diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics

2012 • Volume 48 • Number 3 • 265-271

Praca oryginalna • Original Article

265

Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu

we krwi pacjentów po przeszczepieniach narządowych

Monitoring immunosuppressive drug concentrations using LC-MS/MS on a basis of whole blood everolimus determination

in organ transplant patients

Paweł K. Kunicki1, Jolanta Duda2

1Pracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii Klinicznej, Instytut Kardiologii w Warszawie, 2Pracownia Farmakokinetyki Zakładu Analizy Chemicznej, Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie

StreszczeniePrzedstawiono zastosowanie metody UPLC-MS/MS i zestawu analitycznego „MassTrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit” (Waters) do analizy stężenia ewerolimusu (EWE) w próbkach krwi pełnej pacjentów po przeszczepieniach narządowych. Me-todyka i odczynniki poddane zostały częściowej walidacji. Granica oznaczalności (LLOQ) dla EWE wynosi 1,0 ng/ml. Potwier-dzono, że metoda jest liniowa w zakresie 1,0-33,8 ng/ml, jest specyficzna i spełnia wymagania dla precyzji wewnątrzseryjnej (RSD ≤ 5,7%), precyzji międzyseryjnej (RSD ≤ 8,4%), oraz dokładności wewnątrzseryjnej (100,2 %) i międzyseryjnej (97,3 %), stabilności i efektu przeniesienia.Materiał kliniczny stanowiło 105 próbek krwi pacjentów leczonych EWE, które analizowano podwójnie w laboratorium w War-szawie, a następnie wysyłano do laboratorium referencyjnego wykorzystującego zwalidowaną metodę LC-MS/MS. Uzyskano wyniki stężeń EWE w zakresie 1,00-10,85, średnio: 4,43 ng/ml dla metody ocenianej oraz: 1,40-10,50, średnio: 4,53 ng/ml dla metody referencyjnej (NS), charakteryzujące się satysfakcjonującą korelacją (r=0,9376, p<0,0001) pomimo potencjalnego wpływu warunków i czasu transportu na wynik. Analiza Bland-Altman wykazała bias = -0,09 ng/ml (95% CI: -0,24; +0,06) wskazujący na nieznamienność różnicy pomiędzy metodami. W wymiarze procentowym średni bias wyniósł -4,9 %, przy czym dla decyzyjnych wartości stężenia EWE wynosił on odpowiednio: -9,4 % dla 3 ng/ml oraz +5,7 % dla 8 ng/ml. Analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y = 1,123 x - 0,43. Zastosowana metoda pozwala na szybkie i wiarygodne oznaczanie EWE w próbkach krwi pacjentów będąc wygodnym narzę-dziem dla potrzeb rutynowej terapii monitorowanej i badań farmakokinetycznych.

SummaryThe paper presents an implementation of the UPLC-MS/MS method and MassTrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) to measure everolimus (EWE) concentrations in whole blood samples from patients after organ transplantation. The method & reagents used were subject to partial validation. The limit of quantification (LLOQ) for EWE is 1.0 ng/ml. The method was found: linear in the range of 1.0-33.8 ng/ml, specific and fulfilling criteria for intra- (RSD ≤ 5.7%) and inter-assay (RSD ≤ 8.4 %) precision, intra- (100.2 %) and inter-assay accuracy (97.3 %), stability and for carry-over test.A total number of 105 blood samples from patients treated with EWE were analyzed in duplicate – at our Warsaw laboratory, and subsequently, the samples were transferred in series to a reference laboratory where a validated LC-MS/MS method was used to determine EWE. Drug concentrations measured by the implemented method ranged: 1.00-10.85, (mean: 4.43) ng/ml, whereas measured by the reference method ranged: 1.40-10.50, (mean: 4.53) ng/ml (NS). The methods correlated well (r=0.9376, p<0.0001) despite the potential effects of sample deterioration during transfer and storage. The Bland-Altman analysis revealed mean bias = -0.09 ng/ml (95% CI: -0.24; +0.06) indicating an insignificant difference between the methods. The bias yielded -4.9 %, being -9.4 % at 3 ng/ml, and +5.7 % at 8 ng/ml for decisive EWE concentrations, respectively. The Passing-Bablok regression was obtained: y = 1.123 x - 0.43.The presented method is suitable for rapid and reliable EWE determination in patients’ samples serving as a valuable tool for routine therapeutic drug monitoring and pharmacokinetic studies.

Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu ...

266

WstępEwerolimus (EWE) jest najnowszym z podstawowych leków immunosupresyjnych wprowadzonym do praktyki klinicznej w ostatnich kilku latach. Stosowanie EWE w transplantologii staje się coraz bardziej powszechne, pomimo że niezbęd-nym warunkiem terapii jest regularne monitorowanie jego stężenia we krwi pacjenta dla indywidualizacji dawkowania. Niska i zmienna dostępność biologiczna, polimorficzny me-tabolizm katalizowany przez układ CYP3A4-5 oraz liczne interakcje w fazie farmakokinetycznej są przyczyną stoso-wania w przypadku EWE terapii monitorowanej stężeniem leku [1, 2].Z uwagi na terapeutyczne stężenia EWE wynoszące kilka ng na 1 ml krwi pełnej, konieczne jest stosowanie specy-ficznej metodyki analitycznej z odpowiednio niską grani-cą oznaczalności metody (LLOQ). Referencyjną techniką analityczną jest chromatografia cieczowa połączona z po-dwójną detekcją masową (LC-MS/MS) [3-7]. Zapewnia ona specyficzność oraz odpowiednie parametry walidacji, niestety, podstawowym ograniczeniem w dostępie do niej jest kosztowna aparatura oraz wyspecjalizowany personel analityczny. W wielu krajach europejskich, zwłaszcza w du-żych ośrodkach naukowo-diagnostycznych, LC-MS/MS jest powszechnie obecna w laboratoriach realizujących terapię monitorowaną [3-7]. Alternatywą dla metod chromatograficz-nych są metodyki immunochemiczne, zapewniające często satysfakcjonujące parametry walidacji i dużą automatyzację analiz. Nieustannie jednak największym problemem jest nie-wystarczająca specyficzność metod immunochemicznych powodująca uzyskiwanie wyników zawyżonych średnio na-wet o kilkadziesiąt procent, jak również relatywnie wysoka cena samych odczynników [6, 7]. W przypadku EWE jedyną praktycznie dostępną do końca 2009 r. metodyką immuno-chemiczną była metoda fluorescencyjno-polaryzacyjno im-munochemiczna (FPIA) z wykorzystaniem analizatora TDx firmy Abbott; W czerwcu 2010 roku firma ThermoFisher za-oferowała analizator immunochemiczny CDx90 wprowadza-jąc zestaw nowych odczynników „QMS Everolimus Assay”. Niestety, odczynniki te nie zapewniły wiarygodności ozna-czeń uprawniającej do zastosowania w terapii monitorowa-nej u pacjentów po transplantacji [8].Referencyjna metoda analityczna (LC-MS/MS) nie była do-tychczas stosowana w polskich laboratoriach z uwagi na wy-soki koszt aparatury. Przedstawiony problem z dostępnością do szybkiej i wiarygodnej metody oznaczania stężenia EWE u polskich pacjentów stał się inspiracją do wprowadzenia metody LC-MS/MS do rutynowego monitorowania stężenia tego leku. Celem pracy było przedstawienie wyników pomiarów stę-żenia EWE w próbkach krwi pobranych od grupy polskich pacjentów po przeszczepach narządowych i oznaczonych metodą LC-MS/MS przy użyciu zestawu analitycznego

„MassTrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit” (Waters) w porównaniu z wynikami otrzymanymi w laboratorium re-ferencyjnym wykorzystującym zwalidowaną metodę LC-MS/MS.

Materiał i metodyW badaniach zastosowano system ultrasprawnej chromato-grafii cieczowej (UPLC) połączonej z tandemową detekcją masową (MS/MS) - Aquity Ultra PerformanceLC, Quattro Premier XE firmy Waters (Milford, MA, USA). Oznaczenia przeprowadzono przy użyciu zestawu analitycznego „Mass-TrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit” (Waters) umoż-liwiającego jednoczesną analizę 4 podstawowych leków immunosupresyjnych: EWE, oraz cyklosporyny (CSA), ta-krolimusu (TAC) i syrolimusu (SYR) we krwi pełnej. Technika UPLC jest odmianą wysokosprawnej chromato-grafii cieczowej (HPLC – High Performance Liquid Chroma-tography). Obejmuje procesy chromatograficzne, w których fazą ruchomą jest ciecz przepływająca pod wysokim ciśnie-niem przez fazę nieruchomą (nośnik; wypełnienie kolumny). Do uzyskania ciśnienia używa się pomp dostarczających fazę ruchomą, pod ciśnieniem do 15000 psi. Dzięki użyciu techniki UPLC redukuje się znacznie czas analizy i zużycie odczynników. Detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej, podczas wymywania z kolum-ny składników, umożliwiają śledzenie rozdziału mieszanin, identyfikację i oznaczenie zawartości poszczególnych skład-ników.Tandemowa spektrometria masowa to technika analitycz-na pozwalająca na określanie struktury badanego związku. Strukturę identyfikuje się na podstawie jonów fragmentacyj-nych, które są charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków. W praktyce metoda MS/MS polega na tym, iż z widma masowego selekcjonuje się wybrany jon (najczę-ściej jon molekularny). Jon ten poddawany jest kolizjom (na-stępuje jego zderzenie z wprowadzonym gazem obojętnym). Na skutek zderzeń jon macierzysty (parent ion) rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions). Zastosowanie de-tekcji masowej zapewnia wysoką specyficzność metody. Połączenie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową łączy zalety obu technik.Procedura przygotowania próbki do analizy oparta jest na zjawisku precypitacji. Do 50 µl próbki krwi badanej (kalibra-cyjnej, kontrolnej) dodaje się 20 µl 0,1 M roztworu ZnSO4. Wstępna hemoliza erytrocytów i strącenie białek ułatwia ekstrakcję leków immunosupresyjnych z matrycy biologicz-nej. Ekstrakcję ciecz-ciecz przeprowadza się poprzez doda-nie do próbki 500 µl acetonitrylu zawierającego standard we-wnętrzny [13C2D4]-ewerolimus (dla EWE), [D12]-cyklosporynę A (dla CSA) i askomycynę (dla TAC i SYR). Otrzymany po wymieszaniu i odwirowaniu próbki supernatant jest nano-szony na kolumnę chromatograficzną w objętości 20 µl.

Słowa kluczowe: ewerolimus, takrolimus, cyklosporyna, syrolimus, LC-MS/MS, terapia monitorowana

Key words: everolimus, tacrolimus, cyclosporine, sirolimus, LC-MS/MS, therapeutic drug monitoring

267

Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie Mass- Trak TDM C18 cartridge column 2,1 x 10 mm (Waters) w temperaturze +55°C, przy gradientowym przepływie (0,4 ml/min.) fazy ruchomej: metanol - woda zawierającej 2 mM octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. Po jonizacji ES+ jonami amonowymi [NH4]

+ monitorowano jony macie-rzyste i jony fragmentacyjne oznaczanych leków immuno-supresyjnych oraz ich standardów wewnętrznych: EWE (975,2 / 908,4), CSA (1219,8 / 1202,8), TAC (821,5 / 768,5), SYR (931,6 / 864,5), [13C2D4]-EWE (981,2 / 914,5), [D12]-CSA (1231,8 / 1214,8), askomycyna (809,5 / 756,5). Przy-kład widma masowego przedstawia Ryc. 1, a przykładowy chromatogram przedstawiono na Ryc. 2. Użyto argonu jako gazu kolizyjnego.Czas analizy jednej próbki wynosił 2 minuty. Krzywe kalibra-cyjne wyznaczano przy użyciu 7 kalibratorów w zakresach: EWE 0-33,8 ng/ml (Ryc. 3), CSA 0-1567 ng/ml, SYR 0-31,1 ng/ml, TAC 0-33,6 ng/ml. W każdej serii oznaczeń analizo-wano po 3 próbki kontrolne - EWE: 2,0; 9,2; 25,7 ng/ml, CSA: 161; 429; 956 ng/ml, SYR: 2,3; 8,4; 22,9 ng/ml, TAC: 2,3; 9,1; 24,5 ng/ml. Do obliczeń zastosowano program kompu-terowy MassLynx 4.1 z aplikacją TargetLynx (Waters). Do kalibracji zastosowano model regresji ważonej 1/x.Zgodnie z zaleceniami nowej wytycznej EMA [9] metodyka poddana została częściowej walidacji w zakresie dostępnym dla komercyjnych zestawów odczynnikowych. Walidacja ob-jęła: specyficzność, liniowość, zakres, precyzję, dokładność oraz efekt przeniesienia (carry-over). Oceniono stabilność roztworu standardu wewnętrznego oraz stabilność próbek badanych, kalibracyjnych i kontrolnych: długoterminową w temperaturze od +2°C do +8°C, krótkoterminową w tem-peraturze pokojowej, po ekstrakcji w warunkach przechowy-

wania przed analizą oraz podczas przechowywania w auto-samplerze.Wyniki oznaczeń EWE uzyskane omawianą metodą porów-nano z pomiarami wykonanymi w referencyjnym laborato-rium (Analytical Unit, St George’s – University of London) wykorzystującym zwalidowaną metodę LC-MS/MS [10]. W skrócie: w laboratorium referencyjnym EWE izolowano z krwi pełnej (kalibratory / próbki kontroli jakości / próbki badane) metodą ekstrakcji ciecz-ciecz (0,1 M wodorotlenek sodu, eter metylo-tert-butylowy) po uprzedniej precypitacji 5% siarczanem cynku i acetonem. Chromatografię przepro-wadzono na kolumnie Alltima C18 150mm x 2,1mm, 5µm (Alltech) w temperaturze +50ºC, przy przepływie 0,35 ml/min fazy ruchomej o składzie metanol : woda (82:18, v/v) za-wierającej 2 mM octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. W celu monitorowania jonów zastosowano spektrometr masowy z podwójnym kwadrupolem Sciex API2000 (Ap-plied Biosystems) ze źródłem turbo-ion spray i temperaturą +450ºC. Zastosowano jonizację dodatnią i oznaczano jony macierzyste oraz jony fragmentacyjne EWE (975,6/908,5) i standardu wewnętrznego [13C2D4–EWE] (981,6/914,4). Ga-zem kolizyjnym był azot. Całkowity czas oznaczenia wynosił 5 minut. Krzywe kalibracyjne wyznaczano przy użyciu 6 ka-libratorów o stężeniach 1-50 ng/ml analizowanych dwukrot-nie. Zastosowano model regresji ważonej 1/x2. Próbki kon-trolne (3, 15, 30 ng/ml) analizowano w dwóch powtórzeniach pomiędzy próbkami w danej sekwencji analitycznej.Materiał kliniczny stanowiły próbki krwi pełnej pochodzące od pacjentów po przeszczepieniach narządowych (serce, nerka, wątroba) leczonych EWE w różnych schematach immunosupresji. Próbki krwi pobierane były dla określenia stężenia minimalnego w stanie stacjonarnym. Ponieważ ce-

Rycina 1Widmo masowe – EWE m/z 975,37; CSA m/z 1219,59; SYR m/z 931,44; TAC m/z 821,36.

Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu ...

268

lem badania było porównanie dwóch metod analitycznych zrezygnowano z oceny wpływu dodatkowych czynników de-mograficznych (wiek, płeć) i terapeutycznych (rodzaj prze-szczepu, schemat immunosupresji) traktując każdą próbkę

Rycina 2. Przykładowy chromatogram.

Rycina 3. Przykładowa krzywa kalibracyjna dla EWE.

jako źródło dwóch niezależnych obserwacji. Analizie podda-no 105 próbek krwi, w których oznaczano stężenie EWE: najpierw podwójnie przy użyciu zestawu analitycznego „MassTrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit” (Waters) w laboratorium w Warszawie, a następnie odpowiednio za-bezpieczone próbki wysyłano do laboratorium referencyj-nego w Londynie. Taka sytuacja spowodowała zaistnienie dodatkowego czynnika: wpływu transportu próbek (głównie w postaci czasu i temperatury), który mógłby być odpowie-dzialny za ewentualne różnice w wartościach stężeń EWE uzyskiwanych w laboratorium referencyjnym oraz mieć ne-gatywny wpływ na korelację wyników.Do statystycznego porównania metod zastosowano analizę regresji Passing-Bablok, odpowiednią do porównania dwóch równocennych metod pomiarowych oraz analizę Bland-Altman, która umożliwia ocenę różnicy pomiędzy pomiarami (bias) [11-14]. Obydwa narzędzia dostępne są w oprogra-mowaniu MedCalc®. Dodatkowo, wobec nieodrzucenia hi-potezy o normalności rozkładu wyniki pomiarów porównano testem t dla prób powiązanych.

269

równania regresji: a = 1,12 (95% CI: 1,07; 1,19) i b = -0,43 (95% CI: -0,77; -0,17) nie potwierdziły równocenności obu metod.Jak zaznaczono wcześniej, zestaw analityczny „MassTrakTM Immunosuppressants XE RUO Kit” umożliwia jednoczesną analizę 4 podstawowych leków immunosupresyjnych: EWE, oraz CSA, TAC i SYR we krwi pełnej. Dla oznaczeń EWE i TAC producent uzyskał certyfikat dla analizy in vitro (IV), dla pozostałych: CSA i SYR laboratorium powinno przepro-wadzić walidację metody, przed jej zastosowaniem w terapii monitorowanej stężeniem leku.

DyskusjaPrzedstawione w pracy wyniki oznaczeń stężenia EWE uzy-skane w obu laboratoriach przy użyciu dwóch różnych me-tod LC-MS/MS wykazały dobrą korelację. Nie stwierdzono różnicy w pomiarach zarówno w analizie procedurą Bland-Altman, jak i w statystycznym porównaniu wartości średnich. Wyników tych nie potwierdzono wprawdzie w analizie regre-sji Passing-Bablok, jednak należy podkreślić, że odnotowa-na na reprezentatywnej liczbie pomiarów różnica pomiędzy metodami (bias) nie przekraczała wartości ± 10 % w całym zakresie stężeń terapeutycznych (3-8 ng/ml). Świadczy to o klinicznej równorzędności zastosowanych metod w terapii monitorowanej stężeniem EWE [11, 14]. Korelacja pomiędzy wynikami, aczkolwiek satysfakcjonująca, mogłaby być wyż-sza przy zastosowaniu podwójnych uśrednionych pomia-rów (analogicznie do laboratorium w Warszawie) w ośrodku referencyjnym. Porównywalne liczbowo wyniki uzyskane w laboratorium w Londynie przemawiają za stabilnością EWE w warunkach transportu i przechowywania przed pow-tórną analizą. Dotychczas medyczne laboratoria diagnostyczne nie ko-rzystały z techniki LC-MS/MS z uwagi na uwarunkowa-nia wymienione we wstępie pracy. Dodatkowo, pokutuje przekonanie, że metodyka taka jest przeznaczona dla pla- cówek naukowo-badawczych lub przemysłowych, a jest

Rycina 4. Ocena różnicy pomiędzy pomiarami wykonana za pomocą analizy Bland-Altman i przedstawiona w wymiarze stężenia.

WynikiW laboratorium Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie wykonano częściową walidację metody LC-MS/MS. Granica oznaczalności metody (LLOQ) EWE wynosi 1,0 ng/ml. Potwierdzono, że metoda jest liniowa w zakresie 1,0-33,8 ng/ml (y = 0,0639831 x + 0,000557454; R = 0,997347; R2 = 0,994701). Na podstawie analizy 10 ślepych próbek oceniono specyficzność metody stwierdzając brak sygnałów na chromatogramach zarówno w czasie retencji odpowia-dającym substancji badanej - EWE, jak i standardowi we-wnętrznemu - [13C2D4]-EWE. Kryteria akceptacji dla precyzji: RSD ≤ 20,0 % dla stężenia na poziomie LLOQ i RSD ≤ 15,0 % dla wszystkich pozostałych stężeń z zakresu kalibracji zo-stały spełnione dla precyzji wewnątrzseryjnej (RSD ≤ 5,7%) i precyzji międzyseryjnej (RSD ≤ 8,4%). Dokładność we-wnątrzseryjna (100,2 %) i międzyseryjna (97,3 %) spełnia wymagania wytycznej [9] (100,0 ± 20,0 % dla stężenia na poziomie LLOQ i 100,0 ± 15.0 % dla wszystkich pozosta-łych stężeń z zakresu kalibracji). W teście carry-over (efekt przeniesienia) nie stwierdzono obecności sygnału substan-cji oznaczanej i standardu wewnętrznego w próbkach śle-pych analizowanych bezpośrednio po próbce najwyższe-go stężenia z zakresu kalibracji. Analizę przeprowadzono w 7 cyklach. Wykonane testy stabilności potwierdziły speł-nienie wymagań stawianych metodom bioanalitycznym (do-kładność oznaczeń w odniesieniu do wartości wyjściowej 100,0 ± 15,0 %).W dwóch badanych próbkach obiema metodami uzyskano wynik poniżej LLOQ (<1,0 ng/ml), stąd ocenę statystyczną wykonano dla n=103 próbek. Metodą badaną uzyskano stężenia EWE w zakresie 1,00-10,85 ng/ml, średnio 4,43 ± 2,22 ng/ml, natomiast w laboratorium referencyjnym zmie-rzono w tych samych próbkach stężenie EWE w zakresie 1,40-10,50 ng/ml, średnio 4,53 ± 1,99 ng/ml. Wynik uzy-skany w laboratorium w Warszawie stanowi zatem średnio 96,72 ± 16,67 % wartości zmierzonej w ośrodku referencyj-nym, przy czym analiza statystyczna nie potwierdziła zna-mienności różnic (p=0,2349). Wykazano satysfakcjonującą korelację (r=0,9376; p<0,0001; y = 1,045 x - 0,29) pomiędzy obiema metodami, pomimo potencjalnego wpływu warun-ków i czasu transportu na wynik oznaczeń w laboratorium referencyjnym. W związku z niewielkim zakresem pomiarów analiza Bland- Altman została oparta na ocenie różnic przedstawionych w wymiarze stężenia (Ryc. 4) [13] – uzyskano wartość -0,09 ng/ml (95% CI: -0,24; +0,06) wskazującą na nieznamien-ność różnicy pomiędzy metodami. W wymiarze procento-wym analiza Bland-Altman wykazała średni bias = -4,9 %, przy czym dla decyzyjnych wartości stężenia EWE (granice zakresu stężeń terapeutycznych) wynosił on odpowiednio: -9,4 % dla 3 ng/ml oraz +5,7 % dla 8 ng/ml.Przeprowadzona analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y = 1,123 x - 0,43 i została przedstawiona gra-ficznie na Ryc. 5. Nie stwierdzono znaczącego odchylenia od liniowości (p>0,10), jednak wyznaczone współczynniki

Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu ...

270

zbyt wyrafinowana do rutynowego stosowania w diagnosty-ce laboratoryjnej. Coraz niższa cena aparatury w połączeniu z dostępnością komercyjnych zestawów aplikacyjnych prze-znaczonych do analizy kilku leków jednocześnie oraz nie-wielkie zużycie odczynników i krótki czas analizy sprawia-ją, że technika LC-MS/MS, (w tym wykorzystująca zestawy analityczne firmy Waters) jest powszechnie wykorzystywana w terapii monitorowanej w wielu krajach. Potwierdzeniem tego trendu jest pojawiająca się duża liczba nowych aplikacji [10, 15-17]. Nasze badania przedstawione na przykładzie oznaczania EWE we krwi pacjentów po przeszczepieniach narządowych dowodzą, że możliwe jest skuteczne wpro-wadzenie techniki LC-MS/MS także do polskiej diagnostyki laboratoryjnej.

PodziękowaniaFirma Novartis Poland sp. z o.o. sfinansowała wykonanie oznaczeń stężenia EWE w próbkach krwi pacjentów po transplantacji leczonych preparatem Certican®. Autorzy składają podziękowanie: prof. D.W. Holt i dr D.A. McKeown z Analytical Unit, St George’s – University of Lon-don za współpracę przy analizie próbek metodą referencyj-ną.

PiśmiennictwoKirchner GI, Meier-Wiedenbach I, Manns MP. Clinical pharma-1. cokinetics of everolimus. Clin Pharmacokinet 2004; 43: 83-95.Dunn C, Croom KF. Everolimus. A review of its use in renal and 2. cardiac transplantation. Drugs 2006; 66: 547-570.Taylor PJ, Franklin ME, Graham KS, et al. A HPLC-mass spec-3. trometric method suitable for the therapeutic drug monitoring of everolimus. J Chromatogr B 2007; 848: 208-214.Koster RA, Dijkers ECF, Uges DRA. Robust, high-throughput LC-4. MS/MS method for therapeutic drug monitoring of cyclosporine, tacrolimus, everolimus, and sirolimus in whole blood. Ther Drug Monit 2009; 31: 116-125.Meinitzer A, Gartner G, Pilz S, et al. ultra fast liquid chromatog-5. raphy-tandem mass spectrometry routine method for simulta-neous determination of cyclosporin A, tacrolimus, sirolimus and everolimus in whole blood using deuterated internal standards

for cyclosporin A and everolimus. Ther Drug Monit 2010; 32: 61-66.Moes DJAR, Press RR, de Fijter JW, et al. Liquid chromatog-6. raphy-tandem mass spectrometry outperforms fluorescence polarization immunoassay in monitoring everolimus therapy in renal transplantation. Ther Drug Monit 2010; 32: 413-419.Sallustio BC, Noll BD, Morris RG. Comparison of blood siroli-7. mus, tacrolimus and everolimus concentrations measured by LC-MS/MS, HPLC-UV and immunoassay methods. Clin Bio-chem 2011; 44: 231-236.Kunicki PK. Application of new QMS® everolimus assay per-8. formed on CDX 90 analyzer (ThermoFisher) to therapeutic drug monitoring in transplant patients. Ther Drug Monit 2011; 33: 542-543.Guideline on bioanalytical method validation, European Medi-9. cines Agency, 2011, EMEA / CHMP / EWP / 192217 / 2009 of 21 July 2011.McKeown DA, Hammond GW, Christians U, et al. Multi-centre 10. evaluation of the Waters MassTrak™ XE (IUO) kit for use with LC-MS/MS for the quantification of everolimus. Ther Drug Monit 2011; 33: 541-542.Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agree-11. ment between two methods of clinical measurement. Lancet 1986; i: 307-310.Payne RB. Method comparison: evaluation of least squares, 12. Deming and Passing/Bablok regression procedures using com-puter simulation. Ann Clin Biochem 1997; 34: 319-320.Dewitte K, Fierens C, Stöckl D, et al. Application of the Bland-13. Altman plot for interpretation of method-comparison studies: A critical investigation of its practice. Clin Chem 2002; 48: 799-801.Altman DG, Bland JM. Commentary on quantifying agreement 14. between two methods of measurement. Clin Chem 2002; 48: 801-802.Parant F, Bouche L, Rougemont B, et al. Evaluation of two 15. tandem-MS kits for immunosuppressant analysis on a Waters Xevo TQ-S tandem mass spectrometer. Ther Drug Monit 2011; 33: 541.Juenke JEM, Smith J, Thomas RL, et al. An everolimus method 16. comparison between Waters MassTrak™ XE (IUO) Kit and an HPLC-MS/MS method, in renal transplant patients. Ther Drug Monit 2011; 33: 541.Ji M, Kim S, Chung HJ, et al. Evaluation of the MassTrak Immu-17. nosupressant XE Kit for the determination of everolimus and cy-closporin A in human whole blood employing isotopically labeled internal standards. Clin Chem Lab Med 2011; [Epub ahead of print].

Zaakceptowano do publikacji: 29.05.2012

Adres do korespondencji: dr n. farm. Paweł K. KunickiPracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii KlinicznejInstytut Kardiologii04-628 Warszawa, Alpejska 42Tel.: +48 22 3434157; fax +48 22 3434518.E-mail: p.kunicki@ikard.pl

Rycina 5. Porównanie oznaczeń stężenia EWE z wykorzystaniem analizy re-gresji Passing-Bablok.