2012 roku rozpoczęto badania

w grupie 217 pacjentów z nowotworami litymi (rak niedrobnokomórkowy

płuc, czerniak, rak odbytu, rak nerki, rak trzustki, rak jajnika i piersi) [29,

26]. Przeciwciało podawano co 2 tygodnie w cyklach 6-tygodniowych

uzyskując 9 odpowiedzi w czerniaku, 2 w raku nerki, 5 w niedrobnoko-

mórkowym raku płuca i 1 w raku jajnika.

4. Podsumowanie

Mimo że pierwsza generacja immunoterapeutyków cechuje

się ograniczoną skutecznością, prace nad tymi substancjami dowiodły

koncepcji, że u niektórych pacjentów „równowaga immunologiczna”

w tkance nowotworowej może być przesunięta na korzyść eliminacji guza.

Ciągłe poszerzanie i zdobywanie wiedzy na temat roli układu

immunologicznego w karcinogenezie ujawnia różnorodne szlaki, poprzez

które nowotwór „ucieka” mechanizmom immunologicznym odpowie-

dzialnym za jego niszczenie. Rola receptora programowanej śmierci PD-1

oraz innych negatywnych receptorów kostymulujących, zaangażowanych w

odpowiedź immunologiczną typu komórkowego, jest obiecującym

przykładem translacji badań nad układem immunologicznym do celów

terapeutycznych. Różnorodne nowotwory lite wykazują ekspresję PD-L1,

co często ma odzwierciedlenie w złym rokowaniu klinicznym, podczas gdy

limfocyty naciekające guzy o ekspresji PD-1 posiadają upośledzone

funkcje antynowotworowe. Wyniki przedklinicznych badań z zastoso-

waniem przeciwciał anty-PD-1/PD-L1 przynoszą wstępne, obiecujące

rezultaty; naukowcy podkreślają poprawę właściwości i funkcji antynowot-

worowych limfocytów T organizmu po zastosowaniu tych substancji.

W dalszym ciągu do rozwiązania pozostają kwestie toksyczności dawek oraz

występowania efektów ubocznych. Potencjał leczniczy przeciwciał anty-PD-1

i anty-PD-L1 u pacjentów w zaawansowanym stadiów nowotworów jest

znaczący i wymaga kolejnych nowatorskich badań.

Literatura

1. Van Noort J.M., van Sechel A., Boon J., Boersma W.J., Polman C.H., et al (1993)

Minor myelin proteins can be major targets for peripheral blood T cells both

multiple sclerosis patients and healthy subjects, J. Neuroimmunol 46: 67-72

2. Lohmann T., Leslie RD., Londei M. (1996) T cell clones to epitopes

of glutamic acid decarboxtlase 65 raised from normal subjects and patients

with insulindependent diabetes, J Autoimmun 9:385-389

3. Lenchow D.J., Walunas T.L., Bluestone J.A. (1996) CD28/B7 system of T cell

costimulation, Annu Rev Immunol 14: 233-258



49

4. Grewal I.S., Flavell R.A. (1998) CD40 and CD154 in cell- mediated immunity,

Annu Rev Immunol 16: 111-135

5. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. (1992) Incluced expression

of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon

programmed cell death, EMBO J 11: 3887-3895

6. Liang S.C., Latchman Y.E., Buhlmann J.E., Tomczak M.F., Horwitz B.H.,

et al (2003) Regulation of PD-1, PD-1L and PD-L2 expression during normal

and autoimmune responses, Eur J Immunol 33: 27-6-2716

7. Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Shape A.H. (2008) PD-1 and its ligands

in tolerance and immunity, Annu Rev Immunol 26: 677-704

8. Okazaki T., Honjo T. (2007) PD-1 and PD-1 ligands: from discovery

to clinical application, Int Immunol 19: 813-824

9. Yamazaki T., Akiba H., Iwai H., Matsuda H., Aoki M., et al (2002)

Expression of programmed death-1 ligands by murine T cells and APC,

J Immunol 169: 5538-5545

10. Riley J.L. (2009) PD-1 sygnaling in primary T cells, Immunol Rev 229: 114-125

11. Nishimura H., Agata Y., Kawasaki A., Sato M., Imamura S., et al. (1996)

Developmentally regulated expression of the PD-1 protein on the surface

of double negative (CD4-CD8-) thymocytes, Int Immunol 8: 773-780

12. Dong H., Zhu G., Tamada K., Chen L. (1999) B7-H1, a third member

of the B7family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10

secretion, Nat Med 5: 1365-1369

13. Tseng S.Y., Otsuji M., Gorski K., Huang X., Slansky J.E., et al. (2001) B7-

DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties

for T cells, J Exp Med 193: 839-846

14. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., et al (2002)

Tumor associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potencial mechanism

of immune evasion, Nat Med 8: 793-800

15. Youngnak P., Kozono Y., Kozono H., Iwai H., Otsuki N., et al. (2003)

Differential binding properties of B7-H1 and B7-DC to programmed death-1,

Biochem Biophys Res Commun 307: 672-677

16. Iwai U., Ishida M., Tanaka Y., Okazaki T., Honjo T., et al. (2002) Involvement

of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor

immunotherapy by PD-L1 blocade, Proc Natl Acad Sci USA

99: 12293-122297

17. Blank C., Gajewski T.F., Mackensen A. (2005) Interaction of PD-L1 on tumor

cells with PD-1 on tumor-specific T cells as a mechanism of immune evasion:

implications for tumor immunotherapy, Cancer Immunol Immunother

54: 307-314

18. Zang X., Allison JP. (2007) The B7 family and cancer therapy: costimulation

and conhibition, Clin Cancer Res 13: 5271-5279

19. Ishida M., Iwai Y., Tanaka Y., Okazaki T., Freeman G.J., et al. (2002) Differential

expression of PD-L1 and PD-L2, ligands for an inhibitory receptor PD-1, in the

cells of lymphohematopoietic tissues, Immunol Lett 84: 57-62

20. Azuma T., Yao S., Zhu G., Flies A.S., Flies S.J., et al (2008) B7-H1

is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells, Blood 111: 3635-3643


50

21. Blank C., Brown I., Peterson A.C., Spiotto M., Iwai Y., et al (2004) PD-

1/B7H-1 inhibits the effector phase of tumor rejection by T cell receptor (TCR)

transgenic CD8+ T cells, Cancer Res 64: 1140-1145

22. Curiel T.J., Wei S., Dong H., Alvarez X., Cheng P., et al (2003) Blokade

of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity, Nat

Med 9: 562-567

23. Hirano F., Kaneko K., Tamura H., Dong H., Wang S., et al. (2005) Blokade

of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic

immunity, Cancer Res 65: 1089-1096

24. Blank C., Kuball J., Voelkl S., Wiendl H., Becker B., et al (2006) Blokade

of PD-1 (B7-H1) augments human tumor-specific T cell responses in vitro, Int

J Cancer 119: 317-327

25. Zhixue Z., Zhaode B., Xijuan L., Lianhai Z., Ziyu L., et al (2013) Level

of circulating Pd-1 expression in patients with advanced gastric cancer and its

clinical implications, Chin J Cancer Res 26(1): 104-111

26. McDermott D.F., Atkins M.B. (2013) PD-1 as a potential target in cancer

therapy, Cancer Med 2(5): 662-673

27. Takanori K., Teruji T., Koji U., Shin M., Tetsuya N., et al (2014) Blockade

of B7-H1 Suppresses of Development of Chronic Intestinal Inflammation,

J Immunol 171: 4156-4163

28. Takeo N., Masayuki S., Takahiro A., et al (2007) Clinical Significance

and Therapeutic Potential of the Programmed Death-1 Ligand/Programmed

Death-1 Pathway in Human Pancreatic Cancer, Clin Cancer Res 13, 2151-2157

29. Sznol M., Lieping C. (2013) Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1)

in the treatment of advanced Human Cancer, Clin Cancer Res 19: 1021-1034

30. Harvey R.D. (2014) Immunologic and Clinical Effects of Targeting PD-1

in Lung Cancer, Clinical Pharmacology & Therapeutics 96 2: 214-217

Programmed death receptor PD-1 as a potential target in anticancer

therapy

Nowadays, an improved understanding of the molecular mechanisms ruling the host immune response to tumors has led to the identification of checkpoint signaling pathways involved in limiting the anticancer immune response. One of the most significant checkpoint pathways responsible for mediating tumor-inducted immune suppression is the programmed death-1 (PD-1) pathway, which is normally involved in promoting tolerance and preventing tissue damage during chronic inflammation. The programmed death-1 receptor is upregulated in activated T lymphocytes and inhibits T-cell function upon binding to its ligands B7-H1 (PD-L1) and B7-DC (PD-L2). Many solid tumors express PD ligand 1 (PD-L1) and this is often associated with a worse prognosis. Tumor-infiltrating lymphocytes from patients with cancer typically express PD-1 and have impaired antitumor functionality. Proof-of-concept has come from several preclinical studies in which blockade of PD-1 or PD-L1 enhanced T-cell function and tumor cell lysis. Three monoclonal antibodies against PD-1, and one against PD-L1, have reported phase 1 data. All four agents have shown encouraging preliminary activity, and those that have been evaluated in larger patient populations appear to have encouraging safety profiles. If subsequent investigations confirm the initial results, it is conceivable that agents blocking the PD-1/PD-L1 pathway will prove valuable additions to the grooving armamentarium of immunotherapeutic agents.

51

Karolina Okła1, Anna Wawruszak

2, Artur Anisiewicz

3

Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1

w nowotworach

Szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi jedną ze strategii wykorzystywanych przez komórki nowotworowe do ucieczki spod nadzoru układu immunolo-

gicznego gospodarza. Zwiększoną ekspresję PD-L1 zaobserwowano w wielu

ludzkich nowotworach, co w większości z nich stanowiło negatywną wartość

prognostyczną. Wysoką ekspresja liganda PD-L1 na komórkach nowotwo-rowych lub/i pobudzenie ekspresji receptora programowanej śmierci

komórkowej PD-1 na limfocytach mogą prowadzić do zahamowania

odpowiedzi przeciwnowotworowej. Obecnie prowadzonych jest szereg badań

klinicznych nad przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi na poszczególne składowe szlaku PD-1/PD-L1, co daje nadzieję na konstrukcję

skutecznych schematów immunoterapeutycznych w leczeniu nowotworów.

1. Wstęp

Układ immunologiczny pełni nieodzowną rolę w ochronie organizmu

przed patogenami zewnątrzkomórkowymi, a także komórkami własnymi

o niepożądanych właściwościach i cechach. Do takich komórek, które

wymagają usunięcia z organizmu można zaliczyć komórki przechodzące

proces transformacji nowotworowej. Podczas progresji nowotworu,

komórki nowotworowe nabywającharakterystycznych właściwości, takich

jak: oporność na apoptozę i egzogenne inhibitory wzrostu, nieograniczony

potencjał replikacyjny, zdolność wytwarzania własnych sygnałów

wzrostowych czy ucieczka spod nadzoru układu immunologicznego, które

pozwalają im uzyskać swoistą autonomię [1÷3]. W ucieczce spod kontroli

układu odpornościowego komórki nowotworowe wykorzystują dwa

mechanizmy[4÷8]. Pierwszy z nich polega na „unikaniu” rozpoznania

i eliminacji przez komórki T, drugi zaś na uszkodzeniu lub zahamowaniu

aktywności niektórych elementów odpowiedzi immunologicznej przez

komórki nowotworowe (Tabela 1). Jednym z punktów kontrolnych

modulujących odpowiedź immunologiczną i wykorzystywanych przez

[email protected], I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii,

I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie [email protected], Laboratorium Doświadczalnej Terapii Przeciwnowotworowej,

Zakład Onkologii Doświadczalnej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN

we Wrocławiu





52

nowotwór do ucieczki spod nadzoru immunologicznego jest szlak

sygnałowy PD-1/PD-L1 (receptor programowanej śmierci 1/ligand

receptora programowanej śmierci 1). Komórki nowotworowe, poprzez

wysoką ekspresję liganda lub/i pobudzenie ekspresji receptora

programowanej śmierci komórkowej PD-1 na limfocytach mogą hamować

odpowiedź przeciwnowotworową [9,10]. Podwyższoną ekspresję PD-L1

stwierdzono w wielu ludzkich typach nowotworów [11], co wskazuje

na potencjalną rolę PD-1 oraz jego ligandów w kontekście terapii

przeciwnowotworowej.

Tabela 1. Dwa mechanizmy ucieczki spod nadzoru układu immunologicznego wykorzystywane przez komórki nowotworowe [4-8]

1. Unikanie rozpoznania i eliminacji przez komórki limfocytów T

• zahamowanie ekspresji w komórkach nowotworowych cząsteczek

MHC klasy I

• ↓ ekspresji antygenów na powierzchni komórek nowotworowych

• „złuszczanie” z powierzchni komórek nowotworowych antygenów

• ↓ ekspresji cząsteczek kostymulujących z rodziny B7 mających

wpływ na odpowiedź limfocytów T

• ↑ oporność komórek nowotworowych na apoptozę indukowaną przez

limfocyty T (↑BCl-2, ↓Fas, ↓ICAM-1)

2. Uszkodzenie, hamowanie aktywności niektórych elementów odpowiedzi

odpornościowej przez komórki nowotworowe oraz inne komórki

• wydzielanie przez komórki nowotworowe czynników

immunosupresyjnych (TGF-β, IL-10, PGE2, VEGF) hamujących

dojrzewanie komórek dendrytycznych oraz aktywność limfocytów T

• rekrutacja komórek MDSC wydzielających czynniki

immunosupresyjne: NOS2, ARG1

• rekrutacja przez komórki nowotworowe, limfocytów T reg,

hamujących dojrzewanie k. dendrytycznych i stymulujących je do

wydzielania IDO katabolizującego tryptofan (produkty degradacji

tryptofanu-kinureniny są toksyczne dla limfocytów )

• wydzielanie przez komórki nowotworowe ligandów FasL i TRAIL

indukujących w komórkach T śmierć apoptotyczną

• wytwarzanie przez komórki nowotworowe ligandów PD-L1, PD-L2,

B7-H4 indukujących śmierć apoptotyczną limfocytów T

2. Charakterystyka i funkcja receptora PD-1 oraz jego ligandów

PD-1jestprzezbłonowym, glikoproteinowym receptorem programowanej

śmierci 1 należącym do rodziny CD28 (B7).Cząsteczka zbudowana jest

z części zewnątrzkomórkowej immunoglobulinopodobnej oraz wewnątrz-

komórkowego ogona cytoplazmatycznego, odpowiedzialnego za przekazy-

wanie immunosupresyjnego sygnału. PD-1 ulega ekspresji na aktywo-

Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach

53

wanych limfocytach T oraz B,monocytach/makrofagach i komórkach

dendrytycznych(Rys.1.) [9, 12-14]. Należy on do kluczowych negatywnych

receptorów odpowiedzi immunologicznej, odpowiedzialnych za zacho-

wanie tolerancji, zapobieganie rozwojowi chorób autoimmuno-logicznych

a także kontrolowanieuszkodzeń zdrowych tkanek podczas infekcji.

Receptor ten aktywowany jest w momencie związania jednego z dwóch

ligandów: PD-L1i PD-L2 (B7–DC) [11, 15, 16,], co prowadzi do zaha-

mowania szlaku receptora TCR/BCR, spadku produkcji cytokin, białek

promujących przeżycie komórki oraz zwiększenie syntezy IL-10, która

hamuje odpowiedź immunologiczną. PD-L1 ulega indukowanej ekspresji

na większości komórek ludzkiego organizmu, z kolei PD-L2 na komórkach

dendrytycznych, monocytach i nielicznych komórkach niehematopo-

etycznych. Pomimo, że PD-L2 wykazuje trzykrotnie większe powino-

wactwo do PD-1 niż PD-L1, za właściwości immunoregulacyjne związane

z PD-1 odpowiada PD-L1 [17,18].

Rys.1. Immunologia nowotworu i szlak sygnałowy PD-L1/PD-1 [11]


54

3. Ekspresja PD-1/PD-L1 w nowotworach

Wykazano, że szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi jeden

z potencjalnych mechanizmów wykorzystywanych przez komórki

nowotworowe, które poprzez wysoką ekspresję liganda lub/i pobudzenie

receptora PD-1 na limfocytach mogą hamować odpowiedź przeciwnowo-

tworową. Ekspresję PD-L1 wykazano w wielu ludzkich typach nowotworów

takich jak: rak płuc, jelita grubego, wątroby, jajnika, żołądka, okrężnicy,

przełyku, trzustki, piersi, pęcherza a także w czerniaku, chłoniaku czy

białaczce (Tabela 2) [10, 1,19].

Tabela 2. Ekspresja PD-L1 w nowotworach [11]

Typ nowotworu % PD-L1+ [11]

Czerniak 40–100

Rak niedrobnokomórkowy płuc 35–95

Rak jamy nosowo-gardłowej 68–100

Glejak wielopostaciowy/glejak mieszany 100

Rak jelita grubego 53

Rak wątrobowokomórkowy 45–93

Rak nabłonkowy 28–100

Szpiczak mnogi 93

Rak jajnika 33–80

Rak żołądka 42

Rak przełyku 42

Rak trzustki 39

Rak nerkowokomórkowy 15–24

Rak piersi 31–34

Chłoniaki 17–94

Białaczki 11–42

Podwyższona ekspresja PD-L1została powiązana z krótszym czasem

przeżycia uchorych z rakiem jajnika, nerek, przełyku oraz trzustki [20-23].

Co ciekawe, w przypadku czerniaka stwierdzono zarówno pozytywny [24],

jak i negatywny wpływ podwyższonej ekspresji PD-L1 na przeżycie

pacjentów[25]. Podobnie, w przypadku chłoniaka grudkowego podwyższona

ekspresja receptora PD-1 na limfocytach w zmianie korelowała zarówno

z dobrym [26], jak i złym rokowaniem u chorych[27]. Opisano również,że

podwyższona ekspresja receptora PD-1 na limfocytach naciekających

komórki raka nerki także wiąże się ze złym rokowaniem dla chorych [28].

Z kolei, wysoka ekspresja liganda PD-L1 na komórkach raka nerki wiązała

się a bardziej agresywnym przebiegiem choroby oraz znacznie

zwiększonym ryzykiem zgonu nią spowodowanego [29]. Podobną

zależność uzyskano w przypadku chorych na raka jajnika, gdzie


55

podwyższenie ekspresji PD-1 na limfocytach naciekających komórki raku

jajnika, wiązała się z większym ryzykiem zgonu, a także negatywnie

korelowała z ilością limfocytów T CD8+w jajniku.W przeciwieństwie

do PD-L1 ekspresja liganda PD-L2 była rzadsza (około połowy raków

jajnika wykazywało PD-L2+) [21].Poza mechanizmem hamowania

limfocytów T w nowotworach z ekspresją cząsteczki PD-L1, zaobser-

wowano zwiększoną oporność na apoptozę tych komórek, co wskazuje na

dodatkowy mechanizm zwiększający przeżycie komórek nowotworowych

wykorzystujący szlak sygnałowy PD-1/PD-L[30].

Niestety, pomimo intensywnych badań,mechanizmna drodze którego

komórki nowotworowe modulują własną ekspresję PD-L1 bądź ekspresję

PD-1 na limfocytach efektorowych pozostaje nieznany. W warunkach

in vitro ekspresja PD-L1 ulega indukcji pod wpływem interferonu typu I

(α,β) i II (γ), a także w mniejszym stopniu TNF-α[10,31]. Ekspresja PD-L1

na komórkach nowotworowych świeżo izolowanych ex vivo jest

zdecydowanie większa niż na komórkach hodowanych in vitro, co ze

względu na wpływ cytokin może sugerować, iż mikrośrodowisko nowotworu

(TME) może modulować ekspresję szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1[10].

4. Blokowanie szlaku sygnałowegoPD-1/PD-L1 jako potencjalny

cel terapii przeciwnowotworowej

Cechą wyróżniającą receptor PD-1, na tle innych cząsteczek z rodziny

CD28 (np. immunosupresyjnej cząsteczki CTLA-4)jest powszechność

ekspresji liganda PD-L1,co wskazuje na szerokie znaczenie w modulacji

odpowiedzi immunologicznej.Doświadczenia z komórkami nowotwo-

rowymi wykazały, że zastosowanie przeciwciał monoklonalnych(mAb)

blokujących PD-L1 wspiera odpowiedź przeciwnowotworową. Innym

środkiem terapeutycznym może być również siRNA, powodujący degra-

dację transkryptu PD-1 [16]. Wiele eksperymentów in vivo z wykorzy-

staniem mysich modelów nowotworów, potwierdziło regresję nowotworu

lub wydłużenie czasu przeżycia chorych po inaktywacji szlaku sygna-

łowego PD-1. Regresji nowotworu towarzyszyło zwiększenie populacji

limfocytów T i produkcji immunostymulujących cytokin. Jednak dokładna

sekwencja zdarzeń w mikrośrodowisku guza, która prowadzi do regresji

nowotworu po zablokowaniu szlaku PD-1 pozostaje nieznana. Przypuszcza

się jednak, że blokada szlaku PD-1 hamuje limfocyty naciekające

nowotwór (TIL). W przypadku przedłużającego się stanu stymulacji

antygenem dochodzi do przedłużającej się i wysokiej ekspresji PD-1 na

limfocytach T o fenotypie opisywanym jako „wyczerpane” i nie mogą być

one reaktywowane przez samą blokadę PD-1. Wyczerpanie limfocytów

T jest wynikiem przewlekłej ekspozycji na antygen (przewlekłe infekcje


56

wirusowe lub postępująca choroba nowotworowa). Fenotyp „wyczerpane”

charakteryzuje się wysokim poziomem cząsteczek hamujących, słabą

funkcją efektorową oraz odrębnym profilem transkrypcji i może

w rzeczywistości stanowić etap różnicowania limfocytów T. Wśród

pacjentów z przerzutującym czerniakiem, CD8+TIL wyrażają na swojej

powierzchni kilka cząsteczek związanych z wyczerpaniem, w tym TIM-3

LAG-3 i PD-1, które mogą być przyczyną oporności na blokadę szlaku

PD-1, a także mogą stać się wskazówką w projektowaniu kombinacji

punktów kontrolnych/ koinhibitorów antagonistów tych cząsteczek.

Zaobserwowano, że leczenie myszy białkiem fuzyjnym B7-DC-Ig

w kombinacji z cyklofosfamidem i szczepionką spowodowało znaczny

spadek liczby komórek PD-1hi oraz limfocytów T CD4

+ i CD8

+ w obrębie

guza, co pozwalało na infiltrację i/lub zwiększenie populacji limfocytów

T niewyczerpanych (PD-1lo)w mikrośrodowisku guza. Nie wiadomo

jednak, czy takie zjawisko występuje także u ludzi [32].

Kilka obiecujących środków immunoterapeutycznych skierowanych

na szklak PD-1/PD-L1 jest obecnie w fazie badań klinicznych. Jest

to m.in. Nivolumab(BMS-936559), Lambrolizumab (MK-3475) oraz

MPDL320A. Nivolumab jest inhibitorem PD-1 a obszar terapeutyczny

obejmuje guzy lite. Badania kliniczne prowadzono na grupie

107 pacjentów z czerniakiem złośliwym, u których rak postępował mimo

wcześniejszych terapii. Z badanej grupy 33 pacjentów wykazywało

zmniejszenie rozmiarów guza o co najmniej 30%, średnia przeżycia

wyniosła blisko 16,8 miesięcy. Dodatkowo, w skojarzeniu z innym

immunoterapetukiem – Yervoy przynosił jeszcze lepsze efekty powodując

zmniejszenie się rozmiarów guza o ponad 80% w ciągu 12 tygodni.

Działanie leku pozytywnie oceniono także u chorych z innymi

nowotworami m.in. płuc i nerek. Lambolizumab to przeciwciało, które

blokuje antygen PD-L1. Badania przeprowadzone w grupie 135 pacjentów

z zaawansowanymi zmianami rakowymi skóry wykazały u 51% wszystkich

badanych – częściową, a u 9% – całkowitą odpowiedź nowotworu

na działanie leku. MPDL320A również jest przeciwciałem anty-PD-L1.

Wyniki I fazy badań klinicznych przeprowadzonych w grupie 30 pacjentów

wskazały na wysoką aktywność wobec szerokiej grupy nowotworów

(m.in. raka płuc, nerki, jelita grubego i żołądka) i bezpieczeństwo tego

immunoterapeutyku [33, 34]. Powyższe dane pozwalają stwierdzić,

że zastosowanie specyficznych inhibitorów szlaku PD-1/ PD-L1 przynoszą

wstępne, obiecujące rezultaty, czy to w monoterapii czy też w leczeniu

skojarzonym z innymi lekami, a ich wykorzystanie może być coraz

powszechniejsze w przyszłości.


57

5. Podsumowanie

Szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi ważny punkt kontrolny, który

moduluje odpowiedź immunologiczną i jest wykorzystywany przez

nowotwór do ucieczki spod nadzoru immunologicznego. Liczne dane

literaturowe potwierdzają podwyższoną ekspresję PD-L1 w wielu ludzkich

typach nowotworów, co wskazuje na potencjalną rolę receptora PD-1 oraz

jego ligandów w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Zastosowanie

mAb skierowanych przeciwko PD-1 bądź PD-L1 może stać

się obiecującym schematem immunoterapii. Pomimo podejmowania prób

stosowaniaimmunoterapii, to metoda ta nie weszła jeszcze w standardy

leczenia klinicznego. Pozostaje wiele kwestii do rozwiązania,

jak toksyczność dawek, występowanie efektów ubocznych, które należy

przezwyciężyć, czy zróżnicowany efekt działania w zależności

od zastosowania w monoterapii, bądź w skojarzeniu z innymi lekami.

Jednakże badania kliniczne nad zastosowaniem takich przeciwciał

przynoszą wstępne, obiecujące wyniki, co daje nadzieję na konstrukcję

skutecznych modeli immunoterapeutycznych w leczeniu nowotworów.

Literatura

1. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. (2006). Cancer despite

immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion, Nat. Rev.

Immunol. 6, 715-727

2. Kroemer G., and Pouyssegur, J. (2008). Tumor Cell Metabolism: Cancer’s

Achilles’ Heel, Cancer Cell 13, 472-482

3. Hanahan D., Weinberg R.A. (2000) The hallmarks of cancer, Cell 100, 57-70

4. Bronte V. Mocellin S. (2009). Suppressive influences in the immune response

to cancer, J. Immunother. Hagerstown Md 1997 32, 1-11

5. Rabinovich G.A., Gabrilovich D., Sotomayor, E.M. (2007)

Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells. Annu. Rev.

Immunol. 25, 267-296

6. Stewart T.J., Abrams S.I. (2008). How tumours escape mass destruction.

Oncogene27, 5894-5903

7. Whiteside T.L. (2006) Immune suppression in cancer: effects on immune cells,

mechanisms and future therapeutic intervention. Semin. Cancer Biol. 16, 3-15

8. Whiteside T.L. (2008) The tumor microenvironment and its role in promoting

tumor growth. Oncogene27, 5904-5912

9. Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Sharpe A.H. (2008). PD-1

and its ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 26, 677-704

10. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B.,

Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., et al. (2002). Tumor-associated B7-H1

promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.

Nat. Med. 8, 793-800


58

11. Chen D.S., Irving B.A., Hodi F.S. (2012). Molecular Pathways: Next-

Generation Immunotherapy—Inhibiting Programmed Death-Ligand 1

and Programmed Death-1. Clin. Cancer Res. 18, 6580-6587

12. Philips G.K., Atkins, M. (2015). Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-

L1 antibodies. Int. Immunol. 27, 39-46

13. Yamazaki T., Akiba H., Iwai H., Matsuda H., Aoki M., Tanno Y., Shin T.,

Tsuchiya H., Pardoll D.M., Okumura K., et al. (2002). Expression

of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC. J. Immunol.

Baltim. Md 1950 169, 5538-5545

14. Riley J.L. (2009). PD-1 signaling in primary T cells. Immunol. Rev. 229, 114-125

15. Ankri C., Cohen C.J. (2014). Out of the bitter came forth sweet.

Oncoimmunology3

16. Grzywnowicz M., Giannopoulos K. (2012). Znaczenie receptora

programowanej śmierci 1 oraz jego ligandów w układzie immunologicznym

oraz nowotworach. Acta Haematol. Pol. 43, 132-145

17. Youngnak P., Kozono Y., Kozono H., Iwai H., Otsuki N., Jin H., Omura K.,

Yagita H., Pardoll D.M., Chen L., et al. (2003). Differential binding properties

of B7-H1 and B7-DC to programmed death-1. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 307, 672-677

18. Brahmer J.R., Drake C.G., Wollner I., Powderly J.D., Picus J., Sharfman

W.H., Stankevich E., Pons A., Salay T.M., McMiller T.L., et al. (2010). Phase

I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory

solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic

correlates. J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 28, 3167-3175

19. Zang X., and Allison J.P. (2007). The B7 Family and Cancer Therapy:

Costimulation and Coinhibition. Clin. Cancer Res. 13, 5271-5279

20. Ohigashi Y., Sho M., Yamada Y., Tsurui Y., Hamada K., Ikeda N., Mizuno T.,

Yoriki R., Kashizuka H., Yane K., et al. (2005). Clinical significance

of programmed death-1 ligand-1 and programmed death-1 ligand-2

expression in human esophageal cancer. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc.

Cancer Res. 11, 2947-2953

21. Hamanishi J., Mandai M., Iwasaki M., Okazaki T., Tanaka Y., Yamaguchi K.,

Higuchi T., Yagi H., Takakura K., Minato N., et al. (2007). Programmed cell

death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic

factors of human ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3360-3365

22. Nomi T., Sho M., Akahori T., Hamada K., Kubo A., Kanehiro H., Nakamura S.,

Enomoto K., Yagita H., Azuma M., et al. (2007). Clinical Significance

and Therapeutic Potential of the Programmed Death-1 Ligand/Programmed

Death-1 Pathway in Human Pancreatic Cancer.Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157

23. Thompson R.H., Kuntz S.M., Leibovich B.C., Dong H., Lohse C.M., Webster

W.S., Sengupta S., Frank I., Parker A.S., Zincke H., et al. (2006). Tumor B7-

H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with

long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385

24. Taube J.M., Anders R.A., Young G.D., Xu H., Sharma R., McMiller T.L.,

Chen S., Klein A.P., Pardoll D.M., Topalian S.L., et al. (2012). Colocalization

of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions


59

supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl.

Med. 4, 127ra37

25. Mu C.-Y., Huang J.-A., Chen Y., Chen C., Zhang X.-G. (2011). High

expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and

tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic

cells maturation. Med. Oncol. NorthwoodLond. Engl. 28, 682-688

26. Carreras J., Lopez-Guillermo A., Roncador G., Villamor N., Colomo L.,

Martinez A., Hamoudi R., Howat W.J., Montserrat E., Campo E. (2009). High

Numbers of Tumor-Infiltrating Programmed Cell Death 1–Positive Regulatory

Lymphocytes Are Associated With Improved Overall Survival in Follicular

Lymphoma. J. Clin. Oncol. 27, 1470-1476

27. Richendollar B.G., Pohlman B., Elson P., Hsi E.D. (2011). Follicular programmed

death 1-positive lymphocytes in the tumor microenvironment are an independent

prognostic factor in follicular lymphoma. Hum. Pathol. 42, 552-557

28. Thompson R.H., Dong H., Lohse C.M., Leibovich B.C., Blute M.L., Cheville

J.C., Kwon E.D. (2007). PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells

and is associated with poor outcome for patients with renal cell carcinoma.

Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 13, 1757-1761

29. Thompson R.H., Gillett M.D., Cheville J.C., Lohse C.M., Dong H., Webster

W.S., Krejci K.G., Lobo J.R., Sengupta S., Chen L., et al. (2004).

Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor

aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

A. 101, 17174-17179

30. Azuma T., Yao S., Zhu G., Flies A.S., Flies S.J., Chen L. (2008). B7-H1

is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells. Blood 111, 3635–3643

31. Mazanet M.M., Hughes C.C.W. (2002). B7-H1 is expressed by human

endothelial cells and suppresses T cell cytokine synthesis. J. Immunol. Baltim.

Md 1950 169, 3581-3588

32. Sznol M., Chen L. (2013). Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1)

in the Treatment of Advanced Human Cancer. Clin. Cancer Res. Off. J. Am.

Assoc. Cancer Res. 19, 1021-1034

33. Pal S.K., Hu A., Chang M., Figlin R.A. (2014). Programmed death-1

inhibition in renal cell carcinoma: clinical insights and future directions. Clin.

Adv. Hematol. Oncol. HO 12, 90-99

34. Ramalingam S.S., Mazières J., Planchard D., Stinchcombe T.E., Dy G.K.,

Antonia S.J., Horn L., Lena H., Minenza E., Mennecier B., et al. (2014).

Phase II Study of Nivolumab (anti-PD-1, BMS-936558, ONO-4538)

in Patients with Advanced, Refractory Squamous Non-Small Cell Lung

Cancer: Metastatic Non-small Cell Lung Cancer. Int. J. Radiat. Oncol. Biol.

Phys. 90, 1266-1267


60

The role of signaling pathway PD-1 / PD-L1 in tumors

Summary: Signaling pathway PD-1/PD-L1 is one of the strategies used by tumor cells to escape from

the host immune surveillance system. Increased PD-L1 expression was observed in several

human tumors, in most of them constituted a negative predictive value.High expression

of thePD-L1 on tumor cells and/or stimulation ofexpression of programmeddeath receptor PD-1 on lymphocytes can lead to inhibition of anti-tumor responses.Currently, numerous

clinical trials using of monoclonal antibodies directed against individual components

of PD-1/PD-L1 pathway gives hope for the construction of effective immunotherapy

schemes in the treatment of cancer.

61

Joanna Woźniak1, Tomasz Wandtke

2, Maciej Gawroński

3

TNF-α – budowa molekularna, aktywność

w procesach nowotworowych oraz potencjalne

wykorzystanie w badaniach klinicznych

Czynnik martwicy nowotworu (ang. Tumor Necrosis Factor α, TNF-α) to wielofunkcyjna cytokina, która pełni kluczową rolę w procesach zapalnych

oraz apoptozie komórek. Obecne wykorzystywanie TNF-α ogranicza się do

miejscowego leczenia nowotworów. Związanie TNF-α wraz ze swoistymi

receptorami typu 1 oraz typu 2 (TNFR-1, TNFR-2) prowadzi do zapocząt-kowana kaskady reakcji na drodze transdukcji, które przebiegają niezależnie

od siebie i prowadzą do wystąpienia dwóch różnych efektów – apoptozy lub

ochrony komórki przed programowaną śmiercią. Niniejsza praca stanowi zbiór

aktualnych informacji o TNF-α: budowę molekularną, mechanizmy sygnałowe oraz potencjalne działanie przeciwnowotworowe.

1. Wstęp

TNF-α (ang. Tumor Necrosis Factor, czynnik martwicy nowotworów)

to przykład wielofunkcyjnej cytokiny, która zaangażowana jest w szereg

procesów: programowaną śmierć komórki, bądź jej przeżycie, przebieg

reakcji zapalnych oraz interakcje poprzez dwa różne receptory [1].

TNF-α został wyizolowany w 1975 roku z surowicy myszy,

traktowanych endotoksyną bakterii jako aktywny składnik "toksyny

Coley". Wówczas to zaobserwowano, że czynnik pochodzący z toksyny

bakteryjnej powoduje martwicę guza i jest odpowiedzialny za indukuję

procesu nekrozy nowotworów [2]. Było to pierwsze wykorzystanie cytokin

w bioterapii nowotworów. 10 lat później określono TNF-α jako kachektynę

oraz czynnik różnicowania limfocytów T [3]. W tym samym roku po raz

pierwszy sklonowano ludzki gen dla TNF-α [4], co zapoczątkowało szereg

badań klinicznych nad omawianą cytokiną.

1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 2 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 3 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy

http://pl.wikipedia.org/wiki/J%C4%99zyk_angielski

Joanna Woźniak,Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński

62

2. Budowa molekularna

TNF-α należy do nadrodziny TNF, do których należy 19 białek.

Omawiana cytokina zbudowana jest z 157 aminokwasów o łącznej masie

17 kDa. U ludzi gen kodujący niniejszą cytokinę znajduje się na

chromosomie 6 [5]. TNF-α jest wydzielany głównie przez aktywowane

makrofagi, limfocyty T oraz komórki NK (ang. Natural Killers). Niska

ekspresja TNF- α jest również obserwowana w przypadku szeregu innych

komórek, takich jak fibroblasty, neutrofile, keratynocyty, komórki tuczne

i komórki nowotworowe. TNF-α jest syntetyzowane w pierwszej kolejności

jako pro-TNF o masie 26 kDa, które następnie wiąże się z błoną

komórkową i jest uwalniany po odcięciu jego pro-domeny przez enzym

konwertujący TNF (ang. TNF-converting enzyme, TACE). W ten sposób

ulega proteolityczneej modyfikacji do postaci rozpuszczalnej (ang. soluble

TNF-α, sTNF-α) [6].

Bioaktywność TNF-α regulowana jest przez wiązanie rozpuszczalnych

receptorów typu 1 (ang. Tumour-Necrosis Factor receptor-1, TNFR-1)

o masie cząsteczkowej 55 kDa oraz typu 2 (ang. Tumour-Necrosis Factor

receptor-2, TNFR-2) o masie cząsteczkowej 72 kDa. Oba receptory

to heterotrimery, składające się z trzech domen: zewnątrzkomórkowej

(ang. ExtraCellular Domain, ECD), transbłonowej (ang. TransMembrane

Domain, TMD) i wewnątrzkomórkowej (ang. IntraCellular Domain, ICD).

Powinowactwo TNF-α do TNFR-2 jest pięć razy wyższe niż do TNFR-1

jednak to receptor typu 2 odpowiedzialny jest za wyższą bioaktywność

cytokiny. TNFR-1 jest obecny niemal we wszystkich typach komórek,

podczas gdy ekspresja TNFR-2 ograniczona się do komórek układu

immunologicznego [7]. Podstawową różnicą pomiędzy tymi dwoma

receptorami jest domena śmierci (ang. death domain, DD), która występuje

tylko w przypadku TNFR-1. Dlatego też receptor typu pierwszego należy

do członków rodziny receptorów śmierci, zdolnych do indukcji śmierci

komórek na drodze apoptozy [8].

3. Ścieżki sygnałowe

W przypadku TNFR-1 pierwszym etapem jest jego związanie

z homotrimerem TNF-α. Następnie dochodzi do trimeryzacji receptora oraz

uwalniania białka wyciszającego domenę śmierci (ang. silencer of death

domain, SODD) [9]. Umożliwia to przyłączenie się białka wzmacniającego

do domeny śmierci receptora TNF- α (ang. TNF-R1 associated death

domain, TRADD), które następnie silne wiąże szereg białek adaptorowych,

takich jak: RIP (ang. receptor interacting protein, białko adaptorowe

łączące się z receptorem TNF-α), TRAF-2 (ang. TNF- α receptor

associated factor 2, białko adaptorowe typu 2 związane z receptorem TNF-

TNF-α– budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych

oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych

63

α), czy FADD (ang. Fas associated death domain, białko z domeną śmierci

wiążące się z receptorem Fas) [10]. Prowadzi to następnie do aktywacji

NF-kB (ang. nuclear factor kappa B, czynnik jądrowy kappa B) oraz

do powstania sygnalosomu, który indukuje fosforylację IkB

(ang. inhibitory subunit of NF-kB, podjednostka hamująca aktywność NF-

kB), jego ubikwitynację oraz degradację proteasomalną [11].

TNFR-2 w odróżnieniu od receptora typu 1 nie posiada domeny śmierci.

Posiada natomiast sekwencje pozwalające związać zestaw wewnątrz-

komórkowych adapterów TRAF (TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5

i TRAF6). Po zapoczątkowaniu sygnału przeżycia komórki kinaza MAP3K

(ang. Mitogen-Activated Protein-3 Kinase, białkowa aktywowana

mitogenem kinaza-3) indukuje TRAF 2, które z kolei aktywuje kinazy JNK

(ang. Jun N-terminal Kinases, Jun N-końcowe kinazy). W dalszym etapie

czynnik NIK (ang. NuclearFactor-NF-kB Incucing Kinase, kinaza

indukująca czynnik NF-kB) przy udziale NF-kB aktywuje kaskadę

procesów, prowadzących do przeżycia komórki [12].

4. Wpływ TNF-α na komórki nowotworowe

Powszechnie wiadomo, że TNF-α indukuje śmierć komórek podczas

leczenia chorób nowotworowych. Jego niepodważalny wpływ

potwierdzono podczas serii doświadczeń aplikując szczurom w różnych

dawkach kombinację TNF-α i chemioterapeutyków wykazując ich

synergistyczne działanie przeciwnowotworowe w leczeniu skojarzonym

[13]. Okazało się również, że dostarczenie do komórki samego TNF-α

nie wywołuje martwicy nowotworu w tak znacznym stopniu. Na tych

samych szczurzych modelach wykazano, że TNF-α zwiększa 3-6-krotnie

akumulowanie chemioterapeutyków [14].

Mechanizmy leżące u podstaw działania TNF-α podczas stałego

leczenia nie powodują bezpośredniego działania cytotoksycznego

lub cytostatycznego TNF-α wobec komórek nowotworowych. Pojawiła

się natomiast hipoteza, że cytokina ta nie ma wpływu na same komórki

nowotworowe, lecz na komórki podścieliska guza. Zostało to potwierdzone

na podstawie danych, zebranych z doświadczeń na myszach, które

wskazują cytotoksyczne działanie TNF-α w układzie naczyniowym

nowotworu [15]. Co ciekawe, okazuje się, że omawiana cytokina

ma również pośredni wpływ na wzbudzanie odpowiedzi przeciwno-

wotworowej, gdyż odpowiedzialna jest za indukcję komórek NK oraz

limfocytów T CD8+, które wzmacniają aktywność cytotoksyczną

względem komórek raka [16].


64

5. Udział TNF-α w angiogenezie

Rosnący guz aktywuje otaczające naczynia przez wydzielanie

czynników angiogennych, zmieniając w ten sposób swój fenotyp oraz

tworzy mikrośrodowisko, którego składniki zapewniają mu nieograniczony

wzrost [17]. Oprócz wzrostu i proliferacji, guz może dawać przerzuty.

Złośliwe komórki nowotworowe, poprzez inwazję naczyń, degradację

ECM (ang. extracellular matrix, macierz zewnątrzkomórkowa) oraz

zasiedlanie miejsc docelowych mogą tworzyć przerzuty odległe [18].

Niniejsze zjawisko stało się jednym z głównych celów terapeutycznych

w leczeniu raka.

Postuluje się, iż komórki śródbłonka naczyń nowotworowych

w porównaniu z normalnymi wykazują większą ekspresję TNFR1

na swojej powierzchni, co może być zależne od czynników produkowanych

przez komórki obecne w mikrośrodowisku nowotworu, takie jak

makrofagi. Stanowi to jednocześnie cel terapeutyczny, gdyż umożliwia

łączenie się sTNF-α ze swoistym receptorem. Podanie TNF-α do guza

litego prowadzi tym samym do kaskady procesów, prowadzących

do zaprogramowanej śmierci komórki. Co ciekawe, zdrowy śródbłonek

również wiąże cytokinę, lecz posiada mniejszą ilość receptorów na swojej

powierzchni [19].

Uważa się, iż związanie TNFR1 do TNF-α powoduje większą

przepuszczalność śródbłonka naczyń guza. Pozbawienie nowotworu dużej

ilości erytrocytów skutkuje jego „krwotoczną nekrozą”. W wyniku

właściwości cytotoksycznych wysokiej dawki TNF-α, niektóre z komórek

przechodzą apoptozę, a cały proces silnie wzmaga permeabilizację

komórek śródbłonka. Liczne badania wykazały, że już mała dawka TNF-α

wywołuje porównywalny efekt anty-angiogenny. Co ciekawe, w przypadku

tych badań nie zauważono wpływu TNF-α na zdrowe naczynia: pozostają

one nienaruszone, a ich komórki śródbłonka nie ulegają apoptozie, dlatego

też nie dochodzi do wynaczynienia [20, 21].

Obserwowane synergiczne działanie w przypadku jednoczesnego podania

TNF-α i leków chemioterapeutycznych jest konsekwencją podwójnie

indukowanej permeabilizacji. Zjawisko to polega na zwiększeniu

przepuszczalności błony przez TNF-α do komórek nowotworowych, do

których znacznie skuteczniej wnikają leki terapeutyczne. Powoduje to

zwiększone gromadzenie się leków i ich rozkład w guzie poprzez zwiększoną

ekspozycję komórek nowotworowych na działanie środków cytostatycznych

[22]. Jest to jak dotąd jedyne wytłumaczenie obserwowanej wysokiej

odpowiedzi immunologicznej u pacjentów, którym podano oba terapeutyki.



65

6. Metody walki z nowotworem przy wykorzystaniu TNF-α

Najpowszechniejszym celem terapeutycznym jest hamowanie ścieżki

sygnałowej przeżycia komórek z udziałem NF-κB. Inaktywacja tego

czynnika jest powszechnie uznana za uwrażliwienie wielu nowotworów

na wpływ TNF-α [23]. NF-κB może być zablokowany na szereg sposobów,

do których można zaliczyć zwiększenie ekspresji swoistego inhibitora IκB,

bądź innych jego inhibitorów, które poprzez zahamowanie ścieżki

przeżycia zwiększają indukcję apoptozy komórek nowotworowych przy

udziale TNF-α [24, 25]. Przykładem takiego leku, który wykorzystuje

inhibitor NF-κB, jest bortezomib, który jest w fazie badań klinicznych jako

terapia skojarzona z chemioterapeutykami w przypadku raka prostaty

i szpiczaka [26]. Najnowsze badania Yang i wsp. Również potwierdziły,

że blokowanie ścieżki sygnałowej z NF-κB wywołuje skuteczną

inhibicję TNF-α [27].

Tlenek azotu (NO, ang. Nitric oxide) jest zaangażowany w ścieżkę

przeżycia komórek traktowanych TNF-α poprzez indukowanie ekspresji

NF-κB przez indukowaną syntazę tlenku azotu (iNOS, ang. inducible NO

synthase) [28]. W badaniach doświadczalnych u szczurów wykazano,

że hamowanie NOS poprzez L-NAME (ang. NG-nitro-L-arginine methyl

ester, ester metylowy NG-nitro-L-argininy) podczas leczenia z wykorzys-

taniem TNF-α powodowało znaczny wzrost odpowiedzi przeciwnowot-

worowej [29]. Niniejsze obserwacje zostały potwierdzone przez kolejne

badanie, wykazujące, że indukcja ekspresji NOS przez czerniaka

uwrażliwiała komórki endotelialne na cytotoksyczne działanie TNF-α

w warunkach in vitro [30]. Z kolei Campanholo i wsp. postanowili

jednocześnie zahamować ekspresję iNOS oraz NF-κB, co zaowocowało

zmniejszeniem ekspresji TNF-α [31].

Apoptoza komórek indukowana TNF-α jest związana również

z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen

species). Wykazano, że NF-κB, który jest kluczowym czynnikiem

prowadzącym komórkę na ścieżkę przeżycia, indukuje enzymy neutralizujące

ROS. Doskonałym przykładem jest dysmutaza ponadtlenkowa. Indukcja

produkcji ROS lub inhibicja ścieżki z udziałem NF-κB przez

cyklooksygenazę 2 (COX-2, ang. cyclooxygenase-2) jest uważana za

skuteczną terapię, prowadzącą do uwrażliwienia komórek nowotworowych

na indukcję apoptozy przez TNF-α [32].

Kolejnym sposobem walki z nowotworami przy wykorzystaniu TNF-α

jest otrzymanie analogów niniejszej cytokiny, które z większą wydajnością

będą wiązać swoisty receptor TNFR-1 na poziomie angiogenezy.

Pozytywne wyniki, wykorzystujące opisany mechanizm zostały uzyskane


66

w warunkach in vivo. Jednak żaden z analogów TNF-α nie osiągnął jeszcze

fazy badań klinicznych [33].

Potencjalnym narzędziem terapeutycznym wydaje się również

wykorzystywanie innych molekuł, które uwrażliwiają docelową komórkę

na TNF-α. Interferon gamma (IFN-γ) jest jedną z najczęściej wybieranych

cytokin w badaniach eksperymentalnych. Zaobserwowano, iż jego

zastosowanie wchodzi w interakcje z TNFR-1 oraz kaspazą-8, regulując

indukcję apoptozy przez TNF-α [34].

Kolejną cytokiną jest nabłonkowy polipeptyd aktywujący

monocyty typu 2 (EMAP-2, ang. endothelial monocyte-activating

polypeptide-2,). Omawiana cząsteczka wydzielana jest przez komórki

nowotworowe, a lokalna produkcja EMAP-2 związana jest z ułatwionym

przeciwnowot-worowym działaniem TNF-α [35]. Wykazano również,

że sam EMAP-2 wykazuje działanie immunosupresyjne oraz anty-

angiogenne [36]. Terapia kombinowana, z jednoczesnym wykorzystaniem

obu cytokin wydaje się być skuteczną metodą w leczeniu nowotworów.

7. Podsumowanie

Wielofunkcyjne działanie TNF-α jest niepodważalne. Z punktu

widzenia niniejszej pracy najważniejsza wydaje się odpowiedź

cytotoksyczna, skierowana przeciwko nowotworom. TNF-α poprzez

łączenie się ze swoim receptorem TNFR-1 kieruje docelową komórkę

na szlak apoptozy. Wykorzystanie wysokich dawek TNF-α w leczeniu

miejscowym guza zostało potwierdzone jako skuteczna metoda

terapeutyczna. Ponadto, TNF-α to skuteczna cytokina anty-angiogenna.

W terapii kombinowanej z wykorzystywaniem chemioterapeutyków

powoduje permeabilizację błon oraz skuteczniejsze wnikanie i rozkład

leków w komórkach nowotworowych. Potwierdzono również, iż sama

cytokina wpływa na zwiększenie ilości wolnych rodników. W działaniu

przeciwnowotworowym potwierdzono współdziałanie TNF-α z IFN-γ oraz

EMAP-2. Ze względu na swoje właściwości biologiczne TNF wydaje

się mieć szerokie zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych.

Literatura

1. Bazzoni F., Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families,

N Engl J Med., 334 (1996), pp. 1717-1725

2. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N., Williamson B.

An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors, Proc Natl

Acad Sci., 72 (1975), pp. 3666-3670

3. Beutler B., Greenwald D., Hulmes J.D., Chang M., Pan Z.C, Mathison J.,

Ulevitch R., Cerami A. Identity of tumour necrosis factor



67

and the macrophage-secreted factor cachectin Nature., 316 (1985),

pp. 552-554

4. Marmenout A., Fransen L., Tavernier J., Van der Heyden J., Tizard R.,

Kawashima E., Shaw A., Johnson M.J., Semon D., Müller R., Ruysschaert

M.R., van Vliet A., Fiers W. Molecular cloning and expression of human

tumor necrosis factor and comparison with mouse tumor necrosis factor

Eur J Biochem., 152 (1985), pp. 515-22

5. Muller U., Jongeneel C.V., Nedospasov S.A., Lindahl K.F., Steinmetz M.

Tumour necrosis factor and lymphotoxin genes map close to H-2D

in the mouse major histocompatibility complex Nature., 325 (1987),

pp. 265-267

6. Bemelmans M.H., van Tits L.J., Buurman W.A. Tumor necrosis factor:

function, release and clearance Crit Rev Immunol., 16 (1996), pp. 1-11

7. Aggarwal B.B. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged

sword Nat Rev Immunol., 3 (2003), pp. 745-756

8. Ashkenazi A., Dixit V.M.. Death receptors: signaling and modulation

Science., 281 (1998), pp. 1305-1308

9. Takada H., Chen N.J., Mirtsos C., Suzuki S., Suzuki N., Wakeham A.,

Mak T.W., Yeh W.C Role of SODD in regulation of tumor necrosis factor

responses Mol Cell Biol., 23 (2003), pp. 4026-4033

10. Rath P.C., Aggarwal B.B.. TNF-induced signaling in apoptosis J Clin

Immunol., 19 (1999) pp. 350-36

11. Zhang S.Q., Kovalenko A., Cantarella G., Wallach D. Recruitment of the IKK

sygnalosome to the p55 TNF receptor: RIP and A20 bind to NEMO (IKKg)

upon receptor stimulation Immunity., 12 (2000) pp. 301-311

12. Baker S.J., Reddy E.P.. Modulation of life and death by the TNF receptor

superfamily Oncogene., 17 (1998), pp. 3261-3270

13. Manusama E.R., Stavast J., Durante N.M., Marquet R.L., Eggermont A.M.

Isolated limb perfusion with TNF alpha and melphalan in a rat osteosarcoma

model: a new anti-tumour approach Eur J Surg Oncol., 22 (1996),

pp. 152-157

14. Manusama E.R., Nooijen P.T., Stavast J., Durante N.M., Marquet R.L.,

Eggermont A.M. Synergistic antitumour effect of recombinant human tumour

necrosis factor alpha with melphalan in isolated limb perfusion in the rat Br J

Surg., 83 (1996), pp. 551-555

15. Watanabe N., Niitsu Y., Umeno H., Kuriyama H., Neda H., Yamauchi N.,

Maeda M., Urushizaki I. Toxic effect of tumor necrosis factor on tumor

vasculature in mice Cancer Res., 48 (1988), pp. 2179-2183

16. Prevost-Blondel A., Roth E., Rosenthal F.M., Pircher H. Crucial role of TNF-

alpha in CD8 T cell-mediated elimination of 3LL-A9 Lewis lung carcinoma

cells in vivo Journal of Immunology., 164 (2000) pp. 3645-3651

17. Bergers G., Benjamin L.E. Tumorigenesis and the angiogenic switch Nat Rev

Cancer., 3 (2003), pp. 401-410

18. Chambers A.F., Groom A.C., MacDonald I.C. Dissemination and growth

of cancer cells in metastatic sites Nat Rev Cancer., 2 (2002) pp. 563-572


68

19. Bradley J.R., Thiru S., Pober J.S. Disparate localization of 55-kD and 75-kD

tumor necrosis factor receptors in human endothelial cells Am J Pathol. 146

(1995), pp. 27-32

20. Hill S., Fawcett W.J, Sheldon J., Soni N., Williams T., Thomas J.M. Low-dose

tumour necrosis factor alpha and melphalan in hyperthermic isolated limb

perfusion Br J Surg., 80 (1993), pp. 995-997

21. Bonvalot S., Laplanche A., Lejeune F., Stoeckle E., Le Péchoux C., Vanel D.,

Terrier P., Lumbroso J., Ricard M., Antoni G., Cavalcanti A., Robert C.,

Lassau N., Blay J.Y., Le Cesne A. Limb salvage with isolated perfusion

for soft tissue sarcoma: could less TNF-alpha be better? Ann Oncol., 16

(2005), pp. 1061-1068

22. van der Veen A.H., de Wilt J.H., Eggermont A.M. TNF-alpha augments

intratumoural concentrations of doxorubicin in TNF-alpha-based isolated

limb perfusion in rat sarcoma models and enhances anti-tumour effects

Br J Cancer., 82 (2000), pp. 973-980

23. Orlowski R.Z., Baldwin A.S. NF-kappaB as a therapeutic target in cancer

Trends Mol Med., 8 (2002), pp. 385-389

24. Wang C.Y., Cusack J.C, Liu R., Baldwin A.S. Control of inducible

chemoresistance: enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis

by inhibition of NF-kappaB Nat Med., 5 (1999), pp. 412-417

25. Lee K.Y., Chang W., Qiu D., Kao P.N., Rosen G.D. PG490 (triptolide)

cooperates with tumor necrosis factor-alpha to induce apoptosis in tumor

cells. J Biol Chem., 274 (1999), pp. 13451-13455

26. Richardson P.G., Barlogie B., Berenson J., Jakubowiak A., Lonial S., Raje

N.S., Alsina M., Ghobrial I.M., Schlossman R.L., Munshi N.C., Mazumder A.,

Vesole D.H., Kaufman J.L., Colson K., McKenney M., Lunde L.E., Feather J.,

Maglio M.E., Warren D., Francis D., Hideshima T., Knight R., Esseltine D.L.,

Mitsiades C.S., Weller E., Anderson K.C. A phase 2 study of bortezomib

in relapsed, refractory myeloma N Engl J Med., 348 (2003) pp. 2609-2617

27. Yang J.S., Wu C.C., Lee H.Z., Hsieh W.T, Tang F.Y., Bau D.T., Lai K.C.,

Lien J.C., Chung J.G. Suppression of the TNF-alpha level is mediated by Gan-

Lu-Yin (traditional Chinese medicine) in human oral cancer cells through

the NF-kappa B, AKT, and ERK-dependent pathways Environ Toxicol. (2015)

doi: 10.1002/tox.22127

28. Binder C., Schulz M., Hiddemann W., Oellerich M. Induction of inducible

nitric oxide synthase is an essential part of tumor necrosis factor-

alphainduced apoptosis in MCF-7 and other epithelial tumor cells Lab Invest.,

79 (1999), pp.1703-1712

29. de Wilt J.H., Manusama E.R., van Etten B., van Tiel S.T.B., Jorna A.S,

Seynhaeve A.L., ten Hagen T.L., Eggermont A.M. Nitric oxide synthase

inhibition results in synergistic anti-tumour activity with melphalan

and tumour necrosis factor alpha-based isolated limb perfusions Br J Cancer.,

83 (2000), pp. 1176-1182

30. Mocellin S., Provenzano M., Rossi C.R., Pilati P., Scalerta R., Lise M., Nitti

D. Induction of endothelial nitric oxide synthase expression by melanoma



69

sensitizes endothelial cells to tumor necrosis factor-driven cytotoxicity Clin

Cancer Res., 10 (2004), pp. 6879-6886

31. Campanholo V.M., Silva R.M., Silva T.D., Neto R.A., Paiotti A.P., Ribeiro

D.A., Forones N.M. Oral Concentrated Grape Juice Suppresses Expression

of NF-kappa B, TNF-α and iNOS in Experimentally Induced Colorectal

Carcinogenesis in Wistar Rats Asian Pac J Cancer Prev.16 (2015);16(3): 947-52

32. Totzke G., Schulze-Osthoff K., Janicke R.U. Cyclooxygenase-2 (COX-2)

inhibitors sensitize tumor cells specifically to death receptor-induced

apoptosis independently of COX-2 inhibition Oncogene., 22 (2003),

8021-8030

33. Curnis F., Sacchi A., Corti A. Improving chemotherapeutic drug penetration

in tumors by vascular targeting and barrier alteration J Clin Invest.,

110 (2002), pp. 475-482

34. Fulda S., Debatin K.M. IFNgamma sensitizes for apoptosis by upregulating

caspase-8 expression through the Stat1 pathway Oncogene., 21 (2002),

pp. 2295-2308

35. Gnant M.F., Berger A.C., Huang J., Puhlmann M., Wu P.C., Merino M.J.,

Bartlett D.L., Alexander H.R., Libutti S.K. Sensitization of tumor necrosis

factor alpha-resistant human melanoma by tumor-specific in vivo transfer

of the gene encoding endothelial monocyte-activating polypeptide II using

recombinant vaccinia virus Cancer Res., 59 (1999), 4668-4674

36. Schwarz M.A., Kandel J., Brett J., Hayward J., Schwarz R.E., Chappey O.,

J.L. Wauiter, J. Chabot, P.Lo Gerfo, D. Stern Endothelial-monocyte activating

polypeptide II, a novel antitumor cytokine that suppresses primary

and metastatic tumor growth and induces apoptosis in growing endothelial

cells J Exp Med. 190 (1999), pp. 341-54

TNF-α – molecular structure, anti-tumor activity and potential

application in clinical trials

Abstract

Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) is a multifunctional cytokine that plays crucial role in inflammation and also in apoptosis. Despite anti-tumor entitled, it is found in variety

other diseases. Up to date, application of TNF-α is limited to local treatment of tumors.

The binding of TNF- α with its specific TNF receptor type 1 and type 2 (TNFR-1, TNFR-2)

leads to cascade reactions via transduction pathways, which process independently of each other and result in occurrence of two different effects – apoptosis and protection of the cell

against programmed cell death. This review pays particular attention to describe current

information of TNF-α: its molecular structure, signaling pathways and potential tumor

activity.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schwarz%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10430623

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chappey%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10430623

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wautier%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10430623

70

Katarzyna Terlega1, Justyna Płonka

1, Dariusz Kuśmierz

1

Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach

Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (MMPs) tworzą grupę enzymów proteolitycznych niezbędnych do utrzymania prawidłowej

struktury macierzy pozakomórkowej (ECM). Można je znaleźć m.in. w fib-

roblastach, keratynocytach, monocytach, leukocytach, hepatocytach

oraz komórkach nowotworowych. MMPs uczestniczą w regulacji procesów apoptozy, angiogenezy i odpowiedzi immunologicznej oraz wpływają

na inwazyjność i tworzenie przerzutów. Obecność aktywnych enzymów

z rodziny metaloproteinaz wykrywa się praktycznie na wszystkich etapach

rozwoju procesu nowotworowego. Ich działanie polega na degradacji składników macierzy pozakomórkowej oraz uwalnianiu cząsteczek

biologicznie czynnych, które z kolei wpływają na zachowanie się komórek

nowotworowych. Zaangażowanie metaloproteinaz w procesy związane

z rozwojem nowotworu daje szanse na wykorzystanie ich jako markerów pozwalających nie tylko potwierdzić obecność nowotworu, ale także

określić jego stopień zaawansowania.

1. Wprowadzenie

Rozwój nowotworu jest procesem złożonym i wieloetapowym.

Obejmuje on proliferację i migrację komórek nowotworowych oraz

ich przemieszczanie się drogą naczyń krwionośnych lub limfatycznych

do odległych narządów. Związany jest również tworzeniem przerzutów

oraz powstawaniem nowych naczyń krwionośnych, które odżywiają tkankę

nowotworową i umożliwiają wzrost guza. Każdy z tych etapów pełniących

istotną rolę w przejściu od zdrowej komórki do dojrzałego przerzutującego

guza, regulowany jest poprzez interakcje wielu genów [1]. Naciekanie

podścieliska tkankowego narządu oraz struktur sąsiadujących, a także

tworzenie przerzutów odległych staje się możliwe tylko wtedy,

gdy nowotwór przekroczy barierę jaką tworzą błony podstawne i elementy

strukturalne macierzy pozakomórkowej. Aby guz mógł powiększać

swe rozmiary, a komórki go budujące migrować do innych części

organizmu niezbędny jest udział wydzielanych przez komórki

nowotworowe enzymów proteolitycznych - głównie metaloproteinaz

macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs), które odpowiadają za rozkład

struktury błon podstawnych i macierzy pozakomórkowej [2÷4].

1 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach, Zakład Biologii Komórki


71

2. Metaloproteinazy

Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej stanowią liczną rodzinę

endopeptydaz, których aktywność proteolityczna zależna jest od jonów

cynku i wapnia [5÷7]. Posiadają zdolność degradacji i reorganizacji białek

macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [8]. Są jedynymi enzymami

proteolitycznymi trawiącymi kolagen typu IV, który buduje szkielet błony

podstawnej naczyń, tym samym przyczyniają się do powstawania

przerzutów. W organizmie ludzkim występują 24 geny kodujące MMPs

lecz tylko 23 metaloproteinazy ponieważ MMP-23 kodowany jest przez

dwa jednakowe geny zlokalizowane na chromosomie 1 [5,8,9]. Wszystkie

one mają zbliżony do siebie schemat budowy i masę cząsteczkową leżącą

w przedziale od 28 do 92 kDa [10].

W strukturze chemicznej wszystkich MMPs można wyróżnić trzy

domeny – peptyd sygnałowy, propeptyd oraz domenę katalityczną,

a dodatkowo w obrębie większości MMPs również region zawiasowy oraz

domenę hemopeksyny. Ponadto wybrane MMPs posiadają charakterystyczne

domeny decydujące o ich odmiennych właściwościach [11÷14].

Biorąc pod uwagę budowę chemiczną oraz specyficzność substratową

poszczególnych enzymów podzielono metaloproteinazy na sześć

podrodzin:

kolagenazy, do których należą MMP-1, MMP-8, MMP-13 oraz MMP-

18 – występujący wyłącznie u Xenopus; wykazują zdolność degradacji

m.in. kolagenu typu I, II, III, V i IX;

żelatynazy degradujące m.in. kolagen typu IV, lamininę oraz żelatynę;

podrodzina obejmuje MMP-2 i MMP-9;

stromielizyny, do których zaliczamy MMP-3, MMP-10 i MMP-11,

enzymy te powodują rozkład składowych EMC: fibronektyny,

lamininy oraz proteoglikanów;

matrylizyny – MMP-7 i MMP-26, metaloproteinazy o najkrótszym

łańcuchu polipeptydowym; ich substratami są m.in. żelatyna,

fibronektyna, ligand Fas czy E-kadheryna;

błonowe MMPs związane z powierzchnią błony komórkowej: MMP-

14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 oraz MMP-25;

niesklasyfikowane MMPs, które nie zostały przyporządkowane

do innych grup MMP-12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23,

MMP-27 oraz MMP-28 [4, 15÷17].

Metaloproteinazy pełnią zasadnicze funkcje w licznych procesach

fizjologicznych, których podstawą jest przebudowa istoty pozakomórkowej,

tj. w morfogenezie tkanek, w rozwoju kości i zębów, w cyklicznym

przekształceniu endometrium macicy oraz w zmianach zachodzących w tym

narządzie podczas ciąży, porodu i połogu. Ponadto odgrywają znaczną rolę


72

w budowie tkanki podporowej narządów wewnętrznych oraz tworzeniu

nowych naczyń krwionośnych. Umożliwiają także migrację komórek

odpowiedzi immunologicznej do miejsca toczącego się procesu zapalnego

oraz uczestniczą w procesie gojenia się ran i powstawania blizn [5, 14, 17,

18]. Syntetyzowane są wówczas przez wiele komórek, między innymi przez

fibroblasty, keratynocyty, komórki śródbłonka naczyń, monocyty, makrofagi

i leukocyty [11].

Jednak dużo ważniejszy z punktu widzenia diagnostyki i leczenia

wydaje się być udział tych enzymów w procesach patologicznych

prowadzących do powstania nowotworów lub rozwoju różnego rodzaju

chorób. Wzrost aktywności proteolitycznej MMPs wykazano

w schorzeniach, w których dochodzi do zaburzenia równowagi pomiędzy

syntezą i rozkładem elementów strukturalnych macierzy pozakomórkowej,

takich jak: miażdżyca, zapalenie stawów czy choroby nowotworowe [9].

2.1. Kontrola aktywności metaloproteinaz

Zsyntetyzowane MMP mają postać nieaktywnych zymogenów (pre-

proenzymów), ich aktywacja jest realizowana poprzez usunięcie

prodomeny i tym samym odsłonięcie miejsca aktywnego. W procesie tym,

zwanym przełącznikiem cysteinowym, rozerwane zostaje wiązanie

pomiędzy grupą tiolową cysteiny w propeptydzie i atomem cynku

w centrum aktywnym, co powoduje zmianę konformacji cząsteczki MMP

[4, 19]. Przeważająca część MMP aktywowana jest na zewnątrz komórki,

natomiast błonowe MMPs: MMP-1 i MMP-21 aktywowane są wewnątrz

komórki w aparacie Golgiego [13]. Do pełnej aktywacji enzymu wymagana

jest obecność jonów wapnia [4, 20]. Istnieje wiele czynników mogących

wywołać aktywację MMP. Należą do nich między innymi: HgCl2,

detergenty (SDS), niskie pH, podwyższona temperatura, proteazy oraz

reaktywne formy tlenu [13].

W prawidłowych komórkach metaloproteinazy wydzielane są w małych

ilościach a ich aktywność jest niska, jednak gdy zajdzie konieczność

niespodziewanej przebudowy macierzy pozakomórkowej natychmiast

indukowana jest ich produkcja i uwalnianie [20]. Aktywność tych

enzymów w warunkach fizjologicznych podlega regulacji na poziomie:

transkrypcji genów;

translacji;

aktywacji proenzymów;

oraz poprzez inhibitory tkankowe [6, 14, 21÷23].

W badaniach in vitro udowodniono, że liczne substancje takie

jak czynniki wzrostu i cytokiny a wśród nich: nabłonkowy czynnik wzrostu

(EGF), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), interleukina 1β (IL-1β),


73

podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), płytkowy czynnik

wzrostu (PDGF), interleukina 6 (IL-6), transformujący czynnik wzrostu

β (TNF-β), środki chemiczne, psychiczny stres, onkogeniczna transformacja

błonowa podobnie jak wzajemne oddziaływanie komórki na komórkę lub

komórki na macierz – regulują ekspresję genów kodujących MMP [6,14].

Aby stać się aktywnym, proenzym MMP musi przejść przez proces

zwany „przełącznikiem cysteinowym” podczas, którego zyskuje aktywność

katalityczną [24]. Większość proMMP jest wydzielana z komórki

i aktywowana poza nią. Nieaktywny zymogen może zostać aktywowany

przez proteinazy lub czynnik nie posiadający właściwości proteolitycznych

[6]. Proces nadania aktywności zymogenowi MMP obejmuje bezpośrednią

aktywację przez proteinazy, redukcję przez utleniacze lub nie fizjologiczne

reagenty oraz przekształcenia allosteryczne [24].

Aktywacja proenzymu zachodząca pod wpływem enzymów proteoli-

tycznych, plazminy, jonów metali oraz oksydantów jest kolejnym stopniem

kontroli aktywności metaloproteinaz [24].

Aktywność metaloproteinaz kontrolowana jest również przez szereg

endogennych inhibitorów, niektóre z nich to ogóle inhibitory proteazy

np. α2-makroglobulina lub α1-proteaza, które są niespecyficzne w stosunku

do MMPs i powodują blokowanie aktywność MMPs przede wszystkim

w osoczu i płynach tkankowych [19].

Istnieje również grupa strukturalnie powiązanych i specyficznych

w stosunku do MMPs tkankowych inhibitorów metaloproteinaz zwanych

w skrócie TIMP [25÷29]. Obecnie zidentyfikowane zostały cztery takie

inhibitory: TIMP-1, TIMP-2 i TIMP-4 są wydzielane do płynów

tkankowych natomiast TIMP-3 zakotwiczony jest w ECM czyli w macierzy

pozakomórkowej [19]. Wszystkie TIMPs posiadają 12 konserwatywnych

reszt cysteiny, które są niezbędne do utworzenia sześciu wiązań

dwusiarczkowych. N-końcowa domena każdego TIMPs jest wymagana do

hamowania aktywności MMP [30]. Mechanizm działania inhibitorów

tkankowych może być dwojaki. Po pierwsze inhibitory TIMP mogą działać

już na poziomie aktywacji proenzymu poprzez zablokowanie możliwości

odłączenia N-końcowego fragmentu metaloproteinaz [14]. Po drugie może

zostać utworzony kompleks TIMP-MMP co powoduje inaktywację

aktywnej formy metaloproteinazy [29, 31].


74

3. Metaloproteinazy w nowotworach

3.1. Metaloproteinazy a mikrośrodowisko guza

Metaloproteinazy odgrywają niezwykle istotną rolę w procesie rozwoju

nowotworu, jednak - jak wykazano w licznych pracach - same komórki

nowotworowe syntetyzują tylko niewielkie ilości MMPs. Strategia przyjęta

przez nowotwór polega przede wszystkim na pobudzaniu otaczających

je prawidłowych komórek (fibroblastów, makrofagów, komórek tucznych,

wielojądrzastych neutrofili, adypocytów i komórek śródbłonka)

do wytwarzania potrzebnych im MMPs. W procesie tym pośredniczą

interleukiny, interferony, czynniki wzrostu i induktor metaloproteinaz

macierzy zewnątrzkomórkowej (EMMPRIN) [32,33].

Należy pamiętać też, że zwiększenie ekspresji MMPs jest naturalną

konsekwencją starzenia się fibroblastów, które może być ważnym ogniwem

w wytworzeniu proonkogenicznego środowiska w tkance i zwiększać

liczbę zachorowań wraz z wiekiem. Uszkodzenia DNA powodują

wzmożony MMP-zależny wzrost komórek rakowych [34].

3.2. Rola metaloproteinaz w rozwoju nowotworu

Wśród krytycznych dla rozwoju nowotworu procesów, na które

oddziaływują MMPs warto wymienić: proliferację komórek nowotwo-

rowych, inwazyjność, migrację, angiogenezę oraz blokowanie apoptozy

komórek nowotworowych. Jedne z najnowszych badań pozwalają

stwierdzić, iż rożne enzymy z rodziny MMPs wpływają na rozmaite

procesy odbywające się na kolejnych etapach rozwoju choroby. Bardzo

ciekawym jest fakt, że są one zdolne zarówno do przyśpieszenia jak i do

hamowania rozwoju nowotworu, a kierunek w jakim będzie przebiegał

rozwój zależy między innymi od stadium guza i jego lokalizacji [35].

MMPs mogą przyczyniać się do proliferacji komórek nowotworowych

na kilka sposobów. Mogą one zmieniać biologiczną dostępność czynników

wzrostu i funkcję receptorów na powierzchni komórek. Posiadają

np. zdolność uwalniania insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF)

i receptorów czynnika wzrostu naskórka (EGFR) dla ligandów, które

promują proliferację. EGFR pełni funkcję mediatora proliferacji

komórkowej, który przyczynia się do rozwoju nowotworu, ponieważ ulega

nadekspresji w przypadku ponad jednej trzeciej wszystkich guzów litych

[36]. Warte uwagi są również wyniki badań, które potwierdzają kluczową

rolę interakcji pomiędzy glikozoaminoglikanami (GAG)-MMP-GFS, która

powoduje aktywację proMMP [37].

Migracja komórek nowotworowych jest podstawowym procesem

w inwazyjności i przerzutowaniu nowotworu, ale żeby była możliwa


75

konieczna jest degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej przez

metaloproteinazy. Nadekspresja MMPs intensyfikuje migrację komórek

nowotworowych, natomiast nadmierna ekspresja TIMPs lub wykorzystanie

inhibitorów MMPs ogranicza migrację [14].

Nowotwór odżywiany tylko przez naczynia krwionośne z sąsiadujących

tkanek może osiągnąć maksymalną średnicę około 2 mm dalszy jego wzrost

i możliwość przerzutowania zależy od zaopatrzenia w tlen i substancje

odżywcze dostarczane poprzez naczynia krwionośne [14,38]. Najistotniejszą

rolę w procesie angiogenezy nowotworowej odgrywają MMP-2, MMP-9

oraz MMP-14 i w mniejszym stopniu MMP-1 i MMP-7 [36]. MMP-9 m.in.

uczestniczy w uruchamianiu włącznika naczyniotwórczego, MMP-2,-7,-9,-

12 posiadają możliwość trawienia plazminogenu i uwalniania zwiększającej

apoptozę komórek nowotworowych angiostatyny [38]. Angiogeneza

w obrębie zmian nowotworowych prawie zawsze dotyczy małych naczyń

krwionośnych. Proces tworzenia nowych naczyń możemy podzielić na pięć

etapów:

zwiotczenie ściany naczyń i pobudzenie komórek śródbłonka;

degradacja błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej;

migracja i proliferacja komórek śródbłonka;

wytworzenie rurkowatych struktur nowego naczynia;

otoczenie nowopowstałych naczyń przez komórki mezenchymalne [13].

Powstawanie nowych naczyń krwionośnych może odbywać się na różne

sposoby. Poprzez waskulogenezę, czyli tworzenie naczyń de novo

z angioblastów, różnicujących się następnie w dojrzale komórki śródbłonka

lub poprzez tworzenie naczyń na bazie już istniejącej sieci naczyń [13].

Innym sposobem jest najczęściej opisywany mechanizm zwany

kiełkowaniem (sprouting) wykorzystujący proliferacją i migrację

EC, tworzących ściany powstających naczyń [39]. Wśród czynników

regulujących proces angiogenezy najistotniejszym jest VEGF czyli

naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu [38,40].

Metaloproteinazy mają zdolność zarówno indukowania jak i hamowania

apoptozy. Działanie proapoptotyczne MMP-7 polega na uwolnieniu

związanego z błoną ligandu Fas, który łącząc się ze swoimi receptorami

uruchamia szlak sygnalizacyjny [7]. MMPs mogą wspomagać apoptozę

komórek w procesie anoikis [13]. Pośrednio również zmiana składu ECM

wywołana działaniem MMPs może wywierać efekt proapoptotyczny. Efekt

antyapoptotyczny związany jest z aktywacją pośrednią serynowo/treoinowej

kinazy Akt/białko B przez kaskady sygnalizacyjne EGFR i IGFR [36].


76

3.3. Metaloproteinazy w różnych nowotworach

Liczne badania prowadzone w celu oceny zależności pomiędzy

ekspresją metaloproteinaz np. w tkance nowotworowej czy surowicy krwi,

a występowaniem zmian nowotworowych, ich stopniem zaawansowania,

oraz występowaniem przerzutów odległych potwierdzają, iż w wielu

nowotworach złośliwych następuje wzrost ekspresji MMPs.

3.3.1. Nowotwór krtani

Jest to najczęściej występujący złośliwy nowotwór szyi i głowy.

Współczynnik zachorowań na raka krtani wynosi wśród mężczyzn 4,8%

a wśród kobiet tylko 0,4% wszystkich zarejestrowanych zachorowań

na nowotwory. W męskiej populacji występowanie tego typu nowotworu

jak i umieralność nim spowodowana jest około 10-15-krotnie wyższe

niż w populacji kobiet. Najliczniejszą grupą chorych z takim umiejąco-

wieniem zmian stanowią wśród mężczyzn pacjenci w przedziale

wiekowym od 50 do 60 lat, a wśród kobiet te powyżej 70 roku życia [41].

W wyniku przeprowadzonych badań ekspresji MMP-1,-2,-9 w prepara-

tach mikroskopowych pobranych od chorych na raka krtani, zaobserwowano

wzrost ekspresji MMP-1 u 63,5% pacjentów, MMP-2 u 16,3% pacjentów

oraz MMP-9 u 37,5% pacjentów. Uzyskane wyniki dotyczyły nowotworów

o niskim zróżnicowaniu. W przeprowadzonych testach obserwowano istotną

zależność między ekspresją MMP-2, a obecnością przerzutów do węzłów

chłonnych oraz brak takiej zależności dla MMP-1 i MMP-9 [42].

3.3.2. Nowotwór żołądka

Rak żołądka plasuje się na drugim miejscu w rankingu chorób

nowotworowych o najwyższej śmiertelności. Najczęściej chorują na niego

mieszkańcy Japonii, Chin oraz Rosji a najrzadziej występuje on w Ameryce

Północnej i Europie Zachodniej. Biorąc jako kryterium częstość

zachorowania na nowotwory złośliwe w Polsce to rak żołądka zajmuje

trzecie miejsce wśród mężczyzn i ósme wśród kobiet [21].

W licznych badaniach zaobserwowano nasiloną ekspresję metalo-

proteinaz i fakt iż poziom ekspresji MMPs jest proporcjonalny do stopnia

zaawansowana nowotworu. Stężenie MMP-9 w osoczu chorych jest wyższe

niż u zdrowych, a jej nasilona ekspresja występuje w przypadku obecności

przerzutów odległych i słabo zróżnicowanego guza. Krótsza przeżywalność

obserwowana jest w przypadku wzrostu ekspresji: MMP-2, MMP-3, MMP-

7, MMP-9 I MMP-13. Występowanie przerzutów do węzłów chłonnych

związane jest z ekspresją MMP-2 i MMP-9. W badaniach wykazano również

istotny związek pomiędzy nadekspresją MMP-7, MMP-9 i MMP-13,

a zwiększoną złośliwością nowotworu [5].


77

3.3.3. Nowotwór trzustki

Szacunkowa roczna ilość zachorowań na raka trzustki waha się od 4

do 10 przypadków wykrytych na 100 tysięcy mieszkańców, co powoduje

że jest on ósmą przyczyną zgonów powodowanych przez nowotwory

złośliwe na świecie. Nowotwór tego narządu cechuje się agresywnym

przebiegiem, złym rokowaniem i wysokim wskaźnikiem śmiertelności [5,

18]. Rak trzustki jest niezwykle podstępną chorobą, która przez długi czas

nie daje prawie żadnych objawów a w momencie wystąpienia symptomów

chorobowych najczęściej mamy już do czynienia z zaawanso-wanym jej

stadium. Zastosowanie metaloproteinaz w diagno-styce może dać szansę na

wykrycie choroby w jej wczesnym stadium co zwiększyło by szanse

chorych na dłuższe przeżycie, a może nawet całkowity powrót do zdrowia.

Przeprowadzono badania oceniające poziom różnych biomarkerów raka

trzustki w tkankach, krwi oraz soku trzustkowym. W analizach surowicy

krwi oraz tkanek zauważono, iż stężenie MMP-9 było znacznie wyższe

u pacjentów z gruczolakorakiem przewodowym trzustki niż u chorych

z przewlekłym zapaleniem trzustki oraz osób zdrowych [26]. Liczne

badania potwierdzają, że MMP-9 ma znaczący wpływ na powstawanie

przerzutów raka przewodowego trzustki [43]. Inne badania wskazują,

iż nasilona synteza MMP-2 i MMP-9 w komórkach nowotworowych może

ułatwiać naciekanie guza i zwiększać stopień jego inwazyjności [18].

Dodatkowo wykazano występowanie mRNA dla MMP-1 w komórkach

raka trzustki, a badania Ito i wsp. sugerują, że pacjenci, u których wykryto

MMP-1 mają gorsze rokowania niż ci, u których jej nie znaleziono [44].

Kolejne badania dowiodły, że komórki raka trzustki charakteryzują

się wyższą ekspresją MMP-7,-8,-9,-11 w porównaniu do zdrowej tkanki .

Nadekspresja MMP-11 powiązana jest z obecnością przerzutów do węzłów

chłonnych [45].

Stosując żelatynową zymografię do analizy wskaźnika aktywności

MMP-2, (stosunek aktywnej postaci MMP-2 do całkowitego MMP-2 oraz

proMMP-2) w uzyskanym endoskopowo soku trzustkowym, wykazano

znaczący wzrost tego wskaźnika u chorych z rakiem trzustki w stosunku

do pacjentów z zapaleniem trzustki oraz osób zdrowych. Aktywna forma

MMP-2 została znaleziona także u pacjentów, u których średnica guza

trzustki była mniejsza niż 2 cm, co pozwala sądzić, iż ocena aktywności

MMP-2 za pomocą zymografii może pełnić funkcję wskaźnika

w diagnostyce raka trzustki, także w jego wczesnym stadium [46].


78

3.3.4. Nowotwór płuc

Największa zachorowalność na raka płuc występuje między 55 a 70

rokiem życia i w 80% przypadków występuje postać niedrobnokomórkowa

(NDRP). Pośród czynników zwiększających ryzyko rozwoju nowotworu

w płucach są: palenie tytoniu, zapalne zmiany włókniste płuc oraz praca

w powietrzu zawierającym azbest, uran. Bardzo często nowotwór płuc

ma przebieg bezobjawowy, a z powodu przerzutów 30-40% chorych

nie kwalifikuje się do chirurgicznego usunięcia guza [5].

Badania dotyczące MMPs w próbkach surowicy krwi oraz plwociny

wykazały znaczący wzrost poziomu MMP-2 w przypadku nowotworu płuc

w porównaniu do zmian łagodnych i grupy kontrolnej [47]. Ekspresja MMP-

7 była wyższa w NDRP niż w komórkach gruczolakoraka i skorelowana

z krótszym czasem przeżycia pacjentów. Zauważono także ujemną korelację

między poziomem MMP-7, a ogólną odpowiedzią na chemioterapię dlatego

też ekspresja MMP-7 może być znaczącym czynnikiem prognostycznym

i służyć może do przewidywania odpowiedzi na chemioterapię [26].

Wykazano ponadto brak wpływu podwyższonego stężenia MMP-9

w surowicy krwi na wielkość guza oraz przerzutowanie do węzłów chłonnych.

Natomiast potwierdzono, iż MMP-9 odpowiada za przerzuty odlegle [5].

3.3.5. Rak piersi

Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem u kobiet

na świecie. Badania, w których rozpatrywany jest udział MMPs i TIMPs

w patogenezie raka piersi zmierzają do wytypowania tych spośród

metaloproteinaz, które mogłyby znaleźć zastosowanie jako wczesne

markery raka gruczołu piersiowego oraz czynniki prognostyczne

przebiegu choroby.

Sugeruje się, że MMP-1 przyczynia się do zapoczątkowania rozwoju

raka piersi. W tkance nowotworowej uzyskanej od pacjentek z rakiem

piersi obserwuje się podwyższoną aktywność proteolityczną MMP-1,

MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-15, MMP-19, MMP-23

i MMP-28 [48] oraz MMP-2 i MMP-9 [49]. Stosunki ekspresji MMP-

2/TIMP-2 oraz MMP-9/TIMP-1 mogą mieć znaczenie jako wskaźniki

pozwalające różnicować łagodne i złośliwe zmiany nowotworowe

rozwijające się w obrębie gruczołu piersiowego. Podwyższony stosunek

MMP-9/TIMP-1 w tkance nowotworowej piersi koreluje z większym

rozmiarem zmiany nowotworowej, natomiast MMP-2/TIMP-2

z występującymi przerzutami w węzłach chłonnych [50].


79

3.3.6. Czerniak

Czerniak (melanoma malignum) jest jednym z najbardziej złośliwych

nowotworów skóry. Wywodzi się on z melanocytów, ulegających złośliwej

przemianie. Najczęstszym umiejscowieniem czerniaka jest skóra oraz

błony śluzowe i siatkówka oka.

Wykorzystanie wielu technik badawczych pozwoliło na identyfikację

metaloproteinaz macierzy zarówno w obrębie komórek czerniaka,

jak i komórkach podścieliska je otaczających. Z rozwojem czerniaka

związany jest zwiększony poziom MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13

i MMP-14. MMP-2 identyfikowana jest zarówno w zmianach

barwnikowych łagodnych jak i złośliwych, przy czym w złośliwych jest

wyraźnie wyższa. MMP-2 koreluje również z występowaniem odległych

przerzutów i krótszym czasie przeżycia u chorych z czerniakiem [51].

Również ekspresja MMP-1, MMP-13, MT-MMP-1, TIMP-1 oraz

TIMP-3 jest podwyższona w fazach zaawansowanych zmian, natomiast

ekspresja MMP-9 ogranicza się do wczesnych faz czerniaka, co wskazuje

na odmienne profile ekspresji MMP w różnych stadiach rozwoju

tych zmian [52].

4. Podsumowanie

Przytoczone dane prezentują ważną rolę jaką metaloproteinazy

macierzy zewnątrzkomórkowej spełniają zarówno w procesach

fizjologicznych jak i w rozwoju procesu nowotworowego. Czynny udział

MMP w procesach związanych z powstawaniem i rozwojem zmian

nowotworowych daje szansę na zastosowanie ich jako markerów

nowotworowych. Dokładne poznanie właściwości biologicznych

metaloproteinaz oraz związków hamujących ich aktywność może

w przyszłości podnieść skuteczność terapii przeciwnowotworowych.

Literatura

1. Martin M.D., Matrisian L.M. The Rother side of MMPs : protestive roles in tumor progression, Cancer Metastasis Rev., 2007 Dec, 26 (3-4), pp. 717-724

2. Grębecka L. Migracja komórek nowotworowych w organizmie, Kosmos, 44 (1995), pp. 405-436

3. Radzikowski C., Opolski A., Wietrzyk J. Postęp w badaniach procesu inwazyjnego i przerzutowania, Nowotwory – Journal of Oncology, 53 (2002), pp. 57-65

4. Kwiatkowski P., Godlewski J., Śliwińska – Jewsiewicka A., Kmieć Z. Rola metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej w procesie inwazji nowotworu, Pol. Ann. Med. 15 (2008), pp.43-50

5. Zygmunt K., Zygmunt L. Znaczenie Metaloproteinaz i ich inhibitorów tkankowych w procesie nowotworowym, Przegl. Med. Uniw. Rzesz. Inst. Leków, 3 (2013), pp. 410-417


80

6. Hijova E. Matrix metalloproteinases: their biological functions and clinical implications, Bratisl Lek Listy, 106 (2005), pp. 127-132

7. Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., Huska D.,. Adam V, Masarik M., Prusa R., Kizek R. Matrix Metalloproteinases, Curr Med Chem, 17 (2010), pp. 3751-3768

8. Hadler-Olsen E., Fadnes B., Sylte I., Uhlin-Hansen L., Winberg J.O. Regulation of matrix Metalloproteinase activity in health and disease, FEBS J, 278(2011), pp. 28-45

9. Dziankowska-Bartkowiak B., Waszczykowska E., Żebrowska E. Udział metaloproteinaz i ich inhibitorów w patogenezie wybranych chorób skóry, Alergia Astma Immunologia, 9 (2004), pp.71-79

10. Tauro M., McGuire J., Lynch C.C. New approaches to selectively target associated matrix metalloproteinases activity, Cancer Metastasis Rev., 33 (2014), pp. 1043-1057

11. Kessenbrock K., Plaks V., Werb Z. Matrix metalloproteinases: Regulators of the tumor microenvironment, Cell, 141 (2010), pp. 52-67

12. Scherer R.L., McIntyre J.O., Matrisian L.M. Imaging matrix metalloproteinases in cancer, Cancer Metastasis Rev., 27 (2008), pp. 679-690

13. Fink K., Boratyński J. Rola metaloproteinaz w modyfikacji macierzy zewnątrzkomórkowej w nowotworowym wzroście inwazyjnym, w przerzutowaniu i w angiogenezie, Postep Hig Med Dosw, 66 (2012), pp. 609-628

14. Śliwowska I., Kopczyński Z. Metaloproteinazy macierzy zewnątrz – charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartość oznaczenia u chorych na raka piersi, Współczesna Onkologia, 9 (2005), pp. 327-335

15. Decock J., Thirkettle S., Wagstaff L., Edwards D.R. Matrix metalloproteinases: protectice, roles in cancer, J Cell Mol Med., 6 (2011), pp. 1254-1265

16. Krizkova S., Zitka O., Masarik M., Adam V., Stiborova M., Eckschlager T., Hubalek J., Kizek R. Clinical importance of matrix metalloproteinases, Bratisl Lek Listy, 112 (2011), pp. 435-440

17. Wlaźlak E., Surkont G., Kobos J., Tyliński W., Stetkiewicz T., Suzin J. Ekspresja metaloproteinaz MMP-1, MMP-9 oraz tkankowego inhibitora metaloproteinazy TIMP-1 w przypadkach raka endometrium oraz rozrostów błony śluzowej jamy macicy, Przegląd Menopauzalny, 6 (2006), pp. 363-366

18. Łukaszewicz M., Mroczko B., Szmitkowski M. Rola metaloproteinaz i ich inhibitorów w raku trzustki, Post. Hig. Med. Dośw., 62 (2008), pp. 141-147

19. Folgueras A.R., Pendas A.M., Sanchez L.M., Lopez-Otin C. Matrix metaloproteinas in cancer: from new functions to improved inhibition strategies, Int. J. Dev. Biol., 48 (2004), pp. 411-424

20. Nagase H., Woessner J.F. Matrix metalloproteinases, J Biol Chem, 274 (1999), pp. 21491-21494

21. Łukaszewicz-Zając M., Mroczko B., Szmitkowski M. Znaczenie metaloproteinaz oraz ich inhibitorów w raku żołądka, Postępy Hig. Med. Dośw., 63 (2009), pp. 258-265

22. Biljana E., Boris V., Cena D., Veleska-Stefkovska D. Matrix metaloproteina (with akcent to collagenases), J Cell and Animal Biology, 5 (2011), pp. 113-120


81

23. Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression, Nat Rev Cancer, 2 (2002), pp. 163-176

24. Deryugina E.I., Quigley J.P. Pleiotropic role of matrix metalloproteinases In tumor angiogenesis: Contrasting, overlapping and compensatory function, Biochim Biophys Acta, 1803 (2010), pp. 103-120

25. Konjević G., Stanković S. Matrix metalloproteinases in the process of invasion and metastasis of breast cancer, Arch Oncol, 14 (2006), pp.136-140

26. Roy R., Yang J., Moses M.A. Matrix metalloproteinases as novel biomarks and potential therapeutic target in human cancer, J Clin Oncol, 27 (2009), pp. 5287-5297

27. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function and biochemistry, J Am Heart Assoc, 92 (2003), pp. 827-839

28. Noel A., Jost M., Maquoi E. Matrix metalloproteinases at cancer tumor-host interface, Seminars in Cell & Developmental Biology, 19 (2008), pp. 52-60

29. Murphy G., Nagase H. Progress in matrix metalloproteinases research, Mol Aspects Med., 29 (2008), pp. 290-308

30. Polette M., Nawrocki-Raby B., Gilles C., Clavel C., Birembaut P. Tumor invasion and matrix metalloproteinases, Crit Rev Oncol Hematol, 49 (2004), pp. 179-186

31. Albin A., Melchiori A., Santi L., Liotta L.A., Brown P.D., Stetler-Stevenson W.G. Tumor cell invasion inhibited by TIMP-2, J. Natl Cancer Inst, 83 (1991), pp. 775-779

32. Zigrino P., Löffek S., Mauch C. Tumor-stoma interactions: their role In control of tumor cell invasion, Biochimie, 87 (2005), pp. 321-328

33. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior, Annu Rev Cell Dev Biol, 17 (2001), pp. 463-516

34. Liu D., Hornsby PJ. Senescent human fibroblasts increase the elary growth of xenograft tumors via matrix metalloproteinase secretion, Cancer Res, 67 (2007), pp. 3117-3126

35. Decock J., Hendrickx W., Vanleeuw U., Van Belle V., Van Huffel S., Christiaens M.R. Plasma MMP-1 and MMP-8 expression in breast cancer: protective role of MMP-8 against lymph node metastasis, BMC Cancer, 20 (2008), pp. 8-77

36. Gialeli C., Theocharis A.D., Karamanos N.K. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting, FEBS Journal, 278 (2011), pp.16-27

37. Yu W.H, Woessner J.F., McNeish J.D., Stamenkovic I. CD44 anchors the assembly of matrilysin/MMP-7 with heparyn-binding epidermal growth factor prekursor and ErbB4 and regulates female reproductive organ remodeling, Genes Dev, 16 (2002), pp. 307-323

38. Yoon S.O., Park S.J., Yun C.H., Chung A.S. Roles of matrix metalloproteineses in tumor metastasis and angiogenesis, J Biochem Mol Biol, 36 (2003), pp. 128-137

39. Risau W. Mechanisms of angiogenesis, Nature, 386 (1997), pp. 671-674 40. Hua H., Li M., Lou T., Yin Y. Matrix metalloproteinases in tumorigenesis:

an evolving paradigm, Cell Mol Life Sci, 68 (2011), pp. 3853-3868


82

41. Gryczyński M., Pietruszewska W. Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtani, Otorynolaryngologia, 1 (2002), pp. 13-20

42. Pietruszewska W., Kobos J., Durko T., Murlewska A., Bojanowska-Poźniak K. Ocena ekspresji i wartości prognostycznej metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej -1, -2 i -9 w raku krtani, Nowotwory – Journal of Oncology, 60 (2010), pp. 28-36

43. Pryczynicz A., Guzińska-Ustymowicz K., Dymicka-Piekarska V., Czyżewska J., Kemona A. Expression of matrix metalloproteinase9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation, Folia Histochem Cytobiol, 45 (2007), pp. 37-45

44. Ito T., Ito M., Shiozawa J., Naito S., Kanematsu T., Sekine I. Expression of the MMP-1 in human pancreatic carcinoma: relationship with prognostic factor, Mod Pathol, 12 (1999), pp. 669-674

45. Jones L.E., Humphreys M.J., Campbell F., Neoptolemos J.P., Boyd M.T. Comprehensive analysis of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor expression In pancreatic cancer: increased expression of matrix metalloproteinase-7 predicts poor survival, Clin Cancer Res, 10 (2010), pp. 2832-2845

46. Yokohama M., Ochi K., Ichimura M., Mizushima T., Shinji T., Koide N., Tsurumi T., Hasuoka H., Harada M. Matrix metalloproteinase-2 in pancreatic juice for diagnosis of pancreatic cancer, Pancreas, 24 (2002), pp. 344-347

47. Ali-Labib R., Louka M.L., El-Sayed Galal I.H., Tarek M. Evaluation of matrix metalloproteinases-2 in lung cancer, Proteomics. Clinical applications, 8 (2014), pp. 251-257

48. Kohrmann A., Kammerer U., Kapp M., Dietl J., Anacker J. Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer and breast cancer cell lines: New findings and review of the literature. BMC Cancer 9, 188 (2009), pp.1-20

49. Liu S.C., Yang S.F., Yeh K.T. Relationships between the level of matrix metalloproteinase-2 and tumor size of breast cancer, Clin Chim Acta, 371 (2006), pp. 92-96

50. Jinga D.C., Blidaru A., Condrea I., Ardeleanu C., Dragomir C., Szegli G., Stefanescu M., Matache C. MMP-9 and MMP-2 gelatinases and TIMP-1 and TIMP-2 inhibitors in breast cancer: correlations with prognostic factors, J Cell Mol Med, 10 (2006), pp. 499-510

51. Wandel E., Raschke A., Hildebrandt G., Eberle J., Dummer R., Anderegg U., Saalbach A. Fibroblasts ehhance theninvasive capacity of melanoma cells in vitro, Arch Dermatol Res 293 (2002), pp. 601-608

52. Hofmann U., Houben R., Bröcker E., Becker J. Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasion, Biochime 87 (2005), pp. 307-314

53. Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D., Rola metaloproteaz

macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteaz w progresji nowotworów

skóry a nowe strategie farmakologicznej inhibicji metaloproteaz macierzy,

Prz Dermatol 91 (2004), pp. 153-160


83

The importance of metalloproteinases in cancer

Abstract Extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) are a group of proteolytic enzymes

necessary to maintain the normal structure of the extracellular matrix (ECM). MMPs

are expressed in fibroblasts, keratinocytes, monocytes, leukocytes, hepatocytes and tumor

cells. Virtually all stages of cancer demonstrated activity of enzyme from the family of metalloproteinases which consisted of the degradation of extracellular matrix components

and the release of biologically active molecules, which influence the behavior of cancer

cells. MMPs are involved in the regulation of apoptosis, angiogenesis and immune response

as well as influence on invasiveness and metastasis. The involvement of metalloproteinases in the processes associated with the development of cancer is the chance to use them

as sensitive and accurate tumor markers, allowing not only to confirm the presence of cancer

but also to determine its degree of the progress.

84

Tomasz Wandtke1, Joanna Woźniak

2, Alicja Janicka

3

Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne

w diagnostyce infekcji wirusowych?

Aptamery to sekwencje oligonukleotydowe DNA lub RNA, które nie wykazują własności kodujących. Ich cechą charakterystyczną jest niezwykle

wysokie powinowactwo wiązania oraz specyficzność wobec cząsteczek

docelowych o różnej budowie (związki wielko- oraz małocząsteczkowe)

i pochodzeniu (związki organiczne i nieorganiczne). Aptamery pozyskiwane są w procesie selekcji in vitro, znanym także jako SELEX. Ze względu na

swoje właściwości aptamery mogą być wykorzystane jako potencjalnie

skuteczne narzędzie zarówno w diagnostyce jak i terapii medycznej. Ich

wykorzystanie w aptasensorach pozwala na szybką, czułą i swoistą detekcję zarówno wczesnych (materiał genetyczny, białka wirusa) jak i późnych

markerów zakażenia wirusem (przeciwciała produkowane przez organizm

gospodarza).

1. Wprowadzenie

Aptamery to cząsteczki kwasu rybo- (RNA) lub deoksyrybonukleinowego

(DNA) o strukturze jednoniciowej, których cechą charakterystyczną jest

zdolność wiązania różnorodnych molekuł [1]. Spektrum wiązanych przez

nie drobin okazuje się niezwykle szerokie, odkąd metodami eksperymen-

talnymi określono, że mogą być to pojedyncze atomy, ale także całe

cząsteczki, pochodzenia zarówno nieorganicznego jak i organicznego,

a nawet całe komórki [1÷3]. Co niezwykle istotne, rozpoznanie oraz

związanie cząsteczki docelowej przez aptamer jest niezwykle specyficzne

i trwałe. Niejednokrotnie udowodniono, że stała dysocjacji takich

kompleksów wykazywała wielkości nanomolowe [1].

Aptamery to cząsteczki otrzymywane w procesie selekcji in vitro, w skrócie

oznaczanym jako SELEX (ang. SystematicEvolution of Ligands by

ExponentialEnrichment). Proces ten, szczegółowo opisany w dalszych

rozdziałach, pozwala na otrzymanie aptamerów o wysokim powinowactwie

wiązania i specyficzności wobec określonych molekuł [4]. Co ważne,

modyfikacja warunków przebiegu tego procesu pozwala otrzymać aptamery

[email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy




Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych?

85

wiążące cząsteczki docelowe z największym powinowactwem i specyfi-

cznością w ściśle zdefiniowanych przez eksperymentatora warunkach np.

temperatury otoczenia, ciśnienia, pH, lepkości roztworu i wielu innych [3, 5].

Ostatnie dekady to okres intensywnego rozwoju diagnostyki i terapii

medycznej z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych. Ich stosowanie

uznaje się aktualnie za złoty standard w terapii wielu chorób, a w szcze-

gólności w dziedzinie diagnostyki laboratoryjnej gdzie wykorzystywane są

w celu wykrywania wielu infekcji. Aptamery, ze względu na łatwość

wytwarzania oraz swoje właściwości wydają się być interesującą alternatywą

dla aktualnie stosowanych procedur. Istnieje wiele czynników pozwalających

uznać aptamery za drobiny konkurencyjne w wymienionych powyżej

obszarach. Wśród najważniejszych powodów można wymienić przede

wszystkim możliwość pozyskania aptamerów wiążących ligandy

o właściwościach toksycznych. Wysiłki podjęte w celu pozyskania

przeciwciał monoklonalnych w takich okolicznościach, nastręczają wielu

trudności, gdyż jak powszechnie wiadomo w celu ich otrzymania niezbędna

jest wcześniejsza immunizacja antygenem zwierząt laboratoryjnych. Jako, że

antygen w tym przypadku może wykazywać właściwości toksyczne,

immunizacja zwierząt laboratoryjnych z jego udziałem może doprowadzić do

ich śmierci. W przypadku aptamerów otrzymywanych na drodze procesu

selekcji in vitro, podobne zagrożenie nie występuje [3]. Kolejną przewagą

aptamerów nad przeciwciałami monoklonalnymi wydaje się być ich wielkość.

Niewielkie rozmiary aptamerów sprawiają, że są one idealne do zastosowań

in vivo. Pozwalają one dosięgnąć rejonów, które są niedostępne dla

większych przeciwciał monoklonalnych. Interesująca wydaje się także

możliwość ich sprzęgania z innymi związkami, co ma na celu poszerzyć

spektrum ich właściwości. Proponuje się np. użycie barwników

immunofluorescencyjnych co pozwalałoby na wykorzystanie aptamerów

w diagnostyce obrazowej i laboratoryjnej, lub środków o działaniu cytotoksy-

cznym co mogłoby przysłużyć się zwiększeniu selektywności leczenia

przeciwnowotworowego. Sprzęganie takie, przeciwnie niż w przypadku

przeciwciał monoklonalnych, nie wpływa na pierwotną specyficzność

i powinowactwo aptamerów [1, 6]. W końcu, także krótszy czas

pozyskiwania aptamerów, niższe koszty tego procesu oraz ich większa

stabilność w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi sprawia, że są

one w centrum zainteresowania wielu naukowców [3].

Pomimo zainteresowania, oczywistych zalet względem przeciwciał

monoklonalnych oraz niezwykle dużej swoistości i powinowactwa

względem drobin docelowych nie doszło jak dotąd do szerszego

wykorzystania aptamerów w diagnostyce i terapii. Aptamery to drobiny

stosunkowo nowe, które wymagają dokładnego zbadania zanim zostaną


86

użyte na ludziach. Jak dotąd jedynym aptamerem, który przeszedł

pozytywnie wszystkie próby kliniczne i wszedł do powszechnego użytku

farmaceutycznego jest Macugen (pegaptanib sodu) stosowany w okulistyce

w leczeniu wysiękowej postaci zwyrodnienia plamki żółtej związanej

z wiekiem (ang. Age-RelatedMacularDegeneration, AMD). Macugen

to aptamer skierowany przeciw czynnikowi wzrostu śródbłonka

naczyniowego (ang. VascularEndothelialGrowthFactor, VEGF), blokujący

patologiczny rozrost unaczynienia w gałce ocznej w przebiegu wyżej

wspomnianej jednostki chorobowej [7]. Mimo skąpej obecności preparatów

o składzie aptamerowym na rynku, należy nadmienić, że co najmniej kilka

kolejnych środków o różnym spektrum działania i zastosowaniu

(m.in. o działaniu przeciwnowotworowym i antykoagulacyjnym) znajduje

się aktualnie w zaawansowanej fazie prób klinicznych [1, 7].

Jak dotąd, poza badaniami eksperymentalnymi, aptamerów nie stosowano

w diagnostyce laboratoryjnej. Postuluje się, że ich użycie może przyczynić

się do: zwiększenia czułości testów oraz stworzenia możliwości szybszego

postawienia bardziej wiarygodnej diagnozy, co powinno w sposób bezpo-

średni przełożyć się na wydajność i skuteczność terapii w przypadku wielu

różnych jednostek chorobowych, w tym szczególnie o charakterze infekcji

wirusowych.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy

na temat możliwości wykorzystania aptamerów w diagnostyce wirusolo-

gicznej oraz wykazanie ich wszechstronności i przewagi nad przeciwciałami

monoklonalnymi, stanowiącymi „złoty standard” diagnostyki laboratoryjnej.

W dalszej części tego opracowania, zaprezentowano sposób otrzymy-

wania, mechanizm działania oraz przykłady aptamerów potencjalnie

użytecznych w diagnozowaniu ostrych i przewlekłych chorób wirusowych.

3. Otrzymywanie aptamerów. Proces selekcji in vitro

W 1990 roku Ellington i Szostak po raz pierwszy zastosowali nową

technikę selekcji cząsteczek kwasów nukleinowych. Jej użycie pozwalało

na otrzymanie oligonukleotydów zdolnych do wiązania innych drobin

(np. białek) z dużym powinowactwem i specyficznością. Technikę

tą nazwali selekcją in vitro (wcześniej przywołany SELEX), a molekuły

uzyskane w tym procesie aptamerami [4].

W celu pozyskania aptamerów, w procesie tym wykorzystuje

się kombinatoryczną bibliotekę sekwencji DNA lub RNA, obejmującą

wszystkie możliwe sekwencje o określonej długości. Długość aptameru,

a zatem także sekwencji biblioteki kombinatorycznej, nie jest zwykle


87

krótsza niż 20 i dłuższa niż 90 nukleotydów. W pierwszym etapie procesu

kombinatoryczną bibliotekę sekwencji poddaje się inkubacji z molekułą

docelową w dobranych przez eksperymentatora warunkach [4, 5]. Warto

zaznaczyć zatem, że opisywana procedura pozwala otrzymać aptamery

wiążące cząsteczki docelowe w różnych, nie zawsze fizjologicznych

warunkach, co nie jest możliwe w przypadku przeciwciał monoklonalnych

[5]. W trakcie inkubacji, wybrane sekwencje charakteryzujące się specyfi-

cznością wobec cząsteczki docelowej i największym wobec niej

powinowactwem, ulegają przez nią związaniu. Pozostałe, niezwiązane,

usuwane są z mieszaniny. Wyselekcjonowane tą drogą aptamery odzyskuje

się, powiela i poddaje kolejnym cyklom selekcyjnym [4].

Każda z sekwencji zawartych w bibliotece kombinatorycznej

oskrzydlona jest z dwóch stron tzw. sekwencjami stałymi. Rejony

te stanowią miejsca przyczepu białek enzymatycznych o właściwościach

polimerazowych. Obecność tych sekwencji pozwala na zwielokrotnienie

liczby aptamerów po każdym cyklu selekcyjnym. W przypadku

kombinatorycznej biblioteki DNA przeprowadza się łańcuchową reakcję

polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), zaś w przypadku

biblioteki RNA najpierw transkrypcję w warunkach in vitro (z użyciem

polimerazy RNA bakteriofaga T7) i następnie jak w przypadku biblioteki

DNA reakcję PCR. Zwielokrotnienie uszczuplonej już po cyklu

selekcyjnym puli aptamerów, pozwala zmusić cząsteczki do współzawod-

niczenia między sobą o miejsce wiązania z drobiną docelową, której

stężenie ulega zmniejszeniu w kolejnym cyklu selekcji. W konsekwencji

prowadzi to do pozyskania aptameru, który będzie wiązał cząsteczkę

docelową nie tylko w sposób specyficzny, ale także z największym

możliwym powinowactwem [4].

Standardowo przeprowadza się od 15 do 25 cyklów selekcji.

Po uzyskaniu właściwego aptameru przeprowadza się jego ocenę

obejmującą określenie stałej dysocjacji i sekwencji nukleotydowej.

Działanie takie pozwala na pozyskanie kolejnych aptamerów na drodze

sztucznej syntezy chemicznej, bez przeprowadzania uprzednio selekcji

w warunkach in vitro [4]. Niweluje to koszty i ogranicza czas

ich pozyskiwania.

4. Diagnostyka zakażeń wirusowych z wykorzystaniem

aptamerów

Diagnostyka zakażeń wirusowych niesie ze sobą wiele wyzwań [8].

Właściwa i przede wszystkim szybka diagnoza jest kluczem do terapii tego

rodzaju zakażeń. Różne infekcje wirusowe charakteryzują się często

odmiennym przebiegiem, co jest bezpośrednią pochodną odmiennej


88

budowy i biologii wirusów je wywołujących. Istnieją jednak także wspólne

elementy dla tego rodzaju chorób. Przede wszystkim początek infekcji

zazwyczaj jest skąpoobjawowy, dlatego wykrycieinfekcji wirusowych

na wczesnym etapie nastręcza wielu trudności. Sukces terapii bardzo często

zależy od wczesnego wykrycia zakażenia. Czas to najważniejszy czynnik

warunkujący powodzenie terapii szczególnie w przypadku chorób

wirusowych o przewlekłej naturze, takich jak HIV (ludzki wirus niedoboru

odporności; ang. Human ImmunodeficiencyVirus) czy HCV (wirus

zapalenia wątroby typu C; ang. Hepatitis C Virus). Nie mniej istotne jest

także szybkie zdiagnozowanie chorób, które mogą stanowić szybko

szerzące się zagrożenie epidemiologiczne, gdzie ilość zakażeń rośnie

w krótkim czasie (np. wirus grypy).

Obowiązujący standard w diagnostyce infekcji wirusowych stanowią

testy immunoenzymosorbcyjne oraz odczyny biologii molekularnej [8÷11].

Chociaż są to powszechnie stosowane procedury, postrzega się je jako

nieatrakcyjne, ze względu na ich wieloetapowość, czasochłonność, wysoki

koszt i nierzadko zbyt małą czułość [10÷12]. Fundamentalnym problemem

testów immunoenzymatycznych jest konieczność stosowania przeciwciał

monoklonalnych. Ich pozyskanie po pierwsze nie zawsze jest możliwe,

po drugie jeśli możliwe nie jest gwarantem czułości testu, natomiast zawsze

bywa długotrwałe i kosztowne [3]. Większość aktualnie stosowanych

testów tego rodzaju umożliwia wykrycie zakażenia w momencie

wytworzenia odporności (przeciwciał) przez gospodarza, do czego

dochodzi nierzadko dopiero po kilku tygodniach, a nawet miesiącach

od infekcji. Natomiast u pacjentów poddanych np. leczeniu immunosup-

resyjnemu do produkcji przeciwciał może nie dojść wcale [13].

Pojawiające się okienko serologiczne stanowi poważny problem dzisiejszej

diagnostyki medycznej. Jego występowanie wiąże się z opóźnionym

podjęciem decyzji o leczeniu i gorszymi rokowaniami dla chorego, a także

niebezpieczeństwem rozprzestrzeniania się zakażenia. Problem ten miały

rozwiązać badania molekularne, umożliwiające bezpośrednie wykrycie

materiału genetycznego intruza, bez konieczności oczekiwania

na odpowiedź immunologiczną gospodarza. Niewątpliwą zaletą testów

molekularnych jest ich czułość, pozwalająca wykryć już pojedyncze kopie

wirusów w krótkim czasie po zakażeniu. Jednak ze względu na bardzo

wysoki jednostkowy koszt badań tego rodzaju, są one wykonywane

stosunkowo rzadko [14].

Odpowiedzią na ograniczenia testów molekularnych oraz

immunoenzymatycznych są aptamery. Możliwość pozyskania aptamerów

o wysokiej specyficzności i powinowactwie wiązania przeciwko

dowolnemu antygenowi wirusowemu, w połączeniu z niskim kosztem


89

ich produkcji, sprawia że wydają się one atrakcyjną alternatywą dla aktualnie

stosowanych procedur. Ich użycie umożliwia wykrycie zarówno wczesnych

(materiał genetyczny, białka wirusa) jak i późnych (przeciwciała

produkowane przez gospodarza) markerów infekcji wirusem [8, 15].

Interesująca jest także strategia umożliwiająca różnicowanie komórek

gospodarza na zakażone wybranym wirusem i zdrowe, a także użycie

cząsteczek rozróżniających aktywne i nieaktywne formy wirusów [16, 17].

Od czasu kiedy po raz pierwszy otrzymano aptamery minęło ponad

dwadzieścia lat [4]. Jednak możliwości ich wykorzystania w diagnostyce

zakażeń wirusowych zaczęto zauważać stosunkowo niedawno. Skala badań

nad ich wykorzystaniem na tym polu wciąż jest niewielka i obejmuje

najczęściej eksperymenty z wykorzystaniem wirusów już stanowiących,

albo mogących stanowić w najbliższej przyszłości poważny problem

epidemiologiczny, takimi jak HIV-1, HCV, HBV (wirus zapalenia wątroby

typu B, ang. Hepatitis B Virus), HPV (wirus brodawczaka ludzkiego,

ang. Human PapillomaVirus), SARS(zespół ostrej ciężkiej niewydolności

oddechowej, ang. SevereAcute Respiratory Syndrome) czy wirusy grypy,

gdzie szybkie postawienie diagnozy jest istotne dla chorego i znacząco

zmniejsza ryzyko rozprzestrzenienia infekcji [12, 15, 18÷22]. Rzadko

prowadzi się badania nad innymi wirusami.

W przeprowadzonych dotąd badaniach wykorzystano wiele aptamerów

o różnorodnym mechanizmie działania. W swojej pierwotnej formie,

aptamery to cząsteczki wiążące i unieczynniające białka. Na tej podstawie

mogą przysłużyć się zarówno w diagnostyce jak i w terapii zakażeń

wirusowych. W okresie późniejszym stworzono także cząsteczki

aptamerowe zdolne do wiązania materiału genetycznego wirusów.

Oba mechanizmy pozwalają na wczesną i precyzyjną detekcję obecności

wirionów w organizmie gospodarza. Jednak, same aptamery mogą

stanowić jedynie element systemu detekcyjnego. Ich odpowiednie

wykorzystanie w tzw. aptasensorach wykorzystujących różnego rodzaju

oddziaływania biochemiczne, fizyczne oraz fizykochemiczne pozwoliło

stworzyć precyzyjne, szybkie oraz czułe wirusologiczne testy

diagnostyczne. Przykłady aptamerów, ich ligandy (elementy

poszczególnych wirusów lub całe wirusy) oraz mechanizmy ich działania

przedstawiono w poniższej tabeli ze wskazaniem odpowiednich referencji,

gdzie przedstawiono ich dokładny opis.


90

Tabela 1. Przykłady wykorzystania aptamerów w diagnostyce laboratoryjnej

Lp. Wirus Ligand

aptameru Wykorzystanie Rok Źródło

1. Grypa

typ B

Hemaglutynina

typ B Detekcja obecności

wirusa; różnicowanie wirusa typu A i B

2005 [23]

2. Grypa

typ A

Hemaglutynina

typ A 2006 [24]

3.

Grypa

typ

H5N1

(ptasia

grypa)

Hemaglutynina

Detekcja obecności

wirusa; aptamer w sensorze

wykorzystującym

powierzchniowy

rezonans plazmowy (SPR)

2012 [10]

4.

Detekcja obecności wirusa; aptamer w

sensorze

wykorzystującym

mikrowagę kwarcową (QCM)

2013 [11]

5.

HIV-1 Białko Tat

Detekcja obecności wirusa; aptamer w

sensorach

wykorzystującychSPR

oraz QCM

2005 [18]

6.

Detekcja obecności

wirusa; aptamer w sensorze

wykorzystującym

diamentowy tranzystor polowy (FET)

2013 [15]

7.

HCV

Antygen rdzeniowy

Detekcja wirusa; aptamer znakowany

fluorescencyjnie (Cy-3)

2007 [13]

8. Glikoproteina

E2

Różnicowanie komórek

na prawidłowe i

zainfekowane wirusem;

aptamer znakowany fluorescencyjnie (FITC)

2009 [20]

9. HBV Antygen HbS Różnicowanie komórek

na zainfekowane

wirusem i prawidłowe

2010 [19]


91

10. Ospakro

wia

Całe cząsteczki wirusa

Różnicowanie cząsteczek

wirusa na aktywne i

nieaktywne; aptamer w

sensorze wykorzystującym złotą

mikroelektrodęo

właściwościach

impedymetrycznych

2012 [17]

11. Glikowana

Hemaglutynina

Różnicowanie komórek

na zainfekowanie i

niezainfekowane

wirusem

2009201

0 [9, 25]

12.

HPV-16

Onkoproteina

E7 2011 [21]

13.

Epitopy

powierzchniow

ekomórek prawidłowych

2012 [16]

14. Denga

Materiał

genetyczny

wirusa

Jakościowa i ilościowa ocena wirusa; 3-

modułowy

fluorescencyjny

aptasensor

2010 [8]

Źródło: Opracowanie własne

5. Podsumowanie

Aktualna diagnostyka medyczna walczy z wieloma wyzwaniami.

Jednym z najpoważniejszych jest tzw. okienko serologiczne, którego

istnienie opóźnia diagnozę i leczenie, tym samym przyczyniając się często

do gorszych rokowań.

Aktualnie stosowanym standardem diagnostycznym w wykrywaniu wielu

infekcji, w tym wirusowych są przeciwciała monoklonalne. Ich wykorzy-

stanie, choć pomocne, wiąże się jednocześnie z wieloma ograniczeniami

(np. brak możliwości detekcji infekcji wirusowej przed wyprodukowaniem

przeciwciał odpornościowych przez organizm gospodarza). Z kolei badania

molekularne, choć dają możliwość wczesnej detekcji zakażenia,

wykonywane są rzadko ze względu na swój wysoki koszt.

Rozwiązaniem dla przywołanych problemów mogą okazać się aptamery,

cząsteczki kwasów nukleinowych zdolne do czułej detekcji białek i/lub

kwasów nukleinowych wirusów. Ich wykorzystanie wiąże się z niskimi

kosztami produkcji oraz możliwością detekcji zakażenia tuż po kontakcie

z patogenem.

Jak dotąd żaden aptamer nie wszedł do użytku laboratoryjnego w zakresie

diagnostyki medycznej. Jednak spektrum ich zalet przedstawionych

w artykule powinno zachęcać do dalszych eksperymentów, a nawet

wdrożenia rozwiązań diagnostycznych opierających się na ich wykorzystaniu.


92

Literatura

1. Zhou J., Bobbin M.L., Burnett J.C., Rossi J.J. Current progress of RNA

aptamer-based therapeutics, Front Genet., 3 (2012), pp. 1-14

2. Keefe A., Ellington P. S. Aptamers as therapeutics, Nat Rev Drug Discov.,

9 (2010),pp. 537-550

3. Szpechciński A., Grzanka A. Aptamers in clinical diagnostics, Postępy

Biochem., 52 (2006), pp. 260-270

4. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind

specific ligands, Nature, 346 (1990),pp. 818-822

5. Ni X., Castanares M., Mukherjee A., Lupold E. Nucleic acid aptamers:

clinical applications and promising new horizons, Curr Med Chem.,

18 (2011), pp. 4206-4214

6. Dey A., Khati M., Tang M., Wyatt R., Lea S., James W. An Aptamer That

Neutralizes R5 Strains of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Blocks

gp120-CCR5 Interaction, Journal of Viology, (2005), pp. 13806-13810

7. Sundaram P., Kurniawan H., Byrne M.E., Wower J. Therapeutic

RNA aptamers in clinical trials, Eur J Pharm Sci.,48 (2013),pp. 259-271

8. Fletcher S.J., Phillips L.W., Milligan A.S., Rodda S.J. Toward specific

detection of Dengue virus serotypes using a novel modular biosensor,

BiosensBioelectron., 26 (2010), pp.1696-1700

9. Parekh P., Tang Z., Turner P.C., Moyer R.W., Tan W. Aptamers recognize

glycosylated hemagglutinin expressed on the surface of vaccinia virus-infected

cells, Anal Chem., 82 (2010), pp. 8642-8649

10. Bai H., Wang R., Hargis B., Lu H., Li Y. A SPR Aptasensor for detection

of avian influenza virus H5N1,Sensors, 12 (2012), pp. 12506-12518

11. Wang R., Li Y. Hydrogel based QCM aptasensor for detection of avian

influenza virus, BiosensBioelectron., 42 (2013), pp. 148-155

12. Negri P., Chen G., Kage A., Nitsche A., Naumann D., Xu B., Dluhy R.A.

Direct optical detection of viral nucleoprotein binding to an anti-Influenza

aptamer,Anal. Chem.,84 (2012), pp. 5501-5508

13. Lee S., Kim Y.S., Jo M., Jin M., Lee D., Kim S. Chip-based detection

of hepatitis C virus using RNA aptamers that specifically bind to HCV core

antigen, BiochemBiophysRes Commun., 358 (2007), pp. 47-52

14. Ocadiz-Delgado R., Albino-Sanchez M.E., Garcia-Villa E., Aguilar-Gonzalez

M.G., Cabello C., Rosete D., Mejia F., Manjarrez-Zavala M.E., Ondarza-

Aguilera C., Rivera-Rosales R.M., Gariglio P. In situ molecular identification

of the Influenza A (H1N1) 2009 Neuraminidase in patients with severe and

fatal infections during a pandemic in Mexico City, BMC Infect

Dis., 13 (2013), pp. 1-20

15. Ruslinda R.A., Tanabe K., Ibori S., Wang X., Kawarada H. Effects

of diamond-FET-based RNA aptamer sensing for detection of real sample

of HIV-1 Tat protein,BiosensBioelectron., 40 (2013), pp. 277-282

16. Graham J.C., Zarbl H. Use of Cell-SELEX to generate DNA aptamers

as molecular probes of HPV-associated cervical cancer cells,

PLoSOne.,7 (2012), pp. 1-9


93

17. Labib M., Zamay A.S., Muharemagic D., Chechik A.V., Bell J.C., Berezovski

M.V. Aptamer-based viability impedimetric sensor for viruses, Anal

Chem., 84 (2012), pp. 1813-1816

18. Tombelli S., Minunni M., Luzi E., Mascicni M. Aptamer-based biosensors

for the detection of HIV-1 Tat protein,Bioelectrochemistry, 67 (2005),

pp. 135-141

19. Liu J., Yang Y., Hu B., Ma Z., Huang H., Yu Y., Liu S., Lu M., Yang D.

Development of HBsAg-binding aptamers that bind HepG2.2.15 cells via HBV

surface antigen,VirolSin., 25 (2010), pp. 27-35

20. Chen F., Hu Y., Li D., Chen H., Zhang X. CS-SELEX generates high-affinity

ssDNAaptamers as molecular probes for Hepatitis C Virus envelope

glycoprotein E2, PLoS One., 4 (2009), pp. 1-11

21. Toscano-Garibay J.D., Benitez-Hess M.L., Alvarez-Salas L.M. Isolation

and characterization of an RNA aptamer for the HPV-16 E7 oncoprotein,

Arch Med Res., 42 (2011), pp. 88-96

22. Cho S.J., Woo H.M., Kim K.S., Oh J.W., Jeong Y.J. Novel system

for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA

aptamer,J BiosciBioeng., 112 (2011), pp. 535-540

23. Gopinath S.C., Kawasaki K., Kumar P.K. Selection of RNA-aptamer against

human influenza B virus, Nucleic Acids SympSer (Oxf)., 49 (2005), pp. 85-86

24. Gopinath S.C., Misono T.S., Kawasaki K., Mizuno T., Imai M., Odagiri T.,

Kumar P.K. An RNA aptamer that distinguishes between closely related

human influenza viruses and inhibits haemagglutinin-mediated membrane

fusion, J Gen Virol., 87 (2006), pp. 479-487

25. Tang Z., Parekh P., Turner P., Moyer R.W., Tan W. Generating aptamers

for recognition of virus-infected cells,Clin Chem., 55 (2009), pp. 813-522

Aptamer – a sensitive and specific tool useful in diagnostics of viral

infections?

Aptamers are oligonucleotide sequences of DNA or RNA that do not exhibit coding

properties. They are characterized by an extremely high binding affinity and specificity towards target molecules of different structure (high- and low-molecular weight compounds)

and origin (organic and inorganic). Aptamers are obtained in the process of in vitro

selection, also known as SELEX. Due to their properties, aptamerscould be used

as a potentially effective tool in diagnostics and medical therapy. Their utilization in aptasensors allows for rapid, sensitive and specific detection of early (the genetic material

and/or proteins of the virus) and late (antibodies produced by the host) viral infection

markers.

94

Anna Machnikowska1, Aleksandra Jarosz2, Lidia Kotuła

3

Możliwości farmakologiczne w zaburzeniach

syntezy neuroprzekaźników w autyzmie

Streszczenie Wzrastająca wykrywalność zaburzeń ze spektrum autyzmu (Autism

Spectrum Disorder; ASD) we współczesnej populacji stanowi ważny

problem dla społeczeństwa. Obecnie według danych Centers for Disease

Control and Prevention zaburzenia ze spektrum autyzmu są wykrywane w Stanach Zjednoczonych u 1 dziecka na 68. Przyczyna tego zjawiska

pozostaje nieznana. Obecnie ASD uznawanie są za zaburzenia o podłożu

epigenetycznym - możliwości leczenia przyczynowego pozostają

ograniczone. W leczeniu stosuje się psychoterapię oraz farmakoterapię. Podanie leków neurotropowych opiera się na znajomości zaburzeń

neurochemicznych mogących wystąpić w mózgu pacjenta. W patogenezie

autyzmu odgrywają rolę nieprawidłowości w układzie serotoninergicznym,

acetylocholinergicznym, brak równowagi między działaniem aktywującym oraz hamującym glutaminianu i GABA, a także obniżenie stężenia

oksytocyny w porównaniu z populacją ogólną. W pracy postaramy się

przedstawić możliwości terapeutyczne związane z zaburzeniami receptorów

o podłożu genetycznym.

1. Wprowadzenie

Zaburzenia ze spektrum autyzmu (autism spectrum disorders – ASD) to

pojęcie obejmujące grupę chorób wynikających z zaburzeń rozwoju

neurologicznego charakteryzujących się nieprawidłowościami w obrębie

interakcji społecznych, komunikacji oraz ograniczonymi zainteresowaniami.

Autyzm to najlepiej poznane zaburzenie należące do tej grupy [1]. Problem

ASD we współczesnej populacji jest coraz wyraźniej dostrzegalny. Według

danych Centers for Disease Control and Prevention wykrywalność zaburzeń

ze spektrum autyzmu wzrosła w Stanach Zjednoczonych wzrosła z 1 na 150

dzieci w 2000r do 1 na 68 dzieci w 2010r [2]. W Polsce brak jest danych

epidemiologicznych dotyczących zaburzeń ze spektrum autyzmu. Szacuje się,

że w populacji polskiej żyje co najmniej 30 tysięcy osób z tym zaburzeniem

[3]. Niewątpliwie wzrost wykrywalności ASD ma związek ze zmianą

kryteriów diagnostycznych oraz zwiększoną wiedzą społeczną na temat

autyzmu, nie wydaje się to jednak ostatecznie wyjaśniać przyczyny tego

zjawiska. Podejrzewa się udział czynników środowiskowych w zwiększeniu

1 [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie




Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób

95

zachorowalności na ASD takich jak: zanieczyszczenia środowiska,

niedotlenienie okołoporodowe czy ciężkie infekcje w okresie niemowlęcym.

Niewątpliwie zaburzenia neuroprzekaźnictwa mają znaczenie w patogenezie

autyzmu. Niektóre z nich można korygować za pomocą farmakoterapii. Na

złożony patomechanizm ASD nakładają się czynniki genetyczne.

2. Podłoże genetyczne

Autyzm to zaburzenie o podłożu wielogenowym, które cechuje duża

heterogenność. Niemal w każdym chromosomie odkryto nieprawidłowości,

które mogą mieć znaczenie w rozwoju autyzmu. Kluczową rolę przypisuje się

genom biorącym udział w synaptogenezie, np. SHANK3 [4]. Na genetyczne

predyspozycje do tego zaburzenia wskazuje badanie przeprowadzone wśród

brytyjskich bliźniąt, które wykazało, że zgodność zachorowań na autyzm

wśród bliźniaków jednojajowych wynosi 60%, zaś wśród dizygotycznych

0%. Natomiast porównując szersze zaburzenia takie jak zaburzenie interakcji

społecznej częstość wzrosła do 92% i 10% [5]. Obserwuje się również

zwiększoną częstość zapadalności na zaburzenia ze spektrum autyzmu wśród

rodzeństwa: jest ona 25-krotnie większa niż w populacji ogólnej [6]. Cechy

autystyczne występują ponadto w przebiegu zespołów genetycznych takich

jak: zespół Angelmana, zespół łamliwego chromosomu X, stwardnienie

guzowate. Dyskutowana jest rola zaburzeń metylacji genów znajdujących się

na chromosomie X ulegających ekspresji w mózgowiu w patogenezie

autyzmu [4]. Wiele genów, których mutacje są wykrywane u pacjentów z

zaburzeniami ze spektrum autyzmu dotyczy neuroprzekaźnictwa.

3. Przekaźnictwo serotoninergiczne

Serotonina (5-hydroksytryptamina) jest neuroprzekaźnikiem o działaniu

zarówno hamującym jak i pobudzającym. Właściwe przekaźnictwo

serotoninergiczne warunkuje prawidłowe reakcje emocjonalne, nastrój,

odczuwanie bólu, sen czy łaknienie[7]. Nie można pominąć również jej

znaczenia w procesach neurorozwojowych, migracji neuronów, wzrostu

komórek neuronalnych czy synaptogenezy[8].

Wyniki badań wskazują na zwiększoną ilość serotoniny w płytkach krwi

pacjentów z autyzmem w porównaniu z populacją ogólną aż w 30-50%

przypadków. W związku z odkryciem znaczenia przekaźnictwa serotoni-

nergicznego z autyzmem powstała teoria hiperserotoninergiczna. Zgodnie z tą

hipotezą zaburzenia ze spektrum autyzmu są skorelowane z nieprawid-

łowościami w sekrecji serotoniny we wczesnych stadiach rozwoju

neuronalnego. Powoduje to zmniejszoną gęstość lub wrażliwość na serotoninę

receptorów 5-HT i zaburzenia w synaptogenezie. W rezultacie prowadzi to do

zaburzeń w architekturze mózgu.


96

W badaniach neuroobrazowych za pomocą pozytonowej emisyjnej

tomografii komputerowej wykazano zmniejszoną całkowitą syntezę

serotoniny w porównaniu z populacją ogólną, szczególnie wśród najmłodszych

pacjentów cierpiących na autyzm. Rozkład deficytu 5HT w poszczególnych

częściach kory mózgu zależał od wielkości problemów z komunikacją

werbalną. U osób z największymi problemami językowymi wykazano

najmniejszy wychwyt tryptofanu w lewej półkuli [9].

Serotonina działa na ponad tuzin różnych typów receptorów[7]. Obecność

patologii wśród nich wpływa na powstawanie zaburzeń takich jak: depresja,

problemy ze snem, agresja, napady złośliwości oraz problemy z komunikacją,

czyli objawów związanych z ASD. Wpływ konkretnych uwarunkowań

genetycznych na dysfunkcję przekaźnictwa serotoni-nergicznego nie został

dokładnie poznany. Wykazano jednak zwiększoną częstość występowania

ASD wśród rodzin, w których występowały zaburzenia związane z układem

serotoninergicznym: depresja, choroba dwubiegunowa, zaburzenia obsesyjno-

kompulsywne [10]. Najmocniejszą pozycję wśród genów, których

polimorfizm ma udowodniony związek z objawami ASD zajmuje gen

SCL6A4 kodujący transporter serotoniny (5HTT). Występuje on w postaci

polimorfizmów: l i s. Haplotyp ss lub ls jest związany z objawami takimi jak

problemy z komunikacją oraz odwzajemnieniem społecznym, a haplotyp ll

warunkuje zachowania agresywne i stereotypowe. Niemniej jednak obecność

danego haplotypu nie jest skorelowana z wystąpieniem autyzmu.

W zaburzeniach ze spektrum autyzmu często wykorzystuje się leki

działające na układ serotoninergiczny, zwiększające ilość serotoniny

w szczelinie synaptycznej. Największe znaczenie w łagodzeniu objawów

autyzmu mają inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI). Szacuje

się, że leki z tej grupy są stosowane aż u 21%-32% dzieci cierpiących na

autyzm. Z badań przeprowadzonych do tej pory wynika, że podawanie tych

leków zmniejsza zachowania stereotypowe u części pacjentów z ASD oraz

agresję. Lepszą odpowiedź na leki z tej grupy i mniej działań niepożądanych

zaobserwowano u starszych dzieci oraz dorosłych [11]. Ostatnio zwrócono

jednak uwagę, iż dotychczasowe badania na temat skuteczności działania tych

leków zostały przeprowadzone na małych populacjach, a ich wyniki nie są

jednoznaczne. Ponadto postawiono hipotezę, iż skuteczność selektywnych

inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny może zależeć od polimorfizmu

genu SLC6A4. W celu weryfikacji tej hipotezy oraz skuteczności działania

leków wpływających na układ serotoninergiczny u pacjentów z ASD zostały

zarejestrowane randomizowane badania na dużej populacji [12].

Najpopularniejszym lekiem z grupy SSRI jest fluoksetyna. Jej stosowanie

może wiązać się z działaniami niepożądanymi takimi jak: stan maniakalny

oraz nadaktywność. Inną grupą leków działającą na układ serotoninergiczny


97

są trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne. Nortryptylina, która jest najlepiej

tolerowanym lekiem z tej grupy, wpływa na zmniejszenie nadaktywności,

agresji oraz zachowań powtarzalnych. Do działań niepożądanych TLPD

należy sedacja. Wystąpić może również agresja, drażliwość oraz

nadaktywność [13].

4. Neuroprzekaźnictwo cholinergiczne

Acetylocholina w ośrodkowym układzie nerwowym może działać

zarówno w sposób hamujący oraz pobudzający w różnych drogach

nerwowych. Drogi te mają znaczenie w zapamiętywaniu, odbieraniu bodźców

czuciowych oraz koordynacji ruchowej [7]. Receptory dla acetylocholiny

dzielą się na muskarynowe i nikotynowe. Ostatnie badania wykazały że

dysfunkcje neuroprzekaźnictwa cholinergicznego mogą mieć znaczenie

w patogenezie ASD. Wśród osób chorujących na autyzm zaobserwowano

zmniejszenie wiązania agonisty do receptora nikotynowego zbudowanego

z podjednostki α4 o 40-50% w warstwie ziarnistej i komórkach Purkiniego

kory mózgowia w porównaniu do zdrowych osobników. Natomiast wiązanie

agonisty do podjednostki α7 receptora nikotynowego warstwy ziarnistej było

trzykrotnie zwiększone [14]. Locus dla podjednostki α4 receptora

nikotynowego znajduje się na chromosomie 20q13.2-q13.3. Aberracje tego

regionu łączy się z występowaniem padaczki oraz schizofrenii, ale ich

związek z autyzmem nie został zbadany [15].

Wśród leków działających na neuroprzekaźnictwo cholinergiczne

w autyzmie stosuje się inhibitory cholinoesterazy: donepezil, rywastygminę

i galantaminę. Wykazano, że łagodzą one szczególnie takie objawy jak

nadaktywność oraz drażliwość dzieci [13].

5. Równowaga między neuroprzekaźnikami: GABA

i glutaminianem

Glutaminian jest aminokwasem kwaśnym działającym w ośrodkowym

układzie nerwowym jako neuroprzekaźnik pobudzający. Jego funkcja to

udział w długotrwałym wzmocnieniu synaptycznym niezbędnym w procesach

zapamiętywania. Ponadto odgrywa rolę w apoptozie komórek nerwowych

spowodowanej krwiakiem lub urazem. Zwiększona ilość tego przekaźnika

sprzyja neurodegeneracji. Stężenie glutaminianu jest regulowane przez

enzym: dekarboksylazę kwasu glutaminowego (GAD). Przekształca on

glutaminian w kwas gamma-aminomasłowy (GABA). GABA jest

najważniejszym hamującym neuroprzekaźnikiem mózgowia. Aktywacja

receptora GABAA powoduje hiperpolaryzację neuronów i zmniejszenie

przewodnictwa w układzie nerwowym. Natomiast pobudzenie receptora

GABAB zmniejsza napięcie mięśniowe [7]. Zbyt mały poziom GABA


98

upośledza filtrowanie nadmiaru informacji pochodzących ze środowiska

zarówno wewnętrznego jak i zewnętrznego. Udowodniono, że w autyzmie

występuje zmniejszona gęstość receptorów GABAA w hipokampie, a w 1/5

przypadków odkryto występowanie przeciwciał przeciwko interneuronom

GABA [3].

Na udział zaburzeń neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego w pato-

genezie autyzmu zwrócono uwagę w 2006 roku. Przeprowadzono wtedy

badania, które wykazały zwiększone stężenie glutaminianu we krwi

pacjentów cierpiących na autyzm w porównaniu z grupą kontrolną [16].

Przyczyna wzrostu stężenia kwasu glutaminowego we krwi pacjentów

z autyzmem nie została jednoznacznie wyjaśniona. Nie potwierdzono również

jej związku ze zwiększeniem ilości glutaminianu w mózgowiu. Jest ona

jednak na tyle charakterystyczna, szczególnie u pacjentów z prawidłowym

poziomem IQ, że zaproponowano użycie pomiaru stężenia glutaminianu

w surowicy jako testu przesiewowego [17].

Do mechanizmów przemawiających za udziałem przekaźnictwa

glutaminergicznego w ASD należą przynajmniej dwa. Pierwszy z nich to

zmniejszona ekspresja enzymu GAD w komórkach Purkinjego u pacjentów

z autyzmem. Została ona potwierdzona badaniami post mortem, w których

wykazano zmniejszoną o 40% ilość GAD67 mRNA w komórkach Purkinjego

móżdżku pacjentów chorujących na autyzm w porównaniu z grupą kontrolną

[18]. Zmniejszona ekspresja GAD zaburza równowagę między pobudzającym

wpływem glutaminianu na ośrodkowy układ nerwowy a hamowaniem

GABA, co skutkuje nieprawidłowym zachowaniem pacjenta cierpiącego na

ASD. Drugi mechanizm ma związek z potwierdzeniem zwiększonej glejozy

zachodzącej w ośrodkowym układzie nerwowym u osób z autyzmem.

Komórki neurogleju nie tylko wychwytują glutaminian ze szczeliny

synaptycznej, ale mogą również przekształcać glutaminę w glutaminian

zwiększając jego poziom [19]. Nie należy również zapominać że zwiększona

hiperaktywacja glutaminergiczna sprzyja wystąpieniu padaczki: chorobie

często towarzyszącej ASD [20].

Badania genetyczne potwierdziły związek mutacji genów kodujących

receptory dla glutaminianu z wystąpieniem objawów ASD. Substytucja

jednego aminokwasu w receptorze dla glutaminianu (GluR6) występowała

istotnie statystycznie częściej w populacji osób z autyzmem niż u zdrowych

osobników [15]. Obecnie jednak przeważa pogląd, że w patogenezie ASD

ważniejsza od pojedynczych mutacji jest kumulacja często występujących

defektów genetycznych. Ostatnio przeprowadzona analiza genotypu 6742

pacjentów z ASD wykazała obecność 3 sieci genetycznych prowadzących do

wystąpienia tej choroby. Wśród nich znajduje się upośledzona sieć

metabolizmu glutaminianu-defective network of metabotropic glutamate


99

(GRM). Geny tworzące tą sieć wpływają na neuroprzekaźnictwo oraz neuro-

i synaptogenezę: procesów zaburzonych w ASD. Odkrycie to potencjalnie

daje nowe możliwości terapeutyczne [20].

Za udziałem neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego w patogenezie ASD

przemawia również skuteczność antagonistów glutaminianu w leczeniu

objawów autyzmu. Stosuje się amantadynę i memantynę. Amantadyna

powoduje zmniejszenie nadaktywności u dzieci z ASD, natomiast memantyna

ponadto poprawia pamięć , zmniejsza stereotypie ruchowe oraz izolację

społeczną. W niektórych przypadkach podanie tych leków powoduje nasilenie

objawów autyzmu [13].

W genetycznym podłożu ASD istotną rolę pełni również receptor

GABRB3. Należy on do receptorów GABAA . Wykazano, że myszy

pozbawione tego receptora cierpią na epilepsję, mają nieprawidłowy zapis

EEG, a także charakteryzują się deficytem pamięci i upośledzeniem uczenia

się. Objawy te są charakterystyczne również dla pacjentów z ASD.[15]

Badania genetyczne przeprowadzone wśród pacjentów z ASD potwierdziły,

że polimorfizm genu GABRB3 oraz jego nadekspresja mogą wpływać na

występowanie ASD w niektórych przypadkach [22].

6. Oksytocyna

Oksytocyna jest hormonem biorącym udział w laktacji i porodzie. Poza

tymi dobrze znanymi funkcjami oksytocyna ma znaczenie również

w neuroprzekaźnictwie. Wyższy poziom oksytocyny dodatnio koreluje

z empatią oraz tworzeniem więzi społecznych. W ASD w wielu badaniach

zaobserwowano zmniejszenie poziomu oksytocyny w surowicy w porów-

naniu z populacją ogólną oraz zwiększenie stężenia jej prekursora [15]. Może

to świadczyć o nieprawidłowościach w przemianie prekursora do aktywnej

formy nonapeptydu. W badaniach genetycznych wykryto zwiększoną

częstość występowania haplotypu rs2268493 genu kodującego receptor dla

oksytocyny u dzieci z Zespołem Aspergera [23] Ponadto z ASD łączy się

aberracje w obrębie genu kodującego oksytocynę: 20p13 [15].

W hiperserotoninergicznym zwierzęcym modelu autyzmu wykazano

zmniejszoną ilość neuronów przekazujących oksytocynę w przykomorowym

jądrze podwzgórza. Neurony te za pośrednictwem jądra półleżącego

stymulują uwalnianie serotoniny z jądra grzbietowego szwu. Ostatnie badania

wykazały, że ta ścieżka bierze udział w procesach interakcji społecznych,

które są zaburzone u osób cierpiących na autyzm [9].

Dobre wyniki odnotowano w przypadku leczenia pacjentów ASD

oksytocyną podawaną donosowo. Zaobserwowano zmniejszenie lękliwości

oraz poprawę kontaktów społecznych. Lek ten jest dobrze zbadany w

populacji osób dorosłych i nie powoduje istotnych objawów niepożądanych.


100

Niemniej jednak wątpliwości budzi przewlekłe podawanie oksytocyny

u dzieci, gdyż na modelach zwierzęcych wykazano zwiększoną agresję oraz

trwałe uszkodzenie osi podwzgórze-przysadka [24].

7. Neuroprzekaźnictwo dopaminergiczne

Dopamina jest aminą biogenną będącą jednym z głównych przekaźników

OUN. Działa na 5 typów receptorów. Pobudzając receptor D1 i D5 powoduje

wzrost neuroprzekaźnictwa, natomiast działając na receptory D2 D3 lub D4 ma

działanie hamujące. Dopaminergiczne drogi nerwowe biorą udział

w odczuwaniu lęku oraz w procesach behawioralnych [7].

Mimo braku jednoznacznego potwierdzenia defektu przekaźnictwa

dopaminergicznego w badaniach genetycznych osób chorujących na autyzm

oraz wątpliwej oceny metabolitów dopaminy w płynie mózgowo

rdzeniowym, leki blokujące receptor D2 są jednymi z najskuteczniejszych

w leczeniu objawów ASD [15]. Leki przeciwpsychotyczne są najlepiej

działającymi na takie objawy autyzmu jak zwiększona drażliwość i napady

złości [11]. Najstarszy lek z tej grupy: antagonista receptorów D2 : haloperidol

jest rzadko stosowany ze względu na liczne działania niepożądane. Wśród

nich najważniejszym działaniem ograniczającym jego użycie są nieod-

wracalne dyskinezje późne [7]. Częściej stosuje się atypowe neuroleptyki

działające zarówno na receptory dopaminergiczne jak i serotoninergiczne.

Wśród nich 2 są zarejestrowane przez Agencję Żywności i Leków: risperidon

i aripiprazol. Łagodzą takie objawy jak: nadaktywność, zaburzenia koncen-

tracji, autoagresja, zachowania stereotypowe. Poza tym wykazano, że

risperidon, wpływając modulująco na funkcję astrogleju, ma działanie

neuroprotekcyjne u pacjentów cierpiących na ASD. Niestety, jego użycie

ograniczają działania niepożądane: zwiększony apetyt, męczliwość, nudności

[13].

8. Podsumowanie

Nieprawidłowości w neuroprzekaźnictwie zaobserwowane u osób

cierpiących na ASD mogą dotyczyć niemal wszystkich układów. Ważnym

czynnikiem determinującym wystąpienie zaburzeń w działaniu neurotrans-

miterów są uwarunkowania genetyczne. Część z nich jest spowodowana

spontaniczną mutacją jednego genu, ale większość to rezultat skumulowania

się nieprawidłowości sieci genów, których warianty często występują

w zdrowej populacji [21].

Leczenie zaburzeń ze spektrum autyzmu jest kwestią kontrowersyjną. Nie

ma wypracowanego schematu terapeutycznego osób cierpiących na ASD.

Zasadniczym problemem jest fakt, że pomimo coraz nowszych metod terapii

zarówno farmakologicznych jak i psychologicznych, całkowite odwrócenie


101

objawów autyzmu nie jest wykonalne. Za pomocą leków neurotropowych

możliwe jest jedynie leczenie objawowe. Co więcej, te preparaty obarczone są

ryzykiem działań niepożądanych. Wybór leku neurotropowego opiera się na

znajomości możliwych zaburzeń neuroprzekaźnictwa w autyzmie oraz

objawów z nim związanych. Przy wyborze należy zachować ostrożność,

określić cel terapii i zawsze wziąć pod uwagę wiek pacjenta, nasilenie

objawów choroby, możliwości interakcji leków oraz ryzyko wystąpienia

efektów niepożądanych. Istotne w terapii dziecka cierpiącego na ASD jest

wsparcie multidyscyplinarne.

Możliwe, że przyszłość farmakologii autyzmu wiąże się z podłożem

genetycznym. Prowadzi się badania nad możliwością wyciszania genów za

pomocą mikromolekuł. Potencjalnym celem są geny z sześciu grup: receptory

sprzężone z białkiem G (GPCR), kinazy serynowo-treoninowe i tyrozynowe,

metalopeptydazy cynkowe, proteazy serynowe, receptory jądrowe dla

hormonów oraz fosfodiesterazy [21]. Badanie genetyczne pacjenta może dać

również wskazówki, indywidualizujące postępowanie terapeutyczne.

Literatura

1. Abrahams BS, Geschwind DH. Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology. Nature Reviews Genetics., 9 (2008), s. 341-355

2. http://www.cdc.gov/ncbddd/autism/data.html dostęp 12.12.14 3. Gerhant A., Olajossy M., Olajossy-Hilkesberger L. Neuroanatomiczne,

genetyczne i neurochemiczne aspekty autyzmu dziecięcego. Psychiatr. Pol., 2013; 47(6): 1101–1111.

4. http://www.omim.org/entry/209850 dostęp 12.12.14 5. Bailey A., Le Couteur A., Gottesman I., Bolton P., Simonoff E., Yuzda E.,

Rutter M. Autism as a strongly genetic disorder: evidence from a British twin study. Psychological Medicine., 1 (1995), s. 63-77

6. Geschwind DH. Advances in autism., Annu Rev Med., 60 (2009), s. 367-80 7. Brenner G., Stevens C., Farmakologia, Wydawnictwo Uniwersytetu

Warszawskiego, Warszawa 2010, s. 211-215 8. Patel TD, Zhou FC. Ontogeny of 5-HT1A receptor expression in the

developing hippocampus, Brain research., 2005 Jun 9;157(1):42-57 9. Ciranna L., Vincenza Catania. M. 5-HT7 receptors as modulators of neuronal

excitability, synaptic transmission and plasticity: physiological role and possible implications in autism spectrum disorders, Frontiers in Cellular Neuroscience., 8 (2014), s. 250

10. DeLong GR. Autism: New data suggest a new hypothesis, Neurology., 52 (1999); s. 911- 916

11. Doyle CA.., McDougle CJ. Pharmacologic treatments for the behavioral symptoms associated with autism spectrum disorders across the lifespan, Dialogues in Clinical Neuroscience., 2012 Sep; 14(3): 263-279

12. Mouti A. et al. Fluoxetine for Autistic Behaviors (FAB trial): study protocol for a randomized controlled trial in children and adolescents with autism, Trials., 2014, Vol. 15(1); 230

http://journals.cambridge.org/action/displayJournal?jid=PSM


102

13. Kumar B. et al. Drug therapy in autism: a present and future perspective, Pharmacological Reports., 64 (2012), 1291-1304

14. Lee M. et al. Nicotinic receptor abnormalities in the cerebellar cortex in autism. Brain A Journal of Neurology., (2002) 125 (7): 1483-1495

15. Muhle R, Trentacoste SV, Rapin I. The Genetics of Autism, Pediatrics., 2004;113; s. 472-486

16. Shinohe A, Hashimoto K, Nakamura K, Tsujii M, Iwata Y, Tsuchiya KJ, Sekine Y, Suda S, Suzuki K, Sugihara G, Matsuzaki H, Minabe Y, Sugiyama T, Kawai M, Iyo M, Takei N, Mori N. Increased serum levels of glutamate in adult patients with autism, Progress in neuro-psychopharmacology and biological psychiatry., 2006 Dec 30;30(8):1472-1477

17. ShimmuraC. et al. Alteration of Plasma Glutamate and Glutamine Levels in Children with High-Functioning Autism, PLoS One., 2011; 6(10): e25340

18. Yip J. et al. Decreased GAD67 mRNA levels in cerebellar Purkinje cells in autism: pathophysiological implications, Acta Neuropathologica., 2007, 113 (5), s. 559-568

19. Shinohe A. et al. Increased serum levels of glutamate in adult patients with autism, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry., 2006, 30 (8), s. 1472-1477

20. Hussman JP. et al. Suppressed GABAergic inhibition as a common factor in suspected etiologies of autism, Journal of Autism and Developmental Disorders., 2001; 31(2), s. 247-248

21. Hadley D. et al. The impact of the metabotropic glutamate receptor and other gene family interaction networks on autism, Nature Communications., 5 (2014),Article number: 4074

22. Chia-Hsiang Chen, Chia-Chun Huang, Min-Chih Cheng, Yen-Nan Chiu, Wen-Che Tsai, Yu-Yu Wu, Shih-Kai Liu, Susan Shur-Fen Gau Genetic analysis of GABRB3 as a candidate gene of autism spectrum disorders, Molecular Autism., 2014, 5:36

23. Napoli A. et al. Genetic variation in the oxytocin receptor (OXTR) gene is associated with Asperger Syndrom,. Molecular Autism., 2014; 5(1): 48

24. Adrienne E. Taylor, Hsu-en Lee, Femke T. A. Buisman-Pijlman. Oxytocin treatment in pediatric populations, Frontiers in Behavioral Neuroscience., 2014; 8: 360

Possibilities of pharmacotherapy in deffects of synthesis of

neurotransmitters in autism

The increasing detection of Autism Spectrum Disorder (ASD) in modern population is the key issue for society. Currently, the prevalence of ASD in the United States is in 1 child in 68 (according to the data presented by the Centers for Disease Control and Prevention). The reason of this phenomenon remains unknown. At present, ASD is considered to have epigenetic background – that is why causal treatment possibilities are limited. Treatment options include psychotherapy and pharmacotherapy. The choice of neurotropic drugs is based on the knowledge of neurochemical abnormalities that may occur in a patient’s brain. The pathogenesis of autism is multi-faceted: there are abnormalities in the serotonergic system, cholinergic neurotransmission, also the imbalance between activating and inhibiting function of glutamate and GABA, as well as lower levels of oxytocin compared with the general population. In our article we will try to present pharmacological possibilities of treatment associated with receptor’s disorders on genetic background.

http://link.springer.com/journal/401

103

Karolina Jakubczyk1, Katarzyna Barchiewicz

2

Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach

diagnostyki i leczenia chorób

Ftalocyjaniny to syntetyczne analogi porfiryn, ważnej grupy biologicznie aktywnych związków, mających duże znaczenie dla procesów zachodzących

w komórkach organizmów żywych. Właściwości fizykochemiczne tych

związków wynikają z rozkładu gęstości elektronowej w rdzeniu makro-

pierścienia ftalocyjaninowego. Dodatkowo makropierścień może być podstawiony przez różnego rodzaju grupy funkcyjne, dzięki czemu można

odpowiednio modyfikować właściwości chemiczne i opto-elektroniczne

tych substancji. Ponadto ftalocyjanina oraz jej kompleksy mają naturalne

powinowactwo do molekularnego tlenu, stąd też stanowią one bardzo atrakcyjny materiał dla różnych zastosowań medycznych, np. jako

fotosensybilizatory w fotodynamicznej metodzie diagnozowania (PDD) oraz

leczenia (PDT) nowotworów. Metody te mogą pomóc rozwiązać problemy,

z jakimi borykają się dotychczas stosowane strategie terapeutyczne, takie jak mała selektywność oraz skutki uboczne. PDT znajduje również

zastosowanie w leczeniu wielu nienowotworowych zmian chorobowych.

Przykładem są infekcje wywołane grzybami bądź bakteriami lekoopornymi,

choroby oczu (zwłaszcza zwyrodnienie starcze plamki żółtej) oraz choroby skóry.

1. Charakterystyka ftalocyjanin

Pierwszą ftalocyjaninę zsyntetyzowano w 1907 roku. Dokonali tego

niemieccy naukowcy – Braun i Tcherniac, którzy ogrzewając o-cyjanoben-

zamid otrzymali niewielką ilość niebieskiej substancji [1]. Już w 1928 roku

stwierdzono, że związki tego typu są doskonałymi barwnikami

w przemyśle tekstylnym (obecnie ponad 25% stosowanych w przemyśle

pigmentów), a w 1933 roku opisano dokładną strukturę cząsteczek.

Zjawisko barwienia pochodzi od charakterystycznej makrocyklicznej

budowy cząsteczek. Pojedyncza cząsteczka ftalocyjaniny (z ang. phthalo-

cyanine, z gr. naphtha – olej skalny, ropa naftowa i cyanine – ciemno-

niebieski) zbudowana jest czterech pierścieni izoindolowych. Pierścienie

połączone są ze sobą za pomocą mostków azametinowych. Taki sposób

uporządkowania atomów w cząsteczce stworzył płaski układ sprzężonych

wiązań podwójnych, z 18 zdelokalizowanymi elektronami π. Znajdujące się

w tym układzie elektrony π, spełniają warunek aromatyczności Hückla

[email protected] Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski [email protected] Koło Naukowe Chemików „Koronan”, Wydział Chemii, Uniwersytet

Opolski


104

(4n+2π). Aromatyczność cząsteczek powoduje, że cząsteczki ftalocyjanin

są stabilne i odporne chemicznie [2].

Rys. 1. Budowa cząsteczki ftalocyjaniny [opracowanie własne]

Połączone pierścienie tworzą zamknięte centrum cząsteczki, gdzie

do atomów azotu, za pomocą wiązań koordynacyjnych można włączać

atomy metali grup głównych (np. magnezu), przejściowych (np. miedzi

i cynku) i lantanowców (np. lantanu) (rys. 1). W wyniku chelatowania

metali, płaska struktura może ulegać jednak deformacji. Gdy atom metalu

jest zbyt duży, wychyla sie delikatnie nad powierzchnię tworzoną przez

pierścienie [3, 4]. Oprócz chelatowania metali, ftalocyjaniny mogą być

modyfikowane również w zewnętrznej części cząsteczki, a mianowicie,

pierścień benzenowy może być podstawiony różnymi grupami funkcyjnymi

[5], które mogą wpływać na właściwości związku, na przykład

rozpuszczalność. Umieszczenie podstawników takich jak grupy sulfonowe,

karboksylowe, czy hydroksylowe w pozycjach peryferyjnych makropier-

ścienia ftalocyjaninowego znacznie zwiększa hydrofilowość cząsteczki,

która normalnie jest hydrofobowa. Ftalocyjaniny ulegają również

polimeryzacji lub agregacji. Biorą udział w reakcjach redukcji i utleniania,

są katalizatorami reakcji chemicznych, a także biorą udział w przemianach

fotochemicznych, dzięki możliwości absorpcji promieniowania UV-VIS

(ε>105) [6, 7]. Układ czterech pierścieni, połączonych mostkami azameti-

nowymi jest bardzo stabilnym chromoforem. Dzięki temu, związki te są


105

dobrym materiałem do badań transferu elektronów w układach

biologicznych, gdzie mogą naśladować działanie układów porfirynowych

(ftalocyjaniny są analogami porfiryn). Zredukowana lub utleniona cząsteczka

(po oderwaniu lub przyłączeniu elektronu do makrocyklicznego układu

aromatycznego) staje się π-kationem lub π-anionem i również jest stabilnym

układem. Maksima absorpcji promieniowania dla ftalocyjanin znajdują się

przy około 340 nm (tzw. pasmo B) oraz w zakresie 600-800 nm (tzw. pasmo

Q). Jest to ważna cecha tych cząsteczek, w odniesieniu do przemian

w układach biologicznych, bowiem pasma absorpcji nie pokrywają się

z pasmami barwników żywych komórek ludzkich, takich jak hemoglobina

czy melanina. Przy długościach fali krótszych niż 600 nm absorpcja jest

niewielka (w przeciwnym wypadku, zastosowanie ftalocyjanin w terapii

fotodynamicznej dawałoby szkodliwy efekt, sprzyjający rozwijaniu

się nowotworów skóry). Zastosowanie ftalocyjanin w terapii fotodyna-

micznej możliwe jest dzięki temu, że cząsteczki nie wywierają działania

cytotoksycznego na zdrowe komórki (nie są także mutagenne), lecz potrafią

selektywnie kumulować się w tkankach nowotworowych (pozostają

w komórkach przez kilkadziesiąt godzin). Mechanizm działania w głównej

mierze zależy od dostępności tlenu i zewnętrznego źródła promieniowania

(rys. 2). W pierwszym etapie cząsteczka (w podstawowym stanie

singletowym) absorbuje foton promieniowania (najczęściej stosowane są

lasery, emitujące promieniowanie o długości fali odpowiadającej maksimum

absorpcji danego związku) dzięki czemu ftalocyjanina (zwana dalej

fotouczulaczem) ulega wzbudzeniu (rys. 3) [8].

Rys. 2. Mechanizm reakcji fotodynamicznej, na podstawie [9]

Część energii tak wzbudzonej cząsteczki (w stanie singletowym) zostaje

wyemitowana jako fluorescencja (energia wykorzystywana do diagnostyki

– lokalizacja komórek nowotworowych [11]). W pewnych przypadkach


106

możliwe jest wygenerowanie stanu trypletowego wzbudzonej cząsteczki

fotouczulacza, co jest wykorzystywane w procesie terapeutycznym.

W momencie, kiedy w środowisku jest wysokie stężenie tlenu,

fotouczulacz (we wzbudzonym stanie trypletowym) przekazuje energię

do cząsteczki tlenu O2 (w podstawowym stanie trypletowym), w efekcie

czego powstaje tlen w stanie wzbudzonym (tlen singletowy), który ma silne

właściwości utleniające. Niszczone są wówczas błony organelli

komórkowych, a także zewnętrzne błony plazmatyczne. Tlen singletowy

ma krótki czas życia, dlatego działa na te struktury, które są najbliżej.

W przypadku, kiedy w komórce stężenie tlenu jest małe, zachodzi reakcja

przeniesienia wodoru lub elektronu między fotouczulaczem a komórką

tkanki, dzięki czemu powstają rodniki lub anionorodniki głównie

związków organicznych. Molekuły te reagują następnie z tlenem

(w podstawowym stanie trypletowym), powstają rodniki tlenowe (ROS –

reaktywne formy tlenu) niszczące tkankę nowotworową utleniając

jej składniki. Zapoczątkowana reakcja rodnikowa prowadzi do powsta-

wania dalszych rodników [10, 12].

Rys. 3. Diagram Jabłońskiego poziomów energetycznych fotouczulacza, na podstawie [12]

Również w tym przypadku, rodniki niszczą struktury znajdujące

się w najbliższym sąsiedztwie, ze względu na krótki czas życia.

2. Dystrybucja ftalocyjanin i innych fotouczulaczy do komórek

Fotouczulacze najczęściej podaje się dożylnie, a następnie są transpor-

towane z krwią do chorych komórek. Wykazują one różną biodystrybucję

w obrębie ciała ludzkiego (w zależności od charakteru chemicznego) i różną


107

farmakokinetykę, która jest zależna od miejsca kumulacji oraz od rodzaju

nośnika, z którym są transportowane [9, 13]. Związki hydrofobowe

(niemodyfikowane lub z podstawnikami hydrofobowymi) łączą się najczęściej

z lipoproteinami i kumulują się w tkance łącznej nowotworu. Powinowactwo

cząsteczek hydrofobowych do LDL (lipoprotein o niskiej gęstości) również

sprzyja transportowi do komórek, a także przechodzeniu do ich wnętrza ze

względu na obecność na powierzchni licznych receptorów dla LDL.

Cząsteczki lipofilowe i o charakterze pośrednim – transportowane są dzięki

połączeniom z elementami białkowymi surowicy (np. z albuminami)

i kumulują się w zrębie naczyń krwionośnych guza. Fotouczulacze mogą się

również łączyć z kolagenem, elastyną i fibrynogenem w istocie między-

komórkowej tkanki łącznej. Ponadto, niskie pH komórek nowotworowych

jest środowiskiem sprzyjającym dla ftalocyjanin. Słabe naczynia krwionośne

nowotworu (powstałe w wyniku angiogenezy) są przepuszczalne dla

fotouczulaczy, a ze względu na niezbyt rozbudowany układ naczyń limfaty-

cznych nowotworu, cząsteczki fotouczulaczy zostają zakumulowane

w tkance. Wewnątrz komórki, lokalizacja fotouczulaczy również zależy od

ich charakteru chemicznego. Związki hydrofobowe lokalizują się głównie

w błonach (jądrowa, mitochondrialna, aparatu Golgiego, komórkowa),

natomiast hydrofilowe w lizosomach (ponieważ nie przechodzą przez błonę

i dostają się do komórki w głównej mierze przez endocytozę) [14]. Najbar-

dziej pożądaną lokalizacją w terapii celowanej jest jądro komórkowe (śmierć

komórki z powodu uszkodzenia DNA) lub błona mitochondrialna (śmierć

komórki poprzez zahamowanie oddychania komórkowego) (Tab. 1) [13-16].

Tabela 1. Lokalizacja fotouczulaczy w zależności od ich charakteru chemicznego [13-17]

Fotouczulacze

hydrofobowe

komórka

błona komórkowa,

mitochondrialna,

jądrowa, aparatu

Golgiego

tkanka naczynia krwionośne,

nowotwory

Fotouczulacze

hydrofilowe

komórka lizosomy

tkanka naczynia krwionośne

Źródło: opracowanie własne

Charakter chemiczny fotouczulacza decyduje o jego lokalizacji

w komórce. Dzięki zastosowaniu liposomów, lipoprotein lub nawet

polimerów, można przewidzieć miejsce działania fotouczulacza wewnątrz

komórki i zwiększyć efektywność terapii [12, 17].

Terapia fotodynamiczna prowadzi do śmierci komórek. Istnieją dwa

mechanizmy tego procesu: nekroza i apoptoza. Obydwa są obserwowane


108

jako następstwo działania wzbudzanych fotouczulaczy na komórki

nowotworowe, chociaż bezpośrednią przyczyną śmierci komórek jest

uszkodzenie białek, tłuszczów i dezorganizacja komórki w efekcie działania

silnie reaktywnego tlenu singletowego. Wpływ na śmierć komórek ma

przede wszystkim stężenie i rodzaj fotouczulacza, obecność tlenu a także

faza cyklu komórkowego. Wysokie stężenie fotouczulacza i naświetlanie

promieniowaniem o odpowiedniej długości fali powoduje nekrozę (fot. 1),

natomiast podawanie fotouczulacza w niskim stężeniu lecz w kilku dawkach,

oraz dłuższy czas inkubacji powoduje apoptozę [12, 13, 18].

Fot. 1. Nekroza komórek raka prostaty po PDT [19]

Po spełnieniu swej roli, fotouczulacze (w podstawowym stanie

singletowym) odprowadzane są przez naczynia limfatyczne i krwionośne

i unieszkodliwiane i wydalane przez wątrobę i nerki.

3. Ftalocyjaniny w diagnostyce fotodynamicznej chorób

Dzięki selektywnemu gromadzeniu się fotouczulaczy w tankach

nowotworowych, możliwe jest ich wykorzystanie w diagnostyce

fotodynamicznej (PDD – Photodynamic Diagnosis), która polega na

zjawisku fluorescencji. Fotouczulacz, ulokowany w tkance nowotworowej


109

zostaje wzbudzony przez promieniowanie lasera, bądź inne źródło światła.

Część pochłoniętej energii zostanie wyemitowana w postaci kwantu

fluorescencji, co umożliwia ocenę stanu tych tkanek. Metodę tą stosuje się

nie tylko w diagnostyce nowotworów, lecz także zmian miażdżycowych

w naczyniach krwionośnych. Dużą zaletą PDD jest wysoka wybiórczość

identyfikacji zmian chorobowych [4, 20].

Fotosensybilizatory absorbujące w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR)

znalazły zastosowanie w naukach biomedycznych ze względu na ich

absorpcję fotonów i fluorescencję w zakresie 600-1000 nm, co pokrywa się

z „oknami” transmisyjnymi tkanek. Przy tych długościach fali absorpcja

światła przez barwniki endogenne jest minimalna, co z kolei umożliwia

głębszą penetrację tkanek światłem. Ftalocyjaniny są jednymi z najbardziej

stabilnych i skutecznych chromoforów, absorbujących światło z zakresu

bliskiej NIR [21].

Lau i in [22] stworzyli fotouczulacze, które mogą być aktywowane

w środowisku redukującym, o pH nieco mniejszym niż 7. Takie

środowisko jest bowiem typowe dla tkanek nowotworowych. Cechą

charakterystyczną takich związków jest obecność w ich budowie pewnych

fragmentów, które powodują wygaszanie fluorescencji i niwelują

właściwości fotouczulające. Gdy związek znajdzie się w środowisku

kwaśnym i redukującym, następuje odłączenie takiego „wygaszacza”,

a właściwości fotosensybilizatora zostają przywrócone. Badane

fotouczulacze (Compound 4) były pochodnymi ftalocyjaniny krzemu,

w których zastosowano podstawniki ferrocenylowe jako wygaszacze,

połączony z atomem krzemu poprzez grupy hydrazonowe i mostki

dwusiarczkowe. Taki uczulacz dobrze sprawdzał się zarówno w badaniu

in vitro, jak in vivo (rys. 4) [22].

Inną strategią do aktywacji proleków jest wykorzystanie

promieniowania z zakresu bliskiej podczerwieni. Promieniowanie

to, chociaż przenika w głąb tkanek, jest niskoenergetyczne, co utrudnia

wykorzystanie go do aktywacji proleków. Bio i in. wykorzystali więc tlen

singletowy (1O2,

1Δg) powstający w procesach fotochemicznych

pod wpływem promieniowania NIR. Powstały 1O2 reaguje z bogatymi

w elektrony olefinami, w wyniku czego tworzą się niestabilne dioksetany,

które ulegają następnie rozkładowi, powodując uwolnienie proleku [23].

Bio i in. jako łącznik pomiędzy ftalocyjaniną a wygaszaczem zastosowali

aminoakrylan. Cząsteczki otrzymane przez tych autorów z powodzeniem

łączyły właściwości diagnostyczne (fluorescencję ftalocyjaniny krzemu)

z właściwościami przeciwnowotworowymi (PDT i uwalnianym lekiem

przeciwnowotworowym – komberstatyną A-4) [23].


110

Rys. 4. Zmiana intensywności fluorescencji po podaniu fotouczulacza aktywowanego in situ

(Compound 4) u myszy z ludzkim rakiem jelita grubego oraz u osobników w próbie

kontrolnej. Widoczne jest przywrócenie fluorescencji fotouczulacza w tkance nowotworowej [21]

4. Ftalocyjaniny w terapii chorób

8.1. Terapie przeciwnowotworowe

Tradycyjne terapie przeciwnowotworowe borykają się z licznymi

problemami, wśród których wyróżnić można niską specyficzność

chemioterapeutyków, której konsekwencją jest uszkodzenie nie tylko

komórek nowotworowych, ale też tkanek prawidłowych [24].

Terapia fotodynamiczna nowotworów ma przewagę nad terapiami

tradycyjnymi, ze względu na jej selektywność. Po pierwsze – fotouczulacze

gromadzą się selektywnie w tkance nowotworowej. Po drugie efekt

cytotoksyczny obserwowany jest dopiero po naświetleniu fotouczulacza –

ograniczając obszar naświetlania jedynie do tkanek zmienionych

chorobowo, można dodatkowo zwiększyć selektywność terapii [25].

Idealny fotouczulacz w diagnostyce i terapii fotodynamicznej powinien

odznaczać się następującymi cechami:

powinien selektywnie gromadzić się w tkance nowotworowej;

nie powinien powodować efektów fitotoksycznych w zdrowych

tkankach;


111

wykazywać maksimum absorpcji w zakresie 600-800 nm, a więc

w „oknach” transmisyjnych tkanki. Dzięki temu pasma absorpcji

fotouczulacza nie będą się pokrywać z pasmami absorpcji barwników

endogennych, takich jak hemoglobina czy melanina;

wykazywać minimum absorpcji w zakresie 400-600 nm, co pozwoli

na ograniczenie efektu ubocznego, jakim jest fotowrażliwość skóry;

mieć wysoką wydajność kwantową tworzenia tlenu singletowego

lub reaktywnych form tlenu (ROS), co ma duży wpływ

na efektywność terapii;

wykazywać wysoką fotostabilność [4, 20].

Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że stosowane obecnie

fotouczulacze nie są tak specyficzne, jak początkowo zakładano – kumulują

się bowiem we wszystkich szybko rozwijających się tkankach (np. w skórze),

co skutkuje niepożądaną nadwrażliwością na światło. Problem ten

rozwiązać można przez zastosowanie odpowiednich nośników, połączo-

nych z odpowiednimi cząsteczkami, specyficznie rozpoznawanymi

i wychwy-tywanymi przez komórki nowotworowe. Takie połączenia,

zwane fotouczulaczami trzeciej generacji, stwarzają zupełnie nowe

możliwości w PDT [4, 26].

Dalszym rozwiązaniem problemu niskiej specyficzności fotouczulaczy

może być zastosowanie nośnika leków. Metoda ta wykorzystuje

zwiększoną przepuszczalność naczyniową oraz zatrzymywanie małych

i dużych cząsteczek w tkance guza nowotworowego (efekt EPR - enhanced

vascular permeability and retention). Tkance nowotworowej często

towarzyszy bowiem nieszczelna sieć naczyń krwionośnych, będąca

skutkiem chaotycznej neoangiogenezy, podczas gdy większość zdrowych

tkanek (poza m. in. wątrobą, szpikiem kostnym, śledzioną) ma względnie

zwartą strukturę śródbłonka naczyń włosowatych. Koniugaty nośnik-lek,

będące makrocząsteczkami, ze względu na swoją wielkość nie będą mogły

przenikać przez szczelną warstwę śródbłonka naczyń włosowatych

zdrowych tkanek. Natomiast względnie łatwo mogą dyfundować do tkanek

nowotworowych. Dodatkowo w obrębie guza obserwuje się często

upośledzenie drenażu limfatycznego, co skutkuje obniżeniem klirensu leku

z tkanki nowotworowej i jego akumulacją w tej tkance [27].

Jednymi z najczęściej badanych fotouczulaczy są pochodne

ftalocyjaniny cynku (ZnPc). Ogbodu i in. wykazali, że połączenie

monoaminoftalocyjaniny cynku z kwasem foliowym (ZnMAPc-FA)

wykazuje bardzo niską cytotoksyczność wobec komórek czerniaka skóry

przy braku dostępu światła. Zastosowanie tego związku w połączeniu

z naświetlaniem (676 nm) pozwala uzyskać znaczne zahamowanie

proliferacji komórek (fot. 2), przy czym skuteczność jest zależna zarówno


112

od dawki leku, jak i dawki naświetlenia. Badano również skuteczność tego

związku po umiejscowieniu wewnątrz nośnika – jednościennej nanorurki

węglowej (SWCNT). Sam nośnik SWCNT poza tym, że poprawia

efektywność transportu leku, ma również zdolność do pochłaniania światła

z zakresu bliskiej podczerwieni. Dzięki temu zwiększa się skuteczność

działania leku poprzez wykorzystanie efektu fototermicznego (PTT).

Stwierdzono, że takie połączenie, choć skutkuje zmniejszeniem wydajności

kwantowej tlenu singletowego, to znacznie polepsza dostarczanie leku,

przez co stanowić może obiecujący fotouczulacz w PDT [28].

Fot. 2. Wpływ ZnMAPc-FA na komórki czerniaka (A) Komórki bez obecności leku (B) Komórki w obecności ZnMAPc-FA, bez napromieniania (C) Komórki bezpośrednio

po PDT (5 J/cm2) w obecności ZnMAPc-FA (D)komórki po PDT i 24 h inkubacji w świeżej

pożywce hodowlanej [28]

Fotouczulacze ftalocyjaninowe zbadano również na kilku modelach

zwierzęcych. Tu i in. zastosował mezoporowate nanocząstki krzemionki

(MSNs) jako transporter ftalocyjaniny cynku (ZnPc) w leczeniu

ksenograftów ludzkiego raka wątroby u myszy. Takie nanocząsteczki

transportowane są do cytozolu przez drogę endolizosomalną. Powierzchnia

nanocząstek była sfunkcjonalizowana przy użyciu glikolu polietylenowego

(PEG) oraz polietylenoiminy (PEI). PEI ułatwia uwalnianie leku


113

z endosomów poprzez „efekt gąbki protonowej” oraz zwiększa jego

biokompatybilność. Terapia fotodynamiczna z zastosowaniem PEG-PEI-

MSNs/ZnPc jako fotouczulacza pozwoliła na wydłużenie życia leczonych

osobników z 16 do 40 dni (fot. 3) [29].

Fot. 3. Przeciwnowotworowe działanie PEG-PEI-MSNs/ZnPc, w porównaniu do podwójnej

kontroli – PEG-PEI-MSNs/ZnPc bez naświetlania oraz naświetlania bez fotouczulacza.

Parametry promieniowania: λ = 680 nm, 120 J/cm2 [29]

Nishiyama i in. projektując fotouczulacz wykorzystali efekt EPR. Jako

nośnik wykorzystali dendrymer, którego rdzeń stanowiła ftalocyjanina

cynku. Takie rozwiązanie zapobiegało tworzeniu się agregatów fotou-

czulacza, przy zachowanej efektywności tworzenia ROS. Do utworzenia

miceli wykorzystano kopolimer blokowy poli(glikolu etylenowego) i poli(L-

lizyny) (PEG-PLL) (rys. 5). Taki układ nośnik-lek wykorzystano do leczenia

ksenograftów ludzkiego raka płuc u myszy. Po trzydziestu dniach terapii

fotodynamicznej guz wzrósł jedynie 10-krotnie, podczas gdy w grupie

kontrolnej zaobserwowano 25-krotny wzrost. Dla porównania, w grupie

leczonej stosowanym obecnie fotouczulaczem porfirynowym – Photofrin®,

zaobserwowano ponad 15-krotny wzrost guza [30].

Część fotouczulaczy ftalocyjaninowych znajduje się obecnie w fazie

badań klinicznych. Wśród takich fotosensybilizatorów wyróżnić można

ftalocyjaninę cynku o nazwie handlowej CGP55847 (rys. 6), o maksimum

absorpcji przy długości fali 670 nm. Lek ten testowany jest w Szwajcarii

wobec płaskonabłonkowego raka górnych dróg oddechowych. W Chinach

natomiast prowadzone są testy kliniczne sulfonowanej pochodnej

tej ftalocyjaniny o nazwie handlowej Photocyanine, o maksimum absorpcji

również przy długości fali 670 nm [31].


114

Rys. 5. Struktura chemiczna anionowego dendrymeru ftalocyjaniny cynku (DPc) (A)

i kopolimeru blokowego PEG-PLL (B). Micelę (DPc/m) otrzymano poprzez zmieszanie

DPc i PEG-PLL w stosunku stechiometrycznym względem ich ładunków [30]

Duże zainteresowanie budzi również Pc 4, znajdująca się w fazie badań

klinicznych na terenie USA. Jest to fotouczulacz drugiej generacji, będący

modyfikowaną ftalocyjaniną krzemu (rys. 6), o maksimum absorpcji przy

długości fali 675 nm. Pierwsza faza testów klinicznych nie wykazała

znaczącej toksyczności ani nadwrażliwości na światło. Obiecujące efekty

PDT przy użyciu Pc 4 uzyskuje m. in. wobec ziarniaka grzybiastego

czy nowotworów skóry [31, 32].

Sulfonowana ftalocyjanina glinu (rys. 6), o maksimum absorpcji przy

długości fali 675 nm, została zaakceptowana do komercyjnego użycia

w Rosji, pod nazwą handlową Photosens, gdzie jest stosowana w leczeniu

m.in. nowotworów skóry, piersi, płuc, krtani, głowy i szyi, mięsaka

M1, guzów oczu i powiek [31].


115

Rys. 6. Fotouczulacze ftalocyjaninowe będące w fazie testów klinicznych [31]

4.2. Fotodynamiczna terapia przeciw mikroorganizmom (PACT)

Terapeutyczne zastosowanie ftalocyjanin wzbudzanych promienio-

waniem świetlnym znalazło zastosowanie w zwalczaniu chorobotwórczych

patogenów. Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) zwalcza

zakażenia grzybicze, bakteryjne (antybiotykooporne) oraz pasożytnicze.

Odnotowano także działanie antywirusowe. Trudność w zwalczaniu

patogenów lekami wynika z tworzenia biofilmów przez bakterie. Połączone

produkowaną przez komórki macierzą zewnątrzkomórkową drobnoustroje

(jednego lub kilku gatunków) tworzą strukturę, która jest bardziej oporna na

antybiotyki i działanie układu immunologicznego, dlatego rozpoczęto

poszukiwania alternatywnego sposobu ich zwalczania [33, 34].

Mechanizm działania fotouczulaczy wobec mikroorganizmów nie różni

się od działania w obrębie komórek nowotworowych, jednak w przypadku

bakterii najistotniejszą rolę odgrywa tlen singletowy. Powstające w trakcie

reakcji rodniki (w tym także rodniki hydroksylowe – z cząsteczki wody)

są unieszkodliwiane przez enzymy bakteryjne – katalazę i dysmutazę

ponadtlenkową. Tlen singletowy działa na materiał genetyczny bakterii oraz

na błony cytoplazmatyczne. Lipidy znajdujące się w błonie ulegają perok-

sydacji, w wyniku czego powstają ich nadtlenki. Wzrasta wówczas przepusz-

czalność błon dla jonów Na+/K

+. Peptydy również ulegają przemianom,

w wyniku czego liczne enzymy tracą swoją aktywność. W łańcuchu

oddechowym (błona mitochondrialna) zachodzą liczne niepożądane reakcje

redoks zaburzające porządek reakcji. Enzymy cytoplazmatyczne ulegają

oksydacji i zostają dezaktywowane. W materiale genetycznym bakterii

dochodzi do uszkodzenia łańcucha DNA w wyniku utlenienia zasad (powstaje

8-hydroksyguanozyna) lub cukrów. W przypadku grzybów fotouczulacze

doprowadzają do lizy błon komórkowych, mitochondrialnych i lizoso-

malnych, co doprowadza do śmierci komórek (fot. 4) [33, 34].


116

Fot. 4. Zastosowanie PACT w grzybicy paznokci. Zastosowano fotouczulacz firmy Briggate Medical Company [35]

Zastosowanie fotouczulaczy w PACT musi spełniać te same warunki,

które są spełniane wobec komórek nowotworowych (PDT). Fotouczulacze

nie mogą być toksyczne dla zdrowych komórek ludzkich ani dla naturalnej

flory bakteryjnej, nie mogą być immunogenne, a także muszą działać

selektywnie z wysoką wydajnością. Dlatego też, wobec komórek

bakteryjnych stosuje się związki kationowe. Aktywność ftalocyjanin zależy

od ilości grup kationowych w obrębie cząsteczki. Tetrakationowa

ftalocyjanina cynkowa podstawiona czterema grupami aminoalkilowymi

działa destrukcyjnie na lekooporne szczepy Candida albicans. Kationowa

ftalocyjanina cynku jest skuteczna wobec bakterii gram dodatnich i gram

ujemnych. Pc4 posiada właściwości antypierwotniakowe. Działa

destrukcyjnie na komórki Trypanosoma crusi oraz Plasmodium falciparum.

Fotouczulacze obdarzone ładunkiem ujemnym (takie jak np. pochodne

zawierające grupy sulfonowe bądź karboksylowe) są skuteczne tylko

wobec niektórych bakterii gram dodatnich, których ściana komórkowa jest

wystarczająco porowata, aby związki te mogły przeniknąć do wnętrza

komórki. Nie sprawdza się to w przypadku bakterii gram ujemnych,

których ściana komórkowa zawiera lipopolisacharydy (LPS), obdarzone

również ładunkiem ujemnym [9, 34].

Fotouczulacze drugiej generacji (do których należą ftalocyjaniny)

działają na szczepy oporne na antybiotyki (metycylinooporne

Staphylococcus aureus, a także wankomycynooporne Enterococcus

faecalis i Enterococcus faecium). Koszty leczenia z zastosowaniem PACT

są stosunkowo niskie, w połączeniu z wysoką skutecznością i brakiem

skutków ubocznych. Słabym punktem PACT jest to, że światło nie może

wnikać do głębszych partii ciała.


117

9. Podsumowanie i perspektywy

PDT jest nieinwazyjną metodą niszczenia komórek zmienionych

chorobowo, a także zakażeń patogenami. Zaletą tej metody jest możliwość

stosowania niezbyt skomplikowanej aparatury, natomiast fotouczulacze

można podawać w warunkach ambulatoryjnych. Dotychczas nie wykazano

ograniczeń związanych z dawką całkowitą, proces można wielokrotnie

powtarzać, a podawanie nie powoduje blizn i uszkodzeń ciała.

Terapia fotodynamiczna (PDT) znana jest na całym świecie. W wielu

krajach prowadzone są na szeroką skalę badania kliniczne w celu

dopuszczenia do powszechnego stosowania fotouczulaczy, a także

rozszerzenia ich zastosowań. Wśród krajów zainteresowanych PDT

są Stany Zjednoczone, Kanada, kraje Unii Europejskiej a także Japonia.

Na etapie I/II badań klinicznych jest ftalocyjanina Pc4 (CWRU), która

w PDT może być podawana dożylnie i miejscowo. W III fazie badań

klinicznych znajduje się ftalocyjanina cynkowa w leczeniu nowotworu

kolczysto komórkowego (lizosomalna formulacja ftalocyjaniny cynkowej).

Fenylo-tri(N-metylo-4-pirysylo)porfiryna (znana jako Sylsens) badana jest

w kierunku dezynfekcji czerwonych krwinek. Związek ten wykazuje

również aktywność antywirusową. We Francji prowadzone są badania

kliniczne nad zastosowaniem sulfonowanej ftalocyjaniny glinu (AlPcS),

natomiast na Ukrainie testowane są w leczeniu nowotworów skóry

ftalocyjaniny cyrkonu i hafnu.

Obecnie w Polsce prowadzone są badania diagnostyczne nad 5-ALA

i Photofrinem. Obejmują one wiele dziedzin medycyny. Przewiduje się ich

zastosowanie w gastroenterologii, pulmonologii, laryngologii, dermatologii,

ginekologii, a także ortopedii. Wśród klinik zajmujących się PDT w Polsce

znajdują się: Klinika Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Centrum

Laserowej Diagnostyki i Terapii Fotodynamicznej w Bytomiu, Klinika

Ginekologii Onkologicznej B Centrum Onkologii w Warszawie, Katedra

Ginekologii i Położnictwa Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, oraz

Klinika Chorób Przyzębia Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.

Literatura

1. Braun A., Tcherniac J., Über die Produkte der Einwirkung von Acetanhydrid

auf Phthalamid, 1907

2. Kadish K., Guilard R., Smith K., The Porphyrin Handbook, Volume

17: Phthalocyanines: Properties and Materials, (17) 2002 r.

3. Kinzhybalo V. Synteza, stereochemia i właściwości 4+1 i 4+2

koordynacyjnych związków kompleksowych ftalocyjaniny magnezu, praca

doktorska, Instytut Niskich Temperatur i Badań Strukturalnych PAN

im. Włodzimierza Trzebiatowskiego we Wrocławiu, 2009 r.


118

4. Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny

i ftalocyjaniny. Cz.1. Właściwości i niektóre zastosowania. Biotechnologia,

4 (71) (2005), s. 109-127

5. Chin Y., Lim S., Zorlu Y., Ahsen V., Kiew L. V., Chung L. Y., Dumoulin F.,

Lee B. H., Improved Photodynamic Efficacy of Zn(II) Phthalocyanines

via Glycerol Substitution, PLOS ONE, 9(5) (2014)

6. Contakes M. S., Beatty S. T., Dailey K. K., Rauchfuss T. B., Fenske D.,

π-Complexes of Phthalocyanines and Metallophthalocyanines,

Organometallics 19 (2000), s. 4767-4774

7. Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny

i ftalocyjaniny. Cz. II. Porfiryny jako biomimetyczne katalizatory transformacji

związków organicznych, Biotechnologia, 4, 71 (2005), s. 128-141

8. Jiang Z., Shao J., Yang T., Wang J., Jia L., Pharmaceutical development,

composition and quantitative analysis of phthalocyanine as the photosenstizer

for cancer photodynamic therapy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 87 (2014), s. 98-104

9. Ratuszna A., Światłoterapia szansą w leczeniu nowotworów, Gazeta

Uniwersytecka Uniwersytetu Śląskiego, 2, 135 (2005)

10. Wzgarda A., Koczorowski T., Nowak M., Lijewski S., Czarczyńska-Goślińska

B., Szczołko W., Gośliński T., Terapia fotodynamiczna z udziałem

fotouczulaczy porfirynoidowych jako narzędzie współczesnej medycyny

i wyzwanie dla farmacji, Czasopismo Aptekarskie 8-9 ( 2012), s. 224-225

11. Sieroń A., Sieroń-Stołtny K., Kawczyk-Krupka A., Latos W., Kwiatek S.,

Straszak D., Bugaj A. M., The role of fluorescence diagnosis in clinical

practise, OncoTargets and Therapy 6(2013), s. 977-982

12. Urbańska N., Synteza i spektroskopia wielofunkcyjnych pochodnych

porficenów, praca doktorska, Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii

Nauk, ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa

13. Nowak-Stępniowska A., Pergoł P., Padzik-Graczyk A., Metoda

fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów - mechanizmy

i zastosowania, Postępy Biochemii 59, 1 (2013), s. 53-63

14. Ferreira S., Tedesco A. C., Sousa G., Zângaro R. A., Silva N. S., Pacheco M.,

Pacheco-Soares C., Analysis of mitochondria, endoplasmic reticulum

and actin filaments after PDT with AlPcS4, Lasers in Medical Science

18 (2004), s. 207-212

15. Brożek-Płuska B., Metody spektroskopowe w diagnostyce zmian

nowotworowych ludzkiego gruczołu piersiowego, Zeszyty Naukowe

Politechnika Łódzka, 1157 (2013)

16. Souto C., Madeira K., Rettori D., Baratti M., Rangel L., Razzo D., da Silva A.,

Improved photodynamic action of nanoparticles loaded with indium (III)

phthalocyanine on MCF-7 breast cancer cells, Journal of Nanoparticles

Research 15 (2013), s. 1879-1898

17. Portilho F. A., de Oliveira Cavalcanti C., Miranda-Vilela A. L., Estevanato L.,

Longo J., Santos M., Bocca A., Martins O., Simioni A., Morais P., Azevedo

R., Tedesco A.., Lacava Z., Antitumor activity of photodynamic therapy


119

performed with nanospheres containing zinc-phthalocyanine, Journal

of nanobiotechnology 11, 41 (2013)

18. Chwiłkowska A., Kulbacka J., Saczko J., Śmierć komórek nowotworowych.

Udział reakcji fotodynamicznej w indukcji apoptozy w komórkach

nowotworowych, Polski Merkuriusz Lekarski, XXX, 175, 45 (2011)

19. Kwitniewski M., Juzeniene A., Ma L.W., Glosnicka R., Graczyk A., Moan J.,

Diamino acid derivatives of PpIX as potential photosensitizers

for photodynamic therapy of squamous cell carcinoma and prostate cancer:

In vitro studiem, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology,

94, 3(2009), s. 214-222

20. Osmałek T., Modyfikowane ftalocyjaniny, porfirazyny i subftalocyjaniny jako

potencjalne fotosensybilizatory w terapii fotodynamicznej, praca doktorska,

Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Uniwersytet

Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań

21. Lim C.K., Shin J. , Lee Y.D., Kim J. , Oh K.S. , Yuk S.H. , Jeong S.Y. , Kwon

I.C. , Kim S., Phthalocyanine-Aggregated Polymeric Nanoparticles as Tumor-

Homing Near-Infrared Absorbers for Photothermal Therapy of Cancer,

Theranostics, 2 (2012), s. 871-879

22. Lau J.T.F. , Lo P.C. , Jiang X.J., Wang Q., Ng D.K.P., A dual activatable

photosensitizer toward targeted photodynamic therapy, Journal of Medicinal

Chemistry, 57 (2014), s. 4088-4097

23. Bio M. , Rajaputra P., Nkepang G., You Y., Far-red light activatable,

multifunctional prodrug for fluorescence optical imaging and combinational

treatment, Journal of Medicinal Chemistry, 57 (2014), s. 3401-3409

24. Werengowska K. M., Wiśniewski M., Terzyk A. P., Gurtowska N., Drewa T.

A., Olkowska J., Chemiczne aspekty celowanej terapii przeciwnowotworowej

II, Połączenia nośnik-lek. Wiadomości Chemiczne. 66 (2012), s. 7-8

25. Allen C.M. , Sharman W.M. , Van Lier J.E., Current status of phthalocyanines

in the photodynamic therapy of cancer, Journal of Porphyrins

and Phthalocyanines. 5 (2001), s. 161-169

26. Osmałek T., Gośliński T., Mielcarek J., Osmałek E., Nowe tendencje oraz

bezpieczeństwo terapii fotodynamicznej, Przegląd Lekarski. 69 (2012),

s. 1205-1208

27. Nevozhay D., Kańska U., Budzyńska R., Boratyński J., Współczesny stan

badań nad koniugatami i innymi systemami dostarczania leków w leczeniu

schorzeń nowotworowych i innych jednostek chorobowych, Postepy Higieny

i Medycyny Doświadczalnej (online), 61(2007), s. 350-360.

28. Ogbodu R.O, Ndhundhuma I., Karsten A., Nyokong T., Photodynamic

therapy effect of zinc monoamino phthalocyanine–folic acid conjugate

adsorbed on single walled carbon nanotubes on melanoma cells, Acta

Spectrochimica Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,

137 (2015), s. 1120-1125

29. Tu J., Wang T., Shi W., Wu G., Tian X., Wang Y., Ge D., Ren L.,

Multifunctional ZnPc-loaded mesoporous silica nanoparticles

for enhancement of photodynamic therapy efficacy by endolysosomal escape,

Biomaterials. 33 (2012), s. 7903-7914


120

30. Nishiyama N., Nakagishi Y., Morimoto Y., Lai P.S., Miyazaki K., Urano K.,

Horie S., Kumagai M., Fukushima S., Cheng Y., Jang W.D., Kikuchi M.,

Kataoka K., Enhanced photodynamic cancer treatment by supramolecular

nanocarriers charged with dendrimer phthalocyanine, Journal of Controlled

Release, 133 (2009), s. 245-251

31. Jiang Z., Shao J., Yang T., Wang J., Jia L., Pharmaceutical development,

composition and quantitative analysis ofphthalocyanine as the photosensitizer

for cancer photodynamic therapy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 87 (2014), s. 98-104

32. Baron E. D., Malbasa C. L., Santo-Domingo D., Fu P., Miller J. D. ,

Hanneman K. K., Hsia A. H. , Oleinick N. L. , Colussi V. C. , Cooper K. D.,

Silicon phthalocyanine (Pc 4) photodynamic therapy is a safe modality for

cutaneous neoplasms: Results of a phase 1 clinical trial, Lasers in Surgery

and Medicine, 42 (2010), s. 728-735

33. Wright M., Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), Journal

of Antimicrobial Chemotherapy 42 (1998), s. 13-28

34. Gośliński T., Konopka K., Piskorz J., Kryjewski M., Wierzchowski M.,

Sobiak S., Perspektywy zastosowania fotodynamicznej terapii skierowanej

przeciw mikroorganizmom - PACT, Postępy mikrobiologii, 47, 4 (2008),

s. 447-456

35. www.briggatemedical.com

Phthalocyanines in photodynamic methods of diagnosis and treatment

Abstract

Phthalocyanines are synthetic analogues of porphyrins, an important group of biologically

active compounds, which are of great importance for the processes occurring in the cells

of living organisms. The physicochemical properties of these compounds result from the electron density distribution in the core of the phthalocyanine macrocycle. Additionally,

the macrocycles can be diversely functionalized which allows modifying and tuning

of the chemical and opto-electronic properties of these compounds. Moreover, phthalocyanine and its complexes exhibit natural affinity to molecular oxygen and hence

they have been considered a very attractive material for medical applications,

i.a. photosensitizers in photodynamic methods for diagnosis (PDD) and therapy (PDT)

of tumors. These methods may help solving problems such as low selectivity and side effects faced by the therapeutic strategies used so far. Photodynamic therapy is also used

in the treatment of many non-neoplastic lesions. Examples include infections caused

by fungi or drug-resistant bacteria, eye diseases (especially age-related macular

degeneration) and skin diseases.

121

Arkadiusz Czerwonka1, Anna Wawruszak

2, Karolina Okła

3

Spirulina – historia, skład

i właściwości prozdrowotne

Spirulina to produkt handlowy otrzymywany z wolno żyjących w toni wodnej przedstawicieli sinic (cyjanobakterii) z rodzaju Arthrospira,

stosowany jako suplement diety. Ze względu na wysoki potencjał odżywczy

i prozdrowotny zawartych w niej substancji cieszy się ona obecnie dużym

zainteresowaniem zarówno konsumentów, jak i naukowców. W spirulinie stwierdzono bowiem występowanie między innymi: c-fikocyjaniny,

β-karotenu, witamin, specyficznych kwasów tłuszczowych, białek

i peptydów oraz składników mineralnych. Liczne badania wykazały,

że przyjmowanie tego suplementu wpływa korzystnie na ludzki układ sercowo-naczyniowy oraz odpornościowy, a także zmniejsza ryzyko

zachorowania na choroby nowotworowe. W związku z tym w ostatnich

latach obserwuje się intensywny rozwój zarówno zakładów produkujących,

jak też przetwarzających spirulinę. W ostatnim czasie powstało szereg prac badawczych opisujących korzystne działanie spiruliny na organizm ludzki,

wynikający z jej spożywania. Celem poniższej pracy było opisanie

suplementu diety jakim jest spirulina oraz przybliżenie jej ewentualnego

prozdrowotnego wpływu na organizm ludzki z uwzględnieniem aktualnego piśmiennictwa.

1. Wprowadzenie

Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira to bakterie tworzące

charakterystyczne, kilkumilimetrowe, nitkowate, wielokomórkowe kolonie

o spiralnej budowie trychomu. Ze wzglądu na obecność chlorofilu oraz

zdolność do fotosyntezy, początkowo opisywano je jako rośliny (Plantae).

Wraz z postępem badań nad ich genetyką, fizjologią i biochemią

zaklasyfikowano je ostatecznie do królestwem bakterii (Bacteria).

Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira charakteryzują się obecnością

specyficznych barwników fotosyntetycznych, takich jak allofikocyjanina

i c-fikocyjanina, czemu zawdzięczają swój zielono-niebieski kolor [1].

Należy zwrócić uwagę, że produkt rozpowszechniany pod nazwą handlową

spirulina, który nie powstaje z cyjanobakterii rodzaju Spirulina lecz

[email protected],Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii

i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej,

II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie [email protected],I Katedra i Zakład Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii,

I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie





122

Arthrospira. Nieprawidłowość nazwy suplementu wiąże się bardziej

z przemysłowymi aspektami produkcji i elementami historycznymi,

niż rzeczywistą systematyką opartą na genetycznym podobieństwie

organizmów [2]. W związku z tym, że w niektórych pracach naukowych

dopuszcza się używanie nazw Spirulina/Arthrospira jako synonimów,

prowadzi to do pewnego rodzaju nieścisłości.

W naturalnym środowiskusinice z rodzaju Arthrospira występują

w silnie zasolonych, ciepłych wodach strefy tropikalnej i subtropikalnej,

takich jak wody Meksyku, Ameryki Północnej (Kalifornia), centralnej

Afryki i Azji. Najlepsze warunki do ich rozwoju stwarzają płytkie, słone

lub słonawe jeziora [3]. Organizmy te były prawdopodobnie spożywane

już od bardzo dawna. Po raz pierwszy Europejczycy spotkali

się z tym pożywieniem w XVI wieku, kiedy to Hiszpańscy konkwistadorzy

zaobserwowali, że Aztekowie zamieszkujący Dolinę Meksyku zbierają

z jeziora Texcoco zielone „rośliny” określane przez nich jako "Techuitlatl".

Po wyłowieniu z płytkich lagun wolno pływających sinic, suszono

je i przyrządzano potrawy przypominające placki [4]. Pierwsze próby

hodowli sinic z rodzaju Arthrospira na skalę przemysłową rozpoczęły

się w drugiej połowie lat 50 ubiegłego wieku na terenie USA, Niemiec

i Japonii, i miały głównie charakter naukowo-badawczy. Po ustaleniu

metod hodowli, zbioru i procesów oczyszczania, pierwszą fabrykę

komercyjnie produkującą spirulinę otwarto we wczesnych latach 70

XX wieku. Została ona założona na terenie dawnego jeziora Texcoco

w Meksyku przez firmę Sosa Texcoco S.A. W związku z dużym

potencjałem odżywczym, spirulinę okrzyknięto „cudownym pokarmem

przyszłości”, co zaowocowało powstaniem wielu zakładów produkcyjnych

w ciągu kilkunastu następnych lat [4].

Obecnie cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira hodowane są głównie

w otwartych zbiornikach wyposażonych w specjalne mieszadła lub inne

systemy zapewniające ciągły przepływ wody i ruch hodowli, takie

jak układy kaskadowe lub koryta przepływowe. Zazwyczaj są to płytkie

(20-30 cm) zbiorniki o dużej powierzchni (nawet do 1000 m2)

i intensywnym nasłonecznieniu. W celu obniżenia kosztów i podniesienia

wydajności produkcji, fabryki lokalizuje się na terenach o zbliżonym

klimacie w jakim Arthrospira występuje w środowisku naturalnym.

Specyficzne warunki hodowli eliminują część niepożądanych glonów

mogących rozwijać się w zbiornikach wraz z hodowlą Arthrospira [5].

Obecnie spirulinę otrzymuje się zazwyczaj z trzech gatunków Arthrospira:

A. platensis, A. maxima i A. fusiformis wykorzystując ich wysokie wartości

odżywcze, a także obecność licznych związków bioaktywnie czynnych [3].

Po zbiorze surowca odbywa się szereg procesów oczyszczania,

Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne

123

zagęszczania, neutralizowania pH, dezintegracji komórek czy osuszania,

pozwalających na uzyskanie ostatecznej formy surowca [4].

Spirulina najczęściej trafia na rynek w formie sproszkowanej

lub tabletek. Można ją odnaleźć zarówno w produktach pitnych,

jak też żywnościowych, jako dodatek do produktów zbożowych,

mlecznych, słodyczy czy emulsji [6]. Sprzedawana zazwyczaj jako

suplement diety, który przyjmowany systematycznie i w niewielkich

dawkach ma zapewniać szereg prozdrowotnych korzyści dla konsumenta.

W związku z stosunkowo prostymi metodami produkcji, szerokim

spektrum aktywności biologicznej jak i dużej popularności wśród

konsumentów, celem artykułu jest przybliżenie informacji o suplemencie

diety jakim jest spirulina z uwzględnieniem zarówno jej pozytywnego

jak i negatywnego wpływu na organizmy żywe.

2. Składi aktywność spiruliny

Popularność spiruliny wśród konsumentów wiąże się przede wszystkim

z bogactwem zawartych w niej składników bioaktywnych. Jej odżywcze

właściwości opierają się głównie na znacznej zawartości białka i peptydów,

szacowanej na około 55-70% suchej masy. Chociaż produkty bogate

w spirulinę uboższe są w metioninę, cystynę i lizynę w porównaniu

do protein zwierzęcych, stanowi ona lepsze źródło aminokwasów

niż większość białek roślinnych [4]. Spirulina zawiera również znaczną

ilość witamin (tiamina, ryboflawina, niacyna, pirydoksyna, kwas foliowy,

kobalamina, kwas askorbinowy) i prowitamin (prekursory witaminy D i E),

składników mineralnych (potas, wapń, chrom, miedź, żelazo, magnez,

mangan, fosfor, selen, sód i cynk), kwasów tłuszczowych (około 4-9 %

suchej masy) [7] takich jak wielonienasycone kwasy ω-3 (kwas

eikozapentaenowy, kwas stearydynowy, kwas dokozaheksaenowy) i ω-6

(kwas arachidonowy, kwas linolowy, kwas γ- linolenowy) oraz lipidów [4].

Ciekawą grupę związków obecnych w spirulinie, odpowiedzialnych

za jej prozdrowotne właściwości, stanowią związki fenolowe oraz barwniki

fotosyntetyczne. Możemy tu stwierdzić występowanie między innymi:

chlorofilu a i produktów jego rozpadu, c-fikocyjaniny i allofikocyjaniny,

β-karotenu, β-kryptoksantyny, zeaksantyny, echinenonu, oscyllaksantyny

czy myksoksantofilu [8]. O bogatym składzie odżywczym tego suplementu

świadczy fakt, że zarówno Narodowa Agencja Aeronautyki i Przestrzeni

Kosmicznej (NASA), jak i Europejska Agencja Kosmiczna (ESA),

rekomendują spirulinę jako pokarm dla astronautów podczas długo-

terminowych misji kosmicznych [9].

Pomimo licznych walorów odżywczych, spirulina przyciąga uwagę

konsumentów głównie ze względu na jej prozdrowotny charakter.


124

Już wczesne badania nad zwierzętami z lat 80- i 90-tych ubiegłego wieku

wykazały brak zaburzeń rozwoju płodu, aktywności teratogennej czy zmian

behawioralnych osobników, którym podawano spirulinę nawet w wysokich

dawkach (30 g na 100 g masy ciała) czy długoterminowo (13 tygodni) [41,

42, 43]. Szereg prac badawczych potwierdziło pozytywny wpływ

przyjmowania spiruliny na ograniczenie wystąpienia różnych schorzeń.

Zauważono wówczas, że u gryzoni karmionych paszą wysokotłuszczową

przy jednoczesnej suplementacji spiruliną uzyskano spadek frakcji

transporterów cholesterolu LDL, VLDL oraz acylogliceroli i fosfolipidów

z jednoczesnym wzrostem frakcji HDL w surowicy krwi [10]. Zmiany

te korelują z ogólno przyjętym modelem zmniejszenia ryzyka wystąpienia

chorób układu sercowo-naczyniowego, a mianowicie ograniczeniem

wystąpienia miażdżycy. Dalsze badania [11] potwierdziły, że zmiany

te wiążą się ze wzrostem aktywności takich enzymów jak lipaza

lipoproteinowa i wątrobowa, lipaza triglicerydów na skutek działania

spiruliny, co jednocześnie chroni i przeciwdziała rozwojowi takich

schorzeń jak np. niealkoholowe stłuszczenie wątroby. Dane uzyskane

z badań nad zwierzętami zostały częściowo potwierdzone w kilku

projektach z udziałem ochotników. Biorąc jednak pod uwagę stosunkowo

mało liczebną grupę badaną i duże rozbieżności pomiędzy osobami

badanymi, próby kliniczne powinny zostać uzupełnione [12].

Spirulina wywiera korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy

poprzez bezpośredni wpływ na śródbłonek naczyń krwionośnych.

Wzmacnia ona bowiem syntezę i uwalnianie endogennych związków,

takich jak tlenek azotu, doprowadzając do rozszerzenia naczyń

krwionośnych. Spirulina jednocześnie obniża produkcję niektórych

pochodnych kwasu arachidonowego, odpowiedzialnych za skurcz naczyń,

co skutkuje obniżeniem ciśnienia krwi [13, 14]. Ponadto z ekstraktów

spiruliny wyizolowano również specyficzny tripeptyd (Ile-Gln-Pro) zdolny

do inhibicji konwertazy angiotensyny (ACE) [15]. ACE jest

odpowiedzialny za przekształcanie angiotensyny I w II, która podnosi

ciśnienie tętnicze krwi. Tym samym, zahamowanie aktywności ACE przez

wyżej wymieniony peptyd, sprzyja obniżeniu ciśnienia w układzie

krwionośnym.

Interesujący jest również ewentualny wpływ spiruliny na centralny

układ nerwowy. W przypadku badań nad gryzoniami, suplementacja

spiruliną niwelowała związany z wiekiem wzrost ekspresji cytokin

prozapalnych (TNFα i TNFβ), a także spadek aktywności β-adre-

nergicznego receptora w móżdżku szczura [16, 17].

Wiele uwagi poświęcono również stymulacji układu odpornościowego

pod wpływem spiruliny, zarówno wśród ludzi jak i zwierząt. Wykazano,

że na poziomie komórkowym spirulina ułatwia produkcję przeciwciał,


125

zwiększa aktywację makrofagów, komórek NK oraz limfocytów T i B,

a w komórkach szpikowych, wykazuje stymulujący wpływ na produkcję

niektórych cytokin za pośrednictwem receptorów TLR [6, 18, 19]. Może

to stymulować układ odpornościowy do szybszej i skuteczniejszej

odpowiedzi immunologicznej w przypadku infekcji patogenami. Ponadto,

próby z udziałem ochotników spożywających spirulinę, wykazały redukcję

alergicznych objawów nieżytu górnych dróg oddechowych, takich

jak przekrwienie błon śluzowych, kichanie, swędzenie czy zwiększoną

produkcję wydzieliny z nosa [20]. Daje to podstawy do przyjęcia założenia,

iż może ona wywierać kompleksowy, modulujący wpływ na komórki

immunokompetentne, zarówno zwiększając ich aktywność, jak i hamując,

w przypadkach nadwrażliwości, odpowiedź na neutralne antygeny.

Spirulina nie tylko potrafi stymulować układ odpornościowy,

ale również bezpośrednio zwalczać patogeny odpowiedzialne za infekcję.

W przypadku wirusów, ekstrakty uzyskane ze spiruliny hamują replikację,

adsorpcję czy też wnikanie wirionów do komórek gospodarza. Aktywność

ta przypisywana jest obecności między innymi spirulanowi wapnia,

polisacharydowi zawierającemu w swoim składzie ramnozę, rybozę,

mannozę, fruktozę, galaktozę, ksylozę, glukozę, kwas glukuronowy, kwas

galakturonowy, siarczan oraz chelatowany wapń [21]. Działanie

przeciwwirusowe wykazują ponadto związki z grupy sulfolipidów (nawet

do 5% suchej masy) obecne w spirulinie, wykazujące między innymi

zdolność do inhibicji polimerazy DNA wirusa HIV [6]. Wodne ekstrakty

uzyskane z Arthrospira hamują replikację takich wirusów jak Herpes

simplex (opryszczka), Human herpesvirus-5 (cytomegalia), Measles virus

(odra), Mumps virus (nagminne zapalenie przyusznic), Influenzavirus

A (grypa typu A) czy łagodzą objawy leukoplakii związanej z wirusem

brodawczaka ludzkiego [6, 22]. W przypadku bakterii, wykazano hamujący

wpływ spiruliny na wzrost między innymi Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Salmonella typhi czy Enterococcus faecalis [23],

a w przypadku grzybów – Aspergillus Niger [24] i Candida albicans [25].

Spirulina może też być użyteczna w hodowli zwierząt. Ze wzglądu

na aktywność przeciwbakteryjną w stosunku do różnorodnych

przedstawicieli gatunków Pseudomonas, Aeromonas i Vibrio, będących

patogenami ryb [26], zwrócono uwagę na ewentualną możliwość

suplementacji zwierząt hodowlanych takich jak Tilapia nilowa

(Oreochromis niloticus) [27] czy też karp (Cyprinus carpio) [28].


126

3. Spirulina a nowotwory

W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudza możliwość

przeciwnowotworowego zastosowania spiruliny. Uwagę naukowców

zwracają przede wszystkim substancje wykazujące silne działanie

przeciwutleniające i przeciwzapalne, sprzyjające hamowaniu procesów

nowotworzenia oraz doprowadzające do indukcji enzymów związanych

z ochroną komórek przed stresem oksydacyjnym. Badania in vitro

wykazały hamujący wpływ ekstraktów spiruliny na proliferację komórek

raka trzustki [29] i wątroby [30], co potwierdza jej możliwości

terapeutyczne.

Aktywność przeciwnowotworową przypisuje się między innymi

zawartej w spirulinie c-fikocyjaninie. Kompleks ten, składający się z białek

i barwnika fotosyntetyzującego - fikocyjanobiliny, jest selektywnym

inhibitorem cyklooksygenazy 2. Enzym ten, aktywowany przez mitogeny,

onkogeny i czynniki wzrostowe sprzyja progresji chorób nowotworowych

poprzez produkcję prostaglandyn doprowadzając zarówno do indukcji

stanu zapalnego, jak i procesów angiogenezy [31]. Ponadto pod wpływem

spiruliny stwierdzono wzrost aktywności takich enzymów jak: peroksydaza

glutationowa, peroksydaza glutationowa zależna od selenu czy reduktaza

glutationu oraz do wzrostu poziomu samego glutationu [32]. Zapobiega

to uszkodzeniom komórek wywoływanym przez reaktywne formy tlenu

itoksyny, stanowiąc tym samym barierę ochronną przed wczesnymi

etapami inicjacji procesu nowotworzenia.

Co ciekawe spirulina jest też w stanie chronić organizm przed

genotoksycznym wpływem licznych czynników fizycznych, takich

jak promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości 900 MHz [33],

promieniowanie izotopu kobalt-60 [34] oraz chemicznych czynników

rakotwórczych, takich jak 7,12-dimetylobenzantracen (DMBA) [35,36].

Ochronny chrakter spiruliny przed czynnikami fizycznymi i chemicznymi

wynikać może z występowania w niej unikalnych polisacharydów

wspomagających mechanizmy naprawcze DNA poprzez modulację

aktywności endonukleaz [6].

Podawanie spiruliny może również służyć łagodzeniu skutków terapii

cytostatykami. 5-fluorouracyl czy doksorubicyna, to leki używane w terapii

przeciwnowotworowej, charakteryzujące się licznymi skutkami ubocznymi,

między innymi wywołują uszkodzenie mięśnia sercowego. W obu

przypadkach stosowania tych leków można zaobserwować ochronny

wpływ spiruliny na ten narząd [37,38]. Podawanie spiruliny obniża również

nefrotoksyczność cis-platyny [39].

Uwagę zwraca również fakt, że podczas hodowli w określonych

warunkach, spirulina posiada zdolność do silnej akumulacji cząsteczek


127

selenu. Pierwiastek ten charakteryzuje się dużym potencjałem

przeciwnowotworowym i podawany w takiej formie może zatrzymywać

komórki neoplastyczne w fazie G1 cyklu komórkowego, indukując tym

samym proces apoptozy [40]. Należy jednak pamiętać, że może istnieć

pewne ryzyko związane z suplementacją spiruliną. Już od dawna wiadomo

o zdolności Arthrospira do akumulacji metali ciężkich lub rtęci

bezpośrednio ze środowiska [44], które mogą wywierać szkodliwy wpływ

na organizm. Poza tym, niektóre gatunki cyjanobakterii zanieczyszczające

hodowlę Arthrospira mogą wytwarzać substancje chemiczne toksyczne

dla wątroby lub komórek układu nerwowego (anatoksyna-A [45]

czy β-metylamino-L-alanina (BMAA)) [46]. W związku z tym niezwykle

istotna wydaje się być kontrola procesów związanych z produkcją,

dystrybucją i przechowywaniem tego surowca, w celu uniknięcia

spożywania wraz z nim niepożądanych zanieczyszczeń.

4. Podsumowanie

Stosunkowo prosta produkcja, wysoka wydajność oraz atrakcyjność

pod względem wartości odżywczych i bogactwo związków bioaktywnie

czynnych powinny gwarantować spirulinie, jako suplementowi

lub elementowi diety, powodzenie wśród konsumentów. Pomimo szeregu

korzystnych właściwości, związek ten nie jest obecnie powszechnie znany

i rutynowo stosowany.

Produkt ten wydaje się nie wywierać skutków ubocznych przy

regularnym jego stosowaniu i może odgrywać dużo istotniejszą rolę jako

suplement diety nie tylko ludzi ale również zwierząt hodowlanych. Istnieją

silne podstawy naukowe, że przyjmowanie spiruliny może przeciwdziałać

lub łagodzić objawy chorób związanych z układem krążeniowo-

oddechowym, gospodarką lipidową lub nowotworami oraz wywierać

ochronny wpływ na organy wewnętrzne takie jak wątroba, serce czy mózg.

Ponadto, przeciwdziałając indukcji stanu zapalnego, modulując aktywność

układu odpornościowego czy też niwelując szkodliwy wpływ niektórych

ksenobiotyków wspiera utrzymanie homeostazy w organizmie. W oparciu

o dotychczasowe badania spirulina może znaleźć zastosowanie jako

substancja pomocnicza w zwalczaniu wielu chorobotwórczych patogenów

bakteryjnych, grzybiczych czy też wirusowych.

Pomimo wielu właściwości prozdrowotnych spiruliny, należy jednak

zwracać pilną uwagę na procesy jej produkcji, dystrybucji czy też

przechowywania by zminimalizować ryzyko wystąpienia szkodliwych

zanieczyszczeń takich jak metale ciężkie czy też mikroorganizmy

patogenne. Ponadto by w pełni zrozumieć mechanizmy odpowiedzialne za

działanie spiruliny, należy uwzględnić długoterminowe analizy z udziałem


128

większej grupy badanej niż te przeprowadzane dotychczas. Pozwoli to

uzupełnić niezbędne informacje na temat tego suplementu diety.

Literatura

1. Miklaszewska M. Waleron M. Waleron K. Charakterystyka jadalnej

cyjanobakterii z rodzaju Arthrospira. Biotechnologia, 3, (2008), pp. 103-118

2. Ling N. Mao Y. Zhang X. Wang G. Liu W. Sequence analysis of Arthrospira

maxima based on fosmid library. Journal of Applied Phycology, (2007),

19 (4), pp. 333-346

3. Gershwin ME. Belay A. Spirulina in human nutrition and health. Boca Raton:

CRC Press, (2008), pp. 4

4. Habib MAB. Parvin M. Huntington TC. Hasan MR. A review on culture,

production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic

animals. FAO Fisheries and Aquaculture Circular, (2008) 1034

5. Borowitzka MA. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes

and fermenters. Journal of Biotechnology 70 (1-3), (1999), pp. 313-321

6. Hosseini SM. Shahbazizadeh S. Khosravi-Darani K. Mozafari MR.

Spirulinapaltensis: Food and Function. Current Nutrition and Food Science,

9 (3), (2013), pp. 189-193

7. Gouveia L. Oliveira AC. Microalgae as a raw material for biofuels

production. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 36 (2),

(2009), pp. 269-274

8. Jaime L. Mendiola JA. Herrero M. Cifuentes A. Ibáñez E. Separation

andcharacterization of antioxidants from Spirulinaplatensis microalga

combining pressurized liquid extraction, TLC, and HPLC-DAD. Journal

of Separation Science, 28 (16), (2005), pp. 2111-2119

9. Small E. Spirulina - food for the universe. Biodiversity, 12 (4),(2011),

pp. 255-265

10. Kato T. Takemoto K. Katayama H. Kuwabara Y. Effects of Spirulina

(Spirulinaplatensis) on dietary hypercholesterolemia in rats. J Jap SocNutr

Food Sci., 37, (1984),pp. 323-332

11. Iwata K. Inayama T. Kato T. Effects of Spirulinaplatensis on plasma

lipoprotein lipase activity in fructose-induced hyperlipidemic rats.

J NutrSciVitaminol., 36, (1990), pp. 165-171

12. Deng R. Chow TJ. Hypolipidemic, Antioxidant, and Antiinflammatory

Activities of Microalgae Spirulina. Cardiovascular Therapeutics, 28 (4),

(2010), pp. e33-e45

13. Paredes-Carbajal MC. Torres-Durán PV. Díaz-Zagoya JC. Mascher D. Juárez-

Oropeza MA. Effects of the ethanolic extract of Spirulina maxima

on endothelium dependent vasomotor responses of rat aortic rings.

J Ethnopharmacol, 75, (2001), pp 37-44

14. Paredes-Carbajal MC. Torres-Durán PV. Rivas-Arancibia S. Zamora-

Gonzalez J. Mascher D. Juárez-Oropeza MA. Effects of dietary Spirulina

maxima on vasomotor responses of aorta rings from rats fed on a fructose-

rich diet. Nutr Res., 18, (1998) pp. 1769-1782


129

15. Lu J. Ren DF. Xue YL. Miyakawa T. Tanokura M. Isolation

of anantihypertensive peptide from alcalase digest of spirulinaplatensis.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58 (12), (2010), pp. 7166-7171

16. Gemma C. Mesches MH. Sepesi B. Choo K. Holmes DB. Bickford PC. Diets

enriched in foods with high antioxidant activity reverse age-induced decreases

in cerebellar beta-adrenergic function and increases in proinflammatory

cytokines. J Neurosci., 22, (2002) pp. 6114-6120

17. Hwang JH. Lee IT. Jeng KC. Wu SM. Chan YC. Spirulina prevents memory

dysfunction, reduces oxidative stress damage and augments antioxidant

activity in senescence-accelerated mice. Journal of Nutritional Science

and Vitaminology, 57 (2), (2011), pp. 186-191

18. Yakoot M. Salem A. Spirulinaplatensis versus silymarin in the treatment

of chronic hepatitis C virus infection. A pilot randomized, comparative clinical

trial. BMC Gastroenterology, (2012), 12:32

19. Hirahashi T. Matsumoto M. Hazeki K. Ui M. Seya T. Activation of the human

innate immune system by Spirulina: Augmentation of interferon production

and NK cytotoxicity by oral administration of hot water extract

of Spirulinaplatensis. International Immunopharmacology, 2 (4), (2002),

pp. 423-434

20. Cingi C. Conk-Dalay M. Cakli H. Bal C. The effects of Spirulina on allergic

rhinitis. Eur Arch Otorhinolaryngol, 265, (2008), pp. 1219-1223

21. Hayashi T. Hayashi K. Maeda M. Kojima I. Calcium Spirulan, an Inhibitor

of Enveloped Virus Replication, from a Blue-Green Alga Spirulinaplatensis.

J Nat Prod., 59 (1), (1996), pp. 83-7

22. Rechter S. König T. Auerochs S. Walter C. Marschall M. Antiviral activity

of Arthrospira-derived spirulan-like substances. Antiviral Research, 72 (3),

(2006), pp. 197-206

23. El-Baz FK. El-Senousy WM. El-Sayed AB. Kamel MM. In vitro antiviral

and antimicrobial activities of Spirulinaplatensis extract. Journal of Applied

Pharmaceutical Science, 3 (12), (2013), pp. 52-56

24. Mendiola JA. Jaime L. Santoyo S. Ibañez E. Señoráns FJ. Screening

of functional compounds in supercritical fluid extracts from

Spirulinaplatensis. Food Chemistry, 102 (4), (2007), pp. 1357-1367

25. Soltani M. Khosravi AR. Asadi F. Shokri H. Evaluation of protective efficacy

of Spirulinaplatensis in Balb/C mice with candidiasis. Journal

de MycologieMedicale, 22 (4), (2012), pp. 329-334

26. Pradhan J. Das BK. Sahu S. Mishra BK. Eknath AE. Traditional antibacterial

activity of freshwater microalga Spirulinaplatensis to aquatic pathogens.

Aquaculture Research, 43 (9), (2012), pp. 1287-1295

27. Ragap HM. Khalil RH. Mutawie HH. Immunostimulant effects of dietary

Spirulinaplatensis on tilapia Oreochromisniloticus. Journal of Applied

Pharmaceutical Science, 2 (2), (2012), pp. 26-31

28. Watanuki H. Ota K. Tassakka AC. Kato T. Sakai M. Immunostimulant effects

of dietary Spirulinaplatensis on carp, Cyprinuscarpio. Aquaculture, 258 (1-4),

(2006), pp. 157-163


130

29. Koníčková R. Vaňková K. Vaníková J. Wong RJ. Vítek L. Anti-cancer effects

of blue-green alga Spirulinaplatensis, a natural source of bilirubin-like

tetrapyrrolic compounds. Annals of Hepatology, 13 (2), (2014) pp. 273-283

30. Soheili M. Khosravi-Darani K. The potential health benefits of algae

and micro algae in medicine: A review on Spirulinaplatensis. Current

Nutrition and Food Science 7 (4), (2011), pp. 279-285

31. Saini MK. Sanyal SN. Targeting angiogenic pathway for chemoprevention

of experimental colon cancer using C-phycocyanin as cyclooxygenase-2

inhibitor. Biochemistry and Cell Biology, 92 (3), (2014), pp. 206-218

32. Bermejo-Bescós P. Piñero-Estrada E. Villardel Fresno AM. Neuroprotection

by Spirulinaplatensis protean extract and phycocyanin against iron-induced

toxicity in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Toxicol In Vitro, 22 (2008),

pp. 1496-1502

33. Mohamed WA. Ismail SA. El-Hakim YMA. Spirulinaplatensis ameliorative

effect against GSM 900-MHz cellular phone radiation-induced genotoxicity

in male Sprague-Dawley rats. Comparative Clinical Pathology, 23 (6), (2014),

pp 1719-1726

34. Hong-Quan Z. An-Ping L. Yun S. Yang-Mei D. Chemo- and radio-protective

effects of polysaccharide of spirulinaplatensis on hemopoietic system of mice

and dogs. ActaPharmacologicaSinica, 22 (12), (2001), pp. 1121-1124

35. Grawish ME. Zaher AR. Gaafar AI. Nasif WA. Long-term effect

of Spirulinaplatensis extract on DMBA-induced hamster buccal pouch

carcinogenesis (immunohistochemical study). Medical Oncology, 27 (1),

(2010), pp. 20-28

36. Ouhtit A. Ismail MF. Othman A. Al-Riyami H. Raj MHG. Chemoprevention

of rat mammary carcinogenesis by spirulina. American Journal of Pathology,

184 (1), (2014), pp. 296-303

37. Khan M. Shobha JC. Mohan IK. Kuppusamy P, Kutala VK. Protective effect

of Spirulina against doxorubicin-induced cardiotoxicity. Phytotherapy

Research, 19 (12), (2005), pp. 1030-1037

38. Simbre C. Duffy A. Dadlani H. Miller L. Lipshultz E. Cardiotoxicity of cancer

chemotherapy: Implications for children. Pediatr Drugs, 7 (2005), pp. 187-202

39. Mohan, I.K., Khan, M., Shobha, J.C., Kuppusamy, P., Kutala, V.K. Protection

against cisplatin-induced nephrotoxicity by Spirulina in rats. Cancer

Chemotherapy and Pharmacology, 58 (6), (2006), pp. 802-808

40. Yang F. Tang Q. Zhong X. Li Y. Zheng W. Surface decoration by Spirulina

polysaccharide enhances the cellular uptake and anticancer efficacy

of selenium nanoparticles. International Journal of Nanomedicine, 7 (2012),

pp. 835-844

41. Chamorro G. Salazar M. Salazar S. Teratogenic study of Spirulina in rats.

Arch Latinoam Nutr, 39 (1989), pp. 641-649.

42. Chamorro G. Salazar M. Teratogenic study of Spirulina in mice. Arch

Latinoam Nutr, 40 (1990), pp. 86-94

43. Salazar M. Chamorro GA. Salazar S. Steele CE. Effect of Spirulina maxima

consumption on reproduction and peri- and postnatal development in rats.

Food Chem Toxicol, 34 (1996), pp. 353-359


131

44. Johnson PE. Shubert LE. Accumulation of mercury and other elements

by Spirulina (cyanophyceae). Nutr Rep Int. 34 (1986), pp. 1063-1070

45. Rellán S. Osswald J. Saker M. Gago-Martinez A. Vasconcelos V. First

detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing

cyanobacteria. Food and Chemical Toxicology, 47 (9), (2009), pp. 2189-2195

46. McCarron P. Logan AC. Giddings SD. Quilliam MA. Analysis of β-N-

methylamino-L-alanine (BMAA) in spirulina-containing supplements by liquid

chromatography-tandem mass spectrometry. Aquatic Biosystems, (2014), 10:5

Spirulina - history, composition and health promoting properties

Summary:

Spirulina is a commercial product obtained from free-living in the water column

representatives of blue-green algae (cyanobacteria) of the genus Arthrospira, used asa dietary supplement. Because of the nutritional and health-promoting potential it enjoys

considerable interest both consumers and scientists now. In the spirulina was found

the c-phycocyanin, β-carotene, vitamins, specific fatty acids, peptides and proteins

and minerals. Numerous studies have shown that taking this supplement has a beneficial effect on the human cardiovascular and immune system, and also reduces the risk

of developing cancer. Therefore, in recent years there has been intensive development

of both production facilities, as well as spirulina processing. Recently created a series

of research describing the beneficial effects of spirulina on the human body, resulting from its consumption. The purpose of this study was to describe a dietary supplement that

is spirulina and bringing its possible impact on the healthy human body including the current

literature.

132

Paulina Syryjczyk1, Paulina Miziak

1, Julita Kołodziejczyk

1, Marta Fiołka

2,

Krzysztof Grzywnowicz3

Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej

u dżdżownic

Dżdżownice odgrywają ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu

ekosystemu pomagając w recyklingu martwego materiału roślinnego poprzez jego przetwarzanie. Dżdżownice są bogatym źródłem aktywności

przeciwbakteryjnej, przeciwgrzybowej i przeciwnowotworowej. Aktywność

przeciwgrzybowa u dżdżownic opisywana jest głównie w odniesieniu

do ekstraktów z całych zwierząt. Innym źródłem tej aktywności mogą być bakterie związane z jelitem tych bezkręgowców. Celem pracy była analiza

badań dotyczących pozyskiwania związków przeciwgrzybowych

z organizmu dżdżownic. Analizę przeprowadzono na podstawie dostępnej

literatury tematycznej w oparciu o najnowsze publikacje opisujące pozyskiwanie związków przeciwgrzybowych z dżdżownic. Ekstrakty

do izolacji związków przeciwgrzybowych były przygotowywane na bazie

roztworów wodnych i alkoholowych. Metabolity bakterii jelitowych

rozdzielano metodą chromatografii jonowymiennej. Aktywność przeciwgrzybowa była określana metodami mikrobiologicznymi w stosunku

do różnych szczepów. Ekstrakty z dżdżownic działają przeciwgrzybowo

w stosunku do szczepów Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,

Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium notatum, Trichophyton rubrum. Metabolity Pseudomonas strutzeri z jelita Eisenia foetida dodatkowo

są aktywne przeciw Fusarium oxysporum, F. solani, F. moniliformae,

F. udum, Macrophomena phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum

capsicii, Metabolity Raoultella ornithinolytica z jelita Dendrobaena veneta

działają przeciwko C. albicans. Antagonistyczne mikroorganizmy przez

swoje interakcje z różnymi patogenami odgrywają ważną rolę w utrzymaniu

równowagi mikrobiologicznej. Są istotnym czynnikiem w eliminacji

drobnoustrojów chorobotwórczych. Na podstawie przeanalizowanych badań można stwierdzić, że aktywność metabolitów bakterii związanych z jelitem

dżdżownic jest obiecującym źródłem związków przeciwgrzybowych

do zwalczania zarówno chorób roślin jak i chorób u ludzi.

1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”,

Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,

Polska 2 Zakład Immunobiologii Instytut Biologii i Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-

Skłodowskiej w Lublinie, Polska 3 Zakład Biochemii, Instytut Biologii i Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej

w Lublinie, Polska


Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic

133

1. Wstęp

Dżdżownice to organizmy występujące w glebie, wchodzące w skład

edafonu. Ich działalność w łańcuchu pokarmowym opiera się na recyklingu

martwego materiału roślinnego, którym się żywią. Dzięki temu odgrywają

ogromną rolę w użyźnianiu gleby [1]. Poprzez występowanie w środowisku

bogatym w przeróżne drobnoustroje, dżdżownice w toku ewolucji rozwinęły

mechanizmy obronne, które pozwoliły im przetrwać [2]. Okazuje się, że

substancje występujące w ich organizmie mają działanie przeciwbakteryjne

i przeciwgrzybowe. Wyciągi z tych zwierząt były znane medycynie

orientalnej jako środki przeciwbólowe, przeciwgorączkowe oraz

przeciwzapalne. Na przestrzeni lat istotne dla ludzkości okazały się właś-

ciwości przeciwnowotworowe tych organizmów, polegające na zapobieganiu

zbyt intensywnej absorpcji glukozy. Celem pracy była analiza badań

dotyczących pozyskiwania związków przeciwgrzybowych z organizmu

dżdżownic, które wykazały, iż substancje wchodzące w skład tych

bezkręgowców uniemożliwiają rozwój poszczególnych gatunków bakterii

oraz grzybów. Ze względu na małą szkodliwość i stosunkowo łatwą

dostępność materiału biologicznego, jakimi są dżdżownice, możliwe było

przeprowadzenie szeregu badań dotyczących ich działania na takie gatunki

bakterii jak Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens czy Escherichia

coli oraz grzybów: Aspergillus niger i Candida albicans. Gatunkami

dżdżownic wykorzystywanymi powszechnie w badaniach są Mauriti lampito

i Eudrilus eugeniae, jak również Eisenia fetida. Ekstrakty bądź puder

pochodzące z tych dżdżownic wykazywały silne działanie antybakteryjne

i antygrzybicze. Dla człowieka istotny jest negatywny wpływ wyciągów

z dżdżownic na gatunek grzyba Candida albicans [1, 5].

Gatunek Candida albicans odpowiedzialny jest za ok. 70-90% grzybic

występujących u człowieka. Mimo rozwoju medycyny i dostępie do wielu

różnorodnych antybiotyków liczba kandydoz w ostatnich latach zwiększyła

się. Wśród wielu czynników sprzyjających wystąpieniu zakażeń grzybami,

obok upośledzenia układu immunologicznego, są zabiegi chirurgiczne oraz

współistniejące choroby takie jak cukrzyca i gruźlica, w których dochodzi

do immunosupresji. Zakażenia grzybicze stanowią istotny problem

u biorców przeszczepu narządów unaczynionych i szpiku. Infekcja

drożdżakowa błony śluzowej jamy ustnej i dróg oddechowych stanowi

najczęstsze zakażenie oportunistyczne u pacjentów z AIDS. Pomimo

postępu w opiece medycznej uogólnione infekcje grzybicze są nadal

istotnym zagrożeniem dla życia i zdrowia noworodków urodzonych przed-

wcześnie. W związku z niewielką liczbą antybiotyków przeciwgrzybiczych

ważne jest poszukiwanie nowych związków przeciwgrzybowych o efek-

tywnym działaniu i znikomej toksyczności.

Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk,

Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz

134

Okazuje się, że pomocne w zwalczaniu grzyba Candida albicans mogą

być dżdżownice. Aktywność przeciwgrzybowa u dżdżownic opisana jest

głównie w odniesieniu do ekstraktów z całych zwierząt, chociaż jej

źródłem mogą być także bakterie występujące w jelicie tych organizmów

glebowych. Określenie aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybowej

polega na mierzeniu średnicy zahamowania wzrostu danego szczepu.

Badania przeprowadzane są z wykorzystaniem ekstraktów z organizmów

całych dżdżownic, przygotowanych na bazie roztworów wodnych lub

alkoholowych, jak również otrzymywane są z nich pasty i pudry.

W badaniach wykorzystywane zostały też metabolity bakterii związanych

z jelitem tych bezkręgowców, które frakcjonowano za pomocą chroma-

tografii jonowymiennej. Aktywność przeciwgrzybowa określana jest przy

zastosowaniu metod mikrobiologicznych. Do testów stosowane są różne

szczepy bakterii oraz grzybów, w tym Candida albicans [1].

2. Ekstrakt etanolowy jako silny środek przeciwgrzybowy

Ekstrakt etanolowy z dżdżownicy działał na Candida albicans

wykazując istotną aktywność przeciwgrzybową. Średnica zahamowania

wzrostu szczepu Candida wynosiła 15 mm, zaś Aspergillus 12 mm.

Wykorzystanie ekstraktu naftowego pozwala zauważyć, iż wykazuje

on znacznie mniejszą, wręcz znikomą aktywność przeciwgrzybową.

Całkowity brak aktywności przeciwgrzybowej odnotowano w przypadku

ekstraktu w buforze fosforanowym. W przeprowadzanych badaniach

kontrolą pozytywną był fuconazol (1mg/ml), który charakteryzował

się dużą aktywnością przeciwko wszystkim badanym gatunkom grzybów.

W badaniach przeprowadzonych przez Mathur i in [1] dowiedziono, iż 95%

ekstrakt etanolowy z dżdżownic działał silnie jako środek przeciw-

grzybowy w stosunku do C. albicans. Zastosowanie ekstraktu naftowego

nie dało oczekiwanych wyników, w związku z czym okazał się on słabiej

działającym środkiem antygrzybowym. Wyciąg z dżdżownicy w buforze

fosforanowym nie wykazywał jakichkolwiek właściwości przeciw-

grzybowych, jak również przeciwbakteryjnych [1].

3. Pasta wykonana z dżdżownic i jej działanie na Candida albicans

Oprócz ekstraktów powszechne w badaniach nad aktywnością

przeciwdrobnoustrojową są pasty wykonane z dżdżownic. Gatunkiem

dżdżownicy, z którego otrzymuje się pasty jest Eudrilus eugeniae.

W doświadczeniach wykonanych przez Vasanthi i in [2] wykorzystano

ww. gatunek bezkręgowca, a otrzymaną pastą działano na pięć wybranych

szczepów bakterii i dwa szczepy grzybów. Hodowle bakteryjne


135

przygotowane były na skosach agarowych zawierających odpowiednio

dobrane składniki, zaś hodowle grzybów przygotowane na skosach

agarowych z dodatkiem dekstrozy utrzymywane w temperaturze 4°C.

Szczepami wykorzystanymi do badań były: Candida albicans, Aspergillus

niger, Trichophyton niger, Aspergillus flavus i Penicillium notatum. Ilości

pasty stosowanej w doświadczeniu to 50 i 100

mikrolitrów. Opracowane wyniki opierały się na 3 powtórzeniach i przy

użyciu próby kontrolnej, którą była nystatyna. W badaniach wykazano,

że działanie przeciwgrzybowe zależne było od dawki pasty. Spośród

przebadanych szczepów dawka 100 mikrolitrów działała najsilniej,

zaś najbardziej podatny na działanie tego preparatu był gatunek C. albicans.

Mniej podatne na obecność pasty z dżdżownic okazał się gatunek

Trichophyton rubrum [2]. Przygotowanie pasty rozpoczyna się od mycia

dżdżownic po bieżącą wodą. Następnie karmi się je wilgotną bibułą przez

18-20 godzin, w celu oczyszczenia jelit. Po upływie tego czasu ponownie

myje się organizmy, tym razem w destylowanej wodzie. Dżdżownice

układa się w plastikowych rynienkach i wystawia na działanie promieni

słonecznych przez 3 dni, w tym czasie powinny całkowicie wyschnąć.

W czasie tego procesu śluz i płyn celomatyczny trawi martwe organizmy,

co nadaje produktowi brązowy kolor. Z wysuszonych dżdżownic

przygotowuje się pastę, którą przesączano, a następnie skraplano w łaźni

wodnej w temperaturze 35°C. Tak powstała surowa pasta, którą

rozcieńczano w 10% DMSO, w celu oceny aktywności przeciwgrzybowej [2].

4. Porównanie aktywności przeciwgrzybowej pudru przygotowanego

z dżdżownicy Lampito mauritii, Eudrilus eugeniae oraz Eisenia fetida

Kolejne badania potwierdzające aktywność przeciwgrzybową

u dżdżownic, to badania wykorzystujące puder z tych organizmów.

Gatunkiem, wykorzystywanym do otrzymywania pudru jest Lampito

mauritii. Wysuszony proszek z tych dżdżownic jest dodawany

do roztworów różnych rozpuszczalników. Badania z użyciem pudru

podobnie jak te wykorzystujące ekstrakty oraz pasty wykazują najsilniejszą

aktywność przeciwgrzybową w stosunku do Candida albicans.

W doświadczeniu próbą kontrolną o maksymalnej aktywności przeciw-

grzybowej była erytromycyna [3].

Początkowe procesy przygotowania pudru z dżdżownicy Lampito

mauritii nieco różniły się od procesu tworzenia pasty. Organizmy myje

się pod bieżącą wodą, by usunąć zanieczyszczenie z powierzchni ciała.

Następnie przez 6-8 godzin moczy się je w wodzie destylowanej,

co ma na celu usunięcie gleby z jelit. Dżdżownice przemywa się wodą

destylowaną i układa na płytce Petriego. Umieszcza się ją w inkubatorze



136

nastawionym na 55°C na 24 godziny. Po tym czasie zbiera się suche

dżdżownice i uciera na jednolity puder. Testy wykonywane na Candida

i Aspergillus przez Bhorgin i Uma [3] wykazały zahamowanie wzrostu

o średnicy 12 mm dla Candida albicans oraz 9 mm dla Aspergillus niger.

Okazuje się, iż ekstrakt etanolowy z dżdżownicy w proszku jest skuteczny,

zaś ekstrakt z eterem naftowym dżdżownicy w proszku nie wykazuje

właściwości przeciwgrzybowych w stosunku do badanych gatunków

grzybów [3].

Puder antygrzybowy otrzymano również z dżdżownic należących

do gatunku Eudrilus eugeniae. Badania przeprowadzane przez Anitha

i Jayraaj [4] skupiały się zarówno na aktywności przeciwbakteryjnej

i przeciwgrzybowej, jak również na występowaniu flawonoidów i fenoli

w masie pudru. Preparaty bogate we flawonoidy będące składnikami

aktywnymi fizjologicznie były stosowane w zwalczaniu wielu chorób.

Podczas badań wyizolowano flawonoidy o określonych strukturach

posiadające właściwości przeciwbakteryjne i cytotoksyczne. Badania te

skupiały się na sporządzaniu proszku i jego wykorzystaniu do wytwarzania

nowych preparatów leczniczych. W celu przygotowania próbki dżdżownice

przemywano wodą, aby usunąć zanieczyszczenia. Dalej umieszczano

na 1-2 godziny w 0,5% NaCl w temperaturze pokojowej, tak aby oczyścił

się system trawienny bezkręgowca. Następnie zwierzęta dzielono

nożyczkami, odważano po 3 gramy tkanki dżdżownicy, homogenizowano

w 40 ml mieszaniny chloroform-metanol (w stosunku 1:2) i uzyskany

roztwór na noc umieszczano w temperaturze 4°C. Po tym czasie dodawano

wodę destylowaną do homogenizacji, całość mieszano i wirowano.

Po odparowaniu w wyparce rotacyjnej otrzymany płyn o pH 7 został

zliofilizowany na proszek.

W powyższych badaniach wykorzystano wiele szczepów bakterii oraz

pięć szczepów grzybów. Testowanymi gatunkami były: Aspergillus

alternate, Aspergillus niger, Candida albicans, Curvularia lunata oraz

Fusarium solani [4]. Interesującym etapem badań nad aktywnością

przeciwbakteryjną i przeciwgrzybową pudru z Eudrilus eugeniae było

oszacowanie zawartości flawonoidów i fenoli. Zawartość flawonoidów

określano mierząc absorbancję wcześniej odpowiednio przygotowanego

roztworu przy długości fali 506 nm. W celu określenia zawartości

całkowitej fenolu zmieszano bufor z próbką badaną (1mg/ml).

Po 5 minutach dodawano 7% roztwór węglanu sodu, a następnie wodę

destylowaną. Taką mieszaninę przechowywano w ciemności przez okres

90 minut w temperaturze 23°C i następnie odczytywano absorbancję przy

długości fali 750nm [4].


137

Aktywność pudru z Eudrilus eugeniae była sprawdzana na w stosunku

do 15 gatunków bakterii: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis,

Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus

mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

parathypi, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

faecalis, Staphylococcus pyogenes. Najbardziej podatny na puder okazał

się szczep Staphylococcus ureus. Wrażliwością charakteryzowały

się również gatunki Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Proteus

vulgaris, Streptococcus pyogens czy Klebsiella pneumoniae. Niewrażliwe

na działanie pudru z dżdżownicy były gatunki: Enterococcus faecalis,

Salmonella parathypi, Serratia marcescens, Streptococcus faecalis [4].

Jednocześnie puder otrzymywany z Eudrilus eugeniae wykazywał

działanie przeciwgrzybowe w stosunku do wszystkich testowanych

gatunków grzybów patogennych. Najsilniejsze działanie zaobserwowano

w stosunku do Candida albicans oraz Aspergillus flavus.

Badania nad obecnością flawonoidów i fenoli pozwoliły zauważyć,

iż w pudrze występują związki lityczne. Doprowadziło to powstania

hipotezy o wykorzystaniu tego środka jako antybiotyku. Doświadczenia

prowadzone przez Anitha i Jayraaj [4] potwierdziły wcześniejsze wyniki

mówiące o aktywności przeciwbakteryjnej płynu jamy ciała dżdżownic

Eudrilus eugeniae, który najsilniej oddziałuje na Staphylococcus aureus

i Klebsiella pneumoniae [4].

Fenole i flawonoidy należą do metabolitów wtórnych, wykazują działanie

antyoksydacyjne. Są istotne w procesach żywieniowych, mają duże

znaczenie dla zdrowia człowieka. Związki te są przede wszystkim

pochodzenia roślinnego, w mniejszym stopniu analizuje się fenole

i flawonoidy otrzymywane ze zwierząt. Wobec powyższych danych

obecność flawonoidów i fenoli w pudrze może zostać wykorzystana

w procesie tworzenia antybiotyków o szerszym spektrum działania, zarówno

na choroby wywoływane przez bakterie jak i różnego rodzaju grzybice.

Produkowane leki charakteryzowałyby się mniejszą toksycznością

i obniżonym do minimum ryzykiem pojawienia się oporności patogenów na

środek pochodzący z dżdżownicy [4].

Testy wykonywane przy użyciu pudru dżdżownic Eisenia fetida

wykazały warunki, w których najbardziej zauważalna była aktywność

przeciwgrzybowa wobec Candida albicans, przy czym bardziej efektywny

okazał się roztwór wodny, niż acetonowy [5]. Porównując pastę i puder

pochodzące z dżdżownic można zauważyć podobieństwo polegające

najednakowej wrażliwości grzyba Candida na oba środki przeciwgrzybowe.



138

5. Bakterie jako źródło aktywności antygrzybowej dżdżownic

Kolejnym czynnikiem o aktywności antygrzybowej są bakterie

izolowane z jelita dżdżownic. Badania prowadzone przez Prasanna i in [6]

umożliwiły wyizolowanie i rozpoznanie bakterii żyjących w jelitach tych

bezkręgowców. Na podstawie badań biochemicznych i porównania

sekwencji 16S rDNA zidentyfikowano bakterie z gatunku Pseudomonas

stutzeri szczep EGB3. W celu molekularnego scharakteryzowana szczepu

EGB3 przeprowadzono szereg etapów, w tym: ekstrakcje genomowego

DNA EGB3, elektroforezę na żelu agarozowym, sekwencjonowanie DNA,

amplifikację DNA 16S rybosomu, oczyszczanie produktu PCR,

sekwencjonowanie 16S rDNA, analizę filogenetyczną. Fitopatogenne

grzyby zawarte w glebie, takie jak Fusarium oxysporum, Fusarium solani,

Fusarium moniliforme, Fusarium udum, Macrophomina phaseolina,

Rhizoctonia solani, Colletotrichum capsicii, Aspergillus flavus

i Aspergillus niger były wrażliwe na działanie przeciwgrzybowych

metabolitów wytwarzanych przez EGB3. Badania wykonywane przez

Prasanna i in [6] wykazały działanie antygrzybowe skierowane przeciwko

chorobotwórczym gatunkom grzybów atakujących rośliny. W celu

otrzymania homogenatu stosowano warunki aseptyczne. Dżdżownice

po przemyciu głodzono przez okres 24 godzin, tak aby wyeliminować

mikroorganizmy związane z glebą i inne organiczne szczątki w jelitach.

Po tym czasie przemywano dżdżownice jałową wodą podwójnie

destylowaną, dalej izolowano jelito. Zawartość zbierano i po zważeniu

mieszano z buforem do homogenizacji przez 5 minut przy użyciu

mieszadła magnetycznego. Kolejnym etapem było wirowanie przy 10000

obrotach na minutę przez okres 15 minut. Zebrany supernatant posłużył

do dalszych analiz [6].

Istotne również okazało się potwierdzenie przeciwgrzybowych

właściwości bakterii pochodzących z jelita dżdżownic. Spośród badanych

szczepów największą wrażliwością wykazały się gatunki grzybów:

Fusarium oxsysporum, Fusarium udum, Fusarium solani i Fusarium

moniliforme. Kluczowe okazało się scharakteryzowanie związku

przeciwgrzybowego. Wstępne badania przesiewowe zostały przepro-

wadzone na pożywce PDA bez dodatku chlorku żelaza III. Warunki te

umożliwiłyby hamowanie wzrostu grzybów poprzez obecność

wytworzonych sideroforów lub metabolitów. Właściwość antygrzybową

tych substancji potwierdzano poprzez trzykrotne powtórzenie ekspert-

mentu z udziałem EGB3 na płytkach agarowych z dekstrozą ziemniaczaną

i dodatkiem 1% chlorku żelaza metodą dyfuzyjną. Brak hamowania na

płytkach PDA z dodatkiem 1% chlorku żelaza oznaczał, iż działały

siderofory. Aktywność przeciwgrzybową badano pod kątem termosta-


139

bilności oraz działano na środek przeciwgrzybowy enzymem, sprawdzano

również jak czas wpływa na jego właściwości [6]. Badania wykonywane na

tkankach pochodzących z dżdżownic również wykazały aktywność

przeciwgrzybową. Doświadczeń z udziałem tkanek podjął się Chauhan i in

[7], a gatunkiem dżdżownicy stosowanym w badaniach był Eudrilus

eugeniae. Jako próbę kontrolną o maksymalnej aktywności stosowano

antybiotyk- fluconazol o stężeniu 5mg/ml. Płytki inkubowano w tempe-

raturze 20°C przez okres 72 godzin [7].

Z jelita dżdżownic Dendrobaena veneta [Zdjęcie 1] bakterię Raoultella

ornithinolytica związaną ze ścianą jelita środkowego, której metabolity

charakteryzowały się aktywnością skierowaną na C. albicans.

Wyizolowana bakteria jest najprawdopodobniej symbiontem tego gatunku

dżdżownicy, gdyż stwierdzono jej obecność u 40 osobników, po zabiegu

oczyszczania jelita poprzez karmienie przez 3 doby jałową bibułą

filtracyjną. Metabolity bakterii wysalono siarczanem amonu przy

wysyceniu do 90%, a następnie rozdzielano przy zastosowaniu ultrafiltracji

z punktem odcięcia 100 kDa. Wysokocząsteczkowe metabolity (o masie

powyżej 100 kDa) płynu pohodowlanego bakterii R. ornithinolytica

rozdzielano przy zastosowaniu chromatografii jonowymiennej na złożu

DEAE-Sepharose, a następnie poddawano filtracji żelowej [8, 9].

Zdjęcie 1. Dżdżownice Dendrobaena veneta, fot. M. Fiołka

Otrzymany kompleks glikoproteinowy, wykazywał działanie na komórki

C. albicans. Po inkubacji z aktywnym związkiem, przy zastosowaniu

mikroskopii świetlnej oraz elektronowej, obserwowano obniżenie aktywności

metabolicznej oraz zmiany morfologiczne komórek grzyba. Obserwacje

mikroskopowe pozwoliły stwierdzić deformacje komórek, tworzenie się

aglomeratów wielokomórkowych oraz łańcuszków zbudowanych z kilku

połączonych ze sobą komórek. Specyficzne barwienie komórek poddanych



140

działaniu otrzymanego kompleksu potwierdziło występowanie amyloidu jako

charakterystycznej substancji międzykomórkowej [10].

Działanie na C. albicans wykazywał również płyn celomatyczny

D. veneta. Badania wstępne pozwoliły zaobserwować zmianę morfologii

komórek grzyba, różnice w grubości ściany komórkowej i tendencję

do tworzenia skupisk komórek pod wpływem działania płynu

celomatycznego [Zdjęcie 2]. Analiza przy zastosowaniu skaningowej

mikroskopii elektronowej wykazała również rozpad komórek grzyba jako

efekt inkubacji z płynem jamy ciała dżdżownicy [Zdjęcie 3].

A B

DC

Zdjęcie 2. A,B- komórki hodowli kontrolej C. albicans, C,D- komórki C. albicans po 48h

inkubacji z płynem celomatycznym dżdżownic D. veneta; znacznik odpowiada 5µm. Obraz

mikroskopowy po zabarwieniu komórek fluorochromem Calcofluor- White.


141

A B

Zdjęcie 3.A- komórki hodowli kontrolej C. albicans, komórek kontrola hodowli C. albicans,

B- komórki C. albicans po 48h inkubacji z płynem celomatycznym dżdżownic D. veneta;

znacznik odpowiada 5µm. Obraz uzyskany po analizie skaningowym mikroskopem

elektronowym.

6. Podsumowanie

Środki otrzymywane z dżdżownic mogą okazać się szansą w leczeniu

kandydoz oraz chorób bakteryjnych. W ostatnich latach mikroorganizmy

nabrały oporności na działanie powszechnie stosowanych antybiotyków.

Dlatego tak ważne staje się stosowanie nowoczesnych metod zwalczania

patogenów. Rozwój badań z wykorzystaniem dżdżownic pozwolił

na pozyskiwanie substancji pod różnymi postaciami – pudrów, past

i ekstraktów co zwiększyło możliwości nad badaniem najbardziej

skutecznych postaci środków przeciwgrzybowych. Uwagę zwrócono

również na bakterie występujące w jelicie dżdżownic, które również

wykazywały właściwości przeciwgrzybowe.

Sukcesem okazuje się silne oddziaływanie ww. środków na Candida

albicans jak również jej podatność na obecność substancji otrzymywanych

z dżdżownic. Najpowszechniej analizowany pod tym kątem jest gatunek

Eudrilus eugeniae. Pomimo rozwoju medycyny kandydozy są dalej

chorobami ciężkimi do zwalczania i wymagającymi niejednokrotnie

stosowania leków wywołujących wiele niekorzystnych skutków

ubocznych. Większość kandydoz jest wywoływanych właśnie przez

Candida albicans, dlatego tak istotne są dalsze badania i doświadczenia

prowadzące do otrzymania skutecznego i bezpiecznego leku skierowanego

przeciwko temu gatunkowi grzyba.



142

Literatura

1. Mathur A., Verma S. K., Bhat R., Singh S. K., Prakash A., Prasad G.B.K.S,

Dua V.K., Antimicrobial activity of earthworm extracts, Journal of Chemical

and Pharmaceutical Research, 2 (2010), pp. 364-370

2. Vasanthi K., Chairman K., Ranjit Singh A. J. A., Antimicrobial activity

of earthworm (Eudrilus eugeniae) paste, African Journal of Environmental

Science and Technology, 7 (2013), pp. 789-793

3. Bhorgin A. J., Uma K., Antimicrobial activity of earthworm powder (Lampito

mauritii), International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences,

3 (2014), pp. 437-443

4. Anitha J., Jayraaj I. A., In-vitro antibacterial activity and evaluation

of flavonoid and phenol in earthworm powder(Eudrilus eugeniae), World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2 (2013), pp. 4917-4928

5. Ansari A. A., Sitaram K., An Investigation into the anti-microbial and anti-

fungal properties of earthworm powder obtained from Eisenia fetida,

American Journal of Food Technology, 6 (2011), pp. 329-335

6. Prasanna N. D., Vijayalakshmi K., Seshagirirao K., Shaheen S. K.,

Characterization of antifungal compounds produced by Pseudomonas stutzeri

(EGB3) isolated from gut of earthworm (Eisenia foetida), Journal

of Microbiology and Antimicrobials, 6 (2011), pp. 57-65

7. Chauhan P. S., Tomar J., Prasad G. B. K. S., O. P. Agrawal, Evaluation

of antimicrobial activity if earthworm tissue extract of Eudrilus eugeniae,

Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 6 (2014), pp. 28-38

8. Fiołka M. J., Grzywnowicz K., Chlebiej K., Szczuka E., Mendyk E., Keller

R., Rzymowska J., Anti-Candida albicans action of the glyco-protein complex

purified from metabolites of gut bacterium Raoultella ornithinolytica isolated

from earthworms Dendrobaena veneta, Journal of Applied Microbiology,

113 (2012), pp. 1106-1119

9. Fiołka M., Grzywnowicz K., Chlebiej K., Nowak A., Keller R., Rzymowska

J., Mendyk E., Aktywność anty-Candida albicans kompleksu gliko-

proteinowego otrzymanego z metabolitów bakterii Raoultella ornithinolytica

wyizolowanej ze ściany jelita dżdżownic Dendrobaena veneta, Sepsis,

5 (2012), pp. 223-228

10. Fiołka M. J., Lewtak K., Rzymowska J., Grzywnowicz K., Hułas-Stasiak

M., Sofińska-Chmiel W., Skrzypiec K., Antifungal and anticancer effects

of a polysaccharide-protein complex from the gut bacterium Raoultella

ornithinolytica isolated from the earthworm Dendrobaena veneta, Pathogens

and Disease, 69 (2013), pp. 49-61

Different sources of antifungal activity in earthworms

Earthworms play an important role in the proper functioning of the ecosystem. They are helping in recycling dead plant material through processing it, increasing soil fertility.

Earthworms are rich source of antibacterial, antifungal and antitumor activity.

The antifungal activity of earthworms is described mainly in relation to extracts of whole


143

animals. The other source of this activity could be bacteria associated with the intestine

of these invertebrates. The aim of the study was to analyze obtaining of antifungal

compounds from the body of earthworms. The analysis was conducted on the basis

of the most recent publications describing the acquisition of antifungal compounds from earthworms. The extracts for isolation of antifungal compounds were prepared from aqueous

and alcoholic solutions. The metabolites from intestinal bacteria were separated by ion

exchange chromatography. Antifungal activity was determined by microbiological methods

relative to different strains. The extracts of earthworms had antifungal activity against strains like Candida albicans,

Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium notatum, Trichophyton

rubrum. The metabolites of Pseudomonas strutzeri from intensine Eisenia foetida were

additionally active against Fusarium oxysporum, F. solani, F. moniliformae, F. udum, Macrophomena phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum capsicii. The metabolites

ofRaoultella ornithinolytica from intenstine of Dendrobaena veneta showed activity against

C. albicans. Antagonistic micro-organisms through its interactions with various pathogens

play an important role in holding microbiological balance. They are significant factor in the elimination of pathogenic microorganisms. On the basis of the analyzed study

it can be concluded the activity of the metabolites of bacteria associated with the gut

earthworms is promising source of antifungal compounds to fight against both plant

and human diseases.

144

Michał Chojnacki1, Maciej Frant

1,2, Mateusz Pięt

1,2, Adrian Zając

1

Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów

jadalnych występujących na terenie polskich lasów

Właściwości dziko rosnących grzybów jadalnych były od wieków doceniane i wykorzystywane w medycynie naturalnej. Już wtedy było wiadomo,

że ich spożywanie w różnych postaciach (jako dodatki do potraw, napary

z suszonych owocników, itp.) ma pozytywny wpływ na zdrowie człowieka.

Do niedawna twierdzono, iż grzyby pozbawione są wszelkich wartości odżywczych. Jednak najnowsze badania z ostatnich kilkunastu lat dowodzą,

że grzyby wielkoowocnikowe (Macromycetes) posiadają szereg biologicznych

aktywności, takich jak: przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe, przeciw-

zapalne, przeciwgrzybiczne czy obniżające poziom cholesterolu. Ponadto, zaobserwowano, że produkują także takie substancje odżywcze, jak: łatwo

przyswajalne białka, wszystkie aminokwasy z grupy egzogennych, witaminy,

mikro- i makroelementy. Z tego powodu, coraz częściej prowadzi się badania

nad popularnie zbieranymi i spożywanymi grzybami z lasów europejskich (w tym z Polski). Mają one na celu obalenie popularnego mitu dotyczącego

grzybów jako wyłącznie dodatku poprawiającego smak i aromat potraw.

Celem poniższej pracy jest przedstawienie wybranych gatunków grzybów

powszechnie rosnących w polskich lasach: Boletus edulis, Boletus badius, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus jako dobre źródło substancji

mających wartości odżywcze i wykazujących właściwości prozdrowotne.

1. Wstęp

Grzyby należą do królestwa organizmów powszechnie występujących

na całym świecie, we wszystkich strefach klimatycznych. Takson ten jest

niejednorodny, w jego skład wchodzą różne organizmy, od jednoko-

mórkowych, poprzez formy komórczakowe, do wielokomórkowych.

Grzyby są cudzożywne, niezdolne do aktywnego ruchu, a ich ściana

komórkowa zbudowana jest głównie z chityny [5]. Z uwagi na walory

smakowe, zapachowe oraz odżywcze, obiektem szczególnych zainte-

resowań jest grupa jadalnych podstawczaków. Walory odżywcze przez

wieki były niedoceniane, jednak szczegółowe badania z ostatniej dekady

wykazały, że grzyby są bogatym źródłem, m.in. łatwo przyswajalnych

aminokwasów, witamin (głównie z grupy B) oraz makro- i mikro-

1 Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „MIKRON”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, [email protected],

[email protected] 2 Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii

Curie-Skłodowskiej w Lublinie, [email protected], [email protected]



Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie

polskich lasów

145

elementów. W ostatnich latach stwierdzono również występowanie w ich

owocnikach szeregu substancji o silnych właściwościach bioaktywnych.

Substancje te wykazują również prozdrowotny wpływ na organizm

człowieka.

Polska należy do krajów, w których od wieków owocniki grzybów

dziko rosnących były powszechnie spożywane pod różnymi postaciami.

Do najpopularniejszych i wysoko cenionych ze względu na swoje rozliczne

walory zaliczane są m.in. grzyby z rodzaju Boletus, takie jak borowik

szlachetny czy podgrzybek brunatny oraz blaszkowe grzyby z pieprznikiem

jadalnym i mleczajem rydzem na czele [1, 2, 3].

2. Borowik szlachetny (Boletus edulis)

Borowik szlachetny (Boletus edulis), często nazywany w Polsce

prawdziwkiem, jest jadalnym grzybem należącym do rodziny

borowikowatych (Boletaceae), występującym powszechnie zarówno

w lasach liściastych, iglastych, jak i mieszanych. Pomimo faktu,

że wchodzi on w mikoryzę z wieloma gatunkami drzew, najczęściej jego

grzybnia łączy się ze świerkami. Borowik szlachetny wytwarza owocniki

w okresie od lipca do listopada i harakteryzuje się znakomitymi walorami

smakowymi, do czego przyczynia się aromatyczny i zwarty miąższ [2].

Wygląd prawdziwka przedstawiono na rysunku 1.

Fot.1. Borowik szlachetny (Boletus edulis) w naturalnym środowisku [źródło własne

fot. M. Frant]


146

Sucha masa prawdziwka, podobnie jak u większości grzybów, składa

się głównie z węglowodanów (65,4%), wśród których dominuje chityna.

Borowik ten zawiera również duże ilości mannitolu oraz trehalozy [2, 4].

Boletus edulis wyróżnia się na tle innych grzybów dużą zawartością białka,

która może dochodzić nawet do 33,1% suchej masy [2, 5]. Borowik

szlachetny, podobnie jak inne grzyby, zawiera niewielkie ilości tłuszczy,

z których zdecydowaną większość stanowią kwasy tłuszczowe nienasycone

(kwas linolenowy – 42%, kwas oleinowy – 36,1%, kwas palmitynowy –

9,8%) [2]. Grzyb ten jest również cennym źródłem witamin, takich jak: B1,

B2, B3, B6, E, C [2, 4]. Dla prawidłowego funkcjonowania ludzkiego

organizmu niezwykle istotne są makro- i mikroelementy, które można

odnaleźć w owocnikach borowika szlachetnego. Są to m.in. jony wapnia,

magnezu, cynku, żelaza, miedzi oraz niewielkie ilości manganu [2].

Boletus edulis oprócz wyżej wymienionych substancji charakteryzuje

się zawartością szeregu bioaktywnych substancji o właściwościach

prozdrowotnych, w tym przeciwnowotworowych. Były one już znane

w połowie XX wieku, jednak badania nad aktywnością poszczególnych

związków i grup związków z niego izolowanych są domeną ostatnich lat

[3]. Pierwszą taką grupą substancji są polisacharydy, o właściwościach

immunostymulujących, przeciwnowotworowych, hipoglikemicznych oraz

antyoksydacyjnych. W grupie tych związków szczególną rolę odgrywają

β-glukany występujące u borowika szlachetnego. Największą aktywność

przeciwnowotworową wykazują wielkocząsteczkowe β-glukany z przewagą

wiązań β-(13) [3, 4, 5]. Ergosterol powszechnie występujący u grzybów,

w znacznych ilościach obecny jest również w owocnikach prawdziwka.

Oprócz podstawowej formy tego sterolu u Boletus edulis występuje on

również w formie pochodnej, czyli nadtlenku ergosterolu. Jest to steroid

o szerokim spektrum aktywności biologicznej, m.in. przeciwbakteryjnej,

przeciwzapalnej oraz cytotoksycznej, ocenianych w testach in vitro

w stosunku do różnych linii nowotworowych [6]. Nadtlenek ergosterolu,

obecny w borowiku, wykazuje aktywność przeciwnowotworową

w stosunku do takich linii nowotworowych, jak: W256 (Walker carcino-

sarcoma), MDA-MB-231 (ludzki gruczolakorak sutka), SNU-1 (ludzki

nowotwór żołądka), SNU-354 (ludzki wątrobiak), czy SNU-C4 (ludzki

nowotwór okrężnicy). Cytotoksyczność nadtlenku ergosterolu może być

związana z jego konwersją w ergosterol, której towarzyszy wytworzenie

toksycznych aktywnych form tlenu. Inne badania na linii komórkowej HL-

60 (ostra białaczka promielocytowa) wykazały zdolność nadtlenku

ergosterolu do indukcji apoptozy [6].

Związki fenolowe zawarte w grzybach odpowiadają za ich właściwości

antyoksydacyjne. Z tej klasy związków, Boletus edulis zawiera m.in. kwasy:

galusowy, gentyzynowy, p-hydroksybenzoesowy oraz α-tokoferol (o działaniu


polskich lasów

147

podobnym do związków fenolowych) [2]. Badania zespołu Shu-Yao (2007)

nad ekstraktami z owocników tego borowika wykazały, że ekstrakt etanolowy

był bogatszy w związki antyoksydacyjne (fenolowe), w związku z tym działał

silniej antyutleniająco niż ekstrakt wodny [7].

Kolejną, ciekawą grupą substancji występujących w borowiku

szlachetnym są lektyny. Jest to grupa glikoprotein wykazująca zdolność do

wiązania węglowodanów. Do tej klasy należą również lektyny

charakteryzujące się silnym działaniem mitogennym (aktywacja limfocytów

i transformacja blastyczna, wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej),

znajdujące się m.in. w owocnikach Boletus edulis. Badania zespołu Zheng

(2007) wykazały, że oprócz wspomnianej aktywności, lektyny z borowika

szlachetnego wykazują również właściwości hamujące aktywność odwrotnej

transkryptazy HIV-1 [8].

Borowik szlachetny jest również bogatym źródłem flawonoidów,

związków chemicznych o szerokim spektrum aktywności (m.in. zapobie-

gających miażdżycy, wykazujących działanie przeciwzapalne i przeciw-

alergiczne) [2].

3. Podgrzybek brunatny (Boletus badius)

Podgrzybek brunatny (Boletus badius) to gatunek grzyba z rodziny

borowikowatych powszechnie występujący w polskich lasach zarówno

liściastych, jak i iglastych. Występuje on najczęściej na glebach

piaszczystych. Jego wzrost obserwuje się zwykle na przełomie lata

i jesieni, od czerwca do listopada. Wygląd grzyba przedstawiono

na rysunku 2.


148

Fot. 2. Podgrzybek brunatny (Boletus badius) w naturalnym środowisku [źródło własne,

fot. M Frant]

Wielkość kapelusza tego grzyba może osiągać od 5 do nawet 30 i więcej

centymetrów i jest zależna od wieku owocnika. Barwa jest najczęściej

ciemnobrązowa lub kasztanowobrązowa, spotyka się jednak również

owocniki o ciemnej, wręcz czarnej barwie. Sam kapelusz jest gruby,

poduchowaty, a jego powierzchnia jest matowa i aksamitna. Podczas

uszkodzenia owocnik podgrzybka zmienia swoją barwę na ciemno-

niebieską (stąd potoczna nazwa w niektórych regionach: „Siniaki”). Miąższ

grzyba zazwyczaj jest biały lub żółtawy, o delikatnym, owocowym zapachu

i łagodnym smaku [9].

Pozyskiwane owocniki z gatunku Boletus badius można śmiało zaliczyć

do artykułów pełnowartościowych, ponieważ zawierają one wszystkie

podstawowe składniki odżywcze. Na suchą masę owocników tego grzyba

składają się: duże ilości węglowodanów (w tym polisacharydy

o właściwościach prozdrowotnych), łatwo przyswajalne białka, kwasy

tłuszczowe, składniki mineralne oraz witaminy [2].

Ogólna zawartość cukrów podgrzybka brunatnego wynosi

od 3,8 do 4,0 g/100 g owocnika [10]. Charakteryzuje się on bardzo dużą

zawartością chityny oraz chitosanów w ścianie komórkowej. Jednak

nie są one jedynymi cukrami wytwarzanymi przez te grzyby. Produkują

one również glukozę, trehalozę, mannitol, a także glikogen i błonnik

pokarmowy [11, 12]. Chitosany znajdujące się w owocnikach podgrzybka


polskich lasów

149

wykazują działanie przeciwbakteryjne oparte na hamowaniu rozwoju

bakterii poprzez zmniejszenie ich adhezji do podłoża. Ponadto, wykazują

one właściwości przeciwwirusowe i przeciwgrzybiczne. Chitosany

są również stosowane podczas leczenia otwartych ran w celu łagodzenia

bólu, przyspieszenia gojenia oraz zniwelowaniu powstawania blizn [12].

Grzyby te są również źródłem wielu polisacharydów, które posiadają silne

aktywności biologiczne. Przykładem takich polisacharydów są

(1→3)/(1→6)-β-glukany charakteryzujące się właściwościami przeciwno-

wotworowymi [1]. Powodują one przede wszystkim bardzo silne

wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej człowieka oraz stymulują

komórki immunokompetentne do wytwarzania cytokin. Niektóre β-glukany

zawarte w owocnikach podgrzybka wykazują właściwości cytotoksyczne

względem komórek nowotworowych, co potwierdzono badaniami in vitro

oraz in vivo, a także nie posiadają właściwości alergicznych [12].

Białka stanowią aż 33,2% suchej masy Boletus badius i jest to jedna

z najwyższych wartości notowanych wśród grzybów dziko rosnących

w Polsce[2]. Grzyby z tego gatunku wytwarzają praktycznie wszystkie

aminokwasy egzogenne, jakie potrzebne są człowiekowi do prawidłowego

funkcjonowania, m.in.: walinę, leucynę, metioninę, fenyloalaninę

czy tryptofan. Aktywność biologiczna białek jest zależna właśnie od ilości

wymienionych aminokwasów. Wśród łatwo przyswajalnych białek

i aminokwasów, podgrzybek wytwarza również lektyny. Są to

glikoproteiny o właściwościach przeciwnowotworowych. Indukują one

apoptozę komórek nowotworowych poprzez hamowanie syntezy białek,

wynikające z dezaktywacji rybosomów [12].

Podgrzybek brunatny jest doskonałym źródłem składników

mineralnych. Posiada on wiele istotnych biologicznie mikro- i makro-

elementów, tj.: żelazo, mangan, selen, potas, magnez, wapń. Jednym ze

znaczących mikroelementów jest selen, który produkowany jest przez ten

gatunek grzyba w ilościach od 0.31 do 19,86 mg/kg suchej masy [13]. Jest

on składnikiem centrum aktywnego enzymu peroksydazy glutationowej,

która jest jednym z silnych przeciwutleniaczy, występujących w orga-

nizmie człowieka. Chroni m.in. czerwone krwinki i błonę komórkową

przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Selen zmniejsza również

ryzyko wystąpienia większości rodzajów nowotworów, w tym raka płuca:,

wątroby, prostaty oraz jelita grubego. Pierwiastek ten bierze także udział w

regulacji prawidłowego funkcjonowania tarczycy oraz układu

immunologicznego. Jest on również istotnym mikroelementem stoso-

wanym do łagodzenia skutków radio- i chemioterapii. Ponadto, zapobiega

przerzutom oraz chroni przed promieniowaniem UV [13].

Boletus badius jest także źródłem licznych związków fenolowych.

Wykazano, że w jego owocnikach znajduje się aż sześć różnych kwasów


150

fenolowych, tj.: kwas protokatechowy, kwas p-hydroksybenzoesowy,

p-kumarowy, synapinowy, cynamonowy oraz ferulowy w łącznej ilości

48,25 mg/kg suchej masy [14]. Związki te posiadają silne właściwości

przeciwutleniające oraz chronią ważne struktury organizmu (błony

komórkowe, enzymy, kwasy nukleinowe) przed uszkodzeniem oksyda-

cyjnym. Ponadto, fenole pochodzące z ekstraktów z owocników grzyba

mają również właściwości przeciwzapalne oraz przeciwnowotworowe [15].

4. Pieprznik jadalny (Cantharellus cibarius)

Pieprznik jadalny (Cantharellus cibarius), potocznie nazywany kurką,

jest przedstawicielem rodziny pieprznikowatych (Cantharellaceae),

powszechnie występującym w polskich lasach. Kurka jest gatunkiem

grzyba mikoryzowego znajdowanym w lasach na całej półkuli północnej,

a także w Australii. Najczęściej spotykany jest na piaszczystych, kwaśnych

glebach porośniętych mchami [16].

Owocnik pieprznika jadalnego składa się z kapelusza, którego średnica

waha się od 2 do 10 cm. Początkowo jest on owalny, natomiast

u dojrzałych owocników przyjmuje lejkowaty kształt. Po spodniej stronie

kapelusza można zaobserwować dobrze rozwinięty hymenofor w postaci

podłużnych blaszek. Trzon kurki ma wysokość do 6 cm i podobnie jak cały

owocnik przyjmuje barwę żółtą lub żółtawo-pomarańczową [16].

Znaczącym składnikiem suchej masy grzyba są węglowodany,

stanowiące około 13% mokrej masy grzyba. Ważnymi cukrami wystę-

pującymi w pieprzniku jadalnym są mannitol, glukoza, oraz glikogen.

Chityna budująca ścianę komórkową grzyba stanowi 6,4% suchej masy [17].

Pieprznik jadalny jest bogatym źródłem rozpuszczalnych w tłuszczach

witamin należących do grupy D, a także A i E [18]. Dodatkowo, owocniki

tego grzyba cechują się wysoką zawartością witamin z grupy

B, porównywalną do ich zawartosci w drożdżach piekarniczych [2].

Zawartość białka w suchej masie owocników pieprznika jadalnego

stanowi około 18,7%. Do najważniejszych aminokwasów stwierdzonych

u C. cibarius należy leucyna, składowa wielu białek występujących

w kurce. Dodatkowo pieprznik jadalny bogaty jest w takie aminokwasy

jak: metionina, fenyloalanina, tryptofan oraz treonina [2].

Obecność tłuszczy w owocnikach pieprznika jadalnego jest niewielka.

Jego owocniki zawierają różne rodzaje tłuszczów, a największą ich grupę

stanowią wielonienasycone kwasy tłuszczowe, których udział stanowi

54,08%. Dodatkowo, występują tu nasycone kwasy tłuszczowe w ilości

22,63% oraz mononienasycone kwasy tłuszczowe, stanowiące 23,29%

wszystkich lipidów [19].


polskich lasów

151

Kurka ceniona jest głównie za smak i aromat, lecz posiada również

wiele substancji biologicznie czynnych o charakterze prozdrowotnym.

Spośród substancji aktywnych izolowanych z owocników pieprznika

jadalnego szczególną uwagę warto zwrócić na polisacharydy, których

głównym źródłem jest grzybowa ściana komórkowa. Aktywność

przeciwnowotworowa polisacharydów grzybowych szczególnie związana

jest ze związkami typu (1-3) i (1→6) β-glukany oraz (1→3) α-glukany [20].

Badania prowadzone nad aktywnością β-glukanów wykazały, że wiążą

się one z receptorami w błonach komórek immunokompetentnych, przez

co wpływają na indukcję odpowiedzi immunologicznej organizmu [21].

W badaniach przeprowadzonych w Lublinie, przy użyciu testu MTT,

wykazano, że frakcje polisacharydowe otrzymane z owocnika pieprznika

jadalnego wpłynęły znacząco na zahamowanie proliferacji komórek nowot-

worowych raka jelita grubego (linie komórkowe LS 180 oraz HT-29) [22].

W 2006 roku Ribeiro i współpracownicy stwierdzili w testach in vitro,

iż obecność w owocnikach pieprznika jadalnego kwercetyny znacząco

wpływa na właściwości przeciwutleniające ekstraktu grzybowego,

a co za tym idzie, na jego właściwości przeciwnowotworowe [23].

Dodatkowo, portugalscy badacze stwierdzili w owocnikach pieprznika

wysoką zawartość związków aktywnych, takich jak: fenole, flawonoidy,

kwas askorbinowy, -karoten oraz likopen. Ponadto, badacze udowodnili

silną aktywność antybakteryjną owocników kurki przeciwko Bacillus

cereus, Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus [24].

Owocniki kurki posiadają także wiele związków fenolowych o działaniu

prozdrowotnym. Największą ich ilość u C. cibarius stanowi kwas

galusowy, którego zawartość wynosi 161,83 µg/100 g suchej masy oraz

kwas gentyzynowy występujący w ilości 53,87 µg/100 g suchej masy [25].

Związki te posiadają udokumentowane właściwości przeciwnowotworowe [2].

5. Mleczaj rydz (Lactarius deliciosus)

Mleczaj rydz (Lactarius deliciosus), potocznie zwany rydzem, jest

jadalnym grzybem podstawkowym należącym do rodziny gołąbkowatych

(Russulaceae) [26]. Szeroko występuje w Europie, rzadziej w Ameryce

Północnej, Australii i Azji. Rośnie w okresie jesiennym, najczęściej

w lasach sosnowych i dębowych [27].

Rydz posiada kapelusz o średnicy kilkunastu centymetrów, z wklęsłym

środkiem i ziarnistościami na powierzchni, koloru od pomarańczowego,

poprzez pomarańczowo-różowy do czerwono-pomarańczowego, czasem

sinozielony. Kapelusz zaopatrzony jest w liczne, zbiegające się blaszki

o jasno-pomarańczowej barwie, które po uszkodzeniu przyjmują kolor


152

zielony. Trzon jest dość krótki, długości kilku centymetrów,

z charakterystycznymi wżerami.

Grzyb ma przyjemny, owocowy zapach. Mleczko, znajdujące

się w miąższu, ma przyjemny zapach i łagodny, lecz gorzki smak [27].

Mleczaj rydz charakteryzuje się niewielką zawartością białka (1,9%)

zawiera jednak liczne aminokwasy egzogenne ale także węglowodany

(6,9%) i tłuszcze (0,7%). Wysoka zawartość wody i tym samym niewielka

zawartość suchej masy powoduje, iż grzyby te mają niską wartość

energetyczną. Rydz jest bardzo dobrym źródłem potasu (310 mg/100 g

części jadalnych grzyba) i fosforu (74 mg/100 g części jadalnych),

w mniejszej ilości także pierwiastków takich jak: wapń, magnez, sód oraz

śladowych ilości: żelaza, cynku, miedzi, molibdenu, fluoru, manganu,

selenu, kobaltu czy tytanu. Jest również zasobny w witaminy: B1, B2

czy C [1]. Charakteryzuje go niewielka zawartość flawonoidów (około

1 mg/100 g świeżej masy grzyba) [28]. Termiczna obróbka nie prowadzi

do zmniejszenia ilości flawonoidów, i polifenoli występujących w mleczaju,

zmniejsza natomiast potencjał zmiatania wolnych rodników [29].

Grzyby te mają zdolność akumulacji metali ciężkich, o czym należy

pamiętać szczególnie podczas zbiorów w pobliżu terenów przemysłowych [1].

Badania wykazały również, iż ekstrakty metanolowe zarówno

z niedojrzałych jak i dojrzałych owocników hamowały rozwój bakterii

Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych. Yasukawa i in. (1996) indukowali

zapalenie ucha u myszy 12-O-tetradekanoilforbol-13-octanem (TPA).

Okazało się, iż metanolowe ekstrakty grzybów jadalnych, w tym także

mleczaja rydza, wykazywały pożądany efekt przeciwzapalny [31]. Większy

potencjał przeciwbakteryjny wykazywały owocniki niedojrzałe ze względu

na większą ilość węglowodanów [30].

Hou i wsp. (2013) badali natomiast właściwości immunostymulacyjne

polisacharydu (nazwanego LDG-A) wyizolowanego z Lactarius deliciosus.

Analizie poddano aktywność przeciwnowotworową in vivo, proliferację

limfocytów i stymulację makrofagów, potencjał wydzielania IL-6

(interleukiny-6) i TNF-α (ang. tumor necrosis factor – czynnik nekrozy

nowotworu) oraz tlenku azotu (NO). W celu badania właściwości

przeciwnowotworowych wszczepiano myszom komórki linii S-180

(komórki mysiego mięsaka). Badanie te pozwoliły stwierdzić

iż u osobników poddanych działaniu określonych stężeń substancji badanej

(wyizolowanego polisacharydu) masy guzów nowotworowych były

mniejsze o 44-57% w porównaniu do grupy kontrolnej. Badaniu poddano

także proliferację limfocytów i makrofagów w komórkach śledziony myszy

w hodowli in vitro. Polisacharyd istotnie zwiększał proliferację komórek,

obserwowano także zwiększoną fagocytozę przez makrofagi otrzewnowe [32].


polskich lasów

153

Polisacharyd LDG-A stymuluje także wydzielanie IL-6 i TNF-α,

wpływając na stan zapalny [32].

Innym aspektem eksperymentu była analiza wpływu LDG-A na indukcję

makrofagów otrzewnowych. Wykazano, iż przy stężeniu polisacharydu

powyżej 50 mg/ml makrofagi wydzielały większą ilość NO niż w przypadku

ich indukcji lipopolisacharydem (kontrola pozytywna) [32].

Jak wykazały przeprowadzone badania, mleczaj rydz jest zarówno

zasobny w pożądane właściwości organoleptyczne, jak i w substancje

prozdrowotne (takie jak β-glukany, polisacharydy czy błonnik). Ponadto,

wykazuje niewielką kaloryczność i jest postrzegany pozytywnie w aspekcie

dietetycznym.

6. Podsumowanie

Mechanizmy aktywności prozdrowotnych substancji pochodzących

z grzybów nie są jeszcze dokładnie poznane. Substancje izolowane

z grzybów wymagają zwiększenia liczby prowadzonych na nich badań.

Warto zaznaczyć jednak, że obecny stan wiedzy na temat korzystnego

wpływu grzybów na ludzki organizm pozwala wyciągnąć wnioski

o ich dużym znaczeniu w profilaktyce niektórych chorób, w tym także

nowotworów. Grzyby jadalne mogłyby być w przyszłości stosowane

do produkcji żywności funkcjonalnej, czyli takiej, która przyczyni

się do poprawy stanu zdrowia człowieka. Należy pamiętać również

o znaczącej roli grzybów w medycynie naturalnej, a także starać

się wykorzystywać możliwości wytwarzanych przez nie związków w celu

poprawy jakości życia.

Literatura

1. Sas-Golak I., Sobieralski K., Siwulski M., Lisiecka J., Skład, wartość odżywcza

oraz właściwości zdrowotne grzybów pozyskiwanych ze stanowisk naturalnych,

Kosmos. Problemy nauk biologicznych, 60 (3-4) (2011), pp. 483-490

2. Sitarska K., Grzyby dziko rosnące - wartość odżywcza i właściwości

prozdrowotne, Journal of NutriLife, 03 (2014),

url: http://www.NutriLife.pl/index.php?art=142 [dostęp: 2014.11.18]

3. Siwulski M., Sobieralski K., Sas-Golak I., Wartość odżywcza i prozdrowotna

grzybów, Żywność Nauka Technologia Jakość, 1(92) (2014), pp.16-28

4. Rajewska J., Bałasińska B., Związki biologicznie aktywne zawarte w grzybach

jadalnych i ich korzystny wpływ na zdrowie, Postępy Higieny i Medycyny

Doświadczalnej, 58 (2004), pp. 352-357

5. Kalac P., Chemical composition and nutritional value of European species

of wild growing mushrooms: A review, Food Chemistry, 113 (2009), pp. 9-16

6. Krzyczkowski W., Malinowska E., Suchocki P., Kleps J., Olejnik M., Herold

F., Isolation and quantitative determination of ergosterol peroxide in various

edible mushroom species, Food Chemistry, 113(1) (2009), pp. 351-355

http://www.nutrilife.pl/index.php?art=142%20


154

7. Shu-Yao T., Hui-Li T., Jeng-Leun Mau L.W.T., Antioxidant properties

of Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea, and Boletus edulis, Food Science

and Technology, 40 (2007), pp. 1392-1402

8. Zheng S., Li C., Ng T.B., Wang H.X., A lectin with mitogenic activity from

the edible wildmushroom Boletus edulis, Process Biochemistry, 42 (2007),

pp. 1620-1624

9. Volk R., Volk F. Praktyczny poradnik grzybiarza, Wydawnictwo DELTA W-

Z (2009), pp. 45-132

10. Elmadfa I., Muskat E. Wielkie tabele kalorii i wartości odżywczych,

Wydawnictwo Muza S.A, Warszawa (2004), pp. 220-247

11. Muszyńska B., Jadalne gatunki grzybów źródłem substancji dietetycznych

i leczniczych, Wydawnictwo Zakład Opieki Zdrowotnej Ośrodek UMEA

SHINODA –K KURACEJO, Kraków (2012), pp. 15-62

12. Rajewska J., Bałasińska B., Biologically active compounds of edible

mushrooms and their beneficial impact on health, Postępy Higieny

i Medycyny Doświadczalnej, 58 (2005), pp. 352-357 13. Kopczyński K., Immunomodulating and anticancer properties of fungi, Acta

Mycologica, 47(1) (2012), pp. 91-96

14. Muszyńska B., Sułkowska-Ziaja K., Ekiert H., Phenolic acids in selected

edible basidomycota species: Armillaria mellea, Boletus badius, Boletus

edulis, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus and Pleurotus ostreatus,

Acta Scientiarum Polonorum, 12(4) (2013), pp. 107-116

15. Grzyby i ich hodowle laboratoryjne źródłem substancji leczniczych, Projektor

Jagielloński (2014) ulr: http://www.projektor.uj.edu.pl [dostęp: 2014.11.18]

16. Gerhardt E. Przewodnik GRZYBY. MULTICO, Oficyna Wydawnicza,

Warszawa, (2001), pp. 28

17. Muszyńska B., Sułkowska-Ziaja K., Ekiert H., Właściwości lecznicze

i dietetyczne wybranych jadalnych grzybów wielkoowocnikowych, Farmacja

Polska, 67 (8) (2011), pp. 553-562

18. Manzi P., Marconi S., Aguzzi A., Pizzoferrato L., Commercial mushrooms,

nutritional quality and effect of cooking, Food Chemistry, 84 (2004), pp. 201-206

19. Barros L., Cruz T., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I., Wild

and commercial mushrooms as source of nutrients and nutraceuticals, Food

and Chemical Toxicology, 46 (2008), pp. 2742-2747

20. Tao Y.,Zhang L., Cheung P.C.K., Physicochemical properties and antitumor

activities of water soluble native and sulfated hyper branched mushroom

polysaccharides, Carbohydrate Research, 341 (2006), pp. 2261-2269

21. Czop J.K., Austen K.F. Properties of glycans that activate the human

alternative complement pathway and interact with thehuman monocyte beta-

glucan receptor, Journal of Immunology, 135 (1985), pp. 3388-3393

22. Lemieszek M., Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów

izolowanych z grzybów klasy Basidiomycetes (2014),

url: http://www.rsi2004.lubelskie.pl/doc/sty7/art/Lemieszek_Marta_art.pdf

[dostęp: 2014.11.21]

23. Ribeiro B., Rangel J., Valentao P., Baptista P., Seabra R. M., Andrade P. B.,

Contents of carboxylic acids and two phenolics and antioxidant activity

http://www.projektor.uj.edu.pl/

http://www.rsi2004.lubelskie.pl/doc/sty7/art/Lemieszek_Marta_art.pdf


polskich lasów

155

of dried Portuguese wild edible mushrooms Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 54, (2006), pp. 8530-8537

24. Barros L., Calhelha R. C., Vaz J.A., Ferreira I., Baptista P., Estevinho L.M.,

Antimicrobial activity and bioactive compounds of Portuguese wild edible

mushrooms methanolic extracts, European Food Research and Technology,

225 (2007), pp. 151-156

25. Palacios I., Lozano M., Moro C., Arrigo M.D., Rostagno M.A., Martinez J.A.,

Garcia-Lafuente A., Antioxidant properties of phenolic compounds occurring

in edible mushrooms, Food Chemistry, 128 (2011), pp. 674-678

26. http://www.indexfungorum.org/ [dostęp: 2014.12.06]

27. http://www.first-nature.com/fungi/lactarius-deliciosus.php [dostęp: 2014.12.06]

28. Mirończuk-Chodakowska I., Witkowska A., Żujko M.E., Zawartość

flawonoidów w jadalnych grzybach leśnych, Bromatologia i Chemia

Toksykologiczna, XLV, 3 (2012), pp. 665-668

29. Pogoń K., Jaworska G., Duda-Chodak A., Maciejaszek I., Influence

of the Culinary Treatmet on the Quality of Lactarius deliciosus, Foods,

2 (2013), pp. 238-253

30. Barros L., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I.C.F.R., Effect of Fruiting

Body Maturity Stage on Chemical Composition and Antimicrobial Activity

of Lactarius sp. Mushrooms, Journal of Agricultural and Food Chemistry,

55(21) (2007), pp. 8766-8771

31. Yasukawa K., Kanno H., Kaminaga T., Takido M., Kasahara Y., Kumaki K.,

Inhibitory Efect of Methanol Extracts from Edible Mushroom on TPA-induced

Ear Oedema and Tumour Promotion in Mouse Skin, Pytotherapy Research,

10(4) (1996), pp. 367-369

32. Hou Y., Ding X., Zhong J., Immunostimulant Activity of a Novel

Polusaccharide Isolated from Lactarius deliciosus (L. ex Fr.) Gray, Indian

Journal of Pharmaceutical Sciences, 75(4) (2013), pp. 393-399

Pro-health properties of selected edible mushrooms occurring

in the Polish forests

Properties of wild growing edible mushrooms for centuries were appreciated and used

in natural medicine. It was known then, that consumption of the mushrooms in various forms (as food additives, brewed dried fruiting bodies, etc) has a beneficial impact on

human health. Until recently, it was claimed that mushrooms are deprived of any nutritional

values. However, recent studies of the last several years prove, that Macromycetes

mushrooms possess number of biological properties, such as: antitumor, antiviral, anti-inflammatory, antifungal or cholesterol-lowering. Moreover, there was observed production

of nutrients, such as: easily available proteins, all the exogenous amino acids, vitamins,

micro- and macroelements. Therefore there are study on common gathered or consumed

mushrooms from European forests (including Polish forests) are conducted. Their goal is to refute the popular myth describing mushrooms as nothing but food additive improving

the taste and flavor of dishes.

The purpose of the article is to present selected species of mushrooms widely growing

in the Polish forests: Boletus edulis, Boletus badius, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus as a good source of nutrients compounds and pro-health properties.

http://www.indexfungorum.org/

http://www.first-nature.com/fungi/lactarius-deliciosus.php

156

Karolina Kasprzak1, Kinga Kropiwiec

2, Marek Babicz

3

Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt

gospodarskich

Prolaktyna należy do rodziny hormonów białkowych. Pełni w organizmie bardzo rozległe funkcje, daleko wykraczające poza sferę reprodukcji.

Prolaktyna odgrywa ważną rolę w metabolizmie, wzroście i rozwoju,

behawiorze, a także w utrzymaniu homeostazy organizmu. Do tej pory

udokumentowano ponad 300 rodzajów oddziaływań tego hormonu na określone funkcje biologiczne ssaków. Prolaktyna poza regulacją funkcji

reprodu-kcyjnych i odpornościowych wpływa na laktogenezę i laktopoezę,

gospodarkę wodno – elektrolitową organizmu, wzrost i różnicowanie

komórek, pobudzanie proliferacji: melanocytów, keratynocytów, hepatocytów, nabłonka kanalików nerkowych, nabłonka jelitowego, mięśni

gładkich naczyń, komórek B wysepek trzustkowych oraz astrocytów.

Wszystkie działania prolaktyny pośrednio wiążą się jednak z rozmnażaniem

się zwierząt i służą dostosowaniu funkcji rozrodczych do szeroko pojętych warunków środowiskowych. Przyjmuje się, że na procesy związane

z rozrodem przypada 38% aktywności prolaktyny. Natomiast za najważ-

niejszą funkcję prolaktyny uznaje się stymulację laktacji oraz utrzymanie

czynności sekrecyjnej gruczołu mlekowego. Celem pracy było określenie wpływu prolaktyny na rozród zwierząt

gospodarskich.

1. Wstęp

Wartość rozpłodowa zwierząt gospodarskich jest uwarunkowana zarówno

licznymi czynnikami środowiskowymi (m.in. warunkami zoohigienicznymi,

żywieniem) jak i genetycznymi (m.in. rasą, genotypem). Dlatego też

zwiększenie efektywności produkcyjnej poprzez działania selekcyjne jest

problemem złożonym. Z przeglądu literatury tematu z ostatnich

kilkudziesięciu lat wynika, że obecnie kształtowanie postępu hodowlanego

opiera się przede wszystkim na wykorzystaniu narzędzi genetyki

molekularnej [1, 2, 3, 4]. Coraz częściej zwraca się uwagę na możliwość

zastosowania selekcji wspomaganej markerami – Marker Assisted Selection

MAS [5], jako selekcji pozytywnej. Selekcja tego rodzaju polega na

wyszukaniu genów o dodatnim wpływie na wartość danej cechy, a następnie

1 [email protected]; Katedra Hodowli i Ochrony Zasobów Genetycznych Bydła,

Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 2 [email protected]; Katedra Hodowli i Technologii Produkcji Trzody Chlewnej,

Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 3 [email protected]; Katedra Hodowli i Technologii Produkcji Trzody Chlewnej,

Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie




Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich

157

zwiększeniu puli alleli korzystnych w danej populacji zwierząt

gospodarskich [6]. Najczęściej, spośród markerów wybiera się tzw. geny

kandydujące, które kodują produkty białkowe biorące udział w procesach

metabolicznych mających wpływ na określone cechy m.in. użytkowości

tucznej, rzeźnej czy rozpłodowej. Jednym spośród licznych produktów

białkowych występujących zarówno w organizmie człowieka, jak i u zwierząt

gospodarskich (świnie, bydło, owce) wykazującym wielokierunkowe

oddziaływanie na procesy metaboliczne i fizjologiczne organizmu, w tym

również te związane z rozrodem, jest prolaktyna.

2. Ogólna charakterystyka prolaktyny

Prolaktyna (PRL) wraz z hormonem wzrostu (GH) i laktogenem

łożyskowym (PL), należy do rodziny hormonów białkowych [7, 8]. Została

zidentyfikowana w 1928 r. przez Strickera i Guetera jako czynna substancja

obecna w ekstrakcie z przedniego płata przysadki. Jest peptydem zbudo-

wanym z około 200 aminokwasów. Przez długi czas uważano, że prolaktyna

występuje tylko w przysadce i odpowiada przede wszystkim za czynność

sekrecyjną gruczołu mlekowego. W 1970 r. wykryto PRL we krwi

człowieka, łożysku oraz mózgu, komórkach układu immunologicznego,

gruczole krokowym, jądrach, nadnerczach, trzustce, jelicie i wielu innych

tkankach [9].

U większości ssaków zbudowana jest ze 199 aminokwasów z trzema

mostkami disiarczkowymi znajdującymi się między sześcioma cysternami

10, 11, 12, 13]. Masa cząsteczkowa hormonu wynosi ok. 23 kilodaltonów

(kDa) [8]. Prolaktyna może występować w różnych formach, co jest

związane z jej modyfikacjami potranslacyjnymi, różnymi wariantami genu

prolaktyny (występowania więcej niż jednej jego kopii), alternatywnego

składania genów czy też stanu fizjologicznego organizmu [14]. Aktywną

postać hormon ten przyjmuje dopiero po utworzeniu kompleksu z dwoma

receptorami: receptor – hormon – receptor [15].

Prolaktyna syntetyzowana jest nie tylko przez komórki laktotropowe

w przednim płacie przysadki mózgowej lecz także w centralnym układzie

nerwowym w komórkach układu immunologicznego, w macicy, łożysku,

a także w wymionach [12]. Jej występowanie stwierdzono również w nie-

których płynach ustrojowych: mleku, płynie mózgowo – rdzeniowym,

pocie czy łzach [11, 16, 17, 18]. Miejsca wiązania prolaktyny zidentyfikowano

w wielu tkankach i komórkach dorosłych zwierząt, m.in. w mózgu,

jajnikach, łożysku i macicy [19].

W obrębie przysadki mózgowej i w surowicy wykryto jej niejednorodne

odmiany o różnym ciężarze cząsteczkowym. Na tej podstawie można

wyróżnić kilka odmian biologicznie czynnej prolaktyny:


158

mała – tzw. forma monomeryczna o masie cząsteczkowej ok.23 kDa,

uważana za bardzo aktywny biologicznie rodzaj PRL, wykazujący

duże powinowactwo z receptorami;

duża – tzw. forma dimeryczna o masie cząsteczkowej ok. 50 kDa,

będąca mieszanką drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur

hormonów;

bardzo duża – tzw. forma polimeryczna o masie cząsteczkowej ok. 60

– 100 kDa, wykazująca mniejsze powinowactwo z receptorami [20];

glikozydowa – o masie cząsteczkowej ok. 25 kDa, o mniejszej

immunoreaktywności w porównaniu do odmiany małej [21]

Hormony białkowe, do których należy prolaktyna, działają na tkanki

docelowe najczęściej drogą endokrynną, podczas której określony hormon

zostaje uwolniony do krwioobiegu. Następnie razem z krwią dociera do

odpowiednich narządów, gdzie łączy się z licznymi receptorami

ulokowanymi w błonie komórkowej, przez co wywiera swoisty dla siebie

efekt [15]. PRL może również oddziaływać w sposób pośredni, jako

czynnik wzrostu, neurotransmiter lub immunomodulator para- lub

autokrynnie, z pominięciem uwalniania hormonu do krwi.

3. Funkcje prolaktyny

3.1. Funkcje prolaktyny w organizmie zwierząt

Funkcje prolaktyny w organizmie zwierzęcym są rozległe. Uważa

się, że hormon ten odgrywa ważną rolę w metabolizmie, wzroście

i rozwoju, behawiorze, a także w utrzymaniu homeostazy organizmu [12].

Do tej pory udokumentowano ponad 300 rodzajów oddziaływań tego

hormonu na określone funkcje biologiczne ssaków. Prolaktyna poza

regulacją funkcji reprodukcyjnych i odpornościowych wpływa na lakto-

genezę i laktopoezę, gospodarkę wodno – elektrolitową organizmu, wzrost

i różnicowanie komórek [8].

Wpływ PRL na wzrost i rozwój obejmuje przede wszystkim: stymulację

wzrostu ciała, pobudzanie proliferacji: melanocytów, keratynocytów,

hepatocytów, nabłonka kanalików nerkowych, nabłonka jelitowego, mięśni

gładkich naczyń, komórek B wysepek trzustkowych oraz astrocytów [22].

U ssaków stymuluje aktywność wydzielniczą mieszków włosowych

i gruczołów łojowych. Jednak najważniejszym działaniem regulacyjnym

PRL jest wpływ na rozwój i utrzymanie czynności gruczołu mlekowego.

Do istotnych działań prolaktyny na organizm należy także zaliczyć

jej wpływ na metabolizm organizmu: pobudzanie apetytu i wpływ

na metabolizm lipidów, węglowodanów oraz na metabolizm steroidów


159

u ssaków poprzez wzmaganie aktywności enzymów związanych

z ich syntezą, stymulację nadnerczy do syntezy i wydzielania

glikokortykoidów, aldosteronu i androgenów nadnerczowych. W wątrobie

wzmaga aktywność fosforylazy glikogenu, natomiast w trzustce pobudza

wydzielanie insuliny. Pobudza syntezę fosfolipidów (surfaktantu)

w płucach noworodków ssaków i powoduje wzrost aktywności lipazy

lipoproteinowej oraz sekrecji żółci w ich wątrobie, reguluje metabolizm

wapnia. Ponadto wpływa na transport jodu w gruczołach mlekowych ssaków.

Wśród istotnych funkcji osmoregulacyjnych PRL można wyróżnić:

udział w regulacji równowagi wodno-elektrolitowej u wszystkich

kręgowców [12, 23], zmniejszanie wydzielania sodu i chloru przez

gruczoły potowe u ssaków, wzmaganie absorpcji wody i elektrolitów

w jelicie oraz regulację objętości i składu płynu owodniowego u ciężarnych

samic [24]. Wpływ PRL na nerki obejmuje stymulację pompy sodowo –

potasowej w kanalikach nerkowych i spadek wydalania jonów sodu

i potasu, zwiększa także poziom kwasu moczowego we krwi. U ssaków

PRL działa na gruczoły (potowe i łojowe) oraz na wytwory skóry.

Prolaktyna często opisywana jest jako hormon, który pełni istotną rolę

w kontrolowaniu wielu zachowań zwierząt oraz ich adaptacji do warunków

środowiska zewnętrznego. Jej działanie ujawnia się przy zmianie

środowiska bytowego przez zwierzęta. Bierze również udział

w regulowaniu dostosowywania się zwierząt do sezonowych zmian

środowiska. U wielu gatunków wykazano dobowe i okresowe zmiany jej

wydzielania [9]. Prolaktyna wywiera istotny wpływ na behawior poprzez

kontrolę zachowań rozrodczych, ma związek z metabolicznym

i behawioralnym przygotowaniem zwierząt do migracji. Jest uważana za

hormon będący wskaźnikiem stresu [15], ponadto jej wzrost obserwowany

jest także podczas wysiłku fizycznego. Ma właściwości analgetyczne

(podobnie jak opioidy i GABA). Reguluje aktywność ATP-azy sodowo –

potasowej i magnezowo – wapniowej w podwzgórzu. PRL u ssaków

stymuluje proliferację limfocytów i produkcję przeciwciał klasy IgG i IgM.

Pod jej wpływem wzrasta w błonie komórkowej gęstość receptorów

interleukiny – 2, erytropoetyny i samej PRL. Wykazuje ponadto właści-

wości hamowania apoptozy limfocytów, aktywuje makrofagi, wzmaga

cytotoksyczność komórek NK i produkcję anionów nadtlenkowych

odpowiedzialnych za niszczenie patogenów.


160

3.2. Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt

Wszystkie działania prolaktyny pośrednio związane są z rozmnażaniem

się zwierząt i służą dostosowaniu funkcji rozrodczych do szeroko pojętych

warunków środowiskowych. Przyjmuje się, że na procesy związane

z rozrodem przypada 38% aktywności prolaktyny. Istotny wpływ

na syntezę i uwalnianie PRL mają hormony gonad. Hormon ten uwalniany

jest u samic ssaków w odpowiedzi na pobudzenie receptorów podczas

kopulacji [9]. Prolaktyna jest, więc jednym z wielu niezbędnych

hormonów, które wywierają wpływ na cechy związane z rozrodem

(wielkość miotu, przeżywalność prosiąt, laktacja, instynkt macierzyński

[25] a także na funkcjonowanie narządów układu rozrodczego

(np. jajników) [26]. Zadaniem regulacyjnym wydzielania PRL do krwi jest

intensyfikacja funkcji luteotropowej ciałek żółtych (pobudzanie

wydzielania progesteronu) oraz stworzenie odpowiedniego środowiska

dla komórek jajowych uwolnionych z pęcherzyków jajnikowych [9].

W zależności od gatunku zwierzęcia oraz fazy cyklu płciowego

PRL wpływa na funkcjonowanie ciałka żółtego [12]. Cykliczne wyrzuty

prolaktyny pozytywnie wpływają na rozwój ciałek żółtych oraz

ich przemianę w ciałka ciążowe. Mają także istotne znaczenie w regresji

tych ciałek z poprzedniego cyklu. Wpływ hormonu na ciałko żółte

obserwuje się we wczesnej fazie lutealnej cyklu rujowego oraz w drugiej

połowie ciąży [11]. Ponadto, prolaktyna wpływa na zwiększenie sekrecji

progesteronu, nasilając steroidogenne działanie hormonu luteinizującego

(LH) w komórkach ziarnistych – luteinowych oraz hamuje wydzielanie

enzymu inaktywującego progesteron. Prawdopodobnie u ssaków

prolaktyna jest częścią tzw. „kompleksu luteotropowego” składającego

się z hormonów: LH, FSH oraz PRL [12].

PRL poza oddziaływaniem na aktywność enzymów steroidogennych

oraz rozwój pęcherzyków jajnikowych wywiera wpływ na gęstość

receptorów estrogenowych i progesteronowych w macicy, ułatwia

implantację blastocysty w endometrium, a jej poziom wzrasta znacznie

podczas ciąży [9]. Potwierdzają to badania Farmera [27] przeprowadzone

na loszkach, gdzie przez cały okres dojrzewania płciowego poziom

prolaktyny utrzymywał się na stałym poziomie, natomiast jego gwałtowny

wzrost obserwowano podczas ciąży. Po porodzie poziom PRL stopniowo

obniżał się. Jak podaje Dusza i wsp [28], na 2-3 dni przed porodem stężenie

PRL we krwi wzrasta i osiąga poziom maksymalny podczas porodu.

Z badań przeprowadzonych na świniach wynika, iż wzrost poziomu

prolaktyny obserwowany był po pojawieniu się w macicy co najmniej

3 płodów. Z kolei wysoka koncentracja prolaktyny w czasie porodu inicjuje

laktację [29]. Z badań Farmera [27] wynika, iż podanie lochom przed


161

porodem antagonisty prolaktyny – bromokryptyny wpływało na zahamo-

wanie wydzielania prolaktyny, a tym samym zatrzymanie sekrecji mleka

wkolejnej laktacji oraz spadek masy miotu w porównaniu do miotów

kontrolnych. Natomiast, u krów i kóz podanie bromokryptyny podczas

porodu skutkowało opóźnioną sekrecją mleka oraz zmniejszoną jego

produkcją Stwierdzono także, iż podanie bromokryptyny nie wpływało na

całkowite zahamowanie wydzielania prolaktyny i odnotowywano jej

obecność we krwi [30].

Stymulacja laktacji uważana jest za jedną z podstawowych funkcji

prolaktyny. Z badań Farmera [27] wynika, iż prolaktyna wywiera ogromny

wpływ na odruch ssania. W miotach pochodzących od loch, gdzie

laktogeneza była zahamowana odruch ten prawie całkowicie zanikał.

U wszystkich ssaków ilość uwolnionej prolaktyny zależy od intensywności

ssania oraz jest proporcjonalna do liczby potomstwa [26]. U ludzi, bydła

oraz gryzoni wydzielanie prolaktyny podczas karmienia wzmacniane jest

całodobowym rytmem sekrecji. Taka regulacja może skutkować

zwiększoną sekrecją PRL bez względu na intensywność ssania [12]. Kiedy

częstotliwość karmienia zmniejsza się koncentracja prolaktyny spada do

poziomu wyjściowego. Jak wynika z badań przeprowadzonych na świniach

i owcach prolaktyna jest hormonem niezbędnym do rozwoju gruczołu

mlekowego oraz zapoczątkowania wydzielania mleka pod koniec ciąży.

U klaczy natomiast, wzrost wydzielania PRL obserwowany jest wraz

ze wzrostem koncentracji laktozy, trójglicerydów oraz białka w mleku.

W przypadku koni prawdopodobnie prolaktyna nie wywiera tak istotnego

wpływu na laktację oraz ssanie, ponieważ odnotowano jej spadek

do wartości wyjściowej po ok. 1-2 miesiącach po porodzie. Także

zahamowane zostaje uwalnianie prolaktyny u klaczy karmiących, którym

po porodzie zabrano źrebięta [31]. Z kolei u przeżuwaczy nie odnotowano

zależności pomiędzy stężeniem prolaktyny a ilością produkowanego mleka

[26]. Z badań przeprowadzonych na lochach wynika, iż niezależnie od dnia

laktacji u 90% karmiących loch następował wzrost stężenia PRL, osiągając

szczyt po 15 minutach od początku ssania. Lochy, u których sekrecja

prolaktyny była na niskim poziomie, dzięki ssaniu prosiąt wykazywały

kilkakrotnie wyższe stężenie hormonu podczas laktacji.

Prolaktyna pełni także istotną rolę w rozwoju młodych zwierząt oraz ich

zdrowotności. Jak podają Farmer i wsp [32] zarówno u prosiąt płci męskiej

jak i żeńskiej stężenie prolaktyny jest na takim samym poziomie. Jednak,

wyższą przeżywalnością charakteryzowały się te prosięta, u których

zanotowano wyższy poziom PRL. Nie określono jednak czy było

to związane z bezpośrednim oddziaływaniem prolaktyny. Z badań

przeprowadzonych na owcach [33] wynika, iż masa ciała jagniąt nie jest

skorelowana ze stężeniem PRL. Jak dowodzą badania przeprowadzone


162

przez Przałę i wsp [34] podawanie loszkom remontowym egzogennej

prolaktyny w dniu porodu wpływa na ograniczenie zachorowań w stadzie

na „gorączkę poporodową”, czyli tzw. syndrom MMA. Iniekcja egzogennej

PRL pozytywnie wpływa także na liczbę odchowanych prosiąt oraz

ich masę ciała [34] a także na dzienne przyrosty prosiąt w pierwszych

dwóch tygodniach życia. Zależności takie nie zostały odnotowane u loch

wieloródek. W innych badaniach, prowadzonych przez Szczęśniak –

Fabiańczyk i wsp [35] wykazano korzystny wpływ podawania prosiętom

egzogennej prolaktyny na uzyskiwaną przez zwierzęta masę ciała.

Stwierdzono ponadto, iż PRL stymuluje układ odpornościowy zwierząt.

Dlatego, uzupełnianie niskiej zawartości prolaktyny w pokarmie matki

poprzez stosowanie specjalistycznych preparatów wywiera korzystny efekt

zarówno na wzrost jak i zdrowie prosiąt [36,37,38,39].

Liczne badania dowodzą, iż prolaktyna odgrywa istotną rolę

w zachowaniach i odruchach płciowych. Jej wysoki poziom związany jest

z występowaniem ciąży urojonej. Z kolei ograniczone wydzielanie

endogennej prolaktyny prowadzi do zahamowania instynktu

macierzyńskiego [12] Wzrost poziomu PRL u loch tuż przed porodem

związany jest z rozpoczęciem budowy gniazda [40]. Jak wykazały badania

Boultona i wsp [41] podanie loszkom z ciążą urojoną antagonisty prolaktyny

– bromokryptyny osłabia wzrost poziomu prolaktyny, wpływając

jednocześnie na intensywność budowania gniazda. Rushen i wsp [42] w

badaniach stwierdzili, że u loszek prośnych PRL odgrywa ograniczoną rolę

w aktywności przedporodowej (w tym w budowaniu gniazda).

U ssaków prolaktyna jest hormonem warunkującym przeżycie młodych

po urodzeniu, wpływa na behawior macierzyński, pełni kluczową rolę

w przygotowaniu (podczas ciąży) i utrzymaniu w czasie laktacji

aktywności sekrecyjnej gruczołu mlekowego. Wpływa na ukrwienie

gruczołu, proliferację komórek wydzielniczych i stymulację w nich

procesów endocytozy, zarówno gotowych składników, jak i substratów

do produkcji mleka (tłuszczów, białek, laktozy). Jest współodpowiedzialna

za przemieszczanie się ogromnych mas wody i elektrolitów z organizmu

matki do mleka. PRL wpływa na ekspresję i tempo transkrypcji genów

szeregu białek mleka (-kazeiny, - i -laktoalbuminy) oraz

na gromadzenie i stabilizację ich mRNA. Ma również wpływ na translację

i modyfikacje potranslacyjne tych białek. W gruczole mlekowym wpływa

również na syntezę swoich własnych receptorów i ich fosforylację [9].

Prolaktyna pomimo, iż uznawana jest za hormon związany z procesami

zachodzącymi w organizmach samic wywiera istotny wpływ na osobniki

męskie. PRL u samców pobudza aktywność steroidogenną jąder i wpływa

na czynność wydzielniczą gruczołów dodatkowych (np. prostaty) [9].

Jej wydzielanie u osobników męskich sterowane jest poprzez mechanizm


163

sprzężony przysadkowo – podwzgórzowo – gonadowy, zależny od hormonów

sterydowych gonad: testosteronu oraz estradiolu. Mechanizm ten zapewnia

utrzymanie stężenia prolaktyny na fizjologicznym poziomie. Jak wykazały

badania Gill – Sharma [43] słaba lub niewielka hiperprolaktynemia może

wpływać na dojrzewanie plemników oraz ich zdolność do zapłodnienia,

określono prolaktynę, jako główny hormon regulujący płodność samców. Poza

tym prolaktyna bierze udział w patogenezie niektórych chorób: zaburzeniach

steroidogenezy, niepłodności, niektórych chorobach autoimmunologicznych,

osteoporozie oraz nowotworach [9].

4. Gen prolaktyny oraz gen receptora prolaktyny

W związku z licznymi funkcjami jakie prolaktyna spełnia w organizmie

zwierzęcym [12, 44, 45, 46, 47] istotne jest poszukiwanie genetycznego

podłoża warunkującego występowanie poszczególnych form PRL. Analiza

powiązań polimorfizmu genu prolaktyny oraz cech funkcjonalnych

zwierząt gospodarskich związanych z rozrodem podkreśla celowość

wytypowania genu PRL jako markera cech użytkowości rozpłodowej.

U ssaków gen prolaktyny (zbudowany z 5 eksonów oraz 4 intronów)

został zidentyfikowany na chromosomie 6, blisko genów kodujących układ

zgodności tkankowej HLA [48, 49]. U świni domowej gen PRL kodujący

hormon prolaktynę zlokalizowano na chromosomie 7 [50], u bydła

natomiast na chromosomie 23 [51]. Cowan i wsp [52] zidentyfikowali

miejsce polimorficzne w obrębie genu prolaktyny bydła przy użyciu

enzymu restrykcyjnego Ava II. Polimorfizm wynikał z delecji/insercji

około 200 par zasad w pobliżu genu PRL. Z kolei badania przeprowadzone

przez Hart i wsp [53] wykazały cztery allele SSCP w rejonie flankującym – 5'

genu prolaktyny. Także Klauzińska i wsp [54] opisali pojedyncze substytucje

nukleotydów w regionie – 5' genu PRL. Chung i wsp [55] wykazali istotne

zależności polimorfizmu identyfikowanego przy użyciu enzymu restryk-

cyjnego RsaI a wydajnością mleczną oraz procentowym udziałem tłuszczu w

mleku bydła mlecznego. Badania przeprowadzone przez Dybusa [56]

wykazały, że krowy o genotypach AA charakteryzowały się wyższym

udziałem białka w mleku w porównaniu do osobników heterozygotycznych.

Babicz i wsp [57] wykorzystali polimorfizm w regionie 3’UTR

w 5 eksonie do poszukiwania zależności pomiędzy zmiennością w locus

PRL a wartością cech rozrodczych loch rasy puławskiej. Analiza cech

płodności potencjalnej wykazała zależność między polimorfizmem w locus

PRL a wielkością określonych wskaźników. Intensywność przejawianych

zachowań rujowych była statystycznie istotnie większa u samic o genotypie

B/B w porównaniu do obserwowanych u loch A/A. Przewaga loch

o genotypach B/B obserwowana była także w odniesieniu do: takich cech,


164

jak: masa macicy, długość prawego rogu macicy, długość lewego rogu

macicy, łączna długość rogów macicy oraz liczba ciałek żółtych

umiejscowionych na jajniku prawym. Ponadto, samice o genotypie B/B

rodziły więcej żywych prosiąt w miocie [57].

Wieloletnie badania genu receptora prolaktyny spowodowały uznanie

PRLR jako genu kandydata odpowiedzialnego za cechy związane

z rozrodem [50, 58]. Gen receptora prolaktyny (PRLR) zlokalizowany jest

na chromosomie szesnastym w pozycji q 1.4 lub q 2.2 – 2.3 [59, 60].

U ssaków receptor prolaktyny wykryto w różnych tkankach, np. u świni

domowej: w mózgu, macicy, jajnikach oraz łożysku [61]. Receptor ten jest

białkiem międzybłonowym zaliczanym do rodziny receptorów

cytokinowych klasy I, wykazującym duże podobieństwo do receptora

hormonu wzrostu (GHR) [17, 62]. Sus scrofa domestica L. w gruczole

mlekowym posiada dwie formy receptorowe, długą oraz krótką; długa

zbudowana jest z 592 aminokwasów, krótka natomiast w swej budowie

liczy 291 aminokwasów [63, 64]. Zauważono, że zwierzęta które posiadają

zablokowane formy PRLR nie wykazują dostatecznej matczynej opieki

nad swym potomstwem [65].

Prowadzone w ostatnich latach badania dotyczące polimorfizmu genu

prolaktyny (PRL) oraz genu receptora prolaktyny (PRLR) dowodzą,

iż geny te w sposób pośredni i bezpośredni oddziaływują na cechy

produkcyjne zwierząt gospodarskich, dzięki czemu są one rozpatrywane

jako potencjalni kandydaci na markery tychże cech. Istotne jest więc

poznanie i opisanie zależności polimorfizmu genów PRL i PRLR

w kontekście efektywnego prowadzenia hodowli zwierząt gospodarskich.

Literatura

1. Buske B., Sternstein I., Brockmann G. QTL and candidate genes for fecundity

in sows. Animal Reproduction Science, 95, 2006 , pp. 167-183

2. Ellegren H. Abundant (A)n(T)n mononucleotide repeats in the pig genome:

linkage mapping of the porcine APOB, FSA, ALOX12, PEPN and RLN loci.

Animal Genetics, 24 (5), 1993, pp. 367-372

3. Kim C.W., Hong Y.H., Yun S., Lee S., Kim Y.H., Kim M., Chung K.H., Jung

W.Y., Kwon E.J., Hwang S.S., Park D.H., Cho K.K., Lee J.G., Kim B.W.,

Kim J.W., Kang Y.S., Yeo J.S., Chang K. Use of microsatellite markers

to detect Quantitative Trait Loci in Yorkshire pigs. Journal of Reproduction

and Development, 52 (2), 2006, pp. 229-237

4. Rohrer G.A., Ford J.J., Wise T.H., Vallet J.L., Christenson R.K. Identyfication

of quantitative trait loci affecting female reproductive traits

in a multigeneration Meishan-White composite swine population. Journal

of Animal Science, 77, 1999, pp. 1385-1391


165

5. Søller M. Marker – assisted selection – an overview. Animal Biotechnology,

5, 1994, pp. 193-207

6. Rothschild M., Jacobson C., Vaske D., Tuggle Ch., Wang L., Short T.,

Eckardt G., Sasaki S., Vincent A., Mclaren D., Southwood O., Van Der Steen

H., Milehami A., Plastow G. The estrogen receptor locus is associated with

a major gene influencing litter size in pigs. Proceedings of the National

Academy of Sciences 93, 1996., pp. 201-205

7. Bonavera J.J., Sahu A., Kalra P.S. Evidence in support of nitric oxide (NO)

involvement in the cyclic release of prolactin and LH surges. Brain Res 660,

1994, pp. 175-179

8. Horseman N.D., Yu-Lee L.Y. Transcriptional regulation by the helix bundle

peptide hormones: growth hormone, prolactin, and hematopoietic cytokines.

Endocr Rev 15, 1994, pp. 627-649

9. Sotowska – Brochocka J. Fizjologia zwierząt. Zagadnienia wybrane, 9, 2001,

pp. 194-227

10. Colenbrander B., Erkens H. F., Meijer J. C., Poot P., Trudeau V. L., Van De

Wiel D. F. M. Prolactin in the developing Pig. Biology of reproduction,

39, 1988, pp. 264-269

11. Dusza L., Ciereszko R., (red.) Krzymowskiego T. Fizjologiczna regulacja

procesów rozrodczych samicy, Biologia Rozrodu Zwierząt. Wydawnictwo

Uniwersytetu Warmińsko – Mazurskiego, Olsztyn, 2007

12. Freemann M.E. Kannyicska B., Lerant A., Nagy G. Prolactin: structure, function

and regulation of secretion. Physiological Review, 80 (4), 2000, pp. 1523-1631

13. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W. Biochemia

Harpera. Wydawnictwo lekarskie PZWL, Warszawa, 1995

14. Michalik, J., Bartoszewicz, Z. Prolaktyna (PRL)-wielofunkcyjny, przysadkowy

hormon peptydowy. Post. Bioch, 48, 2002, pp. 296-305

15. Terman A., Kmieć M., Kowalewska – Łuczak I. Gen PRLR – marker cech

użytkowości rozrodczej loch? Medycyna Weterynaryjna 63(2), 2007,

pp. 145-146

16. Ben-Jonathan N., Mershon J. L., Allen D. L., Steinmetz R. W. Extrapituitary

prolactin: distribution, regulation, functions, and clinical aspects.

Endocrinology 17, 2006, pp. 639-669

17. Grattan D. R. Behavioural significance of prolactin signaling in the central

nervous system during pregnancy and lactation. Reprod., 123, 2002, pp. 497-506

18. Kmieć M., Terman A. Polymorphism in the PRLR/AluI gene and its effect

on litter size in Large White sows. Anim. Sci. Pap. Rep., 22, 2004. pp. 523-527

19. Goffin V., Binart N., Clement – Lacroix P., Bouchard B., Bole – Feysot Ch.,

Edery M., Lucas BK., Touraine P., Pezet A., Maaskant R., Pichard C., Helloco

Ch., Baran N., Favre H., Bernichtein S., Allamando A., Ormandy Ch., Kelly


166

PA. From the molecular biology of prolactin and its receptor to the lessons

learned from knockout mice models. Genetic Analysis: Biomolecular

Engineeing 15, 1999, pp. 189-201

20. Serri O., Chik C. L. , Ur E., et al. Diagnosis and management

of hyperprolactinemia. CMAJ, 2, 2003, pp. 23-32

21. Badowska-Kozakiewicz A. M. Biologiczna rola prolaktyny. Przegląd

Menopauzalny, 4, 2012, pp. 305-308

22. Vera-Lastra O., Jara L. J., Espinoza L. R. Prolactin and autoimmunity.

Autoimmunity reviews, 1(6), 2002, pp. 360-364

23. Bern H. A. Prolactin and osmoregulation. American Zoologist, 15(4), 1975,

pp. 937-948

24. Pahuja D. N., DeLuca, H. F. (1981). Stimulation of intestinal calcium

transport and bone calcium mobilization by prolactin in vitamin D-deficient

rats. Science, 214(4524), 1981, pp.1038-1039

25. Drogemuller C., Hamann H., Dietl O. Candidate gene markers for litter size

in different German pig lines. J. Anim. Sci., 79, 2001, pp. 2565-2570

26. Poniedziałek – Kempny K. Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt. Przegląd

hodowlany, 4, 2014, pp. 5-8,

27. Farmer C. The role of prolactin for mammogenesis and galactopoiesis

in swine. Livestock Production Science, 70(1), 2001, pp. 105-113

28. Dusza L., Sobczak J., Jana B., Murdza A., Bluj, W. Zastosowanie Biolactinu-2

(oczyszczona prolaktyna świni) do stymulacji laktacji u loch. Med.

Wet., 47, 1991, pp. 418-421

29. Taverne M., Bevers, M., Bradshaw, J. M., Dieleman, S. J., Willemse, A. H.,

& Porter D.G. Plasma concentrations of prolactin, progesterone, relaxin

and oestradiol-17β in sows treated with progesterone, bromocriptine

or indomethacin during late pregnancy. Journal of reproduction

and fertility, 65(1), 1982, pp. 85-96

30. Knight, C. H. (2001). Overview of prolactin’s role in farm animal lactation.

Livestock Production Science, 70(1), 2001, pp. 87-93

31. Zagrajczuk A., Okólski A. Role of prolactin in horse reproduction. Medycyna

Weterynaryjna, 62(6), 2006, pp. 624-627

32. Farmer C., Kensinger R. S., Hagen D. R. (1987). Relationship of estrone

and prolactin with growth and survival of piglets to 35 d of age. Journal

of animal science, 65(4), 1987, pp. 1034-1041

33. Witmer B. L. Relationships of Plasma Protein, Hematocrit,

and Concentrations of Certain Hormones in Blood to Birth Weight

and Growth Rate of Lambs (Doctoral dissertation, Pennsylvania State

University), 1985


167

34. Przała J., Gajęcki M., Przała F., Ryszka F. Prophylactic application

of Biolactin-2 preparation in replacement gilts and the MMA syndrome.

Med. Weter, 1992, 48(1), pp. 31-33

35. Szczęśniak - Fabiańczyk B., Dolińska B., Ryszka F., Smorąg Z. Efficiency

of Biolactin administered to primiparous and multiparous sows. Ann. Anim.

Sci., 2002, 2(2), pp. 173-176

36. Gajda B., Szczęśniak - Fabiańczyk B., Grad I., Poniedziałek K., Ryszka F.,

Smorąg Z., Dolińska B., Leszczyńska L. Effect of “Biolactin” administered per os

on viability and body weight of piglets. Acta Biochim. Pol., 2011, 58 (4), pp. 147

37. Gajda B., Szczęśniak-Fabiańczyk B., Poniedziałek K., Ryszka F., Dolińska B.,

Leszczyńska L., Smorąg Z. Prolaktyna jako stymulator zdrowotności i wzrostu

prosiąt. Mat. VI Zjazdu Towarzystwa Biologii Rozrodu, Polańczyk,

8-10.09.2011, pp. 106

38. Gajda B., Szczęśniak - Fabiańczyk B., Grad I., Poniedziałek K., Ryszka F.,

Smorąg Z., Dolińska B., Leszczyńska L. (2012). Effect of low prolactin dose

administered per os on mortality and body weight of piglets. Reprod.

Domestic. Anim., 47 (4), pp. 574

39. Gajda B, Szczęśniak-Fabiańczyk B, Mandryk I, Poniedziałek K, Ryszka R,

Dolińska B, Leszczyńska L, Smorąg Z. Effect of different dose of prolactin

administered per os on the viability and body weight of piglets. 29th Scientific

Meeting of AETE (European Embryo Transfer Association), 2013, pp. 136

40. Castrén,H.B. Algers de Passillé A.M.B., Rushen J., Uvnas-Moberg K.

Progesterone, prolactin, oxytocin, and somatostatin in relation to nest

building in sows. Appl. Anim. Behav. Sci., 38 (1994), pp. 91-102

41. Boulton M. I., Wickens A., Goode J. A., Lawrence A. B., Gilbert C. L. Does

Prolactin Mediate Induced Nest-Building Behaviour in Pseudopregnant Gilts

Treated with PGF2 ?, Journal of neuroendocrinology, 10, 1998, pp. 601-610

42. Rushen J., Robert S., Farmer C. Evidence of a limited role for prolactin

in the preparturient activity of confined gilts. Applied animal behaviour

science, 72(4), 2001, pp. 309-319

43. Gill-Sharma, M. K. Prolactin and male fertility: the long and short feedback

regulation. International journal of endocrinology, 2009.

44. Vincent A.L., Evans G., Southwood O.I., Plastow G.S., Tuggle C.K.,

Rothschild M.F. The prolactin receptor gene is associated with increased

litter size in pigs. Proceedings of the 6th World Congress of Genetics

and Applied Livestock Production. Armidale, Australia, 27, 1998, pp. 15-18

45. Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Rothschild M.F. 1998a. Linkage and physi-

cal mapping of prolactin to porcine chromosome 7. Animal Genetics 29, 27-29.

46. Korwin-Kosakowska A., Kamyczek M., Cieślak D., Pierzchała M., Kurył J.

2002. The effect of the polymorphism of leptin (LEP), leptin receptor (LEPR)


168

and osteopontin (OPN) genes on selected reproduction traits of synthetic Line

990 sows. Animal Science Papers and Reports 20 (3), 2002, 159-163

47. Goncikowska E., Sotowska-Brochocka J. Prolaktyna – hormon

wszechstronny. (W) Fizjologia zwierząt. Zagadnienia wybrane. Wydawnictwa

Uniwersytetu Warszawskiego, 2001, pp. 191-224

48. Fiedorowicz, M. Układ prolaktynergiczny? Wytwarzanie i rola prolaktyny

w mózgu. Kosmos, 53(3-4), (2004), pp. 305-314

49. Goffin V., Binart N., Touraine P., & Kelly, P. A. Prolactin: the new biology

of an old hormone. Annual Review of Physiology, 64(1), (2002), pp. 47-67

50. Korwin – Kossakowska A., Kamyczek M., Cieślak D., Pierzchała M., Kurył J.

Candidate gene markers for reproductive traits In polish 990 pig line.

J. Anim. Breed. Genet. 120, 2003, pp. 181-191

51. Barendse W., Vaiman D., Kemp S.J., Sugimoto Y., Armitage S.M., Williams

J.L., Sun H.S., Eggen A., Agaba M., Aleyasin S.A., Band M., Bishop M.D.,

Buitkamp J., Byrne K., Collins F.; Cooper L.; Coppettiers W.; Denys B.;

Drinkwater R.D.; Easterday K.; Elduque C.; Ennis S.; Erhardt G.; Ferretti L.;

Flavin N.; Gao Q.; Georges M.; Gurung R.; Harlizius B.; Hawkins G.; Hetzel

J.; Hirano T.; Hulme D.; Jorgensen C.; Kessler M.; Kirkpatrick B.W.;

Konfortov B.; Kostia S.; Kuhn C.; Lenstra J.A.; Leveziel H.; Lewin H.A.;

Leyhe B.; Lil L.; Martin Burriel, I.; Mcgraw R.A.; Miller, J.R.; Moody D.E.;

Moore S.S.; Nakane S.; Nijman I.J.; Olsaker I.; Pomp D.; Rando A.; Ron M.;

Shalom A.; Teale A.J.; Thieven U.; Urquhart B.G.D.; Vage D.-I.; Van De

Weghe, A.; Varvio S.; Velmala R., Vilkki J., Weikard R., WoodsideC.,

Womack J.E., Zanotti M., Zaragoza P. A medium-density genetic linkage map

of the bovine genome. Mammalian Genome, 8, 1997, pp. 21-28

52. Cowan C. M, Dentine M.R, Ax R.L. Schuler L.A., Structural variation around

prolactin gene linked to quantitative traits in an elite Holstein sire family.

Theoretical and Applied Genetics, 79, 1990, pp. 577-582

53. Hart G.L., Bastiaansen J., Dentine M.R., Kirkpatrick B.W., Detection

of a four-allele single strand conformation polymorphism (SSCP) in the bovine

prolactin gene 5’ flank. Animal Genetics, 24, 1993, pp. 149

54. Klauzińska M.; Grochowska R.; Zwierzchowski L. Polymorphism

of the 5’ flanking regions of the prolactin and growth hormone receptor genes of

cattle. 14TH

Congress of Polish Genetics Society, Book of Abstracts, 2001, pp. 84

55. Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K. Associations between PCR-RFLP markers

of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle.

Korean Journal of Animal Science, 38, 1996, pp. 321-336

56. Dybus A. Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes

polymorphisms with milk production traits in polish Black-and-White cattle.

Animal Science Papers and Reports, 20, 2002, pp. 203-212


169

57. Babicz M., Pierzchała M., Urbański P., Rucińska-Rozempolska I.

An insertion/deletion polymorphism in the 3’ UTR encoding region

of the porcie prolactin (PRL) gene. Animal Science Papers and Reports 26(3),

2008, pp. 183-189

58. Van Rens B. T. T. M., Van Der Lende T. Litter size and piglet traits of gilts with

different prolactin receptor genotypes, Theriogenol. 57, 2002, pp. 883-893

59. Putnova L., Knoll A., Dvorak J., Cepica S. A new HpaII PCR – RFLP within

the porcine prolactin receptor (PRLR) gene and study of its effect on litter size

and number of teats. J. Anim. Breed. Genet. 119, 2002, pp. 57-63

60. Terman A. Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin

(LEP) genes on litter size In polish pigs. J. Anim. Breed. Genet. 122, 2005,

pp. 400-404

61. Mazurowski A., Mroczkowski S. Analiza polimorfizmu genu prolaktyny (PRL)

i genu receptora prolaktyny (PRLR). Journal of Health Sciences, 4(9), 2014

62. Kelly P. A., Djiane J., Postel – Vinay M. C., Edery M. The prolactin/growth

hormone receptor family. Endocr. Rev. 12, 1991, pp. 235-251

63. Bole – Feysot C., Goffin V., Edery M., Binart N., Kelly P.A. Prolactin (PRL)

and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes

observed in PRL receptor knockout mice. Endocr. Rev. 19, 1998, pp. 225-268

64. Lesueur L., Edery M., Ali S., Paly J., Kelly P. A., Djiane J. Comparison

of long and short forms of the prolactin receptor on prolactin – induced milk

protein gene transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1991, 824-828

65. Farmer C., Sorensen M. T., Robert S., Petitclerc D. 1999. Administring exogenous

porcine prolactin to lactating sows: milk yield, mammary gland composition, and

endocrine and behavioral responses. J. Anim Sci. 77: 1851-1859

The role of prolactin in reproduction of farm animals

Abstract Prolactin belongs to the family of protein hormones. The functions of prolactin in the body

are extensive and far outside the scope of reproduction. This hormone plays an important

role in the metabolism, growth, development, behaviour, and in homeostasis maintaining.

So far, has been documented more than 300 types of interactions of prolactin hormone on a specific biological functions in mammals organisms. Prolactin, beyond the control

of reproductive and immune functions affects lactogenesis and lactopoesis, water -

electrolyte balance, body cells growth and differentiation, stimulation of proliferation:

melanocytes, keratinocytes, hepatocytes, renal tubular epithelial cells, intestinal epithelial cells, cells of vascular smooth muscle, B cells of pancreatic islets and astrocytes.

All activities of prolactin indirectly are related to animals reproduction. The 38%

of the activity of prolactin associated with the processes of reproduction. Whereas, the most

important function of prolactin is to stimulate and maintain mammary gland secretory function

The aim of this study was to determine the influence of prolactin on livestock breeding.

170

Blanka Bukowska1

Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia:

problemy pediatryczne u psów

Okres poporodowy (neonatalny) jest to okres od urodzenia szczenięcia do osiągnięcia przez niego 3 tygodnia życia lub momentu kiedy zwierzę

zaczyna chodzić oraz samodzielnie oddawać mocz i kał. Prawidłowa opieka

nad szczenięciem sprawowana przez hodowcę i lekarza weterynarii

decyduje o zdrowiu, zdolności użytkowej i płodności osobników dorosłych. W wczesnym okresie noworodkowym notuje się najwyższą śmiertelność

kociąt i szczeniąt, dlatego też okres ten powinien być objęty bacznym

nadzorem. Niniejsza praca prezentuje ważniejsze aspekty i informacje

z zakresu pediatrii szczeniąt w poszczególnych etapach ich rozwoju.

Wstęp/Wprowadzenie

Okres neonatalny, obejmujący pierwsze tygodnie życia szczeniąt, jest

czasem intensywnego wzrostu i rozwoju szczenięcia. Charakteryzuje

się również zwiększoną podatnością na zachorowania wśród osesków.

Przetrwanie szczeniąt w tym okresie jest uzależnione od instynktu

macierzyńskiego suki oraz od warunków zoohigienicznych stworzonych

przez hodowcę. Nowo narodzone szczenię jest podatniejsze na wiele

schorzeń i stany patologiczne ze względu na fizjologiczną niedojrzałość

wielu procesów życiowych w przeciwieństwie do innych gatunków ssaków.

W przypadku szczeniąt śmiertelność pomiędzy narodzinami

a 8 tygodniem życia (przed odstawieniem) wynosi prawie 20%. Zwłaszcza

dwie pierwsze doby życia wydają się być kluczowe dla nowonarodzonych

szczeniąt [1]. Czynniki ze strony płodu takie jak niska masa urodzeniowa,

niedotlenienie podczas porodu, stan po urodzeniu, pobranie siary; ze strony

matczynej (szczepienia matki, inbred, wady i deformacje na tle czynników

genetycznych); czynniki środowiskowe (teratogenne) oraz czynniki

zakaźne predysponują szczenięta do wystąpienia stanów zagrożenia życia.

Celem lekarza weterynarii jest w pierwszej kolejności rozpoznanie

przyczyny choroby, następnie wdrożenie odpowiedniego leczenia oraz

poinstruowanie hodowcy odnośnie indywidualnej opieki nad oseskiem.

Celem pracy jest przedstawienie ważniejszych zagadnień i wiadomości

z zakresu pediatrii szczeniąt. W niniejszej pracy opisane są charakterystyczne

dla okresu neonatalnego u psów oraz algorytm postępowania terapeutycznego.

1 [email protected], Katedra Rozrodu Zwierząt z Kliniką, Wydział Medycyny

Weterynaryjnej w Olsztynie


Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów

171

2. Pozorna śmierć noworodków (zamartwica, niedotlenienie)

Zapotrzebowanie na tlen u noworodków jest 3-krotnie wyższe

niż u osobników dorosłych ze względu na szybką przemianę materii. Przez

zamartwicę należy rozumieć stan duszenia się płodu (noworodka)

w następstwie znacznego zubożenia jego krwi w tlen, a wzrostu stężenia

dwutlenku węgla. U noworodków obserwuje się zamartwicę wczesną, czyli

siną oraz zamartwicę późną, czyli bladą [2]. Zamartwicę wczesną

obserwujemy tuż po porodzie. U szczenięcia następuje zasinienie błon

śluzowych, tachykardia i nieregularne oddechy (przy zachowanych

odruchach i napięciu mięśni). Zamartwica blada rozwija się w późniejszym

czasie niż forma sina. U szczenięcia obserwujemy bezdech, zapaść

krążeniową, tony serca są osłabione lub nadmiernie przyśpieszone. Ciało

zwierzęcia jest zwiotczałe a widoczne błony śluzowe i niepigmentowana

skóra są wyraźnie blade. U szczeniąt przypadki zamartwicy wczesnej mają

dobre rokowanie, gdy noworodkowi udzieli się odpowiednio

szybko pomocy.

W pierwszej kolejności należy udrożnić górne drogi oddechowe czyli

uwolnić jamę ustną, nosowo-gardłową i krtań z zalegającego tam śluzu

owodniowego. Następnie należy zainicjować proces oddychania poprzez

pobudzenie nerwowego ośrodka oddechowego. Drogi oddechowe

udrażniane są poprzez ułożenie główki znacznie niżej niż tylnej części

ciała, odsysanie zalegających płynów z nosa i pyszczka. Raczej nie zaleca

się huśtania i gwałtownego potrząsania ciałem noworodka z powodu

niebezpieczeństwa uszkodzenia delikatnej tkanki mózgowej. W celu

wywołania oddechów stosuje się inhalacje do płuc czystego tlenu albo

mieszanki tlenu z azotem (95% N2 i 5% O2). Kwasicę oddechową

neutralizuje się, podając 1,3-1,4% dwuwęglanu sodu. Pracę ośrodka

oddechowego pobudza się masażem grzbietu, uciskaniem klatki piersiowej

i wdmuchiwaniem powietrza przez otwory nosowe, a także przez

podawanie stymulujących preparatów (Respirot, Pneumogen lub Doxapram

w dawce 1mg/kg m.c. podjęzykowo).

3. Szczenię – uwarunkowania fizjologiczne

Okres noworodkowy u szczeniąt oraz innych gatunków z rodziny

naczelnychwymaga wiele uwagi, opieki i ochrony ze strony hodowcy

jak również lekarza weterynarii. Szczenięta podczas odchowu powinny

znajdować się w specjalnie przygotowanym kojcu. Powinien on być na tyle

duży by samica mogła swobodnie się w nim poruszać i ułożyć do karmienia [3].

Noworodki charakteryzują się wieloma unikalnymi cechami fizjologicz-

nymi, anatomicznymi, żywieniowymi oraz behawioralnymi, co znacznie

odróżnia je od dorosłych osobników [4].

Blanka Bukowska

172

Początkowy spadek temperatury ciała zaraz po porodzie wydaje

się być skutecznym sposobem obrony przed następstwami niedotlenienia.

Czas przeżycia u szczenięcia wzrasta wraz z obniżeniem stopnia

metabolizmu. Po porodzie ważna jest obserwacja masy urodzeniowej

noworodków(zależna rasowo oraz jej dziennych przyrostów. Szczenięta

powinny podwoić urodzeniową masę ciała po 8-10 dniach. Sen zajmuje

około 90% doby, normalnie pobieranie pokarmu oraz niezaburzony odruch

połykania muszą być widoczne. Tabela I obrazuje ważniejsze prawidłowe

wartości podstawowych parametrów fizjologicznych u szczeniąt. W tabeli

II przedstawiono ważniejsze informacje z rozwoju podstawowych

umiejętności psich noworodków.

Tabela 1. (Prawidłowe wartości podstawowych parametrów fizjologicznych u szczeniąt.)

Szczenię – parametr Wartość

Masa ciała Zależna rasowo

Lp. oddechów 15-35/minutę

Tętno 180-220/minutę

Temperatura 34,4-37,2C

Źródło: [1, 5, 10]

Tabela 2. (Rozwój podstawowych umiejętności szczeniąt.)

Zdolność Wiek

Dominacja mięśni prostowników (napięcie) 3 dzień

Drżenie podczas snu, początek czołgania się Od 1 tygodnia

Podwojenie urodzeniowej masy ciała,

otwarcie powiek

Od 10 dnia

Otwarcie kanału słuchowego Między 6-17 dniem

Słyszenie czynnościowe 4-6 tygodni

Samoczynne wydalanie 3 tygodnie

Źródło: [5]

Nowonarodzone szczenię wykazuje najczęściej ograniczoną,

niepełnąodpowiedźorganizmu na czynniki chorobowe a występujące

u niego objawy kliniczne rzadko wskazują na konkretną jednostkę

chorobową. W celu prawidłowego zinterpretowania wyników badania

klinicznego, ważna jest wiedza, co jest normą dla szczenięcia w danym

wieku. Lekarz weterynarii powinien postępować w myśl zasady

iż noworodek to niemały dorosły. Stopniowo wzrastająca temperatura

w pierwszych tygodniach życia, przekrwienie błon śluzowych do 7 dnia

życia, neonetalna leukocytoza, anemia, glikozuria poniżej 7 tygodnia życia

to jedne z wielu fizjologicznych stanów, które nie wskazują na objawy

chorobowy lub zaburzeń u psiego noworodka.


173

4. Najczęściej spotykane problemy pediatryczne oraz terapia

4.1. Małe zdolności termoregulacyjne

Nowonarodzone szczenię ma temperaturę ciała wynosząca 35-36,5C.

Dreszcze i skurcz naczyń w celu podtrzymania ciepła nie występują

w pierwszych dniach życia. Brązowy tłuszcz obecny u noworodka jest

zużywany w termogenezie bezrdzeniowej. Dreszcze pojawiają się

u noworodka od 6 dnia życia, natomiast dyszenie występuje u przegrzanych

nowonarodzonych szczeniąt [6]. W 2 i 3 tygodniu życia temperatura

u zdrowego szczenięcia wynosi 36-38C, a po odsadzeniu temperatura rektalna

prawie zrównuje się z temperaturą u dorosłych psów [6].

Anormalnie niska temperatura u szczenięcia czyli 35C predysponuje

do zaburzeń ssania, odwodnienia, spadku motoryki jelit i następującej

atonii lub porażenia, wzrasta także podatność na zakażenia herpeswirusowe

lub bakteryjne. Spadkowi temperatury towarzyszy spadek częstotliwości

pracy serca (temperatura 21,1C – 40-50 uderzeń/minutę). Jeśli stan

ten utrzymuje się dłużej to obniża się również częstotliwość oddechów,

co może prowadzić do niewydolności krążeniowo-oddechowej. Większość

noworodków w tym stanie umiera. U szczeniąt z hipotermią wskazane jest

powolne ogrzewanie w temperaturze 28-30C za pomocą butelek z ciepłą

wodą owiniętymi w ręcznik. Dużym błędem popełnianym przez hodowców

jest zapewnienie ciepła bez pozostawienia szczenieniu możliwości

przemieszczenia się do nieprzegrzanego miejsca. U takich zwierząt

występuje zwiększone ryzyko zgonu po zbyt długiej ekspozycji na wysokie

temperatury otoczenia. Pomiar ciepłoty ciepła w prostnicy wskazuje

zwykle na 39-40C ponieważ noworodek w tym wieku nie ma zdolności

regulowania temperatury ciała. Przegrzane szczenięwokalizuje i próbuje

wyczołgać się z kojca. Przeniesienie zwierzęcia do temperatury pokojowej

prowadzi do ustąpienia objawów i zaprzestania wokalizacji.

W przypadku znacznej hipotermii można podawać płyny ogrzane

do temperatury 35-37C dożylnie lub doszpikowo. Ze względu na duże

ryzyko zachłystowego zapalenia płuc nie należy szczeniętom poddawać

płynów doustnie.

4.2. Hipoglikemia

Kliniczne objawy hipoglikemii u szczeniąt pojawiają się gdy poziom

cukru we krwi spada poniżej 40 mg/dl. Hipoglikemia u noworodków

(najczęściej u ras typu toy) może być spowodowana rozmaitymi

przyczynami – hipotermią, posocznicą, głodzeniem, toksycznym mlekiem

lub kombinacjami tych czynników [7]. Jest to często spotykany problem

Blanka Bukowska

174

u szczeniąt osieroconych lub chorych. Wynika najczęściej z nie w pełni

rozwiniętego funkcjonowania wątroby oraz szybkiego zużywania zapasów

glukozy. Noworodki rodzą się z małymi zapasami glikogenu w wątrobie

i małą aktywnością enzymów wykorzystywanych w procesie glukoneo-

genezy, małą masą mięśniową i tkanki tłuszczowej oraz ograniczoną

możliwością wykorzystania wolnych kwasów tłuszczowych jako źródła

energii, co niewątpliwie przyczynia się do ryzyka wystąpienia

hipoglikemii. Nowonarodzone szczenięta cierpiące na hipoglikemie

znajdują się pod wpływem olbrzymiego stresu, wykazują zaburzenia

funkcji układu pokarmowego, w wyniku czego są wychudzone, maja

biegunkę i wymiotują. Inne objawy to apatia, niechęć do ssania, otępienie,

drgawki i drżenia, czasami występuje pobudzenie, wokalizują (piszczą),

intensywne łaknienie oraz utrata przytomności [7].

Terapia obejmuje zastosowanie powolnego dożylnego wlewu glukozy

0,5-1,0 g/kg jako 5-10% roztworu glukozy w płynie Ringera lub soli

fizjologicznej [7]. Należy unikać podawania większej ilości glukozy

dożylnie z powodu możliwości wywołania zapalenia żył. Większe stężenie

glukozy powinno być podawane bezpośrednio na błony śluzowe jamy

ustnej [8]. Nie należy podawać hipertonicznego roztworu dekstrozy

w formie podskórnej, ponieważ może dojść do martwicy tkanek

w miejscu iniekcji.

4.3. Odwodnienie

Mocz noworodka jest zazwyczaj bezbarwny, a jego żółte zabarwienie

świadczy o odwodnieniu organizmu [6]. Oseski są również wrażliwe

na przeciążenie ustroju nadmierną ilością płynów podawanych w krótkim

odstępie czasowym, dlatego terapię zastępczą płynami należy

przeprowadzać bardzo ostrożnie [9]. Jeśli odwodnienie jest nieznaczne,

temperatura ciała prawidłowa i nie występują zaburzenia żołądkowo-

jelitowe, można podać doustnie lub podskórnie płyny. Przy odwodnieniu

umiarkowanym do silnego, najskuteczniejsza jest płynoterapia dożylna.

Płyny podawane podskórnie wchłaniają się powoli, przez co nie obciążają

homeostazy organizmu. Kolejna drogą wykorzystywaną w celu

nawodnienia oseska jest dootrzewnowe podawanie płynów. Płyny

podawane tą drogą wchłaniają się wolno i sposób ten nie nadaje

się do długotrwałego nawodniania. Przy podaniu płynów dożylnie lekarz

weterynarii ma do dyspozycji żyłę szyjną lub odpromieniową u oseska.

Przy wkłuciu się należy zachować zasady aseptyki z uwagi na niedojrzały

układ immunologiczny u szczenięcia oraz ryzyko zakażenia. W przypadku

utrudnionego dostępu do żyły, należy pomyśleć o alternatywnej drodze

podania płynów. Dostęp do szpikowy przy wykorzystaniu dołu kretarzowego


175

kości udowej jest najlepszą alternatywą dla dostępu dożylnego. Tą drogą

można podawać krew, płyny oraz leki. Należy stosować płyny chłodne. Zbyt

duża ilość podana w zbyt krótkim czasie może wywołać ból. Wśród

komplikacji iniekcji do szpikowych należy wymienić infekcje, wydostawanie

się płynów poza miejsce iniekcji oraz urazy.

Zapotrzebowanie na płyny u szczeniąt zapewniające utrzymanie

prawidłowych funkcji życiowych, wynosi 80-100ml/kg/dzień. Można

stosować roztwór 5% glukozy z płynem Ringera w proporcji 1:1 [8]. Płyny

należy podawać dożylnie z szybkością 3-4 ml/kg/godz [8].

4.4. Zespół toksycznego mleka

U szczeniąt do 21 dnia życia może wystąpić zespół toksycznego mleka,

wywołujący biegunkę, najczęściej obserwowaną między 3-14 dniem po

porodzie.

Zakażenie subkliniczne macicy suki najczęściej prowadzi

do wchłaniania toksycznych produktów i wydzielania ich z mlekiem.

Szczenięta dotknięte tym schorzeniem wykazują biegunkę, kolkę gazową

oraz często obrzęk odbytu. Odsadzenie szczenięcia prowadzi do ustąpienia

objawów. Przez następne 12-24 godziny podajemy jedynie ciepły płyn

fizjologiczny, następnie preparat mleko zastępczy. Celowe jest sztuczne

dokarmianie przez następne dni (do czasu ponownego zbadania

i wyleczenia suki).

4.5. Niezakaźna biegunka noworodków

Przekarmienie lub nieprawidłowy skład preparatów mleko zastępczych

(np. domowej produkcji) mogą prowadzić do rozwinięcia się biegunki

u szczeniaka. W obu przypadkach dochodzi do przekroczenia wydajności

enzymów trawiennych, zakwaszenia jelit oraz zwiększenia produkcji żółci.

Kał wykazuje zmianę barwy : od zielonej (żółć) przez szary do białego

(kiedy nie pozostały żadne enzymy trawienne). Niestrawione mleko jest

pożywką dla bakterii, co stanowi podstawę dla rozwoju wtórnej infekcji

bakteryjnej. Na początku zalecane jest leczenie objawowe. Terapia polega

na ostawieniu pokarmu, rehydratacji (5% glukoza z płynem Ringera s.c.,

5-10% glukoza per os) i stosowaniu antybiotyków. Do picia można

podawać rozcieńczoną herbatę. Po ustąpieniu objawów należy ograniczyć

ilość pokarmu lub go zmienić [10].

4.6. Choroby infekcyjne

Najczęstsza przyczyna są infekcje bakteryjne. Do często spotykanych

patogenów należą : E.coli, paciorkowce (S.canis) i gronkowce (S.aureus

i S. pseudointermdius), Klebsiella sp., Psudomonas sp.oraz beztlenowce.

Blanka Bukowska

176

Szczepy gronkowców od chorych szczeniąt izolowane są głównie z mleka

i pochwy ich matek. U szczeniąt padłych z powodu posocznicy, te same

szczepy są izolowane podczas sekcji zwłok z narządów wewnętrznych,

z próbek mleka, kału i z pochwy ich matki. Postacie kliniczne obejmują

miejscowe infekcje skóry, płuc, oczu i innych narządów. Stany posocznicowe

najczęściej przebiegają z nagłąśmiercią.

Przeciwciała przekazane biernie przez matkę chronią szczenięta przed

powszechnie występującymi wirusami. Jeśli suka nie nabyła odporności

przeciwko nim, także nowo narodzone szczenięta mogą cierpieć z powodu

zakażeń parwowirusem lub nosówką. Infekcje herpeswirusem psim

są uważane za częstą przyczynę strat nowonarodzonych szczeniąt.

W zakażeniach tych szczenięta zwykle padają przed osiągnięciem

3 tygodnia. Możliwe jest szczepienie (dwa razy w ciągu ciąży) w celu

ochrony szczeniąt za pomocą przeciwciał.

Terapia farmakologiczna u oseska uzależniona jest od kliku czynników,

które wpływają na wchłanianie leków, dystrybucję, wiązanie oraz

metabolizm. Iniekcje dożylne są korzystniejsze niż droga podskórna czy

domięśniowa. Większość leków nie była testowana na nowonarodzonych

szczeniętach, stąddawkowanie i częstotliwość podania opiera się na

własnych doświadczeniach i obserwacjach. Zwykle dawkidla dorosłych

osobników zmniejszane są o 30-50% lub zwiększa się przerwy pomiędzy

kolejnymi dawkami. U młodych szczeniąt należy unikać stosowania

pewnych antybiotyków takich jak aminoglikozydy, chloramfenikol,

tetracykliny oraz potencjalizowane sulfonamidy. Antybiotykami zaleca-

nymi są chinolony oraz antybiotyki beta-laktamowe.

W wieku 10 dni u szczeniąt można znaleźć pierwsze glisty. Infekcje

Trichomonasfetusnie są rzadkie, ale często przechodzą niezdiagnozowane.

U kociąt jak i szczeniąt występuje nawracająca, ostra, wodnista biegunka,

z typowym wyglądem kału oraz żywymi stadiami pasożyta widocznymi

pod mikroskopem, w świeżych, natywnych próbkach. Terapia ronidazolem

jest leczeniem z wyboru. Można spróbować leczenia metronidazolem,

jednakże oba leki mają wiele efektów ubocznych w tak młodym wieku [11].

4.7. Wady wrodzone

Choroby wrodzone to takie, które – widoczne lub nie – obecne

są w chwili narodzin. Mogą być one tła genetycznego albo są spowodowane

czynnikami teratogennymi, w niektórych przypadkach także fenokopiami

[11]. Choroby wrodzone dotyczą około 1-2% nowo narodzonych szczeniąt.

Zaburzenia te manifestują się urodzeniem martwych, zdeformowanych

płodów wymagających szybkiego uśpienia zaraz po urodzeniu [12].

Anomalie typu mikroanatomicznego lub biochemicznego zazwyczaj prze-


177

chodzą niezauważone i kryją się za szczeniętami martwo urodzonymi,

słabnącymi lub niewyjaśnionymi przyczynami padnięć. Niektóre anomalie

mózgu, serca lub układu oddechowego mogą powodować natychmiastowe

zagrożenie życia, podczas gdy inne wady pozostają niezauważone przez

różnie długi czas, w zależności od ich umiejscowienia. Występowanie

patognomicznych objawów – typowych oznak, na podstawie których można

podejrzewać lub zdiagnozować chorobę – pomaga w niektórych przypadkach

rozpoznać problem. W innych przypadkach RTG, ultrasonografia,

endoskopia lub badania krwi mogą pomóc w zdiagnozowaniu zaburzeń

i określeniu rokowania. Niektóre wady wewnętrzne mogą zostać wykryte

przypadkowo ( np. podczas operacji lub sekcji). W praktyce większość wad

wrodzonych jest nie do przewidzenia i nie do uniknięcia, dlatego są one

odpowiedzialne za dużą część upadków lub eutanazji szczeniąt. Szacunkowa

liczba niezgłaszanych przypadków jest prawdopodobnie o wiele większa niż

odsetek podawany w piśmiennictwie, zwłaszcza odnośnie wad wewnętrznych.

5. Podsumowanie

Odsetek okołoporodowych chorób i upadków szczeniąt – z pominięciem

martwo urodzonych i innych strat porodowych – jest najwyższy

w pierwszych dniach życia. Czynniki takie jak niedotlenienie podczas

porodu, małe zdolności termoregulacyjne, hipoglikemia, odwodnienie,

zespół toksycznego mleka, wady i deformacje na tle czynników

genetycznych oraz teratogennych, czynniki środowiskowe oraz czynniki

zakaźne predysponują szczenięta do wystąpienia stanów zagrożenia życia.

Pierwszym zadaniem lekarza weterynarii jest ustalenie przyczyny choroby,

drugim wybranie odpowiedniego algorytmu postępowania, a trzecim

przeszkolenie hodowcy (właściciela) odnośnie samodzielnej opieki

nad szczenięciem lub miotem [11].

Blanka Bukowska

178

Literatura

1. Mila H., Chastant-Maillard S. The first two days of life of puppies : crucial

steps for survival,17th EVSSAR CONGRESS – Reproduction and Pediatric

in Dogs, Cats and Exotics., 1 (2014), pp 127

2. Bielas W. Pozorna śmierć noworodkówRozród Zwierząt, red. A.Dubiel,

Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 459-460

3. Niżański W. Opieka lekarska nad suką hodowlaną (przeznaczoną do rozrodu)

Rozród Zwierząt, red. A.Dubiel, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w

Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 379

4. Evermann J.F., Wills T. Immunologic developmental and immunization Small

animal peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo

Elsevier, WB Saunders Comp 2011, rozdział 8

5. Little S. Osierocone kocięta, Veterinaryfocus, 16(2006), pp3

6. Root- Kustritz M.V. History and physical examination of the neonate Small

animal peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo

Elsevier, WB Saunders Comp 2011, rozdział 3

7. Fitzgerald K.T., Newquist K.L Husbandry of the neonate neonateSmall animal

peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo Elsevier,

WB Saunders Comp 2011, rozdział 6

8. Casal M. Managment and critical care of the neonate Manual of canine and

feline reproductiion and neonatology, red. G.C. England, Wydawnictwo

Heimendhal 2010, rozdział 15

9. Bielas W., Siemieniuch M. Neontologia szczeniąt i kociąt, cz I, Weterynaria

w Praktyce , 6 (2005) pp 8-16

10. Zduńczyk S., Janowski T. Zapalenie jelit (biegunka) Zaburzenia rozrodu psów

i kotów, Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie,

Olsztyn 2010, pp79

11. Muennich A. Problemy pediatryczne u psów : noworodek to nie mały dorosły,

Sympozjum Problemy w rozrodzie psów i kotów (płodność, ciąża

noworodek), 1(2013), pp 120-121

12. Bielas W. Wady wrodzone Rozród Zwierząt, red. A.Dubiel, Wydawnictwo

Akademii Rolniczej w Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 445-449

Puppies during the first weeks of life: the pathological newborn in dogs

The neonatal period is defined as the period from birth through 3 weeks of age, or when the puppy is walking and capable of spontaneous urination and defecation. Proper

careexercised by thebreederandveterinarian of puppies determines the future health

and reproductive performance of the adult animals. In the early neonatal period recorded

the highest mortality in the kittens and puppies, therefore, this period should be covered by the watchful supervision. This paper presents important data and information concerning

paediatric problems in dogs during consecutive stages of puppy development.

179

Agata Pawłowska1, Joanna Kwiczak

2, Donata Pluskota-Karwatka

3

Aminofosfoniany

we współczesnej syntezie organicznej

Znaczenie aminofosfonianów w syntezie wynika z faktu ich strukturalnego podobieństwa do aminokwasów oraz obecności w cząsteczkach atomów

fosforu. Modyfikacja budowy aminofosfonianów, poprzez wprowadzenie

dodatkowych grup funkcyjnych, np. zawierających atom fluoru, może

wpłynąć na zmianę właściwości fizyko-chemicznych oraz ewentualnej aktywności biologicznej tej grupy związków. Wśród aminofosfonianów

można wyróżnić związki charakteryzujące się właściwościami przeciw-

nowotworowymi przeciwgrzybiczymi, przeciwwirusowymi czy owado-

bójczymi, co sprawia, żezwiązki te mogą znaleźć zastosowanie w farmacji, w medycynie jak również w rolnictwie.

1. Wprowadzenie

Aminofosfoniany stanowią analogi aminokwasów, w których grupa

karboksylowa została zastąpiona zestryfikowaną resztą kwasu fosforowego

(V) (rys. 1). Pierwsza wzmianka dotycząca aminofosfonianów pochodzi

z 1940r. i znajduje się w pracach opisujących syntezę kwasu

aminometanofosfonowego [1]. Minęło jednak jeszczedwadzieścia lat zanim

rozpoczęto intensywne i bardziej regularne badania z udziałem aminofos-

fonianów. Przyczyniło się do tego odkrycie kwasu 2-aminoetano-

fosfonowego, związku, który w znacznych ilościach występuje w organizmie

człowieka. Obecnie aminofosfoniany stały się przedmiotem badań

naukowców na całym świecie [2]. Znaczenie biologiczne tej grupy związków

wynika nie tylko z podobieństwa budowy ich cząsteczek do cząsteczek

istotnych dla życia aminokwasów, ale także z posiadania w swojej strukturze

atomu fosforu. Makroelement ten wchodzi bowiem w skład równie ważnych

biomolekuł takich jak kwasy nukleinowe; RNA i DNA, fosfolipidy oraz

ATP. Ze względu na charakteryzującą je aktywność biologiczną

aminofosfoniany znajdują zastosowanie w medycynie i rolnictwie, mogą

także pełnić ważne funkcje w organizmach żywych, między innymi mogą

być inhibitorami różnej klasy enzymów.

[email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu [email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza

w Poznaniu [email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu





180

Rys. 1. Struktury aminofosfonianów

2. Znaczenie biologiczne aminofosfonianów

Szerokie spektrum właściwości i potencjalna aktywność biologiczna

sprawia, że aminofosfoniany mogą mieć zastosowanie zarówno

w medycynie i farmacji, jak i w rolnictwie. Wśród aminofosfonianów

można znaleźć związki charakteryzujące się właściwościami przeciwno-

wotworowymi, przeciwzapalnymi, przeciwbakteryjnymi, przeciwwiru-

sowymi, przeciwgrzybiczymi czy też owadobójczymi. Ponadto aminofos-

foniany mogą być stosowane jako substancje przeciwzakrzepowe, przeciw-

nadciśnieniowe, chwastobójcze oraz antykorozyjne [3-14].

Aminofosfoniany stanowią także grupę związków będących potencjalnymi

inhibitorami enzymów. Tego rodzaju aktywność przypisuje się szczególnie

pochodnym zawierającym w swojej strukturze atom fluoru. Przykładem

takich związków mogą być inhibitory: fosforylazy pirymidynowej, esterazy

serynowej, sfingomielinazy oraz dipeptydazy serynowej [3-14] (rys.2).

Rys. 2. Fluorowane aminofosfoniany jako inhibitory enzymów

Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej

181

3. Fosfonopeptydy

Aminofosfoniany mogą być wykorzystywane jako jednostki strukturalne

w analogach peptydów – w fosfonopeptydach. Fosfonopeptydy są to

związki, w których wiązanie peptydowe zostało zastąpione ugrupowaniem

fosfonianowym (rys. 3) [15].

Rys. 3. Struktura dipeptydu i fosfonopeptydu

Fosfonopeptydy można otrzymać w trójetapowym procesie. Etap

I to reakcja pomiędzy kwasem fosfinowym a trietoksymetanem. W etapie

II fosfinian etylu reaguje z odpowiednią iminą, a etap III polegający

na addycji Michaela prowadzi do utworzenia produktu końcowego

(Schemat 1) [15].

Schemat 1. Otrzymywanie fosfonopeptydów

4. Fluorowane aminofosfoniany

Jedną z możliwości modyfikowaniem aminofosfonianów jest wprowa-

dzenie do ich cząsteczek atomu fluoru bądź grup fluoroalkilowych. Taka

modyfikacja może znaleźć odzwierciedlenie w zmianie właściwości

chemicznych i fizycznych, a w konsekwencji również potencjalnej aktywności

biologicznej aminofosfonianów. Obecność atomu fluoru przyczynia się

bowiem do zmiany kwasowości grup funkcyjnych sąsiadu-jących z tym


182

atomem, a wiązania C-F, charakteryzującego się wysoką energią dysocjacji

oraz niską polaryzowalnością sprawia, że cząsteczki odznaczają się wzrostem

trwałości na proteolityczną degradację. Ponadto obecność grup fluoro-

alkilowych lub atomów fluoru poprawia lipofilowość związków o znaczeniu

biologicznym [11, 12] oraz umożliwia utworzenie wiązania wodorowego

pomiędzy dwiema cząsteczkami C-F...H-X. Przykłady fluorowanych

aminofosfonianów przedstawia rys. 4 [14].

Rys. 4. Przykłady fluorowanych aminofosfonianów

5. Metody syntezy aminofosfonianów

Aminofosfoniany można otrzymać na drodze różnych reakcji, stosując

jako substraty szereg związków chemicznych, np. iminy, enaminy, estry,

nitryle, oksymy. Poniżej przedstawiono metody wykorzystywane najczęściej.

5.1. Redukcja imin

W reakcjach z użyciemimin aminofosfoniany uzyskuje się w dwóch

etapach. Etap pierwszy polega na reakcji odpowiedniej aminy

ze związkiem karbonylowym. W drugim etapie uzyskana imina reaguje

z kwasem dialkilofosfonowym lub dialkilofosfiną tworząc jako produkt

końcowy pochodnąaminofosfonianową (Schemat 2).

Schemat 2. Dwuetapowa synteza aminofosfonianów oparta na redukcji imin

Mechanizm pierwszego etapu polega na nukleofilowym ataku wolnej

pary elektronowej atomu azotu na karbonylowy atom tlenu, po którymma

miejsce eliminacja cząsteczki wody. Następnie, w wyniku addycji fosfiny

(lub kwasu fosfonowego) do wiązania podwójnego iminy otrzymuje

się odpowiedni aminofosfonian (Schemat 3).


183

Schemat 3. Mechanizm etapu tworzenia iminy

W 1970 r. Roman Tyka zaproponował metodę syntezy fenylome-

tyloaminy opartą na reakcjach z prostymi aldehydami takimi jak: aldehyd

octowy, propionowy czy benzaldehyd [16]. Wydajność tych reakcji nie

przekraczała jednak 70%. W kolejnych latach wiele grup badawczych

zaczęło więc prowadzić prace, których celem była optymalizacja warunków

reakcji. Jako substraty wykorzystywano różne aminy oraz związki

karbonylowe (aldehydy i ketony), (tab. 1) [17-19].

Tabela 1. Substraty wykorzystywane do syntezy aminofosfonianów

Amina Związek karbonylowy

Pierwszą metodę syntezy aminofosfonianów opracowali w 1952 r.

Kabachnik i Fields. Bazując na reakcji Streckera, zaproponowali

trójskładnikową syntezę ze związku karbonylowego, aminy i kwasu

dialkilofosfonowego. Mechanizm reakcji ściśle zależy od zasadowości aminy;

aminy słabo zasadowe faworyzują tworzenie się iminy (Schemat 4) [19].


184

Schemat 4. Reakcja Kabachnika-Fields’a z zastosowaniem aminy aromatycznej

Reakcja Kabachnika-Fieldsa stała się bardzo użyteczna, szczególnie

w odniesieniu do syntezy 1-aminoalkanofosfonianów, które stanowią substraty

w syntezie fosfonopeptydów [2]. Z tego powodu opracowano wiele

modyfikacji pierwotnej procedury Kabachnika-Fields’a. Udowodniono, że

zarówno kwas, jak i zasada działa w reakcji jakkatalizator. Zastosowanie

kwasów Lewisa takich jak BF3*OEt [20], Yb(OTf)3 (rys. 5.) [21], Sc(OTf)3

[22], Mg(ClO4)2 [23], ZrCl4 [24] zwiększa wydajność reakcji oraz umożliwia

przeprowadzenie syntezy w łagodniejszych warunkach.

Rys. 5. Jeden z katalizatorów zmodyfikowanej reakcji Kabachnika-Fieldsa

Z czasem wykazano, że wymienione wyżej katalizatory posiadają szereg

wad. BF3*OEt jest wrażliwy na działanie wody; a ponieważ podczas

tworzenia iminy następuje eliminacja cząsteczki wody, niemożliwa stała

się regeneracja katalizatora. Stosowanie soli metali ciężkich wiąże

się z koniecznością ich utylizacji, nadchlorany są wybuchowe, a z kolei

związki metali ziem rzadkich bardzo kosztowne. Niezbędnym okazało

się więc zastosowanie katalizatorów bardziej przyjaznych dla środowiska,

które rozwiązywałyby wspomniane problemy. Obecnie w literaturze znaleźć

można wiele metod syntezy strukturalnych analogów aminokwasów

z zastosowaniem bezrozpuszczalnikowych warunków reakcji, wykorzys-

tujących mniej toksyczne katalizatory. Zapewnia to łagodniejsze warunki

i krótszy czas reakcji. Warto wymienić katalizatory takie jak: Me2S+Br Br

-

[25], [Cp2Zr(OSO2C4F9)2 2H2O] [26], KAl(SO4)2 12H2O [27], charakte-

ryzujące się odpornością na działanie wody i powietrza oraz trwałością

termiczną. Ponadto zastosowanie nanocząsteczek, np. Fe3O4 [28], CoFe2O4

(Schemat 5) [29] również okazało się bardzo dobrym rozwiązaniem, ze

względu na możliwość ich wielokrotnego użycia w reakcjach bez znacznego

spadku właściwości katalitycznych.


185

Schemat 5. Synteza aminofosfonianów z użyciem jako katalizatora CoFe2O4

5.2. Zastosowanie pochodnych enaminowych

Enaminy są obok imin, równie istotnymi związkami w syntezie

aminofosfonianów. W metodach opartych na wykorzystaniu pochodnych

enaminowych stosuje się między innymi pochodne kwasów

karboksylowych: nitryle oraz estry. W reakcji fluoroalkiloestru

z dietyloalkilofosfonianem powstaje pochodna ketofosfonianowa, która

może reagować z amoniakiem, octanem amonu lub N-trimetylosili-

lofosfazanem prowadząc do utworzenia β-enaminofosfonianu. Następnie

związek ten może być poddany katalitycznemu uwodornieniu lub redukcji

przy użyciu chlorku cynku i borowodorocyjanianu sodu (Schemat 6) [13, 30].

Schemat 6. Synteza β-aminofosfonianów oparta na enaminach


186

5.3. Redukcja oksymów

5.3.1. Otrzymywanie α-aminofosfonianów

Aminofosfoniany można również otrzymać w reakcji przebiegającej

z udziałem oksymów. Ogólny schemat syntezy przedstawia się następująco:

1-oksoalkanofosfonian (ester kwasu α-ketofosfonowego) tworzący się

w reakcji pomiędzy chlorkiem kwasowym a trialkilofosfiną [31] lub kwasem

dialkilofosfonowym [32] reaguje z hydroksyloaminą prowadząc do

powstania dialkilo-1-hydroksyiminoalkenofosfonianu. Utworzony oksym

redukowany jest do odpowiedniego aminofosfonianu (Schemat 7) [32-34].

Schemat 7. Wykorzystanie oksymów w syntezie α-aminofosfonianów

Redukcja oksymu może być przeprowadzona przy użyciu następujących

czynników: pył cynkowy w kwasie mrówkowym, amalgamat glinu

w bezwodnym eterze lub etanolu oraz układ cynk-miedź w ciepłym

etanolu. Może zachodzić również na skutek katalitycznego uwodornienia

nad niklem Raney’a w etanolu, metanolu lub ciekłym amoniaku oraz

poprzez zastosowanie katalitycznego uwodornienia nad 5% Pd/C w kwasie

octowym lub metanolu [32-34]. Utworzenie aminofosfonianu przez

redukcję oksymu może nastąpić takżepod wpływem takiego czynnika

redukującego jakim jest układborowodorocyjanian sodu/chlorek tytanu (III)

[32]. W przypadku zastosowania do redukcji mieszaniny borowodorku litu

i chlorku trimetylosililowegow bezwodnym tetrahydrofuranie, istotną rolę

odgrywa utworzenie czynnika redukującego, którym jest kompleks boran-

THF (Schemat 8). Przy użyciu tego kompleksu redukcja oksymu

do aminofosfonianu przebiega w temperaturze pokojowej oraz

pod ciśnieniem atmosferycznym [34].

Schemat 8. Tworzenie czynnika redukującego oksym do aminofosfonianu


187

5.3.2. Otrzymywanie β-aminofosfonianu

β-aminofosfoniany otrzymuje się w sposób analogiczny, jak α-amino-

fosfoniany. Można wyróżnić trzy etapy syntezy: utworzenie odpowiedniego

β-ketofosfonianu, reakcję z hydroksyloaminą prowadzącą do otrzymania

β-ketoksymu oraz redukcję utworzonego oksymu do odpowiedniego

β-aminofosfonianu (Schemat 9) [13].

Schemat 9. Synteza β-aminofosfonianów

5.4. Synteza aminofosfonianów z wykorzystaniem nitronów

i azyrydyn

Substratami w syntezie strukturalnych analogów aminokwasów mogą

być także azyrydyny, które charakteryzują się znaczną reaktywnością

ze względu na silnie naprężony, trójczłonowy pierścień. Jedną

z możliwości otwarcia tego pierścienia jest reakcja azyrydyny z anionem

utworzonym w wyniku deprotonacjidifluorometylenofosfonianu przy

wykorzystaniu diizopropyloamidku litu w układzie tetrahydrofuran/heksa-

metylofosforotriamid (Schemat 10) [13].


188

Schemat 10. Wykorzystanie azyrydyn w syntezie aminofosfonianów

Zastosowanie różnych reagentów do otwarcia pierścienia

azyrydynowego umożliwia otrzymanie szerokiej gamy związków,

np. bisfosfonianów, aminofosfonianów zawierających grupy fluorowe,

a także dialkilofosfonianów (Schemat 11) [15].

Schemat 11. Azyrydyny jako substraty w syntezie aminofosfonianów


189

W syntezie aminofosfonianów coraz większą uwagę zyskują nitrony,

czyli związki zawierające w swojej strukturze ugrupowanie R1R2C=NR+O

-.

Odgrywają one istotną rolę ze względu na możliwość otrzymania

α-aminofosfonianów lub α-(hydroksyamino)fosfonianów na drodze

stereoselektywnej syntezy. W wyniku reakcji pomiędzy nitronem a kwasem

dialkilofosfonowym lub trialkilofosfiną uzyskuje się odpowiednią pochodną

α-(hydroksyamino)fosfonianu, która w kolejnym etapie, w reakcji

z Zn/Cu(OAc)2 ulega przekształceniu w α-aminofosfonian (Schemat 12) [15].

Schemat 12. Synteza aminofosfonianów z zastosowaniem nitronów

6. Zastosowanie łaźni ultradźwiękowej i promieniowania

mikrofalowego

W nowoczesnej syntezie organicznej coraz częściej wykorzystuje

się fale ultradźwiękowe. Stanowią one alternatywne źródło energii, jakiej

w sposób klasyczny dostarcza ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej.

Ultradźwięki znalazły również zastosowanie w syntezie analogów

aminokwasów. Opracowano metodę „one-pot synthesis”, która polega

na przeprowadzeniu syntezy w jednym naczyniu reakcyjnym. Najczęściej

stosuje się warunki bezrozpuszczalnikowe, a reakcja jest trójskładnikowa.

Kondensacji ulega związek karbonylowy, amina oraz dietylofosfina,

a produkt uzyskuje się z bardzo wysoką wydajnością sięgającą 99%.

Wykorzystanie łaźni ultradźwiękowej powoduje skrócenie czasu reakcji

z kilku godzin to kilku lub kilkudziesięciu sekund. Wszystkie wymienione

aspekty przyczyniają się do tego, że synteza aminofosfonianów jest

przyjazna dla środowiska i zgodna z zasadami zielonej chemii. Jedna

z grup badawczych zastosowała tlenki metali jako katalizatory(tab. 2).

Najlepszą zdolność katalityczną wykazują nanocząstki tlenku ceru,

charakteryzujące się łatwością odzysku, selektywnością oraz brakiem

toksycznego działania [35].

Tabela 2. Tlenki metali stosowane jako katalizatory w syntezie aminofosfonianów

Tlenek metalu Wydajność [%]

SiO2 67

TiO2 80

ZnO 72

nanocząstki CeO2 99


190

Innym stosowanym katalizatorem jest tani i nietoksyczny chlorek

tiaminy (rys. 6.). Reakcja z jego udziałem prowadzona jest w środowisku

wodnym, a jej wydajność wynosi 95% [36].

Rys. 6. Struktura chlorku tiaminy

Użycie promieniowania mikrofalowego w syntezie aminofosfonianów

stało się kolejną wydajną i przyjazną środowisku metodą. Metoda

tą zsyntezowano analogi aminokwasów zarówno z alifatycznych

jak i aromatycznych amin oraz różnych związków karbonylowych.

Interesującym rozwiązaniem okazało się wykorzystanie promieniowania

mikrofalowego do syntezy na podłożu stałym w warunkach bezroz-

puszczalnikowych. Reakcję prowadzono przy udziale tlenku glinu Al2O3,

przez sześć minut. Wydajność osiągnęła 95% (Schemat 13) [37].

Schemat 13. Synteza aminofosfonianu na podłożu stałym z użyciem promieniowania

mikrofalowego

7. Podsumowanie

Liczne zastosowanie aminofosfonianów w różnych gałęziach przemysłu

sprawia, że coraz więcej grup badawczych na całym świecie

zainteresowanych jest syntezą różnorodnych struktur aminofosfonianów

charakteryzujących się potencjalną aktywnością biologiczną.

Zainteresowanie to powoduje, iż metody otrzymywania strukturalnych

analogów aminokwasów są od kilku dekad intensywnie rozwijane

i udoskonalane. Oprócz typowych syntez bazujących na klasycznym

ogrzewaniu pod chłodnicą zwrotną, istotne znaczenie zyskuje zastosowanie

promieniowania mikrofalowego oraz fal ultradźwiękowych.

Podziękowania

Badania finansowane z projektu POKL.04.01.01-00-049/13.


191

Literatura

1. Hilderbrand R., Curley-Joseph J., Lubansky H., Henderson T. (1983) Topics

in Phosphorus Chemistry, Vol. 11, 297-338

2. Kafarski P., Zoń J. (2000) Synthesis of α-aminoalkanephosphonic and α-

aminophosphinic acids, Aminophosphonic and Aminophosphinic Acids, 33-102

3. Qian Ch., Huang T. (1998) One-pot synthesis of α-aminophosphonates from

aldehydes using lanthanide triflate as a catalyst, Journal of Organic

Chemistry, 63, 4125-4128

4. Chung S.-K., Kang D.-H. (1996) Asymmetric synthesis of α-aminophosponates

via diastereoselective addition of phosphite to chiral imine derivatives,

Tetrahedron: Asymmetry, 7, 21-24

5. Cen W., Shen Y. (1995) New synthesis of fluorinated 2-aminophosphonates,

Journal of Fluorine Chemistry, 72, 107-110

6. Rak M., Dżygiel P., Wieczorek P. (2001) Supported liquid membrane extraction

of aromatic aminophosphonates, AnalyticaChimicaActa, 433, 227-236

7. Kozyra K., Brzezińska-Rodak M., Klimek-Ochab Magdalena, Żymańczyk-Duda

E. (2013) Biocatalyzed kinetic resolution of racemic mixtures of chiral α-

aminophosphonic acids, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 91, 32-36

8. Dar B., Singh A., Sahu A., Patidar P., Chakraborty A., Sharma M., Singh B.

(2012) Catalyst and solvent-free, ultrasound promoted rapid protocol

for the one-pot synthesis of α-aminophosphonates at room temperature,

Tetrahedron Letters, 53, 5497-5502

9. Dar B.A., Chakraborty A., Sharma P. R., Shrivastava V., Bhowmik A., Vyas

D., Bhatti P., Sharma M., Singh B. (2013) Grinding-induced rapid, convenient

and solvent free approach for the one pot synthesis of α-aminophosphonates

using aluminium pillared interlayered clay catalyst, Journal of Industrial

and Engineering Chemistry, 19, 732-738

10. Bhattacharya A. K., Raut D. S., Rana K. C., Polanki I. K., Khan M. S., Iram S.

(2013) Diversity-oriented synthesis of α-aminophosphonates: a new class

of potential anticancer agents, European Journal of Medicinal Chemistry,

66, 146-152

11. Kaboudin B. (2003) A convenient synthesis of 1-aminophosphonates from 1-

hydroxyphosphonates, Tetrahedron Letters, 44, 1051-1053

12. Milen M., Abranyi-Balogh P., Dancso A., Frigyes D., Pongo L., Keglevich G.

(2013) T3P®-promoted Kabachnik-Fields reaction: an efficient synthesis

of α-aminophosphonates, Tetrahedron Letters, 54, 5430-5433

13. Turcheniuk K. V., Kukhar V. P., Roschenthaler G.-V., Acena J. L.,

Soloshonok V. A., Sorochinsky A. E. (2013) Recent advances in the synthesis

of fluorinated aminophosphonates and aminophosphonic acids, The Royal

Society of Chemistry, 3, 6693-6716

14. Romanenko V. D., Kukhar V. P. (2006) Fluorinated phosphonates: synthesis

and biomedical application, Chemical Reviews, 106, 3868-3935

15. Kukhar V. P., Romanenko V. D. (2009) Chemistry of aminophosphonic acids

and phosphonopeptides, Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic


192

Chemistry, Vol. 2-Modified Amino Acids, Organocatalysis

and Enzyme,WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 191-262

16. Tyka R. (1970) Novel synthesis of α-aminophosphonic acids, Tetrahedron

Letters, 9, 677-680

17. Green D., Patel G., Elgendy S., Baban J., Claeson G., Kakkar V., Deadman J.

(1994) The synthesis of 1-aminobenzylphosphonic acids from benzylidenedi-

phenylmethylamines, for use as structural units in antithrombotic tripeptides,

Tetrahedron, 50, 5099-5108

18. Soroka M., Zygmunt J., (1988) Tritylamine (triphenylmethylamine) in organic

synthesis; The synthesis of N-(triphenylmethyl)alkanimines,

1-(triphenylmethylamino)alkylphosphonic esters, and 1-aminoalkylphosphonic

acids and esters, Synthesis, 370-372

19. Galkin V., Cherkasov R. (1998) The Kabachnik-Fields reaction: synthetic poten-

tial and the problem of the mechanism, Russian Chemical Reviews, 67, 857-882

20. Ha H-J., Nam G-S. (1992) An efficient synthesis

of anilinobenzylphosphonates, Synthetic Communications, 22, 1143-1148

21. Qian Ch., Huang T. (1998) One-pot synthesis of α-aminophosphonates from

aldehydes using lanthanide triflate as a catalys, Journal of Organic Chemistry,

63, 4125-4128

22. Lee S., Park J., Kang J., Lee J. (2001) Lanthanide triflate-catalyzed three

component synthesis of α-amino phosphonates in ionic liquids. A catalyst

reactivity and reusability study, Chemical Communicatons, 1698-1699

23. Bhagat S., Chakraborti A. (2007) An extremely efficient three-component

reaction of aldehydes/ketones, amines, and phosphites (Kabachnik-Fields

reaction) for the synthesis of α-aminophosphonates catalysed by magnesium

perchlorate, Journal of Organic Chemistry, 72, 1263-1370

24. Manjula A., Vittal B., Neelakantan P. (2003) One-pot synthesis of alpha-

aminophosphonates: an inexpensive approach, Synthetic Communications,

33, 2963-2969

25. Kudrimoti S., Bommena V. (2005) Bromodimethylsulfonium bromide:

an inexpensive reagent for the solvent-free, one-pot synthesis

of α-aminophosphonates, Tetrahedron Letters, 46, 1209-1210

26. Li N., Wang X., Qiu R., Xu X., Chen J., Zhang X., Chen S., Yin S. (2014) Air-

stable zirconocenebis(perfluorobutanesulfonate) as a highly efficient catalyst

for synthesis of α-aminophosphonates via Kabachnik-Fields reaction under

solvent-free condition, Catalysis Communications, 43, 184-187

27. Sonar S., Shelke K., Kakade G., Shingate B., Shingare M. (2009) Alum:

an efficient catalyst for one-pot synthesis of α-aminophosphonates,Chin.

Chem. Lett.20, 1042-1046

28. Reddy S., Krishna S., Ganesh A., Kumar N. (2011) Nano Fe3O4

as magnetically recyclable catalyst for the synthesis of α-aminophosphonates

in solvent-free conditions, Tetrahedron Letters,52, 1359-1362

29. Hamadi H., Kooti M., Afshari M., Ghiasifar Z., Adibpour N. (2013) Magnetic

nanoparticle supported polyoxometalate: an efficient and reusable catalyst

for solvent-free synthesis of α-aminophosphonates, Journal of Molecular

Catalysis A: Chemical,373, 25-29


193

30. Palacios F., Ochoa de Retana A. M., Oyarzabal J., Pascual S., Fernandez

de Troconiz G. (2008) Synthesis of fluoroalkylated β-aminophosphonates

and pyridines from primary β-enaminophosphonates,Journal of Organic

Chemistry,73, 4568-4574

31. Krzyżanowska B., Pilichowska S. (1988) Synthesis of O,O-dialkyl

1-aminoalkanephosphonate via N-phosphinylated imines and enamines,Polish

Journal of Chemistry, 62, 165

32. Ryglowski A., Kafarski P. (1994) The facile synthesis of dialkyl

1-aminoalkylphosphonates,Synthetic Communications, 24, 2725-2731

33. Kowalik J., Kupczyk-Subotkowska L., Mastalerz P. (1981) Preparation

of dialkyl 1-aminoalkanephosphonates by reduction of dialkyl

1-hydroxyiminoalkanephosphonates with zinc in formic acid,Synthesis, 57-58

34. Green D., Patel G., Elgendy S., Baban J. A., Claeson G., Kakkar V. V.,

Deadman J. (1993) The facile synthesis of O, O-dialkyl

1-aminoalkanephosphonates, Tetrahedron Letters, 34, 6917-6920

35. Agawane S., Nagarkar J. (2011) Nano ceria catalysed synthesis of

α-aminophosphonates under ultrasonication,Tetrahedron Letters, 52, 3499-3504

36. Mandhane P., Joshi R., Nagargoje D., Gill C. (2011) Thiamine hydrchloride

(VB1): an efficient catalyst for one-pot synthesis of α-aminophosphonates

under ultrasonic irradiation, Chinese Chemical Letters,22, 563-566

37. Kaboudin B., Nazari R. (2001) Microwave-assisted synthesis of 1-aminoalkyl

phosphonates under solvent-free conditions,Tetradehdron Letters, 42, 8211-8213

Novel synthesis of aminophosphonates

The significance of aminophosphonates is arising from their structural similarity to amino acids and from the presence of the phosphorus atom in their structure. Modification

of aminophosphonates by various functional groups can lead to changes in their biological

activity, as well asin physicochemical properties. Analogues of amino acids can exhibit

antiviral, antitumor, antibacterial activity. Therefore, they found application in medicine, pharmacy, and agriculture.

194

Mateusz Niścior1, Katarzyna Tarnawska

2, Monika Adamczyk

3

Chemiczne środki do ujawniania śladów linii

papilarnych

Daktyloskopia to bardzo ważna dziedzina kryminalistyki, zajmująca się badaniem śladów linii papilarnych. Dzięki niej możemy zidentyfikować

sprawcę przestępstwa czy też określić tożsamość zwłok ludzkich

przy których nie znaleziono żadnych dokumentów. Artykuł charakteryzuje

w skrócie technikę daktyloskopii, jej początki i dalszy rozwój. Skupiono się również nad charakterystyką samych śladów linii papilarnych,

ich właściwościami oraz nad systemem ich identyfikacji. System Henry'ego

to jedyny system, który opisuje trzy podstawowe wzory układu linii: pętlę,

wir i łuk. Jednak najważniejsze są minucje, czyli zestaw charakterys-tycznych cech takich jak: początki, haczyki, zakończenia czy oczka. Na ich

podstawie można dokonywać identyfikacji osób. Opisano również metody

służące ujawnieniu śladów linii papilarnych wykorzystujące optyczne,

adsorpcyjne i adhezyjne oraz chemiczne właściwości śladów. Artykuł przedstawia także kilka przykładów chemicznych środków do ujawniania

śladów linii papilarnych oraz krótko je charakteryzuje, są to m.in.

ninhydryna, kleje cyjanoakrylowe, SPR, czerń amidowa oraz genypina.

Środków chemicznych służących do ujawniania linii papilarnych jest bardzo dużo, i wciąż naukowcy tworzą kolejne coraz to lepsze, dokładniejsze

substancje, dzięki którym stanie się o wiele łatwiejsze i skuteczniejsze

dowiedzenie o popełnieniu czynu karalnego przez sprawcę przestępstwa.

1. Wstęp

Daktyloskopię uznaje się za jedną z najważniejszych technik

kryminalistyki, której głównym zadaniem jest identyfikacja osoby

na podstawie zabezpieczonych na miejscu zdarzenia śladów linii

papilarnych, czyli listewek znajdujących się na wewnętrznych powierz-

chniach palców i dłoni oraz na dolnych powierzchniach stóp. Odciski linii

papilarnych stanowią niepodważalny dowód na związek sprawców czynów

przestępczych z przedmiotowym zdarzeniem. Wymiar sprawiedliwości wykorzystuje ujawnione i zabezpieczone ślady

linii papilarnych do: ustalenia czy pobrane odciski linii papilarnych od osoby

podejrzanej o popełnienie określonego czynu są identyczne z pozosta-

1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS, Wydział

Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 2 [email protected] Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS,

Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 3 [email protected] Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS,

Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie




Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych

195

wionymi na miejscu zdarzenia, określenia tożsamości podejrzanego, a także

czy osoba ta była już wcześniej daktyloskopowana w związku z jakimś

zdarzeniem i jakie wtedy dane podała o sobie. Technika ta umożliwia

również identyfikację osób, które ze względu na stan zdrowia nie są w stanie

podać swoich danych, oraz pozwala określić tożsamość ludzkich zwłok, przy

których nie znaleziono żadnych dokumentów, pod warunkiem, że osoba

ta była kiedyś daktyloskopowana. W kryminalistyce daktyloskopia uważana

jest za najskuteczniejsze i co bardzo ważne, dość tanie narzędzie w walce

z przestępczością, ze względu na możliwość bezpośredniej i indywidualnej

identyfikacji człowieka [1].

Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie wybranych środków

chemicznych używanych do wykrycia odcisków śladów linii papilarnych na

różnych podłożach. Szczególną uwagę zwrócono na nowy środek

do ujawniania śladów linii papilarnych – genypinę.

2. Historia

Odciskami palców interesowali się już Chińczycy w VII-X w n.e.

Stworzyli oni pierwszą w świecie klasyfikację daktyloskopijną mającą

na celu oznaczanie pochodzenia przedmiotów. Atramentowe odciski były

w ówczesnych Chinach bardzo popularne. Te wyjątkowe podpisy

znajdowały się na oficjalnych dokumentach, widniały na aktach sprzedaży

ziemi, kontraktach, pożyczkach, uznaniach długów. Jednym z najbardziej

kontrowersyjnych i dziwnych faktów w historii wykorzystania odcisków

linii papilarnych wydaje się być fakt, że w szesnastowiecznych Chinach,

odciski stóp i dłoni dzieci na „rachunku" finalizowały ich sprzedaż.

W Persji, już w XIV wieku jeden z urzędników państwowych, lekarz,

przyglądając się odciskom palców odbitym na różnych oficjalnych

dokumentach stwierdził, że nie sposób znaleźć dwóch identycznych [2].

W 1686 roku Marcello Malpighi opisał charakterystyczne cechy

odcisków linii papilarnych takie jak: zagłębienia, pętle i spirale. Książka

J. Mayera pt.” Anatomische Kupfertafeln Nebst Dazu Gehorigen”, uważana

jest za jeden z pierwszych oficjalnych zapisów o niepowtarzalności układu

linii. Jan Ewangelista Purkinje (urodzony w Pradze) pracujący

we Wrocławiu profesor anatomii, pierwszy wyszczególnił 9 podstawowych

wzorów przebiegu linii papilarnych (1823) [1,2].

Istotny wpływ na rozwój daktyloskopii miał bardzo wysoki poziom

analfabetyzmu w XIX w Indiach. W 1858 roku, mieszkający tam angielski

zarządca W. Herschel, nakazał używania odbitek dłoni, a potem kciuków

na dokumentach potwierdzających m.in. zawieranie wszelkich umów.

Początkowo, przesłanki do zastosowania odcisków linii papilarnych

nie miały naukowego charakteru, lecz z czasem związane były raczej

http://www.northern.pl/d38,czy_systemy_identyfikacji_biometrycznej_podbija_rynek_zabezpieczen_czii_-_daktyloskopia.html


196

z przesądami i zabobonnym podejściem lokalnej społeczności do tak

oznaczonych dokumentów, które w znaczny sposób pomogło Herschelowi

wyeliminować często występujące próby fałszerstwa [2]. Niemniej jednak,

wraz ze wzrostem liczby zebranych odbitek linii papilarnych stwierdził on,

że faktycznie na ich podstawie można potwierdzić lub zanegować czyjąś

tożsamość. Odciski palców stały się zatem swoistym podpisem ich

właściciela. Ponadto, Herschel rozpoczął pobieranie odbitek odcisków od

wszystkich więźniów [2].

Na przełomie XIX i XX w. m. in. za sprawą szkockiego lekarza

i misjonarza Henry’ego Faulds'a, dokonał się efektywny rozwój

daktyloskopii. Po przeprowadzeniu serii eksperymentów potwierdził swoją

hipotezę, która głosiła, że zbiór wzorów linii papilarnych jest w znacznym

stopniu zróżnicowany, ponadto nie indywidualny układ linii nie ulega

zmianie nawet w wyniku powierzchownych skaleczeń gdyż ten sam,

niepowtarzalny wzór odtwarza się po zagojeniu rany.

Henry opisał wzory, w które formują się linie na palcach. Opracował

też sposób pobierania odbitek na różnego rodzaju tablicach. Niemniej

jednak, jego kluczowym osiągnięciem było udowodnienie, że wzór linii

odcisków danej osoby jest niepowtarzalny a utajone ślady zostawione przez

zabrudzone lub zatłuszczone palce na różnych obiektach mogą prowadzić

do naukowej identyfikacji przestępców. W latach osiemdziesiątych

XIX wieku Herschel i Henry opublikowali artykuł na temat zastosowania

odcisków palców do identyfikacji przestępców [2].

W praktyce, daktyloskopię jako nową procedurę sądową przyjęto

po publikacji "Odciski palców” - “Finger Prints" Anglika Sir Francisa

Galtona, w której opisywał on unikalność i niezmienność linii papilarnych

i ich klasyfikację. Galton opracował również metodę analizy ilościowej

listewek skórnych polegającej na liczeniu listewek od centrum wzoru

do trójpromienia bocznego oraz zachęcił do jej stosowania w medycynie

sądowej. Stworzył kartę daktyloskopijną i stał się prekursorem systemu

klasyfikacji dziesięciopalcowej. Specyficzne cechy tzw. minucje,

omówione przez Galtona są używane po dziś dzień, a prawo sformułowane

przez niego, zwane zasadą 3N mówi, że linie papilarne są nieusuwalne

niepowtarzalne i niezmienne [1,2].

3. Linie papilarne

Linie papilarne to inaczej dermatoglify, czyli specyficzny układ bruzd.

Możemy go zobaczyć nie tylko u człowieka ale i również u innych ssaków

naczelnych. Wiadomo, że znajdują się one na wewnętrznej stronie dłoni,

głównie na opuszkach palców, również odnajdujemy je na palcach stóp,

wargach, a u niektórych gatunków na dolnej stronie ogona. Z pewnych




197

badań i obserwacji wiemy, że występowanie linii papilarnych stwierdzono

jeszcze u koali także u pewnych kangurów nadrzewnych i u lemurów.

Koala został wspomniany na pierwszym miejscu, ponieważ odciski palców

tego zwierzęcia z trudem da się odróżnić od ludzkich.

Powstanie linii papilarnych następuje poprzez wzniesienia i pofał-

dowanie epidermy jeszcze w okresie prenatalnym, między 100 a 120 dniem

od zapłodnienia komórki jajowej. Wzór ten jest niepowtarzalny nawet u

bliźniąt jednojajowych. Pewne schorzenia, wady genetyczne, czy leczenie

nowotworów może doprowadzić do ich zacierania się a nawet całkowitego

utracenia, jednak takie przypadki są niezwykle rzadkie. Wrodzony brak

linii papilarnych występuje u osób u których doszło do mutacji w rejonie

SMARCAR1. Brak odcisków palców to poważny problem w wykryciu

sprawcy zbrodni, jeśli dokonała jej osoba z wspomnianą wcześniej mutacją.

Ta mutacja genetyczna w USA określana jest żartobliwie przez celników

jako „choroba opóźniająca wjazd” – „immigration delay disease”[3].

Rys. 1. Widok ludzkich linii papilarnych [11]

Rys. 2. Dłoń osoby z wrodzonym brakiem linii papilarnych [13]


198

O roli linii papilarnych w identyfikacji zadecydowały

ich charakterystyczne właściwości:

niezmienność – wyraźne dermatoglify można odróżnić już

u 6- miesięcznego płodu ludzkiego i od tego momentu pozostają one

w zasadzie niezmienne;

niezniszczalność – uszkodzenia mechaniczne, chemiczne czy też

chorobowe nie prowadzą do trwałego uszkodzenia listewek skórnych;

niepowtarzalność listewek skórnych – prawdopodobieństwo

powtórzenia się tego samego rysunku linii papilarnych wynosi

1:64 miliardów [1,4].

Fundamentalną zasadą dla daktyloskopii jest indywidualność linii

papilarnych. Na całym świecie nie ma dwóch osób mających identyczny

rysunek listewek na skórze. Potwierdziły to zarówno liczne badania,

obliczenia statystyczne jak i wieloletnia praktyka daktyloskopijna. Karty

daktyloskopijne gromadzone są od wielu lat, na całym świecie, jednakże nie

znaleziono dotychczas, dwóch identycznych odcisków linii papilarnych [3].

4. System identyfikacji śladów linii papilarnych

Systemie Henry'ego opisuje trzy podstawowe wzory układu linii: pętla,

wir i łuk.

Rys.3: Rodzaje podstawowych wzorów odcisków palców pobranych z opuszków a) wzór

łukowy b) wzór pętlicowy c) wzór wirowy (pola rozwidleń w kształcie litery y są oznaczone

na czerwono) [3]

Stanowią one odpowiednio 60-70, 25-35 i 5 procent wszystkich odbitek

linii papilarnych. Wszystkie te wzory dodatkowo posiadają różne wariacje:

łuki mogą być gładkie lub namiotowe, wzory pętlicowe mogą być

promieniowe (od kości promieniowej), lub łokciowe (od kości łokciowej),

zależy to od tego, w jaką stronę skierowany jest wzór. Wirowe wzory także

posiadają wiele odmian, np. wiry kieszeniowe, przypadkowe, podwójne

oraz gładkie, itd [3]. Jednak najważniejsze w identyfikacji są minucje, czyli zestaw

charakterystycznych cech, a konkretnie punktów opisujący układ linii.

Zawiera on opis początku, zakończenia, rozwidlenia (pojedyncze,


199

podwójne, jednostronne, dwustronne) linii, złączenia, oczka, styki, haczyki,

wyspy itp. Porównując ich rozmieszczenie z rozmieszczeniem wzorca

można dokonywać identyfikacji osób. Poszczególne kraje same określają

liczbę i rodzaj minucji, które koniecznie muszą zostać prawidłowo

zidentyfikowane, aby uznać za tożsame dwie odbitki linii papilarnych.

W Polsce prawo określa, że potrzeba ich 12, chociaż w nielicznych

rzadkich i bardziej typowych przypadkach wystarczy ich znacznie mniej,

na przykład gdy występują rzadkie haczyki [3]. Poprawne oznaczenie

minucji odbywa się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, poniżej

przestawiono kilka przykładów:

początki oczko punkt

złączenie rozwidlenie odcinek styk boczny

Rys.4. Różne przykłady minucji [3]

Biuro Niemieckiej Federalnej Policji Kryminalnej (BKA) utrzymuje

specjalne instytucje i zbiory dla potrzeb identyfikacji. Specjalne kamery

skanują odciski palców do Automatycznego Systemu Identyfikacji

Odcisków Palców (ang. Automated Fingerprint Identification System -

AFIS), gdzie później mogą być porównywane ze sobą. W systemie

tym obecnie zarejestrowanych jest około 2,7 miliona odcisków palców [3].


200

5. Metody służące ujawnieniu śladów linii papilarnych

5.1. Wykorzystujące optyczne właściwości śladów

Poszukiwania śladów linii papilarnych dokonuję się przy oświetleniu

naturalnym lub sztucznym. W przypadku powierzchni nierównych

lub matowych wykorzystuje się fluorescencję widzialną, wzbudzoną

promieniami ultrafioletowymi. Przy wykorzystaniu fluorescencji

w podczerwieni można uwidocznić ślady pochodzące od palców

zabrudzonych np. krwią [1,4].

5.2. Wykorzystujące adsorpcyjne i adhezyjne właściwości śladów

Ślady linii papilarnych są z reguły lepkie, co wykorzystuje

się do ich ujawniania na nielepkich podłożach za pomocą proszków.

Proszki muszą być odpowiednio rozdrobnione, co gwarantuje zachowanie

struktury śladu [4].

Rys. 5. Ujawnianie śladów linii papilarnych przy pomocy proszków [8]

5.3. Wykorzystujące chemiczne właściwości śladów

Rozwiązaniem trudności z ujawnianiem lub braku możliwości

ujawnienia śladów linii papilarnych przy wykorzystaniu właściwości

fizycznych są proste metody chemiczne. Istotą metod chemicznych jest

zajście reakcji chemicznych pomiędzy składnikami substancji

śladotwórczej a zastosowanym środkiem do ujawnienia [4].

6.Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych

6.1. Ninhydryna

W celu ujawnienia śladów linii papilarnych na powierzchniach

chłonnych np. karton, papier, używa się metod bazujących

na oddziaływaniu śladów ze związkami chemicznymi takimi jak: DFO


201

(1,8-diazafluoren-9-on), ninhydryna, 5-metylotioninhydryna, RTX (ruten

diazotu) czy chlorek cynku.

Stosując ninhydrynę otrzymuje się purpurowe lub fioletowo-niebieskie

ślady. W kolejnych etapach postępowania barwy te mogą ulec zmianie.

Metoda ta jest również stosowana do ujawniania śladów na dużych

powierzchniach kolorowych tapet oraz do śladów pozostawionych wiele lat

temu. Ninhydryna reaguje z zawartymi w odciskach palców

aminokwasami, polipeptydami i białkami [4,5].

Rys. 6. Odcisk śladów linii papilarnych ujawniony ninhydryną [12]

Dobór odpowiedniej metody badawczej uzależniony jest między innymi

od: stopnia zanieczyszczenia i zawilgocenia podłoża, właściwości podłoża,

wieku śladu, itp. Niemniej jednak ważne jest również ustalenie wpływu

użytej metody na zniszczenie podłoża. Zastosowanie roztworów RTX,

ninhydryny, czy 5-metylotioninhydryny, według zasady kontrastowości,

pozwala na ujawnienie śladów linii papilarnych widocznych w świetle

dziennym. Środki takie jak DFO czy chlorek cynku to metody

fluorescencyjne. Roztwór chlorku cynku służy do poprawy i wzmacniania

słabo czytelnych, fragmentarycznych śladów linii papilarnych, które

zostały wykryte przy użyciu ninhydryny i 5-metylotioninhydryny (ślady

te po zastosowaniu roztworu chlorku cynku nabywają właściwości

fluorescencyjnych) [6].


202

Rys.7. Odciska palca ujawniony metodą fluorescencyjną [10]

6.2. SPR

SPR to wodna zawiesina zmielonego dwusiarczku molibdenu (MoS2

z dodatkiem środka powierzchniowo — czynnego). Stosuje się go do

ujawniania śladów linii papilarnych na mokrych lub wilgotnych podłożach

niechłonnych takich jak: ceramika, szkło, tworzywa sztuczne, metale,

przedmioty pokryte lakierami i farbami itp., bez konieczności

wcześniejszego wysuszenia powierzchni badanego obiektu. Dwusiarczek

molibdenu przylega do cząsteczek tłuszczu i pozostawia szary osad.

Według obowiązującej zasady kontrastowości, należy stosować biały SPR –

na powierzchnie o ciemnym zabarwieniu, ciemny SPR – na powierzchnie

o jasnym zabarwieniu oraz SPR UV – na powierzchnie mieszane,

co pozwoli z większą dokładnością i zdecydowanie lepszym efektem

na ujawnienie pozostawionych śladów [5].

6.3. Kleje cyjanoakrylowe

Do ujawniania śladów na powierzchniach niechłonnych służą także

kleje cyjanoakrylowe- są to substancje reagujące z wodą wydzieliny

potowo-łojowej, tworzące na powierzchni badanego obiektu białoszarawy

osad. Aby dodatkowo skontrastować słabo czytelne ślady linii papilarnych,

po użyciu kleju cyjanoakrylowego używa się różnorodne barwniki

np.: chellat europu, ardrox, safranina 0, Basic red 28, rodamina 6g, yellow

basic 40, które ujawniają ślady przy użyciu technik fluorescencyjnych oraz

fiolet krystaliczny i czerń sudanową, które pozwalają na wzmocnienie

kontrastu w świetle dziennym [4, 5].


203

Rys.8. Metoda cyjanoakrylowa [9]

6.4. Środki chemiczne stosowane na papierach termoczułych

Papiery termoczułe mają szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach

życia, m.in. wykorzystuje się je do wyrobu metek cenowych, wyciągów

z kont bankowych, bonów kasowych, biletów, kart wstępu itp.

W celu ujawnienia na powierzchni papierów termoczułych śladów linii

papilarnych stosuje się metody wykorzystujące: aldehyd 4-dimetylamino-

cynamonowy, stężony kwas azotowy, kwas solny, thermaniny, RTX.

Zastosowanie metody kwasów stężonych: azotowego i solnego pozwala na

ujawnienie śladów linii papilarnych tylko i wyłącznie na powierzchni

termoczułej papieru, a fundamentem tego procesu jest barwna reakcja

substancji potowo-tłuszczowej z oparami tych kwasów. Zastosowanie

natomiast metod bazujących na zastosowaniu: thermaniny, aldehydu 4-

dimetylaminocynamonowego (DMAC), RTX oraz pozwala na ujawnienie

śladów linii papilarnych zarówno na powierzchni termoczułej jak i na

powierzchni papierowej. Ujawnione ślady linii papilarnych za pomocą

metod bazujących na zastosowaniu: thermaniny, RTX, kwasów stężonych

azotowego i solnego są widoczne w świetle widzialnym. Metody

wykorzystujące: aldehyd 4-dimetylaminocynamonowy (DMAC) to metody

fluorescencyjne. W świetle dziennym ślady linii papilarnych ujawnione za

pomocą tych metod są niewidoczne, dopiero zastosowanie odpowiednich

technik fluorescencyjnych pozwala na ich wizualizację [4,5].


204

6.5. Środki chemiczne stosowane na taśmach samoprzylepnych

W celu ujawnienia na powierzchniach klejących taśm samoprzylepnych

śladów linii papilarnych stosuje się metody: Sticky-Side (roztwór koloru

ciemnego lub białego), Wet Powder, Liqui-drox fioletu krystalicznego oraz

Tape-Glo. Dobór odpowiedniej metody badawczej uzależniony jest między

innymi od właściwości taśm samoprzylepnych. Niektóre z nich przy

wzbudzaniu promieniowaniem UV mogą wykazywać własną fluorescencję.

Dzięki użyciu roztworów: Sticky-Side (roztwór koloru białego

lub ciemnego), Wet Powder oraz fioletu krystalicznego, możliwe jest

ujawnienie śladów linii papilarnych widocznych w świetle dziennym.

Metody: Liqui - drox oraz Tape-Glo to metody fluorescencyjne. W świetle

dziennym ślady linii papilarnych ujawnione za pomocą tych metod

są niezauważalne, dopiero właściwe zastosowanie technik

fluorescencyjnych pozwala na ich wizualizację [5].

Rys. 9. Ujawnianie śladów na taśmie [9] Rys. 10. Wet Powder [9]

6.6. Czerń amidowa

Chemiczne metody ujawniania krwawych śladów linii papilarnych

opierają się na reakcjach związków chemicznych (w zależności

od zastosowanej metody) ze składnikami krwi. W rezultacie powstają

barwne związki kompleksowe, a w następstwie wizualizacja niewidocznych

krwawych śladów linii papilarnych. W warunkach laboratoryjnych stosuje

się następujące metody: fuksyny kwaśnej, tartrazyny, czerwieni

węgierskiej, fioletu leukokrystalicznego (LCV) oraz czerni amidowej.

Metody te mogą być z powodzeniem stosowane zarówno na podłoża

niechłonne (np. ceramikę, szkło, metale, folię aluminiową, powierzchnie

nieklejące folii i taśm samoprzylepnych, gumę, lakierowane drewno, skórę)

jak i na podłoża chłonne (np. powierzchnie gładkie, błyszczące, matowe).

Roztwory: fuksyny kwaśnej, czerni amidowej, fioletuleukokrystalicznego

(LCV) oraz czerwieni węgierskiej, są stosowane na powierzchnie jasnego

koloru, natomiast na powierzchnie ciemnego koloru stosuje się roztwór


205

tartrazyny (zgodnie z obowiązującą zasadą kontrastowości). Metody te

umożliwiają wykrycie krwawych śladów linii papilarnych widocznych

w świetle dziennym [5].

Inną korzyścią metody czerwieni węgierskiej jest fakt, iż ujawnione

krwawe ślady linii papilarnych wykazują fluorescencję i dlatego można

ją z powodzeniem stosować zarówno na powierzchnie o jasnym,

jak również o ciemnym zabarwieniu.

6.7. Genypina

Badania nad udoskonaleniem metod wizualizacji śladów linii

papilarnych, doprowadziły do odkrycia nowego środka do ujawniania

śladów na podłożach chłonnych zwanego genypiną. Genypina - pochodna

cukru genopozydu, jest to bezbarwny naturalny ekstrakt uzyskiwany

z owoców gardenii (Gardenia jasminoides Ellis), wykorzystywany przez

plemiona indiańskie do wykonywania tatuaży, gdyż po zetknięciu ze skórą

barwi ją na niebieskofioletowo, trudno ją też usunąć. Podobna reakcja

zachodzi również z aminokwasami [7].

Genypinę po raz pierwszy zsyntetyzowano w 1967r. Następnie Hahn

i wsp. (2004) używając genypiny przeprowadzili badania nad kolory-

metrycznym oznaczaniem aminokwasów oraz badania porównawcze

z roztworem ninhidryny stosowanym w daktyloskopii do ujawniania

śladów linii papilarnych [14]. Doszli do wniosku, że produkt reakcji

aminokwasów z genypiną barwi intensywniej na niebieskofioletowo

ujawnione odwzorowania linii papilarnych niż purpura Ruhemanna,

powstająca w reakcji aminokwasów z ninhydryną. Zaobserwowali również,

że przebieg ujawniania śladów roztworem genypiny zachodzi szybciej

niż roztworem ninhydryny. Te pomyślne wyniki, skłoniły naukowców

do dalszych badań nad możliwościami wykorzystania genypiny

do wizualizacji śladów linii papilarnych [5,7].

Przeprowadzono badania, które wykazały, że ślad ujawniony genypiną

nie tylko ma bardzo intensywną barwę w świetle dziennym w postaci

niebieskofioletowych odwzorowań, a także wykazuje silną fluorescencję

po oświetleniu badanej powierzchni w świetle niebieskozielonym

o długości fali 555 nm. Należy pamiętać, że oglądając badaną powierzchnię

trzeba zastosować filtr (okulary) czerwony (630nm), który pozwoli

na uwidocznienie fluorescencji ujawnionych śladów linii papilarnych.

Obecnie prowadzi się badania nad tą metodą wizualizacji [5].

7. Zabezpieczenie techniczne śladów linii papilarnych

W przypadku śladów linii papilarnych wykorzystuje się następujące

sposoby technicznego utrwalenia: wykonanie zdjęcia fotograficznego,


206

przeniesienie na folię daktyloskopijną, sporządzenie repliki silikonowej

bądź zabezpieczenie w całości [5].

Zabezpieczenie technicznie z wykorzystaniem np. folii daktyloskopijnej

polega na zastosowaniu folii, o odpowiedniej barwie i kontraście, którą

przykłada się żelem do podłoża. Dociskając folię dokładnie zabezpieczamy ślad.

Zabezpieczenie techniczne z użyciem pasty silikonowej polega

na nałożeniu pasty silikonowej na powierzchnię z ujawnionym śladem.

Niskie napięcie powierzchniowe pasty powoduje, że wpływa

ona w najdrobniejsze szczeliny. Pasta nie niszczy i nie zniekształca śladów.

Ślad można dodatkowo napylić proszkiem daktyloskopijnym [5].

8. Podsumowanie

Dzięki wykorzystaniu wiedzy z zakresu daktyloskopii możemy z niemal

całą pewnością zidentyfikować osobę podejrzaną o dokonanie prze-

stępstwa. W tym celu powstają coraz nowsze metody i chemiczne środki

ujawniające ślady linii papilarnych z biegiem czasu udoskonalając

tę dziedzinę kryminalistyki będzie niemal w stu procentach możliwe

wskazanie sprawcy przestępstwa.

Opisane chemiczne metody ujawniania śladów linii papilarnych dają

ogromne możliwości w zakresie identyfikacji tych śladów. Zastosowanie

tradycyjnych proszków daktyloskopijnych może dać negatywne rezultaty, ale

nie muszą oznaczać, że na danej powierzchni nie pozostawiono śladów linii

papilarnych. Natomiast odpowiednie zabezpieczenie badanego przedmiotu w

całości i poddanie jego powierzchnie działaniu środków chemicznych

niejednokrotnie pozwala na ujawnienie rozpatrywanych śladów.

Genypina jest skutecznym środkiem do ujawniania „świeżych śladów

linii papilarnych. Zaletą genypiny jest uzyskanie trwałej niebiesko-

fioletowej barwy odwzorowań linii papilarnych widocznych w świetle

białym. Genypina mogłaby być alternatywą dla ninhydryny i chlorku cynku

w stosunku do śladów świeżych.

Literatura

1. Kulicki M., Kwiatkowska-Darul V., Stępka L., Kryminalistyka - Wybrane

zagadnienia teorii i praktyki śledczo-sądowej, wyd. UMK Toruń 2005

2. Thern N. Czy systemy identyfikacji biometrycznej podbiją rynek

zabezpieczeń? Cz.II – Daktyloskopia [Źródło internetowe]:

http://www.northern.pl/d38,czy_systemy_identyfikacji_biometrycznej_podbij

a_rynek_zabezpieczen_czii_-_daktyloskopia.html [Dostęp]: 07.11.2014

3. N. Halverson Biometric First: Touchscreen Recognizes Fingerprints [Źródło

internetowe]: http://news.discovery.com/tech/gear-and-gadgets/biometric-first-

touchscreen-recognizes-fingerprints-130719.htm [Dostęp]: 08.11.2014



http://news.discovery.com/nic-halverson.htm

http://news.discovery.com/tech/gear-and-gadgets/biometric-first-touchscreen-recognizes-fingerprints-130719.htm

http://news.discovery.com/tech/gear-and-gadgets/biometric-first-touchscreen-recognizes-fingerprints-130719.htm


207

4. Jerzewska J., Ślady linii papilarnych w praktyce technika kryminalistyki,

Legionowo 2007

5. Zubański S., Raport z badań dotyczących wizualizacji śladów linii papilarnych

metodami chemicznymi, Szczytno 2006r.

6. Rybczyńska-Królik M., Pękaty M. Przewodnik po metodach wizualizacji

śladów daktyloskopijnych – Substancja śladotwórcza - substancja tworząca

obraz linii papilarnych na dotykanym podłożu. Przykłady substancji

śladotwórczej: substancja potowo - tłuszczowa, substancje pyliste (np. mąka,

pył wapienny), płynne, półpłynne (np. smary, tłuszcze) albo biologiczne

(np. krew) - str. 10, wyd. CLK KGP W-wa, 2006

7. Rogoża E., Wudarczyk M., Genypina- nowy środek do ujawniania śladów linii

papilarnych, Kraków 2006

8. Moszczyński J., Daktyloskopia. [Źródło internetowe]:

https://scholar.google.pl/scholar?as_q=daktyloskopia&as_epq=&as_oq=&as_e

q=&as_occt=any&as_sauthors=moszczy%C5%84ski&as_publication=&as_yl

o=&as_yhi=&btnG=&hl=pl&as_sdt=0%2C5 [Dostęp]: 08.11.2014

9. Králík M., Nejman L., and others, Fingerprints on artefacts and historical

items: examples and comments, J. Anc. Fingerpr., vol. 1, pp. 4-15, 2007

10. M. M. D. Sierra, M. Giovanela, E. Parlanti, and E. J. Soriano-Sierra,

Fluorescence fingerprint of fulvic and humic acids from varied origins

as viewed by single-scan and excitation/emission matrix techniques,

Chemosphere, vol. 58, no. 6, pp. 715-733, 2005

11. Tan F.L., Moravec C. S., Li J., Apperson-Hansen C., McCarthy P. M., Young

J. B., Bond M., The gene expression fingerprint of human heart failure, Proc.

Natl. Acad. Sci., vol. 99, no. 17, pp. 11387-11392, 200

12. Odén S., Von Hofsten B. Detection of fingerprints by the ninhydrin reaction, 1954

13. Jain A., Ross A. Fingerprint mosaicking, in Acoustics, Speech, and Signal

Processing (ICASSP), 2002 IEEE International Conference on, 2002, vol. 4,

pp. IV-4064

14. Almog J., Cohen Y., Azoury M., Hahn T.R. Genipin-A novel fingerprint

reagent with colorimetric and fluorogenic activity, J. Forensic Sci., vol. 49,

no. 2, pp. 255-257, 2004

Chemical agents to reveal latent fingerprints

Dactyloscopy is a very important area of forensic science which takes part in the studies of latent fingerprints. It allows to identify the perpetrator of the crime or the identity the human corpses beside which not found any documents. The article has briefly described fingerprinting technique, its origins and further development. It also focuses on the characteristics of the fingerprint evidence, their properties, and the system of identification. The Henry Classification System is described in this article as the only one that distinguishes three basic patterns of the line: loop, whirl and bow. The most important features of the fingerprints (minutiae), which are the set of basic features such as the origins, hooks, or the end of the mesh are described.. The article also describes methods for disclosing latent fingerprints using optical, adsorption and chemical properties of the adhesives and traces. The article presents several examples to disclose the chemical fingerprint marks and briefly characterizes them, inter alia: ninhydrin, cyanoacrylate glue, SPR, black amide and genypina. Behind the chemicals already in use, the scientists still seek for better substances to easier and more efficiently reveal traces of fingerprints to prove one's crime or identity.

https://scholar.google.pl/scholar?as_q=daktyloskopia&as_epq=&as_oq=&as_eq=&as_occt=any&as_sauthors=moszczy%C5%84ski&as_publication=&as_ylo=&as_yhi=&btnG=&hl=pl&as_sdt=0%2C5



208

Robert Karpiński1, Mariusz Walczak

2, Joanna Śliwa

3

Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych

jako biomateriały

Poniższe opracowanie zawiera informacje dotyczące stopów kobaltu stosowanych w stomatologii oraz medycynie. Praca zawiera przegląd

literatury opisujący ogólne właściwości stopów kobaltu. Opisano także

wpływ warunków wytwarzania i wykorzystywanych dodatków stopowych

na strukturę oraz właściwości mechaniczne tych stopów. W opracowaniu umieszczona została metodyka przeprowadzonych badań oraz uzyskane

wyniki. Do badań wybrane zostały dwa stopy na osnowie kobaltu Co-Cr-

Mo-W oraz Co-Cr-Ni-Mo. Pierwszy z nich wytworzony został techniką

odlewniczą drugi natomiast wyniku obróbki plastycznej. Przeprowadzona została analiza składu chemicznego, a następnie badania tribologiczne

in vitro zrealizowane na tribotesterze typu „ball-on-disc”. Przedstawiona

została porównawcza charakterystyka tribologiczna tych stopów.

1. Wprowadzenie

Do najczęściej używanych stopów metali nieszlachetnych w medycynie

i stomatologii należą stopy kobaltu z chromem. Powszechnie w stomatologii

używane są do wykonywania koron, odlewania mostów, inlayów oraz na

protezy szkieletowe [1-3]. Natomiast w medycynie stopy Co-Cr stosowane

są głównie do produkcji endoprotez stawów biodrowych i kolanowych [4].

Stopy kobaltu cechują się wytrzymałością ok. 800÷900 MPa, granicą

plastyczności 600÷700 MPa i twardością 300÷400HV oraz wydłużeniem

w próbie rozciągania na poziomie 2÷5%. W pomiarach właściwości

mechanicznych wybrane odlewy mogą wykazywać małą ciągliwość,

co może przekładać się na zmniejszenie wytrzymałości zmęczeniowej[5].

Stopy Co–Cr–Mo w stanie odlanym są używane na szeroką skalę

w produkcji implantów wykonywanych przy użyciu technik wytapianych

modeli. Z uwagi na trudności w zakresie obróbki tych stopów oraz

złożoność kształtów protez, proces ten obniża wysokie koszty operacji

obróbki skrawaniem dzięki wytwarzaniu części, których wymiary

są zbliżone do wymiarów finalnych[6]. Jednakże ta metoda wytwarzania

1 [email protected], Koło Naukowe Technologii Materiałów, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Lubelska 2 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej, Wydział Mechaniczny,

Politechnika Lubelska 3 [email protected], Koło Naukowe Inżynierii Biomedycznej, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Lubelska


Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały

209

prowadzi go niskich właściwości mechanicznych w porównaniu do innych

procesów produkcyjnych takich jak metalurgia proszków [7] albo kucie [8].

Komorek i współ [9] badali wpływ warunków wytwarzania, na jakość

odlewów stomatologicznych wykonanych metodą odśrodkową w atmosferze

powietrza oraz odlewania ciśnieniowo-próżniowego w atmosferze argonowo-

wodorowej. Stwierdzili oni, że zastosowanie odlewania ciśnieniowo-

próżniowego zapewniło dobrą czystość metalurgiczną odlewów. Badania

strukturalne nie ujawniły w tych próbkach rzadzizn oraz pustek. Natomiast

odlewanie w atmosferze powietrza spowodowało natomiast wystąpienie

licznych rzadzizn, występujących szczególnie w strefie odcinka pomiarowego

próbek wytrzymałościowych.

Interesującą alternatywę dla odlewów i stopów do przeróbki plastycznej

stwarza tu technika metalurgii proszków [10-13]. Pozwala ona

wyeliminować szereg wad typowych dla odlewniczych i przerabianych

plastycznie implantów metalicznych, m.in. ograniczyć mikrosegregację

oraz zmniejszyć ilość bądź zwiększyć dyspersję wydzieleń obcych faz

(głównie węglików). Dobór odpowiednich klas ziarnowych proszku

pozwala na zwiększenie drobnoziarnistości struktury, korzystnej z punktu

widzenia właściwości mechanicznych takich materiałów [12, 14, 15].Według

Henriques’a [16] metalurgia proszków stanowi alternatywną metodę

w produkcji koron dentystycznych w stosunku do odlewania, gdyż

prasowane na gorąco próbki charakteryzują się znacznie większą

twardością niż odlewane (odpowiednio 438±24HV i 324±8HV), a ponadto

wykazują lepszą odporność na korozję.

Jak wiadomo, do głównych wad występujących w stanie odlanym

należą: porowatość, niejednorodność chemiczna, duża wielkość ziarna

a także mikrostruktura zawierająca twarde substancje wytrącone w strefach

międzydendrytycznych [17, 18]. Ponadto niejednorodności morfologii

węglików, a także ich wielkość oraz rozkład mogą prowadzić niskiej

ciągliwości oraz niskiej wytrzymałości zmęczeniowej [6].

Niemniej jednak możliwa jest poprawa właściwości mechanicznych

przy użyciu technik obróbki cieplnej na drodze rozpuszczania dużej sieci

węglików oraz stworzenia struktury bardziej jednorodnej. Wykazano [19],

że w wyniku rozpuszczenia struktury dendrytycznej uzyskano własności

izotropowe, w szczególności w zakresie odkształceń plastycznych.

1.1 Struktura

Wiele właściwości stopów kobaltu wynika z jego krystalograficznej

budowy [20]. Czysty kobalt posiada strukturę heksagonalną ciasno

upakowaną (hcp) w temperaturze pokojowej oraz wykazuje transformację

alotropową do postaci struktury regularnej płasko centrowanej (fcc)


210

w temperaturze 400 °C. Dodatek pierwiastków stopowych takich jak chrom

(Cr) oraz wolfram (W) zwiększa tę temperaturę transformacji [6].

Zawartość węgla w standardowych odlewniczych stopach kobaltu

wg norm ASTM może osiągnąć 0,35% i jest ona określana jako

maksymalna [21,22]. Typowe stopy noszące miano wysokowęglowych

zawierają zazwyczaj ok 0,15÷0,25% C [22,23]. Natomiast według danych

literaturowych zawartość stopów określanych mianem niskowęglowych

wynosi zazwyczaj poniżej 0,07% C [24], a według innych danych nawet

poniżej 0,06% C [23]. Marciniak i współ [1] podają, że stopy stosowane

w stomatologii są stopami niskowęglowymi. W stopach kobaltu

dla stomatologii występują dodatki Mo i W, które wpływają na umocnienie

roztworu stałego [20,21]. Stąd też, obok popularnej grupy stopów Co-Cr-

Mo stosowane są stopy stomatologiczne Co-Cr-W-Mo oraz Co-Cr-Mo-W.

Stopy, które zawierają wolfram cechują się w porównaniu do stopów Co-

Cr-Mo, niższą grubością warstwy utlenionej podczas wypalania ceramiki

[25], co w końcowym efekcie sprzyja trwalszemu połączeniu układu metal-

ceramika. Obecność Cr w stopach Co-Cr-Mo zapewnia odporność

na korozję. Dodatkowo molibden pomaga obniżyć współczynnik

rozszerzalności, co nie jest bez znaczenia w przypadku stopów

stosowanych do uzupełnień metalowo-ceramicznych [16].

Potencjalnie uznaje się, że w stopach kobaltu, w zależności od składu

chemicznego i warunków przetwarzania mogą powstać węgliki

o zróżnicowanej budowie -od MC poprzez M23C6. M6C, M3C2 aż do M7C3.

Jednak w stopach znajdujących przemysłowe wykorzystanie najbardziej

prawdopodobne jest powstanie węglików M23C6, M6C i M7C3 [26].W stanie

lanym cząstki węglików wykazują dwoistą budowę – występują w postaci

wydzieleń masywnych (ciągłych) lub w formie wydzieleń płytkowych

(lamelamych) [27].

Stopy na bazie kobaltu wykazują metastabilną osnowę dendrytyczną

α-fcc z powodu powolnego charakteru transformacji fcc → hcp [28],

a także substancji wytrąconej złożonej głównie z węglików M23C6

międzymetalicznej fazy σ a także fazy płytkowej złożonej z płytek

międzywarstwowych węglika M23C6 a także z fazy, której dotychczas jasno

nie zidentyfikowano, ewentualnie fazy σ, obydwu faz α oraz σ oraz α albo

M6C faz węglików, co zaproponowało kilku autorów [29-33]. Ta struktura

płytkowa powstaje w trakcie chłodzenia w temperaturach poniżej 990 °C,

stwierdzono, że jest to najbardziej niekorzystna cecha mikrostruktury

[34]ponieważ po rozpuszczeniu tej substancji wytrąconej na granicy ziarna

następuje poprawa trwałości zmęczeniowej[6].

Wytrącanie węglika na granicach ziarna oraz regiony między-

dendrytyczne stanowią główny mechanizm wzmacniający w stanie

odlanym [35] ale także przez oddziaływania dyslokacji z przecięciami


211

błędu ułożenia [36,37]. Gruboziarniste węgliki w formie bloków spełniają

ważna rolę jako źródła dyslokacji oraz błędów ułożenia po przyłożeniu

naprężenia [37]. Z uwagi na specyficzne niskie prędkości chłodzenia

w procesie produkcji, możliwe jest jednoczesne istnienie dwu morfologii

węglików tzn. „typu blokowego” oraz typu „perlitycznego” w wyniku

reakcji eutektycznej [38,39]. Inni autorzy stwierdzili, że powstawanie

płytkowych węglików „eutektoidalnych” ma miejsce w zakresie prędkości

chłodzenia od 8 do 16 °C/min [40] a na podstawie wcześniejszych

wyników ustalono, że maksymalna prędkość chłodzenia umożliwiająca

wytrącanie fazy eutektycznej wynosi 35 °C/min [29]. Stwierdzono także

wzrost wielkości substancji wytrącanej oraz gęstości zarówno fazy

blokowej jak i płytkowej wraz z zawartością węgla [39], przy czym

nie miało to istotnego wpływu na ciągliwość.

Z drugiej strony analiza metalograficzna wykazała [6], iż zawartość

azotu ma niewielki wpływ na wielkość ziarna. Kiedy zawartość azotu

wzrasta, sprzyja to powstawaniu drobniejszych ziaren węglików M6C

zamiast węglików M23C6 mających tendencję do gromadzenia się na

granicach ziarna. W przypadku obecności w roztworze, azot może

oddziaływać jako umacniacz roztworu stałego, co powoduje poprawę

właściwości mechanicznych [8], kosztem innych własności, które często

okazują się niewystarczające aby spełnić wymagania normy

ASTM F75 [6].

Kilner i współ [41], sugerowali możliwość wytrącania węglika M7C3

podczas krzepnięcia stopu ASTM F75 oraz jego rozpuszczania na drodze

dyfuzji w trakcie chłodzenia, ponieważ nie zaobserwowano tego

w temperaturze pokojowej. Clemow and Daniell [42]stwierdzili, że reakcje

podczas operacji obróbki cieplnej roztworu w temperaturach powyżej

1300°C obejmowały topienie węglika oraz że początkowo obecny w stopie

węglik M23C6 wykazywał tendencję do transformacji do postaci węglika

M6C oraz fazy σ. Istotny jest fakt, iż ten typ obróbki cieplnej wymaga

precyzyjnej regulacji zmiennych występujących w procesie z powodu

wąskiego zakresu temperatur, w których ma miejsce rozpuszczania

węglika [43].

Z drugiej strony, Opris i współ [28] stwierdzili obecność kompleksowej

kombinacji węglików Co3Mo/W3C, M23C6 oraz Cr7C3 osadzonych

w osnowie o bogatej zawartości Co, ponieważ węgliki metalu mogą

w rzeczywistości mieć skład potrójnego roztworu stałego ternary [44].

Oprócz faz międzydendrytycznych, należy unikać niektórych z nich,

ponieważ mają negatywny wpływ na niektóre właściwości mechaniczne,

występuje mikrosegregacja, co ewentualnie sprzyja powstawaniu faz

nierównowagi [38].


212

W stopach kobaltu występują międzymetaliczne fazy o topologicznie

zwartej upakowanej strukturze z ang. topologically closed-paced structure

[45-47], takie jak wcześniej przytoczona faza σ, Lavesa (o wzorze

stechiometrycznym A2B), faza π (krystalizująca w układzie tetragonalnym)

i faza µ (identyfikowana jako faza Co7Mo6 [45,48]) [20]. Według Górnego

[20] fazy te tworzyć się mogą przeważnie w niskowęglowych stopach Co,

gdzie stosunek zawartości metali trudnotopliwych i Cr do łącznej

zawartości Co i Cr przekracza graniczną rozpuszczalność w austenicie

w danej temperaturze.

Możliwa jest także modyfikacja mikrostruktury stopów kobaltu w stanie

odlanym w wyniku zmiany pierwiastków stopowych. Zastąpienie wolframu

taką sama ilością molibdenu powoduje poprawę ciągliwości, zwiększa

zakres krzepnięcia oraz zmienia morfologię wytrąconej substancji przez

segregację [29] wytwarzając dodatkowe ilości węglików eutektycznych [6].

Jednocześnie wzrost zawartości wolframu zmniejsza gęstość błędu

ułożenia oraz jednocześnie zwiększa frakcję objętości związku

międzymetalicznego σ w stopach Co–Cr–Mo [49]. Podobne zachowanie

stwierdzili Zhuang i współ [50]w przypadku dodatków niklu. Dodanie

stabilizatorów fazy fcc, takich jak Fe, Ni, Mn oraz C, ułatwia retencję fcc

w temperaturze pokojowej w wyniku spowolnienia transformacji

fcc → hcp [6].

Odlewane stopy Co-Cr-Mo są poddawane obróbce cieplnej w celu

wyeliminowania wad odlewniczych oraz poprawy własności

mechanicznych [51]. W związku z tym zachowanie węglików utworzonych

w stopach Co-Cr-Mo podczas obróbki cieplnej było przedmiotem

niektórych badań [19,29,31,34,39,41-43,52,53]. Wiele badań skupiało

się na charakterystyce rozpuszczania węglików w trakcie procesu

rozpuszczania [19,29,31,34,39,41-43]. Znajomość wytrącania lub rozpusz-

czania węglików ma zasadnicze znaczenie dla ustalenia efektywnego oraz

ekonomicznego procesu produkcji stopów Co-Cr-Mo [51].

Odlewnicze stopy podlegają przeważnie przesycaniu, ale w celu

usuwania naprężeń mogą podlegać wyżarzaniu odprężającemu. Natomiast

normalne wyżarzanie przeprowadza się w temperaturze 760 °C i prowadzi

ono do zwiększenia tworzenia oddzielnych cząstek węglika Cr23C6. Wyższe

temperatury wyżarzania mogą spowodować iglaste i/lub płytkowe

wydzielenia opisane powyżej [20].

Właściwe przesycanie jest rzadko stosowane. Pozwala na uzyskanie

znaczących efektów w mikrostrukturze przy temperaturach powyżej

1175°C; przeważnie są to temperatury ok. 1205÷1260 °C. Natomiast

starzenie przeprowadza się poniżej 760 °C. Nie mniej jednak obróbkę

cieplną dostosowuje się do konkretnych stopów i efektów jakie chce

się uzyskać [20].


213

Badania Montero-Ocampo i współ [19]dotyczące wstępnego

podgrzewania różnych stopów Co-Cr-Mo-C poddawanych następnie pełnej

obróbce normalizującej na końcową wytrzymałość i ciągliwość odlewów

wykazały znaczną poprawę właściwości mechanicznych w stosunku

do własności materiału niepoddanego obróbce.

Zmiana temperatury odlewania nawet o ok.10÷20°C w stosunku

do tego, co zaleca producent dentystycznych stopów może powodować

zmianę właściwości mechanicznych odlewu. Reimann i Dobrzański [54]

badali wpływ temperatury odlewania na właściwości mechaniczne

komercyjnych stopów Remanium 2000+ i Wirobond LFC. Wykazali oni,

że jeżeli następuje wzrost temperatury odlewania, to zmienia się granica

plastyczności i wytrzymałości na ściskanie w porównaniu do wartości

uzyskanych dla temperatury domyślnej z danej instrukcji podawanej przez

producenta stopów. Uzyskana umowna granica plastyczności była mniejsza

o około 10%, a wytrzymałość na ściskanie około 25%.

Odporność na procesy tribologiczne stopów na osnowie kobaltu

w głównej mierze zależy od struktury i sposobu kształtowania materiału,

a także ośrodka w jakim przebywają [55, 56]. Według Iijima i współ [57]

współczynnik zużycia jest ważnym czynnikiem określającym właściwości

tribologiczne materiałów stosowanych w medycynie i stomatologii.

Dodatkowo autorzy [57] zwracają uwagę, że w większości prac

badawczych dotyczących biomateriałów naukowcy zbyt bardzo skupiają

się na badaniu właściwości wytrzymałościowych i korozyjnych, a pomijają

właściwości tribologiczne.

Dlatego też, celem naukowym tej pracy była porównawcza

charakterystyka tribologiczna w warunkach in vitro dwóch stopów

na osnowie kobaltu wytworzonych techniką odlewniczą i w wyniku

obróbki plastycznej.

2. Metodyka badań

Do badań wybrano dwa różne stopy na osnowie kobaltu stosowane jako

biomateriały. Stop Co-Cr-Mo-W wytworzony były w wyniku odlewania

próżniowo-ciśnieniowego techniką wytapianych modeli, natomiast stop

Co-Cr-Ni-Mo uzyskany był w wyniku obróbki plastycznej z jednokrotnie

walcowanej blachy. Próbki użyte do badań posiadały kształt krążków

o średnicy Ø 25 mm i grubości 2 mm. Podano je szlifowaniu na wodnych

papierach ściernych o ziarnistości odpowiednio 220, 600 i 1200. Następnie

próbki polerowano mechanicznie przy użyciu zawiesiny diamentowej 3 m

i zawiesiny tlenków 0,05m, a po zakończeniu polerowania przemywano

je acetonem i suszono.


214

Analizę składu chemicznego wykonano na iskrowym spektrometrze

emisyjnym Q4 Tasman 130 (Bruker, Niemcy). Badania realizowano

na globalnym kanale badawczym Co100, w którym dokonano po 5 analiz

(iskrzeń) dla każdej z próbek.

Badania tribologiczne in vitro zrealizowano na tribotesterze typu „ball-

on-disc” firmy CSM Instruments, w temperaturze 37ºC w roztworze

Ringera (firmy Braun). Jako przeciwpróbki (ball) użyto kulek o średnicy

6 mm wykonanych z Al2O3 o twardości 2000HV (firmy CSM Instruments).

Badania realizowano pod obciążeniem 10N z prędkością liniową 1,88 cm/s

na promieniu 4,5 mm. Całkowita droga testu wynosiła 100 m podczas,

której rejestrowano zmianę współczynnika tarcia. Miarą zużycia był ubytek

objętościowy próbki powstały, jako ślad wytarcia w wyniku współpracy

próbki i przeciwpróbki. W tym celu za pomocą profilometru stykowego

Dektak 150 firmy Veeco Instruments, po obwodzie próbki (w 10

miejscach) mierzono pole profilu wytarcia próbki. Promień zaokrąglenia

igły pomiarowej wynosił 2 µm. Zużycie objętościowe wyznaczono, jako

iloczyn średniej wartości pola wytarcia próbki i obwodu koła śladu

wytarcia powstałego w teście ball-on-disc. Dodatkowo jako porównawczą

miarę zużycia, która uwzględniałaby obciążenie oraz przebieg dystansu

stosowany podczas testu wyznaczono tzw. współczynnik zużycia K [55]:

3. Rezultaty i wyniki badań

Wyniki (średnia ± SD)analizy składu chemicznego badanych

materiałów przedstawiono w tabeli 1. Warto zwrócić uwagę, że producenci

nie wykazują w swoich danych informacji o stężeniach pierwiastków

poniżej 1%. Zawartość węgla w zakresie 0,007÷0,069% wskazuje,

że analizowane materiały należą do grupy stopów niskowęglowych.

W przypadku odlewanego stop3.u Co-Cr-Mo-W obserwuje się wyższą

zawartości węgla w porównaniu do stopu walcowanego Co-Cr-Ni-Mo,

co może dodatkowo determinować wzrost twardości dla tej grupy

materiałów. Według Karaali i współ [49] zarówno w stopach kobaltu

dla medycyny jak i stomatologii mogą się tworzyć węgliki takie jak MC,

M7C3,M23C6 oraz M6C.W przypadku stopu Co-Cr-Mo-W odnotowano

wyższą zawartość molibdenu i wolframu. Molibden i wolfram powoduje

umocnienie roztworu stałego stopu oraz Mo może powodować dodatkowo

tworzenie się faz międzymetalicznych [20, 21]. Dodatkowo większa

zawartość Mo sprzyja większej odporności na korozję wżerową [58],

a na powierzchni stopu tworzyć się mogą korzystne tlenki MoO3 [59].


215

W przypadku walcowanego stopu Co-Cr-Ni-Mo duża zawartość Ni może

wpływać uczulająco na pacjentów – co poświadczają dane literaturowe [60].

Tabela 1. Skład chemicznych badanych stopów (mas. %)

Stop C Si Mn P S Cr Mo Ni

Odle

wa-

ny

Co-C

r-

Mo

-W

0,069 1,189 0,137 0,0086 <0,002 21,38 8,538 0,213

SD 0,008 0,018 0,003 0,001 - 0,511 0,008 0,003

Wal

cow

any

Co-C

r-N

i-M

o

0,007 0,210 0,015 <0,001 <0,002 20,82 3,437 20,55

SD 0,001 0,005 0,001 - - 0,523 0,052 0,102

Stop W Fe Al Cu Nb N Ti Co

Odle

wa-

ny

Co-C

r-M

o-W

4,599 0,0039 0,045 0,0088 <0,005 0,204 0,004

5 63,57

SD 0,112 0,001 0,019 0,007 - 0,069 0,000

3 0,303

Wal

co-w

any

Co-C

r-N

i-M

o

0,054 0,568 0,002 0,014 0,373 0,080 0,017 54,79

SD 0,009 0,025 0,0005 0,001 0,005 0,034 0,000

7 0,455

Testy badań tribologicznych w roztworze Ringera wykazały wyższy

średni współczynnik tarcia dla materiału odlewanego (tabela 2 i rys. 1).

Sytuacja taka zwiana jest z twardością materiałów. Zmierzona średnia

twardość odlewanego stopu Co-Cr-Mo-W wyniosła 370±8 HV10,

a przerobionego plastycznie stopu Co-Cr-Ni-Mo 325±3 HV10.

Według [55] zużycie ścierne stopów kobaltu determinowane jest przez

twarde cząsteczki węglika lub twarde występy, które są dociskane przez


216

przeciwpróbkę, a następnie przesuwają się względem współpracujących

powierzchni. Dane literaturowe [23] wskazują, że wysokowęglowe stopy

CoCrMo zużywają się znacznie słabiej niż stopy niskowęglowe. Tendencja

taka wynika stąd, że CoCrMo o niskiej zawartości węgla charakteryzują

się niskim udziałem objętościowy węglików. Wpływ na wartość

współczynnika tarcia ma środowisko (ośrodek płynny), który stykając

się z aktywną powierzchnią wchodzi z nią w interakcję. I tak na przykład

środowisko 0,36% NaCl powoduje podwyższenie współczynnika tarcia

dla odlewniczych wysokowęglowych stopów kobaltu, obniżenie

dla niskowęglowych [55]. Natomiast w innym medium, – w 50% surowicy

bydlęcej lub Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium trend ten jest

całkowicie odwrotny.

Wielkość uzyskanych przez autorów tego artykułu współczynników

tarcia jest zbliżona do danych literaturowych [55], gdzie badania były

prowadzone dla stopów wysokowęglowych (na poziomie µ=0,19÷0,25)

i dla niskowęglowych (na poziomie µ=0,27÷0,28) w różnych

ośrodkach płynnych.

Tabela 2. Zestawienie wyznaczonych wartości współczynników tarcia badanych materiałów we współpracy z przeciwpróbką z Al2O3

Materiał Średni współczynnik

tarcia µ

Odchylenie

standardowe

Odlewany

Co-Cr-Mo-W 0,317 0,028

Walcowany

Co-Cr-Ni-Mo 0,260 0,047

Na rys. 2 przedstawiono zmiany zużycia objętościowego badanych

materiałów. Wynika z niego, że stop odlewniczy Co-Cr-M-W

charakteryzuje się o ponad czterokrotnie mniejszym zużyciem. Wyższemu

współczynnikowi tarcia towarzyszy mniejsze zużycie w teście

tribologicznym ball-on-disc.

Analiza statystyczna testem Shapiro-Wilka pomiaru zużycia

objętościowego wykazała, że otrzymane wyniki nie mają rozkładu

normalnego p=<0,05. Natomiast test istotności U Manna-Whitneya

(dla α=0,05) wykazał, że różnice w zużyciu są istotne statystycznie

(p<0,05) pomiędzy dwoma badanymi materiałami (dla których p=0,00077)

Dla obu materiałów wyznaczono wartości współczynników zużycia i tak

dla odlewanego stopu CoCr-Mo-W współczynnik K=9,01×10-7mm3N-1m-1,

a dla stopu CoCr-Ni-Mo po obróbce plastycznej K=4,33×10-7mm3N-1m-1.


217

a)

b)

Rys. 1. Wykres zmian współczynnika tarcia w funkcji przebytej drogi przy obciążeniu 10N

dla materiałów: (a)odlewany Co-Cr-Mo-W, (b) walcowany Co-Cr-Ni-Mo.


218

Rys. 2.Wykres zużycia objętościowego badanych materiałów uzyskany na dystansie 100m

Analiza powierzchni torów po testach tribologicznych – zdjęcia SEM

(rys. 3) wskazują na abrazyjny mechanizm zużycia. Wydzielenia twardych

węglików w przypadku odlewniczego stopu Co-Cr-Mo-W stanowią

naturalną przeszkodę dla materiału przeciwpróbki. Dominującym

czynnikiem w przypadku obu materiałów jest mikroskrawanie w postaci

ciągłych rys wzdłuż śladów zużycia oraz zużycie ścierne. Intensyfikacja

procesu zużycia zachodzi poprzez dodatkowe oddziaływanie luźno

przetaczających się twardej fazy (szczególnie widoczne w przypadku stopu

Co-Cr-Ni-Mo) między współpracującymi powierzchniami próbki

i przeciwpróbki z powierzchniami trącymi. Zachowanie takie determinuje

zwiększenie efektu abrazyjnego zużycia badanych stopów. Przetaczające

się węgliki powodują powstawanie zarysowań na powierzchni

współpracującej próbki lub plastyczną deformację fragmentów osnowy

pozostawiając charakterystyczne ślady w postaci bruzd.

Autorzy prac [24, 55], także potwierdzają w swoich badaniach,

że zużycie abrazyjne stanowi dominujący czynnik powodujący niszczenie

warstwy wierzchniej odlewniczych stopów CoCrMo.


219

a)

b)

Rys. 3.Mikrostruktura SEM śladu zużycia: (a) odlewany Co-Cr-Mo-W,

(b) walcowany Co-Cr-Ni-Mo.


220

4. Podsumowanie

Badania składu chemicznego wykazały, że stop odlewniczy

Co-Cr-Mo-W charakteryzuje się nieco wyższą zawartością węgla.

Co przekłada się na większą twardość tego stopu. Generalnie obydwa

materiały kobaltowe należ do grupy stopów niskowęglowych. Uzyskany

w teście tribologicznym ball-on-disc niższy współczynnik tarcia

dla walcowanego stopu Co-Cr-Ni-Mo przekłada się na większe zużycie.

Porównując właściwości obydwu materiałów to w przypadku doboru

materiałów na biomateriały, które będą pracowały w warunkach zużycia

tribologicznego lepiej sprawdzi się stop odlewniczy Co-Cr-Mo-W.

Literatura

1. Marciniak J., Kaczmarek M., Ziembowicz A., Biomateriały w stomatologii,

Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice, 2008

2. Dobrzański L.A., Reimann Ł., Krawczyk C., Effect of age hardening

on corrosion resistance and hardness of CoCrMo alloys used in dental

engineering, Archives of Materials Science and Engineering, Vol. 57/ Issue

1 (2012) 5-12

3. Dobrzański L.A., Reimann Ł., Influence of Cr and Co on hardness

and corrosion resistance CoCrMo alloys used on dentures, Journal of Achieve-

ments in Materials and Manufacturing Engineering 49/2 (2011) 193-199

4. Surowska B., Kształtowanie składu chemicznego i struktury stopów

Co-Cr-Ni-Mo jako biomateriałów, Wydawnictwo Uczelniane Politechniki

Lubelskiej, ISBN 83-87270-46-6, Lublin 1997, 134

5. Leda H., Materiały inżynierskie w zastosowaniach biomedycznych,

Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań, 2012

6. Giacchi J.V., Morando C.N., Fornaro O., Palacio H.A., Microstructural

characterization of as-cast biocompatible Co–Cr–Mo alloys, Materials

Characterization, 62 (2011) 53-61

7. Grądzka-Dahlke M., Dąbrowski J.R., Dąbrowski B. Modification

of mechanical properties of sintered implant materials on the base of Co–Cr–

Mo alloy, Journal of Materials Processing Technology, 204 (2008) 199-205

8. Escobedo J., Méndez J., Cortés D., Gómez J., Méndez M., Mancha H., Effect

of nitrogen on the microstructure and mechanical properties of a CoCrMo

alloy, Mater Des, 17 (1996) 79-83

9. Komorek Z., Jóźwiak S., Kuchta M., Wpływ warunków wytwarzania

na właściwości mechaniczne stopu stomatologicznego Co-Cr-Mo-C,

Archiwum Odlewnictwa, Vol. 6, No. 18 (2006) 279-282

10. Becker B.S., Bolton J.D., Youseffi M., Production of porous sintered

Co-Cr-Mo alloys for possible surgical implants application, Powder

Metalurgy, 3 (1995) 201-208

11. Dąbrowski J.R., Oksiuta Z., Porowaty materiał implantacyjny z proszku stopu

Vitalium, Inżynieria Materiałowa, 4 (2000) 174-179


221

12. Dąbrowski J.R., Sidun J., Piszczatowski Sz., Sterna J., Porowate kompozyty

ceramiczno-metaliczne na bazie stopu Co-Cr-Mo – potencjalne biomateriały

na implanty kostne, Kompozyty, 2/4 (2002) 167-170

13. Krasicka-Cydzik E., Okisiuta Z., Dąbrowski J.R., Corrosion testing of sintered

samples made of the Co-Cr-Mo alloy for surgical applications, Journal

Materials Science: Materials in Medicine, 2005; 16: 197-202

14. Cordey J., Biofunctionality and biomechanics of implant, (w:) Biomaterials-

hard tissue repair and replacement, Elsevier Science Publ. 1992, 235-245

15. Marciniak J., Biomateriały w chirurgii kostnej, Wydawnictwo Politechniki

Śląskiej, Gliwice, 1992

16. Henriques B. Bond strength enhancement of metal-ceramic dental restorations

by FGM design, Tese de Doutoramento Engenharia Mecânica, Universidade

do Minho Escola de Engenharia, Minho, 2012

17. Campbell J., Castings: The new metallurgy of cast metals. 2nd edition,

Oxford/GB: Elsevier Science & Technology; 2003

18. Stefanescu D.M., Science and engineering of casting solidification. 2nd

edition, USA: Springer US; 2009

19. Montero Ocampo C., Talavera M., Lopez H., Effect of alloy preheating on the

mechanical properties of as-cast CoCrMoC alloys, Metall Mater Trans A ,

30 (1999) 611-620

20. Górny Z., Odlewnicze stopy kobaltu, Instytut Odlewnictwa, Kraków, 2008

21. Podrez-Radziszewska M., Haimann K., Dudziński W., Morawska-Sołtysik M.,

Characteristic of intermetallic phases in cast dental CoCrMo alloy, Archives

of Foundry Engineering, Vol. 10, Issue 3 (2010) 51-56

22. Metcalf J.E.P., Cawley J., Band T.J., Cobalt Chromium Molybdenum Metal-

on-Metal Resurfacing Orthopaedic Hip Devices, Business Briefing, Medical

Device Manufacturing & Technology, 2004, 1-7

23. Yan Y., Neville A., Dowson D., Tribo-corrosion properties of cobalt-based

medical implant alloys in simulated biological environments, Wear, Vol.

263 (7-12), (2007) 1417-1422

24. Balagna C., Spriano S., Faga M.G., Characterization of Co–Cr–Mo alloys

after a thermal treatment for high wear resistance, Materials Science

and Engineering C 32 (2012) 1868-1877

25. Surowska B., Biomateriały metalowe oraz połączenia metal-ceramika

w zastosowaniach stomatologicznych, Wydawnictwo Politechniki Lubelskiej,

Lublin, 2009

26. Bojar Z., Analiza morfologii i składu chemicznego węglików w odlewniczych

stopach kobaltu, Krzepniecie Metali i Stopów, 27/13 (1996) 85-92

27. Bojar Z., Korpikiewicz J., Wpływ niklu na morfologię i skład chemiczny

węglików w odlewniczych stopach kobaltu, Krzepnięcie Metali i Stopów,

36/21 (1998) 159-166

28. Opris C.D., Liu R., Yao M.X., Wu X.J.. Development of Stellite alloy

composites with sintering/HIPing technique for wear-resistant applications,

Mater Des 2007;28:581-91


222

29. Ramírez LE, Castro M, Méndez M, Lacaze J, Herrrera M, Lesoult G.

Precipitation path of secondary phases during solidification of the CoCrMoC

alloy, Scripta Materialia, 2002;47:811-816

30. Weeton JW, Clauss FJ. Effect of heat treatment upon microstructures

microconstituents and hardness of a wrought cobalt-base alloy, Stellite 21.

National Advisory Committee for Aeronautics, Technical Note 3107; March 1954

31. Weeton JW, Signorelli RA. Effect of heat treatment upon microstructures

microconstituents and hardness of a wrought cobalt-base alloy, Trans ASM

1955;47:815-45

32. Silverman R, Arbiter W, Hodi F. Effect of sigma phase on Co–Cr–Mo base

alloys, Trans ASM 1957;49:805-22

33. Sims CT. Contemporary view of cobalt-base alloys, J Met 1969;21:27–42

34. Dobbs H.S., Robertson J.L.M., Heat treatment of cast Co–Cr–Mo

for orthopaedic implant use, J Mater Sci 1983;18:391-401

35. Asgar K., Peyton F.A., Effect of casting conditions on some mechanical

properties of cobalt-case alloys, J Dent Res 1961;40:73-86

36. Rajan K., Vander Sande J.B., Room temperature strengthening mechanisms

in a Co–Cr–Mo–C alloy, J Mater Sci 1982;17: 769-778

37. Sims C.T., Hagel W., Stoloff N., The Superalloys II: High temperature

materials for aerospace and industrial power, 2nd edition. Wiley & Sons Inc.;

1987. Chapter 5

38. Montero Ocampo C., Salinas A., Effect of carbon content on the resistance to

localized corrosion of as-cast cobalt-based alloys in an aqueous chloride

solution, J Biomed Mater Res 1995; Vol. 29, Issue 4, 441-453

39. Herrera Trejo M., Espinoza A., Méndez J., Castro M., López J., Rendón J.,

Effect of C content on the mechanical properties of solution treated as-cast

ASTM F75 alloys, J Mater Sci Mater Med. 2005;16:607-611

40. Ramírez-Vidaurri L.E., Castro-Román M., Herrera-Trejo M., García-López

C.V., Almanza-Casas E., Cooling rate and carbon content effect

on the fraction of secondary phases precipitate in as-cast microstructure

of ASTM F75 alloy, J Mater Process Technol 2009;209:1681-1687

41. Kilner T., Pilliar R.M., Weatherly G.C., Alibert C., Phase identification

and incipient melting in a cast CoCr surgical implant alloy, J Biomed Mater

Res 1982;16:63-79

42. Clemow A.J., Daniell B.L., Solution treatment behavior of CoCrMo alloy,

J Biomed Mater Res 1979;13:265-79

43. Mancha H., Carranza E., Escalante J.I., Mendoza G., Méndez M., Cepeda F.,

et al. M23C6 carbide dissolution mechanisms during heat treatment of ASTM

F75 implant alloys, Metall Mater Trans A 2001;32A:979-84

44. Vandamme N.S., Que L., Topoleski L.D.T., Carbide surface coating

of Co–Cr–Mo implant alloys by a microwave plasma-assisted reaction,

J Mater Sci 1999;34:3535-3521

45. Narushima T., Mineta S., Kurihara Y., Ueda K., Precipitates in Biomedical

CoCr Alloys, JOM, Vol. 65, No. 4 (2013) 489-504

46. Pohl M., Storz O., Sigma phase in duplex-stainless steels, Z. Metallkd.

95 (2004)631-638


223

47. Joubert J.M., Crystal chemistry and Calphad modelling of the sigma phase,

Prog. Mater. Sci. 53 (3) (2008) 528-583

48. Huang P., Liu R., Wu X. J., Yao M. X., Effects of molybdenum content

and heat treatment on mechanical and tribological properties of a low-carbon

Stellite alloy, Journal of Engineering Materials and Technology, 129(4)

(2007), 523-529

49. Karaali A., Mirouh K., Hamamda S., Guiraldenq P., Microstructural study

of tungsten influence on CoCr alloys, Mater Sci Eng, A 2005;390:255-299

50. Zhuang L., Langer E.W., Effects of alloy additions on the fatigue properties

of cast Co-Cr–Mo alloy used for surgical implants, J Mater Sci 1990;

25:683-689

51. Mineta S., Namba S., Yoneda T., Ueda K., Narushima T., Carbide formation

and dissolution in biomedical Co-Cr-Mo alloys with different carbon contents

during solution treatment, Metallurgical and Materials Transactions A, Vol.

41A (2010) 2010-2129

52. Caudillo M., Herrera-Trejo M., Castro M.R., Ramírez E., González C.R.,

Juárez J.I.: J. Biomed. Mater. Res., 59 (2002) 378-385

53. Taylor R.N.J., Waterhouse R.B.: J. Mater. Sci., 18 (1983) 3265–3280.

54. Reimann L., Dobrzański L.A., Influence of the casting temperature on dental

Co-base alloys properties, Archives of Materials Science and Engineering

60/1 (2013) 5-12

55. Yan Y., Neville A., Dowson D., Williams S., Tribocorrosion in implants –

assessing high carbon and low carbon Co–Cr–Mo alloys by in situ

electrochemical measurements, Tribology International. 2006; 39: 1509-1517

56. Walczak M., Pieniak D., Niewczas A.M., Effect of recasting on the useful

properties CoCrMoW alloy, Eksploatacja i Niezawodnosc – Maintenance

and Reliability, 16, 2014, 330-336

57. Iijima D., Yoneyama T., Doi H., Hamanaka H., Kurosaki N., Wear properties

of Ti and Ti–6Al–7Nb castings for dental prostheses, Biomaterials, 2003;

24: 1519-1524

58. Geis-Gerstorfer J., Weber H., In vitro corrosion behaviour of four

Ni–Cr dental alloys in lactic acid and sodium chloride solutions, Dental

Materials 1987;3:289-295

59. Igual-Muñoz A., Mischler S., Interactive effects of albumin and phosphate

ions on the corrosion of a CoCrMo implant alloy, Journal

of the Electrochemical Society, Vol. 154 (10), (2007) C562-C570

60. Niinomi M., Recent metallic materials for biomedical applications,

Metallurgical and Materials Transactions A, 33A, 2002, 477-486


224

Tribological research of cobalt alloys used as biomaterials

Abstract This study provides information about the cobalt alloys used in dentistry and medicine.

The work includes a review of the literature describing the general properties of cobalt

alloys. In addition it describes the impact of the manufacturing conditions and alloy

additives used , on the structure and mechanical properties of these alloys. The research methodology and the results obtained has been presented in the study. Two cobalt-based

alloys Co-Cr-Mo-W and Co-Cr-Ni-Mo were selected for the tests. The first one

was prepared with the use of casting technique whereas the second was obtained due

to plastic forming. An analysis of the chemical composition and in vitro tribological tests with the use of tribotester of "ball-on-disc" type was conducted. Comparative tribological

characteristics of these alloys has been presented.

225

Aleksandra Kuźmińska1, Beata Butruk-Raszeja

2

Bioaktywne powierzchnie promujące proces

adhezji komórek śródbłonka

Wysoka umieralność z powodu chorób sercowo-naczyniowych generuje ogromne zapotrzebowanie na sztuczne naczynia krwionośne. Protezy

naczyniowe najczęściej wytwarzane są z polimerów. Jednak ciągle nie

znaleziono materiału, który w pełni spełniałby wszystkie wymagania stawiane

przed biokompatybilnym materiałem. Dlategoaby zminimalizować negatywną odpowiedź organizmu przeprowadza się odpowiednie modyfikacje

powierzchni materiału. Idealnym rozwiązaniem może okazać się hybrydowy

implant – polimer pokryty komórkami śródbłonka ludzkiego.

1. Zapotrzebowanie na protezy naczyniowe

Ludzki układ krwionośny składa się z serca, naczyń krwionośnych oraz

krwi. Naczynia krwionośne dzieli się na 3 grupy: tętnice, naczynia

włosowate oraz żyły.Tętnice transportują krew z serca do tkanek, gdzie

rozgałęziają się na tętniczki. Te transportują krew do najmniejszych naczyń

krwionośnych – naczyń włosowatych. Po przejściu przez organ, kapilary

łączą się w żyły, które transportują krew do serca [1, 2].

Stan naczyń krwionośnychjak i przepływ krwi mają istotny wpływ

na jakość życia. Dostarczają substancji odżywczych do tkanek,

a ich zaburzenia lub urazy mogą spowodować krwawienie i zakrzepicę [3].

Umieralność z powodu schorzeń układu krążenia spada, jednak ciągle

jest to najczęstszy powód zgonów w Polsce. Na początku lat 90-tych

52% zgonów w Polsce było z powodów chorób układu krążenia. Obecnie

(dane z roku 2013) umieralność wynosi 46%.Do chorób układu krążenia

zalicza się wszystkie schorzenia, których przyczyną jest nadciśnienie,

wysoki poziom cholesterolu, cukrzyca i palenie papierosów. Najczęstszą

przyczyną zgonów w Polsce (26,9% wszystkich zgonów) jest choroba

wieńcowa serca [4].

Istnieją różne metody leczenia chorób układu krążenia – leki lub metody

inwazyjne, np. angioplastyka wieńcowa, pomostowanie tętnic wieńcowych.

Jednakże, w przypadku ostrej niewydolności może być konieczny

1 [email protected], Laboratorium Inżynierii Biomedycznej, Zakład

Biotechnologii i Inżynierii Bioprocesowej, Wydział Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika Warszawska 2 [email protected], Laboratorium Inżynierii Biomedycznej, Zakład Biotechnologii

i Inżynierii Bioprocesowej, Wydział Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika

Warszawska



226

przeszczep naczyń krwionośnych. Jest to trudne do wykonania ze względu

na ograniczonąliczbę dawców, dlatego szuka się rozwiązania, które zastąpi

tę procedurę. Z pomocą przychodziinżynieria biomateriałowa, ponieważ

sztuczne narządy są wytrzymałe mechanicznie i odporne na degradację,

jednak muszą być również w odpowiednim stopniu biokompatybilne.

Aktualnym celem inżynierii sercowo-naczyniowej jest uzyskanie powłoki,

która nie wywołujenegatywnych odpowiedzi organizmu, tak by zmniejszyć

potrzebę stosowania antykoagulantów i ryzyko zakrzepicy [5, 6]. Może

to doprowadzić do stworzenia protezy naczyniowej o małej średnicy

pokrytej komórkami śródbłonka tak, aby jak najbardziej odwzorowywała

naturalne naczynie krwionośne.

2. Biomateriały

Biomateriałem jest każda powierzchnia lub materiał, która wchodzi

w interakcję z żywą tkanką [7].

Biomateriały można podzielić na trzy główne grupy: metale, ceramikę

i polimery. Polimery są znacznie bardziej wszechstronne niż metale

czy ceramika. Fizyczne, mechaniczne i chemiczne właściwości polimerów

mogą stanowić pomoc dla dalszych badań i rozwoju aplikacji biomateriałów

polimerowych [8]. Tabela 1 przedstawia wymagania dla biomateriałów,

które muszą być spełnione.

Tabela 2. Specyfikacja materiału do zastosowań biomedycznych [9]

Własność Pożądane cechy

Biokompatybilność

Niepowodujący stanów zapalnych, nietoksyczny,

nie rakotwórczy, kompatybilny z krwią,

niealergiczny

Zdolność do sterylizacji

Niezniszczony przez typowe techniki sterylizujące

jak autoklawowanie, tlenek etylenu,

promieniowanie

Cechy fizyczne Wytrzymałość, elastyczność, odporność

2.1. Metale

Metale są nieorganicznymi materiałami z metalicznymi wiązaniami [9].

Ich właściwości zależą od metody produkcji i czystości, aczkolwiek zawsze

zapewniają wysoką wytrzymałość i odporność na uszkodzenia. Ze względu

na to, metalowe implanty wykorzystywane są głównie do całkowitej

wymiany stawów (biodrowego, kolanowego, barkowego) lub do stabilizacji

złamań. Materiały metalowe muszą być nie tylko biokompatybilne, ale także

odporne na korozję, aby uniknąć uszkodzeń w organizmie.

W tabeli 2 przedstawione są metale najczęściej używane

w zastosowaniach biomedycznych.

Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka

227

Tabela 3. Metale używane, jako implanty [9]

Metal Zastosowanie

Kobalt - stopy

chromu

Sztuczne zastawki serca, protezy

stomatologiczne, ortopedyczne płytki mocujące,

stenty naczyniowe

Stal nierdzewna Protezy stomatologiczne, ortopedyczne płytki

mocujące, stenty naczyniowe

Stopy tytanu

Sztuczne zastawki serca, implanty

stomatologiczne, śruby ortopedyczne, stenty

naczyniowe

Złoto, platyna Plomby dentystyczne, elektrody dla implantów

ślimakowych

Stopy srebra, cyny

i miedzi

Amalgamat stomatologiczny

2.2. Ceramika

Ceramika i szkło są rozumiane, jako nieorganiczne lub metalowe

kompozycje z bezkierunkowymi wiązaniami jonowymi lub kowalen-

cyjnymi. Są one wysoko obojętne, twarde i kruche [9].

Materiały ceramiczne mają szerokie zastosowanie takie jak sprzęt

diagnostyczny, produkty chemiczne, termometry i inne. Ze względu na

odporność na drobnoustroje, zmiany pH i temperatury, a także rodzaj

rozpuszczalnika, nierozpuszczalne szkła porowate są używane, jako nośniki

enzymów, przeciwciał i antygenów. Ceramika jest również stosowana

w stomatologii, jako np. materiał do odbudowy czy wypełnienia

stomatologiczne [10].

W tabeli numer 3 przedstawione są zastosowania najczęściej

stosowanych ceramicznych biomateriałów.

Tabela 4. Zastosowanie najczęściej używanych rodzajów ceramiki [9]

Ceramika Zastosowanie

Tlenki aluminium Ortopedyczna proteza stawu, implanty

stomatologiczne, powłoki implantów

Tlenki cyrkonu Ortopedyczna proteza stawu, implanty

stomatologiczne

Fosforany wapniowe Powłoki implantów ortopedycznych i

stomatologicznych, materiały stomatologiczne

Bioaktywne szkła

Powłoki implantów ortopedycznych i

stomatologicznych, implanty stomatologiczne,

elementy rekonstrukcji twarzowej, cementy kostne


228

2.3. Polimery

Polimery są organicznymi, syntetycznymi lub naturalnymi materiałami

składającymi się z wielu łańcuchów z dużą liczbą (1.000-100.000)

małocząsteczkowych powtarzających podjednostek (monomerów), które są

połączone wiązaniami kowalencyjnymi.

Polimery, dzięki swoim właściwościom fizycznym i chemicznym,

znalazły szeroką gamę zastosowań. Jednakże stosując materiał polimerowy

należy pamiętać, że polimer może absorbować płyny i cząsteczki

z otoczenia. Ponadto, może być konieczne dodanie kilku stabilizatorów

zapobiegających ich rozkładowi. Substancje te mogą być niebezpieczne

dla organizmu, dlatego ważne jest, aby zapobiec ich wymywaniu[9].

W tabeli 4 zostały przedstawione przykłady polimerów i ich zastosowanie.

Tabela 5. Polimery i ich biomedyczne zastosowanie [9]

Polimer Zastosowanie

Polietylen Ortopedyczna proteza stawu, strzykawki

Polipropylen Zastawki serca, szwy, strzykawki

Polidimetylosiloksan

(PDMS)

Implanty piersi, soczewki kontaktowe, zastawki

serca, sztuczne serce

Polietylenotereftalan (PET) Sztuczne naczynia krwionośne, szwy

Chitozan Opatrunki

Wiele urządzeń stosowanych w leczeniu chorób układu krążenia

jak protezy zastawki serca, protezy naczyniowe wykonane są z polimerów,

głównie z poliuretanu oraz politereftalanu etylenu (PET) [8].

3. Odpowiedź organizmu na materiał

Wszystkie materiały wszczepiane do żywego organizmu powodują

odpowiedź otaczających tkanek, zwłaszcza materiały będące w kontakcie

z krwią.

W przeciwieństwie do naturalnej tkanki, powierzchnia biomateriału

nie utrzymuje stanu homeostazy. Dlatego tuż po wszczepieniu implantu,

zachodzi adsorpcja niespecyficznego białka na powierzchni biomateriału.

Inicjuje to reakcje prowadzące do powstawania zakrzepów [11].

Po uszkodzeniu naczynia proces hemostazy ma na celu najpierw stworzenie

skrzepu i zatrzymanie nieciągłości naczynia krwionośnego a następnie

doprowadzenie do ponownej drożności naczynia [3,12-14].

3.1. Zjawiska zachodzące po implantacji biomateriału

Gdy biomateriał jest wprowadzany do ciała, w otaczającej tkance

rozpoczyna się sekwencja zdarzeń, która ostatecznie kończy

się tworzeniem olbrzymichwielojądrzastychkomórek na granicy faz


229

tkanka/materiał. Konsekwencje reakcji na powierzchni materiału mogą być

katastrofalne. Naukowcy dążą do stworzenia biomateriału połączonego

z komórkami, białkami i/lub innymi składnikamibiologicznych,

abystworzyć hybrydowy implant, odpowiedni do funkcjonalnej regeneracji

uszkodzonych lub chorych tkanek[15].

Zapalenie jest definiowane, jako reakcja żywej unaczynionej tkanki

na lokalne uszkodzenie. Zapalenie można podzielić naostre i przewlekłe.

Ostre zapalenie jest trwa stosunkowo krótko - od kilku minut, przez kilka

godzin do kilku dni,w zależności od stopnia uszkodzenia. Jego główne

cechy to wysięk płynu i białek osocza,a także leukocytów (głównie

neutrofili). Neutrofile, leukocyty i inne ruchliwe białe ciałka wydostają

sięlub są przenoszone z naczyń krwionośnych do tkanki. Natomiast

przewlekłe zapalenie jest mniej jednorodne histologicznie od ostrego

zapalenia. Na ogół, przewlekłe zapalenie charakteryzuje się obecnością

makrofagów, monocytów i limfocytów, przy proliferacji naczyń

krwionośnych i tkanki łącznej [16].

Natychmiast po uszkodzeniu następują zmiany przepływu, kalibru

i przepuszczalności naczyń. Płyny, białka i krwinki wydostają się z układu

naczyniowego do uszkodzonej tkanki. Interakcje krew-materiał i reakcje

zapalne są ściśle ze sobą związane, w rzeczywistości wczesne reagowanie

na uszkodzenia obejmują głównie krew i naczynia krwionośne. Początkowa

reakcja zapalna jest aktywowana przez zranienie unaczynionej tkanki.

Przez zaangażowanie krwi i jej składników w początkową reakcję zapalną,

może wystąpić wytworzenie skrzepu krwi[16].

Uraz unaczynionej tkanki przez implantację biomateriału prowadzi

do natychmiastowego rozwoju tymczasowej matrycy na powierzchni

implantu. Składa się ona z fibryny, wytwarzanej przez aktywację układu

krzepnięcia, aktywowanych płytek krwi, komórek układu odpornościowego

oraz komórek śródbłonka. Zdarzenia te występują wcześnie, w ciągu kilku

minut do kilku godzin po implantacji materiału. Elementy wewnątrz

lub uwolnione z tymczasowej matrycy, np. sieć fibryny (skrzep), inicjują

procesy reorganizacji i naprawy. Kompleks trójwymiarowej struktury sieci

fibryny z przyłączonymi białkami adhezyjnymi zapewnia podłoże

dla adhezji i migracji komórek [16].

Wielkość, kształt i właściwości fizyczne i chemiczne biomateriału mogą

być odpowiedzialne za różnice w intensywności i czasu trwania procesu

zapalnego i gojenia ran. A zatem, intensywność i/lub czas trwania reakcji

zapalnej może charakteryzować biozgodność biomateriału [16].


230

4. Komórki śródbłonka

Ściany naczyń krwionośnych składają się z trzech warstw. Najbardziej

zewnętrzna, przydanka, zbudowana jest głównie z włókien kolagenowych,

które przytwierdzają naczynie do otoczenia. Media, czyli warstwa środkowa

zbudowana jest z okrężnej mięśniówki gładkiej, włókien kolagenowych i

sprężystych. Natomiast wewnętrzna warstwa, intima, zbudowana jest ze

śródbłonka i niewielkiej ilości wiotkiej tkanki łącznej [1].

4.1. Endotelium

Endotelium (śródbłonek) składa się z jednej warstwy komórek płaskich

o grubości 0,2-0,3 µm. Biorąc pod uwagę liczbę komórek śródbłonka

obecnych w organizmie dorosłego człowieka (około 1x1012

), jego masę

(1-2 kg), powierzchnię (700-2000 m2), syntezę i uwalnianie substancji

ze zróżnicowanym wpływem biologicznym, endotelium można

rozpatrywać jako integralny narząd [17÷20].

Od strony światła naczynia krwionośnego komórki śródbłonka są pokryte

warstwą glikokaliksu, utworzoną głównie z glikozoami-noglikanów,

z dominacją siarczanu heparanu. Glikokaliks, z uwagi na obecność grup

siarczanowych, daje wewnętrznej ścianie naczynia krwionośnego ujemny

ładunek elektrostatyczny. Zapewnia dzięki temu niezwilżalność powierzchni

w procesie elektrostatycznego odpychania elektroujemnych cząsteczek,

włącznie z albuminą. Glikokaliks bierze także udział w transporcie przez

błonowym, odpowiada za procesy immunologiczne [17].

Cechą charakterystyczną komórek śródbłonka jest obecność znacznej

ilości pęcherzyków pinocytarnych i białek transportowych, co wskazuje

na wysoką aktywność metaboliczną. Śródbłonek wytwarza również tlenek

azotu (śródbłonkowy czynnik rozkurczowy), który bierze udział w relaksacji

mięśni gładkich naczyń [17]. Tlenek azotu jest uwalniany z komórek

śródbłonka w odpowiedzi na siły ścinające działające na ścianę naczynia [21].

Komórki śródbłonka tworzą barierę między krwią a mięśniami gładkimi

naczyń. Odgrywają również ważną rolę w regulacji hemostazy,

angiogenezy, procesów zapalnych oraz immunologicznych. Komórki

śródbłonka, ze względu na swoje położenie, są w pierwszej linii styku

z komórkami i substancjami, które przechodzą z krwi do tkanek zarówno

w czasie biernej dyfuzji jak i transportu aktywnego [3, 17, 22].

Endotelium jest również zaangażowane w proces kontrolowania

przepuszczalności naczyń dla białek i substancji rozpuszczalnych,

regulowania ciśnienia krwi[22÷24].

W warunkach fizjologicznych, śródbłonek zapewnia przewagę

związków przeciwzakrzepowych nad pro koagulacyjnymi. Śródbłonek


231

zapewnia również braku dostępu dla leukocytów i receptorów płytek,

dzięki czemu zapobiega ich aktywacji [17].

Śródbłonek jest strukturą łatwą do pobudzenia i szybko reagującą

na bodźce, które wynikają z jego aktywacji oraz zmian w funkcjonowaniu.

Uszkodzenia mechaniczne lub utrata integralności funkcjonalnej zakłóca stan

równowagi zapewnianej przez te komórki, co prowadzi do rozwoju wielu

zmian chorobowych, takich jak wysokie ciśnienie krwi, miażdżycy, tworzenia

zakrzepów. Endotelium produkuje szereg czynników wzrostu, które wpływają

na podstawową warstwę mięśniówki gładkiej, regulują jej metabolizm

i migrację, proliferacji jak i apoptozę komórek. Śródbłonek bierze również

udział w syntezie składników macierzy zewnątrzkomórkowej [17].

5. Poprawa biokompatybilności implantów

Nie ma jednej właściwej definicji pojęcia biokompatybilności i tego jak

można ją zmierzyć [7]. Jednakże może być zdefiniowana, jako zdolność

materiału do prawidłowego działania z odpowiednią odpowiedzią

organizmu w specyficznym zastosowaniu [25]. Oznacza to, że materiał

biokompatybilny nie może powodować śmierci komórki, przewlekłego

stanu zapalnego ani zaburzać funkcji komórek czy tkanek. Materiał

nie może być cytotoksyczny, musi być stabilny i bezpieczny, szczególnie

w przypadku degradacji. Ważną rzeczą w materiałach biozgodnych jest

ich powierzchnia - jest w stałym kontakcie z organizmem. Zwłaszcza

w materiałach będących w kontakcie z krwią, ponieważ oddziaływania

ich powierzchni z krwią są czynnikiem krytycznym [11].W związku z tym,

właściwości fizyczne i chemiczne implantowanego materiału powinny być

zgodne z otaczającą tkanką. Projektując implant tworzy się kształt

i strukturę dostosowaną do charakterystyki wymienianej tkanki [6, 9].

Celem inżynierii powierzchniowej, oprócz uniknięcia szkodliwego wpływu

implantacji materiału, jest poprawienie oddziaływania między badanym

materiałem a otaczającymi go tkankami[9, 26].

W związku z tym, że ciągle nie znaleziono materiału, który w pełni

spełniałby wszystkie te wymagania, poprawa na biokompatybilności

w ostatnich latach stała się bardzo popularnym tematem; naukowcy

zaproponowali wiele metod jej polepszania. Powierzchnie materiałów

mogą być modyfikowane, aby być biopasywne (czyli bierne/neutralne

dla otaczającego środowiska) lub aktywne, co oznacza, że mogą wchodzić

w interakcje z cząsteczkami w organizmie[11].


232

5.1. Powierzchnie biopasywne

Jak sama nazwa wskazuje, biopasywne powierzchnie się biologicznie

neutralne.Przy projektowaniu takiego materiału, główną zasadą jest

ograniczenie negatywnych reakcji immunologicznych organizmu [27].

Biopasywne powierzchnie zmniejszają przyczepianie się komórek

i adsorpcję protein. Może to być dobre rozwiązanie dla materiałów

będących w kontakcie z krwią, ponieważ może zapobiec tworzeniu

się skrzepu [11]. Dodatkowo biopasywne powierzchnie zapobiegają

adhezji bakterii [28].

Jedną z dobrze znanych cząsteczek służących do modyfikacji

powierzchni jest poli(tlenek etylenu) (PEG). Cząsteczka ta jest powszechnie

stosowana ze względu na swoje unikalne właściwości, w tym hydrofilowość

oraz brak toksyczności. PEG jest znany także z zapobiegania adsorpcji

protein do powierzchni biomateriału [29, 30]. PEG może być wprowadzony

na powierzchnię materiału na wiele sposobów – poprzez fizyczną adsorpcję

lub procesy chemiczne. Kowalencyjne przyczepianie jest najbardziej

korzystną ze stosowanych metod ze względu na długą stabilności

zmodyfikowanej powierzchni [29, 31].

Innym podejściem do biopasywnych powierzchni są hydrożele.

Hydrożele są materiałami usieciowanymi przestrzennie, które pęcznieją

w środowisku wodnym. Są zbudowane z hydrofilowych polimerów

naturalnych, syntetycznych lub półsyntetycznych zawierających grupy

hydroksylowe, aminowe, amidowe, eterowe i sulfonowych. Podczas

pochłaniania dużej ilości wody, hydrożele utrzymują swoją trójwymiarową

strukturę [32].

Hydrożele mają podobne właściwości fizyczne do żywych tkanek.

Charakteryzują się wysoką zawartością wody, plastycznością i miękkością.

Ponadto, białka z płynów ustrojowych są minimalnie adsorbowane

do ich powierzchni [32]. Hydrożele można stworzyć metodami fizycznymi

(np. sieciowania przez oddziaływania jonowe) i chemicznymi

(np. sieciowania przez polimeryzacje rodnikowe lub przy użyciu

enzymów) [33, 34].

5.2. Powierzchnie bioaktywne

Alternatywnym podejściem jest umieszczenie na powierzchni materiału

bioaktywnej cząsteczki, która będzie promować lub podtrzymywać

pozytywną reakcję otaczających tkanek [27, 35]. Biomimiczne materiały

są w stanie spowodować specyficzną odpowiedź komórkową [35].

Duża grupa biomateriałów (np. polimery, metale i szkło) może być

modyfikowana poprzez wprowadzenie białka na ich powierzchnie.

Ponadto, jest duża różnorodność technik modyfikacji powierzchni,


233

na przykład wprowadzenie cząsteczki spacera na powierzchnię materiału

lub fotochemiczna immobilizacja [35÷38].

Tabela 6. Selektywne syntetyczne sekwencje peptydowe używane w modyfikacji

powierzchniowej [35]

Syntetyczna sekwencja Funkcja

RGD Adhezja komórek

YIGSR Adhezja komórek

REDV Adhezja komórek śródbłonka

KQAGDV Adhezja komórek mięśniowych

Jak można zauważyć w tabeli 5, głównym celem większości

modyfikacji powierzchniowych jest zwiększenie adhezji komórek

i ich proliferacji.

Pierwsze bioaktywne powierzchnie opierały się na długich łańcuchach

białkowych (np. fibronektyna). Obecnie stwierdzono, że krótkie

syntetyczne sekwencje również mogą być stosowane w celu zwiększenia

adhezji komórek. Zastosowanie krótkich sekwencji zapobiega losowemu

ułożenia łańcuchów w przestrzeni i pozwala uniknąć niepożądanych reakcji

immunologicznych, ponieważ zostały one wyizolowane z innych żywych

organizmów [35, 36]. Ponadto wprowadzenie bioaktywnych cząsteczek

równocześnie zmienia hydrofilowość powierzchni, co również prowadzi

do zwiększenia adhezji komórek [39, 40].

Opracowanie odpowiedniej bioaktywnej może doprowadzić

do stworzenia hybrydowej protezy naczynia krwionośnego – polimerowego

szkieletu pokrytego ludzkimi komórkami śródbłonka. Użycie sekwencji

peptydowej może pozwolić na wprowadzenie na materiał selektywnie

komórek endotelialnych. Ta selektywność pozwoli na zasiedlenie materiału

tylko tymi komórkami, tak jak w naturalnych naczyniach krwionośnych.

Dzięki pokryciu materiału przez komórki, nie będzie on narażony

na kontakt z krwią, co zmniejszy możliwość powstania skrzepu w miejscu

implantacji.

5.2.1. Heparyna

W literaturze jedną z najszerzej opisanych immobilizowanych

cząsteczek jest cząsteczka heparyny – jest to polisacharyd o działaniu

przeciwzakrzepowym. Heparyna na powierzchni implantu naczyń

krwionośnych katalizuje tworzenie kompleksu pomiędzy białkami

obecnymi w osoczu krwi, które pozostają nieaktywne i nie prowadzą

do uruchomienia kaskady krzepnięcia [2, 41]. Stosuje się różne fizyczne,

jonowe i kowalencyjne techniki immobilizacji heparyny na powierzchni

materiału. Sposób fizycznego wiązania jest najmniej skuteczny ze względu

na dużą szybkość wymywania heparyny z powierzchni. Najbardziej


234

powszechnie stosuje się metodę pośredniego kowalencyjnego wiązania

heparyny z użyciem cząsteczki linkera [42].

5.2.2. Trombomodulina

Trombomodulina jest glikoproteiną obecną na powierzchni komórek.

Cząsteczka ta odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu homeostazy naczyń

krwionośnych przez wiązanie się z trombiną oraz hamowanie tworzenia

skrzepu [43-45]. Trombomodulina ma jeszcze bardziej skuteczne działanie

przeciwzakrzepowe niż heparyna [44].

Materiały pokryte trombomoduliną redukują aktywacje procesu

krzepnięcia krwi [45].

5.2.3. Tlenek azotu

Tlenek azotu jest związkiem chemicznym produkowanym przez

komórki śródbłonka [17]. Jego zadaniem jest zapobieganie aktywacji

i adhezji leukocytów oraz zmniejszenie agregacji płytek krwi, tworzeniu

się zakrzepów, a także przeciwdziałanie proliferacji komórek mięśni

gładkich naczyń krwionośnych [46].

Materiały modyfikowane są głównie w celu opracowania powierzchni

zdolnej do przekształcenia proleku L-argininy do aktywnego leku tlenku

azotu [46].

5.2.4. Peptydy

Biomimetyczne materiały są zaprojektowane tak, aby przypominać

zewnątrzkomórkową macierz komórkową (ECM). ECM jest wytwarzany

przez komórki, wypełniając przestrzeń między nimi. ECM tworzą białka,

glikoproteiny i proteoglikany. Ponadto, aby zapewnić strukturalne wsparcie

dla komórek, ECM wspiera ich podział, wzrost oraz rozwój [46].

Wyizolowano izidentyfikowano różne sekwencje peptydowe

pochodzące z ECM, które mają wpływ na zachowanie się komórek.Używa

się ich do modyfikacji powierzchniowej materiałów w celu polepszenia

ich właściwości biologicznych, głównie do promowania adhezji komórek

(Tabela 5) [46].

Sekwencja RGD

RGD (Arg-Gly-Asp) jest sekwencją najczęściej używaną

do modyfikacji biomateriałów. Sekwencja ta jest główną domeną wiążącą

integryny obecną w różnych białkach ECM. RGD jest stosowana w celu

promowania adhezji wszystkich typów komórek, nie tylko komórek

śródbłonka [35, 47].

https://www.google.pl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&cad=rja&uact=8&ved=0CEAQFjAF&url=https%3A%2F%2Fwww2.chemistry.msu.edu%2Fcourses%2FCEM958%2F10-11%2Ftalks%2FMuchiri.pdf&ei=weRoVIrGHqWBywOw1oHIBg&usg=AFQjCNFNreuqVetkK6J2-1C220dPIH-HVw&sig2=s_fvBI0yEcFtoIQ_D0j9qA&bvm=bv.79142246,d.bGQ


235

Rysunek 4 Struktura sekwencji peptydowej RGD

Sekwencja REDV

Tetrapeptyd REDV, Arg-Glu-Asp-Val, jest peptydem pochodzącym

z fibronektyny. Jest znany z właściwości adhezyjnych - pozwala na adhezję

i proliferację komórek śródbłonka, ale ogranicza adhezję innych komórek

i płytek krwi [35, 47-52].

Rysunek 5. Struktura sekwencji peptydowej REDV

Sekwencja IKVAV

Peptyd IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val) pochodzi z α-łańcucha lamininy.

Dowiedziono, że promuje proces adhezji komórek śródbłonka a także

stymuluje migrację komórek i tworzenie sieci naczyń włosowatych[53].


236

Rysunek 6. Struktura sekwencji peptydowej IKVAV

6. Podsumowanie

Jak dowiedziono, jest ogromne zapotrzebowanie na protezy naczyń

krwionośnych. Tworzy się je z różnych materiałów, wśród których prym

wiodą polimery, jakie jak poliuretan czy PET. Tworzywa te same w sobie

są biokompatybilne, jednak niewystarczająco. Jest szereg metod

modyfikacji, które pozwalają na poprawienie biokompatybilności,

m.in. przez stworzenie bioaktywnej powierzchni, która promuje adhezję

komórek, przede wszystkim komórek śródbłonka. Modyfikacje z użyciem

sekwencji peptydowych są popularnych kierunkiem badań. Ta modyfikacja

jest prostym procesem do przeprowadzenia oraz trwały sposób wiązania

peptydu do powierzchni.Najczęściej używaną sekwencją jest sekwencja

REDV z powodu selektywności tylko względem komórek śródbłonka.

Dodatkowo użycie tego rodzaju komórek pozwoli na odtworzenie

naturalnego naczynia krwionośnego. Pozwoli to także w znacznym stopniu

zminimalizować negatywną odpowiedź organizmu, ponieważ śródbłonek

bierze udział w utrzymaniuhomeostazy ustrojowej.


237

Literatura

1. Seal B. L., Otero T.C., Panitch A. Polymeric biomaterials for tissue and organ

regeneration, Materials Science and Engineering,34 (2001)

2. Solomon E., Berg L., Martin D., Villee C. Biologia,Warszawa: Multico

Oficyna Wydawnicza (2000)

3. Rasche H. Haemostasis and thrombosis: an overview. European Heart Journal

Supplements, 3 (2001)

4. Główny urząd statystyczny Departament Badań Demograficznych i Rynku

PracyNotatka Informacyjna.Podstawowe informacjeo rozwoju

demograficznym Polski do 2014roku,2701 2015

5. Anderson J.M. Biological Responses to Materials,Annual Reviews, 31(2001)

6. Kohane D.S., Langer R. Polymeric Biomaterials in Tissue

Engineering,Pediatric Research, 63(2008)

7. Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J., Lemons J. Biomaterials Science:

A Multidisciplinary Endeavor,Biomaterials Science,Academic Press (2012)

8. He W., Benson R. Handbook of Biopolymers and Biodegradable

Plastics,Elsevier (2012),Polymeric Biomaterials

9. Bauer S., Schmuki P., von der Mark K., Park J. Engineering biocompatible

implant surfaces, Part I: Materials and surfaces,Progress in Materials

Science, 58(2013)

10. Hench L.L., Best S.M. Biomaterials Science, An Introduction to Materials

in Medicine, Academic Press (2012), Ceramics, Glasses and Glass-Ceramics:

Basic Principles

11. Yu K., Mei Y., Hadjesfandiari N., Kizhakkedathu J.N. Engineering

biomaterials surfaces to modulate the host response,Colloids Surf. B (2014)

12. Sokołowska B. Newer concept of blood coagulationZamojskie Studia

i Materiały, 34(2011)

13. Kapłon A., Biskup P. Farmakoterapia przeciwzakrzepowa i fibrynolityczna -

aspekty praktyczne,Studia Medyczne Akademii Świtokrzystkiej, 4(2006)

14. Sokołowska B.The physiological function of hemostasis,Acta Haematologica

Polonica, 41(2010)

15. Anderson J.M., Rodriguez A., Chang D.T. Foreign body reaction

to biomaterials,Seminars in Immunology, 20 (2008)

16. Anderson J.M. Biomaterials Science An Introduction to Materials in Medicine

Elsevier (2013), Inflammation, Wound Healing, And The Foreign-Body

Response

17. Wnuczko K., Szczepański M. Endothelium – characteristics

and functions,Polski Merkuriusz Lekarski, 133(2007)

18. d’Alessio P. Aging and the endothelium,Experimental Gerontology,39 (2004)

19. Blann A.D. Assessment of Endothelial Dysfunction: Focus

on Atherothrombotic Disease,Pathophysiol Haemost Thromb,33 (2003/2004),

20. Sumpio B.E., Riley J.T., Dardik A. Cells in focus: endothelial cell,

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 34(2002)


238

21. Obońska K., Grąbczewska Z., Fisz J. Ocena czynności śródbłonka

naczyniowego - gdzie jesteśmy, dokąd zmierzamy? Folia Cardiologica

Excerpta, 5(2010)

22. Sagripantil A., Carpi A. Antithrombotic and prothrombotic activities

of the vascular endothelium,Biomed & Pharmacother, 54(200)

23. Vestweber D., Winderlich M., Cagna G., Nottebaum A.F. Cell adhesion

dynamics at endothelial junctions: VE-cadherin as a major player, Trends

in Cell Biology, 19 (2008)

24. Razakandrainibea R., Combesb V., Graub G. E., Jamboua R. Crossing

the wall: The opening of endothelial cell junctions during infectious

diseases,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 45(2013)

25. Williams D.F.Definitions in biomaterials: proceedings of a consensus

conference of the European Society for Biomaterials Elsevier (1987)

26. Ma P. X. Biomimetic materials for tissue engineering,Advanced Drug

Delivery Reviews,60 (2008)

27. Chena H., Yuana L., Songa W., Wu Z., Li D. Biocompatible polymer

materials: Role of protein–surface interactions,Progress in Polymer Science,

33 (2008).

28. Charnley M., Textor M., Acikgoz C. Designed polymer structures with

antifouling–antimicrobial properties,Reactive & Functional Polymers,

71(2011)

29. Jo S., Park K. Surface modifcation using silanated poly(ethylene

glycol)s,Biomaterials, 21(2001)

30. Sharma S., Johnson R., Desai T. Ultrathin poly(ethylene glycol) films

for silicon-based microdevices,Applied Surface Science, 26 (2003)

31. Gombotz W., Guanghui W., Horbett T., Hoffman A. Protein adsorption

to poly(ethylene oxide) surfaces,J Biomed Mater Res, 25 (1991)

32. Gupta P., Vermani K., Garg S. Hydrogels: from controlled release

to pH responsive drug delivery, Drug Discovery Today, 10 (2002)

33. Pluta J., Karolewicz B. Hydrogels: properties and application

in the technology of drug form. I. The characteristic hydrogels, Polimers

in medicine, 34(2004)

34. Hennink W.E., van Nostrum C.F. Novel crosslinking methods to design

hydrogels,Advanced Drug Delivery Reviews. 64(2012)

35. Shin H., Jo S., Mikos A.G. Biomimetic materials for tissue

engineering,Biomaterials, 24(2003)

36. Hersel U., Dahmen C., Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials

for stimulated cell adhesion and beyond,Biomaterials, 24(2003)

37. Dee K.C., Andersen T.T, Biziosa R. Osteoblast population migration

characteristics on substrates modified with immobilized adhesive peptides,

Biomaterials, 20 (1999)

38. Sugawara T., Matsuda T. Photochemical surface derivatization of a peptide

containing Arg-Gly-Asp (RGD),J Biomed Mater Res,29 (1995)

39. Grinnell F.Cellular adhesiveness and extracellular substrata,International

Review of Cytology, 53(1978)


239

40. van Wachem P.B., Beugeling T., Feijen J., Bantjes A., Detmers J.P., van Aken

W.G. Interaction of cultured human endothelialc ellsw ith polymerics urfaces

of different wettabilities, Biomaterials,6 (1985)

41. Sobczak M., Olędzka E., Kołodziejski W.L., Kuźmicz R. Polymers

For Pharmaceutical Applications,Polimery,52 (2007)

42. Michanetzis G.P.A., Katsala N., Missirlis Y.F. Comparison

of haemocompatibility improvement of four polymeric biomaterials by two

heparinization techniques,Biomaterials, 24(2003)

43. Rochfort K.D., Cummins P.M. Thrombomodulin regulation in human brain

microvascular endothelial cells in vitro: Role of cytokines and shear stress,

Microvascular Research,97 (2015)

44. Vasilets V.N., Hermel G., Konig U., Werner C., Muller M., Simon F.,

Grundke K., Ikada Y., Jacobasch H.J. Microwave CO2 plasma-initiated

vapour phase graft polymerization of acrylic acid onto polytetrafluoroethylene

for immobilization of human thrombomodulin, Biomaterials, 18(1997)

45. Sperling C., Salchert K., Streller U., Werner C. Covalently immobilized

thrombomodulin inhibits coagulation and complement activation ofartificial

surfaces in vitro,Biomaterials, 25 (2004)

46. de Mel A., Jell G., Stevens M.M., Seifalian A.M. Biofunctionalization

of Biomaterials for Accelerated in Situ Endothelialization: A Review,

Biomacromolecules,9 (2008)

47. Lei Y., Re´my M., Labruge`re C., Durrieu M. Peptide immobilization

on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell

adhesion, spreading and migration,J Mater Sci: Mater Med., 23 (2012)

48. Ji Y., Wei Y., Liu X., Wang J., Ren K., Ji J. Zwitterionic polycarboxybetaine

coating functionalized with REDV peptide to improve selectivity

for endothelial cells,J Biomed Mater Res Part A, 100A(2012)

49. Andukuri A., Minor W.P., Kushwaha M., Anderson J.M., Jun H. Effect

of endothelium mimicking self-assembled nanomatrices on cell adhesion

and spreading of human endothelial cells and smooth muscle

cells,Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 6 (2010)

50. Wei Y., Ji Y., Xiao L., Lin Q., Ji J. Different complex surfaces

of polyethyleneglycol (PEG) and REDV ligand to enhance the endothelial

cells selectivity over smooth muscle cells,Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces,84 (2011)

51. Lin Q., Hou Y., Ren K., Ji J. Selective endothelial cells adhesion to Arg-Glu-Asp-

Val peptide functionalized polysaccharide multilayer,Thin Solid Films, 520(2012)

52. Wei Y., Ji Y., Xiao L., Lin Q., Xu J., Ren K., Ji J. Surface engineering

of cardiovascular stent with endothelial cell selectivity for in vivo re-

endothelialisation,Biomaterials,34 (2013)

53. Ali S., Saik J., Gould D.J., Dickinson M.E., West J.L. Immobilization of Cell-

Adhesive Laminin Peptides in Degradable PEGDA Hydrogels Influences

Endothelial Cell Tubulogenesis,BioResearch Open Access, 2 (2013)


240

Bioactive surfaces promoting endothelial cell adhesion process

Huge demand for artificial blood vessels is caused by high mortality due to the cardiovascular diseases. Polymers are most commonly used material for prosthesis

fabrication. Unfortunately fully biocompatible material has still not been found. Therefore,

in order to minimize the negative organism response material surface modifications

are carried out. The optimal solution might be a hybrid implant - polymer coated with human endothelial cells.

Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe...

Documents

Transcript of Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe...