1

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej

Wydziału Farmaceutycznego

ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII I IMMUNOLOGII

DLA STUDENTÓW FARMACJI

POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK

Łódź 2014

2

AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk

ISBN: 978-83-64344-04-6 Wydanie drugie zmienione i poprawione

3

Spis treści: MIKROBIOLOGIA Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów …………………………………………..……….…5 Rozdział 2 Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na podłożach………..….…..19 Rozdział 3 Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej hodowli …...33 Rozdział 4 .. Wymagania wzrostowe bakterii ………………………….…………..……...41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich Identyfikacji……………………………………………………………………………..51 Rozdział 6 Liczenie bakterii…………………………………………………………….………...69 Rozdział 7 Dezynfekcja i antyseptyka………………………………………………..….…..79 Rozdział 8 Wpływ czynników środowiskowych na wzrost i rozwój bakterii. Sterylizacja………………..…………………………………………………..…………91 Rozdział 9 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych.……………….….103 Rozdział 10 Bakterie w przewodzie pokarmowym.……….………………..…..…....123 Rozdział 11 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka…………………..…145 Rozdział 12 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji…………………………………..……153 Rozdział 13 Wirusologia………………………………………………………………………..……165

4

Rozdział 14 Mikologia…………………………………………………………………………….…..179 Rozdział 15 Bakterie w lekach – kontrola czystości mikrobiologicznej……..…191 Rozdział 16 Schematy identyfikacyjne drobnoustrojów w badaniu leków wg Farmakopei Polskiej IX…………………………………………………….….205 Rozdział 17 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie plazmidów………………………………………………………….……………………211 Rozdział 18 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii…………..217 IMMUNOLOGIA Rozdział 1 Podstawy diagnostyki immunologicznej i immunoprofilaktyki…233

5

Rozdział 1

Morfologia drobnoustrojów

Cześć teoretyczna

Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne Do mikroorganizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i Archea, a do eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Choroby u ludzi wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki). Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami jednokomórkowymi. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli 1.

Morfologia komórki bakterii Wymiar większości komórek bakteryjnych pozwala na ich obserwację w mikroskopie świetlnym, gdyż mieści się w granicach od 1 do 10 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica od 1-2 µm. Jednak rozmiar najmniejszych bakterii wynosi od 0,15 do 0,2 µm i jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, ale największych wynosi od 250 do 600 µm. Komórki grzybów chorobotwórczych są znacznie większe od komórek bakteryjnych (do 40 μm). Ich wielkość waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli. Bakterie różnią się między sobą kształtem. Wyróżniamy kształty: kulisty, cylindryczny i spiralny.

6

Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze i funkcji komórek prokariotycznych i eukariotycznych

Cecha Komórka prokariotyczna Komórka eukariotyczna DNA wolny, zawieszony w

cytoplazmie, zwykle – jeden chromosom; plazmidy

zawarty w jądrze, otoczonym błoną jądrową; jąderko

Rozmnażanie tylko bezpłciowe przez podział komórki

podział komórek przez mitozę; rozmnażanie płciowe z wytworzeniem gamet

Wymiana materiału genetycznego

poprzez koniugację, transdukcję i transformację

w czasie rozmnażania płciowego

Ściana komórkowa zawiera peptydoglikan (u bakterii) lub inne polimery (Archea)

może zawierać chitynę, mannany, glukany (grzyby) lub celulozę

Błona cytoplazmatyczna

brak steroli (poza mikoplazmami); zawiera hopanoidy (poza Archea)

obecne są sterole; organelle błonowe (lizosomy, peroksysomy).

Układ błon wewnętrznych

brak retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego

Mitochondria brak obecne Rybosomy 70 S 80S (cytoplazmatyczne), 70S

(mitochondrialne) Rzęski z białka - flagelliny złożona, tubullarna struktura

Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstawanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe:

7

dwoinki – komórki po podziale pozostają po dwie,

ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach,

pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki,

paciorkowce (Sterptococcus) – komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki,

gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (Bacterium),

laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne przestrzenne układy popodziałowe: dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do zmienności morfologicznej i wielokształtności komórek. Obok kulistych, mogą one tworzyć formy cylindryczne czy nitkowate. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem (pleomorfizmem). Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana) cytoplazmatyczna. Wszystkie bakterie (z wyjątkiem mykoplazm) mają złożoną w swej strukturze ścianę komórkową. Niektóre bakterie wytwarzają warunkujące ruchliwość rzęski czy włókno osiowe, a także ważne dla kolonizacji fimbrie adhezyjne, dla wymiany materiału genetycznego – fimbrie płciowe (pili), albo wpływającą na chorobotwórczość otoczkę. Niektóre rodzaje bakterii (Clostridium, Bacillus) mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory) czy też gromadzić w cytoplazmie materiały zapasowe, najczęściej

8

kwas poli-β-hydroksymasłowy, ziarnistości poli-metafosforanowe zwane wolutyną, ale także skrobię, glikogen czy koloidalną siarkę. Wytwarzanie tych struktur może zależeć od warunków środowiska. Cechy te jednak mają duże znaczenie dla taksonomii, a tym samym identyfikacji bakterii. W mikroskopie świetlnym, w „mokrych” preparatach możemy ocenić kształt i wielkość komórek drobnoustrojów, a także ich ruchliwość spowodowaną obecnością rzęsek lub włókna osiowego (preparat w „kropli wiszącej”). Można także obserwować przetrwalniki jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej (mikroskop fazowo-kontrastowy). Barwienie trwałych preparatów bakterii metodą Grama wykorzystuje różnice w budowie ściany komórkowej dwóch grup bakterii. Jedne mają ścianę złożoną z grubej warstwy peptydoglikanu oraz kwasów tejchojowych, lipotejchojowych i białek – te nazywamy gramdodatnimi, a ściana drugiej grupy jest złożona z cienkiej, zawieszonej w peryplazmie warstwie peptydoglikanu oraz lipopolisacharydu i białek tworzących tzw. błonę zewnętrzną – te nazywamy gramujemnymi. Różnice w budowie ściany są przyczyną różnego zatrzymywania przez komórki barwników stosowanych w metodzie Grama i w efekcie pozwalają na łatwe przyporządkowanie bakterii do grupy. Ma to ogromne znaczenie dla identyfikacji bakterii. Ściana komórkowa niektórych bakterii zawiera dodatkowe składniki, które sprawiają, że barwienie metodą Grama jest trudne lub niejednoznaczne. Stosowane są wtedy inne metody (np. Mycobacterium spp.). Metodą Grama barwią się komórki, ale barwników nie przyjmują przetrwalniki, stąd metoda ta uwidacznia w komórkach te struktury. Komórka bakteryjna wytwarza tylko jeden przetrwalnik. Może on mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru poprzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki i nadaje jej charakterystyczny kształt. Wytwarzane przez niektóre bakterie otoczki, także nie zabarwiają się w metodzie Grama, ale są widoczne, jeśli obok komórki zabarwimy tło metodą pozytywno-negatywną. Otoczki te mają budowę wielocukrową, wielocukrowo-peptydową lub, najrzadziej, peptydową.

9

Stosując specjalne metody barwienia można zabarwić niektóre struktury komórkowe: rzęski, nukleoid, przetrwalniki. Dla celów taksonomicznych zastosowanie znajduje barwienie materiałów zapasowych. Funkcje jakie spełniają w komórkach poszczególne ich struktury przedstawiono w tabeli 2. Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej.

Struktura komórkowa Pełniona funkcja

Nukleoid, plazmidy zapis potencjalnych możliwości komórki; genotyp

Rybosomy synteza białek Błona cytoplazmatyczna umożliwia transport do wnętrza i na zewnątrz

komórki; z nią związany jest metabolizm energetyczny

Ściana komórkowa nadaje kształt, chroni przed uszkodzeniami mechanicznymi, jest barierą przepuszczalności dla substancji wielkocząsteczkowych; odgrywa rolę w patogenezie zakażeń

Otoczka chroni przed fagocytozą; warunkuje przeżycie w organizmie gospodarza; bierze udział w adhezji bakterii do powierzchni

Rzęski ruch Fimbrie udział w adhezji bakterii do powierzchni Fimbrie płciowe (pili) udział w procesie koniugacji – przekazywania

materiału genetycznego z komórki do komórki Przetrwalniki warunkują wyjątkową oporność na działanie

czynników fizyko-chemicznych wytwarzających je bakterii

10

Metody

Mikroskopowanie Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm. Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako dwa oddzielne punkty. Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko wklęsłe. Preparaty przyżyciowe (tzw. „mokre”) oglądamy najczęściej przy pomocy obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze. Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się

11

pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów. Preparat w "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii. Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką") i szkiełka nakrywkowego.

Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału.

Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują.

12

Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą: nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W pH hodowli – zwykle obojętnym lub lekko zasadowym – białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła – otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki określamy barwieniem negatywnym.

Metoda Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:

barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana);

zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola);

odbarwiacz - alkohol etylowy;

barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10).

Wykonanie barwienia - na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą;

13

- nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym. W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo.

Metoda barwienia negatywno-pozytywnego Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania otoczek u bakterii. Komórka bakteryjna zabarwiana jest barwnikiem zasadowym, a tło kwaśnym. W metodzie tej można używać różnych barwników. Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub kolargol.

14

Zadania do wykonania Zadanie 1 Mikroskopowanie pod immersją i ocena preparatów Otrzymujesz gotowy preparat wykonany z hodowli Bacillus subtilis i zabarwiony metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. - Narysuj obraz preparatu widzianego w mikroskopie. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy obserwowany przez ciebie drobnoustrój należy do bakterii gramdodatnich czy gramujemnych?

Powiększenie: To bakterie gram..................

15

Zadanie 2 Przygotowanie i barwienie preparatów Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus w płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy badany przez ciebie drobnoustrój okazał się bakterią gramdodatnią czy gramujemną?

Powiększenie: To bakterie gram..........................

16

Efekty uzyskiwane na poszczególnych etapach barwienia metodą Grama Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje.

Używane odczynniki

Bakterie gramdodatnie Bakterie gramujemne

Fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (Gencjana)

Roztwór jodu w jodku potasu (płyn Lugola)

Alkohol etylowy

Alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (Fuksyna 1:10)

17

18

19

Rozdział 2

Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na podłożach Cześć teoretyczna

Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy szczególnie z grupy B, zasady purynowe i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Bakterie do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg

2+, Fe

2+, Ca

2+, Mn

2+, Zn

2+ są aktywatorami niektórych reakcji

enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki.

20

Podłoża do hodowli bakterii Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Bakterie hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój bakterii na pożywkach pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost wszystkim bakteriom. Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny:

zawierać odpowiednie składniki pokarmowe,

mieć odpowiednią wilgotność,

mieć odpowiednie pH,

mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,

być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Pożywki złożone to podłoża zawierają dodatkowo surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych.

21

Podstawową pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 45-48°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi mogą być: węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym, często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na:

namnażające lub namnażająco-wybiórcze,

wybiórcze (selektywne),

diagnostyczne (różnicujące),

transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych.

22

Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźniki, który, na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych

23

składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha. Czas generacji bakterii, optymalny czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (20 ,21 ,22 , 23…2n). Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to dzięki ciągłemu dostarczaniu do bioreaktora świeżej pożywki z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym poziomie.

24

Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością podziałów komórek i szybkością ich wymierania. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowują swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych.

25

Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego, 4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania Wzrost bakterii na podłożach płynnych i stałych Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy identyfikacji bakterii. Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego. Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; CFU – ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka

czas hodowli

lg lic

zb

y ż

yw

ych

ko

mó

rek

12

3

45

5

6

26

komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy), a także przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami.

Metody Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy:

wielkość - średnica (mm);

kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, ..;

brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ;

powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata, ... ;

wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, wrastająca w podłoże, ... ;

przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ;

barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ;

otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża.

27

Metody sterylizacji pożywek Jednym z podstawowych wymogów, jakie muszą spełniać podłoża bakteriologiczne, jest ich jałowość (sterylność). Sterylizacja to proces prowadzący do całkowitego zniszczenia form wegetatywnych i przetrwalników drobnoustrojów. Do sterylizacji pożywek najczęściej wykorzystuje się wysoką temperaturę – gorąco wilgotne (para wodna). Proces sterylizacji prowadzi się w autoklawie w temperaturze 121°C przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 minut, gdy składniki pożywki są względnie termostabilne lub metodą tyndalizacji w aparacie Kocha, gdy pożywka zawiera składniki termolabilne. Tyndalizacja polega na trzykrotnym 60-minutowym ogrzewaniu pożywki w temperaturze 100°C w odstępach 24 godzinnych. Szkło laboratoryjne, w którym umieszczamy pożywki wyjaławia się w suszarce wykorzystując działanie gorącego suchego powietrza. Czas sterylizacji zależy od zastosowanej temperatury. Najczęściej stosuje się temperaturę 160°C przez 2 godziny lub 180°C przez 30 minut. Szkło laboratoryjne można także jałowić w autoklawie. Metody kontroli urządzeń sterylizujących Niesterylność pożywek może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów. Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych. Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym. Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych przyrządów, coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów. Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry

28

sterylizacji. Testy te mają postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki chemiczne informują jedynie, czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują one jednak, jak długo ta temperatura utrzymywała. Chemiczne wskaźniki wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały osiągnięte wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch) parametrów sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu procesu sterylizacji. Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte, odpowiednio, w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów) i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli użyte w teście przetrwalniki zostały zabite, oznacza to, iż zostały zabite wszystkie bardziej wrażliwe drobnoustroje zanieczyszczające sterylizowany materiał. Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod. Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu wskaźników biologicznych.

29

Zadania do wykonania Zadanie 1 Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku namnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy.

30

Zadanie 2 Kontrola skuteczności sterylizacji w suszarce za pomocą testu biologicznego Sporal S - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu S. - Sprawdź temperaturę suszarki (180°C) i umieść w niej torebkę w szklanym otwartym naczyniu. Zanotuj czas. - Po 30 minutach sterylizacji wyjmij Sporal S z suszarki. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą i jałowo (przy palniku) przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (37°C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch) czy też bulion jest klarowny.

Zadanie 3 Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie za pomocą testu biologicznego Sporal A - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu A. - Włóż torebkę do probówki i umieść ją w autoklawie. Zamknij pokrywę i włącz urządzenie.

- Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia

31

- Po zakończonym cyklu sterylizacji otwórz autoklaw i wyjmij z niego Sporal A. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą jałowo przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (55°C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch) czy bulion jest klarowny.

Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia

32

33

Rozdział 3

Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej hodowli

Część teoretyczna Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody, żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków, spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale, może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej komórki bakterii lub jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej.

Metody Posiew bakterii na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po

34

wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub wacików. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia (probówki lub kolbki). Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL pożywki. Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób – zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy

35

porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina

stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą.

A

B

C

D

Rycina 1. Posiew redukcyjny

36

Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania bakterii.

Z pożywki płynnej

Z pożywki stałej (płytka agarowa, skos agarowy)

Na pożywkę płynną (pipeta, eza)

Na skos agarowy (eza)

Na płytkę agarową (eza, wacik, pipeta)

Na pożywkę płynną (eza)

Na skos (eza)

Na płytkę agarową (eza)

37

Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków.

Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże.

Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną.

Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki.

Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię.

Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii.

Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama.

Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii.

38

- Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki.

- Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).

Kolonia: Preparat:

Kolonia: Preparat:

39

Kolonia: Preparat:

Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych.

40

41

Rozdział 4

Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna

Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów.

Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na:

autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do związków organicznych;

heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na:

42

- prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach

pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych;

- auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska.

Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu.

Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii:

fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące),

chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych.

W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na:

litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych,

organotrofy - korzystające z donatorów organicznych.

43

Zatem, zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii i donatorów elektronów, możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowiące mikrobiota człowieka i te, które są dla niego chorobotwórcze, są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze związków organicznych.

Wymagania tlenowe bakterii Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględnie beztlenowe rosną przy jego braku, a względnie beztlenowe rosną zarówno przy dostępie, jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, u których końcowym akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek organiczny. Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru. Jest on rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane są m.in. bakterie z rodzajów Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu, jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjno-redukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobo-twórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą

44

przestawić metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na oddychanie beztlenowe, np.: Pseudomonas denitrificans. Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko przy braku dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie mają żadnych mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie. Niektóre z nich mogą rosnąć w obecności tlenu, jednak pod warunkiem obniżenia potencjału oksydoredukcyjnego poprzez dodanie do hodowli glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą liczne bakterie chorobotwórcze dla człowieka m.in. z rodzajów Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium.

Wymagania temperaturowe bakterii Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatury kardynalne to temperatura minimalna, która wyznacza dolną granicę, poniżej której wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna, która jest temperaturą, powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy. Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40°C do 70°C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus, czy Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych temperaturach, np. Thermus aquaticus w 65°C. Znane są i takie, które mnożą się w temperaturze 90-110°C. Określane są one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z możliwości, jakie stwarzają dla biologii molekularnej ciepłoodporne enzymy tych bakterii. Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie temperatur 25-45°C. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju w temperaturze 37°C, blisko związane z człowiekiem jako patogeny i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella). Niektóre z mezofili mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur, jak na przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki (+4OC) Listeria spp. – o spektrum od 1do 45°C .

45

Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne o optymalnej temperaturze 20°C, ale mogące też rosnąć w 0°C, występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 0°C, mnożąc się w żywności przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter, a także Bacillus czy Lactobacillus.

Metody

Badanie zdolności wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla Określenie przynależności bakterii do prototrofów oraz zbadanie zdolności do metabolizowania określonego związku organicznego jako jedynego źródła węgla może mieć znaczenie diagnostyczne. Cechę tę można zbadać na podłożu Simmonsa. Jest to podłoże stałe, które może zawierać w swoim składzie cytrynian sodowy lub np. malonian jako jedyne źródło węgła i siarczan amonowy jako źródło azotu. Do pożywki dodany jest wskaźnik pH – błękit bromotymolowy, który w środowisku obojętnym, jakie posiada podłoże wyjściowe, ma zabarwienie zielone. Na podłożu wyrastają jedynie bakterie, które mają zdolność wykorzystywania organicznego substratu, a alkaliczne produkty ich metabolizmu – amoniak i aminy zmieniają jego barwę na niebieską.

Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub aminokwasów jako źródła azotu Bakterie posiane na stałe podłoże nie zawierające źródła azotu, na które punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków) naniesiono roztwory NH4(SO4)2 i aminokwasów wyrosną tylko w pobliżu tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać.

46

Metody hodowli bakterii tlenowych Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce. Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne wstrząsanie lub mieszanie hodowli na tzw. wytrząsarkach. W hodowlach płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie tlenu zwiększa się przepuszczając powietrze lub tlen przez pożywkę.

Metody hodowli bakterii beztlenowych Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki. W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną parafiną. Metoda ta jednak może być zawodna. Najczęściej bakterie beztlenowe hoduje się w specjalnych, szczelnych słojach, wewnątrz których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej wytwórcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu wydzielany jest wodór. Ten reaguje z tlenem obecnym w słoju tworząc wodę. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunków beztlenowych. Efektywność tego procesu sprawdza się przy pomocy wskaźnika, błękitu metylenowego, który w warunkach beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach saszetek wymagają do swojej aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć szybkość łączenia się wodoru z tlenem, stosuje się wtedy katalizator palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka słoja. W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%).

47

Wiele bakterii beztlenowych można wyhodować na podłożach o obniżonym potencjale oksydoredukcyjnym, co jest osiągane poprzez dodanie odpowiednich związków chemicznych. W powszechnie używanych: podłożu Brewera jest to tioglikolan sodu, a w podłożu Schaedlera – chlorowodorek cysteiny.

Zadania do wykonania Zadanie 1 Typy pokarmowe bakterii Uzupełnij poniższą tabelę:

Typ pokarmowy

Źródło energii Źródło węgla Donatory elektronów

chemoorgano-trofy

związki nieorganiczne

CO2 i inne związki nieorganiczne

związki nieorganiczne

światło związki nieorganiczne

związki nieorganiczne

fotoorganotrofy

związki organiczne

48

Zadanie 2 Wykorzystywanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla -Otrzymujesz hodowle stałe Escherichia coli i Klebsiella mobilis w płytce Petriego oraz dwie próbówki zawierające podłoże Simmonsa w formie skosu agarowego. -Probówki z podłożem Simmonsa podpisz nazwami bakterii, które będziesz posiewał. -Każdy z badanych drobnoustrojów posiej na powierzchnię jednego skosu. -Inkubuj posiewy w cieplarce (37°C, 24 godziny). -Na podstawie zmiany zabarwienia podłoża oceń zdolność wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla przez badane bakterie. - Obserwacje zapisz w tabeli.

Escherichia coli Klebsiella mobilis

Zabarwienie podłoża po hodowli

Zdolność wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla

Zadanie 3 Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii w hodowli płynnej - Otrzymujesz hodowle bulionowe: Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli. Każdy z badanych rodzajów bakterii był hodowany w warunkach tlenowych i w beztlenowych. Warunki beztlenowe uzyskano poprzez pokrycie hodowli płynną parafiną. - Posiewy inkubowano w cieplarce (37°C, 48 godzin). - Wyniki hodowli (wzrost) zaznacz w tabeli.

49

Clostridium botulinum

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

Bulion

Bulion pod parafiną

Określenie wymagań tlenowych bakterii

50

51

Rozdział 5

Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji Część teoretyczna Metabolizm bakterii Podobnie, jak w innych żywych komórkach, metabolizm bakterii obejmuje anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu). Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP. W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy, kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów. W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa, będący końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda, dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów anabolicznych wymagających jej nakładu. Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest angażujące cykl Krebsa oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha oddechowego.

52

Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne, np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów ich rozkładu, a także enzymów biorących udział w tych procesach także wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów. Oddychanie azotowe może angażować jeden z dwóch procesów:

denitryfikację polegającą na redukcji azotanu do podtlenku azotu (N2O) oraz uwalnianego do środowiska azotu atmosferycznego. Bakterie posiadające takie zdolności to m.in.: Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis;

amonifikację polegająca na redukcji azotanów do azotynów, a następnie do amoniaku w formie jonu amonowego NH4

+.

Przeprowadzana jest ona m.in. przez: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes.

Oddychanie siarkowe polega na redukcji siarczanów bądź siarki do siarczków. Zdolność do redukcji siarczanów mają bakterie z rodzaju Desulfovibrio, natomiast siarkę redukują bakterie z rodzaju Desulfuromonas. Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego, w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego. Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne powstałe jako produkty pośrednie, np.: etanol, mleczan, maślan, bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy fermentacji. W identyfikacji bakterii znaczenie diagnostyczne mają: fermentacja mlekowa, propionowa, masłowa i mrówkowa.

Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe (Lactobacillus spp.), ale także inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie mlekowe stanowią mikrobiota przewodu pokarmowego niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też mikrobiota pochwy u kobiet.

Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym

53

przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy tej fermentacji powstaje kwas propionowy.

Fermentacja masłowa prowadzona jest przez beztlenowe bakterie przetrwalnikujące z rodzaju Clostridium, w tym laseczki zgorzeli gazowej. Jako produkty końcowe tego procesu powstają kwasy masłowy, octowy, alkohole oraz CO2 i H2.

Fermentacja mrówkowa jest charakterystyczna dla bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Produktami końcowymi jest wiele związków, a wśród nich kwasy organiczne, etanol, glicerol, acetoina, 2,3-butandiol, a także CO2 i H2. Możliwe są dwa szlaki przemian, a ich cechy wykrywa się dla celów identyfikacyjnych.

Pierwszy z nich charakteryzuje się powstawaniem silnych kwasów organicznych, co obniża pH pożywki poniżej 4,5 (próba Metyl-Red). W innym szlaku kwasy organiczne mogą powstawać w mniejszej ilości, a głównymi produktami są acetoina i 2,3-butandiol (próba Voges- Proskauera). Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste, oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy. Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele substratów, zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku większości bakterii jest to glukoza. Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie niezmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są zwykle degradowane przez esterazy, o szerokiej swoistości substratowej. Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności – na przykład lecytynazę.

54

Cechy wykorzystywane do identyfikacji bakterii W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi, próby oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie, poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą w nich mieć także takie cechy, jak morfologia mikroskopowa bakterii i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze z krwią), wytwarzanie enzymów np. katalazy, oksydazy czy też charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych gatunków próby takie, jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce) stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi. Dla bakterii długo rosnących lub niehodowalnych standardowymi metodami mikrobiologicznymi są metody polegające na wykrywaniu ich materiału genetycznego w próbce.

Metody

Diagnostyka bakteriologiczna Standardowe postępowanie zależy od rodzaju materiału i spodziewanych drobnoustrojów. Zwykle rozpoczyna je charakterystyka mikroskopowa badanej próbki. Barwienie metodą Grama pomaga ocenić materiał i wybrać rodzaj podłoża do pierwszego posiewu. Można posłużyć się metodami fenotypowymi, na które składają się:

charakterystyka wzrostu na podłożach, na których dokonano izolacji (pierwszego posiewu materiału);

55

otrzymanie czystej hodowli i charakterystyka morfologii kolonii oraz opis mikroskopowego obrazu komórek bakterii;

próby biochemiczne badające właściwości sacharolityczne, proteolityczne, lipolityczne, utleniająco-redukujące;

badanie właściwości serologicznych (poszukiwanie charakterystycz-nych antygenów);

lub metodami genotypowymi (badającymi genom), w których stosuje się techniki biologii molekularnej i poszukuje charakterystycznych dla danych bakterii markerów (sekwencji nukleotydów).

Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne:

związane z metabolizmem azotowym,

związane z metabolizmem węglowodanów,

związane z metabolizmem lipidów,

związane z procesami oddechowymi (enzymy red-ox). Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne należą do grupy pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób w najczęściej stosowanych wariantach.

Metabolizm azotowy Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa) Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok. 22°C) ma konsystencję stałą, ale w cieplarce (37°C) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji, ulega stałemu upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury. Właściwości proteolityczne - rozkład kazeiny mleka Zdolność do wytwarzania kazeinazy sprawdza się posiewając bakterie na podłoże agarowe z dodatkiem 10% odtłuszczonego mleka. Po

56

48 godzinach inkubacji w 37°C można zaobserwować przejaśnienie wokół kolonii produkujących ten enzym.

Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez bakterie H2S, ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka i na skos. Wynik odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37°C. Wytwarzany siarkowodór reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek żelaza powoduje zaczernienie podłoża.

Wytwarzanie indolu z tryptofanu Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą DL-tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C na podłoże należy nawarstwić zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-di-metyloamino-benzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli bakterie rozłożyły tryptofan, pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej warstwie pożywki.

Rozkład mocznika Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH - czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe.

Deaminacja fenyloalaniny Zdolność bakterii do rozkładu fenyloalaniny na drodze deaminacji tego aminokwasu bada się posiewając je na podłoże agarowe z dodatkiem D-α-fenyloalaniny. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C nakrapla się na płytkę 10% roztwór chlorku żelazowego. Zielone zabarwienie świadczy o deaminacji fenyloalaniny.

57

Metabolizm węglowodanów

Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych wymaganiach Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową (fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy (zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym szeregiem cukrowym.

Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na podłożu Hugh-Leifsona Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym, wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia, jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nie rozkładających cukru barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast, jeśli bakterie rozkładają cukier tylko w warunkach tlenowych, zmienia się barwa pożywki w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji.

Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy - podłoże MacConkeya Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Jest to podłoże diagnostyczne, ale zawiera też takie składniki, jak sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej wybiórczości i hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Zawarta w podłożu laktoza, jeśli jest rozkładana (bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko, co manifestuje się różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika - czerwieni obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii w kolorze nieposianej pożywki.

58

Określanie typu fermentacji glukozy - wykrywanie acetoiny – próba Voges-Proskauera Bakterie posiewa się na podłoże Clarka. Zawarta w nim glukoza rozkładana jest do kwasu pirogronowego, a dalej do różnych produktów końcowych m.in. do acetoiny. Acetoinę wykrywamy po 48-72 godzinach inkubacji dodając 0,5 mL roztworu KOH, a po wymieszaniu 0,2 mL alkoholowego roztworu α-naftolu. Hodowlę po ponownym wymieszaniu odstawia się na 15 minut. Pojawiające się karminowe zabarwienie powstaje w wyniku utlenienia acetoiny w obecności tlenu do diacetylu, reagującego następnie w obecności α-naftolu z obecną w peptonie resztą guaninową argininy.

Metabolizm lipidowy

Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80 W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80 (polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce jonami wapnia, powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł wapniowych.

Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących

Wytwarzanie katalazy Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2.. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą o obecności katalazy.

Wytwarzanie reduktazy azotanowej Zdolność bakterii do redukcji azotanów do azotynów można sprawdzić metodą sulfanilową, posiewając je na pożywkę zawierającą azotan potasu.

59

Po inkubacji (24 godziny w 37°C) do hodowli dodaje się kilka kropli odczynnika Griessa. W skład tego odczynnika wchodzą w proporcji 1:1 roztwory kwasu sulfanilowego i α-naftyloaminy w kwasie octowym. W środowisku kwaśnym kwas sulfanilowy ulega diazowaniu jonami azotynowymi, po czym łącząc się z α-naftyloaminą daje barwę.

Badanie zdolności hemolitycznych bakterii Hemolizyny bakteryjne są cytolizynami, które niszczą krwinki czerwone ludzi i zwierząt. Zdolność wytwarzania ich przez bakterie można wykazać na podłożu agarowym zawierającym dodatek 5% odwłóknionej krwi baraniej lub ludzkiej. Podłoże takie jest jednocześnie podłożem diagnostycznym, jak i wzbogaconym. Bakterie posiewa się redukcyjnie, inkubuje w optymalnych dla nich warunkach. W pobliżu kolonii wytwarzających hemolizyny pojawiają się charakterystyczne zmiany. Wyróżnia się dwa typy hemolizy:

α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej strefy wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu krwinek (przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny);

β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne przejaśnienie wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy krwinek i wyługowania barwnika.

Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy szczepów.

Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie

60

wyników i przy użyciu książki kodowej lub odpowiedniego oprogramowania zidentyfikowanie zwykle do gatunku.

Techniki biologii molekularnej w diagnostyce bakteriologicznej Metody genotypowe umożliwiają wykrycie nawet minimalnej ilości kwasu nukleinowego – genomu poszukiwanych w materiale badanym bakterii. Znalazły one swoje miejsce w diagnostyce bakterii odpowiedzialnych za szereg chorób, uzupełniając fenotypowe metody identyfikacyjne, skracając czas badania, a w przypadku drobnoustrojów wolno rosnących na podłożach sztucznych czy też w ogóle nie dających się na nich hodować, stały się niezastąpione. W diagnostyce mikrobiologicznej wykorzystywane są metody genetyczne, w których poszukuje się specyficznych dla danego drobnoustroju sekwencji stanowiących fragment jego genomu. Metody ich wykrywania oparte są na ich bezpośredniej hybrydyzacji z zastosowaniem swoistych sond molekularnych lub na amplifikacji (powielaniu) określonych (poszukiwanych) fragmentów materiału genetycznego. Najczęściej wykorzystywaną metodą identyfikacji drobnoustrojów jest metoda amplifikacji poszukiwanych fragmentów genomu bakterii. Wykorzystywane są tu komplementarne do końców powielanego fragmentu startery (krótkie sekwencje) genów, często chorobotwórczości, które wcześniej uznano za wystarczająco odróżniające poszczególne rodzaje, gatunki lub szczepy. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR - Polymerase Chain Reaction) oraz jej odmiany (Multiplex-PCR, Real-time-PCR, RT-PCR, nested-PCR) oprócz badanego materiału genetycznego (matryca) oraz starterów wymaga udziału termostabilnej polimerazy Taq, buforu zawierającego jony magnezu oraz trifosforanów deoksynukleozydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Poszczególne etapy amplifikacji DNA wymagają odpowiedniej temperatury, dlatego musi być przeprowadzona przy zastosowaniu termocyklera. Reakcja zachodzi w powtarzających się cyklach (około 30) składających się z etapów: - denaturacja kwasów nukleinowych (temperatura 90-95°C),

61

- przyłączanie starterów (temperatura 40-65°C), - wydłużanie łańcucha DNA (elongacja) katalizowane przez polimerazę DNA (temperatura 72°C). Materiał genetyczny powielany jest wykładniczo, a cały proces pozwala na 10

6-10

9 -krotne namnożenie poszukiwanego fragmentu genomu, jeśli tylko

matryca (materiał badany) zawiera odpowiednie sekwencje. Ograniczeniem metod genetycznych jest fakt, że wykrywane jest DNA także martwych drobnoustrojów (niezagrażających już pacjentowi) oraz, paradoksalnie, ich wielka czułość. Mogą bowiem wskazać na obecność drobnoustroju nawet wtedy, gdy jego dawka infekcyjna nie jest przekroczona i nie on, zapewne, jest przyczyna choroby. Problemy te rozwiązuje amplifikacja w systemie real-time PCR.

Zadania do wykonania Zadanie 1 Badanie niektórych cech biochemicznych bakterii wykorzystywanych do ich identyfikacji - Otrzymujesz hodowlę bakterii na podłożu MacConkey’a. - Obejrzyj płytkę i odpowiedz na pytania w tabeli.

Czy hodowla jest czysta czy mieszana? Wygląd kolonii badanych bakterii na podłożu MacConkeya:

62

- Posiej badane bakterie na następujące podłoża: 1. Podłoże do wykrywania redukcji azotanów 2. Podłoże do wykrywania dezaminacji fenyloalaniny 3. Podłoże z mocznikiem 4. Wodę peptonową z tryptofanem 5. Bulion odżywczy (do wykrycia obecności katalazy) - Posiewy inkubuj w cieplarce (37°C , 48 godzin). - Wykonaj preparat barwiony metoda Grama z bulionu odżywczego. Odczytaj wyniki posiewów dodając odpowiednich odczynników. Wyniki zapisz w tabeli. Badanie właściwości bakterii z hodowli na podłożu MacConkeya:

Preparat: Kształt: Barwienie metodą Grama:

63

Zdolność redukcji azotanów

Dodane odczynniki: Jaka reakcja chemiczna zaszła: Jaki był jej efekt wizualny:

Wynik próby:

Deaminacja fenyloalaniny

Dodane odczynniki: Jaka reakcja chemiczna zaszła: Jaki był jej efekt wizualny:

Wynik próby:

Wykrywanie ureazy

Jaka reakcja zaszła: Jaki był jej efekt wizualny:

Wynik próby:

64

Wykrywanie rozkładu tryptofanu

Dodane odczynniki: Jaka reakcja chemiczna zaszła: Jaki był jej efekt wizualny:

Wynik próby:

Wykrywanie katalazy

Dodane odczynniki: Jaka reakcja chemiczna zaszła: Jaki był jej efekt wizualny:

Wynik próby:

Zadanie 2 Próby biochemiczne i biologiczne stosowane do identyfikacji bakterii Opisz i narysuj wszystkie demonstracje prób identyfikacyjnych, jakie zobaczyłeś na ćwiczeniach.

65

66

67

68

69

Rozdział 6

Liczenie bakterii Część teoretyczna Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach mikrobiologii. Jest ono przydatne między innymi w ocenie czystości mikrobiologicznej leków, kosmetyków i żywności, w badaniu bakteriologicznym wody, ścieków, powierzchni produkcyjnych i powietrza, przy produkcji szczepionek, w kontroli skuteczności działania środków myjących i dezynfekujących, a w diagnostyce laboratoryjnej – w ocenie liczby bakterii w moczu. Oznaczać można całkowitą liczbę bakterii, to znaczy łącznie komórki żywe i martwe lub tylko liczbę żywych komórek. Obliczanie całkowitej liczby komórek można wykonać mikroskopowo przez bezpośrednią obserwację i liczenie komórek bakteryjnych:

w preparacie barwionym,

w hemacytometrach, np. kamerze Thoma,

na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości. Bakterie obecne na sączku barwi się najczęściej błękitem metylenowym lub roztworem erytrozyny. Metoda stosowana jest na przykład przy badaniu wody i ścieków. Można też posłużyć się metodami turbidymetrycznymi - porównując zmętnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie komórek - wzrokowo lub za pomocą fotometru. Przy stosowaniu tych metod potrzebne są krzywe wzorcowe, odnoszące liczbę komórek (policzonych innymi metodami) do gęstości optycznej zawiesiny. Całkowitą liczbę bakterii można też określić metodami chemicznymi – przez oznaczenie całkowitego azotu, fosforu, białek lub kwasów nukleinowych. Metoda ma zastosowanie głównie w pracach badawczych.

70

Liczbę żywych, to znaczy zdolnych do podziału, komórek bakteryjnych oznacza się wymienionymi poniżej metodami hodowlanymi.

Metoda posiewu na podłoże stałe (metoda płytkowa) – polega na liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpływem sił grawitacyjnych - metoda Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowo-zderzeniowa) osiadaniu bakterii na powierzchni podłoża. Metoda stosowana jest przy badaniu czystości mikrobiologicznej powietrza.

Metoda płytek odciskowych – wykorzystuje podłoże agarowe, tworzące w płytce Petriego menisk wypukły, który przykłada się na kilka sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie, a wynik ocenia w zależności od przyjętych kryteriów. Metoda służy do monit