263

EWOLUCJA UK£ADUSYMBIOTYCZNEGO RHIZOBIUM

� RO�LINY MOTYLKOWATE

Jerzy Wielbo i Anna Skorupska

1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu. 2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne. 3. Charak-terystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu. 4. Filogeneza ro�linnych gospodarzy. 5. Moleku-larne pod³o¿e predyspozycji ro�lin do tworzenia brodawek. 6. Filogeneza rizobiów. 7. Ewolucja kom-pleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy czynników Nod. 8. Geny nod-nif: jednostkagenetyczna o odrêbnej filogenezie. 9. Rozprzestrzenianie siê grup genów symbiotycznych. 10. Bak-terie i ro�liny � ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ. 11. ��lepe uliczki ewolucji�� zjawisko niezgodno�ci uniemo¿liwiaj¹ce nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a ro�linamimotylkowatymi. 12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu � perspektywy. 13. Podsumowanie

The evolution of Rhizobium-legumes symbiosis

Abstract: The process of biological nitrogen fixation was developed by the living organisms overtwo billions years ago. Since that time it has been undergoing continuous evolution in parallelwith the evolution of living organisms which eventually led to development of numerous varieties ofthis process.

Non-symbiotic reduction of N2 performed by free-living Archea and Bacteria is the oldest formof biological nitrogen fixation. The evolution of terrestrial seminal plants and their common predis-position for symbiotic interactions with microorganisms, especially with fungi, permitted the devel-opment of very effective symbiotic systems.

The formation of correctly functioning symbiotic systems in which diazotrophic bacteria reduceatmospheric dinitrogen requires the expression of a genetic information, originating from three inde-pendently evolving sources: the plant genome, the bacterial genome and the nod-nif region. The plantgenome and the nod-nif genes interact most pronouncely (phenotypic interactions), whereas the bacte-rial genome plays but a secondary role in the creation of symbiotic systems. The group of bacterialdiazotrophic microsymbionts enlarges dynamically as an outcome of a significant mobility of the nod-nif region and its dissemination among new bacterial species by the lateral gene transfer mechanism.

1. Importance of the biological nitrogen fixation. 2. Symbiotic and non-symbiotic diazotrophs.3. Symbiotic nitrogen fixation: an overview.4. Phylogeny of plant-host species. 5. The molecularpredisposition of plants for nodulation. 6. Phylogeny of rhizobia. 7. The evolution of enzymaticnitrogenase complex and Nod factors biosynthesis pathway. 8. nod-nif genes � a region with its ownphylogeny. 9. Dissemination of the symbiotic genes among the bacterial species. 10. Bacteria andplants � the evolution of species and their interactions. 11. �Dead ends� of evolution � non-effectivesymbioses as a result of incompatibility between plant host and its microsymbiont. 12. The perspec-tives of symbiotic nitrogen fixation. 13. Summary

1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu

Ca³kowit¹ ilo�æ azotu na Ziemi szacuje siê na oko³o 1,6×1017 t, z czego 98%znajduje siê w geosferze niedostêpnej dla organizmów ¿ywych. Pozosta³e 2% przy-pada na trzy rezerwuary azotu:

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 263�283http://www.pm.microbiology.pl

264

� atmosferê, gdzie azot gazowy wystêpuje g³ównie w formie cz¹steczkowej (N2),lecz równie¿ jako podtlenek (N2O), tlenek (NO) i dwutlenek (NO2) azotu(3,9×1015 t);

� organizmy ¿ywe, w których azot wystêpuje jako sk³adnik zwi¹zków organicz-nych (ok. 1011 t);

� glebê, gdzie azot g³ównie wchodzi w sk³ad zwi¹zków organicznych podda-wanych mineralizacji, lecz wystêpuje równie¿ w postaci azotanów (NO3

�),azotynów (NO2

�) i jonów amonowych (NH4+) (ponad 3,0×1011 t) [33].

Równowagê reguluj¹c¹ okre�lony ilo�ciowy udzia³ poszczególnych zwi¹zkówazotu w jego ca³kowitej puli zapewnia szereg procesów, z których wiele przeprowa-dzanych jest przez mikroorganizmy. S¹ to:

� nitryfikacja � utlenianie jonów amonowych poprzez azotyny do azotanów,przeprowadzane przez grupê chemolitotrofów m.in. przez Nitrosomonas,Nitrosococcus, Nitrospira, Nitrobacter, Nitrococcus;

� denitryfikacja (oddychanie azotanowe) � beztlenowa redukcja azotanów po-przez azotyny do azotu cz¹steczkowego przebiegaj¹ca z uwolnieniem energii,przeprowadzana m.in. przez Pseudomonas denitrificans, Paracoccus denitri-ficans, Thiobacillus denitrificans, Pseudomonas aeruginosa;

� redukcja dysymilacyjna azotanów do jonów amonowych (bez uzyskiwaniaenergii), prowadzona m.in. przez Enterobacter czy Vibrio;

� asymilacja, czyli zamiana jonów amonowych w azot organiczny, wbudowy-wany w biomasê;

� amonifikacja, czyli enzymatyczna hydroliza organicznych zwi¹zków azotuz wydzieleniem jonów amonowych;

� biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego do jonów amonowych, prowadzo-na przez zró¿nicowane pod wzglêdem systematycznym bakterie, okre�lanewspólnym terminem �diazotrofy�.

Biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego jest niezwykle istotnym ogniwemw cyklu obiegu azotu w przyrodzie, poniewa¿ tylko niewielki u³amek nieorganicz-nych soli azotu znajduje siê w warstwie gleby dostêpnej dla organizmów ¿ywych.Równocze�nie ilo�æ azotu cz¹steczkowego przekszta³canego rocznie w formydostêpne dla wiêkszo�ci organizmów ¿ywych stanowi kilka procent ilo�ci azotuzawartej w tych organizmach. Aktywno�æ diazotrofów dostarcza znacznie wiêcejzwi¹zanego N2 (2,4×108 t rocznie) ni¿ ca³kowita produkcja przemys³u nawozówsztucznych (3,6×107 t rocznie) i redukcja abiotyczna (8×107 t rocznie), wiêc mo¿naprzyj¹æ, ¿e biologiczne wi¹zanie azotu jest obecnie g³ównym procesem utrzymuj¹-cym równowagê pomiêdzy ilo�ci¹ N2 a ilo�ci¹ NO3

� i NH4+. Dziêki biologicznej

redukcji N2 utrata azotu z gleby do atmosfery spowodowana denitryfikacj¹ niejest bezpowrotna, co pozwala na zachowanie w glebie zasobu nieorganicznych soliazotu dostêpnych dla ro�lin [5, 37, 43, 45, 73, 77].

Obserwowane obecnie proporcje pomiêdzy poszczególnymi procesami zwi¹za-nymi z obiegiem azotu nie by³y sta³e na przestrzeni dziejów Ziemi. Przypuszcza siê,¿e przed 2,2 mld lat przewa¿a³a abiotyczna redukcja N2 poprzez etap NO, która by³askutkiem wy³adowañ elektrycznych w atmosferze. Wi¹zanie biologiczne pojawi³o

265

siê jako reakcja na rosn¹ce zapotrzebowanie organizmów ¿ywych na zwi¹zki azotu,id¹ce w parze ze zmniejszeniem intensywno�ci wi¹zania abiotycznego [56]. Bior¹cpod uwagê istniej¹ce obecnie drogi przemian zwi¹zków azotu oraz ewolucjê atmo-sfery ziemskiej sugeruje siê, ¿e biologiczne wi¹zanie N2 jest ewolucyjnie najm³od-szym procesem, powsta³ym po (kolejno): amonifikacji, denitryfikacji (istniej¹cejprzed powstaniem atmosfery tlenowej) i nitryfikacji (wymagaj¹cej tlenu) [44].

2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne

Mikroorganizmy redukuj¹ce cz¹steczkowy azot atmosferyczny, spotyka siê za-równo w domenie Archea jak i w domenie Bacteria [7, 31]. W domenie Bacteria(Bakterie), mikroorganizmy wi¹¿¹ce azot grupuj¹ siê g³ównie w typach Proteo-bacteria (Bakterie w³a�ciwe), Cyanobacteria (Sinice) i Actinobacteria (Promie-niowce). W�ród zdolnych do redukcji N2 Proteobacteria spotykamy zarówno orga-nizmy tlenowe (Azotobacter, Klebsiella) [31, 50], jak i beztlenowe (Clostridium)[34, 52]. Diazotrofy wystêpuj¹ w�ród fotoautotrofów (Rhodospirillum, Rhodo-bacter) [41, 76], chemolitotrofów (Geobacter, Magnetospirillum) i heterotrofów(Burkholderia, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Azospirillum), czêsto egzy-stuj¹cych na powierzchni lub w zewnêtrznych warstwach tkanek ro�linnych [14,17, 22, 42]. Diazotroficzne sinice mog¹ byæ zarówno organizmami l¹dowymi,pochodz¹cymi z ró¿nych stref klimatycznych, jak i morskimi [59, 72, 97]. Wchodz¹w efektywn¹ symbiozê z ro�linami nale¿¹cymi do mchów (Bryopsida), w¹trobow-ców (Hepaticopsida), glewików (Anthocerophytina, np. Anthoceros), paprociowych(Pterophytina, np. Azolla), nagozal¹¿kowych sagowców (Cycadopsida, np. Cycas)i okrytozal¹¿kowych (Myrtales, np. Gunnera). Sinice tworz¹ zewn¹trzkomórkowesymbiozy z ró¿nymi ro�linami; wyj¹tek stanowi Nostoc tworz¹ca wewn¹trzko-mórkow¹ symbiozê z Gunnera. Wi¹zanie azotu u sinic zachodzi w specyficznychkomórkach tzw. heterocystach przystosowanych do ochrony labilnej nitrogenazyprzed tlenem [1, 10].

Zwi¹zek bakterii zdolnych do redukcji azotu cz¹steczkowego z eukariontamimo¿e przybieraæ czasem znacznie �ci�lejsze formy. Wówczas mikroorganizmy do-starczaj¹ce ³atwo przyswajalnych zwi¹zków azotu staj¹ siê endosymbiontami ro�linlub zwierz¹t (termitów) � jak niektóre Spirochaetales (krêtki) [39, 57, 58]. Symbio-za diazotrofów (Proteobacteria i Actinobacteria) z ro�linami zachodzi zazwyczajw obrêbie specjalnych organów ro�linnych � brodawek korzeniowych lub (rzadziej)brodawek ³odygowych [63, 80]. Wiêkszo�æ bakterii symbiotycznych to Gram-ujemnebakterie glebowe okre�lane ogólnym terminem �rizobiów�, wchodz¹ce w interakcjez licznymi gatunkami z rodziny Fabaceae = Leguminoseae (motylkowate) orazwyj¹tkowo z gatunkiem niemotylkowatej Parasponia z rodziny Ulmaceae (wi¹zo-wate) [79]. Promieniowce, Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Frankia s¹ znaczniemniej wyspecjalizowanymi endosymbiontami ni¿ rizobia [79]. Frankia jest sym-biontem wybranych gatunków z 8 rodzin ro�lin okrytozal¹¿kowych: Betulaceae(1 z 6 gatunków), Casuarinaceae (wszystkie 4 gatunki), Elaeagnaceae (wszystkie

266

3 gatunki), Myricaceae (2 z 3 gatunków), Rhamnaceae (7 z 55 gatunków), Rosaceae(5 ze 100 gatunków), Datiscaceae (1 z 3 gatunków) oraz Coriariaceae (1 gatunek).Jednak pomimo znacznie mniejszej liczby potencjalnych gospodarzy nie nale¿ylekcewa¿yæ ekologicznego znaczenia wariantu symbiozy realizowanego przezFrankia. Przyjmuje siê, ¿e ilo�æ N2 redukowanego w uk³adach z udzia³em promie-niowców dorównuje ilo�ci azotu przyswajanego przy udziale rizobiów [10].

3. Charakterystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu

Do nawi¹zania efektywnej symbiozy, w wyniku której nastêpuje redukcja azotuatmosferycznego, potrzebne s¹ dwa niezale¿ne dopasowane do siebie organizmy,czyli bakterie zdolne do wi¹zania N2 na poziomie znacznie przekraczaj¹cym ichzapotrzebowanie na ten pierwiastek oraz ro�liny, zapewniaj¹ce odpowiednie warunkidla tego procesu, tzn. beztlenowe �rodowisko i energiê konieczn¹ do przebiegureakcji redukcji azotu cz¹steczkowego.

Rhizobia (mikrosymbionty) zdolne do symbiotycznego wi¹zania N2 maj¹ funk-cjonalny kompleks enzymatyczny nitrogenazy redukuj¹cej N2 do NH3, kompletenzymów niezbêdnych do funkcjonowania szlaku biosyntezy chitolipooligosacha-rydów (czynników Nod) indukuj¹cych u ro�lin powstanie brodawek korzeniowych,odpowiednio zbudowane struktury powierzchniowe umo¿liwiaj¹ce ro�linom roz-poznanie bakterii oraz prawid³owo funkcjonuj¹ce mechanizmy kolonizacji korzenii hamowania reakcji obronnej ro�lin. Ro�linny partner symbiozy (makrosymbiont)posiada receptory umo¿liwiaj¹ce percepcjê bakteryjnych czynników Nod, sprawnemechanizmy reakcji na chitolipooligosacharydy pozwalaj¹ce na wytworzeniebrodawek, zestaw bia³ek pozwalaj¹cych bakteriom na kolonizacjê korzeni (nodu-liny buduj¹ce niæ infekcyjn¹) oraz bia³ka odpowiedzialne za zapewnienie mikro-aerofilnych warunków w brodawkach odpowiednich dla redukcji azotu (np. leghe-moglobiny czy bia³ka systemów transportu substancji bêd¹cych �ród³ami energiidla bakteroidów).

Nawi¹zywanie efektywnej symbiozy jest procesem wieloetapowym i precyzyj-nym [63, 80]. Rozpoczyna go wymiana sygna³ów pozwalaj¹ca na wzajemne roz-poznanie siê partnerów. Ro�liny wydzielaj¹ do ryzosfery szereg zwi¹zków flawono-idowych, które s¹ atraktantami dla zgodnych mikrosymbiontów, hamuj¹ wzrostkonkuruj¹cych z nimi bakterii oraz indukuj¹ za po�rednictwem bia³ka regulatoro-wego NodD ekspresjê bakteryjnych genów nod (ang. nodulation) odpowiedzialnychza brodawkowanie ro�lin. Mikrosymbionty ulegaj¹ adhezji do powierzchni w³o�ni-ków korzeniowych i produkuj¹ tzw. czynniki Nod (chitolipooligosacharydy, CLOS)� specyficzne morfogeny, które wywo³uj¹ zmiany morfologiczne we w³o�nikachkorzeniowych oraz indukuj¹ w korze korzenia powstawanie nowych merystemów.Bakterie s¹ odpowiedzialne za supresjê ro�linnych mechanizmów obronnych i zapo�rednictwem czynników Nod indukuj¹ nowe merystemy korzeni daj¹c pocz¹tekbrodawkom korzeniowym. Rizobia docieraj¹ do zawi¹zków brodawek w obrêbietubularnych struktur zwanych niæmi infekcyjnymi i zaka¿aj¹ brodawki. W zaka¿o-

267

nych brodawkach, bakterie otoczone ro�linnymi b³onami peribakteroidalnymi prze-kszta³caj¹ siê w bakteroidy zdolne do wi¹zania azotu dziêki ekspresji genów nif i fix(ang. nitrogen fixation) koduj¹cych bia³ka kompleksu enzymatycznego nitrogenazy.Struktury brodawki korzeniowej ro�liny zapewniaj¹ odpowiednie �rodowisko dlaprzebiegu procesu redukcji azotu [63, 80].

Proces ten przybra³ swój obecny kszta³t w wyniku trwaj¹cych przez co najmniejkilkadziesi¹t milionów lat prób dopasowania budowy i funkcjonowania organizmówgospodarzy i mikrosymbiontów. Ewolucja symbiozy doprowadzi³a do wypraco-wania mechanizmów wzajemnego rozpoznawania partnerów oraz obustronnego zre-dukowania tych mechanizmów lub cech, które mog³yby niekorzystnie wp³yn¹æna efektywno�æ procesu. Obecnie za� ewolucja symbiotycznego wi¹zania azotuwydaje siê przebiegaæ w kierunku poszerzania krêgu zarówno mikrosymbiontów,jak i ich ro�linnych gospodarzy.

4. Filogeneza gatunków ro�linnych gospodarzy

Na ogóln¹ liczbê 380 rodzin ro�lin okrytozal¹¿kowych, tylko 10 rodzin jestgospodarzami dla diazotroficznych symbiontów. Podanie zadawalaj¹cego wyja�nie-nia dla faktu pojawienia siê cech umo¿liwiaj¹cych nawi¹zanie symbiozy u tej w¹-skiej grupy ro�lin by³o niemo¿liwe przy stosowaniu tradycyjnej taksonomii opartejo klasyfikacjê morfologiczn¹. W tym systemie taksonomicznym ro�liny�gospodarzedla diazotrofów nie stanowi¹ jednej grupy, lecz s¹ rozproszone po ró¿nych, niezwi¹zanych ze sob¹ jednostkach systematycznych. Zastosowanie wspó³czesnejklasyfikacji opartej o analizê porównawcz¹ sekwencji genu rbcL koduj¹cego du¿¹podjednostkê chloroplastowej karboksylazy rybulozo-1,5- bisfosforanu pozwala nakonstrukcjê drzewa filogenetycznego (kladogramu) grupuj¹cego razem przedstawi-cieli 10 wspomnianych rodzin w obrêbie taksonu Ró¿owe-I (ang. Rosid-I clade),wywodz¹c je od wspólnego przodka [79]. Poniewa¿ nie wszystkie gatunki ro�linz ga³êzi ewolucyjnej Ró¿owe-I s¹ zdolne do nawi¹zywania symbiozy z mikroorga-nizmami, jedn¹ z jego podgrup, z³o¿on¹ w wiêkszo�ci z potencjalnych gospodarzy,okre�la siê mianem kladu wi¹¿¹cego azot (ang. nitrogen-fixing clade). Uwa¿a siê,¿e w przypadku pozosta³ych ro�lin z Ró¿owych-I utrata zdolno�ci do symbiotycz-nego wspó³¿ycia z bakteriami lub promieniowcami jest wtórna i mo¿e wynikaæz mutacji pojedynczych genów [11]. Klasyfikacja oparta o sekwencjê rbcL dowodzirównie¿, ¿e symbioza typu ro�lina-sinice (na przyk³adzie Gunnera-Nostoc) [65]to odmienny i ewolucyjnie bardzo odleg³y wariant tego zjawiska [79].

Poszukiwanie cech wspólnych ³¹cz¹cych ro�liny z grup potencjalnych gospoda-rzy dla wi¹¿¹cych azot symbiotycznych diazotrofów wykaza³y, ¿e istniej¹ równie¿inne, wspólne dla nich cechy genetyczne. Podobnie jak w przypadku rbcL, badaniesekwencji genów leghemoglobin ro�linnych, czy sekwencji ITS (ang. internal trans-cribed spacer) w obrêbie genów rDNA pozwoli³o na skonstruowanie drzew filogene-tycznych grupuj¹cych ro�liny zdolne do symbiozy w obrêbie blisko spokrewnionychtaksonów [86, 91].

268

5. Molekularne pod³o¿e predyspozycji ro�lin do tworzenia brodawek

Uwa¿a siê, ¿e predyspozycja ro�lin do tworzenia brodawek wynika z obecno�ciw ich genomie specyficznych genów regulatorowych. Mog¹ one kodowaæ bia³katakie jak np. Nmh7, NmhC5 czy Ngl9 w Medicago truncatula, które s¹ czynnikamitranskrypcyjnymi typu kaseta-MADS (skrót od nazw 4 genów ro�linnych dla czynni-ków transkrypcyjnych: mcm1, ap3, defA, srf) [25, 26, 100]. Bia³ka typu kaseta-MADSs¹ szeroko rozpowszechnione w�ród ro�lin. Uwa¿a siê, ¿e ich wszystkie obecniespotykane warianty wywodz¹ siê od prototypu obecnego u ro�lin przed rozdzie-leniem siê linii rozwojowych paproci i ro�lin nasiennych. W wyniku duplikacjipojedynczego genu oraz pó�niejszej ewolucji jego kopii u wspólnych przodkównago- i okrytonasiennych (ok. 340 mln lat temu) prawdopodobnie pojawi³a siêrodzina genów okre�lana mianem kwiatowych genów homeotycznych (ang. floralhomeotic genes), z której wywodz¹ siê wszystkie bardzo licznie spotykane wariantygenów bia³ek MADS [55]. Obecnie bia³ka tego typu funkcjonuj¹ jako czynnikitranskrypcyjne zaanga¿owane w rozwój kwiatów, i s¹ odpowiedzialne za skiero-wanie komórek na okre�lon¹ drogê ró¿nicowania [26]. Wyró¿nia siê w�ród nich2 podgrupy: bia³ka odpowiedzialne za cechy merystemów, z których rozwijaj¹ siêtkanki kwiatów, oraz bia³ka odpowiedzialne za wykszta³cenie poszczególnych cechkwiatów [25]. Prawdopodobnie pojawienie siê bia³ek typu kaseta-MADS orazrealizowanych przez nie mechanizmów regulacyjnych by³o warunkiem niezbêdnymdla wytworzenia przez ro�liny nowych organów � kwiatów [55]. Mo¿na przypusz-czaæ, ¿e dalsza ewolucja niektórych genów dla bia³ek MADS doprowadzi³a dopowstania nowych wariantów, takich jak np. bia³ka Nmh7, NmhC5, Ngl9, w przy-padku których dosz³o do zmiany miejsca ekspresji i utworzenia nowych meryste-mów korzenia oraz nowych organów indukowanych dzia³alno�ci¹ bakterii. Bezzmian pozosta³a natomiast zdolno�æ bia³ek typu kaseta-MADS do kierowaniaekspresj¹ innych genów, a przez to do sterowania programem rozwoju okre�lonegoorganu � brodawki korzeniowej.

Najwiêksz¹ adaptacjê w tym kierunku wykaza³y niektóre gatunki ro�lin z rodzi-ny motylkowatych. Badania Leguminoseae wykaza³y, ¿e w trakcie ewolucji w ichtrzech podrodzinach, tzn. Ceasalpinioideae (brezylkowate), Mimosoideae (mimo-zowate), oraz Papillionoideae (motylkowate w³a�ciwe) ró¿nie kszta³towa³a siê pre-sja selekcyjna zwi¹zana z wykszta³caniem siê cech pomocnych w nawi¹zywaniusymbiozy z diazotrofami. Zdolno�æ do symbiozy z rizobiami obserwuje siê u oko³o30% Ceasalpinioideae, podczas gdy u Mimosoideae oraz Papillionoideae, któreprawdopodobnie wyewoluowa³y z prymitywnych Ceasalpinioideae, ilo�æ gatunkówwchodz¹cych w symbiozê wynosi oko³o 90% ogólnej ich liczby [4].

Tworzenie brodawek wynikaj¹ce z regulacyjnej aktywno�ci czynników trans-krypcyjnych typu kaseta-MADS zale¿y równie¿ od obecno�ci bakterii i produkowa-nych przez nie zwi¹zków. Jednak w pewnych warunkach u ro�lin motylkowatychtakich jak lucerna czy koniczyna mo¿na zaobserwowaæ spontaniczne (przebiegaj¹cebez udzia³u bakterii) ukierunkowanie rozwoju zespo³ów komórek, prowadz¹ce dopowstania merystemów w korze korzenia lub struktur przypominaj¹cych brodawki

269

(tzw. pseudobrodawek). We wnêtrzu pseudobrodawek stwierdzono wystêpowaniedu¿ych ilo�ci amyloplastów oraz tkanek aktywnych w transporcie metabolitów.Przypuszcza siê, ¿e tego typu lub podobne struktury mog³y u przodków motylkowa-tych stanowiæ organy przechowywania skrobi, po czym zosta³y zaadaptowane donowych funkcji [2, 23, 47].

Szereg faktów przemawia za przyjêciem hipotezy, ¿e symbioza ro�liny�diazo-trofy jest szczególnym wariantem ogólnej predyspozycji ro�lin do wchodzeniaw symbiozê z innymi organizmami. Szacuje siê, ¿e oko³o 80% ro�lin l¹dowychjest zdolne do symbiozy z grzybami, czyli endomikoryzy. Jest to najstarszy typsymbiozy wykryty w skamienielinach ro�lin l¹dowych pochodz¹cych sprzed400 mln lat [66]. Istot¹ mikoryzy jest wymiana substancji mineralnych (g³ówniezwi¹zków fosforu) uzyskiwanych przez grzyby, na zwi¹zki wêgla produkowaneprzez ro�liny. Mikoryzê od symbiozy z udzia³em bakterii odró¿nia znacznie ni¿szaspecyficzno�æ oraz brak zdolno�ci do wywo³ywania precyzyjnie kontrolowanychzmian w tkankach ro�linnych. Istnieje jednak wiele cech wspólnych mikoryzy i sym-biozy: stymulacja kie³kowania spor i rozwoju grzybni przez flawonoidy, adhezjai penetracja tkanek ro�linnych, wymiana substancji od¿ywczych, brak indukcjisilnych reakcji obronnych u gospodarza [27]. W wyniku zaka¿enia ro�lin przezgrzyby mikoryzowe obserwuje siê wzrost aktywno�ci genów zaanga¿owanychw procesy odporno�ciowe ro�lin, jednak jest to indukcja na bardzo ograniczon¹ ska-lê podobnie jak w przypadku infekcji Rhizobium [70]. Symbioza i mikoryza maj¹czê�ciowo nak³adaj¹cy siê program genetyczny, co oznacza, ¿e istnieje zwi¹zekpomiêdzy zdolno�ci¹ do tworzenia efektywnych brodawek a zdolno�ci¹ do nawi¹-zywania mikoryzy u okre�lonych ro�lin. Mutanty ro�lin motylkowatych niezdolnedo brodawkowania lub tworz¹ce brodawki defektywne mog¹ byæ równie¿ niezdolnedo wchodzenia w symbiozê z grzybami [70, 75]. Badania funkcjonuj¹cych w ko-mórkach ro�linnych szlaków transmisji sygna³ów wykaza³y, ¿e za percepcjê sygna-³ów wysy³anych przez bakteryjne lub grzybowe mikrosymbionty odpowiedzialnes¹ te same bia³ka ro�linne, takie jak SYMRK (ang. symbiosis receptor-like kinase)wystêpuj¹ca u Lotus japonicus (komonica) lub NORK (ang. nodulation receptorkinase) obecna w komórkach Medicago (lucerna) i Pisum (groch). Kinazy te zlo-kalizowane s¹ w b³onie komórkowej i przypuszczalnie pe³ni¹ funkcjê receptoradla bakteryjnych czynników Nod [15, 83]. Prawdopodobnie mechanizmy funkcjo-nuj¹ce w mikoryzie zosta³y zaadaptowane i zmodyfikowane do formy obecnieobserwowanej w przypadku symbiozy ro�lin i diazotrofów. U³atwieniem dla ewolu-cji nowego procesu mog³a byæ obecno�æ ro�lin, grzybów i bakterii we wspólnym�rodowisku, niekiedy przejawiaj¹ca siê jako endosymbioza bakterii wi¹¿¹cych azotw organizmach grzybów [51].

Podsumowuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e zdolno�æ ro�lin do nawi¹zywania symbiozyz bakteriami, manifestuj¹ca siê morfologicznie jako zdolno�æ do tworzenia brodawekprzeznaczonych do zasiedlenia przez bakterie, jest mo¿liwa u gatunków wykazuj¹-cych szereg okre�lonych cech fizjologicznych. Mo¿na do nich zaliczyæ zdolno�æ dosyntezy leghemoglobin, czynników transkrypcyjnych typu kaseta-MADS oraz wieluinnych, dotychczas nieznanych bia³ek. Wiadomo jednak, ¿e ich wystêpowanie jest

270

skorelowane z obecno�ci¹ okre�lonych wariantów genów rbcL, leghemoglobin, czysekwencji ITS, co wskazuje na istnienie wspólnej filogenetycznie linii rozwojowejdla tego typu ro�lin.

6. Filogeneza rizobiów

Podobnie jak ro�liny, które s¹ gospodarzami dla wi¹¿¹cych azot mikrosymbion-tów, równie¿ rizobia nie stanowi¹ z punktu widzenia systematyki jednolitej grupyo wspólnej filogenezie. Metody klasyfikacji oparte o podobieñstwo sekwencji ge-nów 16S rDNA (koduj¹cego 16S rRNA) umieszczaj¹ zdecydowan¹ wiêkszo�æ wi¹-¿¹cych azot bakterii symbiotycznych w obrêbie rodziny Rhizobiaceae (Rys. 1) [99].Okre�la siê je równie¿ mianem ga³êzi Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium(ang. Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium branch), nale¿¹c¹ wraz z trzema

Rys. 1. Drzewo filogenetyczne Rhizobiaceae oparte na sekwencji 16S rDNA wykonane metod¹�najbli¿szego s¹siedztwa� (ang. neighbor-joining) [wg. 99]

271

pozosta³ymi ga³êziami � Bradyrhizobium, Azorhizobium i Methylobacterium do pod-klasy " Proteobacteria. Bakteryjne endosymbionty ro�lin spotyka siê równie¿ w�ródgatunków zaliczanych do podklasy $ Proteobacteria. S¹ to niektóre szczepy Burk-holderia, znajduj¹ce siê tam obok wi¹¿¹cych N2 niesymbiotycznych Herbaspirillumi Azoarcus [29, 53]. Niewykluczone, ¿e w miarê postêpu badañ odkrywane bêdziecoraz wiêcej ewolucyjnie odleg³ych od siebie gatunków bakterii zdolnychdo nawi¹zania efektywnej symbiozy z ro�linami. Nale¿y bowiem pamiêtaæ, ¿e dotej pory scharakteryzowano mikrosymbionty dla zaledwie 10% z 750 istniej¹cychrodzajów ro�lin motylkowatych [53, 87].

Sekwencja genu koduj¹cego 16S rRNA nie jest jedynym kryterium, na podstawiektórego mo¿na tworzyæ drzewa filogenetyczne (dendrogramy) bakterii. Jako referen-cyjne wykorzystuje siê równie¿ geny takie jak 23S rDNA [88], czy geny syntetazyglutaminowej (GS) [64]. Wykorzystanie wszystkich trzech wymienionych genów dajew zasadzie podobne wyniki, potwierdzaj¹c ugruntowan¹ pozycjê systematyczn¹ wiêk-szo�ci gatunków rizobiów. Obserwowane niewielkie ró¿nice, pojawiaj¹ce siê w przy-padku opierania klasyfikacji o ró¿ne geny s¹ nie do unikniêcia, ze wzglêdu na ró¿netempo ewolucji tych genów; obserwuje siê je nawet w przypadku definiowania jedno-stek taksonomicznych w oparciu o ró¿ne fragmenty tego samego genu [13].

Niezale¿nie od wyboru genu u¿ytego w celach taksonomicznych, przeprowadzo-ne badania wykazuj¹, ¿e bakterie symbiotyczne zdolne do wi¹zania azotu w komór-kach ro�lin nale¿¹ do kilku ró¿nych, czasem bardzo od siebie ewolucyjnie odle-g³ych linii rozwojowych. Dlatego uwa¿a siê, ¿e zdolno�æ do indukowania brodaweki wi¹zania w nich azotu wyp³ywaj¹ca z faktu posiadania przez bakterie genówbrodawkowania nod i genów nitrogenazy nif ma niewiele wspólnego z pozycj¹systematyczn¹ poszczególnych gatunków bakterii, okre�lan¹ na podstawie analizysekwencji genów takich jak 16S rDNA.

7. Ewolucja kompleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy czynników Nod

Kompleks nitrogenazy sk³ada siê z homodimeru metaloproteiny Fe o masie cz¹st.oko³o 60 kDa (kodowanej przez gen nifH) oraz tetrameru metaloproteiny Mo-Fe ("2$2)o masie oko³o 240 kDa (kodowanych przez geny nifD i nifK) [32]. Do ekspresjii dzia³ania nitrogenazy wymagana jest ponadto obecno�æ kilkunastu bia³ek, kodo-wanych przez geny nif i tworz¹cych operony. Takie operony wraz z towarzysz¹cymiim jednostkami monocistronowymi mog¹ byæ zgrupowane w obrêbie wydzielonegoregionu genetycznego po³o¿onego na plazmidzie lub chromosomie lub lokowaæ siêw ró¿nych, odleg³ych od siebie miejscach chromosomu stanowi¹c regulon [50, 69,84, 85]. Przypuszcza siê, ¿e istnienie wielu genów nif jest skutkiem ewolucji proto-typu genu nitrogenazy powsta³ego u wspólnych przodków Archea i Bacteria [36].Duplikacje i dywergencja poszczególnych jego kopii prawdopodobnie spowodowa³apowstanie genów nifH oraz operonów nifDK i nifEN [18]. Z kolei ewolucja genównifDK doprowadzi³a do powstania nowych wariantów kompleksu metaloprotein

272

Mo-Fe, w których dosz³o do wymiany molibdenu na wanad (metaloproteina V-Fe,kodowana przez geny vnfDK, spotykana u Azotobacter saliestris, A. chroococcumczy Anabaena variabilis), lub do utraty zdolno�ci wi¹zania atomów dwu ró¿nychmetali na korzy�æ wy³¹czno�ci ¿elaza (metaloproteina Fe, kodowana przez genyanfDK, spotykana u Clostridium pasteurianum, Rhodobacter capsulatus, Rhodo-spirillum rubrum czy Azomonas macrocytogenes) [31, 32, 41, 76]. Obecnie spotykasiê trzy g³ówne typy nitrogenaz, przy czym mo¿liwe jest wystêpowanie dwóch ró¿-nych izoform enzymu w komórkach jednego szczepu bakterii [40, 41, 76]. Zakreswystêpowania poszczególnych typów nitrogenaz w populacjach bakteryjnychw znacznej czê�ci zale¿y od zjawiska poziomego transferu genów [7].

Czynniki Nod (chitolipooligosacharydy) s¹ g³ównymi czynnikami bakteryjnymiwyzwalaj¹cymi u ro�lin mechanizm brodawkowania. Poszczególne rodzaje czynni-ków Nod produkowane przez ró¿ne szczepy rizobiów mog¹ wykazywaæ znaczneró¿nice dotycz¹ce ich struktury jak równie¿ zakresu reaguj¹cych na nie ro�lin. Tymniemniej wszystkie zbudowane s¹ z oligosacharydowego rdzenia i przy³¹czonych doniego podstawników, do których zawsze nale¿y reszta d³ugo³añcuchowego nienasyco-nego kwasu t³uszczowego [49]. Istniej¹ przes³anki wskazuj¹ce, ¿e szlak biosyntezytego typu zwi¹zków móg³ powstaæ dziêki modyfikacji szlaku biosyntezy zwi¹zkówwchodz¹cych w sk³ad struktur powierzchniowych bakterii, takich jak np. BF-7 z gru-py diglikozylodiacylogliceroli (DGDG). Prawdopodobnie z powodu ró¿nic w struktu-rze chemicznej, BF-7 nie wywo³uje tak rozleg³ych zmian w tkankach ro�lin jak CLOS,tym niemniej jego synteza jest powi¹zana z syntez¹ czynników Nod [60]. Przyk³adBF-7 mo¿e wyja�niaæ mechanizm zmian prowadz¹cych do syntezy zwi¹zków sekre-cyjnych o charakterze morfogenów (chitolipooligosacharydy) w wyniku ewolucjiszlaków biosyntezy zwi¹zków buduj¹cych struktury powierzchniowe bakterii.

Analiza sekwencji genów nod (nodA, nodC, nodD) ujawni³a, ¿e ich ewolucja prze-biega³a wspólnie (jako ca³ych zespo³ów), lecz z ró¿nie ukierunkowan¹ presj¹ selek-cyjn¹ [91]. W przypadku tzw. genów wspólnych nod (ang. common nod genes), spo-tykanych u wszystkich rizobiów, presja selekcyjna zapewni³a zachowanie wzglêdniedu¿ej konserwatywno�ci sekwencji. W przypadku genów nod okre�laj¹cych specy-ficzno�æ gospodarza (ang. host specifity nod genes) presja selekcyjna innego rodzajupozwoli³a na wyewoluowanie wielu nowych genów, których wystêpowanie ograni-czone jest do niewielkiej liczby szczepów. Poniewa¿ w wyniku ekspresji genów nodbakterie tworz¹ lipooligosacharydowe morfogeny przeznaczone do dzia³ania nakomórki i tkanki �ci�le okre�lonego gatunku ro�lin, dlatego struktura tych zwi¹zkówmusi byæ dopasowana do mo¿liwo�ci percepcyjnych okre�lonych ro�lin. Dziêki temubakterie ró¿nych gatunków wchodz¹ce w symbiozê z tym samym gospodarzem[np. w uk³adzie Phaseolus (fasola) � Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, R. etli,R. gallicum czy Sinorhizobium sp. (Phaseolus)] wykazuj¹ bardzo wysokie podobieñ-stwo sekwencji swoich genów nod [35]. Równie¿ mikrosymbionty ro�lin zbli¿onychpod wzglêdem fizjologicznym (tworz¹cych podobny typ brodawek) wykazuj¹ bliskiepokrewieñstwo genów nod, rizobia zasiedlaj¹ce brodawki typu niezdeterminowanegoR. leguminosarum bv. viciae, bv. trifolii i S. meliloti, czy obecne w brodawkach typuzdeterminowanego R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91].

273

8. Geny nod-nif: jednostka genetyczna o odrêbnej filogenezie

Geny nif oraz geny nod stanowi¹ region genomu rizobiów, zlokalizowany naj-czê�ciej na jednym z plazmidów, nazwanym �symbiotycznym� (pSym). Szacuje siê,¿e wystêpuje 45 typów zespo³ów genów nod oraz 41 typów grup genów nif, daj¹-cych w sumie ponad 50 typów �zespo³ów genów symbiotycznych� [35]. Drzewafilogenetyczne rizobiów konstruowane w oparciu o sekwencje genów nod lub nif s¹do siebie zbli¿one. Jednocze�nie obserwuje siê du¿e rozbie¿no�ci przy porównaniuich do dendrogramów tworzonych w oparciu o sekwencje genów takich jak genykoduj¹ce 16S rRNA, 23S rRNA czy syntetazê glutaminow¹ (GS). Grupowaniegatunków mikrosymbiontów na podstawie homologii regionu nod-nif jest w wyso-kim stopniu zgodne z grupowaniem ich ro�linnych gospodarzy opartym o analizêsekwencji genów leghemoglobin, genu rbcL czy sekwencji ITS. Pozwala to nastwierdzenie, ¿e istot¹ ewolucji procesu symbiozy rizobia � ro�liny motylkowatejest dopasowanie siê fenotypów ro�lin i fenotypów bakterii bêd¹cych wynikiemdzia³ania okre�lonych zestawów genów nod-nif. Pozosta³a czê�æ genomu bakteriipe³ni w tym procesie raczej drugoplanow¹ rolê [10, 86, 91].

9. Rozprzestrzenianie siê �grup genów symbiotycznych�

Obecno�æ regionu nod-nif w genomach odleg³ych ewolucyjnie gatunków bakte-rii glebowych wynika z pionowego lub poziomego mechanizmu przekazywania ze-spo³u tych genów. Badania populacyjne dowiod³y, ¿e w przekazywaniu i rekombi-nacji materia³u genetycznego u rizobiów preferencyjnie wykorzystywana jest �ci�leokre�lona strategia [3, 20, 46, 48, 71, 82]. Jej charakterystycznymi cechami s¹:

� du¿e potencjalne mo¿liwo�ci przekazywania materia³u genetycznego na dro-dze koniugacji (do 40% materia³u genetycznego rizobiów znajduje siê w plaz-midach);

� wysoka czêsto�æ rekombinacji wynikaj¹ca z wystêpowania sekwencji inser-cyjnych, sekwencji powtórzonych i zduplikowanych genów (ang. reiterratedgenes);

� wystêpowanie zjawiska przesuniêcia równowagi sprzê¿eñ miêdzy genami(sprzê¿enia niezrównowa¿one) (ang. linkage disequilibrium) pozwalaj¹cegona nieprzypadkowe segregowanie alleli, co prowadzi do powstania kilku od-rêbnych linii w populacji;

� sporadyczna wymiana materia³u genetycznego pomiêdzy liniami/gatunkami;� swobodna wymiana genetyczna w obrêbie linii/gatunku.Poziomy transfer genów, czêsto zlokalizowanych na plazmidach i przekazy-

wanych za ich po�rednictwem, obserwowany pomiêdzy liniami (czy gatunkami)zdarza siê wprawdzie niezbyt czêsto [78, 94], lecz mo¿e mieæ szczególne znaczeniew przypadku drastycznej zmiany warunków ¿ycia mikroorganizmów lub spotkaniadwu do tej pory nie kontaktuj¹cych siê linii/gatunków. W takich warunkach mo¿ewydatnie pomóc w wygenerowaniu nowego fenotypu, potrzebnego do zasiedle-nia nowych terenów lub gospodarzy [95]. O du¿ym znaczeniu koniugacyjnego

274

przekazywania plazmidu symbiotycznego dla rozprzestrzeniania siê w populacjachbakteryjnych zdolno�ci do wchodzenia w efektywn¹ symbiozê z ro�linami motylko-watymi �wiadcz¹ takie zjawiska jak:

� uderzaj¹ce podobieñstwo genów wspólnych nod w grupie obejmuj¹cej R. legu-minosarum bv. trifolii, bv. viciae i S. meliloti, jak równie¿ obserwowanew grupie skupiaj¹cej m.in. R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91];

� wystêpowanie tego samego plazmidu pSym, pochodz¹cego z R. leguminosa-rum bv. trifolii, w komórkach R. tropici i S. meliloti, zajmuj¹cych tê sam¹ coR. leguminosarum bv. trifolii niszê ekologiczn¹ [78];

� badania genetyczne nad Rhizobium galegae wykazuj¹ce, ¿e jest to prawdopo-dobnie Agrobacterium (podobieñstwo sekwencji 16S rDNA) wyposa¿onyw region symbiotyczny nod-nif rizobiów szybkorosn¹cych (R. leguminosarumbv. trifolii, bv. viciae czy S. meliloti) [86];

� symbiotyczne wi¹zanie azotu przez Methylobacterium nodulans, Burkholde-ria sp. STM678 i STM815 czy Ensifer adhaerens, bêd¹ce wynikiem nabyciaprzez te bakterie genów nod i nif [53, 68, 87].

Przeniesienie plazmidu symbiotycznego czêsto oznacza dla jego biorcy ca³kowi-t¹ zmianê behawioru � np. zmianê z patogena lub z bakterii ¿ywi¹cej siê innymibakteriami w symbionta ro�lin [68, 86]. Z drugiej strony stwierdzono, ¿e niektóre zcech bakterii opisywanych jako charakterystyczne dla patogena (a nie dla rizobiów)utrzymuj¹ siê tak¿e u symbiotycznych rizobiów, jak np. synteza opin (typowa dlakomórek ro�linnych zaka¿onych przez Agrobacterium) obserwowana w brodawkachkorzeniowych indukowanych przez S. meliloti [54]. W genomie bakterii z rodzajuRhizobium stwierdzono równie¿ wystêpowanie genów koduj¹cych bia³ka nale¿¹cedo III systemu sekrecyjnego (ang. type III secretion system, TTSS) [62, 93].W sk³ad tego systemu wchodzi ca³y szereg bia³ek pozwalaj¹cych mikroorganizmomna infekcjê komórek eukariotycznych, dlatego bia³ka TTSS wystêpuj¹ powszechnieu wielu bakteryjnych patogenów ro�lin i zwierz¹t [21, 92]. Na przyk³adzie bakteryj-nych endosymbiontów owadów wykazano, ¿e prowadz¹ce do mutualizmu zacie-�nianie symbiozy jest skorelowane z postêpuj¹c¹ redukcj¹ III systemu sekrecyjnego� od zmniejszania aktywno�ci transkrypcyjnej genów koduj¹cych bia³ka TTSS poca³kowit¹ ich utratê [8]. Mo¿na wiêc przypuszczaæ, ¿e gatunki rizobiów uwa¿aneobecnie za �typowe� i �modelowe� (jak np. Sinorhizobium meliloti), to bakteriedawniej saprofityczne lub patogenne dla ro�lin, a zmiana ich behawioru na dosto-sowany do warunków symbiozy nast¹pi³a stosunkowo niedawno w porównaniu doczasu ewolucji gatunków bakterii.

Uwa¿a siê, ¿e wystêpuj¹ce obecnie geny nod i nif maj¹ monofiletyczne pocho-dzenie. Rizobia nale¿¹ce do linii ewolucyjnej, w której po raz pierwszy pojawi³ siêzespó³ genów nod-nif otrzyma³y go w wyniku pionowego transferu genów, a rizobianale¿¹ce do linii, które uleg³y dywergencji przed pojawieniem siê zespo³u genównod-nif jako integralnej ca³o�ci, naby³y go w wyniku transferu poziomego. Ponie-wa¿ proces ten trwa nadal, nale¿y spodziewaæ siê, ¿e grupa bakterii okre�lanychmianem rizobiów bêdzie wzbogaca³a siê wci¹¿ o nowe gatunki, powsta³e w sposóbnaturalny [53, 86, 87] lub sztuczny [68].

275

Przekazywanie plazmidów pSym nie jest jedyn¹ drog¹ rozprzestrzeniania siêgenów symbiotycznych w populacjach bakteryjnych. Na chromosomach szczepówMesorhizobium loti spotyka siê regiony DNA o wielko�ci oko³o 500�600 kb, zawie-raj¹ce m.in. geny nod, nif oraz geny odpowiedzialne za syntezê biotyny, kwasunikotynowego i tiaminy, którego przekazanie do szczepu nieefektywnego w sym-biozie powoduje jego zmianê w szczep efektywny. Region ten nazwany zosta³wysp¹ symbiotyczn¹ (ang. symbiosis island), ze wzglêdu na uderzaj¹ce podobieñ-stwo do opisanych wcze�niej wysp patogeniczno�ci (ang. pathogenicity islands)wystêpuj¹cymi u bakterii chorobotwórczych. Podobnie jak wyspy patogeniczno�ci,równie¿ wyspy symbiotyczne charakteryzuje szereg specyficznych cech jak ró¿naod reszty chromosomu zawarto�æ par G/C, mo¿liwo�æ przemieszczania siê nadrodze rekombinacji wynikaj¹ca z obecno�ci sekwencji IS i genów koduj¹cychbia³ka homologiczne do integraz fagowych oraz przenoszenie zestawu genówpowoduj¹cych gwa³town¹ zmianê fenotypu biorcy umo¿liwiaj¹c¹ kolonizowanieorganizmu tkankowego [84, 85].

10. Bakterie i ro�liny � ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ

Badania filogenezy poszczególnych linii ewolucyjnych zarówno mikro- jak i ma-krosymbiontów sugeruj¹, ¿e powstanie poszczególnych gatunków rizobiów znaczniewyprzedzi³o ewolucjê gatunków ich ro�linnych gospodarzy. Uwa¿a siê, ¿e dywer-gencja pomiêdzy Bradyrhizobium a rizobiami szybkorosn¹cymi (Rhizobium, Sino-rhizobium) nast¹pi³a 500�550 mln lat temu, po czym 200�300 mln lat temu dosz³odo wyodrêbnienia poszczególnych gatunków rizobiów szybkorosn¹cych. Z drugiejstrony rozdzia³ ro�lin na jedno- i dwuli�cienne zarysowa³ siê prawdopodobnie150�170 mln lat temu, a wyodrêbnienie siê ro�lin motylkowatych zasz³o oko³o120�130 mln lat temu. Dopiero ten fakt pozwoli³ na szybk¹ ewolucjê regionu genównod-nif, opart¹ o ich jednoczesne rozprzestrzenianie siê w istniej¹cych gatunkach bak-terii i dopasowywanie ich funkcji do postêpuj¹cej ewolucji ro�lin motylkowatych [90].

Istniej¹ równie¿ dowody przemawiajace na korzy�æ hipotezy, która zak³adaistnienie znacznie starszych powi¹zañ bakterii � przodków rizobiów z eukarionta-mi. Analiza sekwencji wspomnianego ju¿ genu syntetazy glutaminowej wykaza³a,¿e enzym ten, uwa¿any za bardzo dobry �zegar molekularny� pozwalaj¹cy na od-tworzenie jego ewolucji do oko³o 2,5 mld lat wstecz, wystêpuje w dwóch ró¿nychformach: GSI i GSII. Forma GSI spotykana jest w komórkach bakterii, GSII w ko-mórkach eukariontów, a oba typy enzymu razem jedynie w komórkach Rhizobium.Filogeneza GSI rizobiów jest zgodna z filogenez¹ ich 16S rRNA. Brak zgodno�cifilogenezy GSII z filogenez¹ 16S rRNA pozwala na przypuszczenie, ¿e rizobiaotrzyma³y ten gen od eukariontów na drodze poziomego transferu, i mia³o to miejsceoko³o 1,2 mld lat temu. Byæ mo¿e ju¿ wtedy dochodzi³o do tworzenia zwi¹zkówpomiêdzy zdolnymi do redukcji azotu przodkami dzisiejszych rizobiów i prymi-tywnymi organizmami eukariotycznymi [64, 90], chocia¿ nie by³a to symbiozarealizowana w brodawkach korzeniowych.

276

11. ��lepe uliczki ewolucji� � zjawisko niezgodno�ci uniemo¿liwiaj¹ce nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a ro�linami motylkowatymi

Symbioza pomiêdzy diazotrofami i ro�linami istnieje dziêki predyspozycji ro�lindo reakcji na bakteryjne morfogeny, prowadz¹cej do wytworzenia brodawek, orazdziêki wykorzystaniu zdolno�ci rizobiów do kolonizacji tkanek ro�linnych i reduk-cji azotu atmosferycznego. W uk³adach symbiotycznych pomiêdzy rizobiami a ro-�linami motylkowatymi zazwyczaj dochodzi do zrealizowania obu tych aktywno�ci.Tym niemniej opisano szereg przyk³adów wskazuj¹cych, ¿e w obrêbie gatunku,pomiêdzy poszczególnymi szczepami bakteryjnymi lub odmianami ro�lin istniej¹drobne, lecz istotne ró¿nice genetyczne, uniemo¿liwiaj¹ce nawi¹zanie efektywnejsymbiozy. Przyk³adami takiego zjawiska mog¹ byæ:

� oporno�æ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup (koniczyna �ródziemno-morska) na zaka¿enie przez R. leguminosarum bv. trifolii ANU794 [9];

� oporno�æ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup na zaka¿enie przez R. legu-minosarum bv. trifolii TA1, prawdopodobnie spowodowana wystêpowaniempojedynczego genu ro�linnego oraz genu nodM w genomie bakterii [38];

� oporno�æ Pisum sativum cv. Afghanistan (groch zwyczajny) posiadaj¹cegounikalny allel sym2A, na zaka¿enie szczepami pozbawionymi genu nodX [28];

� utrata zdolno�ci grochu do efektywnej symbiozy z naturalnym endosymbion-tem R. leguminosarum bv. viciae TOM, w przypadku zmiany ilo�ci produko-wanych przez ten szczep specyficznych morfogenów [28];

� oporno�æ odmian Vicia faba (bób) posiadaj¹cych allele sym-2 i sym-3 na zaka-¿enie przez niektóre szczepy takie jak R. leguminosarum bv. viciae St48 czySt53 [16];

� istnienie niezgodno�ci uniemo¿liwiaj¹cej zaka¿enie izolowanych geograficz-nie odmian Medicago truncatula okre�lonymi szczepami Sinorhizobium meli-loti (brak mo¿liwo�ci wzajemnej wymiany gospodarzy i mikrosymbiontów po-chodz¹cych z ró¿nych siedlisk) [89];

� zjawisko fenotypowego zró¿nicowania populacji Amphicarpaea (gospodarzaBradyrhizobium) i jego mikrosymbionta [96], zale¿ne od zdolno�ci do pro-dukcji rizobiotoksyny przez Bradyrhizobium i wra¿liwo�ci/oporno�ci na rizo-biotoksynê w ró¿nych odmianach i populacjach ro�lin [12, 61].

Wymienione przypadki niezgodno�ci dotycz¹ce okre�lonych odmian ro�lini szczepów bakteryjnych kontrastuj¹ z ogóln¹ zgodno�ci¹ obserwowan¹ na pozio-mie gatunków. Niezgodno�ci te wynikaj¹ z obecno�ci lub braku pojedynczychgenów lub ich alleli, a zasiêg zjawiska ogranicza siê do wybranych populacji danegogatunku. Z tego powodu populacje ro�linne ró¿nicuje siê na niewyspecjalizowanepod wzglêdem symbiotycznym (ang. symbiotic generalists), nawi¹zuj¹ce symbiozêz wiêkszo�ci¹ szczepów danego gatunku bakterii, oraz na symbiotycznie wyspecja-lizowane (ang. symbiotic specialists), wchodz¹ce w symbiozê jedynie z wybranymiszczepami. Z kolei w przypadku bakterii wyró¿nia siê o szczepy o szerokim za-kresie gospodarza (ang. broad host range), zaka¿aj¹ce wiêkszo�æ populacji danegogatunku ro�lin, ró¿ne gatunki a nawet rodzaje ro�lin. Natomiast mianem szczepów

277

o w¹skim zakresie gospodarza (ang. narrow host range), okre�la siê szczepy zaka¿a-j¹ce jedynie niewielk¹ liczbê odmian danego gatunku lub pojedyncze gatunki ro�lin.Zjawisko niezgodno�ci obserwowane jest najczê�ciej w przypadku zetkniêcia siêbakteryjnego szczepu o w¹skim zakresie gospodarza z symbiotycznie wyspecjalizo-wan¹ odmian¹ ro�lin [96].

12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu � perspektywy

Zdolno�æ rizobiów do kolonizacji tkanek ro�linnych i przeprowadzania w nichredukcji azotu atmosferycznego nie ogranicza siê do gatunków rodziny Legumi-noseae zdolnych do tworzenia brodawek. Obecno�æ diazotrofów wi¹¿¹cych azotatmosferyczny stwierdzono równie¿ w tkankach korzeni ro�lin motylkowatych nie-zdolnych do tworzenia brodawek [4]. Ponadto zarejestrowano szereg przypadkówkolonizacji przez rizobia korzeni ro�lin spoza rodziny Leguminoseae. Stwierdzono:

� obecno�æ R. leguminosarum bv. trifolii na powierzchni korzeni pszenicy czykukurydzy [74];

� kolonizacjê korzeni ry¿u przez R. leguminosarum bv. trifolii [67, 98];� obecno�æ Rhizobium etli w tkankach kukurydzy [24];� symbiozê pomiêdzy ro�linami ry¿u a Bradyrhizobium [6].Efekt kolonizacji uzale¿niony jest od wspó³dzia³ania danego szczepu bakteryjnego

i okre�lonej odmiany ro�lin. Decyduj¹c¹ rolê odgrywa fakt d³ugotrwa³ego bytowa-nia ro�lin i potencjalnych bakteryjnych endosymbiontów we wspólnym �rodowisku.W przypadku Rhizobium i ry¿u bakterie mog¹ wystêpowaæ w przestworach miêdzy-komórkowych oraz w zlizowanych komórkach gospodarza, co wywo³uje indukcjêreakcji obronnych ro�lin, manifestuj¹cych siê jako wytwarzanie pogrubionych �ciancelulozowych w komórkach kory korzenia [67]. W przypadku d³ugiego i powtarzane-go kontaktu R. leguminosarum bv. trifolii z ro�linami ry¿u (np. wskutek stosowaniap³odozmianu ry¿ � koniczyna) mo¿na doprowadziæ do sytuacji, w której bakterie staj¹siê endosymbiontami ry¿u [98]. Podobny mechanizm obserwuje siê w uk³adzie R. etli� kukurydza, który wyewoluowa³ w wyniku d³ugotrwa³ego stosowania w bezpo�red-nim s¹siedztwie upraw fasoli i kukurydzy [24]. Z kolei zdolno�æ Bradyrhizobium dosymbiozy z wybranymi odmianami ry¿u pojawi³a siê w wyniku dostosowania bakteriido wspó³¿ycia z dzikimi odmianami ry¿u (Oryza brevilingulata) spotykanymi na tychsamych terenach co Aeschynomene (naturalny symbiont fotosyntetyzuj¹cych brady-rizobiów) [19], po czym zdolno�æ ta zosta³a zaadaptowana do potrzeb uk³adu Brady-rhizobium � uprawne odmiany ry¿u (Oryza glaberriana) [6].

W wiêkszo�ci opisywanych przypadków bakterie s¹ endosymbiontami wspo-magaj¹cymi wzrost ro�lin (ang. PGPR, plant growth promoting rhizobacteria), niedostarczaj¹cymi gospodarzom zwi¹zków azotu [24, 98]. Jednak w pewnych oko-liczno�ciach diazotrofy kolonizuj¹ce korzenie ro�lin niezdolnych do wytworzeniabrodawek s¹ zdolne do redukcji N2 przeznaczonego na potrzeby ro�lin [6, 29, 30].

Obserwowane dynamiczne przystosowywanie siê rizobiów do kolonizacji sys-temów korzeniowych i nawi¹zywania symbiozy z nowymi gatunkami ro�lin jest

278

wyra�nym przyk³adem ukazuj¹cym ci¹g³o�æ procesu ewolucji i powszechno�æ adap-tacji gatunków do zmieniaj¹cych siê warunków �rodowiskowych. Byæ mo¿e jeste�-my �wiadkami kolejnego rozszerzania zasiêgu uk³adu symbiotycznego z udzia³emro�lin i diazotrofów � tym razem o ro�liny jednoli�cienne [29, 81]. Jednak na raziemusi pozostaæ bez odpowiedzi pytanie o koñcowy (ewolucyjnie stabilny) efekt tychprocesów � czy dojdzie do wytworzenia struktur analogicznych do brodawek korze-niowych np. u ro�lin zbo¿owych, czy te¿ bêdzie to symbioza realizowana w innychni¿ brodawki zespo³ach tkanek ro�linnych.

Podsumowanie

Proces biologicznego wi¹zania azotu pojawi³ siê na Ziemi ponad 2 mld lat temu.Od tego czasu ulega ci¹g³ej ewolucji, podobnie jak wci¹¿ ewoluuj¹ mikroorganizmyredukuj¹ce azot cz¹steczkowy. Zjawisko to doprowadzi³o do powstania licznychodmian procesu biologicznego wi¹zania azotu.

Najstarsz¹ form¹ wi¹zania azotu jest niesymbiotyczna redukcja N2 wystêpuj¹cau wolno¿yj¹cych archebakterii, sinic i bakterii w³a�ciwych. Ewolucja l¹dowych ro�linnasiennych i ich powszechna predyspozycja do wchodzenia w symbiozê z mikro-organizmami, szczególnie z grzybami, pozwoli³a na powstanie bardzo wydajnychuk³adów symbiotycznych z udzia³em ro�lin i bakterii.

Wytworzenie prawid³owo funkcjonuj¹cych uk³adów symbiotycznych wymagazaanga¿owania informacji genetycznej pochodz¹cej z trzech odrêbnych, posiadaj¹-cych w³asn¹ filogenezê �róde³: genomu ro�linnego, genomu bakteryjnego i regionunod-nif. Spo�ród nich najaktywniej wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ (poprzez interakcje fenoty-pów) genom ro�linny i region nod-nif, natomiast genom bakteryjny odgrywa drugo-planow¹ rolê. Region nod-nif jest bardzo mobilny, a dziêki mo¿liwo�ci poziomegotransferu grupa diazotroficznych mikrosymbiontów ro�lin wci¹¿ siê powiêksza.

Pi�miennictwo

1. Bergman B., Matveyev A., Rasmussen U.: Chemical signalling in cyanobacterial-plant symbio-ses. Trends Plant Sci. 1, 191�197 (1996)

2. Blauenfeldt J., Joshi P.A., Gresshoff P.M., Caetano-Anollés G.: Nodulation of white clover(Trifolium repens) in the absence of Rhizobium. Protoplasma, 179, 106�110 (1994)

3. Brom S., de los Santos A.G., de Lourdes-Girard, Davilla G., Palacios R., Romero D.: High--frequency rearrangements in Rhizobium leguminisarum bv. trifolii plasmids. J. Bacteriol. 173,1344�1346 (1991)

4. Bryan J.A., Berlyn G.P., Gordon J.C.: Toward a new concept of the evolution of symbiotic nitro-gen fixation in the Leguminoseae. Plant Soil, 18, 151�159 (1996)

5. Burris R.H., Roberts G.P.: Biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Nutr. 13, 317�335 (1993)6. Chaintreuil C., Giraud E., Prin Y., Lorquin J., Bâ A., Gillis M., de Lajudie P., Dreyfus B.: Photo-

synthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata. Appl.Environ. Microbiol. 6, 5437�5447 (2000)

7. Chien Y.T., Auerbuch V., Brabban A.D., Zinder S.H.: Analysis of genes encoding an alternativenitrogenase in the archaeon Methanosarcina barkeri 227. J. Bacteriol. 182, 3247�3253 (2000)

279

8. Dale C., Plague G.R., Wang B., Ochman H., Moran N.A.: Type III secretion system and the evo-lution of mutualistic endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12397�12402 (2002)

9. de Boer M.H., Djordjevic M.A.: The inhibition of infection thread development in the cultivar-specific interaction of Rhizobium and subterranean clover is not caused by a hypersensitiveresponse. Protoplasma, 185, 58�71 (1995)

10. Doyle J.J.: Phylogenetic perspectives on nodulation: evolving views of plants and symbiotic bac-teria. Trends Plant Sci. 3, 473�478 (1998)

11. Doyle J.J., Doyle J.L., Ballenger J.A., Dickson E.E., Kajita T., Ohashi H.: A phylogeny of thechloroplast gene rbcL in the Leguminoseae: taxonomic correlations and insights into the evolu-tion of nodulation. Am. J. Bot. 84, 541�554 (1997)

12. Duodu S., Bhuvaneswari T.V., Stokkermans T.J.W., Peters N.K.: A positive role for rhizobio-toxine in Rhizobium-legume symbiosis. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 1082�1089 (1999)

13. Eardly B.D., Wang F.S., van Berkum P.: Corresponding 16S rRNA gene segments in Rhizobiaceaeand Aeromonas yield discordant phylogenies. Plant Soil, 186, 69�74 (1996)

14. Elbeltagy A., Nishioka K., Sato T., Suzuki H., Ye B., Hamada T., Isawa T., Mitsui H., Minami-sawa K.: Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolatedfrom wild rice species. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5285�5293 (2001)

15. Endre G., Kereszt A., Kevei Z., Mihacea S., Kalo P., Kiss B.G.: A receptor kinase gene regulatingsymbiotic nodule development. Nature, 417, 962�966 (2002)

16. Esser-Mönning K., Roskothen P., Röbbelen G.: Two host genes in Vicia faba for nodulation deffi-ciency with strain specifity for Rhizobium leguminosarum. Plant Bred. 114, 363�365 (1995)

17. Estrada-De Los Santos P., Bustillos-Cristales R., Caballero-Mellado J.: Burkholderia, a genusrich in plant � associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution.Appl. Environ. Microbiol. 67, 2790�2798 (2001)

18. Fanni R., Gallo R., Lio P.: Molecular evolution of nitrogen fixation: the evolutionary history ofthe nifD, nifK, nifE and nifN genes. J. Mol. Evol. 51, 1�11 (2000)

19. Fleischman D., Kramer D.: Photosynthetic rhizobia. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 17�36 (1998)20. Flores M., Gonzalez V., Pardo M.A., Leija A., Martínez E., Romero D., Piñero D., Dávila G.,

Palacios R.: Genomic instability in Rhizobium phaseoli. J. Bacteriol. 170, 1191�1196 (1988)21. Foultier B., Troisfontaines P., Muller S., Opperdoes F.R., Cornelis G.R.:Characterization of the

ysa pathogenicity locus in the chromosome of Yersinia enterocolitica and phylogeny analysis oftype III secretion system. J. Mol. Evol. 55, 37�51 (2002)

22. Fuentes-Ramirez L.E., Bustillos-Critales R., Tapia-Hernandez A., Jimenez-Salgado T., Wang E.T.,Martinez-Romero E., Caballero-Mellado J.: Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria, Glu-konacetobacter johannae sp. nov. and Glukonacetobacter azotocaptans sp. nov., associated withcoffee plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1305�1314 (2001)

23. Grosjean C., Huguet T.: A persistent meristem is formed in nodular structures elicited by Nodfactor or by a Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutant in alfalfa plants which nodulatespontaneously. Plant Sci. 127, 215�225 (1997)

24. Gutirrez-Zamora M.L., Martinez-Romero E.: Natural endophytic association between Rhizobiumetli and maize (Zea mays L.). J. Biotechnol. 91, 117�126 (2001)

25. Heard J., Caspi M., Dunn K.: Evolutionary diversity of symbiotically induced nodule MADS-boxgenes: characterization of nmhC5, a member of a novel subfamily. Mol. Plant-Microbe Interact.10, 665�676 (1997)

26. Heard J., Dunn K.: Symbiotic induction of a MADS-box gene during development of alfalfa rootnodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5273�5277 (1995)

27. Hirsch A., Kapulnik Y.: Signal transduction pathways in mycorrhizal associations: comparisonswith the Rhizobium-legume symbiosis. Fungal Genet. Biol. 23, 205�212 (1998)

28. Hogg B., Davies A.E., Wilson K.E., Bisseling T., Downie A.: Competitive nodulation blocking ofcv. Afghanistan pea is related to high levels of nodulation factors made by some strains of Rhizo-bium leguminosarum bv. viciae. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, 60�68 (2002)

29. Hurek T., Handley L.L., Reinhold-Hurek B., Piche Y.: Azoarcus grass endophytes contributes fixednitrogen to the plant in an unculturable state. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, 233�242 (2002)

280

30. James E.K.: Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crops Research,65, 197�209 (2000)

31. Kessler P.S., McLarnan J., Leigh J.A.: Nitrogenase phylogeny and the molybdenum dependenceof nitrogen fixation in Methanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 179, 541�543 (1997)

32. Kim J., Rees D.C.: Nitrogenase and biological nitrogen fixation. Biochemistry, 33, 389�397 (1994)33. Krug E.C., Winstanley D.: The need for comprehensive and consistent treatment of the nitrogen

cycle in nitrogen cycling and mass balance studies: I. Terrestial nitrogen cycle. Sci. Total Environ.293, 1�29 (2002)

34. Kuhner C.H., Matthies C., Acker G., Schmittroth M., Gossner A.S., Drake H.L.: Clostridiumakagii sp. nov. and Clostridium acidisoli sp. nov.: acid-tolerant, N

2-fixing clostridia isolated from

acidic forest soil and litter. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 873�881 (2000)35. Laguerre G., Nour S.M., Macheret V., Sanjuan J., Drouin P., Amarger N.: Classification of rhizo-

bia based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic relationship amongPhaseolus vulgaris symbionts. Microbiology, 147, 981�993 (2001)

36. Leigh J.A.: Nitrogen fixation in methanogenes: the archaeal perspective. Curr. Issues Mol. Biol.2, 125�131 (2000)

37. Levine J.S., Augustsson T.R., Anderson I.C., Hoell J.M. Jr.: Troposferic sources of NOx: lightning

and biology. Atmos. Environ. 18, 1797�1804 (1984)38. Lewis-Henderson W.R., Djordjevic M.A.: A cultivar-specific interaction between Rhizobium

leguminosarum bv. trifolii and subterranean clover is controlled by nodM, other bacterial cultivarspecificity genes, and a single recessive host gene. J. Bacteriol. 173, 2791�2799 (1991)

39. Lilburn T.G., Kim K.S., Ostrom N.E., Byzek K.R., Leadbetter J.R., Breznak J.A.: Nitrogen fixa-tion by symbiotic and free-living spirochetes. Science, 292, 2495�2498 (2001)

40. Loveless T.M., Bishop P.E.: Identification of genes unique to Mo-independent nitrogenase sys-tems in diverse diazotrophs. Can. J. Microbiol. 45, 312�317 (1999)

41. Loveless T.M., Saah J.R., Bishop P.E.: Isolation of nitrogen-fixing bacteria containing molybde-num-independent nitrogenases from natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4223�4226(1999)

42. Magalhaes Cruz L., de Souza E.M., Weber O.B., Baldani J.I., Dobereiner J., Pedrosa Fde O.: 16Sribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp.)and pineapple (Ananas comosus (L.) Merril). Appl. Environ. Microbiol. 67, 2375�2379 (2001)

43. Mancinelli R.L.: The nature of nitrogen: an overview. Life Support Biosph. Sci. 3, 17�24 (1996)44. Mancinelli R.L., McKay C.P.: The evolution of nitrogen cycling. Orig. Life Evol. Biosph. 18,

311�325 (1988)45. Mandermack K.W., Kinney C.A., Coleman D., Huang Y.S., Freeman K.H., Bogner J.: The bio-

geochemical controls of N2O production and emission in landfill cover soils: the role of methano-

trophs in the nitrogen cycle. Environ. Microbiol. 2, 298�309 (2000)46. Maynard Smith J., Smith N.H., O�Rourke M., Spratt B.G.: How clonal are bacteria? Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 90, 4384�4388 (1993)47. McIver J., Djordjevic M.A., Weinman J.J., Rolfe B.G.: Influence of Rhizobium leguminosarum

bv. trifolii host specific nodulation genes on the ontogeny of clover nodulation. Protoplasma,172, 166�179 (1993)

48. Mercado-Blanco J., Toro N.: Plasmids in rizobia: the role of nonsymbiotic plasmids. Mol. Plant-Microbe Interact. 9, 535�545 (1996)

49. Mergaert P., van Montagu M., Holsters M.: Molecular mechanisms for Nod factor diversity. Mol.Microbiol. 25, 811�817 (1997)

50. Merrick M.J.: Nitrogen control of the nif regulon in Klebsiella pneumoniae: involvement of thentrA gene and analogies between ntrC and nifA. EMBO J. 2, 39�44 (1983)

51. Minerdi D., Fani R., Gallo R., Boarino A., Bonfante P.: Nitrogen fixation genes in endosymbioticBurkholderia strain. Appl. Environ. Microbiol. 67, 725�732 (2001)

52. Monserrate E., Leschine S.B., Canale-Parola E.: Clostridium hungatei sp. nov., a mesophilic,N

2-fixing cellulolytic bacterium isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 123�132 (2001)

281

53. Moulin L., Munive A., Dreyfus B., Boivin-Masson C.: Nodulation of legumes by members of$-subclass of Proteobacteria. Nature, 411, 948�950 (2001)

54. Murphy P.J., Heycke N., Banfalvi Z., Tate M.E., de Brujin F., Kondorosi A., Tempe J., Schell J.:Genes for catabolism and synthesis of an opine-like compound in Rhizobium meliloti are closelylinked and on the Sym plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 493�497 (1987)

55. Münster T., Pahnke J., di Rosa A., Kim J.T., Martin W., Saedler H., Theissen G.: Floral homeoticgenes were recruited from homologous MADS-box genes preexisting in the common ancestor offerns and seed plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2415�2420 (1997)

56. Navarro-Gonzalez R., McKay C.P., Mvondo D.N.: A possible nitrogen crisis for Archaean lifedue to reduced nitrogen fixing by lightning. Nature, 412, 61�64 (2001)

57. Noda S., Ohkuma M., Usami R., Horikoshi K., Kudo T.: Culture-independent characterization ofa gene responsible for nitrogen fixation in the symbiotic microbial community in the gut of thetermite Neotermes koshunensis. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4935�4942 (1999)

58. Ohkuma M., Noda S., Kudo T.: Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the symbioticmicrobial community in the gut of diverse termites. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4926�4934(1999)

59. Olson J.B., Steppe T.F., Litaker R.W., Paerl H.W.: N2-fixing microbial consortia associated with

the ice cover of Lake Bonney, Antarctica. Microb. Ecol. 36, 231�238 (1998)60. Orgambide G.G., Philip-Hollingsworth S., Hollingsworth R.I., Dazzo F.B.: Flavone-enhanced

accumulation and symbiosis-related biological activity of a diglycosyl diacylglicerol membraneglycolipid from Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. J. Bacteriol. 176, 4338�4347 (1994)

61. Parker M.A., Peters N.K.: Rhizobiotoxine production and symbiotic compatibility of Brady-rhizobium from Asian and North American lineages of Amphicarpaea. Can. J. Microbiol. 47,889�894 (2001)

62. Perret X., Freiberg C., Rosenthal A., Broughton W.J., Fellay R.: High-resolution transcriptionalanalysis of the symbiotic plasmid of Rhizobium sp. NGR234. Mol. Microbiol. 32, 415�425 (1999)

63. Perret X., Staehlin C., Broughton W.: Molecular basis of symbiotic promiscuity. Microbiol. Mol.Biol. Rev. 64, 180�201 (2000)

64. Pesole G., Bozzetti M.P., Lanave C., Preparata G., Saccone C.: Glutamine synthetase gene evolu-tion: a good molecular clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 522�526 (1991)

65. Rasmussen U., Johansson C., Renglin A., Petersson C., Bergman B.: A molecular characteriza-tion of the Gunnera-Nostoc symbiosis: comparison with Rhizobium- and Agrobacterium-plantinteractions. New Phytol. 133, 391�398 (1996)

66. Remy W., Taylor T.N., Hass H., Kerp H.: Four hundred-million-year-old vesicular arbuscularmycorrhizae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11841�11843 (1994)

67. Reddy P.M., Ladha J.K., So R.B., Hernandez R.J., Ramos M.C., Angeles O.R., Dazzo F.B., deBrujin F.J.: Rhizobial communication with rice roots: induction of phenotypic changes, mode ofinvasion and extent of colonization. Plant Soil, 194, 81�98 (1997)

68. Rogel M.A., Hernández-Lucas I., Kuykendall L.D., Balkwill D.L., Martinez-Romero E.: Nitro-gen-fixing nodules with Ensifer adhaerens harboring Rhizobium tropici symbiotic plasmids. Appl.Environ. Microbiol. 67, 3264�3268 (2001)

69. Romero D., Davilla G., Palacios R.: The dynamic genome of Rhizobium. (w:) Bacterial genomes:physical structure and analysis. Chapman & Hall, Int. Thomson Publ. 1998

70. Ruiz-Lozano J.M., Roussel H., Gianinazzi S., Gianinazzi-Pearson V.: Defense genes are differen-tially induced by a mycorrhizal fungus and Rhizobium sp. in wild-type and symbiosis-defectivepea genotypes. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 976�984 (1999)

71. Saleena L.M., Loganathan P., Rangarajan S., Nair S.: Genetic diversity of Bradyrhizobium strainsisolated from Arachis hypogaea. Can. J. Microbiol. 47, 118�122 (2001)

72. Sanudo-Wilhelmy S.A., Kustka A.B., Gobler C.J., Hutchins D.A., Yang M., Lwiza K., Burns J.,Capone D.G., Raven J.A., Carpenter E.J.: Phosphorus limitation of nitrogen fixation by Tricho-desmium in the central Atlantic Ocean. Nature, 411, 66�69 (2001)

73. Schlegel H.G.: Mikrobiologia ogólna. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2000

282

74. Schloter M., Wiehe W., Assmus B., Steindl H., Becke H., Höflich H., Hartmann A.: Root coloni-zation of different plants by plant-growth-promoting Rhizobium leguminosarum bv. trifolii R39studied with monospecific polyclonal antisera. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2038�2046 (1997)

75. Shirtliffe S.J., Vessey J.K.: A nodulation (Nod+/Fix�) mutant of Phaseolus vulgaris L. has nodule-like structures lacking peripheral vascular bundles (Pvb�) and is resistant to mycorrhizal infection(Myc�). Plant Sci. 118, 209�220 (1996)

76. Siemann S., Schneider K., Drottboom M., Muller A.: The Fe-only nitrogenase from Rhodobactercapsulatus: a coparative study on the redox properties of metal clusters present in the dinitro-genase components. Eur. J. Biochem. 269, 1650�1661 (2002)

77. Singleton P.: Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa2000

78. Sivakumaran S., Lockhart P.J., Jarvis B.D.W.: Identification of soil bacteria expressing a symbio-tic plasmid from Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Can. J. Microbiol. 43, 164�177 (1997)

79. Soltis D.E., Soltis P.S., Morgan D.R., Swensen S.M., Mullin B.C., Dowd J.M., Martin P.G.:Chloroplast gene sequence data suggest a single origin of the predisposition for symbiotic nitro-gen fixation in angiosperms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2647�2651 (1995)

80. Spaink H.P.: Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annu. Rev.Microbiol. 54, 257�88 (2000)

81. Steenhoudt O., Vanderleyden J.: Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closelyassociated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 24,487�506 (2000)

82. Stêpkowski T., Legocki A.B.: Reduction of bacterial genome size and expansion resulting fromobligate intracellular lifestyle and adaptation to soil habitat. Acta Biochim. Polon. 48, 367�381(2001)

83. Stracke S., Kistner C., Yoshida S., Mulder L., Sato S., Kaneko T., Tabata S., Sandal N., StiugaardJ., Szczyglowski K., Parniske M.: A plant receptor-like kinase required for both bacterial andfungal symbiosis. Nature, 417, 959�962 (2002)

84. Sullivan J.T., Ronson C.W.: Evolution of rhizobia by acquisiting of a 500-kb symbiosis islandthat integrates into a phe-tRNA gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5145�5149 (1998)

85. Sullivan J.T., Trzebiatowski J.R., Cruickshank R.W., Gouzy J., Brown D.S., Elliot R.M.,Fleetwood D.J., McCallum N.G., Rossbach U., Stuart G.S., Weaver J.E., Webby R.J., de Brujin F.J.,Ronson C.W.: Comparative sequence analysis of the symbiosis island of Mesorhizobium loti strainR7A. J. Bacteriol. 184, 3086�3095 (2002)

86. Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L., Lindström K.: Identification and structure of Rhizo-bium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer. Mol. Biol. Evol.18, 907�916 (2001)

87. Sy A., Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., de Laudje P., Prin Y., Neyra M., Gillis M.,Boivin-Masson C., Dreyfus B.: Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fixnitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol. 183, 214�220 (2001)

88. Tesfaye M., Petersen D.J., Holl F.B.: Comparison of partial 23S rDNA sequences from Rhizo-bium species. Can. J. Microbiol. 43, 526�533 (1997)

89. Trichine L., de Billy F., Huguet T.: Mtsym6, a gene conditioning Sinorhizobium strain-specificnitrogen fixation in Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 845�851 (2000)

90. Turner S.L., Young P.W.: The glutamine synthetases of Rhizobia: phylogenetics and evolutionaryimplications. Mol. Biol. Evol. 17, 309�319 (2000)

91. Ueda T., Suga Y., Yahiro N., Matsuguchi T.: Phylogeny of Sym plasmids of rhizobia by PCR-based sequencing of a nodC segment. J. Bacteriol. 177, 468�472 (1995)

92. Van Sluys M.A., Monteiro-Vitorello C.B., Camargo L.E., Menck C.F., da Silva A.C., Ferro J.A.,Oliveira M.C., Setubal J.C., Kitajima J.P., Simpson A.J.: Comparative genomic analysis of plant-associated bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 40, 169�189 (2002)

93. Viprey V., del Greco A., Golinowski W., Broughton W.J., Perret X.: Symbiotic implications oftype III protein secretion machinery in Rhizobium. Mol. Microbiol. 28, 1381�1389 (1998)

283

94. Wernergreen J.J., Harding E.E., Riley M.A.: Rhizobium gone native: unexpected plasmid stabi-lity of indigenous Rhizobium leguminosarum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5483�5488 (1997)

95. Wernegreen J.J., Riley M.A.: Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and house-keeping loci: a case for the genetic coherence of rhizobial lineages. Mol. Biol. Evol. 16, 98�113(1999)

96. Wilkinson H.H., Parker M.A.: Symbiotic specialization and the potential for genotypic coexi-stence in a plant-bacterial mutualism. Oecologia, 108, 361�367 (1996)

97. Wong F.C., Meeks J.C.: Establishment of a functional symbiosis between the cyanobacteriumNostoc punctiforme and the bryophyte Anthoceros punctatus requires genes involved in nitro-gen control and initiation of heterocyst differentiation. Microbiology, 148, 315�323 (2002)

98. Yanni Y.G., Rizk R.Y., Corich V., Squartini A., Ninke K., Philip-Hollingsworth S., Orgambide G.,de Brujin F., Stolzfus J., Buckley D., Schmidt T.M., Mateos P.F., Ladha J.K., Dazzo F.B.: Naturalendophytic association between Rhizobium leguminosarum bv. trifolii and rice roots and assssmentof its potential to promote rice growth. Plant Soil, 194, 99�114 (1997)

99. Young J.M., Kuykendall L.D., Martinez-Romero E., Kerr A., Sawada H.: A revision of Rhizo-bium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species ofAgrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combina-tion: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubri, R. undicola and R. vitis. Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 51, 89�103 (2001)

100. Zuchcero J.C., Caspi M., Dunn K.: ngl9: a third MADS-box gene expressed in alfalfa root nodu-les. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 1463�1467 (2001).

Praca wykonana ze �rodków Komitetu Badañ Naukowychw ramach grantu badawczego nr 6 PO4A 058 18.Zak³ad Mikrobiologii OgólnejInstytut Mikrobiologii i BiotechnologiiUniwersytetu Marii Curie-Sk³odowskiejul. Akademicka 19, 20-033 Lublin

Wp³ynê³o w styczniu 2003 r.

285

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 285�300http://www.pm.microbiology.pl

ORGANIZACJA, FUNKCJAI FILOGENEZA BAKTERYJNEGO

SYSTEMU NAPRAWYB£ÊDNIE SPAROWANYCH ZASAD W DNA

Adam Jaworski, Liliana Serweciñska, Pawe³ St¹czek

1. Wprowadzenie. 2. Ogólna organizacja i funkcja systemu MMR. 3. Charakterystyka genów i bia³eknaprawczych uk³adu MMR. 4. Udzia³ systemu MMR w innych, molekularnych procesach komórko-wych. 5. System MMR w �wietle osi¹gniêæ genomiki bakterii

Organization, function and phylogeny of the DNA mismatch repair system in bacteria

Abstract: The postreplication mismatch repair system (MMR) is evolutionarily conserved and stabi-lizes the cellular genome by correcting DNA replication errors. The methyl-directed Mut HSL path-way is able to recognize and repair all base-base mismatches (except C/C) and small insertion/dele-tion mismatches that arise during DNA replication. The MMR enzymes protect the cell against muta-tions as well as interspecies recombination, whereas the SOS response increases both. There is thewide range of effects that MMR can exert ; the VSP (Very Short Pathway) and TCR (Transcription-Coupled Nucleotide-Excision Repair) systems of Escherichia coli are strongly stimulated orsupported by the MMR factors MutS and MutL but not by MutH. MMR factors are required for therepair of mismatches in heteroduplex DNA that form as a result of interspecies recombinationbetween divergent DNA sequences. In addition, MutH,S,L proteins play an important role inrearragement of chromosomal DNA subsequent to strand-slippage mutagenesis of tandemly repeatedsequences, and can act to prevent interchromosomal exchanges between homologous DNAs. Themultiple homologues of bacterial MutS and MutL exist in eukaryotes but play different roles inthe MMR pathway or in recombination.

1. Introduction. 2. General organization and function of MMR system. 3. Characteristics of genesand repair proteins of MMR. 4. Contribution of MMR to the other molecular processes in the cell.5. MMR system in the light of bacterial genomics achievements

1. Wprowadzenie

Filogenetyczny rozwój wszystkich organizmów ¿ywych, w tym bakterii, jest de-terminowany okre�lonym stanem równowagi miêdzy aktywno�ci¹ komórkowychmechanizmów utrzymuj¹cych integralno�æ genomów a tempem mutacji wprowa-dzanych przez zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowe czynniki mutagenne, które nieprze-rwanie dzia³aj¹c na materia³ genetyczny ka¿dej komórki, z jednej strony generuj¹dostateczny stopieñ zmienno�ci mutacyjnej i fizjologicznej, konieczny dla adaptacjido ró¿norodnych warunków �rodowiska, z drugiej za� zagra¿aj¹ prawid³owemufunkcjonowaniu organizmów w tym¿e �rodowisku [1, 2, 20, 93].

Zmiany strukturalne i przestrzenne DNA spowodowane dzia³aniem mutagenówmog¹ polegaæ miêdzy innymi na pojawieniu siê pêkniêæ w jednej lub obydwu niciachtego polimeru, modyfikacjach zasad purynowych i pirymidynowych, powstawaniu

286

miejsc AP (apurynowych i apirymidynowych), adduktów, usieciowanych regionówDNA, pojedynczych i wiêkszych niesparowañ zasad w dupleksie DNA. Uszkodzeniate nie usuniête w porê mog¹ mieæ daleko id¹ce konsekwencje biologiczne dla komór-ki, bowiem bezpo�rednio lub po�rednio prowadz¹ do zmiany informacji genetycznej,a w efekcie do zaburzenia prawid³owego przebiegu procesów komórkowych.

Ogromna ró¿norodno�æ mutagenów i mo¿liwych zmian w budowie i w struktu-rze przestrzennej DNA ma swoje odzwierciedlenie zarówno w z³o¿ono�ci bia³eki enzymów naprawczych jak i w ró¿norodno�ci mechanizmów komórkowych odpo-wiedzialnych za naprawê b³êdów i uszkodzeñ DNA. Mo¿na powiedzieæ, i¿ nie matakiego uszkodzenia czy aberracji strukturalnej DNA, które nie by³oby rozpoznawa-ne przez odpowiednie bia³ka i naprawiane w okre�lonym szlaku metabolicznym.Jedne z tych mechanizmów s¹ wysoce specyficzne i zdolne do naprawy tylko �ci�leokre�lonego rodzaju zmian strukturalnych w DNA (np. Base Excision Repair, BER),inne za� bardziej uniwersalne, usuwaj¹ szereg ró¿norodnych uszkodzeñ (NucleotideExcision Repair, NER). Zró¿nicowanie bakteryjnych mechanizmów naprawy DNApolega tak¿e i na tym, i¿ w niektórych przypadkach funkcjê naprawcz¹ spe³nia jednookre�lone bia³ko w jednoetapowym procesie, podczas gdy w innych w naprawieuczestniczy wiele czynników, wype³niaj¹cych �ci�le okre�lone funkcje w szeregunastêpuj¹cych po sobie reakcji i etapów [22].

Ze wzglêdu na molekularne mechanizmy usuwania uszkodzeñ i b³êdów DNA,ró¿norodne szlaki mo¿na najogólniej podzieliæ na 4 g³ówne klasy:

� naprawy bezpo�redniej (ang. Direct Damage Repair, DDR), kiedy to zmianyw DNA s¹ w pe³ni odwracalne w stosunkowo prostej reakcji enzymatycznej,

� naprawy rekombinacyjnej (ang. Recombinational Repair, RER), kiedy w na-prawê uszkodzonej nici zaanga¿owany jest mechanizm homologicznej rekom-binacji,

� naprawy przez wycinanie (ang. Excision Repair), gdy uszkodzony odcinekpojedynczej nici w okre�lonym regionie DNA jest rozpoznawany i wycinany,a powsta³a luka w dupleksie DNA jest de novo syntetyzowana na matrycydrugiej, nie uszkodzonej nici,

� naprawy uszkodzeñ DNA zwi¹zanych z indukcj¹ bakteryjnego systemu SOS,który cechuje siê znacz¹c¹ mutagenno�ci¹ [2, 22].W ka¿dej z wy¿ej wymienionych 4 klas mo¿na wyró¿niæ po kilka subklas,

ze wzglêdu na ich strukturalne zró¿nicowanie i wype³nian¹ funkcjê. Przyk³ademmo¿e byæ wymieniony wy¿ej sposób naprawy uszkodzeñ DNA przez wycinanie(Excision Repair), który ze wzglêdu na biologiczne funkcje mo¿na podzieliæ na:

� szlak naprawy przez wycinanie uszkodzonych lub zmodyfikowanych zasadazotowych (ang. Base Excision Repair, BER),

� system naprawy uszkodzeñ DNA przez wycinanie nukleotydów (ang. Nucle-otide Excision Repair, NER),

� system naprawy b³êdnie sparowanych zasad w DNA (ang. Methyl-DirectedMismatch Repair System lub Mismatch Excision Repair, MMR) [2, 20, 22, 93]

Bia³ka naprawcze systemu MMR oraz mechanizm rozpoznawania i naprawianianiesparowanych zasad w DNA, zosta³y najpe³niej scharakteryzowane w komórkach

287

Escherichia coli, Salmonella enterica sv. Typhimurium i Streptococcus pneumoniae[29, 36, 39, 62, 75], znacznie mniej natomiast wiadomo o genach i bia³kach szlakuMMR w komórkach innych bakterii. Z uwagi na fakt, i¿ do chwili obecnej poznanope³n¹ sekwencjê nukleotydow¹ genomów 64 gatunków bakterii z grup Gram-dodat-nich, Gram-ujemnych, wewn¹trzkomórkowych paso¿ytów oraz ekstremalnychhalofili i termofili, mo¿liwym sta³y siê tak¿e porównawcze badania taksonomicznetego wa¿nego systemu naprawy DNA w komórkach ró¿nych, filogenetycznie od-leg³ych rodzajów bakterii, w tym nale¿¹cych do królestwa Archea (www.tigr.org).

2. Ogólna organizacja i funkcja szlaku MMR

B³êdnie sparowane zasady w dupleksie DNA mog¹ byæ naprawiane przez trzyró¿ne systemy E. coli: w krótkim szlaku naprawy (ang. Very Short Path, VSP),w szlaku zale¿nym od bia³ka MutY (ang. MutY-dependent Repair) oraz na drodzezale¿nej od metylotransferazy Dam (ang. Dam-Directed DNA Mismatch Repair,DDMR lub Methyl-Directed Mismatch Repair, MMR). Dwa pierwsze systemycharakteryzuje �ci�le okre�lona specyficzno�æ substratowa, bowiem rozpoznaj¹w dupleksie DNA niesparowania, odpowiednio TG i AG, trzeci z nich, MMR, mo¿erozpoznawaæ i naprawiaæ 11 z 12 teoretycznie mo¿liwych niekomplementarno�ci,bowiem nie rozpoznaje jedynie niesparowania typu CC. Najefektywniej naprawianes¹ niekomplementarno�ci G:T, A:C, A:A i G:G. Co wiêcej, bia³ka tego systemurozpoznaj¹ i usuwaj¹ pêtle (ang. loops) powstaj¹ce w dupleksie DNA, kiedy niespa-rowania obejmuj¹ do 4 par zasad [62, 75].

Poznanie w latach 70-tych i 80-tych strukturalnej organizacji i biologicznej funk-cji szlaku MMR E. coli, przedstawionego schematycznie na rys. 1, zwi¹zanejest z pracami wielu o�rodków naukowych, w szczególno�ci z odkryciami PaulaM o d r i c h � a i wsp. z Duke University [40, 49, 61].

W komórkach Enterobacteriacae DNA jest w pe³ni metylowany przez metylazêDam, która rozpoznaje sekwencjê docelow¹ d(GATC) i metyluje adeninê w pozycjiN6. Metylaza Dam i proces metylacji spe³niaj¹ w komórkach E. coli i bakterii po-krewnych wiele wa¿nych funkcji, jak inicjacja replikacji, regulacja transpozycji, regu-lacja ekspresji genów [7, 10, 75]. Jedn¹ z dodatkowych funkcji tej metylazy jest �ukie-runkowanie� systemu MMR na naprawê b³êdów replikacji w nowosyntetyzowanejnici DNA. DNA bezpo�rednio po replikacji jest w stanie hemimetylowanym, to zna-czy, i¿ wszystkie docelowe sekwencje d(GATC) s¹ zmetylowane w nici matrycowej,za� w nowo syntetyzowanej nici potomnej pozostaj¹ przez krótki czas nie zmetylo-wane. Zatem metylaza Dam niejako naznacza niæ rodzicielsk¹ DNA, kieruj¹c w tensposób aktywno�æ systemu MMR na nowosyntetyzowan¹ niæ potomn¹ [40, 61, 62].

Jedno z bia³ek naprawczych, MutS, rozpoznaje b³êdy replikacji wprowadzane doDNA przez replisom i wi¹¿e siê do tych regionów dupleksu DNA, w których znajduj¹siê niesparowane zasady [68, 81, 82]. Drugi czynnik, MutL, tworzy kompleksz bia³kiem Mut S, który po przy³¹czeniu do regionów o niesparowanych zasadachpowoduje ich wypêtlenie i w nastêpnej fazie naprawy aktywacjê bia³ka Mut H [26].

288

To ostatnie nacina nowosyntetyzowan¹ niæ w miejscach GATC, le¿¹cych najbli¿ejniesparowanych zasad w kierunku 5� lub 3�. Niæ rodzicielska jest w tych miejscachzmetylowana przez metylazê Dam, a wiêc chroniona przed endonukleolitycznym dzia-³aniem bia³ka MutH. W kolejnym etapie helikaza UvrD, nazywana tak¿e w literaturzebia³kiem UvrE, MutU lub RecL [17, 90], rozwija naciêt¹ niæ, a egzonukleazy ExoI,ExoVII lub RecJ degraduj¹ kolejne nukleotydy nowosyntetyzowanej nici od koñca 3�

Rys. 1. Model dzia³ania systemu postreplikacyjnej naprawy b³êdów MMR u bakterii (opis w tek�cie)

289

lub 5� w kierunku uszkodzenia, w zale¿no�ci od miejsca wcze�niej dokonanego na-ciêcia przez bia³ko MutH. Je¿eli ciêcie nowosyntetyzowanej nici przez bia³ko MutHnast¹pi³o w pozycji 5� od niesparowanych zasad, degradacje nici prowadz¹ egzo-nukleazy ExoVII lub RecJ, bowiem oba te enzymy degraduj¹ niæ DNA w kierunku5� → 3�, natomiast je¿eli naciêcie nast¹pi³o od strony 3�, to degradacje prowadziegzonukleaza I, odznaczaj¹ca siê hydrolityczn¹ aktywno�ci¹ w kierunku odwrot-nym [15, 25, 41, 48]. Ostatnio zidentyfikowano nowy enzym, egzonukleazê X, zdol-n¹ do degradacji DNA (podobnie jak egzonukleaza I) w kierunku 3�→ 5�. Enzymten by³by zatem kolejnym, wa¿nym sk³adnikiem bakteryjnego systemu MMR [90].

W komórkach E. coli region nowosyntetyzowanej nici DNA, usuwany przezomawiane egzonukleazy, mo¿e siêgaæ od 1 do 3 tysiêcy par zasad [9]. Tak wytwo-rzona luka w dupleksie DNA jest wype³niana przez polimerazê III DNA, któraw obecno�ci bia³ka SSB dosyntetyzowuje usuniêty fragment na matrycy rodziciel-skiej nici DNA. Ligaza, ³¹cz¹c koñce DNA przeprowadza ostatni etap naprawyniekomplementarnych zasad w dupleksie DNA, jednak sygna³em do zakoñczeniaca³ego procesu naprawy jest pe³na metylacja sekwencji GATC w naprawionej niciprzez metylazê Dam, bowiem bia³ko MutS nie rozpoznaje i nie ³¹czy siê z tak zme-tylowanym dupleksem DNA [40, 61].

3. Charakterystyka genów i bia³ek naprawczych uk³adu MMR

W odró¿nieniu od zgromadzonej ju¿, du¿ej wiedzy na temat genów i bia³ek syste-mu MMR E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i Streptococcus pneumoniae [20, 39,61, 62, 68, 75, 95] i w mniejszym stopniu kilku innych gatunków bakterii np. Thermustermophilus, T. aquaticus, Halobacterium, Haemophilus influenzae [5, 6, 20, 83, 92],niewiele wiadomo na temat mechanizmu genetycznej i biochemicznej regulacjiomawianego szlaku naprawy b³êdów DNA. Wiadomo, ¿e gen dam jest czê�ci¹ ope-ronu, na który sk³ada siê nie mniej ni¿ 7 genów [46, 51]. S¹dzi siê, ¿e ekspresja genudam jest skorelowana z szybko�ci¹ wzrostu komórki, a rola samej metylotransferazyDam w kontroli replikacji chromosomu by³a wielokrotnie udowadniana [73, 74].Kontrola ekspresji tego genu jest w komórce bardzo �cis³a, a wszelkie jej zaburzeniaprowadz¹ nieuchronnie do wzrostu czêsto�ci mutacji, asynchronicznej inicjacjinowych rund replikacyjnych, a tak¿e zmiany czêsto�ci transpozycji [7, 54, 55, 77].

Gen mutL jest czê�ci¹ du¿ego operonu, zbudowanego co najmniej z 5 genów.Kontrola ekspresji tego genu, jak i ca³ego operonu, nie jest bli¿ej poznana, wiadomojedynie, ¿e regulacja ta jest zwi¹zana z szybko�ci¹ wzrostu komórek oraz stabil-no�ci¹ mRNA, kontrolowan¹ przez RNA-azê E [13, 14, 84�86]. Nic natomiast niewiadomo o regulacji ekspresji genów mutS i mutH pomimo tego, i¿ geny te zosta³ysklonowane i poznano ich pe³n¹ sekwencjê nukleotydow¹ [24, 28, 52, 67, 78]. Obec-no�æ bia³ek naprawczych MutS, MutL i MutH oraz Dam w czasie logarytmicznegowzrostu E. coli ocenia siê na 100�200 cz¹steczek w przeliczeniu na 1 komórkê,jednak¿e zawarto�æ tych bia³ek zmniejsza siê w komórkach bêd¹cych w stacjonar-nej fazie wzrostu [30, 31, 64]. Dla zapewnienia aktywno�ci ca³ego systemu MMR

290

w komórkach E. coli konieczna jest bezpo�rednia interakcja wy¿ej wymienionychczynników [8, 21, 39].

Masa cz¹steczkowa bia³ka MutS wynosi 97 kDa, a dla rozpoznania niesparowa-nych zasad w heterodupleksach DNA in vitro konieczne jest wytworzenie dimeru,który po przy³¹czeniu do DNA zajmuje obszar 22 par zasad, powoduj¹c protekcjêtego regionu przed dzia³aniem DNAzy [68, 82]. Jedynym kofaktorem niezbêdnymdo zwi¹zania MutS z DNA s¹ jony Mg2+. Ustalono, i¿ bia³ko MutL, o masie cz¹-steczkowej 70 kDa, istnieje w roztworze tak¿e w postaci dimeru i in vitro przy³¹czasiê do kompleksu MutS-DNA, zwiêkszaj¹c do 100 par zasad obszar DNA chro-niony przed dzia³aniem DNazy I i zapobiegaj¹c ��lizganiu siê� (dalszej migracji)bia³ka MutS [26]. Na tym etapie, w obecno�ci ATP, nastêpuje aktywacja latentnegobia³ka MutH (masa cz¹steczkowa 25 kDa), które wykazuje s³ab¹ aktywno�æ endo-nukleolityczn¹, wzrastaj¹c¹ jednak 20�70 razy w obecno�ci MutS, MutL i ATP [57].Endonukleaza MutH trawi niezmetylowan¹ niæ w obrêbie hemimetylowanej sekwen-cji GATC, nawet w znacznej (do 3000 par zasad) odleg³o�ci w dowolnym kierunkuod niekomplementarno�ci [61, 62].

Podczas gdy ogólny schemat dzia³ania szlaku MMR jest podobny u ró¿nych bak-terii, to sam mechanizm rozpoznawania uszkodzonej nici ró¿ni siê do�æ znacznieu poszczególnych gatunków. Nie ulega w¹tpliwo�ci, ¿e centralne ogniwo omawiane-go systemu stanowi¹ bia³ka MutS i MutL lub ich homologi. Dla przyk³adu bia³koHexA S. pneumoniae, wykazuj¹ce 36% podobieñstwa na poziomie sekwencji amino-kwasowej do MutS E. coli, rozpoznaje niesparowane zasady w dupleksie DNA, nato-miast HexB (40% homologii z MutL) przy³¹czaj¹c siê do kompleksu HexA/hetero-dupleks DNA powoduje wypêtlenie uszkodzonego regionu, jednak zarówno u S. pneu-moniae jak i wiêkszo�ci badanych gatunków bakterii brak jest trzeciego czynnika,homologu bia³ka MutH [28, 37�39, 70,71]. Zachodzi zatem pytanie w oparciuo jakie molekularne mechanizmy nastêpuje przeciêcie nici rodzicielskiej i potomneju tych gatunków, u których funkcjonuje system MMR ale bez udzia³u bia³ka MutH?

Jak dot¹d nie znaleziono jednoznacznej odpowiedzi wyja�niaj¹cej ten problem,s¹dzi siê jednak, ¿e rolê MutH spe³niaj¹ inne enzymy restrykcyjne wprowadzaj¹cenaciêcia w naprawianej nici DNA. Hipotezê tê potwierdza³by zaskakuj¹cy fakt,i¿ endonukleaza MutH jest spokrewniona z restryktazami Sau3AI Staphylococcusaureus oraz LlaKR2I Lactobacillus lactis [4, 20, 87]. Z kolei sekwencja aminokwa-sowa metylotransferazy Dam E.coli wykazuje wysoki stopieñ homologii z innymimetylotransferazami, wprowadzaj¹cymi grupê metylow¹ w pozycji N4 adeninyw sekwencjach GATC (metylotransferaza Dam bakteriofaga T4, metylotransferazaDpnII) a tak¿e sekwencji GATATC (metylotransferaza EcoRV) i GAATTC (metylo-transferaza EcoRI) [39, 53]. Spekuluje siê, ¿e metylaza DpnII S. pneumoniae pe³nianalogiczn¹ do enzymu Dam funkcjê i naznacza rodzicielsk¹ niæ DNA, a wolnekoñce fragmentów Okazaki w nici potomnej stanowi¹ docelow¹ tarczê dla bia³ekuk³adu HexA/HexB w czasie naprawy b³êdów replikacji [39, 53].

Obecnie publikowane prace do�wiadczalne w znacznym stopniu zmieniaj¹ naszepogl¹dy na temat mechanizmu replikacji DNA w warunkach in vivo. Wyniki tychprac wskazuj¹, ¿e synteza nici wiod¹cej nie przebiega w sposób ci¹g³y, bowiem

291

zdarzaj¹ siê liczne i czêste pêkniêcia DNA, oraz zatrzymania wide³ek replikacyj-nych [16]. Rozwa¿a siê, ¿e wolne koñce fragmentów Okazaki oraz powsta³e wsku-tek pêkniêæ wolne koñce w nowosyntetyzowanej nici wiod¹cej, mog¹ pe³niæ rolêsygna³u tak¿e dla systemu naprawy MMR u tych bakterii, które nie wykszta³ci³yuk³adu MutH/metylaza Dam [11, 27].

4. Udzia³ MMR w innych, molekularnych procesach komórkowych

Jedn¹ z przyczyn uszkodzeñ DNA polegaj¹cych na powstawaniu niesparowa-nych zasad TG jest spontaniczna deaminacja 5-metylocytozyny w sekwencjachnukleotydowych CCAGG [75]. W tych naturalnych sekwencjach nukleotydowychbakterii, metylowana cytozyna (w pozycji 2-giej) podlega w komórkach procesowispontanicznej deaminacji i przekszta³caj¹c siê w tyminê prowadzi do wytworzeniaw omawianej sekwencji b³êdu, czyli niesparowania TG [45]. B³êdy te s¹ w komór-kach E. coli efektywnie naprawiane przez uk³ad enzymatyczny VSR (ang. VeryShort Repair Pathway), który skutecznie przeciwdzia³a narastaniu, szczególniew sekwencjach CCAGG, mutacji typu amber (CG do TA) [45]. Dowiedziono, ¿ew komórkach bakterii pozbawionych zdolno�ci metylowania cytozyny, czêsto�æmutacji typu amber w sekwencjach CCAGG jest znacznie ni¿sza. System naprawyomawianych niesparowañ TG wymaga obecno�ci aktywnych genów vsr, mutL, mutSi polA [32]. Gen vsr koduje syntezê bia³ka o wielko�ci wyra¿anej mas¹ cz¹st. 18 kDa,które jest endonukleaz¹ zale¿n¹ od jonów Mg2+. Prosty model naprawy b³êdów TGobejmuje: etap przeciêcia wi¹zania fosfodiestrowego od strony 5� b³êdnie sparowanejtyminy, nastêpnie do wolnego koñca 3� przy³¹cza siê polimeraza I DNA, która dziêkiswojej aktywno�ci egzonukleolitycznej 5�-3� usuwa tyminê prawdopodobnie wrazz kilku-, kilkunastoma s¹siednimi nukleotydami, jednocze�nie wype³niaj¹c prawid³o-wymi nukleotydami tak powsta³¹ lukê. W ostatnim etapie, w obecno�ci ligazy, do-chodzi do po³¹czenia wolnych koñców nici [44]. Ten model nie t³umaczy w sposóbzadowalaj¹cy udzia³u bia³ek MutS i MutL w omawianym procesie; wiadomo jedy-nie, ¿e pewien poziom aktywno�ci systemu VSR jest zachowany przy braku tychdwóch czynników, ale efektywno�æ naprawy b³êdów TG jest wtedy znacznie ni¿sza,w porównaniu do komórek zdolnych do syntezy tych bia³ek naprawczych [44].

Alternatywny i bardziej prawdopodobny model (rys. 2) [3] zak³ada, i¿ bia³kaMutS i MutL rozpoznaj¹ niesparowania TG, a nastêpnie w obecno�ci ATP tworz¹w miejscu rozpoznania pêtlê DNA, co eksponuje niesparowania TG na dzia³anieendonukleazy VSR.

Interesuj¹cym jest fakt, i¿ gen vsr jest zlokalizowany obok genu dcm koduj¹cegosyntezê metylotransferazy cytozyny, tworz¹c razem z nim jedn¹ jednostkê trans-krypcyjn¹. Okaza³o siê, ¿e takie u³o¿enie genów vsr i dcm jest charakterystycznenie tylko dla E. coli, ale tak¿e dla wielu innych gatunków bakterii. Mo¿na s¹dziæ, i¿szlak VSR jest wa¿ny dla utrzymania stabilno�ci genetycznej bakterii w regionachgenomów bogatych w sekwencje CCTGG/CCAGG [23]. Potwierdzeniem �cis³ej za-le¿no�ci miêdzy metylacj¹ przy udziale bia³ka Dcm oraz napraw¹ b³êdów typu VSR

292

mo¿e byæ fakt, ¿e mutacja genu dcm blokuje funkcjê biologiczn¹ ca³ego systemu,aczkolwiek sama metylaza nie bierze ¿adnego udzia³u w naprawie DNA [18].

W pi�miennictwie narasta liczba doniesieñ wskazuj¹cych na bezpo�redni zwi¹-zek miêdzy systemem MMR a napraw¹ uszkodzeñ transkrybowanej nici DNA,która przebiega przy udziale uk³adu TCR [22] (Transcription Coupled NucleotideExcision Repair). Dowiedziono, miêdzy innymi, ¿e defekt systemu MMR prowadzido os³abienia mo¿liwo�ci naprawy uszkodzeñ w transkrybowanej nici DNA, wywo-³ywanych w warunkach laboratoryjnych np. dzia³aniem UV czy czynnikami alkilu-

Rys. 2. Schemat dzia³ania szlaku VSP w komórce bakteryjnej

293

j¹cymi [59, 75] Autorzy omawianej pracy sadz¹, i¿ sta³a wi¹zania siê kluczowegodla szlaku TCR kompleksu UvrA2/UvrB jest zbyt niska dla efektywnej naprawytakich uszkodzeñ, w sytuacji gdy, w nieobecno�ci bia³ek Mut, nie s¹ one odpowied-nio wypêtlone i eksponowane na dzia³anie tego kompleksu. Omawiane zale¿no�cipomiêdzy systemami MMR, VSR i TCR nie by³y wcze�niej rozwa¿ane z uwagi nafakt, i¿ specyficzno�æ substratowa poszczególnych, znanych czynników napraw-czych tych systemów jest zupe³nie odmienna.

W ostatnich latach okaza³o siê tak¿e, ¿e bia³ka MutH, S, L pe³ni¹ wa¿n¹ rolê rów-nie¿ w rearan¿acji chromosomalnego DNA bakterii, zachodz¹cej w wyniku �lizganiasiê matryc DNA w czasie replikacji (Strand-Slippage Mutagenesis) tandemowopowtórzonych sekwencji nukleotydowych. Dowiedziono, ¿e delecje regionu chromo-somalnego DNA E. coli, zlokalizowanego pomiêdzy dwiema kopiami takich sekwen-cji o d³ugo�ci 101 par zasad ka¿da i homologii 96%, pojawiaj¹ siê z bardzo wysokaczêsto�ci¹ [47]. Delecje te nie s¹ zwi¹zane z procesem homologicznej rekombinacji,bowiem inaktywacja systemu RecA nie zmienia³a czêsto�ci omawianych mutacji.Co wiêcej, okaza³o siê, ¿e w komórkach z nieaktywnym systemem MMR czêsto�ædelecji wzrasta³a oko³o stukrotnie. W odró¿nieniu, czêsto�æ delecji na odcinkachpomiêdzy w pe³ni homologicznymi, tandemowymi sekwencjami nie ulega³a zmianiew komórkach z defektywnym systemem MMR. Te wyniki oraz inne dane wskazuj¹,¿e nie w pe³ni homologiczne, tandemowe, powtórzone sekwencje w wyniku po�lizgunici rodzicielskiej w stosunku do nowosyntetyzowanej, tworz¹ niesparowania zasad,które s¹ rozpoznawane i naprawiane przez bia³ka MutH, S, L. Autorzy omawianejpracy badali wy³¹cznie czêsto�æ delecji, mo¿na jednak przewidywaæ z du¿¹ doz¹prawdopodobieñstwa, ¿e czêsto�æ duplikacji takich nie w pe³ni homologicznych,tandemowych sekwencji jest tak¿e regulowana aktywno�ci¹ systemu MMR.

Bardzo interesuj¹ce dane uzyskano w badaniach ludzkich mikrosatelitarnychsekwencji (TG)n, replikowanych w komórkach E. coli. Okaza³o siê, ¿e czêsto�æ de-lecji i ekspansji tych dwunukleotydowych, powtórzonych sekwencji zale¿y w decy-duj¹cym stopniu od sprawno�ci systemu MMR; inaktywacja choæby jednego z ge-nów tego szlaku prowadzi do wielokrotnego wzrostu czêsto�ci omawianych mutacjiw obrêbie badanych sekwencji mikrosatelitarnych [43]. W tym miejscu nale¿yzaznaczyæ, ¿e wyniki uzyskane na modelu komórki bakteryjnej s¹ w pe³ni zgodnez danymi uzyskanymi w analogicznych eksperymentach przeprowadzanych na ko-mórkach Saccharomyces cerevisiae z mutacjami w genach mut [80].

W ostatnich latach ukaza³o siê te¿ wiele znacz¹cych prac do�wiadczalnych,których autorzy, w oparciu o wyniki uzyskiwane na modelach komórek bakteryj-nych i dro¿d¿owych wskazuj¹ na istotn¹ rolê systemu MMR w generowaniu takzwanych mutacji dynamicznych w obrêbie ludzkich, powtórzonych, trójnukleoty-dowych sekwencji DNA [34, 69].

Proces rekombinacji zachodz¹cy pomiêdzy, heterologicznymi sekwencjami DNAu gatunków spokrewnionych jest jednym ze �róde³ zmienno�ci genetycznej bakterii.Taka miêdzygatunkowa rekombinacja, zale¿na od bia³ka RecA zachodzi w wynikuprzenoszenia obcego DNA do komórki biorcy na drodze koniugacji, transdukcjiczy transformacji. Jednak czêsto�æ miêdzygatunkowej rekombinacji genetycznej

294

w �wiecie bakterii jest ograniczana przez bia³ka funkcjonalnego systemu MMR, któreprzeciwdzia³aj¹ wymianie odcinków DNA pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami.S¹dzi siê, ¿e kluczow¹ rolê w tym procesie odgrywa bia³ko MutS, które w procesierekombinacji blokuje przemieszczanie siê struktury Holliday�a (branch migration)nie w pe³ni homologicznych nici DNA [94, 57]. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e systemMMR w komórkach bakterii gramujemnych skutecznie przeciwdzia³a destabilizacjigenomu powodowanej nie tylko narastaniem w DNA b³êdów replikacji, ale tak¿emo¿liw¹ miêdzygatunkow¹ rekombinacj¹ pomiêdzy heterologicznymi sekwencjamiDNA. Odwrotne do wy¿ej opisanych skutki, wywo³uje indukcja bakteryjnego syste-mu SOS. W odpowiedzi na uszkodzenia materia³u genetycznego, które stwarzaj¹zagro¿enie dla ¿ycia komórki, uruchomiany mechanizm naprawy typu SOS prowadzido ogromnego wzrostu zarówno czêsto�ci mutacji jak i rekombinacji pomiêdzy hetero-logicznymi sekwencjami DNA. Mo¿na domniemywaæ, ¿e przeciwstawne dzia³aniesystemów MMR i SOS w komórkach E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i zapewneinnych bakterii gramujemnych prowadzi do ustalenia tempa dywergencji genomóww ewolucyjnym rozwoju tych bakterii. Ciekawym przyk³adem na tym tle jest sys-tem MMR S. pneumoniae. Wydaje siê, ¿e czynniki Hex tego gatunku, w odró¿nie-niu od E. coli i S. enterica sv. Typhimurium, nie stanowi¹ bariery dla rekombinacjipomiêdzy heterologicznymi sekwencjami DNA [33, 72]. Stwierdzono, ¿e pomimo,i¿ bia³ka naprawcze systemu Hex (Hex DNA Mismatch Repair) by³y ca³kowiciewysycane, to jest zaanga¿owane w czasie transformacji komórek S. pneumoniaeDNA pochodz¹cymi ze spokrewnionych gatunków S. oralis i S. mitis, to jednak niehamowa³y procesu miêdzygatunkowej rekombinacji. Wyniki te dodatkowo potwier-dza³yby opisywan¹ ju¿ wcze�niej odmienno�æ systemu naprawy S. pneumoniae.

Reasumuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e omawiane bia³ka szlaku MMR mog¹ skutecz-nie zapobiegaæ rekombinacjom pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami u jednychgatunków bakterii, jak E. coli i S. enterica sv. Typhimurium [58], b¹d� nie stanowiætakiej bariery dla rekombinacji pomiêdzy heterologicznymi, blisko spokrewnionymisekwencjami DNA w komórkach innych gatunków, jak to ma miejsce w przypadkuS. pneumoniae. Inaktywacja szlaku MMR w komórkach bakterii prowadzi, miêdzyinnymi, do wzrostu czêsto�ci mutacji w regionach sekwencji mikrosatelitarnychoraz innych powtórzonych sekwencji nukleotydowych. Najnowsze prace do�wiad-czalne z tego zakresu dostarczaj¹ dowodów �wiadcz¹cych o tym, ¿e niestabilno�ætakich sekwencji (zmiana liczby powtórzeñ) mo¿e le¿eæ u pod³o¿a z³o¿onychmechanizmów reguluj¹cych zmianê antygenów powierzchniowych czy ekspresjiczynników chorobotwórczo�ci bakterii z rodzaju Mycobacterium, Haemophilus,Neisseria, Streptococcus [12, 50, 60, 76, 88, 89].

5. System MMR w �wietle osi¹gniêæ genomiki bakterii

Zgromadzona w ostatnich kilkunastu latach wiedza o organizacji i funkcjonowa-niu systemów naprawy b³êdów DNA oraz ich roli w zmienno�ci i stabilno�ci geno-mów dotyczy w g³ównej mierze trzech, najlepiej scharakteryzowanych pod tym

295

wzglêdem gatunków bakterii: E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i S. pneumoniae.Ogromny rozwój biologii molekularnej, w tym technik klonowania i sekwencjono-wania genów i ca³ych genomów pozwoli³ w ostatnich latach lepiej poznaæ homologigenów mutS i mutL w komórkach takich gatunków bakterii jak: Haemophilus influen-zae, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii, T. aquaticus, T. thermophilus, Pseudo-monas aeruginosa [20, 60, 65, 75, 79]. Znajomo�æ pe³nej sekwencji nukleotydowejgenomów 64 gatunków bakterii chorobotwórczych i niechorobotwórczych orazzaawansowanie prac nad sekwencjonowaniem genomów kolejnych 156 szczepówbakterii z ró¿nych gatunków i rodzajów (www.tigr.org), w po³¹czeniu z dostêpemdo ogromnych baz danych, pozwala obecnie podejmowaæ problemy zwi¹zane z filo-genetyk¹ bakterii, a w tym stawiaæ pytania na temat filogenetycznego rozwojupodstawowych, molekularnych mechanizmów komórkowych, do których nale¿yzaliczyæ systemy naprawy b³êdów i uszkodzeñ DNA.

W literaturze przedmiotu panuje zgodna opinia, i¿ podstawowe elementy systemuMMR, to jest geny mutS i mutL, nale¿y uznaæ jako ewolucyjnie bardzo stare, prawdo-podobnie by³y one ju¿ obecne w komórkach wspólnego przodka organizmów pro-i eukariotycznych, a uk³ad MutH/metylaza Dam wykszta³cony zosta³ ze starszych ewo-lucyjnie systemów restrykcji�modyfikacji DNA, bowiem w komórkach wielu gatun-ków identyfikuje siê homologi metylotransferazy Dam [19, 20]. Uwa¿a siê, ¿e mutSi mutL oraz ich homologi obecne s¹ w genomach wszystkich wspó³cze�nie wystêpuj¹-cych organizmów, od bakterii poczynaj¹c na komórkach cz³owieka koñcz¹c [1, 20,35]. Zgodnie z obecn¹ wiedz¹ wyj¹tkiem s¹ tutaj ¿yj¹ce w ekstremalnych warunkach�rodowiska bakterie nale¿¹ce do królestwa Archea oraz wewn¹trzkomórkowe paso-¿yty � Mycoplasma pneumoniae, M. genitalium, Rickettsia prowazeki, Mycobacteriumtuberculosis i M. leprae oraz Helicobacter pylori i Campylobacter jejuni [20]. Uwa¿asiê, ¿e powy¿sze gatunki utraci³y ten podstawowy system naprawy DNA w trakcierozwoju ewolucyjnego, a w komórkach ró¿nych gatunków archeonów funkcjonuj¹,byæ mo¿e, inne mechanizmy naprawy b³êdów DNA [20, 79].

Potwierdzeniem ostatniej hipotezy mo¿e byæ fakt, i¿ w genomach niektórych ga-tunków Archea (Haloferax volcani, Halobacterium) obecny jest, odpowiednio, frag-ment genu mutL oraz homolog tego genu [63]. Natomiast w genomach Pyrococccusfuriosus, P. horikoshii, P. woesei, Methanobacterium thermoautotrophicus i Halobac-terium wykryto sekwencje nukleotydowe koduj¹ce bia³ka o znacznej homologii doznanych bia³ek MutS, ale nie wykryto sekwencji homologicznych do genów mutLi mutH [63, 79]. Istotnym jest pytanie, czy utrata omawianego systemu naprawy by³awynikiem genetycznej niestabilno�ci genów mut, czy te¿ utrata tych genów b¹d� ichmutacyjna inaktywacja doprowadzi³a w przesz³o�ci ewolucyjnej do pojawienia siêszczepów hiperzmutowanych, odznaczaj¹cych siê niezwykle wysok¹ czêsto�ci¹mutacji ró¿nych genów, które w konsekwencji uzyska³y przewagê selekcyjn¹ i przy-stosowa³y siê do nowych, ekstremalnych warunków �rodowiska lub do warunkówwewn¹trzkomórkowego paso¿ytnictwa. Wspomniano wcze�niej, ¿e os³abienie, inakty-wacja lub utrata genów mut prowadzi do 100�400-krotnego wzrostu czêsto�ci mu-tacji, a tym samym generuje ogromn¹ zmienno�æ genetyczn¹ bakterii, co w konse-kwencji u³atwia i przyspiesza przystosowanie do zmienionych warunków ¿ycia.

296

Wiêkszo�æ badaczy sk³ania siê ku tej drugiej hipotezie, a praca do�wiadczalnaopublikowana ostatnio w Molecular Microbiology [65] dowodzi, i¿ czêsto�æ ró¿-nych mutacji genów mutS, mutL i uvrD (insercje, delecje, zmiany ramki odczytu)w komórkach szczepów P. aeruginosa, izolowanych z p³uc pacjentów chorych namukowiscydozê i leczonych antybiotykami w d³ugich przedzia³ach czasu, by³aniezwykle wysoka i wynosi³a a¿ 20%. Uzyskane dane do�wiadczalne wskazuj¹,¿e geny mutS, mutL i uvrD P. aeruginosa s¹ genami mutatorowymi, bowiem ichinaktywacja doprowadzi³a do pojawiania siê z du¿¹ czêsto�ci¹ szczepów hypermu-tantów, w tym szczepów lekoopornych.

W zakoñczeniu niniejszego artyku³u warto przypomnieæ, ¿e hyperzmutowaneszczepy bakterii chorobotwórczych i niechorobotwórczych pojawiaj¹ siê w natural-nych populacjach z czêsto�ci¹, jak siê ocenia np. dla E. coli, Salmonella i Neisseriameningitidis, �rednio wynosz¹c¹ 1% [42, 56, 65, 66, 76]. Szczepy te zwykle charak-teryzuj¹ siê nieaktywnymi lub os³abionymi genami szlaku naprawy b³êdów DNA(MMR). Zatem bardzo wysoka czêsto�æ mutacji w ró¿nych genach i regionachgenomu takich szczepów, a tak¿e u³atwiona miêdzygatunkowa rekombinacja, gene-ruj¹ ogromn¹ zmienno�æ genetyczn¹ i fenotypow¹, co stwarza szansê ³atwegoprzystosowania siê do zmiennych warunków �rodowiska takich mutantów, którew obecno�ci antybiotyków, wskutek uruchomienia mechanizmów odpowiedzi im-munologicznej lub komórkowej makroorganizmu b¹d� w warunkach innych stre-sów �rodowiskowych uzyskaj¹ przewagê selekcyjn¹.

Pi�miennictwo

1. Aquilina G., Bignami M.: Mismatch repair in correction of replication errors and processing ofDNA damage. J. Cell. Physiol. 187, 145�154 (2001)

2. Aravind L., Walker R.D., Koonin E.V.: Conserved domains in DNA repair proteins and evolutionof repair systems. Nucleic Acids Res. 27, 1223�1242 (1999).

3. Balganesh T.S., Lacks S.A.: Heteroduplex DNA mismatch repair system of Streptococcus pneu-moniae: Cloning and expression of the hexA gene. J. Bacteriol. 162, 979�984 (1985)

4. Ban C., Yang W.: Structural basis for MutH activation in E. coli mismatch repair and relationshipof MutH to restriction endonucleases. EMBO J. 17, 1526�1534 (1998)

5. Biswas I., Hsieh P.: Identification and characterization of a thermostable MutS homolog fromThermus aquaticus. J. Biol. Chem. 271, 5040�5048 (1996)

6. Biswas I., Hsieh P.: Interaction of MutS protein with the major and minor grooves of a hetero-duplex DNA. J. Biol. Chem. 272, 13355�13364 (1997)

7. Boye E., Lobner-Olesen A.: The role of dam methyltransferase in the control of DNA replicationin E. coli. Cell, 62, 981�989 (1990)

8. Boye E., Marinus M.G., Lobner-Olesen A.: Quantitation of Dam methyltransferase in Escheri-chia coli. J. Bacteriol. 174, 1682�1685 (1992)

9. Bruni R., Martin D., Jiricny J.: d(GATC) sequences influence Escherichia coli mismatch repair ina distance-dependent manner from positions both upstream and downstream of the mismatch.Nucleic Acids Res. 16, 4875�4890 (1988)

10. Campbell J.L., Kleckner N.: E. coli oriC and dnaA gene promoter are sequestered from dammethyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell, 62, 967�979(1990)

297

11. Chen J.D., Lacks S.A.: Role of uracil-DNA glycosylase in mutation avoidance by Streptococcuspneumoniae. J. Bacteriol. 173, 283�290 (1991)

12. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon SV., Eiglmeier K.,Gas S., Barry C.E 3rd., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., ConnorR., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K.,Barrell B.G.: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genomesequence. Nature, 393, 537�544 (1998)

13. Connolly D.M., Winkler M.E.: Genetic and physiological relationships among the miaA gene,2-methylthio-N6-(delta 2-isopentenyl)-adenosine tRNA modification, and spontaneous mutage-nesis in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 171, 3233�3246 (1989)

14. Connolly D.M., Winkler M.E.: Structure of Escherichia coli K-12 miaA and characterization ofthe mutator phenotype caused by miaA insertion mutations. J. Bacteriol. 173, 1711�1721 (1991)

15. Cooper D.L., Lahue R.S., Modrich P.: Methyl-directed mismatch repair is bidirectional. J. Biol.Chem. 268, 11823�11829 (1993)

16. Cox M.M., Goodman M.F., Kreuzer K.N., Sherratt D.J., Sandler S.J., Marians K.J.: The impor-tance of repairing stalled replication forks. Nature, 404, 37�41 (2000)

17. Dao V., Modrich P.: Mismatch-, MutS-, MutL-, and helicase II-dependent unwinding from thesingle-strand break of an incised heteroduplex. J. Biol. Chem. 273, 9202�9207 (1998)

18. Dar M.E., Bhagwat A.S.: Mechanism of expression of DNA repair gene vsr, an Escherichia coligene that overlaps the DNA cytosine methylase gene dcm. Mol. Microbiol. 9, 823�833 (1993)

19. Eisen J.A.: A phylogenomic study of the MutS family of proteins. Nucleic Acid. Res. 26,4291�4300 (1998)

20. Eisen J.A., Hanawalt P.C.: A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes.Mutat. Res. 435, 171�213 (1999).

21. Feng G., Tsui H.C., Winkler M.E.: Depletion of the cellular amounts of the MutS and MutHmethyl-directed mismatch repair proteins in stationary-phase Escherichia coli K-12 cells. J. Bac-teriol. 178, 2388�2396 (1996)

22. Freiberg E.C. Walker G.C., Side W.: DNA repair and mutagenesis, ASM Press, Washington D.C.,1995

23. Glasner W., Merkl R., Schellenberger V., Fritz H.J.: Substrate preferences of Vsr DNA mismatchendonuclease and their consequences for the evolution of the Escherichia coli K-12 genome.J. Mol. Biol. 245, 1�7 (1995)

24. Grafstrom R.H., Hoess R.H.: Nucleotide sequence of the Escherichia coli mutH gene. NucleicAcids Res. 15, 3073�3084 (1987)

25. Grilley M., Griffith J., Modrich P.: Bidirectional excision in methyl-directed mismatch repair.J. Biol. Chem. 268, 11830�11837 (1993)

26. Grilley M., Welsh K.M., Su S.S., Modrich P.: Isolation and characterization of the Escherichiacoli mutL gene product. J. Biol. Chem. 264, 1000�1004 (1989)

27. Guild W.R., Shoemaker N.B.: Mismatch correction in pneumococcal transformation: donor lengthand hex-dependent marker efficiency. J. Bacteriol. 125, 125�135 (1976)

28. Haber L.T., Pang P.P., Sobell D.I., Mankovich J.A., Walker G.C.: Nucleotide sequence of theSalmonella typhimurium mutS gene required for mismatch repair: homology of MutS and HexAof Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 170, 197�202 (1988)

29. Hanawalt P.C.: DNA repair comes of age. Mutat. Res. 336, 101�113 (1995)30. Harris R.S., Feng G., Ross K.J., Sidhu R., Thulin C., Longerich S., Szigety S.K., Hastings P.J.,

Winkler M.E., Rosenberg S.M.: Mismatch repair is diminished during stationary-phase mutation.Mutat. Res. 437, 51�60 (1999)

31. Harris R.S., Feng G., Ross K.J., Sidhu R., Thulin C., Longerich S., Szigety S.K., Winkler M.E.,Rosenberg S.M.: Mismatch repair protein MutL becomes limiting during stationary-phase muta-tion. Genes Dev. 11, 2426�2437 (1997)

32. Hennecke F., Kolmar H., Brundl K., Fritz H.J.: The vsr gene product of E. coli K-12 is a strand-and sequence-specific DNA mismatch endonuclease. Nature, 353, 776�778 (1991)

298

33. Humbert O., Prudhomme M., Hakenbeck R., Dowson C.G., Claverys J.P.: Homeologous recom-bination and mismatch repair during transformation in Streptococcus pneumoniae: saturation ofthe Hex mismatch repair system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9052�9056 (1995)

34. Jaworski A., Rosche W.A., Gellibolian R., Kang S., Shimizu M., Bowater R.P, Sinden R.R.,Wells R.D.: Mismatch repair in Escherichia coli enhances instability of (CTG)n triplet repeatsfrom human hereditary diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11019�11023 (1995)

35. Kolodner R.: Biochemistry and genetics of eukaryotic mismatch repair. Genes Dev. 10,1433�1442 (1996)

36. Koonin E.V., Mushegian A.R., Rudd K.E.: Sequencing and analysis of bacterial genomes. Curr.Biol. 6, 404�416 (1996)

37. Kramer W.B., Kramer M.S., Williamson M.S., Fogel S.: Cloning and nucleotide sequence of DNAmismatch repair gene PMS1 from Saccharomyces cerevisiae: homology of PMS1 to procaryoticMutL and HexB. J. Bacteriol. 171, 5339�5346 (1989)

38. Lacks S.A.: Generalized DNA mismatch repair its molecular basis in Streptococcus pneumoniaeand other organisms, (w) Genetic of Transformation and Expression, eds: L.O.C. Harwood,B.E.B. Moseley, Intercept, Wimbourne, England, 1989

39. Lacks S.A.: DNA repair and mutagenesis in Streptococcus pneumoniae., (w) DNA repair in pro-caryotes and lower eucaryotes, vol. 1., s. 263�286, ed: J.A. Nickoloff, M.F. Hoekstra, HumanaPress Inc., Totowa, NJ, 1998

40. Lahune R.S., Au K.G., Modrich P.: DNA mismatch correction in a defined system. Science, 245,160�164 (1989)

41. Langle-Rouault F., Maenhaut-Michel G., Radman M.: GATC sequences, DNA nicks and the MutHfunction in Escherichia coli mismatch repair. EMBO J. 6, 1121�1127 (1987)

42. LeClerc J.E., Li B., Payne W.L., Cebula T.A.: High mutation frequencies among Escherichia coliand Salmonella pathogens. Science, 274, 1208�1211 (1996)

43. Levinson G., Gutman G.A.: High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeatsborne by bacteriophage M13 in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 15, 5323�5338 (1987)

44. Lieb M.: Bacterial genes mutL, mutS and dcm participate in repair of mismatches at 5-methyl-cytosine sites. J. Bacteriol. 169, 5241�5246 (1987)

45. Lieb M.: Spontaneous mutation at a 5-methylcytosine hotspot is prevented by very short patch(VSP) mismatch repair. Genetics, 128, 23�27 (1991)

46. Lobner-Olesen A., Boye E., Marinus M.G.: Expression of the Escherichia coli dam gene. Mol.Microbiol. 6, 1841�1851 (1992)

47. Lovett S.T., Feschenko V.V.: Stabilization of diverged tandem repeats by mismatch repair:evidence for deletion formation via a misaligned intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,7120�7124 (1996)

48. Lu A.L.: Influence of GATC sequences on Escherichia coli DNA mismatch repair in vitro.J. Bacteriol. 169, 1254�1259 (1987)

49. Lu A.L., Clark S., Modrich P.: Methyl-directed repair of DNA base-pair mismatches in vitro.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4639�4643 (1983)

50. Lukomski S., Nakashima K., Abdi I., Cipriano V.J., Shelvin B.J., Graviss E.A., Musser J.M.:Identification and characterization of a second extracellular collagen-like protein made by groupA Streptococcus: control of production at the level of translation. Infect. Immun. 69, 1729�1738(2001)

51. Lyngstadaas A., Lobner-Olesen A., Boye E.: Characterization of three genes in the dam-conta-ining operon of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 247, 546� 554 (1995)

52. Mankovich J.A., McIntyre C.A., Walker G.C.: Nucleotide sequence of the Salmonella typhimu-rium mutL gene required for mismatch repair: Homology of MutL to HexB of Streptococcus pneu-moniae and to PMS1 of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 171, 5325�5331 (1989)

53. Mannarelli B.M., Balganesh T.S., Greenberg B., Springhorn S.S., Lacks S. A.: Nucleotide sequ-ence of the Dpn II DNA methylase gene of Streptococcus pneumoniae and its relationship to thedam gene of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4468�4472 (1985)

299

54. Marinus M.G. Morris N.R.: Biological function for 6-methyladenine residues in the DNA ofEscherichia coli K12. J. Mol. Biol. 85, 309�322 (1974)

55. Marinus M.G., Poteete A., Arraj J.A.: Correlation of DNA adenine methylase activity with spon-taneous mutability in Escherichia coli K-12. Gene, 28, 123�125 (1984)

56. Matic I., Radman M., Taddei F., Pcard B., Doit C., Bingen E., Denamur E., Elion J.: Highly variablemutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science, 277 1833�1834 (1997)

57. Matic I., Rayssiguier C., Radman M.: Interspecies gene exchange in bacteria: the role of SOS andmismatch repair systems in evolution of species. Cell, 80, 507�515 (1995)

58. Matic I., Taddei F., Radman M.: Genetic barriers among bacteria. Trends Microbiol. 4, 69�72, (1996)59. Mellon I., Champe G.N.: Products of DNA mismatch repair genes mutS and mutL are required for

transcription coupled nucleotide-excision repair of lactose operon in Escherichia coli. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 93, 1292�1297 (1996)

60. Mizrahi V., Andersen S.J.: DNA repair in Mycobacterium tuberculosis. What have we learnt fromthe genome sequence? Mol. Microbiol. 29, 1331�1339 (1998)

61. Modrich P.: Mechanisms and biological effects of mismatch repair. Annu. Rev. Genet. 25,229�253 (1991)

62. Modrich P., and Lahue R.: Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, andcancer biology. Annu. Rev. Biochem. 65, 101�133 (1996)

63. Ng W.V., Kennedy S.P., Mahairas G.G., Berquist B., Pan M., Shukla H.D., Lasky S.R., Baliga N.S.,Thorsson V., Sbrogna J., Swartzell S., Weir D., Hall J., Dahl T.A., Welti R., Goo Y.A., Leithauser B.,Keller K., Cruz R., Danson MJ., Hough D.W., Maddocks D.G., Jablonski P.E., Krebs M.P.,Angevine C.M., Dale H., Isenbarger T.A., Peck R.F., Pohlschroder M., Spudich J.L., Jung K.W.,Alam M., Freitas T., Hou S., Daniels C.J., Dennis P.P., Omer A.D., Ebhardt H., Lowe T.M., Liang P.,Riley M., Hood L., DasSarma S.: Genome sequence of Halobacterium species NRC-1. Proc.Natl. Acad. Sci.USA, 97, 12176�12181 (2000)

64. Nowosielska A.: Mutageneza zwi¹zana z g³odzeniem aminokwasowym w komórkach Escheri-chia coli. Praca doktorska, Zak³ad Biologii Molekularnej, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN,Warszawa, 2002

65. Oliver A., Baquero F., Blazquez J.: The mismatch rapair system (mutS, mutL and uvrD genes) inPseudomonas aeruginosa: molecular characterization of naturally occuring mutants. Mol. Micro-biol. 43, 1641�1650 (2002)

66. Oliver A., Canton R., Campo P., Baquero F., Blazquez J.: High frequency of hypermutablePseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection. Science, 288, 1251�1254 (2000)

67. Pang P.P., Lundberg A.S, Walker G.C.: Identification and characterization of the mutL and mutSgene products of Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 163, 1007�1015 (1985)

68. Parker B.O., Marinus M.G.: Repair of DNA heteroduplexes containing small heterologous sequ-ences in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1730�1734 (1992)

69. Parniewski P., Jaworski A., Wells R.D., Bowater R.P.: Length of CTG/CAG repeats determinesthe influence of mismatch repair on genetic instability. J. Mol. Biol. 299, 865�874 (2000)

70. Priebe S.D., Hadi S.M., Greenberg B., Lacks S.A.: Nucleotide sequence of the hexA gene forDNA mismatch repair in Streptococcus pneumoniae and homology of hexA to mutS of Esche-richia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 170, 190�196 (1988)

71. Prudhomme M., Martin B., Mejean V., Claverys J.P.: Nucleotide sequence of the Streptococcuspneumoniae hexB mismatch repair gene: homology of HexB to MuL of Salmonella typhimuriumand to PMS1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 171, 5332�5338 (1989)

72. Radman M., Taddei F., Matic I.: Evolution-driving genes. Res Microbiol. 151, 91�95 (2000)73. Rasmussen L.J., Lobner-Olesen A., Marinus M.G.: Growth-rate-dependent transcription initia-

tion from the dam P2 promoter. Gene, 157, 213�215, (1995)74. Rasmussen L.J., Marinus M.G., Lobner-Olesen A.: Novel growth rate control of dam gene expres-

sion in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12, 631� 638, (1994)75. Rasmussen L.J., Samson L., Marinus M.G.: Dam-directed DNA Mismatch Repair, (w:) DNA

repair in procaryotes and lower eucaryotes, vol. 1., 205�228, eds: J.A. Nickoloff, M.F. Hoekstra,Humana Press Inc., Totowa, NJ 1998

300

76. Richardson, A.R., Stojiljkovic I.: Mismatch repair and the regulation of phase variation in Neisseriameningitidis. Mol. Microbiol. 40, 645�655 (2001)

77. Roberts D., Hoopes B.C., McClure W.R., Kleckner N.: IS10 transposition is regulated by DNAadenine methylation. Cell, 43, 117�130 (1985)

78. Schlensog V., Bock A.: The Escherichia coli fdv gene probably encodes mutS and is located atminute 58.8 adjacent to the hyc-hyp gene cluster. J. Bacteriol. 173, 7414�7415 (1991)

79. Stanis³awska A.: Rekombinatowe bia³ka MutS jako narzêdzia do wykrywania mutacji punkto-wych. Rozprawa doktorska, Katedra Mikrobiologii Wydzia³u Chemicznego Politechniki Gdañ-skiej, 2002

80. Strand M., Prolla T.A., Liskay R.M., Petes T.D.: Destabilization of tracts of simple repetitiveDNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 365, 274�276 (1993)

81. Su S.S., Lahue R.S., Au K.G., Modrich P.: Mispair specificity of methyl- directed DNA mismatchcorrection in vitro. J. Biol. Chem. 263, 6829�6835 (1988)

82. Su S.S., Modrich P.: Escherichia coli mutS-encoded protein binds to mismatched DNA base pairs.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5057�5061 (1986)

83. Takamatsu S., Kato R., Kuramitsu S.: Mismatch DNA recognition protein from an extremelythermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8. Nucleic Acids Res. 24, 640�647 (1996)

84. Tsui H.C., Leung H.C., Winkler M.E.: Characterization of broadly pleiotropic phenotypes causedby an hfq insertion mutation in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 13, 35�49 (1994)

85. Tsui H.C., Winkler M.E.: Transcriptional patterns of the mutL-miaA superoperon of Escherichiacoli K-12 suggest a model for posttranscriptional regulation. Biochimie, 76, 1168�1177 (1994)

86. Tsui H.C., Zhao G., Feng G., Leung H.C., Winkler M.E.: The mutL repair gene of Escherichiacoli K-12 forms a superoperon with a gene encoding a new cell-wall amidase. Mol. Microbiol. 11,189�202 (1994)

87. Twomey D.P., McKay L.L., O�Sullivan D.J.: Molecular characterization of the Lactococcus lactisLlaKR2I restriction-modification system and effect of an IS982 element positioned between therestriction and modification genes. J. Bacteriol. 180, 5844�5854 (1998)

88. van Belkum A., Scherer S., van Alphen L., Verbrugh H.: Short-sequence DNA repeats in proka-ryotic genomes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 275�293 (1998)

89. van Belkum A., Scherer S., van Leeuwen W., Willemse D., van Alphen L., Verbrugh H.: Variablenumber of tandem repeats in clinical strains of Haemophilus influenzae. Infect. Immun. 65,5017�5027 (1997)

90. Viswanathan M., Burdett V., Baitinger C., Modrich P., Lovett S.T.: Redundant exonuclease involve-ment in Escherichia coli methyl-directed mismatch repair. J. Biol. Chem. 276, 31053�31058 (2001)

91. Welsh K.M., Lu A.L., Clark S., Modrich P.: Isolation and characterization of the Escherichia colimutH gene product. J. Biol. Chem. 262, 15624�15629 (1987)

92. Whitehouse A., Deeble J., Parmar R., Taylor G.R., Markham A.F., Meredith D.M.: Analysis ofthe mismatch and insertion/deletion binding properties of Thermus thermophilus, HB8, MutS.Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 834�837 (1997)

93. Wood R.D., Mitchell M., Sgouros J., Lindahl T.: Human DNA repair genes. Science, 291,1284�1289 (2001).

94. Worth L.Jr., Clark S., Radman M., Modrich P.: Mismatch repair proteins Mut S and MutL inhi-bit RecA-catalyzed strand transfer between diverged DNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,3238�3241 (1994)

95. Wu T.H., Marinus M.G.: Deletion mutation analysis of the mutS gene in Escherichia coli. J. Biol.Chem. 274, 5948�5952 (1999)

Zak³ad Genetyki Drobnoustrojów U£Instytut Mikrobiologii i Immunologii90-237 £ód�, Banacha 12/16

Wp³ynê³o w maju 2002 r.

301

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 301�317http://www.pm.microbiology.pl

ODPOWIED�LEUKOCYTÓW GOSPODARZA NA ANTYGENY BAKTERYJNE

Justyna Stanis³awska, Bo¿enna Interewicz,Waldemar L. Olszewski

1. Wprowadzenie. 2. LPS i jego wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego. 3. Budowa i aktyw-no�æ biologiczna peptydoglikanu (mureiny). 4. Inne sk³adniki os³on bakteryjnych o w³a�ciwo�ciachantygenowych. 5. Immunogenne w³a�ciwo�ci DNA. 6. Mimikra molekularna i jej rola w etiologiichorób. 7. Podsumowanie

Immune response of host leukocytes for bacterial antigens

Abstract: The immune system has traditionally been divided into innate and adaptive components.The innate immunity refers to the primary immunity against diseases. The innate immune responsedevelops first and then activates the adaptive immune response. The innate components recognizeonly some antigens. These structures are referred to as pathogen-associated molecular pattern (PAMP),for example: lipopolisaccharide � LPS, peptidoglycan � PGN, lipoteichoic acid � LTA, bacterial DNA.Some bacterial antigens show similarity with host structures. This phenomenon is called molecularmimicry and it is one of the important pathogenic factors of microorganisms.

1. Introduction. 2. Effects of lipopolysaccharide on immune cells. 3. Composition and biologicalactivity of peptidoglycan. 4. Others components of bacterial cell wall and their antigenic properties.5. Immunologic properties of DNA. 6. Molecular mimicry. 7. Conclusions

1. Wprowadzenie

Mechanizmy odporno�ci wrodzonej stanowi¹ wczesn¹, nieswoist¹ fazê odpowie-dzi immunologicznej, dopóki nie rozwinie siê odpowied� specyficzna. Zwykle wiêk-szo�æ mikroorganizmów zostaje eliminowana w drodze mechanizmów wrodzonych.Jednak nie s¹ one w stanie rozpoznaæ ka¿dego mo¿liwego antygenu, ale rozpoznaj¹raczej kilka wysokokonserwowanych struktur obecnych u wiêkszo�ci mikroorga-nizmów. Struktury te okre�la siê czêsto jako zwi¹zane z patogenami wzory moleku-larne (PAMP � pathogen-associated molecular pattern) [1, 4], za� receptory zdolnedo ich rozpoznawania i wi¹zania okre�lane s¹ jako receptory rozpoznaj¹ce wzory(PRR � pattern recognition receptors) [31]. Najbardziej znanymi przyk³adami takich

Stosowane skróty okre�leñ angielskichAPC � antigen presenting cells; BPI � bacterial permeability increasing factor; CTL � cytotoxic Tlymphocytes; DC � dendritic cells; FAF � fibroblast activating factor; GlcNAc � N-Acetylglucosami-ne; GM-CSF � granulocyte-macrophage colony stimulating factor; IFN( � intereferon (; LBP � LPSbinding protein; LPS � lipopolisaccharide; MurNAc � N-acetylmuramic acid; NF6B � nuclear factor6B; PAMP � pathogen-associated molecular pattern; PGN � peptidoglycan; PGRP � peptidoglycanrecognition proteins; PMN � polymorphonuclear leukocytes; PRR � pattern recognition receptors;ROS � reactive oxygen species; TCR � T cell receptor; TLR � Toll like receptors; TNF � tumornecrosis factor

302

moleku³ s¹: bakteryjny lipopolisacharyd (LPS), peptydoglikan (mureina), kwasytejchojowe, tejchuronowe i lipotejchojowe, lipoproteiny, bakteryjne DNA, mannanw �cianie komórkowej dro¿d¿y oraz glikan i chityna w �cianach komórkowych grzy-bów [2]. Chocia¿ zwi¹zki te pod wzglêdem budowy chemicznej ca³kiem siê ró¿ni¹,to posiadaj¹ pewne wspólne cechy: produkowane s¹ tylko przez mikroorganizmy,a nie wystêpuj¹ u ich gospodarzy (wyj¹tek � DNA z wieloma niezmetylowanymielementami CpG w odró¿nieniu od DNA eukariotycznego); s¹ one zwykle szcze-gólnie wa¿ne dla prze¿ycia lub patogenno�ci mikroorganizmów; struktury te s¹zazwyczaj zwi¹zane z jak¹� �ci�le okre�lon¹ grup¹ patogenów np. LPS jest struktur¹charakterystyczn¹ tylko dla bakterii Gram-ujemnych [31]. G³ówn¹ grup¹ w�ródPRRs s¹ �Toll like receptors� � TLR, zidentyfikowane najpierw u Drosophila melano-gaster jako receptory Toll, a nastêpnie u wielu innych organizmów [6]. WszystkieTLR wykazuj¹ charakterystyczn¹ budowê � posiadaj¹ dwie specyficzne domeny� konserwatywn¹ cytoplazmatyczn¹ domenê sygnaln¹ Toll/IL-1R (TIR) i zewn¹trz-komórkow¹ domenê obfituj¹c¹ w liczne powtórzenia leucynowe (LRR) [4, 34, 39].Do tej pory u ssaków znaleziono dziesiêæ receptorów TLR, okre�lanych jako TLR1do TLR 10 [1, 55] i podzielono na trzy grupy w zale¿no�ci od sposobu ekspresji:powszechne (TLR1), ograniczone (TLR2, TLR4, TLR5) i specyficzne (TLR3) [33].Rozpoznanie patogenów przez TLR powoduje z regu³y aktywacjê NFêB i gwa³town¹odpowied� immunologiczn¹ w postaci produkcji cytokin i nadregulacji ekspresjimoleku³ kostymuluj¹cych [19, 22]. Warto wspomnieæ, ¿e ró¿ne PAMP rozpozna-wane s¹ przez odrêbne kombinacje TLRs, za� tylko kilka TLRs funkcjonuje jakoreceptory dla produktów bakteryjnych, pozosta³e mog¹ pe³niæ funkcjê korecepto-rów (TLR1, TLR6), promuj¹cych lub hamuj¹cych odpowied� komórkow¹ na ró¿neligandy [1, 55]. Wiêkszo�æ komórek wykazuje ekspresjê przynajmniej jednego TLR,a kilka prawie wszystkich poznanych TLRs ( splenocyty, PBL). Najwiêksz¹ ró¿no-rodno�ci¹ TLR charakteryzuj¹ siê jednak profesjonalne komórki fagocytuj¹ce (g³ów-nie makrofagi i komórki dendrytyczne-DC), które stanowi¹ wa¿ne elementy wro-dzonych mechanizmów odporno�ciowych, stanowi¹cych pierwsz¹ liniê obronyprzed patogenami [19, 22]. TLR1 wystêpuje na wszystkich leukocytach (monocyty,PBL, komórki T, B i NK); TLR2 na komórkach linii mieloidalnej [33]; TLR3� wy³¹cznie na komórkiach dendrytycznych [33], choæ pewna grupa badaczy stwier-dzi³a ekspresjê tego bia³ka równie¿ w komórkach epitelialnych, monocytach, gra-nulocytach, komórkach T i B [55]; TLR4 zidentyfikowano na komórkach liniimieloidalnej [33]; a ekspresj¹ TLR5 w monocytach, niedojrza³ych komórkach DCi komórkach epitelialnych [1, 14]; TLR6 � ekspresja g³ównie w �ledzionie, grasicyi p³ucach [45]; TLR9 i TLR10 � wystêpuj¹ g³ównie na limfocytach B [55].

2. LPS i jego wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego

Najbardziej znanym antygenem bakteryjnym jest LPS czyli lipopolisacharyd bak-terii Gram-ujemnych, bêd¹cy tzw. endotoksyn¹ bakteryjn¹. Jest on czê�ci¹ sk³adow¹b³ony zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych i zbudowany jest z trzech podstawowych

303

czê�ci: lipidu A, polisacharydowego rdzenia oraz O-swoistego ³añcucha cukrowegozwanego antygenem O [17, 27, 53]. Antygen O jest najbardziej zmienn¹ czê�ci¹LPS � u ró¿nych gatunków bakterii odkryto ok. kilkudziesiêciu ró¿nych cukrów,które mog¹ go budowaæ. Jest on g³ówn¹ determinant¹ antygenow¹ LPS i przeciwniemu wytwarzana jest wiêkszo�æ produkowanych przeciwcia³. U wielu gatunkówbakterii istnieje wyra�ny zwi¹zek pomiêdzy ich zjadliwo�ci¹ a budow¹ LPSnp. porównanie ró¿nych szczepów Salmonella enterica sv. Typhimurium, które ró¿-ni³y siê budow¹ ³añcucha cukrowego wykaza³o ró¿nice w zjadliwo�ci wyp³ywaj¹ceze stopnia wra¿liwo�ci na fagocytozê [27]. Kluczowe znaczenie dla mechanizmówodporno�ci wrodzonej ma natomiast konserwatywna hydrofobowa domena LPS� lipid A, który zosta³ zidentyfikowany jako struktura odpowiedzialna za biologiczneefekty dzia³ania LPS [2, 29] i to w³a�nie ten fragment LPS jest g³ównym ligandemdla receptorów TLR [38].

Kr¹¿¹cy w organizmie LPS wi¹zany jest najpierw przez bia³o osocza LBP (LPSbinding protein), transportuj¹c¹ LPS do receptora CD14, który mo¿e wystêpowaæw formie rozpuszczalnej albo jako receptor powierzchniowy makrofagów, monocy-tów i komórek B [32]. Rozpuszczalny CD14 (sCD14) po przy³¹czeniu LPS wi¹¿esiê do niezidentyfikowanego jeszcze receptora i aktywuje komórki linii niemielo-idalnej [48]. B³onowy CD14 (mCD14) jest kluczow¹ protein¹ w aktywacji komórekprzez LPS, choæ jest bia³kiem bez domeny cytoplazmatycznej zakotwiczonym wb³onie za po�rednictwem glkofosfoinozytolu [32, 48]. Sugeruje siê zatem, ¿e CD14po�redniczy w odpowiedzi komórki na LPS poprzez interakcje z kompleksem mole-ku³ transdukuj¹cych sygna³ do jej wnêtrza, w sk³ad którego wchodz¹ najprawdopo-dobniej hsp70 i hsp90 [48]. Na powierzchni makrofagów obecne s¹ równie¿ dwainne bia³ka � proteina adaptorowa MD2 i receptor TLR4 lub TLR2, które tak¿euczestnicz¹ w wi¹zaniu LPS [6, 32], choæ zaczyna przewa¿aæ pogl¹d, ¿e zasadni-czym receptorem dla LPS jest TLR4 [19, 28]. MD2 po�redniczy w rozpoznawaniuLPS przez TLR4, co prowadzi do wytworzenia trójsk³adnikowego (CD14, MD2i TLR4) kompleksu rozpoznaj¹cego i wi¹¿¹cego tê strukturê [19]. TLR4 i MD2 s¹konstytutywnie ze sob¹ po³¹czone, natomiast CD14 jest przy³¹czany dopieropo zwi¹zaniu LPS. Powstanie kompleksu LPS � CD14 � MD2 � TLR4 wywo³ujedimeryzacjê TLR4, ale tylko jeden TLR4 ulega aktywacji i inicjuje kaskadê sygna-³ow¹, która w rezultacie prowadzi do aktywacji kinaz fosforyluj¹cych inhibitor czyn-nika transkrypcyjnego NF6B (I6B). Fosforylacja I6B prowadzi do jego degradacjii uwolnienia NFêB, który przemieszcza siê do j¹dra i indukuje transkrypcjê wielugenów, których produkty uczestnicz¹ w reakcji zapalnej i odpowiedzi immunolo-gicznej [11]. W efekcie dochodzi do ekspresji moleku³ kostymulacyjnych takich jaknp. CD40, CD80 i CD86 oraz sekrecji cytokin zapalnych � IL1, IL6, IL12 i TNF"(rys. 1) [31]. Na powierzchni limfocytów B tak¿e wystêpuje kompleks receptorówuczestnicz¹cych w wi¹zaniu LPS. G³ównym sk³adnikiem tego kompleksu opróczTLR4 i CD14 jest bia³ko RP 105-transb³onowy receptor z ektodomen¹ zawieraj¹c¹powtórzenia leucynowe, podobne do tych, które wystêpuj¹ w TLRs. RP-105 zwi¹-zany jest z cz¹steczk¹ MD1, która po�redniczy w rozpoznawaniu LPS i indukcjisygna³u w komórce [19, 21]. LPS mo¿e zostaæ zwi¹zany równie¿ przez inne bia³ko

304

� BPI (bacterial permeability increasing factor). BPI jest bia³kiem kationowym, wy-stêpuj¹cym na powierzchni neutrofili lub wewn¹trz tych komórek w ziarnach azuro-filnych. Ekspresjê BPI stwierdzono równie¿ w granulach eozynofili i w komórkachepitelialnych [7]. Bia³ko to wi¹¿e LPS i przeciwdzia³a aktywacji komórek przezLPS [13]. Oprócz tego opsonizuje komórki bakterii Gram-ujemnych, co u³atwia usu-wanie tych patogenów przez neutrofile na drodze fagocytozy [7].

Rozpoznanie zwi¹zanych z patogenami wzorów molekularnych (PAMP) przezspecyficzne receptory generuje sygna³y, które aktywuj¹ z kolei mechanizmy uczest-nicz¹ce w swoistej odpowiedzi odporno�ciowej. Ale zanim dojdzie do inicjacji tychmechanizmów antygen bakteryjny oprócz tego, ¿e zostanie zwi¹zany na powierzchnikomórki musi równie¿ zostaæ przetworzony i odpowiednio zaprezentowany napowierzchni komórek APC (antigen presenting cells), do których zaliczane s¹ przedewszystkim makrofagi i komórki dendrytyczne � DC (dendritic cells). W procesietym uczestnicz¹ receptory endocytarne zdolne do rozpoznawania cz¹stek charakte-rystycznych dla mikroorganizmów. Przyk³adem takich receptorów jest makrofagowy

Rys. 1. Droga sygna³owa zainicjowana przez kompleks LPS-CD14-TLR1-MD2

305

receptor mannozowy, który wi¹¿e siê do komponentów �ciany komórkowej mikro-organizmów i po�redniczy w fagocytozie i przetwarzaniu patogenów przez APC[31]. Bia³ka mikroorganizmów ulegaj¹ strawieniu w endosomach, a¿ do utworzeniapeptydów, zdolnych do tworzenia kompleksów z MHC klasy II na powierzchni APC.Peptydy te rozpoznawane s¹ nastêpnie przez receptory komórek T � TCR (T cellreceptor), które ulegaj¹ aktywacji za po�rednictwem sygna³ów p³yn¹cych zarównood TCR, jak i generowanych w wyniku oddzia³ywania moleku³ kostymulacyjnychnp. CD80 na makrofagach z CD28 na komórkach T ( rys. 2) [31].

Rozpoznanie swoistych wysokokonserwowanych u mikroorganizmów strukturindukuje zatem ekspresjê wielu moleku³ kostymulacyjnych i sekrecjê licznych cyto-kin, które wspó³pracuj¹c b¹d� dzia³aj¹c niezale¿nie wywo³uj¹ i wzmacniaj¹ swoist¹i nieswoist¹ odpowied� immunnologiczn¹ gospodarza przeciw intruzowi.

Komórkami aktywowanymi przez LPS s¹ g³ównie makrofagi [29]. Pobudza onmakrofagi do wywarzania trzech grup silnych mediatorów: bia³ek (TNF", IL1, IL6,IL8, interferon), aktywnych zwi¹zków tlenowych (tlen, nadtlenek wodoru, tlenekazotu) i lipidów (prostaglandyny, tromboksan A2, czynnik aktywuj¹cy p³ytki krwi,leukotrieny), które dzia³aj¹c niezale¿nie, razem lub w odpowiedniej kolejno�ci mog¹wywo³ywaæ ró¿ne efekty [53]. Kluczowym bia³kiem, a zarazem jednym z g³ównychmediatorów wydzielanych przez makrofagi jest TNF" [53]. Wywo³uje on ró¿ne

Rys. 2. Wzajemne interakcje miêdzy specyficzn¹ i niespecyficzn¹ odpowiedzi¹ immunologiczn¹

306

reakcje � wydzielany w miejscu zaka¿enia lub guza nowotworowego przyci¹ga ró¿-ne komórki, które zwalczaj¹ zaka¿enie lub niszcz¹ komórki guza; stymuluje komórki�ródb³onka, co objawia siê wiêkszym przyleganiem granulocytów do powierzchninaczyñ; podwy¿sza poziom bia³ek ostrej fazy we krwi oraz bezpo�rednio dzia³ana granulocyty, co wywo³uje zwiêkszon¹ migracjê granulocytów do uszkodzonejtkanki. Pozosta³e bia³ka uwalniane przez makrofagi indukuj¹ podobne efekty. Po-nadto TNF" wraz IL1 aktywuje limfocyty T, a te z kolei produkuj¹ IL2 � cytokinêuczestnicz¹c¹ w aktywacji komórek T i B. Pobudzone makrofagi uwalniaj¹ tak¿eszereg lipidów, które przyczyniaj¹ siê g³ównie do wzrostu temperatury i reguluj¹aktywno�æ komórek uk³adu odporno�ciowego. Natomiast aktywne zwi¹zki tlenowedzia³aj¹c wewn¹trz komórek makrofagów b¹d� na ich powierzchni przyczyniaj¹ siêdo niszczenia bakterii [53] (rys. 3).

Wytwarzane przez makrofagi substancje s¹ pomocne w ograniczaniu zaka¿eniaprzez wywo³anie zlokalizowanej i kontrolowanej odpowiedzi immunologicznej.Takie efekty jak stan podgor¹czkowy oraz pobudzenie uk³adu immunologicznegoprzy�pieszaj¹ zazwyczaj wyzdrowienie i chroni¹ przed innymi zaka¿eniami bakte-ryjnymi. Gdy zaka¿enie jest ciê¿kie, to w organizmie jest znaczna ilo�æ bakterii,

Rys. 3. Wp³yw lipopolisacharydu � LPS na makrofagi

307

które szybko siê mno¿¹ i produkuj¹ ogromne ilo�ci LPS, który z kolei kr¹¿¹c wekrwi kontaktuje siê z makrofagami i powoduje wydzielanie du¿ej ilo�ci mediatorów.Dla organizmu gospodarza ma to bardzo negatywne skutki, a mo¿e nawet doprowa-dziæ do wstrz¹su zagra¿aj¹cemu ¿yciu tzw. wstrz¹su septycznego [53].

LPS wykazuje równie¿ aktywno�æ bez po�rednictwa mediatorów. Wykazuje onaktywno�æ mitogenn¹ wobec limfocytów B i wzmaga aktywno�æ komórek NK.Ma on tak¿e zdolno�æ aktywacji klasycznej drogi dope³niacza przez bezpo�redniezwi¹zanie lipidu A do czynnika C1 [27].

3. Budowa i aktywno�æ biologiczna peptydoglikanu (mureiny)

Peptydoglikan (PGN, mureina) to podstawowy sk³adnik bakteryjnych �cian ko-mórkowych. Jest to heteropolimer zbudowany z N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc), po³¹czonych wi¹zaniem $-1,4-glikozy-dowym, gdzie grupa karboksylowa w MurNAc mo¿e byæ podstawiona krótkim pepty-dem (g³ównie 5 aminokwasów, zarówno D, jak i L) tworz¹cym usieciowanie mureiny.Szczególnie obfity peptydoglikan wystêpuje u bakterii Gram-dodatnich, gdzie mo¿estanowiæ nawet po³owê masy �ciany komórkowej [17, 27, 40].

Komórki gospodarza s¹ nara¿one na du¿e ilo�ci nierozpuszczalnego PGN w po-staci debris �cian komórkowych, ale tak¿e w postaci rozpuszczalnego nieusieciowa-nego PGN, który uwalniaj¹ bakterie podczas normalnych procesów wzrostowych (me-taboliczny obrót mureiny) b¹d� te¿ w obecno�ci antybiotyków $-laktamowych. [27].Innym mechanizmem powoduj¹cym uwalnianie mureiny do �rodowiska s¹ procesyautolizy bakteryjnej, do której dochodzi wówczas, gdy w pewnych warunkach enzy-my rozszczepiaj¹ce wi¹zania w mureinie dzia³aj¹ w sposób niekontrolowany, prowa-dz¹c do degradacji woreczka mureinowego i �mierci komórki. Równie¿ w surowicykrwi wystêpuje szereg czynników (poliaminy, polikationy) oraz bia³ek kationowych(rybonukleaza, lizozym, amidaza, N-acetyloglukozamidaza), które mog¹ indukowaæautolizê komórek bakteryjnych. Procesy degradacji PGN zachodz¹ tak¿e podczasfagocytozy bakterii przez makrofagi, gdy¿ w lizosomach obecne s¹ równie¿ enzymydegraduj¹ce mureinê. Bardzo wa¿n¹ drog¹ pojawiania siê muropeptydów czyli pod-stawowych jednostek strukturalnych mureiny w p³ynach ustrojowych jest sorpcjaz jelita cienkiego, w którym s¹ zwykle bardzo du¿e ilo�ci wolnej mureiny [27].

PGN jako charakterystyczny sk³adnik bakteryjnych �cian komórkowych podob-nie jak LPS rozpoznawany jest przez specyficzne dla niego receptory. Jedn¹ z gruptego typu cz¹stek s¹ PGRP (peptydoglycan recognition proteins) czyli bia³ka rozpo-znaj¹ce PGN, które s¹ szeroko rozpowszechnionymi i konserwatywnymi bia³kamiwystêpuj¹cymi ju¿ u owadów [25]. Wysok¹ ekspresjê mRNA dla PGRP obserwujesiê w komórkach szpiku � g³ównie w neutrofilach, a ni¿sz¹ w innych tkankach lim-fatycznych. Sugeruje to udzia³ ssaczych PGRP w odporno�ci, jakkolwiek dok³adnyrodzaj komórek wykazuj¹cych ekspresjê PGRP, jak i funkcja tych bia³ek nie jestdo koñca znana. Wiadomo, ¿e ssacze PGRP funkcjonuj¹ jako wewn¹trzkomórkoweantybakteryjne bia³ka w neutrofilach i hamuj¹ wzrost bakterii Gram-dodatnich,

308

a tak¿e przyczyniaj¹ siê do zahamowania kilku zaindukowanych przez bakteriew makrofagach i neutrofilach procesów (fagocytoza bakterii Gram-dodatnich w ma-krofagach, wybuch tlenowy w neutrofilach, produkcja cytokin zaindukowana przezPGN w makrofagach) [25]. Najprawdopodobniej mo¿na je zaliczyæ do grupy PRRpodobnie jak wspomniany ju¿ CD14, który równie¿ posiada zdolno�æ rozpoznawa-nia i wi¹zania mureiny [9]. Specyficzno�æ PGRP jest jednak znacznie bardziej ogra-niczona w porównaniu z CD14. PGRP wi¹¿¹ z wysok¹ specyficzno�ci¹ tylko roz-puszczalny, nieusieciowany i niezmodyfikowany PGN, a nie rozpoznaj¹ w ogóleinnych komponentów �cian komórkowych bakterii takich jak np. LPS czy kwasylipotejchojowe � LTA. CD14 wi¹¿e natomiast wszystkie te struktury z takim samympowinowactwem. Po drugie PGRP ulegaj¹ ekspresji wy³¹cznie w PMN (polymor-phonuclear leukocytes), gdzie s¹ obecne wewn¹trz ziaren i funkcjonuj¹ jako we-wn¹trzkomórkowe bia³ka o w³a�ciwo�ciach antybakteryjnych. CD14 jest z koleireceptorem powierzchniowym wystêpuj¹cym przede wszystkim na monocytachi makrofagach, po�rednicz¹cym w odpowiedzi zapalnej komórek. Ponadto CD14mo¿e byæ obecny równie¿ w formie rozpuszczalnej w osoczu, gdzie funkcjonujejako aktywator komórek CD14� i wzmacnia odpowied� komórek CD14+. Bia³ka tenie wykazuj¹ tak¿e ¿adnej strukturalnej i sekwencyjnej homologii [25]. CD14 mo¿ezatem s³u¿yæ jako receptor zarówno dla LPS, jak i PGN. W przypadku LPSnajpierw powstaje w osoczu kompleks LPS-LBP, a dopiero nastêpnie za po�red-nictwem CD14 i TLR4 dochodzi do aktywacji komórki. Natomiast w przypadkumureiny w aktywacji uczestnicz¹ tylko CD14 i TLR 2 [40], który funkcjonuje jakoheterodimer z TLR6 [1, 19] lub TLR1 [1, 21], co stwarza mo¿liwo�æ rozpoznawaniawiêkszego repertuaru czasteczek.

Muropeptydy oddzia³ywuj¹ na organizm gospodarza g³ównie za po�rednictwemmakrofagów [40]. Do najwa¿niejszych oddzia³ywañ na makrofagi mo¿na zaliczyæ:zahamowanie syntezy DNA; zahamowanie migracji makrofagów i zwiêkszenie ichprzylegania do powierzchni; zwiêkszenie ilo�ci wydzielanych metabolitów tlenowych,które uczestnicz¹ w procesach niszczenia drobnoustrojów i komórek nowotworowych;przed³u¿enie ¿ycia makrofagów. Muropeptydy stymuluj¹ równie¿ silnie wydzielanieró¿nego rodzaju czynników przez monocyty i makrofagi np. GM-CSF � czynnik sty-muluj¹cy powstawanie kolonii makrofagów i granulocytów, czynnik FAF aktywuj¹cyfibroblasty, czynnik snu, IL1, IL6, IL8 i TNF" [40]. Aktywacja makrofagów i sekre-cja przez nie mediatorów powoduje z kolei aktywacjê limfocytów B i T. PGN oddzia-³ywuje na limfocyty B równie¿ bezpo�rednio jako nieswoisty poliklonalny aktywator,co wywo³uje produkcjê przeciwcia³ i limfokin przez zaktywowane komórki B. Nato-miast aktywacja komórek T prowadzi do sekrecji limfokin, ale równie¿ przyczynia siêdo powstawania cytotoksycznych komórek T [27].

5. Inne sk³adniki os³on bakteryjnych o w³a�ciwo�ciach antygenowych

�ciany komórkowe wszystkich bakterii Gram-dodatnich oprócz PGN zawieraj¹kwasy tejchojowe albo tejchuronowe, a niektóre zawieraj¹ mieszaninê obu tych kwa-

309

sów. Równie powszechnie w �cianach komórkowych bakterii Gram-dodatnich wy-stêpuj¹ kwasy lipotejchojowe � LTA oraz bia³ka, których ilo�æ oraz znaczenie ró¿nisiê w zale¿no�ci od gatunku, a nawet szczepu [27]. Kwasy tejchojowe s¹ polimeramifosforanów glicerolu lub rybitolu. Kwasy tejchuronowe natomiast s¹ d³ugimi polime-rami zbudowanymi z powtarzaj¹cych siê jednostek � zwykle naprzemiennie wystêpu-j¹cych reszty cukrowej i reszty kwasu uronowego np. glukuronowego. Natomiastcech¹ charakterystyczn¹ LTA jest wystêpowanie na koñcu ³añcucha glikolipiduzakotwiczonego w b³onie cytoplazmatycznej [17]. Glicerolowe kwasy tejchojowemaj¹ zdolno�æ modulacji odpowiedzi immunologicznej organizmu. Modulacja taprzebiega najprawdopodobniej ró¿nymi szlakami i przy wspó³udziale wszystkichg³ównych populacji komórek tworz¹cych uk³ad odporno�ciowy. Powoduj¹ one miê-dzy innymi aktywacjê makrofagów, aktywacjê limfocytów T w obecno�ci makrofa-gów i bezpo�redni¹ poliklonaln¹ aktywacjê komórek B. LTA wydzielane s¹ przezrosn¹ce bakterie w du¿ych ilo�ciach do otaczaj¹cych tkanek podczas bakteriolizyindukowanej przez lizozym, antybiotyki hamuj¹ce syntezê makromoleku³ �cianylub leukocytarne peptydy kationowe. Najwa¿niejsze z biologicznych w³a�ciwo�ciLTA to: antygenowo�æ � indukuj¹ wytwarzanie przeciwcia³, aktywuj¹ dope³niaczi powoduj¹ uwolnienie przez neutrofile i makrofagi reaktywnych zwi¹zków tlenu,tlenku azotu, cytokin (TNF", IL1, IL6, IL10) i innych czynników zapalnych [18].Do komórek docelowych LTA mog¹ wi¹zaæ siê niespecyficznie za po�rednictwemb³onowych fosfolipidów albo specyficznie przy udziale CD14 i TLR2 [8].

Z os³onami bakteryjnymi zwi¹zanych jest równie¿ wiele bia³ek. Jedn¹ z takichgrup s¹ bakteryjne lipoproteiny, wystêpuj¹ce u wszystkich Eubacteria i bêd¹ce silny-mi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej [27]. Za biologiczne w³a�ciwo�ci tychbia³ek odpowiedzialna jest zmodyfikowana reszta cysteinowa na N-koñcu, podsta-wiona przez trzy reszty kwasu palmitynowego. Lipoproteiny aktywuj¹ g³ównie ma-krofagi przy udziale TLR2 i CD14, prowadz¹c do rozwoju odpowiedzi zapalnej [2,55].

Antygenowo�æ wykazuj¹ tak¿e poryny b³ony zewnêtrznej [17]. Jednym z takichbia³ek jest OmpA, które jest szeroko rozpowszechnione i konserwowane w�ródEnterobacteriaceae. Innymi bia³kami, o których warto wspomnieæ to poryny� OmpC i OmpF. Obserwacje wskazuj¹, ¿e OmpC Salmonella enterica sv. Typhimu-rium po�redniczy w adherencji do makrofagów, natomiast peptydy wywodz¹ce siêz Omp F E. coli wzmacniaj¹ cytotoksyczno�æ tych komórek [27]. Do�wiadczeniapotwierdzaj¹ równie¿, ¿e bia³ko OmpA jest rozpoznawane i wi¹zane przez makro-fagi, a nastêpnie ulega internalizacji, co w rezultacie prowadzi do aktywacji tychkomórek oraz produkcji TNF", IL1, IL8 i innych cytokin zapalnych oraz rodnikówtlenowych, które uczestnicz¹ w odpowiedzi antybakteryjnej [41]. Prowadzono rów-nie¿ badania z bia³kiem porynowym PorB Neisseria meningitidis i stwierdzono, ¿ebia³ko to wykazuje zdolno�æ do stymulacji limfocytów B i nadregulacji powierzch-niowej ekspresji moleku³y B7-2 (CD86). Znacz¹c¹ rolê w tym procesie odgrywaTLR2, który jest zdolny do rozpoznawania du¿ej grupy antygenów bakteryjnych.Sugeruje siê tak¿e, ¿e poryny jako bia³ka zdolne do tworzenia kana³ów w b³onachbakteryjnych mog¹ aktywowaæ komórki uk³adu immunologicznego równie¿ przeztworzenie kana³ów jonowych w ich b³onach [28].

310

Tak¿e na zewnêtrznej powierzchni komórki bakteryjnej mog¹ wystêpowaæ struk-tury o w³a�ciwo�ciach antygenowych. Przyk³adem mog¹ byæ dwa rodzaje wypustekzakotwiczonych w os³onach � s¹ to d³ugie rzêski i znacznie krótsze oraz zwykle odnich liczniejsze fimbrie (pili). Komórki Gram-ujemne zwykle maj¹ i rzêski i fimbrie,natomiast rzadko struktury te wystêpuj¹ u bakterii Gram-dodatnich. Rzêski umo¿li-wiaj¹ bakteriom poruszanie siê i zbudowane s¹ z bia³ka flagelliny, które mo¿e byæbakteryjnym czynnikiem wirulencji i jest rozpoznawane przez TLR5 [2, 21], co po-woduje aktywacjê NF6B i wydzielanie TNF" [14, 55]. Fimbrie, czyli pili s¹ z koleicienkimi wyrostkami zbudowanymi z bia³ka piliny i odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê podczaskoniugacji � uczestnicz¹ w transferze materia³u genetycznego z komórki do komórki[17]. U niektórych gatunków po�rednicz¹ tak¿e w adhezji. S¹ one umieszczone nazewn¹trz komórki, nie s¹ os³oniête materia³em otoczkowym i maj¹ silne w³a�ciwo�ciantygenowe. Stwierdzono, ¿e fimbrie powoduj¹ uwalnianie wielu cytokin z komórekepitelialnych, monocytów, makrofagów, fibroblastów i limfocytów [17].

6. Immunogenne w³a�ciwo�ci DNA

Równie¿ DNA bakteryjne stanowi silny antygen. Wynika to z faktu, ¿e w DNAbakteryjnym wystêpuj¹ struktury i sekwencje, które nie s¹ obecne w DNA ssakówi to w³a�nie one rozpoznawane s¹ przez uk³ad immunologiczny jako obce [35, 44].Podstawowa ró¿nica miêdzy DNA bakteryjnym a ssaczym polega na tym, ¿ew DNA bakteryjnym obecna jest du¿a ilo�æ tzw. sekwencji CpG, natomiast w geno-mie krêgowców dinukleotydy CpG s¹ rzadkie, a dodatkowo ulegaj¹ preferencyjnejmetylacji w pozycji pi¹tej cytozyny [16, 24]. U ssaków metylacja CpG i ma³a ilo�ætych sekwencji zapobiega aktywacji uk³adu immunologicznego przez DNA gospo-darza [51]. Wiêkszo�æ zmetylowanych sekwencji CpG wystêpuje w promotorachgenów, czyli w miejscach inicjacji replikacji i transkrypcji DNA. Pozosta³e czê�æfunkcjonuje jako niezmetylowane wyspy CpG do³¹czone do koñca 5' wielu genów.Sugeruje siê zatem, ¿e krêgowce pozostawi³y metylacjê DNA jako mechanizmobronny przed obcym DNA, które mog³oby siê wintegrowaæ w ich genom [50].Prowadzono równie¿ badania z DNA wywodz¹cym siê od bezkrêgowców (owady� D. melanogaster, dro¿d¿e, nicienie i miêczaki) i stwierdzono, ¿e wywiera on po-dobny do bakteryjnego DNA wp³yw na uk³ad immunologiczny, gdy¿ podobnie jakDNA drobnoustrojów zawiera niezmetylowane dinukleotydy CpG. Nale¿y wspom-nieæ, ¿e aktywacji nie powoduje DNA bakteryjne, które w warunkach do�wiadczal-nych poddano metylacji, a tak¿e DNA strawione DNA-z¹ [50].

DNA podobnie jak inne antygeny bakteryjne rozpoznawane jest przez komórkiAPC (makrofagi, DC i monocyty). Do wnêtrza komórki DNA przedostaje siê nadrodze endocytozy, a nastêpnie dochodzi do generowania specyficznych metaboli-tów tlenowych � ROS (reactive oxygen species) [30], co z kolei przyczynia siê doindukcji fosforylacji inhibitora I6B, jego degradacji i uwolnienia NF6B [43]. NF6Bprzemieszcza siê do j¹dra, gdzie uczestniczy w regulacji transkrypcji wielu genów[24]. Jednak¿e ekspresja nie wszystkich genów uczestnicz¹cych w odpowiedzi

311

immunologicznej regulowana jest za po�rednictwem NF6B. Do indukcji mo¿e doj�ærównie¿ w inny sposób � przy udziale kaskady sygna³owej, w której uczestniczydu¿a grupa kinaz bia³kowych, co w rezultacie aktywuje inny czynnik transkrypcyjny� AP1, który równie¿ wêdruje do j¹dra i wyzwala sekrecjê cytokin (TNF",IL1, IL12) oraz syntezê moleku³ kostymulacyjnych (CD80,CD86, CD40) [10](rys. 4). Na komórki B bakteryjne DNA mo¿e dzia³aæ bezpo�rednio wywo³uj¹c ichproliferacjê i syntezê przeciwcia³. CpG DNA bezpo�rednio aktywuje równie¿komórki NK [42, 44], co prowadzi do wzrostu ich aktywno�ci litycznej i produkcjiIFN(. Nie wykazano natomiast bezpo�redniego wp³ywu DNA drobnoustrojów nalimfocyty T. Stymulacja tych komórek przebiega po�rednio za spraw¹ dojrza³ychAPC, ich moleku³ kostymulacyjnych i wydzielanych przez nie cytokin. Aktywnekomórki T wydzielaj¹ IL2 oraz wzmagaj¹ ekspresjê receptora dla IL2, a tak¿eulegaj¹ wzmo¿onej proliferacji i przekszta³caj¹ siê w komórki CTL (cytotoxic Tlymphocytes) [37] (rys. 5). Efekt stymulacji przez bakteryjne DNA jest prawie iden-tyczny jak w przypadku LPS � istniej¹ jednak pewne ró¿nice. CpG DNA indukuj¹odpowied� w komórkach i organach, które s¹ odporne na dzia³anie LPS. LPSpotrzebuje obecno�ci LBP w surowicy i musi zostaæ zwi¹zany przez to bia³ko, ¿eby

Rys. 4. Schemat drogi sygnalnej zainicjowanej przez bakteryjne DNA (CpG DNA)a � endocytoza, b � powstawanie reaktywnych metabolitów tlenowych � ROS, c � indukcja fosforylacji I6B przezROS, d � degradacja I6B, e � translokacja NF6B do j¹dra, f � fosforylacja kinazy JNK i p38, g � fosforylacja c-Jun

aktywuj¹cego czynnik transkrypcyjny ATF-2, h � aktywacja AP-1, i � translokacja AP-1 do j¹dra

312

zaindukowaæ odpowied�. Aktywacja przy udziale CpG DNA jest z kolei wra¿liwana inhibitory endocytozy, w zwi¹zku z czym inicjacja drogi sygnalnej przez LPSi DNA bakteryjne musi przebiegaæ nieco inaczej [16]. Jednak¿e obie te drogi akty-wacyjne w pewnym momencie ³¹cz¹ siê i nastêpuje to najprawdopodobniej naetapie indukcji czynników transkrypcyjnych. Zatem zarówno DNA, jak i LPSwywieraj¹ podobny wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego � w wynikunadmiernej aktywacji i nadprodukcji mog¹ wyst¹piæ liczne stany zapalne, szokseptyczny, a nawet �mieræ organizmu gospodarza.

Odpowied� na bakteryjne DNA odbywa siê za po�rednictwem TLR9 [1, 3,19, 21, 55]. Lokalizacja receptora rozpoznaj¹cego CpG nadal pozostaje spraw¹dyskusyjn¹. Istnieje jednak wiele dowodów wskazuj¹cych na to, i¿ TLR9 nie jest

Rys. 5. Aktywacja komórek uk³adu immunologicznego przez CpG DNA- - - - � aktywacja niebezpo�rednia (kostymulacja)���� � aktywacja bezpo�rednia

↑ � nadregulacja syntezy i sekrecji; bakteryjne DNA stymuluje bezpo�rednio komórki B, NK i APC(DC, makrofagi). Komórki T ulegaj¹ kostymulacji za po�rednictwem moleku³ powierzchniowych

313

zlokalizowany na powierzchni komórki ale w jej wnêtrzu [3]. Przemawia za tymmiêdzy innymi fakt, ¿e do aktywacji komórki niezbêdna jest internalizacja CpG[19], a inhibitory endocytozy jak np. bafilomycyna A hamuj¹ kaskadê sygnaln¹zainicjowan¹ przez bakteryjne DNA [16].

W zwi¹zku ze specyficznymi w³a�ciwo�ciami bakteryjnego DNA istniej¹ du¿eszanse na wykorzystanie plazmidowego DNA b¹d� te¿ syntetycznych pochodnychtzw. CpG ODN (syntetyczne oligodeoksynukleotydy z sekwencjami CpG) jakoszczepionki lub adjuwanty w szczepionkach przeciw bakteriom, paso¿ytom i wiru-som [37, 46]. Szczepionki bazuj¹ce na bakteryjnym DNA maj¹ wiele zalet w sto-sunku do obecnie stosowanych szczepionek: nie ma mo¿liwo�ci rewersji do postaciwirulentnej; s¹ ³atwe do wyprodukowania, podczas gdy wiele do tej pory wyko-rzystywanych antygenów jest technicznie trudna do uzyskania. DNA bakteryjnewywo³uje równie¿ in vivo polaryzacjê limfocytów T w kierunku populacji Th1,co stwarza przes³anki do zastosowania go w immunoterapii np. w alergiach jakoadjuwanty promuj¹ce odpowied� Th1 [20, 24, 51].

8. Mimikra molekularna i jej rola w etiologii chorób

Pisz¹c o antygenach bakteryjnych nale¿y równie¿ wspomnieæ o zjawisku okre�la-nym jako mimikra molekularna. Mo¿na j¹ zdefiniowaæ jako podobieñstwo struktural-ne ró¿nych moleku³ pochodz¹cych od ró¿nych genów. Podobieñstwo to mo¿e wyni-kaæ z podobnej sekwencji aminokwasów lub podobnej konformacji cz¹steczki i mo¿ewystêpowaæ u bardzo odrêbnych grup organizmów [26]. Odpowied� immunologicznaprzeciwko determinantom antygenowym wystêpuj¹cym zarówno u gospodarza, jaki patogenu mo¿e doprowadziæ do tkankowo-specyficznej odpowiedzi immunolo-gicznej, która z kolei mo¿e wywo³aæ destrukcjê komórek i tkanek w wyniku reakcjiautoimmunologicznej. Mimikra molekularna mo¿e byæ zatem strategi¹ wykszta³con¹przez patogeny, umo¿liwiaj¹c¹ im wnikniêcie do organizmu gospodarza, dotarcie dokomórki docelowej, a nastêpnie manipulowanie wewn¹trz- i zewn¹trzkomórkowymiprocesami w celu wymkniêcia siê spod kontroli uk³adu odporno�ciowego gospodarza.Podobieñstwo miêdzy antygenami drobnoustrojów takimi jak: wêglowodany, lipopoli-sacharydy, glikolipidy czy bia³ka, i autoantygenami organizmu cz³owieka sprawia, ¿enawet ³agodne w przebiegu zaka¿enie mo¿e doprowadziæ do rozwoju reakcji krzy-¿owej, a w konsekwencji do rozwoju choroby autoimmunologicznej [52].

Do chorób, których etiologia wi¹zana jest z mimikr¹ molekularn¹ nale¿¹ miêdzyinnymi: gor¹czka reumatyczna (rheumatic fever), przewlek³y go�ciec postêpu-j¹cy (rheumatic arthritis), pierwotna marsko�æ ¿ó³ciowa (PBC � primary biliarycirrhosis) [52].

G³ówn¹ przyczyn¹ gor¹czki reumatycznej � RF i jej formy ostrej � ARF (acuterheumatic fever) s¹ paciorkowce grupy A � bakterie Gram-dodatnie, które mog¹wywo³ywaæ równie¿ zaka¿enia gard³a i krtani oraz prowadziæ do licznych powi-k³añ. Powik³ania te zwi¹zane s¹ miêdzy innymi z wystêpowaniem podobieñstw miê-dzy sk³adnikami �ciany komórkowej paciorkowców (wêglowodany, mukopeptydy,

314

bia³ka � M, R i T) a tkankami ludzkimi. Natomiast wydaje siê, ¿e na patogenezêgor¹czki reumatycznej mo¿e mieæ znaczny wp³yw strukturalne podobieñstwobia³ek M do bia³ek ludzkich takich jak: tropomiozyna, keratyna i wimentyna [52].Mimikra cz¹steczkowa jest równie¿ jedn¹ z przyczyn przewlek³ego go�æca postêpu-j¹cego � RA. Antygenami bakteryjnymi, które s¹ prawdopodobnie zwi¹zane z wy-stêpowaniem tego schorzenia s¹ bia³ka szoku termicznego (heat shock proteins),okre�lane równie¿ jako bia³ka stresu [36]. W organizmie ludzkim dochodzi tak¿e doekspresji bia³ek wstrz¹su termicznego, które pojawiaj¹ siê na powierzchni komórekgospodarza w tkankach dotkniêtych procesem zapalnym. Odkryto mimikrê cz¹stecz-kow¹ miêdzy Hsp65 z Mycobacterium tuberculosis a antygenami hsp tkanki chrzêst-nej czlowieka, co wp³ywa na powstawanie autoprzeciwcia³ i stymulacjê limfocytówT. Istniej¹ tak¿e dane dotycz¹ce zwi¹zku pa³eczek jelitowych E.coli z wystêpowa-niem go�æca na skutek mimikry molekularnej pomiêdzy Hsp60 cz³owieka i Hsp60E. coli. Warto wspomnieæ, ¿e bia³ka szoku cieplnego i to zarówno prokariotyczne,jak i eukariotyczne wykazuj¹ silne w³a�ciwo�ci immunoregulacyjne oraz posiadaj¹zdolno�æ do indukcji odpowiedzi zapalnej [2], co mo¿e stanowiæ podstawê teorii, ¿ebia³ka Hsp mog¹ byæ ogniwem pomiêdzy infekcj¹ a chorob¹ autoimmunologiczn¹[36]. Wiele dowodów wskazuje na to, ¿e bia³ka Hsp takie jak: Hsp60, Hsp70, Hsp90i GP96 aktywuj¹ makrofagi i komórki DC za po�rednictwem TLR2 i TLR4 [1].

Pa³eczka jelitowa E.coli jest równie¿ brana pod uwagê jako czynnik patogennyw pierwotnej marsko�ci ¿ó³ciowej � PBC. Badania wykazuj¹, ¿e podobieñstwomiêdzy podjednostk¹ E2 dehydrogenazy pirogronianowej cz³owieka i tak¹ sam¹podjednostk¹ enzymu z E.coli mo¿e byæ czynnikiem zapocz¹tkowywuj¹cym reak-cjê autoimmunologiczn¹, w której bior¹ udzia³ zarówno limfocyty T, jak i autoprze-ciwcia³a antymitochondrialne, co prowadzi do destrukcji przewodów ¿ó³ciowychi zniszczenia w¹troby [52].

Istnieje jeszcze wiele innych chorób, których wystêpowanie wi¹zane jest z mi-mikr¹ cz¹steczkow¹ � choroba Gravesa i Basedowa, miastenia, zesztywniaj¹cezapalenie stawów krêgos³upa [52], borelioza � choroba z Lyme [15, 54], chorobawrzodowa zwi¹zana z Helicobacter pylori [47, 49], zapalenie opon mózgowych wy-wo³ane przez E.coli K1, Neisseria meningitidis grupy B i Streptococcus grupy B,zespó³ Guillaina-Barrego (GBS) [23], choroby serca zwi¹zane z zaka¿eniem Chla-mydia [5]. We wszystkich tych schorzeniach du¿¹ rolê odgrywa autoimmunologicz-na reakcja organizmu wynikaj¹ca z podobieñstw pomiêdzy antygenami ludzkimii bakteryjnymi. Dok³adne poznanie tego zjawiska stanowi du¿e wyzwanie dla bada-czy, gdy¿ bêdzie mia³o du¿e znaczenie praktyczne zarówno w leczeniu, jak i profi-laktyce. Dotyczy to g³ównie szczepionek, w przygotowaniu których nale¿y koniecz-nie wykluczyæ antygeny wspólne dla bakterii i gospodarza.

9. Podsumowanie

Ostatnie lata przynios³y znacz¹cy postêp w zrozumieniu wrodzonych mechaniz-mów odporno�ciowych. Sta³o siê to dziêki identyfikacji receptorów specyficznychdla produktów bakteryjnych, poznaniu zasadniczych elementów komórkowych dróg

315

sygnalnych i g³ównych mediatorów, produkowanych przez komórki w odpowiedzina infekcje. Stworzy³o to solidne podstawy do dalszych badañ w tej dziedzinie,które dotyczyæ bêd¹ najprawdopodobniej analizy polimorfizmu TLRs oraz zrozu-mienia, jak poszczególne receptory TLR rozpoznaj¹ specyficzne dla siebie ligandy.

Pi�miennictwo

1. Akira S.: Mammalian Toll-like receptors. Curr. Opin. Immunol. 15, 5�11 (2003)2. Aderem A., Ulevitch R.J.: Toll-like receptors in the induction of the innate immunne response.

Nature, 406, 782�787 (2000)3. Ahmad-Nejad P., Hacker H., Rutz M., Bauer S., Vabulas R.M., Wagner B.: Bacterial CpG-DNA and

lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. Eur. J. Immunol.32, 1958�1968 (2002)

4. Anderson K.V.: Toll signaling pathways in the innate immune response. Curr. Opin. Immunol. 12,13�19 (2000)

5. Bachmaier K., Le J., Penninger J.M.: �Catching heart disease�: Antigenic mimicry and bacterialinfections. Nature Medicin, 6, 841�843 (2000)

6. Brightbill H.D., Modlin R.L.: Toll-like receptors: molecular mechanisms of the mammalianimmune response. Immunol. 101, 1�10 (2000)

7. Canny G., Levy O., Furuta G., Narravula-Alipati S., Sisson R.B., Serhan Ch.N., Colgan S.P.:Lipid mediator-induced expression of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) inhuman mucosal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3902�3907 (2002)

8. Ginsburg I.: Role of lipoteichoic acid in infection and inflammation. Lancet, 2, 171�179 (2002)9. Gupta D., Kirkland T.N., Viriyakosol S., Dziarski R.: CD14 is a cell activating receptor for bac-

terial peptidoglycan. J. Biol. Chem. 271, 23310�23316 (1996)10. Häcker H., Mischak H., Miethke T., Liptay S., Schmid R., Sparwasser T., Heeg K., Lipford G.,

Wagner H.: CpG-DNA-specific activation of antigen-presenting cells requires stress kinaseactivity and is preceded by non-specific endocytosis and endosomal maturation. EMBO J. 17,6230�6240 (1998)

11. Haddad J.J., Fahlman C.S.: Nuclear factor-6B-independent regulation of lipopolysaccharide-mediated interleukin-6 biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 1045�1051 (2002)

12. Hajjar A.M., Ernst R.K., Tsai J.H., Wilson C.B., Miller S.I.: Human Toll-like receptor 4 recogni-zes host-specific modifications. Nat. Immunol. 3, 354�359 (2002)

13. Haudek S.B., Natmessnig B.E., Redl H., Schlag G., Hatlen L.E., Tobias P.S.: Isolation, partialcharacterization, and concentration in experimental sepsis of baboon lipopolysaccharide � bin-ding protein. J. Lab. Clin. Med. 136, 363�370 (2000)

14. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S.,Underhill D.M., Aderem A.: The innate immune response to bacterial flagellin is mediated byToll-like receptor 5. Nature, 410, 1099�1103 (2001)

15. Hemmer B., Gran B., Zhao Y., Marques A., Pascal J., Tzou A., Kondo T., Cortese I., Bielekova B.,Straus S.E., McFarland H. F., Houghten R., Simon R., Pinilla C., Martin R.: Identification of candi-date T-cell epitopes and molecular mimics in chronic Lyme disease. Nat. Med. 5, 1375�1382 (1999)

16. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K.,Wagner H., Takeda K., Akira S.: A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 408,740�745 (2000)

17. Henderson B., Poole S., Wilson M.: Bacteria Cytokine Interactions in Health and Disease. Port-land Press Ltd. London 1998

18. Hermann C, Spreitzer I., Schroder N.W., Morath S., Lehner M.D., Fischer H., Schutt C., Schu-mann R.R., Hartung T.: Cytokine induction by purified lipoteichoic acids from various bacterialspecies-role of LBP, sCD14, CD14 and failure to increase IL-12 and subsequent IFN-gammarelease. Eur. J. Immunol. 32, 541�551 (2002)

316

19. Imler J-L., Hoffman J.A.: Toll receptors in innate immunity. Trends Cell Biol. 11, 304�311 (2001)20. Jakob T., Walker P.S., Krieg A.M., Udey M.C., Vogel J.C.: Activation of Cutaneous Dendritic

Cells by CpG-Containing Oligodeoxynucleotides: A Role for Dendritic Cells in the Augmenta-tion of Th1 Responses by Immunostimulatory DNA. J. Immunol. 161, 3042�3049 (1998)

21. Janeway C.A., Medzhitov R.: Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197�216(2002)

22. Kaisho T., Akira S.: Toll-like receptors as adjuvant receptors. Biochim. Biophys. Acta. 1589, 1�13(2002)

23. Korzeniowska-Kowal A., Witkowska D., Gamian A.: Mimikra cz¹steczkowa bakteryjnych anty-genów polisacharydowych i jej rola w etiologii chorób infekcyjnych i autoimmunologicznych.Post. Hig. Med. Do�w. 55, 211�232 (2001)

24. Krieg A. M.: The role of CpG motifs in innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 12, 35�43 (2000)25. Liu Ch., Gelius E., Liu G., Steiner H., Dziarski R.: Mammalian peptidoglycan recognition protein

binds peptidoglycan with high affinity, is expressed in neutrophils and inhibits bacterial growth.J. Biol. Chem. 275, 24490�24499 (2000)

26. Oldstone M. B.: Molecular mimicry and immune mediated diseases. FASEB J. 12, 1255�126(1998)

27. Markiewicz Z.: Struktura i funkcje os³on bakteryjnych. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 199328. Massari P., Henneke P., Ho Y., Latz E., Golenbock D.T., Wetzler L.M.: Cutting edge: immune

stimulation by neisserial porins is toll-like receptor 2 and myD88 dependent. J. Immunol. 168,1533�1537 (2002)

29. Matsuguchi T., Takagi K., Musikacharoen T., Yoshikai Y.: Gene expression of lipopolysaccharidereceptors 2 and 4 are differently regulated in mouse T lymphocytes. Blood, 95, 1378�1385 (2000)

30. McCluskie M.J., Davis H.L.: Novel Strategies Using DNA for the Induction of Mucosal Immunity.Crit. Rev. Immunol. 19, 303�329 (1999)

31. Medzhitov R., Janeway Ch.: Innate immunity. N. Engl. J. Med. 343: 338�343 (2000)32. Muta T., Takeshige K.: Essential roles of CD14 and lipopolysaccharide-binding protein for acti-

vation of toll-like receptor TLR2 as well as TLR4. Eur. J. Biochem. 268, 4580�4589 (2001)33. Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D�amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van�t Veer

C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., Mantovani A.: Differential expression and regulationof toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells.J. Immunol. 164, 5998�6004 (2000)

34. Muzio M., Mantovani A.: Toll-like receptors (TLRs) signalling and expression pattern. J. Endo-toxin. Res. 7, 297�300 (2001)

35. Pisetsky D.S.: The immunologic properties of DNA. J. Immunol. 156, 421�423 (1996)36. Pockey G.A.: Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic agents?

Expert Reviews in Molecular Medicine, 21, 1�21 (2001)37. Polañczyk M.: Immunostimulatory effects of DNA and CpG motifs. Centr. Eur. J. Immunol. 25,

160�166 (2000)38. Reisser D., Pance A., Jeannin J.-F.: Mechanisms of the antitumoral effect of lipid A. BioEssays,

244, 284�289 (2002)39. Schuster J.M., Nelson P.S.: Toll receptors: an expanding role in our understanding in human

disease. J. Leukoc. Biol. 67, 767�773 (2000)40. Schwandner R., Dziarski R., Wesche H., Rothe M., Kirschning C.J.: Peptidoglycan and lipo-

teichoic acid induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J. Biol. Chem. 274,17406�17409 (1999)

41. Soulas C., Baussant T., Aubry Y. D., Barillant N., Caron G., Renno T., Bonnefoy J.-Y., Jeannin P.:Outer membrane protein A (Omp A) binds to and activates human macrophages. J. Immunol. 165,2335�2340 (2000)

42. Sparwasser T., Koch E.-S., Vabulas R.M., Heeg K., Lipford G., Ellwart J.H.: Bacterial DNA andimmunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendriticcells. Eur. J. Immunol. 28, 2045�2054 (1998)

317

43. Sparwasser T., Miethke T., Lipford G., Erdmann A., Häcker H., Heeg K., Wagner H.: Macro-phages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor á-mediated shock.Eur. J. Immunol. 27, 1671�1679 (1997)

44. Stacey K.J., Sweet M.J., Hume D.A.: Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.J. Immunol. 157, 2116�2122 (1996)

45. Takeuchi O., Kawai T., Snajo H., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., Takeda K., Akira S.:TLR6: A novel member of an expanding toll-like receptor family. Gene, 231, 59�665 (1999)

46. Tascon R.E., Ragno S., Lowrie D.B., Colston M.J.: Immunostimulatory bacterial DNA sequencesactivate dendritic cells and promote priming and differentiation of CD8+ cells. Immunol, 99,1�7 (2000)

47. Taylor D.E., Fedorak R.N., Sherburne R.: Antigenic mimicry between Helicobacter pylori andgastric mucosa: failure to implicate heat-shock protein Hsp60 Using immunoelectron microscopy.Helicobacter, 4, 148�153 (1999)

48. Triantafilou K., Triantafilou M., Ladha S., Mackie A., Dedrick R.L., Fernandez N., Cherry R.:Fluorescence recovery after photobleaching reveals that LPS rapidly transfers from CD14 tohsp70 and hsp90 on the cells membrane. J. Cell Science, 114, 2535�2545 (2001)

49. Vandenbroucke-Grauls C. M., Appelmelk B. J.: Helicobacter pylori LPS: molecular mimicry withhost and role in autoimmunity. Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 30, 259�260 (1998)

50. Wagner H.: Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infection Danger. Adv. Immunol.73, 329�368 (1999)

51. Weiner G.J.: The immunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxy-nucleotides. J. Leukoc. Biol. 68, 455�463 (2000)

52. Witkowska D.: Mimikra cz¹steczkowa jako czynnik patogenno�ci bakterii. Post. Hig. Med. Do�w.53, 545�558 (1999)

53. Woltmann A., Hamann L., Ulmer A.J., Gerdes J., Bruch H.-P., Rietschel E.T.: Molecular mecha-nism of sepsis. Arch. Surg. 383, 2�10 (1998)

54. Zajkowska J.M., Hermanowska-Szpakowicz T., Pancewicz S.A., Kondrusik M.: Selected aspectsof immunopathogenesis in Lyme disease. Pol. Merkuriusz Lek. 9, 579�583 (2000)

55. Zarember K.A., Godowski P.J.: Tissue expression of human toll-like receptors and differentialregulation of toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, andcytokines. J. Immunol. 168, 554�561 (2002)

Zak³ad Chirurgii TransplanatacyjnejInstytut Medycyny Do�wiadczalnej i Klinicznej im. Miros³awa Mossakowskiego PANul. Pawiñskiego 5, 02-106 Warszawa, tel. (022) 608 64 06, (022) 608 64 10 lub (022) 668 53 16

Wp³ynê³o w lutym 2003 r.

319

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 319�343http://www.pm.microbiology.pl

ZADANIA LABORATORIÓWMIKROBIOLOGICZNYCH

W PRZYPADKUATAKU BIOTERRORYSTYCZNEGO

Adam Kaznowski, Joanna Mokracka,Ryszard Koczura

1. Wprowadzenie. 2. Zarys historyczny u¿ycia broni biologicznej. 3. Charakterystyka broni biolo-gicznej. 4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych. 4.1. Sytuacje �wiadcz¹ce o u¿yciu broni bio-logicznej. 4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym 4.3. Organizacja systemulaboratoriów mikrobiologicznych w USA. 4.4. Opakowywanie i przesy³anie materia³ów zaka�-nych. 4.5. Ochrona laboratorium. 4.6. Identyfikacja wa¿niejszych czynników broni biologicznej.4.6.1. B. anthracis. 4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Wirus ospy prawdziwej.4.6.5. Wirusy gor¹czek krwotocznych. 4.6.6. Toksyna botulinowa. 5. Podsumowanie

Role of microbiological laboratories in case of bioterroristic attack

Abstract: The threat of terrorists using biological warfare agents has received increased attentionin recent years. Biological agents have been used as weapon for thousands of years to produce fearand harm in humans. They are invisible, silent, odorless, tasteless, easy to disperse and inexpensiveto produce. In this article, the properties of the most important biological agents are presented.A short history of biological weapon usage, and its clinical aspects are described. Microbiology labo-ratories are considered to be the first lines of defense for recognision of biological agents duringa possible terrorism event. In the USA, laboratories involved in preparedness to bioterrorism havebeen classified by CDC into four biosafety levels depending on their facilities and abilities. Thepaper focuses on the role of microbiology laboratory in preparation for and response to a bioterroristicevent, clues indicating attack and identification methods of the most important biological agents. Themicrobiologists can provide a practical assessment of the biological weapons incident, consequentlythe best response to a terroristic incident could be undertaken, many lives saved, panic and crisisthroughout the country avoided.

1. Introduction. 2. Short historical view on using of biological weapon. 3. Characterization ofbiological weapon. 4. The role of microbiological laboratories. 4.1. Clues of a biological weaponattack. 4.2. Biosafety in microbiological laboratories. 4.3. Organization of microbiological labo-ratory network in the USA. 4.4. Packing and shipping of infectious substances. 4.5. Laboratorysecurity. 4.6. Identification of the most important biological weapon agents. 4.6.1. B. anthracis.4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Variola virus. 4.6.5. Hemorrhagic feverviruses. 4.6.6. Botulinum toxin. 5. Summary

1. Wprowadzenie

Zgodnie z artyku³em I Konwencji o broni biologicznej, która odby³a siê w 1972 r.w Genewie, zalicza siê do niej �mikrobiologiczne lub inne biologiczne czynnikilub toksyny, bez wzglêdu na ich pochodzenie lub sposób produkcji, typ lub ilo�æ,których u¿ycie nie jest uzasadnione ze wzglêdów profilaktycznych, ochronnych lubdo innych pokojowych celów� [74].

320

Ataki terrorystyczne na niespotykan¹ skalê przeprowadzone w USA (11 wrze-�nia 2001 r.) i Moskwie (pa�dziernik 2002 r.), doniesienia s³u¿b wywiadowczychoraz gro�by organizacji terrorystycznych sygnalizuj¹ mo¿liwo�æ zastosowaniatak¿e i broni biologicznej w tego rodzaju akcjach. Przedmiotem ataku mog¹ byæbezpo�rednio ludzie [39, 56], a tak¿e zwierzêta hodowlane i uprawy rolne, cow konsekwencji mo¿e mieæ du¿y wp³yw na cz³owieka [72, 76].

Broñ biologiczna nie jest nowo�ci¹, w przesz³o�ci stosowano j¹ w dzia³aniachwojennych, podejmowano tak¿e próby jej u¿ycia w akcjach terrorystycznych [8, 44,45, 66]. W³a�ciwo�ci broni biologicznej predestynuj¹ j¹ do zastosowania w atakachterrorystycznych. U¿ycie jej mo¿e spowodowaæ wysok¹ zachorowalno�æ i �miertel-no�æ, a w konsekwencji uczyniæ przeciwnika niezdolnym do walki w czasie wojnylub przyczyniæ siê do osi¹gniêcia du¿ego spektakularnego efektu, co jest jednymz celów oczekiwanych przez terrorystów. Zastosowanie broni biologicznej mo¿espowodowaæ tak¿e negatywne efekty psychologiczne i spo³eczne: depresjê, panikê,chaos i dezorganizacjê ¿ycia spo³ecznego [17, 36, 39, 61, 63, 70].

Drobnoustroje, które mog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczna s¹ stosun-kowo ³atwe do otrzymania, poniewa¿ mo¿na je wyosobniæ z próbek pobranychod chorych zwierz¹t i ze �rodowiska. Broñ biologiczna jest skuteczna w niewielkichilo�ciach lub stê¿eniach, jej produkcja nie wymaga skomplikowanych technologii,a gromadzenie mo¿na ³atwo utajniæ [32, 36, 63].

U¿ycie broni biologicznej nie jest natychmiast wykrywalne, poniewa¿ jest onapozbawiona zapachu, smaku, nie tworzy widocznych chmur, a objawy zwyklewystêpuj¹ po kilku dniach i mog¹ mieæ one charakter klasycznych symptomów gry-powych [3, 61]. Ze wzglêdu na du¿¹ ró¿norodno�æ czynników zaka�nych i toksyn,ich identyfikacja jest czasoch³onna i mozolna, czêsto wymaga specjalistycznychmetod, natomiast leczenie poszkodowanych jest trudne. Dotyczy to w szczególno�cidrobnoustrojów wystêpuj¹cych na danym terenie endemicznie, ale zmienionychgenetycznie, o zwiêkszonej wirulencji i oporno�ci na wiele czynników przeciwdrobnoustrojowych, w tym antybiotyki i �rodki dezynfekcyjne [36, 45, 63]. Broñbiologiczn¹ mo¿na stosunkowo ³atwo zaadaptowaæ do zastosowania na du¿¹ skalê,np. w postaci aerozolu. Jest ona tañsza w produkcji w porównaniu z broni¹ wybu-chow¹ konwencjonaln¹, j¹drow¹ i chemiczn¹ [60]. Analiza ekonomiczna wykaza³a,¿e do osi¹gniêcia zbli¿onych efektów strat cywilnych nak³ady finansowe na broñbiologiczn¹ wynosz¹ zaledwie 0,5% kosztów broni wybuchowej [19].

Ostateczny efekt u¿ycia broni biologicznej uzale¿niony jest nie tylko od rodzajupreparatu i wielko�ci dawki, ale tak¿e od wielu innych czynników, np. drogi poda-nia. Wiêkszo�æ preparatów broni biologicznej przygotowuje siê w postaci aerozoli,w takiej formie dzia³aj¹ one szybciej i skuteczniej ni¿ po rozpuszczeniu w wodzielub podaniu do ¿ywno�ci. Liczba bakterii, wirusów lub ilo�æ toksyny, podanaw preparacie aerozolowym mo¿e byæ niska poniewa¿ czynniki biologiczne mog¹podlegaæ kumulacji do ilo�ci wywo³uj¹cej objawy chorobowe i �mieræ [14].

Aerozol mo¿e byæ uwolniony z samolotów, ³odzi motorowych, samochodów po-ruszaj¹cych siê pod wiatr lub nawet z wysokich wie¿owców. Warunki meteoro-logiczne mog¹ mieæ wp³yw na ostateczn¹ skuteczno�æ u¿ytej broni poniewa¿ silny

321

wiatr i turbulencja powietrza przyczyniaj¹ siê do szybkiego rozproszenia aerozolui tym samym spadku efektywno�ci broni biologicznej [61].

Realna mo¿liwo�æ u¿ycia broni biologicznej w atakach wojennych lub terro-rystycznych stworzy³a konieczno�æ przeprowadzenia dzia³añ informacyjnychw�ród spo³eczeñstwa, przygotowania odpowiednich �rodków pozwalaj¹cych naprzeciwdzia³anie skutkom jej u¿ycia, oraz organizacyjnych w zakresie postêpo-wania s³u¿by zdrowia, policji, stra¿y po¿arnej i administracji [26, 59, 63]. Dzia-³ania takie podjêto tak¿e i w Polsce. Zasady postêpowania lekarskiego w przypad-ku ataku bioterrorystycznego zosta³y opracowane przez C h o m i c z e w s k i e g oi wsp. [7]. Schematy postêpowania i zwi¹zane z tym zadania szpitali dostêpne s¹ nastronach internetowych G³ównego Inspektoratu Sanitarnego [18, 37]. Niezwyklewa¿ne jest tak¿e okre�lenie zadañ laboratoriów mikrobiologicznych, które powinnype³niæ podstawow¹ rolê w szybkiej i skutecznej diagnostyce pozwalaj¹cej ziden-tyfikowaæ rodzaj i w³a�ciwo�ci u¿ytych preparatów biologicznie czynnych. Wynikiuzyskane w tych laboratoriach powinny przyczyniæ siê do oceny niebezpieczeñ-stwa, podjêcia dzia³añ terapeutycznych i profilaktycznych, a tak¿e byæ wykorzy-stane przy doborze metod neutralizacji u¿ytej broni biologicznej w �rodowisku [4, 34, 51]. W niniejszej pracy zostanie krótko przedstawiona historia u¿ycia bronibiologicznej, najwa¿niejsze jej rodzaje i w³a�ciwo�ci, a tak¿e zadania i metodydiagnostyczne dla laboratoriów mikrobiologicznych w przypadku ataku z zasto-sowaniem tego rodzaju broni.

2. Zarys historyczny u¿ycia broni biologicznej

Poni¿ej przedstawiono wa¿niejsze fakty dotycz¹ce u¿ycia broni biologicznej orazdzia³ania zmierzaj¹ce do zakazu jej u¿ycia.l Staro¿ytno�æ � do XIX w. Ska¿anie wody pitnej wrogów zdech³ymi, cuchn¹-

cymi zwierzêtami [8],l �redniowiecze. Katapultowanie zw³ok ludzi zmar³ych w wyniku epidemii, np.

w roku 1346 Tatarzy wywo³ali w ten sposób epidemiê d¿umy w oblê¿onejtwierdzy Kaffa na Krymie (aktualnie Feodozja, Ukraina) [71].

l 1763 r. Wywo³anie epidemii w�ród Indian w czasie wojny w Stanach Zjedno-czonych, wskutek przekazania im koców i chust zaka¿onych wirusem ospyprawdziwej [8, 19, 21, 34].

l 1914�1917. U¿ycie przez Niemców laseczki w¹glika i pa³eczki nosacizny ce-lem zaka¿enia zwierz¹t hodowlanych przeciwników, ponadto podjêcie próbyzastosowania bakterii cholery i d¿umy przeciwko ludziom [8, 14, 19].

l 1925 r. Podpisanie �Protoko³u Genewskiego� o zakazie stosowania broni che-micznej i biologicznej w dzia³aniach wojennych [63].

l 1931�1941. Badania i u¿ycie bronii biologicznej przez Japoñczyków. Pod-czas prób w Mand¿urii i Chinach zginê³o ok. 10000 osób w wyniku zaka¿eniabakteriami cholery, d¿umy, tyfusu, w¹glika, riketsjami, wirusem ospy i in-nymi drobnoustrojami. Japoñczycy zaka¿ali wodê pitn¹ i ¿ywno�æ, ponadto

322

hodowle bakterii by³y rozpylane z samolotów. Uwolniono tak¿e z samolotów15 mln. pche³ wyhodowanych i zaka¿onych w laboratoriach [19].

l 1941�1942. Przeprowadzenie przez Brytyjczyków prób u¿ycia bomb ze spo-rami laseczki w¹glika na wyspie Gruinard w pobli¿u Szkocji. Przetrwalnikiwykazywa³y ¿ywotno�æ a¿ do roku 1986, kiedy przeprowadzono dezynfekcjêwyspy przy u¿yciu formaldehydu i wody morskiej [8, 43].

l 1941. Podjêcie programu badawczego w zakresie broni biologicznej w USA[19].

l 1957�1963. Zastosowanie w Brazylii wirusów ospy, ospy kurzej, grypy i bak-terii gru�licy przeciwko Indianom [19].

l 1972 r. Ustanowienie w Genewie konwencji �O zakazie produkcji, przecho-wywania i zniszczeniu broni biologicznej i chemicznej�. Do 1975 r. podpisa³yj¹ 144 pañstwa [74].

l 1978 r. Atak z u¿yciem rycyny, toksyny wyekstrahowanej z nasion r¹cznikapospolitego (Ricinus communis), na bu³garskiego emigranta W³adymiraKostowa w Pary¿u oraz 10 dni pó�niej na innego dysydenta, Georgi Markowaw Londynie, który pomimo udzielonej pomocy medycznej zmar³ trzy dni pó�-niej [8, 19, 36, 61].

l 1979 r. Awaria w o�rodku wojskowym w Swierd³owsku (aktualnie Jekateryn-burg), przetrwalniki laseczki w¹glika wydosta³y siê do powietrza [27, 43].Ostatnie analizy dostêpnych danych sugeruj¹, ¿e kontakt z endosporami la-seczki w¹glika mia³o 250 osób, z których 100 zmar³o [29].

l 1960�1999. Podjêcie w USA 33 prób u¿ycia broni biologicznej. Miêdzy inny-mi w 1984 roku w stanie Oregon, religijna grupa Indian Rajneeshee skazi³abary sa³atkowe w 10 restauracjach w Dallas bakteriami Salmonella Typhimu-rium w konsekwencji czego zachorowa³o 751 osób [41, 63, 66]. Motywy ter-rorystów by³y ró¿ne, poczynaj¹c od protestów o charakterze antyrz¹dowym,¿¹dañ nacjonalistycznych, politycznych, apokaliptycznych proroctw, moty-wów przestêpczych i kryminalnych, a¿ do ekoterrorystycznych i walki o pra-wa zwierz¹t [41, 64, 66].

l 1972�1991. Tajna produkcja bronii biologicznej w ZSRR. W arsenale posia-dano 30 ton przetrwalników B. anthracis i ponad 20 ton wirusa ospy prawdzi-wej, a tak¿e wirus Marburg i bakterie d¿umy [11, 34].

l 1991 r. Wykazanie posiadania przez Irak 19000 l stê¿onej toksyny botulino-wej. Ta ilo�æ by³aby wystarczaj¹ca do zabicia ka¿dego cz³owieka na ziemitrzykrotnie [2]. Ponadto, w Iraku wyprodukowano 8500 l bakterii i przetrwal-ników w¹glika [11, 27, 36] oraz 2200 l aflatoksyny [11, 36].

l 1997�1998. Nowa forma ataku bioterrorystycznego w USA, polegaj¹ca naprzes³aniu adresatom listów z endosporami bakterii w¹glika. Osoby, któremia³y styczno�æ z broni¹ biologiczn¹, w tym pracownicy przyjmuj¹cy i sor-tuj¹cy pocztê, zosta³y poddane natychmiastowej kuracji antybiotykowej, niezanotowano zgonu w wyniku tych akcji [64].

l 2001 r. Ataki sporami B. anthracis przesy³anymi drog¹ pocztow¹. Stwierdzono22 przypadki w¹glika u ludzi, w tym 11 zaka¿eñ skórnych i 11 inhalacyjnych.

323

Piêæ osób zmar³o. Dwadzie�cia (91%) osób, u których stwierdzono w¹glik by³opracownikami poczty, w�ród nich byli dorêczyciele oraz pracownicy sortownilistów i przesy³ek [31]. Obecno�æ laseczek w¹glika stwierdzono tak¿e w prób-kach pobranych na terenie sortowni [16, 65]. Bakterie B. anthracis wyizolo-wane z proszku z 4 kopert, wyhodowane z próbek materia³ów pobranych od10 pacjentów oraz ze 121 próbek pobranych ze �rodowiska wzd³u¿ drogi jak¹przeby³y przesy³ki, nie wykazywa³y ró¿nic przy zastosowaniu molekularnejmetody typowania MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeatanalysis) [24]. Izolaty mia³y taki sam wzór oporno�ci na antybiotyki. By³y wra¿-liwe na penicylinê, amoksycylinê, ciprofloksacynê, doksycyklinê, chloramfeni-kol, klindamycynê, tetracyklinê, rifampicynê, klarytromycynê i wankomycynê,natomiast by³y �rednio wra¿liwe na erytromycynê i ceftriakson [31].

3. Charakterystyka broni biologicznej

Wiele rodzajów, gatunków, grup drobnoustrojów lub ich produktów mo¿e byæ wy-korzystane jako broñ biologiczna. Nie wszystkie mikroorganizmy lub ich produktymaj¹ tak¹ sam¹ potencjê do u¿ycia w atakach terrorystycznych lub wojnach. Ze wzglê-du na chorobotwórczo�æ, mo¿liwo�æ u¿ycia na du¿¹ skalê, trudno�æ w rozpoznawaniuchorób i identyfikacji drobnoustrojów, broñ biologiczn¹ podzielono na 3 kategorie.Do kategorii A zaliczono Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis,toksyny Clostridium botulinum, Poxvirus variolae, Filoviridae (np. wirus Ebola)i Arenaviridae (np. wirus Lassa). Czynniki kategorii A stanowi¹ potencjalnie naj-wiêksze zagro¿enie dla ludzi, charakteryzuj¹ siê mo¿liwo�ci¹ wywo³ania wysokiej�miertelno�ci i chorobotwórczo�ci, a ich identyfikacja wymaga specjalistycznego przy-gotowania personelu i niestandardowych metod identyfikacji [39, 56].

W kategorii B umieszczono Coxiella burnetii, Brucella spp., Burkholderia mallei,Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazekii, rycynê (tok-syna z Ricinus communis), toksynê epsilon Clostridium perfringens, enterotoksynê BStaphylococcus aureus i wirusy rodzaju Alphavirus: wenezuelski wirus zapaleniamózgu, wirus koñskiego zapalenia mózgu typu wschodniego, wirus koñskiego zapale-nia mózgu typu zachodniego. Wydzielon¹ podgrup¹ w tej kategorii s¹ drobnoustroje,którymi mo¿na zakaziæ ¿ywno�æ lub wodê, natomiast nie opracowano techniki przy-gotowania ich w postaci aerozolu. Nale¿¹ do niej: Salmonella sp., Shigella sp., Esche-richia coli O157:H7, Vibrio cholerae i Cryptosporidium parvum. Wiêkszo�æ czynni-ków zaliczonych do kategorii B tak¿e wykazuje potencjalne mo¿liwo�ci u¿yciana du¿¹ skalê, ale powoduj¹ one ni¿sz¹ �miertelno�æ i chorobotwórczo�æ, ponadtos¹ ³atwiejsze do zidentyfikowania, chocia¿ tak¿e wymagaj¹ specyficznych metoddiagnostycznych i specjalistycznego przygotowania personelu [39, 56].

Czynniki kategorii C ze wzglêdu na swoje cechy chorobotwórcze mog¹ stanowiæzagro¿enie w przysz³o�ci. Zaliczono do nich wirus Nipah, hantawirusy, wirus klesz-czowego zapalenia mózgu, wirus ¿ó³tej febry, wirus kleszczowej gor¹czki krwotocz-nej i bakterie Mycobacterium tuberculosis oporne na wiele antybiotyków [39, 56].

324

Aktualnie powszechnie s¹dzi siê, ¿e najwiêksze prawdopodobieñstwo u¿ycia jakobroni biologicznej dotyczy przetrwalników bakterii w¹glika. Ich wa¿niejsze w³a�ci-wo�ci przedstawiono w tabeli I. Spory laseczki w¹glika mo¿na produkowaæ w du-¿ych ilo�ciach, wykorzystuj¹c proste metody, powszechnie znane przez mikrobiolo-gów. Mo¿na je przechowywaæ latami bez utraty ich potencji. Mog¹ byæ ³atworozproszone w powietrzu z pocisków, rakiet lub pojemników pod ci�nieniem. Sporynie maj¹ koloru, nie tworz¹ ob³oków, s¹ bez zapachu i smaku. Istniej¹ wiêc bardzodu¿e trudno�ci w stwierdzeniu u¿ycia tej broni [19, 27, 61].

W warunkach naturalnych �ród³em laseczek w¹glika zaka¿aj¹cych cz³owieka s¹chore zwierzêta ro�lino¿erne (owce, kozy, konie, �winie, byd³o) oraz materia³y po-chodz¹ce od nich, np. miêso, skóra, krew, we³na, produkty spo¿ywcze [15, 27, 38,67]. W¹glik u cz³owieka wystêpuje w trzech postaciach: skórnej, p³ucnej i jelito-wej. Najczê�ciej wystêpuje postaæ kliniczna skórna (95�98%), która rozwija siêjako charakterystyczna czarna krosta. W postaci jelitowej, wystêpuj¹cej po spo¿y-ciu zaka¿onego, surowego mleka lub niedogotowanego miêsa zaka¿onych zwierz¹t,przetrwalniki dostaj¹ siê do b³ony �luzowej i wêz³ów ch³onnych jelit, wywo³uj¹czmiany krwotoczne i martwicze. Przebieg choroby jest ciê¿ki, rozpoczyna siê wy-miotami, bólami brzucha, biegunk¹, wysok¹ gor¹czk¹. Chory zwykle umiera po2�3 dniach od daty zaka¿enia [15, 27, 38, 40, 46, 67].

Postaæ p³ucna na pocz¹tku objawia siê zmianami typowymi dla zaka¿enia gór-nych dróg oddechowych i ju¿ w ci¹gu 3�5 dni prowadzi do ostrej niewydolno�ciuk³adu oddechowego. [15, 17, 27, 36, 38, 40, 46, 67]. Wiêksz¹ ilo�æ danych doty-cz¹cych chorobotwórczo�ci B. anthracis i jej uwarunkowania przedstawili M a t r a si B a r t o s z c z e [40].

Dokonano szczegó³owej analizy pierwszych 10 przypadków inhalacyjnego w¹g-lika, bêd¹cego wynikiem ataku bioterrorystycznego w USA w 2001 r. Mia³y onemiejsce w stanach Columbia, Floryda, New Jersey i Nowy Jork. �redni wiek zaka-¿onych osób wynosi³ 56 lat (zakres 43�73 lat), 70% stanowili mê¿czy�ni. Poszko-dowani ulegli zaka¿eniu w wyniku otrzymania listu ze sporami lub sortowania,dostarczania przesy³ek do odbiorców. Czas od ekspozycji do pojawienia siê pierw-szych objawów chorobowych wynosi³ 4�6 dni. Pierwszymi objawami zaka¿eniaby³a podwy¿szona temperatura cia³a i dreszcze (n=10), pocenie siê (n=7), znu¿enielub z³e samopoczucie (n=10), niewielki kaszel (n=9), duszno�ci, wymioty (n=10).Prze�wietlenie klatki piersiowej wykaza³o nacieki w p³ucach u 7 osób oraz wysiêkop³ucnowy u 8 osób. W leczeniu pacjentów zastosowano kombinowan¹ intensywn¹terapiê z równoczesnym zastosowaniem kilku preparatów antybakteryjnych. Pomimotego czterech pacjentów zmar³o [30].

Do tej pory istniej¹ braki w zakresie skutecznych metod leczenia ludzi, którzyuprzednio nie zostali zabezpieczeni przez szczepienie. Dostêpna w USA szczepion-ka powoduje niewielkie uboczne reakcje, nie jest jednak przeznaczona do powszech-nego zastosowania, zalecana jest do u¿ycia dla osób nara¿onych zawodowo na kon-takt z tymi bakteriami. Antybiotyki s¹ skuteczne wówczas, je¿eli s¹ podane w bardzokrótkim czasie po zaka¿eniu, zwykle 24�48 godzin. W terapii zaka¿eñ powodo-wanych przez laseczki w¹glika zalecane s¹: ciprofloksacyna w dawce 400 mg co

325

Bacillus anthracis nie 8000�50000 spor 1�6 dni 3�5 dni ok. 99% Morfologia komórek i kolonii, w³a�ciwo�cifenotypowe, immunofluorescencja, RT-PCR,sekwencjonowanie 16S rDNA

Yersinia pestis tak, 10�50 komórek 2�3 dni 1�6 dni 40�70% Morfologia komórek i kolonii, w³a�ciwo�ciwysoka czêsto�æ fenotypowe, testy serologiczne

Francisella tularensis nie 10�50 komórek 2�10 dni 2 tygodnie 33% Morfologia komórek i kolonii, w³a�ciwo�cifenotypowe, testy serologiczne

Variola major tak, 10�100 wirionów 7�17 dni 4 tygodnie 20�50% ELISA, PCR, efekty cytopatyczne i inkluzjewysoka czêsto�æ w hodowli na zarodkach kurzych, techniki

immunologiczne

Wirusy gor¹czek tak, 1�10 wirionów 4�21 dni 7�16 dni 53�88% PCR, ELISA, testy serologiczne i immuno-krwotocznych �rednia czêsto�æ histologiczne, hodowle na zwierzêtach

laboratoryjnych

Toksyna nie LD50

= 0,001 mg/kg 1�5 dni zgon w czasie wysoka ELISA, odczyn neutralizacji na myszachbotulinowa A 24�72 godz. lub

kilku miesiêcy

Tabela ICharakterystyka broni biologicznej zaliczonej do kategorii A [2, 13, 22, 27, 29, 34, 36, 48]

Czynnik biologiczny

Przenoszeniez cz³owieka

choregona zdrowego

Dawka zaka�na(w postaciaerozolu)

Czasinkubacji

Czastrwaniachoroby

�miertel-no�æ przy

brakuleczenia

Identyfikacja

326

8�12 godzin, doksycyklina (200 mg do¿ylnie i potem 100 mg co 8�12 godz.) orazpenicylina (2 mln jednostek) ze streptomycyn¹ (30 mg/kg) podawane co 2 godz.[9, 15, 17, 27, 36, 38, 67].

W 1970 roku komitet ekspertów WHO teoretycznie okre�li³, ¿e uwolnieniez samolotu 50 kg przetrwalników w¹glika nad terenem zamieszka³ym przez 5 mlnludzi spowoduje chorobê u 250 000 osób z czego, w przypadku braku podjêcia le-czenia, zmar³oby ok. 100 000 osób [27]. W 1993 r. w USA oszacowano, ¿e po uwol-nieniu 100 kg spor w¹glika w Waszyngtonie, 130 000 do 3 mln osób ponios³oby�mieræ [29]. W symulacjach kosztów leczenia terapia 100 000 osób kosztowa³aby26,2 miliardów dolarów [33].

Inn¹ broni¹ biologiczn¹ zaliczon¹ do kategorii A s¹ bakterie d¿umy, Yersiniapestis (Tab. I). D¿uma to ostra choroba zaka�na, która znana jest w dwóch podsta-wowych postaciach klinicznych: d¿umy dymienicznej, przenoszonej na ludzi przezpch³y z zaka¿onych gryzoni, przewa¿nie szczurów i d¿umy p³ucnej, w której zaka-¿enie nastêpuje od chorego cz³owieka. Objawami zaka¿enia pa³eczk¹ d¿umy s¹:gor¹czka, dreszcze, ból g³owy, krwioplucie. W typowym przebiegu d¿umy liczbaleukocytów u pacjentów wynosi 12 000�25 000/ml krwi [73]. W krótkim czasie po-stêpuje toksemia i nasilaj¹ca siê duszno�æ. �mieræ nastêpuje w wyniku niewydolno�ciwielonarz¹dowej. Okres inkubacji trwa 2�3 dni, czas choroby 1�6 dni [28, 36].

Wed³ug obliczeñ ekspertów WHO uwolnienie 50 kg bakterii Y. pestis w postaciaerozolu nad miastem zamieszkiwanym przez 5 mln osób mo¿e wywo³aæ zaka¿eniep³ucne u 150 000 osób, z których 36 000 umrze. Pa³eczki d¿umy s¹ ¿ywotne w aero-zolu przez 1 godz. i mog¹ byæ z samolotu rozprzestrzenione na odleg³o�æ do 10 km.W leczeniu tej choroby stosowane s¹: streptomycyna, gentamycyna, tetracyklina,doksycyklina, chloramfenikol i fluorochinolony, np. ciprofloksacyna, lewofloksa-cyna i ofloksacyna [17, 28].

Pa³eczki tularemii powoduj¹ ostr¹ odzwierzêc¹ chorobê zaka�n¹, wystêpuj¹c¹w naturalnych warunkach w�ród gryzoni. Bakterie te mog¹ dostaæ siê do organizmucz³owieka poprzez uszkodzon¹ skórê, nab³onek, drogi pokarmowe i przez p³ucaw przypadku aerozolu. Pa³eczka ta przekazywana mo¿e byæ na cz³owieka przezkleszcze, gzy, a nawet komary. Ponadto, �ród³em zaka¿enia cz³owieka mo¿e byæwoda, gleba i ro�linno�æ. Pocz¹tek choroby u cz³owieka jest nag³y, z gwa³townymidreszczami, bólem miê�ni, g³owy, uczuciem os³abienia i wymiotami. Czêsto obser-wuje siê tak¿e zapalenie spojówek i zaczerwienienie twarzy. W przypadku atakuz u¿yciem tych bakterii w postaci aerozolu zaka¿enie przybierze najciê¿sz¹ postaætej choroby, z obrazem �ródmi¹¿szowego zapalenia p³uc. �miertelno�æ w przypadkubraku leczenia jest wysoka i siêga 30�50%. W leczeniu tularemii skuteczne s¹: strep-tomycyna, gentamycyna, tetracykliny, chloramfenikol i ciprofloksacyna [13, 17, 36].

W latach 50- i 60-tych opracowano technikê aerozolizacji tych bakterii, a w 90--tych przeprowadzono modyfikacje genetyczne, w konsekwencji których uzyskanoszczepy oporne na wiele antybiotyków i o innej strukturze antygenowej, co uczy-ni³o nieskutecznym zabezpieczenie szczepionk¹ [36]. W 1969 r. eksperci WHO osza-cowali, ¿e rozproszenie 50 kg bakterii tularemii w postaci aerozolu nad obszaremzamieszkiwanym przez 5 mln ludzi spowoduje zaka¿enie 250000 osób, z których

327

19 000 umrze [13]. Analiza kosztów leczenia wykaza³a konieczno�æ nak³adów5,4 miliarda dolarów na ka¿de 100000 osób [33].

Do bardzo gro�nej broni biologicznej zaliczono tak¿e wirusy ospy prawdziwej(Tab. I). W okresie gdy ospa panowa³a endemicznie na ró¿nych kontynentach, obser-wowano dwie postacie tej choroby: ospê wielk¹, czyli klasyczn¹ ze �miertelno�ci¹ do30% oraz ospê ma³¹ o �miertelno�ci ok. 1%. Rezerwuarem tych wirusów i �ród³emzaka¿enia jest wy³¹cznie cz³owiek, okres zaka�liwo�ci ok. 3 tygodnie. Do przeno-szenia siê choroby dochodzi drog¹ kropelkow¹ lub przez styczno�æ ze zmianamina skórze, b³onami �luzowymi lub odzie¿¹ i zanieczyszczonymi przedmiotami. Ospaprawdziwa przebiega z charakterystyczn¹ wysypk¹, pocz¹tek choroby jest nag³yz gor¹czk¹, bólami g³owy, uczuciem rozbicia i wyczerpania, silnymi bólami miê�nigrzbietu, niekiedy z bólami brzucha. Pierwsze 2�3 dni choroby, przed pojawieniemsiê wysypki, przypominaj¹ objawy grypy, dopiero pó�niej temperatura obni¿a siê i naskórze pojawiaj¹ siê wykwity przechodz¹ce od plamki, grudki do krosty. Wysypkarozpoczyna siê na twarzy i koñczynach, a nastêpnie na tu³owiu. W roku 1958 WHOpodjê³a próbê wykorzenienia tej choroby, w latach 70-tych uzyskano sukces. Ostatniezachorowania na ospê zarejestrowano w 1977 r. [17, 21, 22, 36]. W 1980 r. WHOuzna³a t¹ chorobê za zlikwidowan¹ i zaprzestano szczepieñ [22].

Wobec zaprzestania szczepieñ ochronnych aktualnie u¿ycie wirusa ospy praw-dziwej jako broni biologicznej wywo³a³oby katastrofalne efekty. Odporno�æ poszczepionce wynosi 3�5 lat i w celu jej utrzymania konieczne jest ponowne szcze-pienie [21, 22]. Poniewa¿ aktualna ilo�æ zgromadzonej szczepionki jest za ma³aistnieje konieczno�æ opracowania nowych, bardziej efektywnych preparatów anty-genowych do uzyskania odporno�ci na ospê prawdziw¹ na wypadek u¿ycia tychwirusów podczas ataku wojennego lub bioterrorystycznego [42, 55].

Gor¹czki krwotoczne stanowi¹ grupê zachorowañ charakteryzuj¹cych siê stanempodwy¿szonej temperatury oraz zaburzeniami krzepniêcia krwi, co prowadzi dowybroczyn, krwawienia narz¹dów wewnêtrznych i w jamach cia³a oraz ich uszko-dzenia. Gro�nym powik³aniem przy zaka¿eniach tymi mikroorganizmami s¹ zakrzepynaczyniowe. Pocz¹tkowe objawy zaka¿enia trwaj¹ zwykle do 6 dni, nie wykazuj¹cech charakterystycznych i s¹ to: os³abienie, gor¹czka, ból g³owy, bóle miê�niowe,zapalenie gard³a, wymioty, biegunka. Wirusy tej grupy mog¹ byæ wykorzystanew atakach bioterrorystycznych w celu zaka¿enia ludzi przez drogi oddechowe.Objawy kliniczne zaka¿eñ zale¿¹ od wzajemnych interakcji pomiêdzy wirusemi gospodarzem. �miertelno�æ waha siê od 0,2% a¿ do 50�90%. Grupa wirusówpowoduj¹ca gor¹czki krwotoczne jest zró¿nicowana. Arenaviridae obejmuj¹ wiru-sy: argentyñski, boliwijski, wenezuelski i gor¹czki Lassa. Bunyaviridae obejmuj¹hantawirusy i wirusa gor¹czki krymsko-kongijskiej. Z kolei do Filoviridae zali-czane s¹ wirusy Ebola, Marburg, ¿ó³tej gor¹czki i Denga. Najgro�niejsze wirusyto Marburg i Ebola. S¹ to RNA wirusy, wra¿liwe na temp. 60°C oraz rutynowostosowane �rodki dezynfekcyjne: fenolany, podchloryn sodu, formalina, promienieUV, b-propiolakton. Okres inkubacji wirusem Marburg wynosi 3�9 dni, a Ebola2�21 dni. Powoduj¹ one uszkodzenia �ródmi¹¿szowe licznych wewnêtrznychnarz¹dów. W przypadku zaka¿enia cz³owieka obserwuje siê zapalenie w¹troby,

328

miê�nia sercowego, trzustki, p³uc, j¹der i nerek. �miertelno�æ przy chorobie mar-burskiej wynosi do ok. 27%, a przy zaka¿eniu wirusem Ebola 50�90% [17, 36, 45].Aktualnie brakuje skutecznej szczepionki chroni¹cej przed zaka¿eniami powodo-wanymi przez te wirusy [10].

Do broni biologicznej kategorii A zaliczono tak¿e toksynê botulinow¹ (Tab. I).Jest ona wytwarzana przez laseczki beztlenowe Clostridium botulinum. Wyró¿niasiê 7 ró¿nych antygenowych typów toksyny botulinowej, oznaczonych od A do G.Typ A toksyny jest letalny dla cz³owieka o wadze 70 kg w ilo�ci 0,09�0,15 mgprzy podaniu do¿ylnym, 0,7�09 mg podanej drog¹ wziewn¹, natomiast 70 mg przypodaniu drog¹ pokarmow¹. Obliczono, ¿e 1 gram tej toksyny jest wystarczaj¹cy dozabicia przesz³o 1 miliona osób [2, 17]. Objawami zatrucia toksyn¹ botulinow¹ jestznu¿enie, zawroty g³owy, nieostre widzenie i dwojenie widzenia, sucho�æ w ustach,trudno�ci w po³ykaniu, upo�ledzenie mowy, ból gard³a, duszno�æ, zaparcia, nud-no�ci, wymioty, bóle brzucha, biegunka, os³abienie miê�ni ramion i nóg, pora¿enienerwu twarzowego, opadanie powiek, nieruchome �renice oraz brak czucia, chocia¿pacjent jest w pe³ni �wiadomy [2, 17, 36].

Objawy neurologiczne przy botulizmie pokarmowym rozpoczynaj¹ siê w 12�36godzin po spo¿yciu toksyny, natomiast przy ekspozycji oddechowej 24�72 godzin.W profilaktyce mo¿liwe jest stosowanie szczepionki opracowanej przez amerykañ-ski Departament Obrony [1, 10].

Oprócz szerzej opisanych czynników biologicznych zaliczonych do kategorii A,gro�n¹ broni¹ mog¹ byæ inne drobnoustroje i toksyny. Wa¿niejsze w³a�ciwo�ci nie-których czynników zaliczonych do kategorii B przedstawiono w tabeli II. Wed³ugdanych WHO [74], NATO [48] i innych [32, 35, 53] do broni biologicznej zaliczyætak¿e mo¿na wiele innych czynników, z których najczê�ciej wymieniane s¹: bak-terie Rickettsia rickettsi, grzyby Coccidioides immitis, toksyny bakteryjne (shiga,b³onicy), z koralowców morskich (maitotoksynê, palytoksynê), z ¿ab (bratracho-toksynê), jadu wê¿y (alfa-conotoksynê, taipoksynê), z ryb (tetradotoksynê), skorpio-nów (alfa-tityustoksyna), glonów (anatoksynê A, mikrocystynê), grzybów (toksynêT-2, aflatoksynê) i ro�lin (np. abrynê).

4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych

Ataki bioterrorystyczne przeprowadzone na terenie USA w 2001 r. u�wiadomi³yskalê zagro¿eñ i koniecznych dzia³añ, które wystêpuj¹ wskutek u¿yciu broni biolo-gicznej. W laboratoriach mikrobiologicznych przebadano przesz³o 121700 próbekmateria³ów na obecno�æ B. anthracis [50]. Profilaktycznie podano antybiotyki94 pracownikom poczty w Connecticut [75]. Telefoniczne centrum informacyjneuruchomione w CDC odpowiedzia³o na przesz³o 11 tys. zapytañ [47].

W opracowaniach Centrów Kontroli Chorób Zaka�nych w USA (Centers forDiseasae Central and Preventicy � CDC) [5, 50], Instytutu Badawczego ChoróbZaka�nych Armii Amerykañskiej (USA Army Medical Research Institute of Infec-tions Research � USAMRIID) [36] i innych o�rodków [32, 34, 49, 51] podkre�la siê,¿e laboratoria mikrobiologiczne s³u¿b medycznych powinny odegraæ kluczow¹ rolê

329

Coxiella burnetti tak, niska czêsto�æ 1�10 komórek 10�40 dni 2�14 dni ≤ 20%

Brucella spp. nie 10�100 komórek 5�60 dni tygodnie do miesiêcy ≤ 5%

Burkholderia mallei tak, niska czêsto�æ brak danych 1�14 dni zwykle zgon po 2�3 tygodniach, ≥ 50%w postaci przewlek³ej 2�3 lata

Burkholderia pseudomallei bardzo niska czêsto�æ brak danych kilka dni do 4�20 dni ≤ 20%kilku lat

Rickettsia prowazekii nie brak danych 6�16 dni tygodnie do miesiêcy 1�2%

Chlamydia psittaci nie brak danych 4�15 dni 2�8 tygodni ≤ 20%

Wirusy zapalenia mózgu tak, niska czêsto�æ 10�100 wirionów 2�6 dni kilka dni do kilku tyg. ≤ 20%

Rycyna nie 50�100 :g/osobê 18�24 godz. kilka dni 21�49%(dawka �miertelna)

Enterotoksyna B S. aureus nie 1,7 :g/osobê 3�12 godzin kilka godzin ≤ 1%(dawka �miertelna)

Toksyna epsilon nie LD50

= 0,1�5 mg/kg 8�12 godzin 24 godziny wysokaC. perfringens

Tabela II Charakterystyka broni biologicznej kategorii B, która mo¿e byæ u¿yta w postaci aerozolu [5, 14, 34, 36, 48, 56]

Czynnik biologiczny

Przenoszeniez cz³owieka chorego

na zdrowego

Dawkazaka�na/�miertelna

(w postaci aerozolu)Czas inkubacji Czas trwania choroby

�miertel-no�æ

330

w identyfikacji biologicznych czynników u¿ytych w atakach wojennych lub ter-rorystycznych. Wymaga to przygotowania odpowiednich �rodków, wyszkoleniapersonelu o�rodków diagnostycznych i innych placówek s³u¿by zdrowia, do wykry-wania nietypowych i rzadko wystêpuj¹cych czynników etiologicznych, które mog¹byæ u¿yte jako broñ biologiczna oraz ich zwalczania [32, 34, 41, 68]

Kierownictwo i personel laboratoriów wraz z pracownikami dzia³ów kontroli za-ka¿eñ i administracji powinni przygotowaæ plan dzia³añ zarówno dla danego labora-torium oraz ca³ej instytucji, w sk³ad której pracownia wchodzi. Plan ten powinienobejmowaæ [62]:l informacje w zakresie uczestnictwa danej pracowni w sieci laboratoriów bio-

r¹cych udzia³ w diagnostyce i przeciwdzia³aniu atakom bioterrorystycznym,l kryteria �wiadcz¹ce o typie ataku bioterrorystycznego,l zasady bezpiecznego postêpowania,l procedury testowania w kierunku najwa¿niejszych czynników broni biologicz-

nej, w tym protokó³y diagnostyczne,l protokó³y komunikuj¹ce i sprawozdawcze,l zasady bezpiecznego opakowywania i transportu czynników zaka�nych,l ochronê laboratorium.Kierownik laboratorium powinien ustanowiæ i wprowadziæ sposób zawiadamia-

nia, który obowi¹zuje w przypadku uzasadnionego podejrzenia ataku z u¿yciembroni biologicznej i konieczno�ci przes³ania izolatów do laboratorium wy¿szej kate-gorii. Plan musi uwzglêdniaæ kontakty z osobami odpowiedzialnymi za przekazinformacji do osób kluczowych w danej instytucji oraz z lokalnym wydzia³em zdro-wia. Ka¿dy przypadek powinien byæ szczegó³owo opisany. Aby oceniæ stopieñzagro¿enia personel zajmuj¹cy siê kontrol¹ zaka¿eñ powinien odnotowywaæ poja-wianie siê niezwyk³ych zachorowañ. Stosowne w³adze, w oparciu o te dane, powinnyoceniæ czy wystêpuje zagro¿enie dla spo³eczeñstwa i czy materia³ od pacjentóworaz izolaty powinny byæ przekazywane do laboratoriów wy¿szej kategorii. Wykry-cie drobnoustrojów wykazywanych na li�cie czynników mog¹cych stanowiæ broñbiologiczn¹ nie jest jeszcze dowodem, ¿e dosz³o do ataku bioterrorystycznego.Niektóre z drobnoustrojów wymienionych na tej li�cie wystêpuj¹ naturalnie napewnych obszarach geograficznych i powoduj¹ sporadyczne zaka¿enia. Dopierodecyzja uprawnionych w³adz wydzia³ów zdrowia i w³adz ustawowych okre�laczy przypadek by³ wiarygodny. Podczas procesu okre�lenia czy istnieje zagro¿eniedla spo³eczeñstwa, mikrobiolodzy powinni zawiadomiæ najbli¿sze laboratorium Bcelem otrzymania szczegó³owych wskazówek w zakresie ewentualnego u¿yciatestów potwierdzaj¹cych [62].

4.1. Sytuacje �wiadcz¹ce o u¿yciu broni biologicznej

Atak broni¹ biologiczn¹ mo¿e byæ zapowiedziany lub nie, szczególnie gro�nyjest drugi wariant. Efekty ataku mog¹ pojawiæ siê dopiero po kilku dniach i mog¹byæ trudne do rozpoznania. Niew¹tpliwie pierwszoplanow¹ rolê na tym etapie reakcjiodegraæ powinni lekarze, którzy musz¹ byæ przygotowani na rozpoznanie sytuacji

331

bêd¹cej wynikiem u¿ycia broni biologicznej oraz laboratoria przygotowane do po-boru prób i przeprowadzenia badañ [7, 26]. Przes³anki �wiadcz¹ce o ataku bioterro-rystycznym s¹ nastêpuj¹ce [36, 74]:l pojawienie siê w populacji du¿ej liczby zachorowañ z podobnymi objawami,l wiele przypadków niewyja�nionych chorób lub zgonów,l ciê¿szy przebieg choroby w porównaniu z typowym dla danego czynnika etio-

logicznego, brak skuteczno�ci standardowej terapii,l nietypowa droga zaka¿enia, np. poprzez drogi oddechowe, podczas gdy za-

zwyczaj zaka¿enie danym patogenem nastêpuje przez inne wrota,l pojawienie siê chorób nie wystêpuj¹cych na danym obszarze geograficznym

lub w nietypowym sezonie,l choroba warunkowana drobnoustrojem, który normalnie nie wystêpuje na da-

nym terenie,l równoczesny, wielokrotny wzrost liczby zachorowañ lub seria epidemii ró¿-

nych chorób w tej samej populacji,l pojedynczy przypadek zachorowania spowodowany niezwyk³ym czynnikiem

(np. ospa prawdziwa, wirusowa gor¹czka krwotoczna),l wyst¹pienie choroby, która jest niezwyk³a w danej grupie wiekowej,l nietypowe chorobotwórcze szczepy lub organizmy o oporno�ci na antybiotyki

ró¿nej od chorobotwórczych szczepów na danym terenie,l podobieñstwo genetyczne w�ród czynników etiologicznych izolowanych z ró¿-

nych �róde³, miejsc lub w ró¿nym czasie,l wy¿sza czêsto�æ zaka¿eñ w�ród ludzi na obszarach otwartych ni¿ u ludzi prze-

bywaj¹cych w budynkach,l wyst¹pienie wybuchów epidemii tych samych chorób na obszarach nie po³¹-

czonych ze sob¹,l wybuch epidemii powodowanych czynnikiem wywo³uj¹cym epizoocjê,l informacja o potencjalnym ataku terrorystycznym lub wojennym, odkrycie

broni biologicznej nielegalnie przechowywanej lub transportowanej.Niezwykle wa¿nym zagadnieniem jest odpowiednie zabezpieczenie ludno�ci

przed spodziewanym atakiem bioterrorystycznym i podjêcie dzia³añ po ataku.Zastosowanie profilaktycznych szczepieñ lub kuracja antybiotykowa wymagaj¹d³u¿szego czasu a¿eby uzyskaæ ich skuteczno�æ i dlatego nie s¹ uwa¿ane za opty-malne metody. Dodatkow¹ niedogodno�ci¹ w zastosowaniu szczepieñ jako pierw-szej linii obrony przed broni¹ biologiczn¹ s¹ wysokie koszty i trudno�æ w szcze-pieniu du¿ych populacji na szerokie spektrum czynników biologicznych. Aktual-nie brakuje dobrych szczepionek na wszystkie mikroorganizmy i toksyny, któremog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczne. Zaleca siê stosowanie szczepieñ je-dynie dla grup ludzi wysokiego ryzyka, np. pracowników laboratoriów diagnostycz-nych i lekarzy [57].

C a s a d e v a l l [4] sugeruje, ¿e najkorzystniejsze zabezpieczenie ludzi w przy-padku ataku bioterrorystycznego mo¿e stanowiæ bierne uodpornienie uzyskane w wy-niku podania swoistych przeciwcia³. Metoda ta ma wiele zalet, z których najwa¿niej-sz¹ jest bardzo szybkie nabycie odporno�ci na czynniki biologiczne u¿yte w ataku.

332

4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym

Prace z materia³em zaka�nym mog¹ byæ wykonywane wy³¹cznie w laborato-riach posiadaj¹cych odpowiednie zabezpieczenia. Pod koniec ubieg³ej dekady,w CDC ustalono rodzaje zabezpieczeñ dla mikrobiologicznych i biomedycznychlaboratoriów, oznaczaj¹c je symbolami od BSL 1 do BSL 4. Zabezpieczenia BSL 1polegaj¹ na podstawowych procedurach, takich jak zakaz spo¿ywania posi³kówi picia w laboratorium, mycie r¹k przed jego opuszczeniem, zakaz pipetowania usta-mi, odka¿anie powierzchni roboczych, niszczenie materia³u zaka�nego po skoñczo-nej pracy. Wej�cie do zak³adu powinno byæ kontrolowane i ograniczone dla osóbpostronnych. Zabezpieczenia BSL 2, oprócz wymagañ dla BSL 1, polegaj¹ na pro-wadzeniu prac w kabinach biohazard klasy II, stosowaniu fartuchów, rêkawiczeki maseczek, które nie mog¹ byæ wynoszone poza laboratorium przed wyja³owieniem.Personel powinien byæ przeszkolony do pracy ze szczególnie niebezpiecznymi drobno-ustrojami i szczepiony, np. przeciwko WZW B. W laboratorium powinna byæ do-stêpna surowica odporno�ciowa przeciwko szczególnie niebezpiecznym drobno-ustrojom, z którymi prowadzone s¹ prace. Materia³y i sprzêt po skoñczonej pracypowinien byæ odpowiednio zabezpieczony (zamkniêty w szczelnych pojemnikach)i wysterylizowany, laboratoryjny sprzêt i powierzchnie robocze musz¹ byæ zdezyn-fekowane bezpo�rednio po skoñczonej pracy. Meble i sprzêt powinny byæ wykona-ne z materia³u umo¿liwiaj¹cego jego dezynfekcjê. W laboratorium powinna znajdo-waæ siê p³uczka do oczu. W laboratoriach z zabezpieczeniami BSL 3 wszystkiebadania z materia³em zaka�nym powinny byæ prowadzone w kabinach biohazardklasy II lub III. Personel zobowi¹zany jest do noszenia odzie¿y ochronnej, laborato-rium powinno byæ specjalnie zaprojektowane, oddzielone od powierzchni powszech-nie u¿ytkowanych, zabezpieczone zamkniêtymi drzwiami. Powierzchnie �cian, pod-³óg i sufitu powinny byæ wykonane z materia³ów umo¿liwiaj¹cych ich dezynfekcjê.Okna powinny byæ zamkniête i uszczelnione. Klimatyzacja powinna byæ zaopatrzonaw filtry HEPA. Sprzêt tworz¹cy aerozole, w tym wirówki, musi byæ odpowiedniozabezpieczony. W laboratoriach BSL 4 wystêpuj¹ zabezpieczenia najwy¿szego stop-nia. Tego typu laboratoria stanowi¹ wydzielone pomieszczenia odseparowane od po-zosta³ych czê�ci budynku lub umieszczone w oddzielnym budynku. Oprócz zabezpie-czeñ wymaganych dla laboratoriów BSL 3, s¹ one specjalnie zaprojektowane abyuniemo¿liwiæ wydostanie siê z nich drobnoustrojów do �rodowiska. Personel musibyæ odpowiednio przeszkolony, w trakcie prac ubrany w specjaln¹ odzie¿, która jeststerylizowana po ich ukoñczeniu. Tak¿e wszystkie inne materia³y przed opuszcze-niem pracowni musz¹ byæ odka¿one, natomiast pracownicy powinni wzi¹æ natryskprzed opuszczeniem laboratorium. Ca³o�æ powietrza w laboratorium powinna byæsterylizowana przez filtracjê i zastosowanie �rodków bakterio- i wirusobójczych [54].

W laboratoriach nale¿y prowadziæ sta³¹, codzienn¹ kontrolê mikrobiologiczn¹.Powinna ona obj¹æ badanie personelu, miejsc i sprzêtu, który najczê�ciej podlegazaka¿eniu: r¹k personelu, uchwytów i klamek drzwi, sto³ów i sto³ków laboratoryj-nych, masek, ca³ej pracowni mikrobiologicznej i pracowni PCR, a ponadto koryta-rzy i pomieszczeñ przechowywania próbek [20].

333

4.3. Organizacja systemu laboratoriów mikrobiologicznych w USA

W USA pod nadzorem CDC utworzono sieæ laboratoriów przygotowanych dopostêpowania w przypadku ataku z u¿yciem broni biologicznej. Sieæ taka obejmujepracownie prywatne, szpitalne, sanitarno-epidemiologiczne i wojskowe uczestnicz¹-ce w badaniach mikrobiologicznych i dochodzeniach epidemiologicznych zwi¹za-nych z atakiem bioterrorystycznym. Laboratoria mikrobiologiczne s¹ klasyfikowanena podstawie ich wyposa¿enia i mo¿liwo�ci diagnostycznych do jednej z czterechkategorii, A-D [5, 34].

Pracownie kategorii A maj¹ odegraæ g³ówn¹ rolê w rozpoznaniu sytuacji u¿yciabroni biologicznej wówczas, kiedy atak nie zosta³ zapowiedziany. W przypadku ta-kiego typu ataku nastêpuje du¿e zagro¿enie dla lekarzy i personelu laboratoryjnegoponiewa¿ pierwsze objawy wystêpuj¹ po okresie inkubacji. Dlatego najwa¿niejszymelementem na tym etapie odpowiedzi jest identyfikacja pocz¹tkowych przypadkówbêd¹cych wynikiem u¿ycia broni biologicznej. Przes³anki �wiadcz¹ce o mo¿liwo�ciu¿ycia broni biologicznej zosta³y podane w rozdziale 4.1. niniejszego artyku³u. Dolaboratoriów tej kategorii zaliczono wiêkszo�æ pracowni spe³niaj¹cych warunkibezpieczeñstwa BSL 2, w których prowadzone s¹ hodowle drobnoustrojów i iden-tyfikacja powszechnie wystêpuj¹cych patogenów. Najwiêksz¹ liczbê w tej grupiestanowi¹ laboratoria szpitalne i to w³a�nie one odegraj¹ najistotniejsz¹ rolêw przypadku ataku z u¿yciem broni biologicznej. G³ówna rola tych laboratoriówbêdzie polega³a na pobraniu, zabezpieczeniu i przetransportowaniu próbek materia-³ów pobranych od ludzi oraz ich wstêpnym przebadaniu. W pracowniach kategoriiA powinno byæ mo¿liwe wykonanie niewielkiej liczby prostych testów diagnostycz-nych i w przypadku przes³anek �wiadcz¹cych o obecno�ci w pobranych próbkachczynników, które mog³y byæ wykorzystane jako broñ biologiczna, przesy³anoby jedo pracowni kategorii B. Na wyposa¿eniu laboratorium poziomu A musi znajdowaæsiê komora biohazard klasy II. Personel powinien byæ przeszkolony w zakresie pod-stawowych metod pozwalaj¹cych wstêpnie rozpoznaæ czynniki broni biologicznejoraz bezpiecznego pobierania, pakowania, oznakowywania i przekazywania próbekmateria³ów zawieraj¹cych niebezpieczne patogeny do pracowni wy¿szej kategorii.Laboratoria powinny posiadaæ plan dzia³añ, a ponadto przygotowane proceduryoperacyjne, które obejmuj¹ drogi komunikowania siê, w tym numery telefonicznedo laboratoriów wy¿szych kategorii oraz do centralnego o�rodka koordynuj¹cego.Laboratoria powinny tak¿e posiadaæ aktualny wykaz czynników, które mog¹ stano-wiæ broñ biologiczn¹ wraz ze stopniem zagro¿enia które one stwarzaj¹. W przypad-ku ekspozycji pracowników na broñ biologiczn¹ szybko powinna zostaæ podjêtadecyzja, czy u¿yæ profilaktycznie antybiotyki, podaæ szczepionkê, czy zastosowaætylko obserwacjê w kierunku wykrycia objawów chorobowych [5, 34, 62].

W przypadku zapowiedzianego ataku z u¿yciem broni biologicznej laboratoriaszpitalne nie powinny pobieraæ próbek do testowania. Potencjalny odbiorca, cel ataku,powinien byæ uprzedzony i odpowiednio poinstruowany, natomiast próbki powinnybyæ dostarczone bezpo�rednio do laboratoriów kategorii B lub C. Podobn¹ poli-tykê powinno stosowaæ siê tak¿e w przypadku badania ¿ywno�ci, wody i próbek

334

pobranych od zwierz¹t. Ograniczenie w prowadzeniu badañ tych materia³ów w pra-cowniach klasy A wynika z konieczno�ci utrzymanie bezpieczeñstwa personelu,pacjentów i instytucji. G³ówn¹ przeszkod¹ w badaniu materia³ów �rodowiskowychw laboratoriach szpitalnych jest nieznana natura próbek, którymi mog¹ byæ eksplodu-j¹ce lub ulatniaj¹ce siê toksyczne chemikalia lub substancje radioaktywne [20, 62].

Wyposa¿enie laboratoriów kategorii B powinno spe³niaæ wymogi bezpieczeñ-stwa co najmniej BSL 2, chocia¿ zalecane jest BSL 3. T¹ grupê tworzyæ powinnylaboratoria, które maj¹ mo¿liwo�ci do badania specyficznych czynników i przesy-³ania mikroorganizmów lub materia³ów zawieraj¹cych je, do pracowni wy¿szegostopnia. Laboratoria kategorii B powinny zmniejszyæ liczbê fa³szywie dodatnich,wstêpnych wyników i zabezpieczyæ laboratoria C przed nadmiernym przeci¹¿eniem.Ich dzia³alno�æ polega³aby na szybkiej, wstêpnej identyfikacji drobnoustrojów(np. technikami immunofluorescencyjnymi). W przypadku stwierdzenia czynników,które mog³y byæ u¿yte w atakach terrorystycznych, izolaty by³yby przekazywane dolaboratoriów poziomu C [5, 34].

Laboratoria kategorii C, powinny spe³niaæ wymogi bezpieczeñstwa BSL 3 i mieædodatkowe mo¿liwo�ci szybkiej specjalistycznej identyfikacji czynników stano-wi¹cych broñ biologiczn¹. Powinny to byæ stanowe mikrobiologiczne, akademickielub federalne centra badawcze, zdolne do wykonania specjalistycznych badañ,z wykorzystaniem zaawansowanych technik diagnostycznych (np. opartych o ampli-fikacjê kwasów nukleinowych i typowania mikroorganizmów metodami molekular-nymi), a ponadto maj¹cymi zdolno�æ do oznaczenia toksyn. Laboratoria tej katego-rii powinny równie¿ braæ czynny udzia³ w ocenie nowo opracowywanych testówi odczynników oraz okre�leniu, które metody mog¹ byæ stosowane w pracowniachkategorii B [5, 34, 62].

Laboratoria kategorii D, posiadaj¹ce zabezpieczenia BSL 4, powinny pe³niæ funk-cje eksperckie w diagnostyce rzadko wystêpuj¹cych w naturze i szczególnie niebez-piecznych biologicznych czynników, np. wirusów gor¹czek krwotocznych, wiru-sów zapalenia mózgu i wirusa ospy prawdziwej. W laboratoriach tych powinnaistnieæ tak¿e mo¿liwo�æ oznaczenia drobnoustrojów zmodyfikowanych genetycz-nie oraz archiwizowania czynników u¿ytych w atakach bioterrorystycznych. Per-sonel tych pracowni powinien posiadaæ unikatowe do�wiadczenia i umiejêtno�ciw diagnostyce wszystkich czynników, które mog¹ byæ u¿yte jako broñ biologiczna.W tych laboratoriach tak¿e powinny byæ opracowywane nowe testy i metody diag-nostyczne [5, 34, 62].

W przypadku ataku bioterrorystycznego, oprócz sieci sta³ych laboratoriów, wa¿n¹rolê odegraæ mog¹ ruchome laboratoria terenowe. Przyk³adem by³o laboratorium uru-chomione w Waszyngtonie po ataku bioterrorystycznym w pa�dzierniku 2001 roku[23]. Przeznaczone by³o ono do przeprowadzania szybkich molekularnych analizpróbek �rodowiskowych, g³ównie powietrza i wymazów z powierzchni przesy³ek,urz¹dzeñ, mebli i przedmiotów stanowi¹cych wyposa¿enie biur w budynkach admi-nistracji w Waszyngtonie, na obecno�æ przetrwalników B. anthracis. Laboratoriumrównolegle kierowa³o próby do wyznaczonych sta³ych pracowni celem przepro-wadzenia standartowych analiz technikami hodowlanymi. Laboratorium ruchome

335

wyposa¿one by³o w dwie kabiny z laminarnym przep³ywem powietrza klasy I, prze-no�ny autoklaw, dwa przeno�ne termocyklery do przeprowadzania RT-PCR orazniezbêdne odczynniki. Analiza RT-PCR zwi¹zana by³a z monitorowaniem fluo-rescencji wynikaj¹cej z zastosowania fluorogennych sond w PCR. DNA do reakcjiPCR uzyskiwano bezpo�rednio z wymazów i próbek powietrza oraz z materia³uwyhodowanego z ww. próbek na pod³o¿ach hodowlanych. Wykorzystuj¹c metodyhodowlane i RT-PCR mo¿liwe by³o uzyskanie wyników w ci¹gu 24 godzin od po-brania próbki. Podsumowuj¹c, laboratorium zapewni³o wygodny i ³atwo dostêpnypunkt do zbierania i badania na obecno�æ przetrwalników B. anthracis, próbek �ro-dowiskowych i potencjalnie zaka¿onych powierzchni np. kopert. Dziêki analizommolekularnym w po³¹czeniu ze standartowymi metodami hodowlanymi uda³o siêzidentyfikowaæ kilka przypadków wystêpowania przetrwalników B. anthracis i prze-prowadziæ skuteczn¹ dekontaminacjê ska¿onych miejsc [23].

4.4. Opakowywanie i przesy³anie materia³ów zaka�nych

Próbki zawieraj¹ce materia³y, które mog¹ byæ �ród³em zaka¿enia powinny byæpakowane zgodnie z wytycznymi Miêdzynarodowego Stowarzyszenia TransportuPowietrznego oraz innymi rozporz¹dzeniami obowi¹zuj¹cymi w danym kraju.Wszystkie materia³y zawieraj¹ce kultury drobnoustrojów s¹ traktowane jako zaka�-ne i powinny byæ opakowywane oraz transportowane w taki sam sposób bez wzglê-du na odleg³o�æ [62]. Podstawowy zestaw do pakowania sk³ada siê z trzech warstw.Opakowanie bezpo�rednie stanowi oznakowane, wodoszczelne naczynie, zawiera-j¹ce próbkê. Naczynie to powinno byæ owiniête materia³em ch³onnym, przezna-czonym do zaadsorbowania ca³ej zawarto�ci p³ynnej w przypadku uszkodzeniaopakowania bezpo�redniego. Drug¹ warstwê stanowi naczynie wtórne, bêd¹cewodoszczelnym pojemnikiem chroni¹cym opakowanie bezpo�rednie. Zewnêtrznapaczka przesy³owa chroni naczynie wtórne i jego zawarto�æ przed dzia³aniem czyn-ników zewnêtrznych [1]. Personel laboratoriów powinien byæ przeszkolony i po-siadaæ certyfikaty upowa¿niaj¹ce do pakowania i wys³ania materia³ów zaka�nychprzy zastosowaniu zatwierdzonych materia³ów opakowuj¹cych i pojemników. Kie-rownictwo laboratoriów powinno posiadaæ wykaz przewo�ników uprawnionych dotransportu takich materia³ów. Wiêkszo�æ takich przesy³ek bêdzie wysy³ana z pra-cowni A do B [62].

Próbki przed przyjêciem do badañ w laboratorium powinny przej�æ przez spe-cjalnie zaprojektowane wej�cie, gdzie bêd¹ dodatkowo podwójnie opakowanew torebki i nastêpnie odka¿ane zewnêtrznie przed przeniesieniem do pracowni gdziebêd¹ poddane analizom. Ponadto, powinna zostaæ dla nich wykonana dokumentacjaoraz ocena, które z nich s¹ priorytetowe [20].

Materia³y wyj�ciowe i kultury pierwotne powinny byæ przechowywane ponie-wa¿ mog¹ byæ wykorzystane w dochodzeniach epidemiologicznych i kryminalnych.Po pobraniu do badania pozosta³a czê�æ próbki powinna byæ na nowo opakowanatak, a¿eby na zewn¹trz nie by³a ska¿ona i nastêpnie umieszczona w wyznaczonymmiejscu, zabezpieczonym przed dostêpem przez nieuprawniony personel [20, 62].

336

4.5. Ochrona laboratorium

Laboratoria powinny posiadaæ ochronê zaplanowan¹ przez specjalistów [62].Mog¹ one byæ monitorowane kamerami telewizyjnymi przez ca³¹ dobê, wstêp dopracowni powinien byæ kontrolowany i ograniczony tylko dla personelu posiadaj¹-cego karty wstêpu. Osoby postronne powinny byæ przyjmowane w wyznaczonymmiejscu. Korzystne jest ograniczenie do jednego liczby wej�æ dostêpnych dlapacjentów i osób z zewn¹trz oraz wydzielenie innego wyj�cia do przyjmowaniapróbek materia³ów [20]. Dodatkow¹ ochron¹ jest zamykanie wszystkich kabin,ch³odni, inkubatorów i drzwi do pomieszczeñ w których prowadzone s¹ prace orazprzechowywane materia³y i hodowle pierwotne [62].

4.6. Identyfikacja wa¿niejszych czynników broni biologicznej

Poni¿ej przedstawiono laboratoryjne procedury testowania w kierunku najwa¿-niejszych czynników, które mog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczna.

4.6.1. B. anthracisBakterie w¹glika mog¹ byæ izolowane w przypadku zaka¿enia przebiegaj¹cego

w postaci skórnej z uszkodzeñ nab³onka, w postaci p³ucnej z plwociny, krwi, nato-miast w postaci jelitowej z ka³u, p³ynu ¿o³¹dkowo-jelitowego i krwi. Plwocinê, ka³i wymazy skórne posiewa siê na pod³o¿e agarowe z krwi¹ barani¹, agar czekola-dowy i MacConkey�a. Kryteria wstêpnej identyfikacji B. anthracis, prowadzonejw laboratoriach A, obejmuj¹ barwienie metod¹ Grama, opis morfologii kolonii, zdol-no�æ do sporulacji i ocenê ruchliwo�ci [6]. B. anthracis ro�nie dobrze na pod³o¿uagarowym z krwi¹ barani¹ w temperaturze 35°C, tworz¹c po 15�24 godzinach inku-bacji, kolonie o �rednicy 2�5 mm, p³askie, lekko wynios³e, z nieregularnymi brzega-mi, matowe o lepkiej konsystencji, nie hemolizuj¹ce. Laseczki B. anthracis s¹ Gram--dodatnie, wzglêdnie beztlenowe (1�1,5 mm × 3�5 mm), wytwarzaj¹ce katalazê. Bak-terie te s¹ nieurzêsione, czêsto u³o¿one s¹ w ³añcuszki sk³adaj¹ce siê z 2�4 komórek.Otoczki zwykle widoczne s¹ w preparatach wykonanych z zainfekowanych tkanek,natomiast nie obserwuje siê ich tworzenia, kiedy bakterie hodowane s¹ na standar-dowych pod³o¿ach laboratoryjnych. Barwienie tuszem indyjskim mo¿e byæ stoso-wane przy przygotowywaniu preparatów bezpo�rednich z krwi lub p³ynu rdzeniowo-mózgowego. Bakterie te mog¹ tworzyæ w obecno�ci tlenu przetrwalniki owalne, niezniekszta³caj¹ce komórki, zlokalizowane centralnie lub podbiegunowo [5, 15, 34,40, 67]. Najwa¿niejsze w³a�ciwo�ci ró¿nicuj¹ce B. anthracis z innymi fenotypowopodobnymi gatunkami tego rodzaju to brak ruchliwo�ci i zdolno�ci do hemolizowa-nia erytrocytów barana oraz wytwarzanie poliglutaminowych otoczek [5, 34]. Przyminimalnym kontakcie z tymi bakteriami szczepienie personelu nie jest wymagane,natomiast zalecane jest u¿ywanie fartuchów, rêkawic, maseczek na twarz oraz wyko-rzystywanie technik nie tworz¹cych aerozolu. Izolaty wstêpnie zidentyfikowane jakoB. anthracis powinny byæ niezw³ocznie przekazane najbli¿szemu upowa¿nionemulaboratorium wy¿szej kategorii w celu wykonania identyfikacji potwierdzaj¹cej

337

[5, 34]. W pracowniach poziomu B, oprócz ww. badañ przewidziano wykonanietestów potwierdzaj¹cych: lizê fagiem gamma oraz wykrycie polisacharydów �cianykomórkowej (galaktoza/N-acetylgalaktozamina) i otoczki technik¹ bezpo�redniej fluo-rescencji [6]. W laboratoriach kategorii C powinna byæ okre�lona oporno�ci bakteriiw¹glika na antybiotyki oraz dalsze testowanie z udzia³em zaawansowanych techniklaboratoryjnych, np. PCR, natomiast molekularna charakterystyka (np. MLVA, se-kwencjonowanie 16S rDNA) powinna byæ wykonana w pracowni D [6]. Ostatnio opra-cowano nowe, bardzo szybkie i czu³e metody identyfikacji B. anthracis z wykorzysta-niem monoklonalnych przeciwcia³ znakowanych fluorescein¹ [12], techniki RT-PCR[25] i sekwencjonowania genu 16S rRNA [58]. Potwierdzenie zaka¿enia laseczkamiw¹glika u ludzi mo¿na uzyskaæ technik¹ ELISA, wykrywaj¹c¹ obecno�æ specyficz-nych immunoglobulin IgG w surowicy zaka¿onych osób [52].

4.6.2. Francisella tularensisBakterie tularemii s¹ ma³ymi (0,2�1,0 :m), polimorficznymi, nieruchliwymi,

Gram-ujemnymi ziarniakowatymi pa³eczkami, bezwzglêdnie tlenowymi. Mog¹ byæhodowane zale¿nie od formy zaka¿enia z krwi, p³ynu op³ucnowego, plwociny, ran,wêz³ów ch³onnych lub aspiratów ¿o³¹dkowych. Krew badana jest metodami stan-dardowymi, natomiast materia³y inne posiewa siê na pod³o¿e agarowe z krwi¹ bara-ni¹, agar czekoladowy, MacConkey�a, pod³o¿e agarowe z cystein¹ lub z cystein¹i 9% gotowan¹ krwi¹ barani¹. F. tularensis wyrasta na pod³o¿u agarowym z krwi¹barani¹, zalecana jest hodowla do 5 dni. Wymagaj¹ do wzrostu cysteiny, na agarzez tym aminokwasem (cysteine heart agar) tworz¹, po 48-godzinnej inkubacji w tem-peraturze 35�37°C, ma³e (1�2 mm) zielonkawe, opalizuj¹ce kolonie. Mniejsze, szaro--bia³e kolonie tworzone s¹ na agarze czekoladowym lub pod³o¿u Thayer-Martina.Zwiêkszone stê¿enie CO2 w atmosferze hodowlanej mo¿e stymulowaæ ich wzrost.Buforowany agar BCYE (bacto charcoal agar) równie¿ zapewnia wzrost pa³eczkomtularemii i mo¿e byæ stosowany zamiast pod³o¿a z cystein¹, jednak kolonie F. tula-rensis rosn¹ce na nim nie maj¹ zielonkawego po³ysku. Bakterie tularemii niewyrastaj¹ na pod³o¿u MacConkey�a i EMB Levine�a, s³abo rosn¹ na pod³o¿achbulionowych, np. z tioglikolanem i na wyci¹gu mózgowo-sercowym, nawet je�liwzbogacone s¹ witaminami. W³a�ciwo�ci fenotypowe, sugeruj¹ce przynale¿no�æwyhodowanych bakterii do gatunku F. tularensis, to brak oksydazy cytochromowej,s³abo dodatni wynik w te�cie na katalazê, pozytywna reakcja w te�cie na wytwarza-nie $-galaktozydazy i brak produkcji ureazy. Izolaty podejrzane o przynale¿no�ædo gatunku F. tularensis powinny byæ jak najszybciej przekazane z laboratoriumkategorii A do wyznaczonej pracowni poziomu B w celu potwierdzenia wstêpnejidentyfikacji [5, 34]. Taka praktyka jest zalecana nie tylko ze wzglêdu na nieznajo-mo�æ tego gatunku przez mikrobiologów, lecz równie¿ z powodu du¿ego ryzykalaboratoryjnego zaka¿enia tym gro�nym patogenem. Na podstawie w³a�ciwo�cifenotypowych bakterie te mog¹ byæ b³êdnie rozpoznane jako Haemophilus influenzaelub Actinobacillus sp. W identyfikacji stosowane s¹ tak¿e testy serologiczne, aleopisano reakcje krzy¿owe przeciwcia³ anty � F. tularensis z komórkami Brucellasp., Proteus OX19 i Yersinia spp. [5, 34].

338

4.6.3. Yersinia pestisPa³eczki d¿umy najczê�ciej izolowane s¹ od chorych z krwi, wymazów z gard³a,

plwociny, bioptatu z wêz³ów limfatycznych, w¹troby, trzustki, p³uc lub �ledziony,p³ynu rdzeniowo-mózgowego. W przypadku badania krwi, nale¿y wykonaæ kilkaposiewów, bowiem bakteriemia ma charakter nieci¹g³y. Pobranie trzech próbek krwico 45 minut przed podjêciem terapii zazwyczaj pozwala stwierdziæ obecno�æ Y. pestisw badanym materiale metodami hodowlanymi [73]. W preparacie mikroskopowymwykonanym bezpo�rednio z pobranego materia³u, komórki Y. pestis maj¹ kszta³tpa³eczek o wielko�ci 1�3×0,5�0,8 :m, uk³adaj¹cych siê pojedynczo, pary lub krótkie³añcuszki. W metodzie Wrighta-Giemzy komórki barwi¹ siê dwubiegunowo [5, 28,34, 73]. Rozmazy powinny tak¿e byæ bezpo�rednio barwione technik¹ immuno-fluorescencyjn¹ z wykorzystaniem immunoglobulin przeciwko antygenowi F1.W ostrej fazie choroby i w 4�6 tygodniu rekonwalescencji surowicê powinno badaæsiê na obecno�æ przeciwcia³ anty � Y. pestis [73]. Bakterie te naj³atwiej jest hodowaæna pod³o¿u agarowym z krwi¹ barani¹, pod³o¿u z cefsulodin¹ (4 mg/ml), irgasanemi nowobiocyn¹ oraz na agarze MacConkey�a, na którym tworz¹ kolonie laktozo-ujemne, po d³u¿szej inkubacji przypominaj¹ce wygl¹dem sadzone jajko. Pierwotneposiewy nale¿y hodowaæ do 5 dni. W przypadku podejrzenia d¿umy nale¿y inkuba-cjê prowadziæ w temperaturze 22�28°C poniewa¿ Y. pestis ro�nie szybciej w tejtemperaturze ni¿ w 37°C. Na pod³o¿u MacConkey�a i EMB ich wzrost po 24 godz.mo¿e byæ niewidoczny. W przeciwieñstwie do pozosta³ych gatunków rodzaju Yersi-nia, pa³eczki d¿umy nie s¹ zdolne do ruchu. Wiêkszo�æ komercyjnie dostêpnychzestawów do identyfikacji bakterii obejmuje Y. pestis, jednak ich przydatno�æ niezosta³a okre�lona. Podstawowymi kryteriami dla laboratoriów A, �wiadcz¹cymio mo¿liwo�ci obecno�ci pa³eczek d¿umy w próbkach materia³ów jest dwubiegunowewybarwienie komórek, wzrost w postaci bardzo ma³ych kolonii (jak gdyby uk³ucieig³y) na pod³o¿u agarowym z krwi¹ barani¹ po 24 godz. hodowli, brak fermentacjilaktozy, negatywna reakcja w testach na oksydazê i ureazê, natomiast pozytywna nakatalazê oraz wzrost lepszy w temperaturze 28°C ni¿ 37°C [5, 34]. Potwierdzeniediagnozy nale¿y uzyskaæ w laboratoriach wy¿szej kategorii metodami immuno-enzymatycznymi i PCR, które jednak nie s¹ dostêpnie komercyjnie [34] Ostatecznepotwierdzenie mo¿na tak¿e uzyskaæ na podstawie lizy komórek Y. pestis swoistymbakteriofagiem oraz co najmniej 4-krotnym wzro�cie w surowicy krwi pacjentów,miana przeciwcia³ przeciw antygenowi F1, okre�lanego w te�cie hemaglutynacjibiernej [73]. Próbki (biopsje tkanek, skrzep) pobrane do testów opartych na technicePCR nale¿y przewoziæ w suchym lodzie. Prace z Y. pestis powinny byæ prowadzonew laboratoriach z zabezpieczeniem co najmniej BSL 2 [5, 34].

4.6.4. Wirus ospy prawdziwejWirus ospy jest najwiêkszym wirusem zwierzêcym. Wiriony maj¹ wielko�æ ok.

300×200×100 :m. Ich kszta³t nie pozwala na odró¿nienie go od znacznie mniejgro�nego wirusa krowianki. Nukleokapsyd wirusa ospy, przypominaj¹cy kszta³temhantle, zawiera dwuniciowy DNA otoczony dwiema b³onami lipoproteinowymi.Diagnostyk¹ wirusa ospy powinny zajmowaæ siê wy³¹cznie wyspecjalizowane labo-

339

ratoria kategorii D z zabezpieczeniami BSL 4. Pracownicy laboratoriów szpitalnychpowinni jedynie uczestniczyæ w opakowaniu i przes³aniu pobranych próbek dowyznaczonej pracowni. Najlepszym materia³em do badañ laboratoryjnych jest p³ynpêcherzykowy z rany zebrany na szkie³ko podstawowe i wysuszony. Skrzepy,zeskrobiny i bioptaty umieszcza siê w szczelnych pojemnikach, które wytrzymuj¹zamra¿anie. Próbki mo¿na przechowywaæ w 4°C do 6 godzin, d³u¿ej w temperaturze�20 do �70°C. Wstêpne laboratoryjne rozpoznanie mo¿e byæ dokonane metod¹ bar-wienia Giemzy materia³u pobranego ze zmian skórnych. Pewn¹ metod¹ jest hodowlana 12�14 dniowej b³onie kosmówkowo-owodniowej zarodka kurzego, bowiem zmia-ny wywo³ane przez wirusa ospy pozwalaj¹ na ró¿nicowanie go z innymi pokswirusa-mi. Rozpuszczalne antygeny wirusa, obecne w krwi, grudkach i pêcherzykach, mo¿nawykrywaæ za pomoc¹ technik immunofluorescencyjnych, metody immunodyfuzjiOuchterlony�ego, metod¹ hemaglutynacji lub neutralizacji oraz odczynu wi¹zaniadope³niacza. Wirus ospy mo¿e byæ namna¿any w hodowlach komórkowych. Po48 godzinach wykrywane s¹ tzw. cia³ka Guarnieri � eozynoch³onne inkluzje cyto-plazmatyczne, a efekt cytopatyczny wystêpuje zwykle po 5�8 dniach. Szybka diag-nostyka wirusa ospy mo¿e byæ równie¿ wykonana technik¹ PCR [5, 34].

4.6.5. Wirusy gor¹czek krwotocznychBadania tej grupy wirusów powinny byæ prowadzone tylko w laboratoriach ka-

tegorii D, posiadaj¹cych najwy¿szy stopieñ zabezpieczeñ (BSL 4). Diagnostykawirusów gor¹czek krwotocznych mo¿e byæ wykonana metodami serologicznymi,immunohistologicznymi, hodowli na zwierzêtach laboratoryjnych i technikamiamplifikacji kwasów nukleinowych. Do diagnostyki serologicznej nale¿y zebraæsurowicê w ilo�ci 5 do 12 ml w ostrej fazie choroby i 21 dniu rekonwalescencji. Dobadañ mo¿na tak¿e wykorzystaæ po�miertn¹ krew pobran¹ z serca, skrzep oraz biopsjetkanek. Sch³odzone próbki surowicy nale¿y transportowaæ w plastikowych probów-kach w lodzie lub suchym lodzie. Zatopione w parafinie tkanki nale¿y transporto-waæ w temperaturze pokojowej, natomiast próbki pobrane do testowania metod¹PCR w suchym lodzie, powinny mieæ one objêto�æ przynajmniej 1 cm3 [5, 34].

4.6.6. Toksyna botulinowaObecno�æ toksyny botulinowej mo¿na wykryæ w surowicy krwi, wymiocinach,

kale, aspiracie z dróg oddechowych, tkankach i materiale pobranym z okolicy rany.W laboratoriach kategorii A nie powinno prowadziæ siê badañ maj¹cych na celuwykrycie obecno�ci tej toksyny w pobranych próbkach materia³ów. Podstawowymzadaniem pracowników tych pracowni jest pobranie próbek materia³ów i przes³anieich do laboratoriów wy¿szej kategorii. Próbki tkanek nale¿y przesy³aæ w temperatu-rze pokojowej, natomiast pozosta³e materia³y powinny byæ przechowywane i trans-portowane w temperaturze 4°C. Typy antygenowe A, B, E i F s¹ najczê�ciej zwi¹zanez zaka¿eniami u cz³owieka o charakterze zatrucia pokarmowego lub zaka¿enia ran.Toksynê botulinow¹ oraz jej typ antygenowy okre�la siê na myszach w odczynieneutralizacji swoist¹ antytoksyn¹ w wyspecjalizowanych laboratoriach o zabez-pieczeniu BSL 3 lub 4. Metoda ta pozwala na wykrycie toksyny w ilo�ci od 0,03 ng

340

w czasie 6�96 godzin. W identyfikacji stosuje siê tak¿e metody radioimmunologicz-ne i immunoenzymatyczne. Pora¿enie miê�niowe spowodowane u¿yciem toksynybotulinowej mo¿na okre�liæ elektromiogramem. Niekiedy próbki materia³ów posie-wa siê na pod³o¿a i nastêpnie okre�la toksyczno�æ wyhodowanych izolatów Clostri-dium botulinum [2, 5, 34].

5. Podsumowanie

Wed³ug danych z roku 2001, co najmniej 13 pañstw posiada broñ biologiczn¹[29]. Z raportu Biura Bezpieczeñstwa Narodowego [53] wynika, ¿e w Polsce nie mabezpo�redniego zagro¿enia wywo³anego atakiem broni¹ biologiczn¹. Obecna sytua-cja miêdzynarodowa, przede wszystkim d¹¿enie terrorystów do odwetu, sugerujejednak realn¹ mo¿liwo�æ jej u¿ycia. Nawet gdyby taki atak mia³ miejsce na obszarzeobcego pañstwa to w bardzo krótkim czasie mo¿e doj�æ do zawleczenia chorobo-twórczych drobnoustrojów na teren Polski, s³u¿ba zdrowia musi wiêc byæ przygoto-wane na tak¹ ewentualno�æ. W zwalczaniu skutków ataku z u¿yciem broni biolo-gicznej podstawow¹ rolê odegraj¹ laboratoria mikrobiologiczne. Stworzenie siecipracowni, analogicznej do tej która funkcjonuje w USA, opracowanie zakresukompetencji i technik, które nale¿y w nich stosowaæ wydaje siê byæ potrzeb¹ chwili.Konieczne jest tak¿e zwiêkszenie wysi³ków w celu opracowania nowych, szybkichi specyficznych metod identyfikacji czynników, które mog¹ byæ u¿yte jako broñbiologiczna. Szybka identyfikacja mo¿e przyczyniæ siê do przeciwdzia³ania skut-kom ataku i do znacznego zmniejszenia liczby ofiar. Wprowadzenie nowoczes-nych technik, w tym molekularnych z amplifikacj¹ DNA metod¹ PCR, szybkimsekwencjonowaniem kwasów nukleinowych, serologicznych, immunoenzymatycz-nych i innych, powinno czas ten skróciæ z kilkudziesiêciu do kilku godzin [3, 69].Uzyskanie postêpu w tym zakresie jest jednym z najwa¿niejszych bie¿¹cych zadaño�rodków naukowo-badawczych, specjalizuj¹cych siê w opracowywaniu nowychtestów diagnostycznych [34].

Pi�miennictwo

1. Arciuch H. (on line): Pobieranie, pakowanie, ochrona oraz przesy³anie próbek do badañ laborato-ryjnych. http://www.giz.mz.gov.pl./news/sibc.htm (25.02.2003)

2. Arnon S.S., K. Tonat i wsp.: Botulinum toxin as biological weapon. Medical and public healthmanagement. JAMA, 285, 1059�1070 (2001)

3. Black H.: Diagnosing bioterrorrism: applying new technologies. Scientist, July 23, 8�10 (2001)4. Casadevall A.: Passive antibody administration (immediate immunity) as a specyfic defense against

biological weapons. Emerg. Infect. Dis. 8, 833�841 (2002)5. Centers for Disease Control and Prevention (online). Public health emergency preparedness and

response, http://www.bt.cdc.gov/roleofclinlab.asp (04.03.2003 r.)6. Centers for Disease Control and Prevention (online). Approved Tests for the Detection of Bacil-

lus anthracis in the Laboratory Response Network (LRN), http://www.bt.cdc.gov/documentsapp/Anthrax/ApprovedLRNTests.asp (04.03.2003 r.)

341

7. Chomiczewski K., Kocik J., Szkoda M.T.: Bioterroryzm. Zasady postêpowania lekarskiego. Wyd.Lek. PZWL. Warszawa 2002

8. Christopher G.W., Cieslak T.J., Pavlin J.A., Eitzen Jr, E.M.: Biological warfare. A historical per-spective. JAMA 278, 412�417 (1997)

9. Cieslak T.J., Eitzen Jr.E.M.: Clinical and epidemiologic principles of anthrax. Emerg. Infect. Dis.5, 552�555 (1999)

10. Cieslak T.J., Christopher G.W., Kortepeter M.G., Rowe J.R., Pavlin J.A., Culpepper R.C.,Eitzen Jr.E.M.: Immunization against potential biological warfare agents. Clin. Infect. Dis. 30,843�850 (2000)

11. Davis C.J.: Nuclear blindness: an overview of the biological weapons programs of the formerSoviet Union and Iraq. Emerg. Infect. Dis. 5, 509�512 (1999)

12. De B.K., T. Popovic i wsp.: Two-component direct fluorescent-antibody assay for rapid identifi-cation of Bacillus anthracis. Emerg. Infect. Dis. 8, 1060�1065 (2002)

13. Dennis D.T., K. Tonat i wsp.: Tularemia as a biological weapon. Medical and public health mana-gement. JAMA, 285, 2763�2773 (2001)

14. Dickinson Burrows W., Renner S.E.: Biological warfare agents as threats to potable water. Envi-ron. Health Perspect. 107, 975�983 (1999)

15. Dixon T.C., Matthew Meselson B.S., Guillemin J., Hanna P.C.: Antrax. New Engl. J. Med. 341,815�826 (1999)

16. Dull P.M., D. Ashford i wsp.: Bacillus anthracis aerosolization associated with a contaminatedmail sorting machine. Emerg. Infect. Dis. 8, 1044�1047 (2002)

17. Franz D.R., Jahrling P.B., Friendlander A.M., McClain D.J., Hoover D.L., Bryne W.R., Pavlin J.A.,Christofer G.W., Eitzen Jr.E.M: Clinical recognition and management of patients exposed to bio-logical warfare agents. JAMA, 278, 399�411 (1997)

18. G³ówny Inspektorat Sanitarny (online). Schemat postêpowania i wspó³pracy w przypadku zagro¿e-nia niebezpieczn¹ chorob¹ zaka�n¹ oraz bioterroryzmem., http://www.gis.mz.gov.pl./schemat.htm(02.12.2002).

19. Hawley R.J., Eitzen Jr.E.M.: Biological weapons � a primer for microbiologists. Annu. Rev.Microbiol. 55, 235�253 (2001)

20. Heller M.B., S.T. Beatrice i wsp.: Laboratory response to anthrax bioterrorism, New York City,2001. Emerg. Infect. Dis. 8, 1096�1102

21. Henderson D.A.: Smallpox: clinical and epidemiologic features. Emerg. Infect. Dis. 5, 537�539(1999)

22. Henderson D.A., K. Tonat i wsp.: Smallpox as a biological weapon. Medical and public healthmanagement. JAMA, 281, 2127�2137 (1999)

23. A. Higgins, Cooper M., Schroeder-Tucker L., Black S., Miller D., Karns J. S., Manthey E.,Breeze R., Perdue M.l.: A field investigation of Bacillus anthracis contamination of U.S. Depart-ment of Agriculture and other Washington, D.C., buildings during the anthrax attack of October2001. Appl. Environ. Microbiol. 69, 593�599 (2003)

24. Hoffmaster A.R., Fitzgerald C.C., Ribot E., Mayer L.W., Popovic T.: Molecular subtyping ofBacillus anthracis and the 2001 bioterrorism-associated anthrax outbreak, United States. Emerg.Infect. Dis. 8, 1111�116 (2002)

25. Hoffmaster A.R., Meyer R.F., Bowen M.P., Marston C.K., Weyant R.S., Barnett G.A., Sejvar J.J.,Jernigan J.A., Perkins B.A., Popovic T.: Evaluation and validation of Real Time Polymerase ChainReaction assay for rapid identification of Bacillus anthracis. Emerg. Infect. Dis. 8, 1178�1182 (2002)

26. Hughes J.M.:The emerging threat of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 494�495 (1999)27. Inglesby T.V., K. Tonat i wsp.: Anthrax as a biological weapon. Medical and public health mana-

gement. JAMA, 281, 1735�1745 (1999)28. Inglesby T. V., K. Tonat i wsp.: Plague as a biological weapon. Medical and public health mana-

gement. JAMA, 283, 2281�2290 (2000)29. Inglesby T.V., K. Tonat i wsp.: Anthrax as a biological weapon, 2002. Medical and public health

management. JAMA, 287, 2236�2252 (2002)

342

30. Jernigan J.A., B.A. Perkins i wsp.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 casesreported in the United States. Emerg. Infect. Dis. 7, 933�943 (2001)

31. Jernigan D.B., J.L. Gerberding i wsp.: Investigation of bioterrorism-related anthrax, United Sta-tes, 2001: Epidemiological findings. Emerg. Infect. Dis. 8, 1019�1028, (2002)

32. Jortani S.A., Snyder J.W., Valdes Jr, R.: The role of the clinical laboratory on managing chemicalor biological terrorism. Clin. Chem. 46,1883�1893 (2000)

33. Kaufmann A.F., Meltzer M.I., Schmid G.P.: The economic impact of a bioterrorist attack: areprevention and postattack intervention programs justifiable? Emerg. Infect. Dis. 3, 83�94 (1997)

34. Klietmann W.F., Ruoff K.L.: Bioterrorism: implications for the clinical microbiologist. Clin.Microbiol. Rev. 14, 364�381 (2001)

35. Kortepeter M.G, Parker G.W.: Potential biological weapons threats. Emerg. Infect. Dis. 5, 523�527(1999)

36. Kortepeter M., Christopher G., Cieslak T., Culpepper R., Darling R., Pavlin J., Rowe J., McKeeJr.K., Eitzen Jr.E. (online): USAMRIID�s Medical management of biological casualties hand-book, wyd. 4, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Frederick,Maryland, 2001. http://www.usamriid.army.mil/education/ bluebook.html (04.03.2003 r.)

37. Kuroczyñski-Saniutycz S. (online): Podstawowe praktyczne dzia³ania szpitala w odpowiedzi nazagro¿enia bioterrorystyczne i du¿e epidemie. G³ówny Inspektorat Sanitarny. http://www.gis.mz.gov.pl./news/kuroczyñski.htm (02.12.2002)

38. LaForce F.M.: Anthrax. Clin. Infect. Dis. 19, 1009�1014 (1994)39. Lane H.C., La Montagne J., Fauci A.S.: Bioterrorism: a clear and present danger. Nature Medicine.

7, 1271�1273 (2001)40. Matras J., Bartoszcze M.: Bacillus anthracis. Post. Mikrobiol. 41, 3�19 (2002)41. McDade J.E., Franz D.: Bioterrorism as a public health threat. Emerg. Infect. Dis. 4, 493�494 (1998)42. Meltzer M.I., Damon I., LeDuc J.W., Miller J.D.: Modeling potential responses to smallpox as

a bioterrorist weapon. Emerg. Infect. Dis. 7, 959�969 (2001)43. Mierzejewski J., Bartoszcze M.: Konsekwencje do�wiadczeñ nad wykorzystaniem Bacillus anthra-

cis jako broni biologicznej. Post. Mikrobiol. 34, 385�401 (1995)44. Mierzejewski J.: Bioterroryzm. Post. Mikrobiol. 40, 279�285 (2001)45. Mierzejewski J., Franz D.R., Zajtchuck R. (online): Bioterroryzm. G³ówny Inspektorat Sanitarny.

http://www.giz.mz.gov.pl./news/artykul.htm (02.12.2002).46. Mock M., Fouet A.: Anthrax. Ann. Rev. Microbiol. 55, 647�671 (2001)47. Mott J.A., Treadwell T.A., Hennessy T.W., Rosenberg P.A., Wolfe M.I., Brown C.M., Butler J.C.:

Call-tracking data and the public health response to bioterrorism-related antrax. Emerg. Infect.Dis. 8, 1088�1092 (2002)

48. NATO Handbook on medical aspects of NBC defensive operations (online). AMedp-6(B), PartII-biological, 1996, http://www.unh.org/MedAspNCBDef/2toc.htm (02.12.2002)

49. Pavlin J.A.: Epidemiology of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 528�530 (1999)50. Perkins B.A., Popovic T., Yeskey K: Public health in the time of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis.

8, 1015�1018 (2002)51. Peterson L.R., Hamilton J.D., Baron E.J., Tompkins L.L., Miller J.M., Wilfert C.M., Tenover F.C.,

Thomson Jr, R.B.: Role of clinical microbiology laboratories in the managements and control ofinfectious diseases and the delivery of health care. Clin. Infect. Dis. 32, 605�611 (2001)

52. Quinn C.P., B.A. Perkins. i wsp.. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immuno-sorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to antrax toxin protective antigen. Emerg.Infect. Dis. 8, 1103�1110 (2002)

53. Raport BBN o stanie przygotowania pañstwa do realizacji zadañ w zakresie monitorowania, diag-nozowania oraz zwalczania i usuwania skutków zagro¿eñ srodkami mikrobiologicznymi (online).Biuro Bezpieczeñstwa Narodowego RP, Warszawa 2002., http://www.bbn.gov.pl/pl/bbn-pl.html(04.03.2003 r.)

54. Richmond J.Y., McKinney R.W.: Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (online).Wyd. 4, U.S. Government printing office, Washington (1999). http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/brnbl4/bmbt4toc.htm (04.03.2003 r.)

343

55. Rosenthal S.R., Merchlinsky M., Kleppinger C., Goldenthal K.L.: Developing new smallpoxvaccines. Emerg. Infect. Dis. 7, 920�926 (2001)

56. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.M., Ostroff S.M., Hughes J.M.: Public health assessment ofpotential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225�230 (2002)

57. Russell P.K.: Vaccines in civillan defense against bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 531�533(1999)

58. Sacchi C.T., Whitney A.M., Mayer L.W., Morey R., Steigerwalt A., Bioras A., Weyant R.S.,Popovic T.: Sequencing of 16S rRNA gene: a rapid tool for identification of Bacillus anthracis.Emerg. Infect. Dis. 8, 117�1123 (2002)

59. Shalala D.A.: Bioterrorism: how prepared are we? Emerg. Infect. Dis. 5, 492�493 (1999)60. Siegrist D. W.: The threat of biological attack: why concern now? Emerg. Infect. Dis. 5, 505�508

(1999)61. Simon J.D.: Biological terrorism. Preparing to meet the threat. JAMA 278, 428�430 (1997)62. Snyder J. M.: Role of the Hospital-based Microbiology Laboratory in Preparation for and

Response to a Bioterrorism Event. J. Clin. Microbiol. 41, 1�4 (2003)63. Spencer R.C., Lightfoot N.F.: Preparedness and response to bioterrorism. J. Infect. 43, 104�110

(2001)64. Stern J.: The prospect of domestic bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 517�522 (1999)65. Teshale E.H., D.L. Swerdlow i wsp.: Environmental sampling for spores of Bacillus anthracis.

Emerg. Infect. Dis. 8, 1083�1087 (2002)66. Trucker J.B.: Historical trends related to bioterrorism: an empirical analysis. Emerg. Infect. Dis.

5, 498�504 (1999)67. Turnbull P.C.B.: Guidelines for the surveillance and control of anthrax in human and animals

(online). Wyd. 3, WHO/EMC/ZDI/98.6. http://www.who.int/emc-documents/zoonoses/docs/whoemczdi986text.pdf (04.03.2003 r.)

68. Waeckerle J.F.: Domestic preparedness for events involving weapons of mass destruction. JAMA,12, 252�254 (2000)

69. Walt D.H., Franz D.R.: Biological warfare detection. Anal. Chem. 72, 738A�746A (2000)70. Wessely S., Hyams K.C., Bartholomew R.: Psychological implications of chemical and biologi-

cal weapons. BMJ, 323, 878�879 (2001)71. Wheelis M.: Biological warfare at the 1346 siege of Caffa. Emerg. Infect. Dis. 8, 971�975 (2002)72. Whitby S.M.: The potential use of plant pathogens against crops. Microbes Infection 3, 73�80 (2001)73. WHO Communicable Disease Surveillance and Response (online). WHO/CDS/EDC/99.2. Plague

Manual: Epidemiology, distribution, surveillence and Control, http://whqlibdoc.who.int/hq/1999/WHO_CDS_CSR_EDC_99.2.pdf (04.03.2003 r.)

74. WHO guidance. Public health response to biological and chemical weapons second edition (onli-ne), WHO (2001), http://www.who.int/emc/book_2nd_edition.htm (04.03.2003 r.)

75. Williams J.L., Noviello S.S., Griffith K.S., Wurtzel H., Hamborsky J., Perz J.F., Williams I.T.,Hadler J.L., Swerdlow D.L., Ridzon R.: Anthrax postexposure prophylaxis in postal workers,Connecticut, 2001. Emerg. Infect. Dis. 8, 1133�1137 (2002)

76. Wilson T., Logan-Henfrey L., Weller R., Kellman B.: Agroterrorism, biological crimes and biolo-gical warfare targeting animal agriculture. str. 23�57. W: Emerging Diseases of Animals (red.C. Brown i C. Bolin), ASM Press, Washington (2000)

Zak³ad Mikrobiologii, Instytut Biologii EksperymentalnejUniwersytet im. A. Mickiewicza61-701 Poznañ, ul. Fredry 10, e-mail: akazn@amu.edu.pl

Wp³ynê³o w marcu 2003 r.

345

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 345�346http://www.pm.microbiology.pl

Introduction to Food � and Airborne Fungi. Redakcja: Samson R.A., HoekstraEllen S., Frisvad J.C., Filtenborg O., we wspó³pracy z 13 autorami. Sixth Edition.Centralbureau voor Schimmelcultures � Utrecht. 2000. 389 stron, twarda oprawa,ISBN 90-70351-42-0.

Szóste wydanie wymienionego tytu³u, w cztery lata po pi¹tym wydaniu w 1996 r.,daje wielk¹ satysfakcjê mikologom pracuj¹cym w przemy�le rolno-spo¿ywczymi w zwi¹zanych z nim instytucjach naukowych oraz us³ugowych.

Stale trzeba mieæ na uwadze fakt, ¿e w warto�ci produkcji sprzedanej, któraw 1999 r. wynios³a 431,7 mld z³, warto�æ produkcji wyrobów spo¿ywczych i napo-jów osi¹gnê³a a¿ 87,0 mld z³, czyli 20,2%. Druga pozycja w tej statystyce, warto�æprodukcji pojazdów mechanicznych, stanowi tylko 6,6% ca³o�ci warto�ci sprzeda¿yprzemys³u. Mikrobiologia, w tym mikologia, nie jest w przemy�le rolno-spo¿yw-czym tematem teoretycznym. Drobnoustroje, w tym grzyby, powoduj¹ w wynikurozk³adu surowców rolniczych w czasie ich produkcji, a nastêpnie magazynowaniado momentu spo¿ycia, straty ekonomiczne, które siêgaj¹ 20% warto�ci produkcjiw skali roku, czyli 86 mld z³, a wiêc 21,5 mld dolarów. Ta kwota stanowi³a w 2002 r.65% ca³ego eksportu Polski. Autor recenzji pragnie na wstêpie zwróciæ uwagê, ¿emikologia ¿ywno�ci i jej uprawianie w przemy�le ma ogromne znaczenie ekono-miczne, z czego niewiele osób na kierowniczych stanowiskach przemys³u rolno-spo¿ywczego zdaje sobie sprawê.

Objêto�æ szóstego wydania �Introduction ...� wzros³a o 67 stron formatu A4(6480 znaków na stronie). Najwa¿niejszym elementem nowo�ci jest to, ¿e grzybypowietrza wewnêtrznego znalaz³y siê w tytule recenzowanej ksi¹¿ki. Liczba opisa-nych i przygotowanych do identyfikacji grzybów ple�niowych (bez dro¿d¿y) wzro-s³a ze 103 do 133 gatunków. Wielk¹ zas³ug¹ zespo³u pierwszego rozdzia³u jest wy-ra�ne zwrócenie uwagi, ¿e na 133 gatunki grzybów 53 gatunki wystêpuj¹ zarównow ¿ywno�ci jak i w powietrzu pomieszczeñ. W powietrzu pomieszczeñ i tylkow powietrzu stwierdzono gatunki Chaetomium globosum, Curvularia geniculata,Memnoniella echinata, Oidiodendron griseum oraz Stachybotrys chartarum.

Autor recenzji traktuje listê grzybów wyizolowanych z ¿ywno�ci, któr¹ ujêto nastronach 4 i 5, jako wa¿ny dokument. Zastrze¿enia mog¹ natomiast budziæ gatunkigrzybów wymienione jako obecne w pomieszczeniach produkcyjnych i magazyno-wych przemys³u rolno-spo¿ywczego. Ze studiów w³asnych wynika, ¿e w powietrzuwewnêtrznym budynków mieszkalnych i gmachów u¿yteczno�ci publicznej krajóweuropejskich wyizolowano w okresie od 1958 do 1999 r. a¿ 227 gatunków grzybów.W tym przedmiocie autorzy rozdzia³u pierwszego nie s¹ precyzyjni i nie informuj¹czytelnika, ¿e w powietrzu wewnêtrznym ró¿nych pomieszczeñ sk³ad mikoflorymo¿e siê ró¿nie uk³adaæ (Mikologia lekarska, 2000, 8, 3/4, 127�140).

Godny podkre�lenia jest fakt dobrej redakcji kluczy do oznaczania wymienionychwy¿ej 133 gatunków w gromadach Zygomycota i Ascomycota oraz w wydzielonej

346

grupie grzybów anamorficznych, wcze�niej okre�lanej jako Deuteromycetes czyFungi Imperfecti.

Literatura przedmiotu do pierwszego rozdzia³u wzros³a o 30%. W podrozdzialeo dro¿d¿ach i grzybach dro¿d¿opodobnych zwrócono uwagê na 27 gatunków i wy-specyfikowano 16 systemów automatycznej identyfikacji gatunków tej grupy drob-noustrojów. Przy ca³ym uznaniu dla autorów pierwszego rozdzia³u, który stanowi72% objêto�ci ksi¹¿ki, zdumiewa fakt, ¿e w pi�miennictwie pominiêto ósme wyda-nie �Dictionary of Fungi� pod redakcj¹ Hawkswortha i wsp., które jest kontynuacj¹s³ownika autorstwa Guy Richarda Bisby�ego i Geoffrey�a Ains-wortha, wydanegow 1943 r. Wymieniony s³ownik jest po prostu �bibli¹� mikologów. ¯a³owaæ trzeba,¿e autorzy pierwszego rozdzia³u pomijaj¹ w spisie literatury znakomite dzie³o ho-lendra P.J. Van der Werffa z 1958 r., który zestawi³ ca³e listy grzybów ple�niowychdla ró¿nych ga³êzi przemys³u rolno-spo¿ywczego.

£¹czna liczba rozdzia³ów w ksi¹¿ce nie uleg³a zwiêkszeniu, ale wszystkie tre�cizosta³y uaktualnione. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje lista 42 ksi¹¿ek na temat mi-kotoksyn, opublikowanych w okresie od 1974 do 1998 r. Warto zwróciæ uwagê naksi¹¿kê K.K. Sinha i D. Bhatnagara, wydan¹ w 1998 r., o objêto�ci 511 stron, po-�wiêcon¹ mikotoksynom w rolnictwie i bezpieczeñstwu w obrocie ¿ywno�ci¹, jakienarzuca toksyczno�æ tych metabolitów wtórnych dla cz³owieka i zwierz¹t hodowla-nych. Temat jest daleki od wyczerpania, je�li zwa¿yæ, ¿e w roku 2000 ukaza³o siê330 artyku³ów o mikotosynach, a w 2001�254 artyku³y.

W przemys³owej obróbce ¿ywno�ci zwrócono wiêksz¹ uwagê w nowym wydaniuksi¹¿ki na gatunki grzybów odporne na wysokie temperatury oraz warto�æ D, któraokre�la przedzia³ czasu potrzebny dla dezaktywacji 90% drobnoustrojów w danej tem-peraturze. Ma³o kto wie, ¿e Talaromyces flavus, a w³a�ciwie jego makrospory, wytrzy-muj¹ w mi¹¿szu owoców temperaturê 91oC przez okres od 2,1 minuty do 11,7 minuty.

W normach dopuszczalnego stê¿enia grzybów ple�niowych i dro¿d¿y w powietrzuró¿nych zak³adów przetwórczych przemys³u spo¿ywczego w wydaniu szóstym niezasz³y ¿adne zmiany w stosunku do wydania pi¹tego. Autorzy siódmego rozdzia³uzwracaj¹ jednak uwagê na nowo�ci technologiczne w procesach pasteryzacji ¿ywno-�ci, w tym na: � dzia³anie wysokiego ci�nienia hydrostatycznego do 5000 barów, którema zabijaæ drobnoustroje oraz � dzia³anie pulsacyjnego pola elektrycznego przy na-piêciu od 30 kV/cm do 41,7 kV/cm. Obydwie te technologie s¹ ci¹gle w fazie prób.

Niewielkie zmiany zosta³y dokonane w rozdziale o fungicydach dla produktów¿ywno�ciowych. W zwalczaniu grzybów w ¿ywno�ci wyeliminowano azotany i azo-tyny oraz tlenek etylenu, ale dodano pochodne imidazoli. Technolodzy ¿ywno�cipowinni zwróciæ uwagê na pracê Florosa i wsp. (2000) o modyfikacji atmosfery wopakowaniach ¿ywno�ci oraz Nielsena i Riosa (2001) o lotnych zwi¹zkach grzybo-bójczych w zio³ach i przyprawach korzennych.

Dla dokonania postêpu w mikologii ¿ywno�ci by³oby cenn¹ rzecz¹ przet³umacze-nie szóstego wydania �Introduction...� na jêzyk polski i szybkie wydanie tej pracy.Praca O. Fassatiovej sprzed 20 lat jest po prostu przestarza³a. Rzecz jest warta zacho-du, gdy siê zwa¿y roczn¹ warto�æ produkcji przemys³u rolno-spo¿ywczego, o którejmówiono na wstêpie oraz warto�æ strat powodowanych przez grzyby i bakterie.

Bronis³aw Zyska

347

POST. MIKROBIOL.,2003, 42, 3, 347�350http://www.pm.microbiology.pl

NOWE INICJATYWYFEDERACJI

EUROPEJSKICH TOWARZYSTWMIKROBIOLOGICZNYCH � FEMS

Stefan Tyski

Federacja Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych, do której od momentuutworzenia w 1974 roku, nale¿y Polskie Towarzystwo Mikrobiologów, w ostatnichmiesi¹cach podjê³o dwie wa¿ne inicjatywy zmierzaj¹ce do zacie�nienia wspó³pracypomiêdzy towarzystwami mikrobiologicznymi dzia³aj¹cymi w Europie.

Podjêto decyzjê o organizowaniu co 3 lata Kongresu Europejskich Mikrobio-logów FEMS. Pierwszy taki kongres odby³ siê w Ljubljanie w S³owenii w dniach29.06. � 03.07 bie¿¹cego roku. Nastêpny rozpocznie siê 1 lipca 2006 roku w Hisz-panii, prawdopodobnie w Toledo, a kolejny planowany jest na lipiec 2009 rokuw Wielkiej Brytanii.

W pierwszym Kongresie wziê³o udzia³ ponad 1000 osób, w tym tylko 21 cz³on-ków Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Tematyka Kongresu by³a bardzourozmaicona i dotyczy³a rozmaitych aspektów: mikrobiologii lekarskiej, wetery-naryjnej, �rodowiskowej, przemys³owej, ¿ywno�ci a tak¿e genetyki, biochemii,fizjologii i systematyki drobnoustrojów. Specjali�ci zajmuj¹cy siê bakteriami,grzybami, wirusami i pierwotniakami mogli znale�æ interesuj¹ce sesje, wyk³ady,plakaty, a tak¿e dyskusje okr¹g³ego sto³u. Wielu m³odych naukowców z ró¿nychkrajów Europy uzyska³o pomoc finansow¹ FEMS umo¿liwiaj¹c¹ im uczestnictwow Kongresie � niestety nikt z m³odych cz³onków PTM nie by³ t¹ mo¿liwo�ci¹zainteresowany.

Druga inicjatywa FEMS dotyczy przygotowania Europejskiej Deklaracji Mikro-biologii, której projekt opublikowano w kwartalniku Mikrobiologia Medycyna2003; 2 (35): 42�43. Na 1 Kongresie FEMS przedstawiono ostateczn¹ wersjê, któr¹zaaprobowa³o ponad 40 towarzystw mikrobiologicznych Europy. Ze strony Pol-skiego Towarzystwa Mikrobiologów Deklaracjê podpisa³ prof. Stefan Tyski cz³onekZarz¹du G³ównego PTM, delegat PTM do FEMS. Poni¿ej zamieszczono t³umacze-nie przyjêtego tekstu.

348

EUROPEJSKA DEKLARACJA MIKROBIOLOGII

Europejska Deklaracja Mikrobiologii prezentuje opinii publicznej, twór-com polityki, spo³eczno�ci naukowej pogl¹dy i cele Federacji EuropejskichTowarzystw Mikrobiologicznych (FEMS).

Mikrobiologia, nauka o drobnoustrojach (wirusach, bakteriach, glonach,pierwotniakach i grzybach) ma d³ug¹ i nieprzerwan¹ tradycjê w Europie odczasów, gdy Antonie van Leeuwenhoek, pracuj¹cy w Delft w Holandii, po razpierwszy og³osi³ swoje obserwacje dotycz¹ce glonów, bakterii i pierwotnia-ków w Królewskim Towarzystwie w Londynie w 1676 roku. W ci¹gu ostat-nich 200 lat europejscy uczeni, tacy jak Louis Pasteur, Robert Koch, SergeiN. Winogradsky i Martinus W. Beijerinck, w³a�nie w mikrobiologii dokonalibrzemiennych w skutki odkryæ, jakimi nie mogli poszczyciæ siê naukowcyw ¿adnej innej dziedzinie badawczej. Ta silna tradycja wspania³ych osi¹gniêæw europejskiej mikrobiologii trwa do dzi�, a europejscy mikrobiolodzy wci¹¿przyczyniaj¹ siê do najbardziej znacz¹cych postêpów w medycynie, rolnic-twie, biotechnologii i naukach podstawowych.

Mikrobiolodzy na ca³ym �wiecie zorganizowali sieæ towarzystw nauko-wych. W Europie towarzystwa mikrobiologiczne s¹ podzielone, z jednej stro-ny ze wzglêdu na kraje, z drugiej za� ze wzglêdu na zagadnienia; na grupywirusologów, bakteriologów, algologów, mikologów, protozoologów i para-zytologów oraz na specjalno�ci zwi¹zane z dziedzinami, takimi jak mikro-biologia lekarska, ¿ywno�ci, rolnicza, �rodowiskowa czy przemys³owa.

Celem niniejszej deklaracji jest zapocz¹tkowanie procesu, który utrzymawspólny cel prowadz¹cy do zjednoczenia europejskiej mikrobiologii. Jedyniew ten sposób mikrobiolodzy mog¹ jak najlepiej s³u¿yæ spo³eczno�ci Europy,sk³adaj¹cej siê z naukowców, polityków, przemys³owców i reszty spo³eczeñ-stwa. Ta spójno�æ dzia³ania umo¿liwi owocne wspó³zawodnictwo na rynkumiêdzynarodowym i zapewni ukierunkowanie rozwoju �wiata zgodnie z inte-gralnymi normami i zasadami nauki.

Federacja Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych wraz z 46 towa-rzystwami cz³onkowskimi w 35 krajach Europy wschodniej i zachodniej,realizuj¹c zasadê, ¿e razem mo¿na zrobiæ wiêcej ni¿ osobno, pragnie staæ siêcentrum takiej wspólnoty. Chcieliby�my aby pocz¹tek XXI wieku i nowo-czesne badania mikrobiologiczne prowadzone od 500 lat, stanowi³y etap,rozpoczynaj¹cy prawdziwa integracjê i siln¹ naukow¹ wspó³pracê mikrobio-logów w Europie!

Celem niniejszej deklaracji jest zapocz¹tkowanie debaty europejskichmikrobiologów nad ustaleniem mechanizmów harmonizacji i w przysz³o�ci,unifikacji w mikrobiologii. Nale¿y tego dokonaæ nie naruszaj¹c bogatej ró¿no-rodno�ci mikrobiologii europejskiej Ta ró¿norodno�æ bowiem kreuje przy-sz³ych laureatów nagrody Nobla i stymuluje rozszerzanie wp³ywu mikro-

349

biologii na my�l technologiczn¹, naukow¹, polityczn¹, spo³eczn¹ i �rodowi-skow¹ w Europie.

FEMS ¿ywi nadziejê, ¿e niniejsza deklaracja bêdzie stymulowaæ nastêpu-j¹ce zagadnienia:

1. Zapewnienie, ¿e mikrobiologia s³u¿y poprawie dobrobytu ca³ej ludzko�cii pozwala na nieustaj¹cy rozwój ludzi, zapewniaj¹c ochronê i konserwa-cjê przyrody oraz pomoc w osi¹gniêciu pokoju na �wiecie.

2. Wzmocnienie ogólnej �wiadomo�ci korzy�ci dla �wiata i ludzi, p³yn¹cychz istnienia drobnoustrojów i zrozumienie, ¿e niebezpieczeñstwa wynikaj¹cez ich istnienia s¹ niewielkie, a korzy�ci w znacznym stopniu je przewa¿aj¹.

3. Zapewnienie wszystkim Europejczykom dostêpu do szczegó³owej infor-macji na temat mikrobiologii, w³¹cznie z dostêpem do w³a�ciwego pi�-miennictwa. Zapewnienie wiedzy o korzy�ciach i zagro¿eniach dla ludzii naszego �rodowiska naturalnego.

4. Wsparcie zrozumienia i zachowanie ró¿norodno�ci biologicznej w mikro-biologii drog¹ badañ naukowych i utrzymanie sieci kolekcji kultur drobno-ustrojów.

5. Potêpienie umy�lnego stosowania drobnoustrojów na szkodê ludzi (broñbiologiczna i bioterroryzm).

6. Zapewnienie, ¿e nauczanie mikrobiologii stanie siê czê�ci¹ wszystkicheuropejskich systemów edukacyjnych i bêdzie w³¹czone w edukacjê nau-kow¹ i spo³eczn¹ na wszystkich poziomach. Zachêcanie mikrobiologówdo popularyzacji ich pracy i upowszechniania znaczenia drobnoustrojów.

7. Zachêcanie do stosowania najwy¿szych norm bezpieczeñstwa we wszyst-kich procesach mikrobiologicznych, produktach i procedurach oraz za-pewnienie, ¿e wszystkie technologie wywodz¹ce siê z badañ mikrobiolo-gicznych s¹ dok³adnie testowane przed zastosowaniem.

8. Zapewnienie, ¿e dane dotycz¹ce genomu drobnoustrojów s¹ dziedzictwemca³ej ludzko�ci.

9. Wykreowanie mikrobiologii europejskiej poprzez zwiêkszanie mobilno�cinaukowców w Europie i zatrzymywanie w niej najlepszych mikrobio-logów oraz tworzenie struktury zapewniaj¹cej intensywne badania mikro-biologiczne na uniwersytetach, w szpitalach, laboratoriach pañstwowychi przemys³owych Europy.

10. Wsparcie rozwoju dziedzin mikrobiologii takich jak biotechnologia,mikrobiologia ¿ywno�ci, szybka diagnostyka i ochrona �rodowiska.

Opracowane przez Federacjê Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznychna 1 Kongres Europejskich Mikrobiologów FEMS w 2003 roku.

Prezydent FEMS Vice Prezydent FEMS Sekretarz Generalny FEMSDr Hans G, Trüper Dr Eliora Z. Ron Dr Peter Raspor

350

Przy okazji sygnalizowania powy¿szych inicjatyw, wydaje siê celowym przy-pomnienie mo¿liwo�ci i korzy�ci p³yn¹cych z faktu przynale¿no�ci PolskiegoTowarzystwa Mikrobiologów do FEMS oraz zachêcenie cz³onków PTM aby w spo-sób pe³niejszy korzystali z istniej¹cych mo¿liwo�ci.

Pe³ne informacje na temat pomocy finansowej dotycz¹cej: wyjazdów do zagra-nicznych o�rodków badawczych, uczestnictwa w zagranicznych zjazdach i sympo-zjach naukowych, organizacji konferencji i kursów miêdzynarodowych a tak¿e danedotycz¹ce wydawanych przez FEMS czasopism (FEMS Microbiology Letters,FEMS Microbiology Ecology, FEMS Microbiology Reviews, FEMS Yeast Research,FEMS Immunology and Medical Microbiology) znajduj¹ siê na stronach interneto-wych: www.fems-microbiology.org

Nale¿y przypomnieæ, ¿e FEMS przeznacza �rodki finansowe uzyskane ze sk³a-dek organizacji cz³onkowskich (w tym PTM) na:

� stypendia (Fellowships) dla m³odych badaczy (35 lat, do 3.500 Euro na pobytdo 3 miesiêcy w laboratorium zagranicznym),

� finansowanie kosztów podró¿y naukowej (Visiting Scientist Grants) w obrêbieEuropy na zaproszenie towarzystwa mikrobiologicznego nale¿¹cego do FEMS,

� finansowanie kosztów uczestnictwa w konferencji naukowej (Young ScientistsGrants) dla m³odych osób (35 lat, do 6.000 Euro),

� finansowanie kosztów organizacji miêdzynarodowych konferencji (MeetingSupport Grants � do 12.000 Euro),

� finansowanie kosztów organizacji miêdzynarodowych kursów laboratoryjnych(Laboratory Workshop Grants � do 12.000 Euro),

� po¿yczkê na rozpoczêcie prac zwi¹zanych z organizacj¹ konferencji. (Rede-emable Start-Up Fund � do 10.000 Euro),

� indywidualn¹, subskrypcjê on-line wszystkich czasopism FEMS (120 Euro za54 zeszytów czasopism w 2003 roku),

� nagrodê FEMS im. Lwoffa dla mikrobiologa lub grupy osób wnosz¹cych wy-bitny wk³ad w mikrobiologiê europejsk¹. Nagroda wrêczana jest na KongresieFEMS � specjalny wyk³ad, medal i 1000 Euro.

Bior¹c pod uwagê powy¿sze mo¿liwo�ci nale¿y szeroko rozpropagowaæ tê infor-macjê oraz zachêciæ, szczególnie m³odych cz³onków PTM do liczniejszego i pe³-niejszego korzystania z oferty FEMS. Mo¿liwo�ci jakie daje przynale¿no�æ doFEMS powinny byæ równie¿ zachêt¹ do wstêpowania do Polskiego TowarzystwaMikrobiologów.

Nasze Towarzystwo w sposób skromny korzysta³o z dofinansowania FEMSw okresie od wrze�nia 2002 do wrze�nia 2003. Z 19 przyznanych stypendiów �Fellow-ships� (19 aplikacji) otrzymano 2 dla cz³onków PTM (2 aplikacje) a ze 113 stypen-diów �Young Scientists Grants� (143 aplikacje), 5 przyznano dla cz³onków PTM.Z pozosta³ych mo¿liwo�ci FEMS nie korzystano.

Zak³ad Antybiotyków i MikrobiologiiNarodowy Instytut Zdrowia Publicznego00-725 Warszawa, Che³mska 30/34

Stefan TyskiCz³onek Zarz¹du G³ównego PTM

Delegat PTM do FEMS

Spis tre�ci

J. W i e l b o, A. S k o r u p s k a � Ewolucja uk³adu symbiotycznego Rhizobium � ro�linymotylkowate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263

A. J a w o r s k i, L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k � Organizacja, funkcja i filogenezabakteryjnego systemu naprawy b³êdnie sparowanych zasad w DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285

J. S t a n i s ³ a w s k a, B. I n t e r e w i c z, W. L. O l s z e w s k i � Odpowied� leukocytówgospodarza na antygeny bakteryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301

A. K a z n o w s k i, J. M o k r a c k a, R. K o c z u r a � Zadania laboratoriów mikrobiologicz-nych w przypadku ataku bioterrorystycznego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319

Contents

J. W i e l b o, A. S k o r u p s k a � The evolution of Rhizobium-legumes symbiosis . . . . . . . . . 263A. J a w o r s k i, L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k � Organization, function and phylogeny

of the DNA mismatch repair system in bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285J. S t a n i s ³ a w s k a, B. I n t e r e w i c z, W. L. O l s z e w s k i � Immune response of host

leukocytes for bacterial antigens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301A. K a z n o w s k i, J. M o k r a c k a, R. K o c z u r a � Role of microbiological laboratories

in case of bioterroristic attack . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319