PL ISSN 0324-833X

POLSKIE TOWARZYSTWO ANATOMICZNE

POLSKIE TOWARZYSTWO BIOLOGII KOMÓRKI

TOM 24 NR-3’97(301-400)

http://rcin.org.pl

PO STĘPY B IO LO G II KOM ÓRKI AD V A N CES IN C ELL BIOLOG Y

TOM 24, NR 3, 1997 ( 301-400) VOL. 24, ISSU E 3, 1997 (301-400)

Kwartalnik Polskiego Towarzystwa Anatomicznego, Polskiego Towarzystwa Biologii Komórki, Polskiej Sieci UNESCO oraz Fundacji Biologii Komórki i Biologii Molekularnej wydawany z częściową pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych.Quarterly of the Polish Anatomical Society, the Polish Society of Cell Biology, the Polish UNESCO Net, and the Foundation for Cell Biology and Molecular Biology, partialy supported by the Committee for Scientific Research (KBN)

Redaguje Kolegium - Editors:Szczepan BILIŃSKI (biologia rozwoju, embriologia, cytoszkielet, połączenia międzykomórkowe - Instytut Zoologii UJ, 30-060 Kraków, ul. Ingardena 6),Jerzy KAWIAK (immunologia, cytometria, hematologia, biologia nowotworów - Zakład Cytologii Klinicznej CMKP, 01-813 Warszawa, ul. Marymoncka 99),Wincenty KILARSKI (mięśnie, skurcz mięśniowy, ruchy komórek - Instytut Zoologii UJ, 30-060 Kraków, ul. Ingardena 6),Jan MICHEJDA (szlaki informacyjne, błony komórek, energetyka komórki - Zakład Bioenergetyki U AM, 61-701 Poznań, ul. Fredry 10),Maria OLSZEWSKA (komórki roślinne, informacja genetyczna w komórkach roślinnych i zwierzęcych - Zakład Cytologii i Cytochemii Roślin Instytutu Fizjologii i Cytologii UŁ, 90-237 Łódź, ul. Banacha 12/16), Maciej ZABEL (histologia ogólna, endokrynologia, histochemia (immunocytochemia, hybrydocytochemia), ultrastruktura komórek - Zakład Histologii AM, 50-368 Wrocław, ul. Chałubińskiego 6a)

Rada Redakcyjna - Advisory Board:Zofia OSUCHOWSKA - przewodnicząca, Mieczysław CHORĄŻY, Leszek CIECIURA, Antoni HORST, Aleksander KOJ, Włodzimierz KOROHODA, Leszek KUŹNICKI,Olgierd NARKIEWICZ, Aleksandra PRZEŁĘCKA, Aleksandra STOJAŁOWSKA,Lech WOJTCZAK

A d res R edakcji: -E d ito r ia l O ffice: C entrum M ed yczn e K szta łcen ia P o d yp lo m o w eg o ul. M a ry m o n ­cka 99, 01 -813 W arszaw a, P oland , tel. 340 344, fax 340470.

Recenzenci rocznika PBK są publikowani w zeszycie 4. Referees o f the volume are published in issue 4.

© Fundacja Biologii Komórki i Biologii Molekularnej - Foundation for Cell Biology and Molecular Biology

Wszystkie prawa zastrzeżone. Zabrania się kopiowania części lub całości bez uprzedniego pisemnego zezwo­lenia Fundacji Biologii Komórki i Biologii Molekularnej.

All rights reserved. No part o f this publication may be reproduced in any form or by any means without the prior written permission o f the publisher. Requests to the publisher for permission should be adressed to the Fundacja Biologii Komórki i Biologii Molekularnej.

Ark. wyd. 7 ,5. Ark. druk.6,25. Podpisano do druku w maju 1997 r. Druk ukończono w czerwcul997 r.

http://rcin.org.pl

W tym zeszycie • Postępów Biologii Komórki •

W artykułach na stronach 303 i 315 omówiono metabolizm selenu w komórce. Opisano jego znaczenie jako składnika centrum aktywnego peroksydazy glutationowej. Enzym ten uczestniczy w obronie przed stresem oksydacyjnym. Selen ma też działanie antynowotworowe.

Najlepiej poznanym mechanizmem naprawy DNA jest naprawa przez wyci­nanie. Funkcjonujądwa rodzaje takiej naprawy. Jeden, zależny od transkrypcji, jest specyficzny dla nici przepisywanej. Drugi usuwa uszkodzenia z DNA nieaktywnego transkrypcyjnie. Bliższy opis tych mechanizmów Czytelnik znaj­dzie na stronie 325.

Znaczenie ewolucyjne komunikacji międzykomórkowej przez połączenia szczelinowe, jawi się nam w perspektywie ich obecności w większości tkanek (artykuł na stronie 339). Tylko nieliczne populacje komórek są pozbawione połączeń szczelinowych, stanowiących kanały lub ich zespoły. Takie połącze­nia zapewniają ciągłość cytoplazmatyczną połączonych komórek. Nie mają takich połączeń komórki krwi oraz mięśni szkieletowych.

Budowę i funkcje białek surfaktantu płucnego znajdzie Czytelnik na stronie 375.

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

PO STĘPY BIOLOGII KOM ÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (303-313)

M ETABOLIZM SELENU W KOM ÓRCE I ORGANIZM IE CZŁOW IEKA

M E T A B O L IS M O F SE L E N IU M IN C E L L A N D O R G A N IS M

Halina M ałgorzata ŻBIKOW SKA

Katedra Biochemii Ogólnej, Instytut Biochemii UL, Łódź

Streszczenie : Selen jest niezbędnym pierw iastkiem śladowym znanym przede w szystkim jako składnik centrum aktyw nego peroksydazy glutationowej - enzym u uczestniczącego w procesie obrony organizm u przed stresem oksydacyjnym . Selen jest dostarczany do organizm u w form ie organicznej głów nie jako selenom etionina i selenocysteina oraz nieorganicznej w postaci seleninów i selenianów. B iologiczna aktyw ność Se zależy zarówno od ilości, jak i formy spożywanego selenu, a także od sposobu m etabo­lizow ania tego pierw iastka w organizmie. W niniejszej pracy przedstawiono obecny stan wiedzy dotyczący m etabolizm u związków selenu u bakterii i roślin oraz u ssaków, ze szczególnym uw zględnie­niem roli grup tiolowych w tym procesie. Om ówiono też sposoby oznaczania selenu w organizm ie człow ieka.

Słow a kluczow e : selenin, selenian, glutation, selenodiglutation, m etabolizm seleninu, selenobiałka

Sum m ary : Selenium is an essential trace elem ent known to constitute an active center o f glutathione peroxidase - an enzym e protecting different com partm ents o f the organism from oxidative stress. Selenium enters the organism either in organic form (e.g. selenom ethionine and selenocysteine) or as inorganic com pounds mainly sodium selenite and selenate. Biological activity o f selenium depends on the am ount and chem ical form s o f the elem ent in the diet as well as its metabolic pathways in hum an organism . In this paper m etabolism o f selenium com pounds in bacteria, plants and m am m als, and especially the role o f thiols in this process are described. Some ways o f determ ination of selenium status in hum ans are also discussed.

K ey w ords : selenite, selenate, glutathione, selenodiglutathione, selenite metabolism , selenoproteins

W ykaz stosow anych skrótów: A PS - adenozyno-5’-fosfosiarczan, D M Se - dim etyloselenek, D M SeO - d im etyloselenotlenek, D M SO - dim etylosulfotlenek, G R - reduktaza glutationow a, G S H - glutation, G S H -P x - peroksydaza glutationow a, G SSG - disulfid glutationu, G SSeH - glutationyloselenol, G S -S e -S G - selenodiglutation, PA PS - adenozyno-3’-fosfo-5’-fosfosiarczan, SeC ys - selenocysteina, S e M e t - selenom etionina, T M S e+ - j o n trim etyloseleniowy, T rx - tioredoksyna

http://rcin.org.pl

304 H. M. Z B IK O W SK A

1. WSTĘP

Selen (Se) jest pierwiastkiem należącym do VI grupy układu okresowego i pod względem właściwości chemicznych wykazuje bliskie pokrewieństwo do siarki. Pogląd o wyłącznie toksycznym działaniu selenu na organizmy żywe utrzym ywał się aż do roku 1957, kiedy to Schwartz i Foltz po raz pierwszy zwrócili uwagę na jego niezbędność w pożywieniu [51]. Od tego czasu selen jest zaliczany do pierwiastków śladowych o istotnym znaczeniu zarówno dla zwierząt, jak i człowieka. W yjątkowe zainteresowanie tym pierwiastkiem datuje się od odkrycia w 1973 roku, że wchodzi on w skład centrum aktywnego peroksydazy glutationowej - enzymu uczestniczącego w procesie obrony organizmu przed stresem oksydacyjnym [19, 48]. Najwcześniej poznanym dowodem świadczącym o znaczeniu selenu w diecie człowieka była jego rola w zapobieganiu choroby Keshan (kardiomiopatie u dzieci i młodzieży) i choroby Kashin-Beck (zwyrodnienie stawów) występujących w re­gionach Chin o bardzo niskiej zawartości selenu w glebie [20]. Badania epide­miologiczne oraz badania przeprowadzane na zwierzętach laboratoryjnych wskazują, że niedobór selenu w diecie może być związany ze zwiększonym ryzykiem za­chorowalności na niektóre typy nowotworów [6] oraz na choroby układu krążenia [32, 55], chociaż dane na ten temat są kontrowersyjne [22, 39, 49, 61]. Stwierdzono ponadto, że selen pełni rolę komórkowego antyoksydanta [8, 12], wykazuje działanie ochronne przed toksycznością metali ciężkich, między innymi rtęci [9, 25, 34] i cisplatyny - leku antynowotworowego [2, 41]. Selen ma także właściwości anty- karcynogenne [14] i antymutagenne [52]. Zwraca się uwagę na korzystne działanie selenu w schorzeniach serca [33]. Pierwiastek ten wzmaga również funkcjonowanie układu odpornościowego [31, 59], działa przeciwwirusowo i łagodzi przebieg cho­roby u pacjentów zarażonych wirusem HIV [50]. Ostatnio wykazano, że selen w formie selenianu sodowego wykazuje działanie insulinopodobne (obniża poziom glukozy w osoczu) u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną [3, 38]. Selenin sodowy, podobnie jak insulina, hamuje stymulowany glukagonem rozpad glikogenu w wątrobie szczura [47].

W większych stężeniach, o czym mowa niżej, związki selenu są bardzo toksyczne zarówno dla zwierząt, jak i dla człowieka. W przeciwieństwie do większości pier­wiastków śladowych selen charakteryzuje się bardzo niewielką granicą bezpieczeń­stwa między niedoborem a dawką toksyczną [7, 20] (tab. 1). Selen o stężeniu powyżej 1 pM w formie seleninu sodowego hamuje proliferację komórek, replikację DNA i syntezę białek [53], może też być czynnikiem mutagennym [1]. Nadmiar selenu (seleninu), może również prowadzić do stresu oksydacyjnego i wzmożenia peroksydacji lipidów [11] oraz do tworzenia kompleksów z metalami (głównie z cynkiem), które odkładane w niektórych komórkach mózgu i przednim płacie przysadki mogą prowadzić do dysfunkcji tych organów [26].

http://rcin.org.pl

M E T A B O L IZ M SE LE NU W K O M Ó R C E I O R G A N IZ M IE C Z Ł O W IE K A 305

*TA BELA 1. Zapotrzebowanie człowieka na selen

W y szczegó ln ien ie p g / dobę P iśm ien n ic tw o

D zienne zap o trzeb o w an ie (U SA ) 5 0 - 7 0 [7, 20]M in im alne zap o trzeb o w an ie (N ow a Z elandia) 20 [7 ,2 0 ]Z alecan a n iezb ęd n a i bezp ieczn a daw ka uzupełn iająca 5 0 -2 0 0 [10]Z alecan a ilość w ży w ien iu pozajelitow ym 2 0 -1 5 0 [20]D aw ka to k sy czn a pow yżej 600 [7]

P raw id łow e s tężen ie Se w surow icy: 1 -1 ,2 pM

* Ustalenie zakresu norm stężeń selenu oraz poziom u jego dziennego zapotrzebow ania dla określonej populacji jest trudne ze względu na zróżnicow aną zawartość tego pierwiastka w ekosystem ach, jak i różną biodostępność poszczególnych form Se.

Badania epidemiologiczne prowadzone w latach osiemdziesiątych w krajach skandynawskich, a ostatnio rozszerzone na kraje Europy Zachodniej i Środkowej - Austrię [58], W łochy [42] i Czechy [36], wskazują na istotną rolę określonej podaży selenu na stan zdrowia populacji. Ustalona niezbędna i jednocześnie bez­pieczna dla człowieka dawka selenu waha się od 50 do 200 pg/dobę w zależności od regionu [40], 70 pg dla mężczyzn i 55 pg dla kobiet (ok. 0,87 pg/kg masy ciała/dobę) [46]. Światowa Organizacja Zdrowia zaleca spożywanie Se w ilości 40-100 pg/dobę [43], a w USA proponowano większą dobową ilość selenu 250-350 pg [10]. Taka ilość jest konieczna do uzupełnienia ubytku selenu wydalanego dziennie przez zdrowy organizm w normalnych warunkach życia. W iele czynników, takich jak: ciąża, wiek, poziom witaminy E czy stres oksydacyjny, może jednak wpływać na zwiększone zapotrzebowanie na selen [10, 63]. Nierównomierne roz­mieszczenie selenu na kuli ziemskiej sprawia, że jego pobieranie z pożywieniem i poziom we krwi różni się w różnych populacjach ludzi nawet o dwa rzędy wielkości. Niską zawartość selenu w glebie stwierdzono na terenach Chin w regionie Keshan, niskie stężenie tego pierwiastka występuje także w Europie, głównie w Skandynawii, w niektórych częściach USA oraz w Nowej Zelandii. W Finlandii, w celu podniesienia zawartości selenu w produktach rolnych od 1984 roku stosuje się nawożenie upraw z dodatkiem selenianu sodowego [13, 17].

2. METABOLIZM SELENU U BAKTERII I ROŚLIN

Selen w przyrodzie występuje zarówno w formie nieorganicznej, jak i organicznej (tab. 2). G łówną rolę w transformacji obu form odgrywają mikroorganizmy ucze­stniczące w obiegu selenu na Ziemi. W warunkach tlenowych, w wodzie oraz glebie, selen występuje głównie w formie selenianu (Se6+) i seleninu (Se +). Jedną z podstawowych reakcji przeprowadzanych przez liczne bakterie, m.in. Salmonella sp. i Veillonella sp., jest redukcja seleninu do selenu pierwiastkowego (Se°). Re­dukcję selenianu do seleninu mogą przeprowadzać bakterie redukujące siarczany

http://rcin.org.pl

306 H M. Ż B IK O W SK A

Tabela 2. Pow szechnie występujące nieorganiczne i organiczne związki selenu

W zó r chem iczny N azw a

S e0 2 dw u tlenek selenuH 2S e 0 3 kw as selenaw yFLSeOą kw as selenow yN a 2S e 0 3 selen in sodow yN a2S e0 4 selen ian sodow yG S -S e-S G selenod ig lu ta tionG S -S e-H g lu ta tiony lose leno lH 2Se se lenek w odoruC H 3Se-H m ety loseleno l(C H 3)2Se d im ety loselenek(C H 3)3Se+ jo n trim ety lose len iow y(C H 3)2SeO d im e ty loseleno tlenekH -S e-C H 2C H (N H 2)C O O H se len o cy ste in aC H 3-S e-C H 2-C H 2-C H -(N H 2)C O O H se lenom etion inaC O O H (N H 2)C H C H 2-S e -S e -C H 2C H (N H 2)C O O H selenocystynaN H 2-C H 2-C H 2-S e-S e-C H 2-C H 2-N H 2 se lenocystam inaC H 3-S e -C H 2-C H (N H 2)C O O H Se-m ety lo se len o cy ste in aH -S e-C H 2-C H 2-C H (N H 2)C O O H se lenohom ocysteinaC O O H -C H (N H 2)-C H 2-S e-C H 2-C H 2-C H (N H 2)C O O H se len o cy sta tio n in a

[27]. Dalsza redukcja Se0 do selenku (Se2’) zachodzi przypuszczalnie tylko drogą biosyntezy, prowadząc do powstawania selenoaminokwasów i selenobiałek.

Formą selenu najlepiej przyswajalną z gleby przez większość roślin jest selenian, w mniejszym stopniu również selenin. Istnieją rośl iny, które mają wyjątkową zdolność gromadzenia selenu (niektóre gatunki z rodzajów: Astragalus, Xylorrhiza, Oonopsis czy Stanleya). W takich roślinach, zwanych akumulatorami selenu, zawartość tego pierwiastka dochodzi ażdo 2-3 % suchej masy. Selen magazynowany jest w roślinach w formie aminokwasów, spośród których oprócz powszechnie występującej sele- nometioniny i selenocysteiny stwierdzono również obecność rzadkich aminokwasów, takich jak: Se-metyloselenocysteina, selenocystationina, selenocystyna i selenoho- mocysteina [56, 62] (tab. 2). Rośliny, które nie akumulują selenu (trawy, zboża), pobrany z gleby nieorganiczny selen metabolizują do selenometioniny - wolnej lub wbudowanej do białek. Biologiczna degradacja organicznych związków selenu prowadzi do różnych produktów końcowych, takich jak: Se0, selenki i metyloselenki. Lotny dimetyloselenek jest formą selenu najczęściej wydzielaną do atmosfery przez rośliny akumulujące selen oraz przez mikroflorę gleby [62].

3. METABOLIZM SELENU U SSAKÓW

Biologiczna aktywność selenu jako niezbędnego składnika pożywienia człowieka i zwierząt, a także jego działanie toksyczne i antynowotworowe zależą przede wszy­

http://rcin.org.pl

M ETA B O LIZM SE LE NU W K O M Ó R C E I O R G A N IZ M IE C Z Ł OW IE K A 307

stkim od sposobu metabolizowania tego pierwiastka w organizmie. Ze względu na chemiczne podobieństwo selenu i siarki wiele danych wskazuje, że metabolizm obu pierwiastków przebiega tym samym lub podobnym szlakiem. Mimo to przemiana selenu u ssaków nadal nie jest dostatecznie poznana. Hipotetyczny schemat tego procesu wg Sunde [56] oraz Spallholza [54] przedstawiono na rysunku 1. Zwierzęta, w przeciwieństwie do mikroorganizmów i roślin, nie potrafią syntetyzować sele- nometioniny (SeMet) bezpośrednio z nieorganicznego selenu. Selenocysteina (Se- Cys) może być syntetyzowana z SeMet, podobnie jak cysteina z metioniny [15] lub podczas syntezy selenobiałek z nieorganicznych form selenu [56]. Degradacja SeMet prawdopodobnie zachodzi, wspólnym dla metioniny szlakiem, na drodze transaminacji przy udziale enzymu podobnego do L-metionino-y-liazy (EC 4.4.1.11), opisanego przez Esaki i wsp. [15]. Selenocysteina jest metabolizowana innym niż cysteina szlakiem, przy udziale specyficznego enzymu, określonego przez Esaki i wsp. [16] jako selenocysteino-|3-liaza. Enzym ten rozkłada SeCys do alaniny i selenku wodoru. Jedynym dobrze poznanym szlakiem metabolizmu selenu u zwierząt jest stopniowa redukcja seleninu do selenku, a następnie jego metylacja [2, 54,

Rys. 1. Schem at m etabolizm u nieorganicznych i organicznych związków selenu u ssaków (wg Sunde [56]i Spallholza [54], zm odyfikowano)

http://rcin.org.pl

308 H. M Ż B IK O W SK A

56]. Niewiele wiadomo na temat konwersji selenianu do seleninu. M ożliwe, że w reakcji tej uczestniczą analogi adenozyno-5’-fosfosiarczanu (APS) i (lub) ade- nozyno-3’-fosfo-5’-fosfosiarczanu (PAPS) [56].

Pierwszym etapem na szlaku przemiany seleninu w komórce jest chemiczna (nieenzymatyczna) reakcja seleninu z glutationem (GSH) i utworzenie selenodi- glutationu (GS-Se-SG). Jedna cząsteczka seleninu reaguje z czterema cząsteczkami GSH. In vitro selenin może reagować również z innymi niskocząsteczkowymi tiolami (cysteina, merkaptoetanol) tworząc odpowiednie selenotrisulfidy, ale nie wiadomo jeszcze czy reakcja taka zachodzi także in vivo [21]. Przypuszczalnie interakcja seleninu z innymi tiolami mogłaby mieć znaczenie fizjologiczne w warunkach ob­niżonego poziomu GSH w komórce. Selenodiglutation, w obecności reduktazy glu- tationowej (GR), ulega dalszej przem ianie do glutationyloselenolu (GS-SeH). Sugeruje się, że w reakcji tej może brać udział również tioredoksyna (Trx), po­wszechnie występujący enzym o masie cząsteczkowej 12 kDa, wykazujący szeroką specyficzność substratową [4, 5, 35]. Tioredoksyna ssaków lub cały układ tiore- doksyna/reduktaza tioredoksyny (TR; EC 1.6.4.5) redukuje zarówno selenin, jak i GS-Se-SG do selenku (HSe~). Selenek wodoru jest wspólnym pośrednim m e­tabolitem powstającym w przemianie wszystkich form selenu w komórce i zależnie od zapotrzebowania na Se, może być wykorzystany do syntezy selenobiałek lub dalej metabolizowany w procesie metylacji. Metylacja selenku zachodzi stopniowo poprzez metyloselenol (CH3SeH) do dimetyloselenku (DMSe), lotnej formy Se wydalanej przez płuca i jonu trimetyloseleniowego (TM Se+), który jest wydalany z moczem. Uważa się, że metylowane formy selenu (DMSe oraz TM Se+), chara­kteryzujące się niewielką toksycznością, są produktami detoksykacji związków se­lenu w organizmie [23]. Metyloselenki nie są, jak początkowo sądzono, biologicznie nieaktywne. Goeger i Ganther [23] prowadząc badania na komórkach wątroby szczura wykazali, że metylotransferaza betaina.homocysteina (EC 2.1.1.5), lub enzym do niej podobny, przeprowadza demetylację TM Se+ do DMSe. Reakcja transmetylacji dla TM Se+ (reakcja 1) może przebiegać analogicznie jak dla betainy (reakcja 2):

(CH 3)3Se+ + homocysteina —> (CH 3 )2Se + metionina (1)(CH3)3N+CH2C O C r + homocysteina - » (CH3 )2HN+CH2C O C r + metionina (2)

Z kolei dimetyloselenek jest substratem dla mikrosomalnej monooksygenazy flawinowej (FMO), która utlenia go do dimetyloselenotlenku (DMSeO) [24]. Rola reakcji utleniania DMSe do DMSeO w biologicznej aktywności selenu jak dotąd jest niewyjaśniona. Możliwe, że odwracalne reakcje utleniania i metylacji są formą regulacji ilości wydalanego przez płuca dimetyloselenku.

http://rcin.org.pl

M E T A B O L IZ M SELENU W K O M Ó R C E I O R G A N IZ M IE C Z Ł O W IE K A 309

4. OCENA POZIOMU SELENU W ORGANIZMIE CZŁOWIEKA

Z powodu znacznych różnic w spożywaniu selenu, aby zapewnić niezbędną i jednocześnie bezpieczną ilość tego pierwiastka u ludzi, konieczne jest opracowanie sposobu monitorowania poziomu selenu w organizmie. Jak dotąd niedobór bądź nadmiar selenu w organizmie człowieka można stwierdzić jedynie metodami po­średnimi. Określa się stężenie selenu w płynach ustrojowych (osocze, krew) [30, 55, 64] i w dostępnych tkankach, np. we włosach i w paznokciach [22], lub poprzez oznaczanie aktywności peroksydazy glutationowej (GSH-Px) w osoczu i elementach morfotycznych krwi (erytrocyty, płytki) [37]. Ze względu na to, że całkowita ekspresja aktywności GSH-Px występuje już przy niewielkim spożyciu selenu, często znacznie niższym niż przeciętna dawka, w praktyce ta metoda nie zawsze może być wy­korzystana do oceny zawartości Se w organizmie. Przy wyższych dawkach spo­żywanego selenu aktywność enzymu nie odzwierciedla rzeczywistej ilości tego pierw iastka w ustroju. Bezpośrednie oznaczanie Se też nie daje powtarzalnych wy­ników, nawet w warunkach stałej diety selenowej. Badania ostatnich lat wykazały, że dobrym wskaźnikiem poziomu selenu u ludzi może być, obok aktywności GSH-Px, pom iar stężenia selenobiałka P w osoczu [28, 45]. N a^uw ag^zasługują również próby zastosowania izotopów selenu, głównie 74Se, 76Se i 7Se do oznaczania metabolizmu Se w organizmie [18, 60]. W odróżnieniu od radioaktywnego 7‘̂ Se, izotopy te nie emitują promieniowania i wobec tego nie są szkodliwe dla zdrowia. Prace z zastosowaniem izotopów selenu były prowadzone głównie przez badaczy amerykańskich [29, 44, 57]. Przy założeniu, że w organizmie są obecne dwie bio­chemicznie różne pule selenu - wymienialna i zmagazynowana, oznaczano ilość znakowanego selenu wydalanego z moczem i kałem w określonym czasie po podaniu znacznika ( rys. 2). W skład pierwszej puli metabolicznej (1) selenu wymienialnego (Se-EM P, ang. selenite-exchangeable metabolic pool) wchodzą wszystkie funkcjo­nalnie ważne związki selenu, pośrednie i końcowe, powstające w czasie jego prze­m iany. N atom iast pulę zm agazynowaną (2) stanowią białka zawierające sele nometioninę. Obliczona tą metodą ilość selenu obecnego w puli metabolicznej w określonym czasie była zależna od dawki spożytego selenu, a uzyskane wyniki porównywalne z poziomem selenu oznaczonym innymi metodami [29]. W yko­rzystanie tej metody na szerszą skalę wymaga jednak dalszych badań.

http://rcin.org.pl

310 H M. Ż B IK O W SK A

Rys. 2. Schem at m etabolizm u seleninu w organizm ie człowieka (wg Janghorbani i wsp. [29], zm odyfi­kowano): GSH-Px - peroksydaza glutationow a, Se-P - selenobiałko P, Se-W - selenobiałko W, G S-Se- SG - selenodiglutation, Se" —selenek, DM Se - dim etyloselenek, TM Se+ - jon trim etyloseleniowy,

S e -E M P - wym ienialna m etaboliczna pula selenu

LITERATURA

[1] B A L A N S K Y R M . C o m utagen ic and coclastogen ic effec ts o f se len ium in vitro and in vivo. M u ta tion R es 1991; 236: 2 3 1 -2 3 6 .

[2] B A L D E W GS, M O L JG J, D E K A N T E R FJJ, V A N B A A R B, D E G O E IJ JJM , V E R M E U L E N N P E . T he m echan ism o f in te rac tion betw een cisp la tin and selenite. B iochem P h arm aco l 1991; 41: 1 4 2 9 -1437 .

[3] B E C K E R DJ, R E U L B, O Z C E L IK A Y AT, B U C H E T JP, H E N Q U IN JC , B R IC H A R D SM . O ral se lena te im proves g lucose hom eostasis in partly reverses abnorm al ex p ression o f liver g ly co ly tic and g luco n eo g en ic enzym es in d iabetic rats. Dicihetologia 1996; 36: 3 -1 1 .

[4] B JO R N S T E D T M , X U E J, H U A N G W , A K E S S O N B, H O L M G R E N A. T he th io red o x in and g lu ta red o x in system s are e ffic ien t e lectron donors to hum an p lasm a g lu ta th ione peroxidase. ./ B io l C hem 1994; 269: 2 9 3 8 2 -2 9 3 8 4 .

[5] B JO R N S T E D T M , H A M B E R G M , K U M A R S, X U E J, H O L M G R E N A. H u m an th ioredoxin red uctase d irec tly reduces lipid h y droperox ides by N A D P H and selenocystine strongly stim u ­lates the reac tio n v ia ca ta ly tica lly gen era ted selenols. J B io l C hem 1995; 270: 1 1761-11764 .

[6] C L A R K L C , C A N T O R KP, A L L A W A Y W H. S elen ium in fo rage crops and can cer m ortality in U S coun ties. A rch E n viron H ealth 1991; 46: 3 7 -4 2 .

http://rcin.org.pl

M E T A B O L IZ M SE LE NU W K O M Ó R C E I O R G A N IZ M IE C Z Ł O W IE K A 311

[7] C O M B S G F, C O M B S SB. T he nutritional b iochem istry o f selenium . A nn R ev N u tr 1984; 4: 2 5 7 -2 8 0 .

[8] C O M B S Jr. G F, M E R C U R IO SD. Selen ium and ox idative injury, [w] A lan R. [red.] N utritional D iseases: R esearch D irections in C om para tive Pathob io logy . L iss Inc 1986: 3 4 7 -3 5 8 .

[9] C U V IN -A R A L A R M L A , FU R N E SS RW . M ercury and selen ium in teraction: A review , E co to x ico l E nvironm S a fety 1991; 21: 3 4 8 -3 6 4 .

[10] D H U R A, G A L A N P, H E R C B E R G S. R ela tionsh ip be tw een selen ium , im m unity and resistance against in fection . C om p B iochem P hysio l 1990; 96C: 2 7 1 -2 8 0 .

[11] D O U G H E R T Y JJ, H O E K S T R A W G . S tim ula tion o f lipid perox ida tion in vivo by in jected se len ite and lack o f stim u la tion by se lenate . P roc Soc E xp B io l M ed 1982; 169: 2 0 9 -2 1 5 .

[ 12] D O U IL L E T C, T A B IB A, B O S T M , A C C O M IN O T T IM , B O R S O N -C H A Z O T F, C IA V A T T I M . A selen ium supp lem en t assoc iated o r not w ith v itam in E delays early renal lesions in ex p erim en tal d iabe tes in rats. P roc Soc E xp B io l M e d 1996; 211: 3 2 3 -3 3 1 .

[13] E K H O L M P, Y L IN E N M , K O IV IS T O IN E N P, V A R O P. E ffects o f general soil fertilization w ith sod ium se lenate in F in land on the se len ium con ten t o f m eat and fish. J A g rica l F o o d C hem 1990; 38: 6 9 5 -6 9 8 .

[ 14] E L-B A Y O U M Y K. E valuation o f ch em opreven tive agen ts against b reast can cer and proposed s tra teg ies for fu ture c lin ical in te rven tion trials. C arcinogenesis 1994; 15: 2 3 9 5 -2 4 2 0 .

[15] E S A K I N, N A K A M U R A T, T A N A K A H, SU Z U K I T , M O R IN O Y, S O D A K. E nzym atic sy n thesis o f se lenocyste ine in rat liver. B iochem istry 1981; 20: 4 4 9 2 -4 4 9 6 .

[16] E S A K I N, N A K A M U R A T , T A N A K A H, SO D A K. S e lenocyste ine lyase, a novel enzym e th at spec ifica lly acts on se lenocysteine . J B io l C hem 1980; 257: 4 3 8 6 -4 3 9 1 .

[17] E U R O L A M, E K H O L M P, Y L IN E N M , K O IV IS T O IN E N P, V A R O P. E ffects o f se len ium fertiliza tio n on the selen ium conten t o f cereal gra ins, flour, and bread p ro duced in F in land. C ereal C hem 1990; 67: 3 3 4 -3 3 7 .

[18] F IN L E Y JW , V A N D E R P O O L R A , K O R Y N T A E. U se o f stable iso top ic se len ium as a tracer to fo llow in co rpora tion o f selenium into se lenopro teins. P roc S oc E xp B io l M ed 1995; 210: 2 7 0 -2 7 7 .

[19] F L O H E L, G U N Z L E R W A , S H O C K H H . G lu tath ione perox idase: A selenoenzym e. F E B S L e tte rs 1973; 32: 132-134 .

[20] FO X JM . Selenium : N utritional im p lica tions and p rospects for therapeu tic m edicine. M eth F in d E xp C lin P ha rm a co l 1992; 14: 7 5 -2 7 8 .

[21] F R E N K E L G D , F A L V E Y D, M A C V IC A R C. P roducts o f the reaction o f se len ite w ith in trace llu la r su lfhydry l com pounds. B io l Trace E lem R es 1991; 30: 9 -1 8 .

[22] G A R L A N D M , M O R R IS JS, S T A M P F E R M J, C O L D IT Z G A , S P A T E V L, B A S K E T T CK , R O S N E R B, SP E IZ E R FE, W IL L E T T W C , H U N T E R DJ. 1995. P rospec tive study o f toenail se len iu m levels and can cer am ong w om en. J. N atl. C ancer Inst., 87, 4 9 7 -5 0 5 .

[23] G O E G E R D E, G A N T H E R HE. H o m o cy stein e-d ep en d en t d em ethy la tion o f trim ethy lse leno- n ium ion and se lenobeta ine w ith m eth ion ine fo rm ation . A rch B iochem B iophys 1993; 302: 2 2 2 -2 2 7 .

[24] G O E G E R DE, G A N T H E R HE. O xidation o f d im eth y lselen id e to d im eth y lse len o x id e by m ic ro so m es from rat liver and lung and by flav in -con ta in ing m o n ooxygenase from pig liver. A rch B iochem B io p h ys 1994; 310: 4 4 8 -4 5 1 .

[25] G O Y E R R A . N u trition and m etal toxic ity . A m J C lin N u tr 1995; 61: 6 S -6 5 0 S .[26] G R O N B A E K H, T H O R L A C IU S -U S S IN G O. S elen ium com plexes in the an terio r p itu itary

o f rats ex posed to L -se lenom eth ion ine . V irchow s A rch iv B C ell P a tho l 1990; 59: 2 9 1 -2 9 6 .[27] H E ID E R J, B O C K A. S e len ium m etabo lism in m icro-organ ism s. A d v M icro b ia l P h ysio l 1993;

35: 7 1 -1 0 9 .[28] H IL L K E, X IA Y, A K E S S O N B, B O E G L IN M E , B U R K RF. S e lenopro te in P co n cen tra tio n

in p lasm a is an index o f se len ium sta tus in se len iu m -d efic ien t and se len iu m -su p p lem en ted C h in ese sub jects. J N u tr 1996; 126: 138-145 .

http://rcin.org.pl

312 H. M. Z B IK O W SK A

[29] JA N G H O R B A N I M. M A R T IN R F, K A SPE R LJ, SU N XF, Y O U N G V R . T he se len ite -e x ­ch an g eab le m etabo lic pool in hum ans: a new concep t for the assessm en t o f se len ium sta tus. A m J C lin N u tr 1990; 51: 6 7 0 -6 7 7 .

[30] K A N T AK , M O S E R -V E IL L O N PB, R E Y N O L D S RD. D ietary in takes and p lasm a c o n c e n ­trations o f zinc, copper, iron, m agnesium , and selen ium o f young, m iddle ages and o ld er m en. N u tr R es 1989; 9: 7 1 7 -7 2 4 .

[31] K IR E M ID JIA N -S C H U M A C H E R L , ST O T SK Y G. Selenium and im m une responses. E n viro n R es 1987; 42: 2 7 7 -3 0 3 .

[32] K O K FJ, H O FM A N A, W IT T E M A N JC M , D E B R U IJN A M , K R U Y S S E N D H C M , D E B R U IN M , V A L K E N B U R G HA. D ecreased se len ium levels in acute m yocard ia l in farc tion . J A m M e d A sso c 1989; 261: 1161-1164 .

[33] K O R P E L A H, K U M P U L A IN E N J, JU S S IL A E, K E M IL A S, K A A R IA IN E N M , K A A R IA I- N E N T, SO T A N IE M I EA. E ffec t o f se len ium supp lem en tation after acute m yocard ia l in fa rc ­tion. R es C om m un C hem P a tho l P harm aco l 1989: 65: 2 4 9 -2 5 2 .

[34] K R IS H N A N K, B R O D E U R J. T oxic in te rac tions am ong env ironm en ta l po llu tan ts: c o rro b o ­ra ting laborato ry o b servations w ith hum an experience. E nviron H ealth P ersp ec t 1994; 102: 11-17 .

[35] K U M A R S, B JO R N S T E D T M , H O L M G R E N A. Selenite is a substra te for c a lf th y m u s th io redox in reductase and th ioredoxin and e lic its a large n o n -sto ich iom etric o x id a tio n o f N A D P H in the p resence o f oxygen. E u r J B io ch em 1992; 207: 4 3 5 -4 3 9 .

[36] K V IC A L A J, Z A M R A Z IL V, SO U T O R O V A M , T O M IS K A F. C o rre la tio n s be tw een p a ra ­m eters o f body selen ium status and peripheral thyro id param eters in the low selen ium region. A n a ly s t 1995; 120: 9 5 9 -9 6 5 .

[37] L E V A N D E R OA , D E L O A C H DP, M O R R IS V C , M O SE R PB. P la te let g lu ta th io n e p e ro x i­dase activ ity as an index o f se len ium status in rats. J N u tr 1983; 113: 5 5 -6 3 .

[38] M C N E IL L JH , D E L G A T T Y H L M , B A T T E L L M L. Insu lin like effec ts o f sod ium se lena te in strep to zo cin -in d u ced d iabetic rats. D iabetes 1991; 40: 1675-1678 .

[39] N A K A D A IR A H, E N D O H K, Y A M A M O T O M, K A T O H K. D istribu tion o f se len ium and m olybdenum and can cer m orta lity in N iigata , Japan. A rch E nviron H ealth 1995; 50: 3 7 4 -3 8 0 .

[40] N ationa l R esearch C ouncil. 1980. R ecom m ended D ietary A llow ances. W ash in g to n , DC: N atl. A cad. Sci. 185 pp. 9th edition.

[41] O L A S B, W A C H O W IC Z B . Selen a cy to to k sy czn o sc c is-d iam m in o d ich lo ro p la ty n y . P o st H ig M ed D osw 1997; 51: 9 5 -1 0 8 .

[42] O L IV IE R I O, S T A N Z IA L A M , G IR E L L ID , T R E V IS A N M T, G U A R IN I P. T E R Z IM , C A F F I S, F O N T A N A F, C A S A R IL M , F E R R A R I S, C O R R O C H E R R. S elen ium status, fatty acids, v itam ins A and E, and aging: the N ove study. A m J Clin N u tr 1994; 60: 5 1 0 -5 1 7 .

[43] O rgan isation M ond ia le de la Sante (O M S) L es o ligoe lem en ts en nu trition hum aine. [w] R apport T echn ique de 10 .M .S., W H O [red] no 532, 1973, G eneve Sw itzerland .

[44] P A T T E R S O N BH , Z E C H LA . D evelopm ent o f a m odel for se len ite m etabo lism in hum ans. J N u tr 1992; 122: 7 0 9 -7 1 4 .

[45] PE R S S O N -M O S C H O S M , H U A N G W , SR IK U M A R TS, A K E S S O N B. L IN D E B E R G S. Selenopro te in P in serum as a b iochem ical m arker o f se len ium status. A n a ly s t 1995; 120: 8 3 3 -8 3 6 .

[46] R eco m m en d ed D ietary A llow ances 1989, W ash ing ton DC : N ational A cadem y Press. 10th ed ition .

[47] R O D E N M , P R S K A V E C M , F U R N S IN N C, E L M A D F A I, K O N IG J, S C H N E ID E R B, W A G N E R O, W A L D H A U S L W . M etabolic e ffect o f sod ium selenite: in su lin -like inh ib ition o f g lu cag o n -stim u lated g ly cogeno lysis in the iso lated perfused rat liver. Hepcitologv 1995; 22: 169-174 .

http://rcin.org.pl

M ETA B O LIZM SELENU W K O M Ó R C E I O R G A N IZ M IE C Z Ł O W IE K A 313

[48] R O T R U C K JT, PO PE AL, G A N T H E R HE, S W A N SO N A B, H A FE M A N D G , H O E K S T R A W G . Selenium : B iochem ical role as a com ponen t o f g lu ta th ione peroxidase . Science 1973; 179: 5 5 8 -5 9 0 .

[49] S A L V IN I S, H E N N E K E N S C H , M O R R IS JS, W IL L E T T W C, ST A M PF E R M J. 1995. P lasm a levels o f the an tiox idan t se len ium and risk o f m yocard ial in farc tion am ong U .S. physic ians. A m J C ard io l 1995; 76: 1218-1221 .

[50] SC H R A U Z E R G N , SA C H E R J. S elen ium in the m ain tenance and therapy o f H IV -infected patien ts . C hem -B io l In tera c t 1994; 91: 199-205 .

[51] SC H W A R Z K, F O L T Z CM . Selenium as an in tegral part o f facto r 3 against d ietary liver degeneration . J A m C hem Socie ty 1957; 79: 3 2 9 2 -3 2 9 3 .

[52] SH A M B E R G E R R. T he genotox icity o f selenium . M utation R es 1985; 154: 2 9 -4 8 .[53] S IW E K B, B A H B O U T H E, SE R R A M A , S A B B IO N IE , D E PA U W -G IL L E T M C , B A S SL E R

R. E ffec t o f se len ium com pounds on m urine B 16 m elanom a cells and p igm en ted c loned pB 16 cells. A rch Toxico l 1994; 68: 2 4 6 -2 5 4 .

[5 4 ]S P A L L H O L Z JE. On the nature o f se len ium tox ic ity and carc inosta tic activ ity . Free R a d B io l M e d 1994; 17: 4 5 -6 4 .

[55] S U A D IC A N I P, H E IN HO , G Y N T E L B E R G F. Serum selen ium co n cen tra tion and risk o f ischaem ic heart d isease in a p rospective cohort study o f 3000 m ales. A th ero sc lero sis 1992; 96: 3 3 -4 2 .

[56] SU N D E RA. M olecu lar b io logy o f se lenopro teins. A n n u R ev N u tr 1990; 10: 451 —474.[57] S W A N S O N C A , PA T T E R S O N B H , L E V A N D E R OA , V E IL L O N C, T A Y L O R PR, H EL-

Z L S O U E R K, M C A D A M P, Z E C H LA. H um an [74S e]se lenom eth ion ine m etabo lism : a k inetic m odel. A m J C lin N u tr 1991; 54: 9 1 7 -9 2 6 .

[58] T IR A N B, T IR A N A, P E T E K W , R O S SIP A L E, W A W S C H IN E K O. Selen ium sta tus o f healthy ch ild ren and adults in S tyria (A ustria). Trace E lem M ed 1992; 9: 7 5 -7 9 .

[59] T U R N E R RJ, F IN C H JM . Selen ium and the im m une response. Proc N u tr S oc 1991; 50: 2 7 5 -2 8 5 .

[60] V E IL L O N C, PA T T E R S O N KY , B U T T O N LN , S Y T K O W S K I AJ. S e len ium u tiliza tio n in h um ans - a long-term , se lf-labeling experim en t w ith stable iso topes. A m J Clin N u tr 1990; 52: 155-158 .

[61] V IN C E T I M , R O V E S T I S, G A B R IE L L I C, M A R C H E SI C, B E R G O M I , M A R T IN I M, V IV O L I G. C ancer m ortality in residen tial cohort exposed to env ironm en ta l se len ium th rough d rin k in g w ater. J C lin E p id em io l 1995; 48: 1091-1097 .

[6 2 ]W A C H O W IC Z B. Selen w roślinach. W iadom ości B otan iczne 1993; 37: 8 7 -8 9 .[63 ]W O O D RJ, SU T E R PM , R U S SE L L RM . M ineral requ irem ents o f e lderly people. A m J C lin

N u tr 1995; 62: 4 9 3 -5 0 5 .[6 4 ]Z A C H A R A B A , W Ą S O W IC Z W , G R O M A D Z IŃ S K A J, SK Ł O D O W S K A M , K R A SO M SK I

G. G lu tath ione perox idase activ ity , se lenium , and lipid perox ide co n cen tra tions in b lood from a healthy Polish population . B io l Trace E lem R es 1986; 10: 175-187 .

Redaktor prow adzący - M aria Olszewska

O trzym ano: 0 5 .0 3 .1 9 9 7 r.P rzyjęto : 0 2 .0 4 .1 9 9 7 r.A d re s au tora : In sty tu t B iochem ii UŁ9 0 -2 3 7 Łódź, ul. B anacha 12/16

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

PO STĘPY BIOLOGII KOM ÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (315-324)

ANTYKARCYNOGENNE DZIAŁANIE SELENU

C A R C IN O S T A T IC A C T IV IT Y O F S E L E N IU M

Halina Małgorzata ŻBIKOW SKA

Katedra Biochemii Ogólnej, Instytut Biochemii UL, Łódź

Streszczenie: Toksyczne właściwości selenu były znane dużo wcześniej, zanim w 1957 roku wykazano, że jest on pierw iastkiem niezbędnym do życia zwierząt. Typowym objaw em zatrucia obserwow anym u zw ierząt hodowlanych, spożywających rośliny rosnące na obszarach o dużej zawartości selenu w glebie, jes t choroba alkaliczna i ślepa kołowacizna. Znacznym postępem w wyjaśnieniu m echanizmu toksycz­nego działania selenu na kom órki i organizm było odkrycie, że reakcji utleniania glutationu przez selenin tow arzyszy powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego. Badania przeprowadzone na zwierzętach w ykazały, że selen w wysokich dawkach wykazuje działanie antynow otw orowe. Badania epidem iolo­giczne także wskazują na częstsze występowanie chorób nowotworow ych w populacjach zam ieszkują­cych obszary o niskiej zawartości selenu w glebie. W pracy zebrano najnow sze dane na tem at toksycznego działania selenu na organizm oraz m echanizmu cytotoksyczności i aktywności karcynosta- tycznej nieorganicznych i organicznych związków selenu.

Słowa kluczowe: związki selenu, anionorodnik ponadtlenkowy, toksyczność, ham ow anie karcynogene-zy

Summary: Selenium toxicity was known many years before its essentiality for anim als was established in 1957. Selenium toxicity in livestock invoked by ingestion o f plants growing in soils that contained high levels of selenium is m anifested in alkali disease and blind staggers. The observation that oxidation o f glutathione by selenite produces superoxide anion m ade a big progress in explaining the m echanism of selenium toxicity in cells and organisms. On the other hand it was shown that high doses o f selenium have protective action against cancer in a wide variety o f animal models. Human epidem iological studies also indicate a higher incidence o f cancer in geographical areas poor in selenium. The present paper describes inform ation from the current literature on selenium toxicology and cytotoxicity as well as carcinostatic activity of inorganic and organic selenium compounds.

Key words: selenium com pounds, superoxide anion, toxicity, carcinostasis

W ykaz stosow anych skrótów: B SC - selenocyjanian benzylu, G SH - glutation, G S-Se-SG - selenodi- glutation, O 2— anionorodnik ponadtlenkowy, P G E 2 - prostaglandyna, R -SeH - selenol, R -Se-R - selenoeter, R S-Se-SR - selenotrisulfid, SeC ys - selenocysteina, SeM et - selenom etionina, T P S eC l - chlorek trifenyloseleniow y, p - X S C - l,4-fenyleno-bis-(m etyleno)selenocyjanian

http://rcin.org.pl

316 H. M. Ż B IK O W SK A

1. WSTĘP

Selen jest mikroelementem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania or­ganizmów żywych, ale podawany w stężeniach powyżej 600 pg/dobę - dawce nieznacznie przekraczającej dzienne zapotrzebowanie organizmu (50-200 pg) jest jednym z najbardziej toksycznych pierwiastków. Toksyczne właściwości selenu były znane dużo wcześniej, zanim w 1957 roku po raz pierwszy wykazano, że jest niezbędny w żywieniu zwierząt. Ostre zatrucia selenem objawiają się nagłą dusznością, częstoskurczem, biegunką, krańcowym wyczerpaniem, a nawet śmiercią [39]. Już w latach trzydziestych naszego stulecia wykazano, że niektóre regionalne choroby zwierząt hodowlanych są następstwem zatruć selenem w wyniku spożycia przez nie paszy o wysokiej zawartości tego pierwiastka. Typowym objawem zatrucia jest choroba alkaliczna i ślepa kołowacizna (ang. alkali disease i blind staggers). Zwierzęta tracą też sierść, następują deformacje i gubienie racic oraz zmiany w głównych narządach wewnętrznych. Zatrucie selenem u ludzi zdarza się raczej rzadko, chociaż w pewnym regionie Chin w latach 1961 -1964 zanotowano przypadki ostrego zatrucia i śmierci ponad stu osób na skutek spożywania artykułów żyw­nościowych wyprodukowanych na glebie z bardzo wysoką zawartością selenu. Dzien­ne spożycie selenu na tym obszarze dochodziło do 5 mg [42]. W niektórych gałęziach przemysłu np. elektronicznym, fotograficznym, przy produkcji kolorowego szkła pracownicy są zawodowo narażeni na działanie związków selenu [7]. Coraz większe zanieczyszczenie środowiska prowadzi również do wzrostu stężenia selenu przede wszystkim w glebie i wodzie. Bioakumulacja selenu poprzez łańcuch pokarmowy jest szczególnie niebezpieczna w ekosystemach wodnych [36]. Z drugiej strony dająca się zauważyć w ostatnim dziesięcioleciu moda na wzbogacanie żywności w selen na terenach o niskiej jego zawartości oraz profilaktyczne i lecznicze sto­sowanie selenu, stwarzają niebezpieczeństwo przedawkowania.

2. MECHANIZM TOKSYCZNOŚCI SELENU

Toksyczność selenu od lat budzi kontrowersje. Przyczyny, jak i mechanizm to­ksycznego działania związków selenu na komórkę, a tym samym na organizm nie są do końca poznane. Wiadomo, że wrażliwość poszczególnych organizmów na toksyczne działanie selenu znacznie się różni. Ilość i chemiczna forma spo­żywanego selenu wpływa na jego poziom we krwi, jak również na sposób wiązania z białkami poszczególnych tkanek [3,4]. Już w latach czterdziestych zwrócono uwagę na interakcję seleninu z tiolami. Bliższe badania na ten tem at prowadził później m.in. Ganther [10], który toksyczność selenu przypisywał reakcji z grupami

http://rcin.org.pl

A N T Y K A R C Y N O G E N N E DZIAŁ A N IE SELENU 317

-SH białek i tworzeniu selenotrisulfidów (RS-Se-SR) analogicznie do selenodi- glutationu (GS-Se-SG) wg reakcji:

4 GSH + H 2S e 0 3 —> GS-Se-SG + GSSG + 3 H20Znacznym postępem w wyjaśnieniu mechanizmu toksycznego działania selenu

było odkrycie przez Seko i wsp. [29] faktu, że reakcji seleninu z GSH towarzyszy tworzenie anionorodnika ponadtlenkowego (rys. 1).

Rys. 1. Pow staw anie anionorodnika ponadtlenkowego w reakcji seleninu z glutationem(wg Seko i wsp. [30])

Dalsze badania wykazały, że w reakcję ze zredukowanym glutationem (a także innymi niskocząsteczkowymi tiolami), której towarzyszy generowanie anionorodnika ponadtlenkowego, wchodzą również: dwutlenek selenu, selenocystyna, selenocy- stamina. Natom iast związki, takie jak selenian i selenometionina, nie reagują z GSH. Chociaż dane dotyczące toksyczności poszczególnych selenozwiązków są kontrowersyjne, znaczenie interakcji z tiolami i tworzenie rodników w mechanizmie toksyczności selenu wydają się niezaprzeczalne [17, 29, 32, 33, 41]. Według Spal- lholza [33] toksyczność wykazują selenin i dwutlenek selenu, tworzące z tiolami selenotrisulfidy. Toksyczne są również diselenidy, takie jak selenocystyna i sele- nocystamina, które z kolei w obecności związków tiolowych ulegają redukcji do selenoli (RSeH). Selenian i związki typu selenoeterów (R-Se-R) nie reagują z GSH i nie tworzą rodników, dlatego in vitro nie są toksyczne. W warunkach in vivo natom iast ich toksyczność jest prawie taka sama jak seleninu, gdyż najprawdopo­dobniej są redukowane odpowiednio do seleninu albo selenoli i wchodzą we wspólny szlak m etabolizmu selenu, prowadzący ostatecznie do selenku.

3. AKTYWNOŚĆ ANTYNOWOTWOROWA SELENU

Badania ostatnich lat wykazują, że toksyczność selenozwiązków jest bezpośrednio związana z anty nowotworową aktywnością selenu [33]. Podawanie selenu zwie­rzętom doświadczalnym hamuje nowotwory m.in.: sutka, trzustki, wątroby, okręż- nicy, płuc oraz skóry [27]. Udowodniono, że selen w różnych formach hamuje wzrost wielu typów komórek nowotworowych, indukowanych bądź transplanto-

http://rcin.org.pl

318 H .M . ŻB IK O W SK A

TABELA 1. Cytotoksyczność selenodiglutationu w anych zarów no in vitro, ja k i in vivo______________ 1,1 vitro__________________ [2, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 23, 26]. Cyto-Typ komórek nowotworowych toksyczność związków selenu jest zróż-Rak płuc nicowana. Najbardziej cytotoksycznyG ruczolakorak sutka okazał się selenodiglutation, związekG ruczolakorak okrężnicy pośredni powstający w komórce w wy-Czerniak njku reakcji seleninu z GSH. W tabeliS’l,ejak , 1 zestaw iono typy kom órek now otw o-R dzeniak JtrJ-------------------------------------------------------------- row ych, których w zrost był ham ow any

przez GSSeSG. Podobną cytotoksycz- nością in vitro (komórki guza Ehrlicha, komórki leukemiczne L I210 myszy) cha­rakteryzował się selenin, nieco mniejszą selenocystyna i selenian. Najm niejszą cyto­toksyczność wykazywały metyloselenki i selenometionina [33]. Ogrom na ilość przeprowadzonych badań na różnych komórkach i z zastosowanim różnych metod oceny cytotoksyczności sprawia, że uzyskane wyniki są kontrowersyjne. Ip i White [16] na przykład nie stwierdzili żadnych różnic w antykarcynogennej aktywności badanych nieorganicznych (selenian, selenin, dwutlenek selenu) i organicznych (Se- Met, SeCys) selenozwiązków. Słabsze, w porównaniu z seleninem, działanie sele- nometioniny, obserwowane przez większość badaczy można tłumaczyć niespe­cyficznym włączaniem tego aminokwasu do białek. W ten sposób SeMet wchodziłaby w pulę selenu metabolicznie nieaktywną [12, 13]. Potwierdzeniem tej hipotezy może być obserwacja, że u zwierząt doświadczalnych karmionych SeMet większość selenu w tkankach (szczególnie w mięśniach szkieletowych) jest zmagazynowana w postaci tego aminokwasu [3]. Jest jeszcze inne możliwe wytłumaczenie mniejszej aktywności SeMet. U zwierząt karmionych seleninem obserwowano podwyższenie poziomu glutationu, podczas gdy podawanie selenu w formie SeMet nie powodowało żadnych zakłóceń w metabolizmie tego związku. Przypuszczalnie zmiany powo­dowane seleninem mogą być wynikiem odpowiedzi adaptacyjnej organizmu [12, 37].

Wrażliwość poszczególnych komórek nowotworowych na toksyczne działanie związków selenu również nie jest jednakowa. Może to być spowodowane różną ich zdolnością do detoksykacji selenu [18].

Wykazano, że selen hamuje zarówno fazę inicjacji karcynogenezy, jak i rozwój nowotworu, jednak przy obecnym stanie wiedzy trudno wyjaśnić, na czym polega ta zdolność selenu. Istnieją przypuszczenia, że selen może działać przez blokowanie syntezy DNA w komórkach nowotworowych, wzmożenie komórkowej odpowiedzi immunologicznej lub przez hamowanie peroksydacji lipidów, usuwanie nadtlenków i wolnych rodników [8, 22]. Jednym z możliwych wyjaśnień jest też udział sele- nozależnej-GSH-Px. Prostaglandyny, których produkcja znacznie wzrasta w guzach złośliwych, są jednym z regulatorów wzrostu guzów nowotworowych. Okazało się, że niektóre selenozwiązki, np. 1,4-fenyleno-bis-(metyleno)selenocyjanian (p-

http://rcin.org.pl

A N T Y K A R C Y N O G E N N E D ZIAŁ ANIE SELENU 319

XSC) powodują wzrost aktywności selenozależnej-GSH-Px w komórkach indu­kowanego chemicznie raka śluzówki okrężnicy przy jednoczesnym obniżeniu po­ziomu PGEt [26].

Chociaż dokładny mechanizm cytotoksyczności selenu nie jest znany, kluczową rolę w tym procesie, tak jak i w toksycznym jego działaniu na organizm, może odgrywać interakcja związków selenu z GSH. Wykazano, że glutation wzmaga cytotoksyczne działanie seleninu [5, 18]. Bezpośrednio za antynowotworowe wła­ściwości selenu byłyby więc odpowiedzialne metabolity powstające w reakcjach selenozwiązków z GSH, takie jak selenodiglutation [32] lub aktywne formy tlenu [17, 33, 41]. Alternatywną do wolnorodnikowej hipotezy jest także możliwość, że inhibitorowa aktywność selenu pochodzi od związków powstających w czasie jego metylacji. Najbardziej prawdopodobnym związkiem wydaje się być metylo- selenol [11]. Interesujący jest fakt, że związki selenu, które są w pierwszym rzędzie m etabolizowane do metyloselenolu (metyloselenocyjanian, Se-metyloselenocystei- na) powodują jedynie hamowanie wzrostu komórek nowotworowych, a nie działają na ich DNA. W przeciwieństwie do nich związki podlegające redukcji do selenku wodoru (selenin i selenek sodowy) nie tylko hamują wzrost komórek, ale również indukują pęknięcia nici DNA [21]. Wyniki tych badań wskazują na zależność antynowotworowej aktywności związków selenu od drogi metabolizmu, jakiej pod­legają w komórce. Ciekawą hipotezę apoptotycznej odpowiedzi indukowanej przez selenin postawił Lu i wsp. [20]. Traktowanie komórek leukemicznych myszy L1210 seleninem powodowało pęknięcia nici DNA oraz aktywację nukleaz, co w kon­sekwencji prowadziło do fragmentacji DNA i śmierci komórki. Apoptotyczną odpowiedź na działanie seleninu, a także syntetycznego związku selenu p-XSC potwierdzili również Thompson i wsp. badając cytotoksyczną aktywność tych związ­ków w komórkach raka sutka [38].

4. EBSELEN I JEGO ANALOGI - NOWA GENERACJA ZWIĄZKÓW SELENU O AKTYWNOŚCI CYTOSTATYCZNEJ

Charakterystyczną cechą wszystkich naturalnie występujących organicznych i nieorganicznych związków selenu jest ich duża toksyczność, dlatego jest bardziej prawdopodobne, że w przyszłości kliniczne zastosowanie będą miały organiczne selenozwiązki otrzymywane syntetycznie. Pierwszym takim związkiem był zsyn- tetyzowany w 1984 roku ebselen, początkowo określany symbolem PZ 51 [40]. W latach dziewięćdziesiątych opatentowano szereg jego analogów [1, 8, 9, 22, 26,27]. Na rysunku 2 przedstawiono wzory znanych syntetycznych selenozwiązków o udokumentowanej aktywności cytostatycznej, których nazwy pojawiają się w tekście. Działanie syntetycznych form selenu porównuje się na ogół z działaniem

http://rcin.org.pl

320 H. M. Ż B IK O W SK A

Selenocyjanian benzylu (BSC)

1,4-fenylo-bis-(metyleno)selenocyjanian (p-ksyleno-bis-selenocyjanian)

(p-XSC)

chlorek trifenyloseleniowy (TPSeCI)

Selenocyjanian metylu Selenobetaina

Rys. 2. Syntetyczne selenoorganiczne związki o aktywnos'ci cytostatycznej

seleninu, który jest traktowany jako związek modelowy o najlepiej poznanych wła­ściwościach i metabolizmie.

Ebselen jest selenoorganicznym związkiem posiadającym bezpośrednie działanie antyoksydacyjne oraz aktywność peroksydazy glutationowej rozkładającej różno­

ebselen (PZ 51)

CHoSeCN (CH3)2Se+CH2-C O C r

http://rcin.org.pl

A N T Y K A R C Y N O G E N N E D Z IAŁ A N IE SELENU 321

rodne nadtlenki, w tym nadtlenki fosfolipidów i cholesterolu [6, 24]. W ykazuje właściwości przeciwzapalne [31], a także działa jako inhibitor 5-lipooksygenazy[28]. W licznych badaniach in vitro oraz in vivo wykazano ochronną rolę ebselenu m.in. przed toksycznym działaniem adriamycyny [25], paracetamolu [19] czy przed wrzodami żołądka u szczurów, indukowanymi różnymi czynnikami [34, 35]. Ebselen wywiera również efekt cytotoksyczny, hamuje proliferację komórek, replikację DNA i syntezę białek. Interesujące jest, że analogi zawierające siarkę zamiast selenu nie wykazują takich właściwości. Badano metabolizm ebselenu u zwierząt i człowieka [30, 31]. Wykrywane metabolity sugerują, że związek ten po otworzeniu pierścienia zawierającego selen (rozerwanie wiązania Se-N w obecności tioli) ulega biotrans- formacji prowadzącej do utworzenia metylowych lub glukuronidowych pochodnych. Dominującym metabolitem stwierdzonym w osoczu i moczu u człowieka i świni był selenoglukuronid. M inimalna toksyczność ebselenu, w porównaniu z toksy­cznością naturalnie występujących związków selenu, prawdopodobnie wynika właś­nie z odmiennego sposobu metabolizowania tego związku w organizmie. Selen zawarty w ebselenie nie jest uwalniany w formie selenu pierwiastkowego i nie wchodzi w całkowitą pulę selenu. Przypuszczalnie metabolizm innych syntetycznych, selenoorganicznych związków przebiega podobnie, bez uwolnienia Se°, co znacznie zm niejsza ich toksyczność. We wszystkich tych związkach Se jest połączony co najmniej z jednym pierścieniem benzenu (BSC, p-XSC, TPSeCl) lub mającymi również charakter hydrofobowy grupami (grupą) metylowymi (metyloselenocyja- nian, selenobetaina) (rys. 2).

Najm niejszą toksycznością charakteryzuje się najnowszy z generacji związków syntetycznych - chlorek trifenyloseleniowy (TPSeCl) [22]. W ykazano, że TPSeCl wywiera działanie cytostatyczne nie wywołując jednocześnie uszkodzenia błon ko­mórkowych czy nici DNA. Nie powoduje też akumulacji selenu w tkankach i wy­kazuje największy margines bezpieczeństwa spośród wszystkich badanych dotąd związków selenu. Ponadto stwierdzono jego związek z metabolizmem energetycznym komórki. TPSeCl powodował zwiększenie zużycia glukozy i tworzenia mleczanu. Jak dotąd nie wyjaśniono, czy ma to jakiś wpływ na cytotoksyczną aktywność badanego związku.

5. PODSUMOWANIE

Badania epidemiologiczne oraz badania przeprowadzone na zwierzętach wy­kazały, że selen posiada właściwości antynowotworowe. Naturalnie występujące nieorganiczne związki selenu oraz selenoaminokwasy hamują karcynogenezę, ale są toksyczne dla komórek i zwierząt. Jakkolwiek przyczyny toksyczności selenu nie są do końca poznane, przypuszczalnie ten sam mechanizm jest odpowiedzialny

http://rcin.org.pl

322 H. M. Z B IK O W SK A

za toksyczne, jak i antynowotworowe działanie związków selenu. Sugeruje się, że w tym procesie biorą udział aktywne formy tlenu powstające w reakcji utleniania glutationu w obecności seleninu. Opracowanie szeregu syntetycznych selenoorgani- cznych związków stwarza nowe możliwości wykorzystania selenu w terapii no­wotworów oraz schorzeń o podłożu zapalnym.

LITERATURA

[1] A N D R E A D O U I, V A N D E W A T E R B, C O M M A N D E U R JN M , N A G E L K E R K E FJ, V E R M E U L E N N PE. C o m p ara tiv e cy to tox icity o f 14 novel se lenocyste ine S e-co n ju g a te s in rat renal prox im al tu bu lar cells. T oxico l A p p l P harm aco l 1996; 141: 2 7 8 -2 8 7 .

[2] A N D R Z E JA K R, G O C H JH , JU R G A M. R o la selenu w patofizjo log ii cz ło w iek a . P ost H ig M e d D o św 1996; 50: 2 9 3 -3 0 7 .

[3] B E H N E D , K Y R IA K O P O U L U S A, SC H EID S, G E SS N E R H. E ffects o f ch em ica l form and d osage on the in co rpora tion o f se len ium into tissue p ro teins in rats. J N u tr 1991; 121: 8 0 6 -8 1 4 .

[4] B E H N E D, W E IS S -N O W A K C, K A L C K L O S C H M , W E S T P H A U C , G E S S N E R H. K Y R IA - K O PO U L O S A. S tud ies on the d istribu tion and characteris tics o f new m am m alian se len ium - co n ta in in g proteins. A n a ly s t 1995; 120: 8 2 3 -8 2 5 .

[5] C A F F R E Y PB , F R E N K E L GD. Selenite cy to tox icity in drug resistan t and no n resis tan t hum an ovarian tu m o r cells. C a n cer R es 1992; 5 2 :4 8 1 2 -4 8 1 6 .

[6] C H R IS T IS O N J, SIES H, S T O C K E R R. H um an blood cells support the reduction o f low -density -lip o p ro te in -asso c ia ted cho lestery l e ster hydroperox ides by a lb u m in -b o n d ebselen . B iochem J 1994; 304: 3 4 1 -3 4 5 .

[7] D A N IE L S S O N B R G , D A N IE L S O N M , K H A Y A T A., W ID E M. C o m p ara tiv e em b ryo tox i- city o f se len ite and selenate: up take in m urine em bryonal and fetal tissues and e ffec ts on b lastocysts and em bryon ic cells in vitro. Toxico logy 1990; 63: 123-136.

[81 E L -B A Y O U M Y K. E valuation o f chem opreven tive agents against breast c an c e r and p roposed stra teg ies fo r fu ture c lin ical in te rven tion trials. C arcinogenesis 1994; 15: 2 3 9 5 -2 4 2 0 .

[9] E L -B A Y O U M Y K, U P A D H Y A Y A P, C H A E Y-H , SO H N O-S, R A O C V , F IA L A E, R E D D Y BS. C h em o p rev en tio n o f can cer by o rganoselen ium com pounds. J C ell B io ch em 1995; 22: 9 2 -1 0 0 .

[10] G A N T H E R HE. Se lenotrisu lfides. Form ation by reaction o f th io ls w ith se len io u s acid. B io ch em is try 1968; 7: 2 8 9 8 -2 9 0 5 .

[11] IP C, G A N T H E R HE. A ctiv ity o f m ethy lated form s o f se len ium in can cer p rev en tion . C ancer R es 1990; 50: 1206-1211 .

[ 12] IP C, L IS K DJ. B ioactiv ity o f se len ium from B razil n u t fo r cancer p reven tion and se lenoenzym e m ain tenance . N a tu r C ancer 1994; 21: 2 0 3 -2 1 2 .

[ 13] IP C, L ISK DJ. C h arac te riza tio n o f tissue p rofiles and anti carc inogen ic re sp o n ses in rats fed natural sou rces o f se len ium -rich products. C arcinogenesis 1994; 15: 5 7 3 -5 7 6 .

[14] IP C, L ISK DJ. E n rich m en t o f se len ium in allium vegetab les for cancer p rev en tion . C a rcino­g en esis 1994; 15: 1881-1885 .

[15] IP C, L ISK DJ. E fficacy o f can cer p reven tion by h igh-se len ium garlic is p rim arily dependen t on the action o f se len ium . C arcinogenesis 1995; 16: 2 6 4 9 -2 6 5 2 .

[1 6 ]IP C , W H IT E G. M am m ary cancer chem opreven tion by inorgan ic and o rgan ic se len ium : single agent trea tm en t o r in com bination w ith v itam in E and their effects on in vitro im m u n e functions. C a rc in o g en esis 1987; 8: 1763-1766 .

http://rcin.org.pl

A N T Y K A R C Y N O G E N N E DZIAŁ A N IE SELENU 323

[17] K IT A H A R A J, SE K O Y, IM U R A N. Possib le in vo lvm en t o f active oxygen species in se len ite toxicity in iso la ted rat hepatocy tes. A rch Toxicol 1993; 67: 4 9 7 -5 0 1 .

[18] K U C H A N M J, M IL N E R JA . In fluence o f in trace llu la r g lu ta th ione on se len ite-m ed ia ted grow th in h ib itio n o f can ine m am m ary tum or cells. C ancer R es 1992; 52: 1 091-1095 .

[19] LI Q -J, B E S S E M S JG M , C O M M A N D E U R JN M , A D A M S B, V E R M E U L E N N PE. M ech a­nism o f p ro tec tio n o f ebselen against paracetam ol-induced toxicity in rat hepatocy tes. B iochem P h a rm a co l 1994; 48; 1631-1640 .

[20] LU J, K A E C K M , JIA N G C, W IL S O N AC, T H O M P S O N HJ. Selen ite induction o f D N A strand b reaks and apoptosis in m ouse leukem ic L I 210 cells. B iochem P harm aco l 1994; 47: 1531-1535 .

[21] L U J, JIA N G C. K A E C K M, G A N T H E R H, V A D H A N A V IK IT S, IP C, T H O M P S O N H. D issocia tion o f the genotox ic and grow th inhib itory e ffects o f se len ium . B iochem P harm aco l 1995; 50: 2 1 3 -2 1 9 .

[22] LU J, JIA N G C, K A E C K M, G A N T H E R H, IP C, T H O M P S O N H. C e llu lar and m etabo lic e ffects o f tr ip h en y lsc len o n iu m ch lo ride in a m am m ary cell cu ltu re m odel. C a rcinogenesis 1995; 16: 5 1 3 -5 1 7 .

[23] N A N O JL , F R A N C O IS E, R A M P A L P. In vivo and in vitro study o f the role o f se len ium in co lon carc in o g en esis , [w]: C ollery P, Po irier LA, M anfait M, E tienne JC [red.] M etal Ions in B io logy and M ed icine. Paris: John L ibbey E uro tex t 1990: 4 9 3 -4 9 6 .

[24] N O G U C H I N , Y O S H ID A Y, K A N E D A H, Y A M A M O T O Y, N IK I E. A ction o f ebselen as an an tio x id an t ag ainst lipid peroxidation . B iochem P harm aco l 1992; 44: 3 9 -4 4 .

[25] P R IT S O S C A , S O K O L O F F M , G U S T A F S O N DL. PZ-51 (E bse len) IN V IV O pro tection against A d riam y c in -in d u ced m ouse card iac and hepatic lipid pe rox ida tion and toxicity . B iochem P h a rm a co l 1992; 44: 8 3 9 -8 4 1 .

[26] R E D D Y B S. R IV E N S O N A. K U L K A R N I N. U P A D H Y A Y A P. E L -B A Y O U M Y K. C he- m o p rev en tio n o f co lon carc inogenesis by the syn thetic o rganoselen ium com pound 1,4 ,-pheny- leneb is(m eth y len e)se len o cy an ate . C a n cer R es 1992; 52: 5 6 3 5 -5 6 4 0 .

[27] R O N A I Z, T IL L O T S O N JK . T R A G A N O S F, D A R Z Y N K IE W IC Z Z, C O N A W A Y CC, U P A D H Y A Y A P, E L -B A Y O U M Y K. E ffects o f o rgan ic and inorgan ic se len ium com pounds on rat m am m ary tu m o r cells. In t J C ancer 1995; 63: 4 28—434.

[28] S C H E W E C. S C H E W E T, W E N D E L A. S trong inh ib ition o f m am m alian lipoxygenases by the an tiin flam m ato ry se leno-o rgan ic com pound ebselen in the absence o f g lu ta th ione . B iochem P h a rm a co l 1994; 48 : 6 5 -7 4 .

[29] SE K O Y, S A IT O Y, K IT A H A R A J, IM U R A N. A ctive oxygen genera tion by the reac tion o f se len ite w ith reduced g lu ta th ione in vitro, [w]: W endel A. [red.] Selen ium in B iology and M ed icine. Springer, B erlin , H eidelberg N ew Y ork 1989: 7 0 -7 3 .

[30] SIE S H. E b se len , a se lcnoorgan ic com pound as g lu ta th ione perox idase m im ic. F ree R a d B io l M ed 1993; 14: 3 1 3 -3 2 3 .

[31] SIES H. E bse len : a g lu ta th ione perox idase m im ic. M eth E n zym o l 1994; 234: 476^182 .[32] S IW E K B, B A H B O U T H E, SE R R A M A . SA B B IO N I E, D E P A U W -G IL L E T M C, B A S-

SL E R R. E ffec t o f se len ium com pounds on m urine B 16 m elanom a cells and p igm en ted cloned pB 16 cells. A rch Toxico l 1994; 68: 2 4 6 -2 5 4 .

[331 S P A L L H O L Z JE . On the nature o f se len ium toxic ity and carc inosta tic activ ity . F ree R a d B io l M ed 1994; 17: 4 5 -6 4 .

[34] T A B U C H I Y, K U R E B A Y A S H I Y. A n tisecre to ry and an tiu lcer effec ts o f ebse len , a se leno- o rgan ic co m p o u n d , in rats. Japan J P harm aco l 1993; 61: 2 5 5 -2 5 7 .

[35] T A B U C H I Y, S U G IY A M A N, H O R IU C H I T, F U R U S A W A M , FU R U H A M A K. E bselen , a se len o -o rg an ic co m pound , p ro tec ts against e th ano l-induced m urine gastric m ucosal in ju ry in both in v ivo and in vitro system s. E a r J P ha rm a co l 1995; 272: 195-201 .

http://rcin.org.pl

324 H M. Ż B IK O W SK A

[36] T A L L A N D IN I L, C E C C H I R, D E B O N I S, G A L A S S IN I S, G H E R M A N D I G, G IA L A N E L - L A G, L IU N , M O R O R, T U R C H E T T O M , Z H A N G Y. T oxic levels o f se len ium in enzym es and selen ium up take in tissues o f m arine fish. B io l Trace E lem R es 1996; 51: 9 7 -1 0 6 .

[37] T H O M P S O N HJ, Ip C. T em poral changes in tissue g lu ta th ione response to ch em ica l form , d ose and dura tion o f se len ium treatm ent. B io l Trace E lem R es 1991; 30: 163-173 .

[38] T H O M P S O N HJ, W IL S O N A, L U J, S IN G H M , JIA N G C, U P A D H Y A Y A P, E L -B A Y O U - M Y K, IP C. C om parison o t the e ffects o f an o rgan ic and inorgan ic form o f se len ium on a m am m ary carc inom a cell line. C arcinogenesis 1994; 15: 183-186 .

[39] V A N V L E E T JF, FE R R A N S VJ. C om para tive pa tho logy o f se len ium and v itam in E defic iency and excess, [w j: A lan R, [red.] N u tritional D iseases: R esearch D irections in C o m para tive P a thobio logy . L iss, Inc 1986: 3 5 9 -3 9 6 .

[40] W E N D E L A, F A U S E L M , S A FA Y H I H, T IE G S G, O T T E R R. A novel b io log ically active se len o -o rg an ic com pound-II. A ctiv ity o f PZ 51 in re la tion to g lu ta th ione perox idase . B iochem P h a rm a co l 1984; 33: 3 2 4 1 -3 2 4 5 .

[41 ] Y A N L, S P A L L H O L Z JE. G enera tion o f reacti ve oxygen species from the reaction o f se len ium co m pounds w ith th io ls and m am m ary tum or cells. B iochem P harm aco l 1993; 45: 4 2 9 ^ -3 7 .

[42] Y A N G G, W A N G S, Z H O U R, SU N S. (1983). E ndem ic se len ium in tox ication o f hum ans in C hina. A m J C lin N u tr 1983; 37: 8 7 2 -8 8 1 .

Redaktor prow adzący - M aria Olszewska

O trzym ano: 0 5 .0 3 .1 9 9 7 r.P rzyjęto : 0 2 .0 4 .1997r.Aclres au tora: In sty tu t B io ch em ii UŁ,9 0 -2 3 7 Łódź, ul- B anacha 12/16

http://rcin.org.pl

POSTĘPY BIOLOGII KOM ÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (325-337)

STRUKTURA NUKLEOSOM OW A CHROM ATYNY A NAPRAW A DNA

N U C L E O S O M A L S T R U C T U R E O F T H E C H R O M A T IN A N D D N A R E PA IR

Piotr WIDŁAK

Zakład Biologii Nowotworów, Instytut Onkologii, Gliwice

Streszczenie: Struktura chrom atyny ma wpływ na powstawanie uszkodzeń DNA indukowanych przez czynniki genotoksyczne oraz na usuw anie tych uszkodzeń z genomu. Naprawa DNA związana jest ze zmianam i w strukturze nukleosom ów um ożliw iającym i dostęp kom pleksu naprawczego do uszkodzenia. Po zakończeniu naprawy następuje odtworzenie struktury chromatyny niezbędne dla prawidłowego funkcjonow ania genomu. Najlepiej poznanym m echanizm em naprawy DNA jest napraw a przez w yci­nanie. W kom órce funkcjonują dw a rodzaje naprawy przez wycinanie. Jeden, zależny od transkrypcji, jest specyficzny dla nici transkrybowanej. Drugi usuwa uszkodzenia z DNA nieaktywnego transkrypcyj- nie. W obu rodzajach naprawy przez wycinanie biorą udział białka, których praw dopodobna funkcja zw iązana jes t ze zmianam i struktury chromatyny.

Słowa kluczow e: Chrom atyna; nukleosom y; uszkodzenia DNA; naprawa DNA.

Summ ary: The form ation and repair o f DNA dam age is influenced by chrom atin structure. R econfigu­ration o f nucleosom es takes place during DNA repair to increase accessibility o f dam age to repair proteins. Reconstitution of nucleosom es after DNA repair is then necessary to recover primary chromatin structure. Nucleotide excision repair (NER) is well known m echanism o f DNA repair. It is suggested that two types o f NER work in the cell. One o f them, transcription-dependent, is specific for transcribed strands o f DNA. The other is specific for non-transcribed DNA. The function o f NER depends on proteins that act as "chromatin processors". Probably some of them displace histones from dam age-containing DNA.

Key words: Chrom atin; nucleosom es; DNA damage; DNA repair.

W ykaz skrótów: A A F - acetyloam inofluoren, A FB j - aflatoksyna B i , B fa jP - benzo[a]pyren, b ia łko DDB - białko w iążące się z uszkodzonym DNA, białko SSB - białko wiążące się z jednoniciow ym DNA, B PD E - diolepoksyd benzo[a]pyrenu, C A K (ang. CDK activating kinase) - k inaza aktyw ująca białko CDK , C D K (ang. cyclin-dependent kinase) - kinaza białkowa zależna od cykliny, G G R (ang. global genom e repair) - rodzaj NER specyficzny dla DNA nietranskrybowanego, M M S - sulfonian

http://rcin.org.pl

326 P. W ID ŁA K

m etano-m etylowy, N E R (ang. nucleotide excision repair) - rodzaj naprawy DNA, T C R (ang. transcrip­tion-coupled repair) - rodzaj NER specyficzny dla nici transkrybowanej.

1. WSTĘP

M ateriał genetyczny organizmów eukariotycznych ma postać chromatyny, będącej kompleksem DNA, histonów i białek niehistonowych. Podstawową jednostką stru­kturalną chromatyny jest nukleosom. Rdzeń nukleosomu (core) tworzony jest przez oktamer histonowy (centralny tetramer [H3/H4]2 i dwa bardziej peryferyjne dimery [H2A/H2B]), wokół którego owinięte jest 146 par zasad DNA w postaci 1,75 pętli. Pomiędzy poszczególnymi nukleosomami znajduje się wrażliwy na działanie nukleaz DNA łącznikowy (linker), którego część oddziałuje z histonem H I. Długość DNA łącznikowego (10-90 par zasad) jest zmienna u różnych organizmów i w różnych typach komórek. Szczegóły struktury nukleosomu można znaleźć w licznych pracach przeglądowych, na przykład [28, 35]. W trakcie transkrypcji i replikacji następują zmiany struktury nukleosomów i częściowe lub całkowite usuwanie histonów z DNA. Proces ten związany jest z modyfikacją histonów oraz oddziaływaniem DNA z innymi kompleksami białkowymi (czynniki transkrypcyjne, kompleksy polimeraz DNA i RNA). Uważa się, że poza funkcjami strukturalnymi (pierwszy poziom upakowania DNA w jądrze) nukleosomy są czynnikiem regulującym przebieg wielu procesów zachodzących w jądrze. Omówienie zagadnień dotyczących związków pomiędzy transkrypcją a strukturą nukleosomową chromatyny można znaleźć w licznych pracach przeglądowych [16, 26, 36, 37].

Wiele fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych indukuje uszko­dzenia materiału genetycznego. Do czynników genotoksycznych należą między in­nymi promieniowanie jonizujące i promieniowanie UV oraz związki chemiczne tworzące tak zwane addukty DNA. Przykładowymi związkami tworzącymi addukty są sulfonian metano-metylowy (MMS), aflatoksyna (AFB,), benzo[a]pyren (B[a]P) czy acetyloaminofluoren (AAF). W komórce funkcjonuje szereg mechanizmów usu­wających uszkodzenia z genomu. Jednym z rodzajów naprawy DNA jest naprawa przez wycinanie - NER (nucleotide excision repair). Jest to mechanizm uniwersalny, usuwający z genomu uszkodzenia indukowane przez większość czynników geno­toksycznych [31, 48]. Podobnie jak transkrypcja i replikacja, naprawa DNA uza­leżniona je s t od obecności nukleosom ów. N iniejsza praca traktuje o współ- zależnościach pomiędzy nukleosomową strukturą chromatyny a powstawaniem usz­kodzeń DNA i ich naprawą w mechanizmie NER.

http://rcin.org.pl

S T R U K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A P R A W A DNA 327

2. OBECNOŚĆ NUKLEOSOMÓW ZMIENIA PODATNOŚĆ DNA NA USZKODZENIA

Badania nad wpływem nukleosomów na powstawanie uszkodzeń DNA zaini­cjowane zostały po wykryciu nukleosomowej struktury chromatyny oraz stwier­dzeniu, że chromatyna jest bardziej oporna na powstawanie uszkodzeń niż nagi DNA. W większości doświadczeń jako materiał do badań używano chromatynę z jąder trawionych nukleazami (zwykle nukleazą mikrokokalną). Następnie po­równywano ilość uszkodzeń we frakcji opornej i wrażliwej na nukleazy lub we frakcji mononukleosomowej i DNA całkowitym. Stwierdzono, że addukty indu­kowane przez wiele chemicznych związków genotoksycznych (na przykład pochodne B[a]P, AAF, A FB |) powstają 2-5 razy łatwiej w DNA łącznikowym niż w DNA rdzeniowym [18]. Obecność nukleosomów wpływa również na powstawanie usz­kodzeń indukowanych przez promieniowanie UV. Dimery pirymidynowe (główny typ uszkodzeń indukowanych przez UV) powstają w podobnych ilościach w DNA łącznikowym i rdzeniowym [24], ale [6-4]-fotoprodukty (inny typ uszkodzeń in­dukowanych przez UV) powstają sześciokrotnie częściej w DNA łącznikowym [20].

W części doświadczeń badano powstawanie uszkodzeń w poszczególnych nu- kleotydach DNA nukleosomowego. Stwierdzono, że w obrębie rdzenia nukleosomu dimery pirymidynowe powstają z regularnością przypominającą podatność DNA nukleosomowego na DNazę I. Miejsca o maksymalnej częstości uszkodzeń wypadały przeciętnie co dziesiąty nukleotyd, tam gdzie rdzeń fosfodwuestrowy DNA oddalony był najbardziej od powierzchni oktameru histonowego [8]. Ponieważ powstanie dimeru wymaga znacznych odkształceń struktury DNA wydaje się, że taka dys­trybucja uszkodzeń związana jest z bardziej "giętką" strukturą w miejscach najbardziej oddalonych od histonów. Specyfika powstawania uszkodzeń może być również związana z zakrzywieniem DNA (bencling) w obrębie nukleosomu, stymulującym tworzenie dimerów pirymidynowych [42].

Centralne 80-100 par zasad DNA rdzeniowego jest dwukrotnie oporniejsze na powstawanie adduktów indukowanych przez AFB] i diolepoksyd B[a]P (BPDE) niż pozostała część DNA rdzeniowego. Przy czym, odmiennie niż w przypadku dimerów pirymidynowych, położenie danego nukleotydu wobec histonów nie ma wpływu na jego zdolność do tworzenia adduktów [21, 34, 41]. W ynika to pra­wdopodobnie z faktu, że powstanie adduktów indukowanych przez AFB| i BPDE związane jest z relatywnie niewielkim zaburzeniem struktury DNA. Przypuszcza się, że ochrona nukleotydów przed BPDE (atakującym DNA od strony rowka mniej­szego) spowodowana jest silniejszym skrętem DNA i zwężeniem rowka mniejszego w centralnej części nukleosomu [34].

http://rcin.org.pl

328 P. W ID Ł A K

3. DNA RDZENIOWY I DNA ŁĄCZNIKOWY NAPRAWIANE SĄ Z RÓŻNĄ SZYBKOŚCIĄ

Zróżnicowanie szybkości naprawczej syntezy DNA w jądrach komórek poddanych działaniu czynników genotoksycznych badano przez porównanie szybkości wbu­dowywania radioaktywnych prekursorów do DNA wrażliwego i opornego na nu- kleazy. Stwierdzono, że w jądrach zawierających uszkodzenia indukowane przez MMS i AAF, znakowane nukleotydy wbudowywane są szybciej do DNA łącz­nikowego [18]. Podobną preferencję stwierdzono w przypadku syntezy naprawczej związanej z usuwaniem dimerów pirymidynowych [47]. Ponieważ ilość dimerów pirymidynowych w DNA rdzeniowym i łącznikowym jest podobna, specyfika wbu­dowywania nukleotydów wskazuje na preferencyjną naprawę uszkodzeń obecnych w DNA łącznikowym. W ydaje się, że na tak wykonane pomiary szybkości naprawy DNA łącznikowego i rdzeniowego ma wpływ obecność w jądrze materiału o zm ie­nionej strukturze nukleosomowej, na przykład chromatyny aktywnej transkrypcyjnie. Ewentualny wpływ DNA o "nietypowej" strukturze nukleosomowej został zmi­nimalizowany w doświadczeniu wykorzystującym chromatynę odtworzoną in vitro. Również w takim układzie in vitro obecność nukleosomów była czynnikiem ha­mującym naprawę uszkodzeń indukowanych przez prom ieniowanie UV [44].

W większości komórek naprawcza synteza DNA jest procesem wielofazowym. Ta fazowość wynika z różnic w szybkości naprawy różnych części genomu. Zwykle można wyróżnić dwie fazy: wczesną fazę "szybką" i następującą po niej fazę "wolną". M ożna przypuszczać, że jedną z przyczyn obecności dwu faz naprawy DNA jest różnica w szybkości naprawy DNA łącznikowego i DNA rdzeniowego. W fazie szybkiej naprawiany jest głównie DNA łącznikowy. W fazie wolnej nukleotydy wbudowywane są z podobną szybkością do DNA łącznikowego i rdzeniowego [33]. Inną przyczyną dwu faz naprawy jest prawdopodobnie to, że w mechanizmie NER geny aktywne transkrypcyjnie naprawiane są szybciej niż DNA nie trans- krybowany. Zjawisko to związane jest z przebiegiem transkrypcji oraz różnicami w strukturze chromatyny aktywnej transkrypcyjnie i nieaktywnej heterochromatyny [46].

4. MECHANIZM NAPRAWY PRZEZ WYCINANIE (NER)

W największym skrócie, mechanizm naprawy przez wycinanie funkcjonuje na­stępująco: po rozpoznaniu uszkodzenia zależna od ATP endonukleaza nacina nić DNA po obu stronach uszkodzenia, po czym następuje usunięcie jednoniciowego fragmentu z uszkodzeniem i wypełnienie powstałej przerwy przez polimerazę i ligazę DNA. Struktura i funkcje białek związanych z m echanizmem NER są bardzo

http://rcin.org.pl

ST R U K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A P R A W A DNA 329

podobne u wszystkich zbadanych organizmów eukariotycznych. W tabeli 1 wy­mienione są białka obecne w komórkach ludzkich oraz homologiczne do nich białka drożdży Saccharomyces cerevisiae, wraz z krótkim opisem ich funkcji. Do pełnego przebiegu reakcji, czyli do rozpoznania i wycięcia uszkodzenia oraz syntezy na­prawczej, niezbędnych jest około 20 polipeptydów. Szczegółowe omówienie me­chanizmu NER można znaleźć w innych pracach przeglądowych [31, 48].

Zakłada się, że złożony kompleks naprawczy mógłby formować się niezależnie od oddziaływań z DNA. Alternatywą byłoby stopniowe tworzenie kompleksu w trakcie kolejnych etapów naprawy. Pomiędzy składnikami NER występują silne oddziaływania białko-białko. W jądrach drożdży składniki NER obecne są w formie

TA BELA 1. Funkcje białek zw iązanych z NER w kom órkach ludzi i drożdży: zgrupowano białka tw o­rzące kom pleksy, w naw iasach podano inne nazwy danego białka, skróty i symbole: DDB - wiążące

się z uszkodzonym DNA (dam agedD N A -bind ing)\ SSB - w iążące się z jednoniciow ym DNA (single strand DNA-binding)', CDK - kinaza zależna od cykliny (cyclin-dependent kinase)', ? - białko lub fun­

kcja nieznana.

Typ naprawy Białko ludzkie Białkohomologiczne w komórkachS. cerevisiae

Funkcja białka (ew. motyw struktury)

Funkcja kompleksu w NER

Kompleks XPA Rad 14 białko DDB rozpoznaniepodstawowy RPA(HSSB) RPA białko SSB uszkodzenia DNA

"repairosom" UV-DDB (XPE?) ? białko DDB

TFIIH XPB (ERCC3) TFIIH Rad25 (Ssl2) 3’->5’ helikaza tworzenie otwartegoXPD (ERCC2) Rad3 5 ’—>3’ helikaza kompleksup44 Ssl 1 l(zinc-finger) naprawczegop62 Tbfl ? (kompleksp52 Tbf2 l(WD-repeat) pre-incision)p34 Tbf4 1 (zinc - finge r)Cdk7 Kin28 kinaza białkowacyklina H C c ii aktywator CDKMAT1 Tbf3 stabilizator CDK

XPC Rad4 białko SSB stabilizacja kompleksuHHR23B Rad23 l{motyw ubikwityny) "pre-incision"

XPG (ERCC5) Rad2 endonukleaza (3’)

XPF (ERCC4, ERCC1 DRadl WycięcieERCC1 RadlO endonukleaza (5’) uszkodzenia

Naprawa nici CSA (ERCC8) Rad28 l(WD-repeat)transkrybowa- CSB (ERCC6) Rad26 lim otyw heUkazy) ?nej "TCR"

Naprawa DNA ? Rad 16 l(motyw helikazy)nieaktywnego ? Rad7 ? 7"GGR"

http://rcin.org.pl

330 P. W ID ŁA K

kompleksu, tworząc tak zwany "repairosom" nawet pod nieobecność uszkodzonego DNA [38]. Tak więc, mniej lub bardziej gotowy kompleks naprawczy prawdo­podobnie występuje w formie "preformowanej", gotowy do podjęcia naprawy DNA. Z oczyszczonych białek ludzkich udało się odtworzyć kompleks naprawczy, w pełni funkcjonujący w reakcji in vitro. Stwierdzono, że do rozpoznania i wycięcia uszkodzenia niezbędne były białka; RPA, XPA, XPC, XPG, ERCC1, XPF oraz kompleks TFIIH [1, 22]. Kompleks NER odtworzono również z białek drożdży, homologicznych do wymienionych wyżej białek ludzkich [9, 38] (patrz tabela). W ymienione składniki NER funkcjonowały w reakcji in vitro, w której substratem był nagi DNA. Jednak w warunkach in vivo rzeczywistym substratem jest DNA związany ze złożonymi strukturami białkowymi, takimi jak oktamer histonowy czy kompleks tran skry pcyjny. Szereg danych wskazuje, że w komórce funkcjonują dwa częściowo niezależne rodzaje NER. Jednym z nich jest naprawa nici transkrybowanej genów aktywnych transkrypcyjnie, tzw. transcription-coupleclrepair (TCR). Drugim rodzajem NER jest naprawa pozostałej części genomu, czyli global genome repair (GGR). Zakłada się, że każdy z nich oprócz podstawowego, wspólnego zestawu białek ("repairosomu") zawiera dodatkowe, specyficzne składniki.

5. NAPRAWA DNA ZALEŻNA OD TRANSKRYPCJI (TCR)

Stwierdzono, że różne obszary genomu naprawiane są z różną szybkością. Naj­szybciej naprawiane są nici będące matrycami w procesie transkrypcji, najwolniej nieaktywna transkrypcyjnie heterochromatyna. Z szybkością pośrednią naprawiane są (traktowane jako dwuniciowa całość) geny aktywne lub potencjalnie aktywne transkrypcyjnie. Preferencyjna naprawa nici transkrybowanych jest wynikiem TCR. W komórkach ludzkich białkami specyficznymi dla tego mechanizmu są CSA i CSB [10, 43]. Uszkodzenia genów kodujących oba białka stwierdzono u chorych z zespołem Cockayne syndrome (CS), charakteryzującym się między innymi za­burzeniami transkrypcji i brakiem preferencyjnej naprawy DNA transkrybowanego.

Wiadomo, że preferencyjna naprawa nici transkrybowanej jest całkowicie zależna od transkrypcji danego genu [49]. Jednak dotychczas nie wiadomo, jak funkcjonuje TCR w komórkach eukariotycznych oraz jaka jest rola białek CSA i CSB. Jedna z hipotez zakłada, że kompleks CSA/CSB (ewentualnie razem z TFIIH) jest de­tektorem polimerazy RN A zablokowanej na uszkodzeniu [43]. W takim ujęciu brak białek CSA i CSB byłby przyczyną defektu naprawy, prowadzącego do zaburzeń transkrypcji obserwowanych w komórkach CS. Alternatywna hipoteza zakłada, że białka CSA i CSB są czynnikami transkrypcyjnymi, zaś pierwotnym wynikiem braku tych białek jest defekt transkrypcji. Ponieważ TCR zależny jest od transkrypcji, wtórnym efektem zaburzeń transkrypcji mógłby być defekt naprawy [5].

http://rcin.org.pl

S T RU K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A PR A W A DNA 331

Istotnym elementem kompleksu NER jest generalny czynnik transkrypcyjny TFIIH. Tak zwany holoTFIIH składa się z rdzenia (w skład którego wchodzą między innymi helikazy XPB i XPD) oraz kinazy CAK (kompleksu cykliny H i cykli- no-zależnej kinazy Cdc7). Składnikami TFIIH bezpośrednio związanymi z naprawą są białka XPB i XPD, natomiast obecność kinazy CAK prawdopodobnie nie jest niezbędna w trakcie naprawy DNA. Jeden z modeli zakłada, że rdzeń TFIIH mógłby tworzyć odwracalne kompleksy z CAK lub z białkami NER, a to determinowałoby jego udział w transkrypcj i bądź w naprawie [11,23,39]. Nie wiadomo, jakie znaczenie dla naprawy nici transkrybowanej ma fakt, że TFIIH bierze udział w obu procesach. Początkowo uważano, że na etapie elongacji łańcucha RNA TFIIH nie jest związany z kompleksem polimerazy II RNA. Część danych sugeruje jednak, że i w tej fazie transkrypcji TFIIH oddziałuje z kompleksem transkrypcyjnym [52]. Mogłoby to mieć istotne znaczenie dla preferencyjnej naprawy genów transkrybowanych. Szcze­gółowe dane na temat współzależności transkrypcji i naprawy DNA można znaleźć w innych pracach przeglądowych [4, 6, 39].

6. NAPRAWA DNA NIE TRANSKRYBOWANEGO (GGR)

W iększa część DNA naprawiana jest w procesie global genome repair. Defekt GGR wykryto po raz pierwszy u pacjentów z zespołem xeroderma pigmentosum grupy C (XP-C). W komórkach z uszkodzonym genem XPC prawidłowo fun­kcjonuje naprawa nici transkrybowanej, natomiast brak naprawy nici kodującej i DNA nieaktywnego transkrypcyjnie. Funkcjonowanie TCR w komórkach XP-C tłumaczy ich relatywnie dużą oporność na czynniki uszkadzające DNA, pomimo obniżenia całkowitego poziomu naprawy DNA do 10-20% [50]. Białko XPC wy­stępuje w kompleksie z HHR23B, ludzkim homologiem białka Rad23 drożdży [19]. Kompleks XPC/HHR23B mógłby pełnić następujące funkcje:

1) rozpoznawanie uszkodzenia (lub rozpoznawanie kompleksu DNA-XPA/RPA);2) stabilizacja kompleksu zawierającego uszkodzony DNA, XPA/RPA oraz

TFIIH;3) ochrona DNA przed niespecyficzną degradacją przez nukleazy XPG i

X PF/ER C C 1.W komórkach S. cerevisiae białkiem homologicznym do XPC jest Rad4. Jednak

w przeciwieństwie do komórek XP-C, u mutantów rad4 całkowicie brak naprawy DNA. Sugeruje to, że kompleks XPC/HH23B, podobnie jak Rad4/Rad23, jest skład­nikiem podstawowego mechanizmu NER [31, 48]. Naprawa nici transkrybowanej w komórkach XP-C mogłaby być rezultatem przejęcia funkcji białka XPC przez czynniki specyficzne dla TCR.

http://rcin.org.pl

332 P. W IDŁAK

W przypadku drożdży S. cerevisiae fenotyp zbliżony do XP-C wykazują mutanty rad7 i radló, u których również brak naprawy heterochromatyny (na przykład locus H M L-a) i nici nietranskrybowanej [51]. Przypuszczalnie białka Rad7 i R adló działają w kompleksie, posiadając zdolność oddziaływania z Rad4 [45]. Stwierdzono, że białko R adló posiada domenę strukturalną swoistą dla helikaz DNA. Podobny do R ad ló element strukturalny mają białka z rodziny SWI2, które są czynnikami transkrypcyjnymi związanymi z derepresją heterochromatyny [3]. Natomiast białko Rad7 oddziałuje (przynajmniej in vitro) z białkiem Sir3, które jest strukturalnym komponentem heterochromatyny [25]. Może to sugerować, że ewentualny kompleks R ad7/R adl6 funkcjonuje jako czynnik zmieniający strukturę chromatyny. Do tej pory nie są znane ludzkie białka homologiczne do Rad7 i R adló.

7. STRUKTURA CHROMATYNY WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ NAPRAWY DNA

Czynnikiem mającym wpływ na szybkość naprawy genów aktywnych trans- krypcyjnie jest preferencyjna naprawa nici transkrybowanej (zwykle uszkodzenia usuwane są z tej nici 2 lub 3 razy szybciej niż z nici kodującej). Nie jest to jednak czynnik jedyny. Zaobserwowano, że w genie, którego transkrypcję wyłączono poprzez delecję fragmentu promotora, brak preferencyjnej naprawy nici będącej matrycą dla polimerazy RNA. Pomimo tego, uszkodzenia z obu nici DNA tego genu były usuwane dwukrotnie szybciej niż z heterochromatyny [49]. Stwierdzono, że uszkodzenia w różnych pozycjach nici kodującej i DNA nie transkrybowanego naprawiane są ze zróżnicowaną szybkością (w przeciwieństwie do TCR, gdzie usz­kodzenia w różnych pozycjach nici transkrybowanej naprawiane są z jednakową szybkością). W ynika to najprawdopodobniej z różnej dostępności uszkodzeń w miej­scach oddziałujących z różnymi białkami (histony, białka niehistonowe chromatyny, czynniki transkrypcyjne) [40].

W ydaje się, że poza samą transkrypcją (a więc udziałem TCR), czynnikiem mającym wpływ na preferencyjną naprawę genów aktywnych transkrypcyjnie (lub potencjalnie aktywnych) są specyficzne cechy strukturalne aktywnej chromatyny. Jedną z takich cech jest modyfikacja struktury nukleosomów, często związana z modyfikacją histonów. Stwierdzono, że naprawa DNA jest szybsza w komórkach, w których inhibitorami deacetylaz indukowano hyperacetylację histonów [29]. Inną cechą chromatyny aktywnej transkrypcyjnie jest jej oddziaływanie ze strukturami szkieletu jądrowego. Postuluje się, że podobnie jak replikacja i transkrypcja, procesy naprawy DNA przebiegają w kontakcie z tymi strukturami [46]. Toteż oddziaływanie chromatyny aktywnej transkrypcyjnie ze szkieletem jądrowym również może być przyczyną jej preferencyjnej naprawy.

http://rcin.org.pl

S T RU K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A PR A W A DNA 333

8. ZMIANY STRUKTURY NUKLEOSOMOWEJ W TRAKCIE NAPRAWY DNA

Stwierdzono, że dimery pirymidynowe powstałe w obrębie DNA rdzeniowego naprawiane są z szybkością niezależną od położenia uszkodzenia w stosunku do powierzchni nukleosomu [12]. Sugerowało to, że w trakcie naprawy DNA następuje rearanżacja nukleosomów (lub nawet ich całkowite usuwanie) ułatwiająca dostęp kompleksu reperacyjnego do uszkodzenia. Jeden z proponowanych modeli zakłada, że w trakcie fazy szybkiej naprawy uszkodzenia udostępniane są dzięki dysocjacji histonów. Natomiast w czasie fazy wolnej uszkodzenia udostępniane byłyby poprzez przemieszczanie się nukleosomu [33].

Jednym z potencjalnych mechanizmów rearanżacji chromatyny jest modyfikacja histonów, na przykład acetylacja, ubikwitynacja czy poli(ADP)-rybozylacja. En­zymem odpowiedzialnym za poli(ADP)-rybozylację białek jest polimeraza po- li(ADP)-rybozy (PARP). PARP jest enzymem aktywowanym przez przyłączenie się do wolnych końców DNA (np. pojawiających się w rezultacie uszkodzeń DNA). W chwili obecnej fizjologiczna rola PARP pozostaje niejasna. Jedna z hipotez sugeruje, że katalizowana przez PARP modyfikacja histonów stymuluje ich dy- socjację i ułatwia dostęp do uszkodzonego DNA [2].

Zm iana struktury nukleosomowej w trakcie naprawy DNA może być również wynikiem działania wyspecjalizowanych kompleksów białkowych, podobnie jak ma to miejsce w procesie transkrypcji. Do tej pory znane są trzy kompleksy zmie­niające strukturę chromatyny i aktywujące transkrypcję: SWI/SNF, NURF (n u ć - leosome rem odeling factor) i R SC (remodeling the structure o f chromatin). Kompleksy te zawierają ATP-azy zależne od DNA i posiadające domeny strukturalne helikaz DNA (taką ATP-azą jest SWI2 z kompleksu SWI/SNF). Aktywność tych kompleksów umożliwia derepresję chromatyny i wiązanie do DNA nukleosomowego specyficznych czynników transkrypcyjnych. Nie wiadomo jednak, czy jest to zwią­zane z dysocjacją nukleosomów (być może są one przesuwane lub dysocjują tylko dimery H2A/H2B) [15, 17, 27, 36]. Białkami wykazującymi homologię do białek z rodziny SWI2 są składniki NER: Rad 16, Rad26, CSB. Nie wiadomo, jaki jest mechanizm działania tych białek. Hipotetyczna rola białka Rad 16 mogłaby polegać na usuwaniu z uszkodzonego DNA histonów, do tej pory nie stwierdzono jednak żadnej aktywności enzymatycznej tego białka. CSB i Rad26, podobnie jak SWI2, są ATP-azami zależnymi od DNA i metodami in vitro nie stwierdzono ich aktywności helikazowej. Stwierdzono również, że CSB (przynajmniej in vitro) nie katalizuje dysocjacji polimerazy II RNA zablokowanej na uszkodzonym DNA. CSB tworzy kompleksy (in vitro) z XPA i TFIIH, co sugeruje jego udział w ułatwianiu oddziaływań pom iędzy "repairosomem" a kompleksem zawierającym zablokowaną polimerazę RNA [32].

http://rcin.org.pl

334 P. W IDŁAK

Część informacji o sposobie ekspresji informacji genetycznej zakodowanej w sekwencji nukleotydów zawarta jest w strukturze chromatyny. Toteż rezultatem kompletnej naprawy DNA, poza przywróceniem prawidłowej struktury nukleotydów, powinno być odtworzenie pierwotnej struktury chromatyny. Z procesami um ożli­wiającymi dostęp kompleksu naprawczego do DNA muszą więc współdziałać m e­chanizmy rekonstytucji chromatyny. Stwierdzono, że reperacyjna synteza DNA jest czynnikiem stymulującym rekonstytucję chromatyny, a nowosyntetyzowane frag­menty są wydajnie włączane do powstających nukleosomów [30]. W warunkach fizjologicznych w tworzeniu nukleosomów biorą udział wyspecjalizowane kom ­pleksy białkowe. W komórkach ludzkich takim kompleksem jest CAF1 (chromatin assembly factor). Działanie CAF1 jest specyficzne dla odtwarzania nukleosomów w trakcie replikacji [13]. Przypuszcza się, że czynnik CAF1 bierze również udział w rekonstytucji nukleosomów w trakcie naprawczej syntezy DNA [7, 14]. Być może z rekonstytucją nukleosomów w trakcie naprawy DNA związane są również inne czynniki, takie jak NAP1 (nucleosome assembly protein) [13].

9. UWAGI KOŃCOWE

Struktura chromatyny wywiera wpływ na powstawanie i naprawę uszkodzeń materiału genetycznego. Obecność nukleosomów jest czynnikiem chroniącym DNA przed niektórymi czynnikami genotoksycznymi, lecz jednocześnie spowalniającym naprawę DNA. Procesy naprawy chromatyny związane są z rearanżacją struktury nukleosomów. Ma ona na celu ułatwienie dostępu enzymów naprawczych do usz­kodzenia, a następnie odtworzenie pierwotnej struktury chromatyny. Związki po­między strukturą chromatyny a naprawą DNA poznane sa najlepiej w przypadku mechanizmu NER. Można jednak przypuszczać, że obecność nukleosomów jest czynnikiem silnie wpływającym na przebieg innych rodzajów naprawy DNA. Wydaje się, że wyjaśnienie, w jaki sposób naprawiana jest chromatyna ("prawdziwy" substrat dla kompleksów reperacyjnych) oraz jakie są wzajemne związki pomiędzy naprawą a transkrypcją i replikacją DNA, będzie kolejnym etapem poznania mechanizmów naprawy DNA.

LITERATURA*

[1] A B O U S S E K H R A A, B IG G E R S T A F F M, SH IV JI M K K , V IL PO JA , M O N C O L L IN V, P O D U S T V N , PR O T IC M , H U B S C H E R U, E G L Y JM , W O O D R D . M am m alian D N A n u c leo tid e ex c ision rep a ir reconstitu ted w ith purified protein com ponen ts. C ell 1995; 80: 8 5 9 -8 6 8 .

*D la zm n ie jszen ia ob jętości część cy tow anego p iśm ienn ictw a stanow ią artyku ły p rzeg lądow e.

http://rcin.org.pl

S T RU K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A P R A W A DNA 335

[2] A L T H A U S FR, H O F FE R E R L, K L E C Z K O W S K A HE, M A L A N G A M, N A E G E L I H, P A N Z E T E R PL, R E A L IN IC A . H istone shu ttling by poly A D P-ribosy la tion . M ol C ell B iochem 1994; 138: 5 3 -5 9 .

[3] B A N G DD , V E R H A G E RA , G O O SE N N, B R O U W E R J, van de P U T T E P. M o lecu lar c lon ing o f R A D 16, a gene involved in d ifferen tia l repair in Saccharom yces cerevisiae . N u c l A c id s R es 1992; 20: 3 9 2 5 -3 9 3 1 .

[4] B H A T IA PK , W A N G Z, FR IE D B E R G EC. D N A repair and transcrip tion . C urr O pin Gen D eve l 1996; 6: 146-150 .

[5] C H U G, M A Y N E L. X eroderm a p igm entosum , C ockayne syndrom e and trich o -th io d y stro p h y : do the genes exp lain the d iseases? Trends Gen 1996; 12: 187-192 .

[6] FR IE D B E R G EC. R e la tionsh ips betw een D N A repair and transcrip tion . A n n u R ev B iochem 1996; 65: 15^42.

[7] G A IL L A R D PH L, M A R T IN I EM D , K A U FM A N PD , ST IL L M A N B, M O U S T A C C H I E, A L M O U Z N IG . C hrom atin assem bly coupled to D N A repair: a new role fo r ch rom atin assem bly fac to r 1. C ell 1996; 86: 8 8 7 -8 9 6 .

[8] G A L E JM , N IS SE N KA, SM E R D O N M J. U V -induced fo rm ation of py rim id ine d im ers in nu c leo so m e core D N A is strongly m odulated w ith a period o f 10.3 bases. P roc N a tl A c a d Sci USA 1987; 84: 6 6 4 4 -6 6 4 8 .

[9] G U Z D E R SN, H A B R A K E N Y. SU N G P. P R A K A S H L. P R A K A S H S. R econstitu tion o f yeas t nuc leo tide excision repair w ith purified R ad pro teins, rep lica tion pro tein A and tran sc rip ­tion facto r T FIIH . J B io l C hem 1995; 270: 12973-12976 .

[10] H E N N IN G K A , LI L, IY E R N, M cD A N IE L LD , R E A G A N M S, L E G E R S K I R, S C H U L T Z RA , S T E F A N IN IM , L E H M A N N AR, M A Y N E LV , F R IE D B E R G EC. T he C ockayne sy n d ro ­m e group A gene encodes a W D repeat pro tein that in te rac ts w ith C SB protein and a subun it o f R N A po ly m erase II T FIIH . C ell 1995; 82: 5 5 5 -5 6 4 .

[11] H O E IJM A K E R S JH J, E G L Y JM , V E R M E U L E N W. TFIIH : a key co m ponen t in m ultip le D N A transac tions. C urr O pin G en D evel 1996; 6: 2 6 -3 3 .

[ 12] JE N S E N KA , SM E R D O N M J. D N A repair w ithin nucleosom e cores o f U V -irrad ia ted hum an cells. B io ch em is try 1990; 29: 4 7 7 3 -4 7 8 2 .

[ 13] K A U F M A N PD . N ucleosom e assem bly: the C A F and the H A T. C urr O pin C ell B io l 1996; 8: 3 6 9 -3 7 3 .

[14] K A U F M A N PD , K O B A Y A S H I R, ST IL L M A N B. U ltrav io le t rad ia tio n sensitiv ity and red u ctio n o f telom eric silencing in S accharom yces cerev isiae cells lacking ch ro m atin assem bly facto r-I. G enes D ev 1997; 11: 3 4 5 -3 5 7 .

[15] K IN G S T O N R E, B U N K E R C A , IM B A L Z A N O AN. R epression and activation by m u ltip ro ­tein com plexes that a lte r ch rom atin structure. G enes D ev 1996; 10: 9 0 5 -9 2 0 .

[16] K O R N B E R G R D , L O R C H Y. In terp lay betw een chrom atin structure and transcrip tion . C u rr O pin C ell B io l 1995; 7: 3 7 1 -3 7 5 .

[17] K R U D E T , E L G IN SCR . C hrom atin : push ing nucleosom es around. C urr B iol 1996; 6: 5 1 1 -5 1 5 .

[18] M A C L E O D M C. In teraction o f bulky chem ical carc inogens w ith D N A in chrom atin . C a r­c in o g en es is 1995; 16: 2 0 0 9 -2 0 1 4 .

[19] M A S U T A N I C, SU G A S A W A K, Y A N A G IS A W A J, SO N O Y A M A T, U I M, E N O M O T O T, T A K IO K, T A N A K A K, van der SP E K PJ. B O O T S M A D, H O E IJM A K E R S JH J, H A N A O - K A F. P urifica tio n and c lon ing o f a nucleo tide excision repair com plex invo lv ing the x e roderm a p ig m en to su m group C protein and a hum an hom ologue o f yeast R A D 23. E M B O J 1994; 13: 1 8 3 1 -1 8 4 3 .

[20] M IT C H E L L DL, N G U Y E N TD , C L E A V E R JE. N on-random induction o f p y rim id in e-p y ri- m id o n e (6-4) p h o to products in u ltrav io le t-irrad ia ted hum an chrom atin . J B iol C hem 1990; 265: 5 3 5 3 -5 3 5 6 .

http://rcin.org.pl

336 P. W ID ŁA K

21] M O Y E R R, M A R IE N K. van H O L D E K, B A IL E Y G. S ite-spec ific a fla tox in B 1 ad d u ctio n o f seq u en ce-p o sitio n ed nucleosom e core particles. J B io l C hem 1989; 264: 1 2 2 2 6 -12231 .

22] M U D, P A R K C H , M A T S U N A G A T, H SU DS, R E A R D O N JT, S A N C A R A. R eco n stitu tio n o f hum an D N A repair excision nuclease in a h ighly defined system . J B ioI C hem 1995; 270; 2 4 1 5 -2 4 1 8 .

23] N IG G EA. C yc lin -d ep en d en t k inase 7: at the cross-roads o f transcrip tion , D N A rep air and cell cycle con tro l? C u rr O pin C ell B io l 1996; 8: 3 1 2 -3 1 7 .

24] N IG G L I HJ, C E R U T T I PA . N ucleosom al d istribu tion o f thym ine pho tod im ers fo llo w in g far- and n ear-u ltrav io le t irrad iation . B iochem B iophys R es C om m un 1982; 105: 1 2 1 5 -1223 .

25] P A E T K A U D W , R IE S E JA , M acM O R R A N W S, W O O D S R A , G IE T Z R D . In te rac tio n s o f the yeast R ad7 and Sir3 pro teins: im plications fo r D N A repair and ch rom atin struc tu re . G enes D ev 1994; 8: 2 0 3 5 -2 0 4 5 .

26] P A R A N JA P E SM , K A M A K A K A RT, K A D O N A G A JT. R ole o f ch ro m atin stru c tu re in the regu la tion o f transcrip tion by R N A polym erase II. A n n u R ev B iochem 1994; 63: 2 6 5 -2 9 7 .

27] P E T E R S O N CL. M ultip le S w itc h e s to turn on ch rom atin? C u rr O pin Gen D evel 1996; 6: 171-175 .

28] PR U SS D, H A Y E S JJ, W O L F F E AP. N ucleosom al anatom y - w here are the h isto n es? B io E ssa ys 1995; 17: 161-170 .

29] R A M A N A T H A N B, SM E R D O N M J. E nhanced D N A repair syn thesis in h y p eracety la ted nucleosom es. J B io l C hem 1989; 264: 11026-11034 .

30] R Y O JI M , T O M IN N A E, Y A SU I W . M in ich rom osom e assem bly accom p an y in g repair-type D N A synthesis in X en o p u s oocytes. N u cl A cid s R es 1989; 17: 10243-10258 .

31] SA N C A R A. D N A excision repair. A n n u R ev B iochem 1996; 65: 4 3 -8 1 .32] SE L B Y CP, SA N C A R A. H um an tran scrip tio n -rep air coup ling facto r C S B /E R C C 6 is a

D N A -stim ula ted A T P ase but is not a he licase and does not d isrup t the ternary tran scrip tio n com plex o f stalled R N A p o lym erase II. J B io l C hem 1997; 272: 1885-1890 .

33] SM E R D O N M J. D N A repair and the role o f ch rom atin structure. C u rr O pin C ell B io l 1991; 3: 4 2 2 -4 2 8 .

34] S M IT H BL, M A C L E O D M C. C ovalen t b ind ing o f the carcinogen b en zo[a ]pyrene diol epox ide to X en o p u s laevis 5S D N A reconstitu ted into nucleosom es. ./ B io l C hem 1993; 268: 2 0 6 2 0 - 20629.

35] S M IT H M M . H istone struc tu re and function. C urr O pin C ell B io l 1991; 3: 4 2 9 ^137 .36] S T E G E R DJ, W O R K M A N JL. R em odeling ch rom atin struc tu res for ranscrip tion : w hat

h appens to the histones. B ioE ssays 1996; 18: 8 7 5 -8 8 4 .37] SV A R E N J, H O R Z W . R egu la tion o f gene expression by nucleosom es. C urr O pin Gen D evel

1996; 6: 164-170.38] S V E JS T R U P JQ , W A N G Z, F E A V E R W J, W U X, B U S H N E L L D A , D O N A H U E T F,

F R IE D B E R G EC, K O R N B E R G RD. D ifferen t form s o f T FIIH for transcrip tion and D N A repair: ho lo -T F IIH and a nuc leo tide excision repairosom e. C ell 1995; 80: 2 1 -2 8 .

39] S V E JS T R U P JQ , V IC H IP , E G L Y JM . T he m ultip le ro les o f tran scrip tio n /rep a ir facto r T FIIH . Trends B iochem Sc i 1996; 21: 3 4 6 -3 5 0 .

40] T IJS T E R M A N M , T A S S E R O N de JO N G JG , van de P U T T E P, B R O U W E R J. T ran sc rip ­tio n -coup led and g lobal genom e repair in the Saccharom yces cerev isiae R PB 2 gene at n u c leo ­tide reso lu tion . N u cl A cid s R es 1996; 24: 3 4 9 9 -3 5 0 6 .

41] T H R A L L B D , M A N N D B , SM E R D O N M J, S P R IN G E R DL. N u c leo so m e struc tu re m o d u la ­tes benzo[a]pyrened io l epox ide adduct fo rm ation . B iochem istry 1994; 33: 2 2 1 0 -2 2 1 6 .

42] T O R N A L E T T I S, P F E IF E R GP. U V dam age and repair m echan ism s in m am m alian cells. B io E ssa ys 1996; 18: 2 2 1 -2 2 8 .

43] T R O E L S T R A C, van G O O L A, de V IT J, V E R M E U L E N W , B O O T S M A D, H O E IJM A K E R S JH J. E R C C 6, a m em ber o f a subfam ily o f pu tative helicases, is invo lved in C o ckaynes syndrom e and p referen tia l repair o f active genes. C ell 1992; 71: 9 3 9 -9 5 3 .

http://rcin.org.pl

S T R U K T U R A N U K L E O S O M O W A C H R O M A T Y N Y A N A P R A W A DNA 337

[44] W A N G Z, W U X, F R IE D B E R G EC. N ucleo tide excision repair o f D N A by hum an cell ex tracts is suppressed in reconstitu ted nucleosom es. J B io l C hem 1991; 266: 2 2 4 7 2 -2 2 4 7 8 .

[45] W A N G Z, W EI S, R E E D SH, W U X, S V E JS T R U P JQ , F E A V E R W J. K O R N B E R G R D , F R IE D B E R G EC. T he R A D 7, R A D 16 and R A D 23 genes o f Sacch a ro m yces cerevisiae: requ irem en t for tran scrip tio n -in d ep en d en t nucleo tide excision repair in vitro and in teractions be tw een the gene products. M o l C el B io l 1997; 17: 6 3 5 -6 4 3 .

[46] W ID Ł A K P. Specyfika pow staw an ia i napraw y m utagennych uszkodzeń m ateria łu g en ety cz ­nego. P ost B iochem 1994; 40: 194-199 .

[47] W IL L IA M S JI, F R IE D B E R G EC. D eoxyribonucle ic acid excision repair in chrom atin a fter u ltrav io le t irrad iation o f hum an fib rob lasts in culture. B io ch em is try 1979; 18: 3 9 6 5 -3 9 7 2 .

[48] W O O D RD. D N A repair in eukaryo tes. A n n u R ev B iochem 1996; 65: 135-167 .[49] V E N E M A J, B A R T O S O V A Z, N A T A R A JA N AT, van Z E E L A N D A A , M U L L E N D E R S

LH F. T ran scrip tio n affects the rate but not the ex ten t o f repair o f cy c lobu tane p y rim id ine d im ers in the hum an adenosine d eam inase gene. J B io l C hem 1992; 267: 8 8 5 2 -8 8 5 6 .

[50] V E N E M A J, van H O F F E N A, K A R C A G I V, N A T A R A JA N A T, van Z E E L A N D AA , M U L L E N D E R S LH F. X ero d erm a p igm en tosum co m plem en ta tion group C cells rem ove p y ri­m id ine d im ers se lec tive ly from the transcribed strand o f active genes. M o l C ell B io l 1991; 11: 4128—4134 .

[51] V E R H A G E RA , Z E E M A N A M , de G R O O T N, G L E IG F, B A N G D D , van de P U T T E P, B R O U W E R J. T he R A D 7 and R A D 16 genes, w hich are essen tia l for py rim id ine d im er rem oval from the silent m ating type loci, are a lso requ ired for repair o f the non transcribed strand o f an active gene in Sa cch a ro m yces cerevisiae. M o l C ell B io l 1994; 14: 6 1 3 5 -6 1 4 2 .

[52] Y A N K U L O V K Y , PA N D E S M, M cC R A C K E N S, B O U C H A R D D, B E N T L E Y DL. T FIIH fu n c tions in regu la ting transcrip tion e longation by R N A po lym erase II in X enopus o ocy tes. M o l C ell B io l 1996; 16: 3 2 9 1 -3 2 9 9 .

Redaktor prow adzący - M aria O lszewska

O trzym ano: 2 1 .0 1 .1 9 9 7 r.P rzy ję to : 1 1 .04 .1997 r.A d re s au tora : In sty tu t O nkologii, 44 -1 0 0 G liw ice.

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

POSTĘPY BIOLOGII KOM ÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (339-373)

POŁĄCZENIA SZCZELINOWE

G A P JU N C T IO N S

Andrzej FIERTAK i Wincenty KILARSKI

Zakład Cytologii i Histologii, Instytut Zoologii UJ, Kraków

Streszczenie: W iększość zespołów tkankowych zarówno organizm ów dorosłych jak i tych będących w stadium zarodkowym ma międzykom órkowe kanały łączące ze sobą sąsiednie kom órki. System kanałów łączących z jednej strony rozdziela, a z drugiej łączy ze sobą zespoły kom órek w fizjologiczne podjednostki. Opisane kanały zapewniają ciągłość cytoplazm atyczną połączonych kom órek i służą w ym ianie jonów , małych cząsteczek oraz zapewniają niską, m iędzykom órkową oporność elektryczną. Kanały lub ich zespoły są dobrze zdefiniowanym i jednostkam i strukturalnym i opisanymi jako połączenia szczelinowe. Znaczenie ewolucyjne kom unikacji m iędzykomórkowej przez istnienie połączeń szczeli­now ych, jaw i się nam dopiero w perspektywie ich wszechobecności we wszystkich typach zwierząt tkankow ych oraz w większości ich tkanek. Tylko nieliczne populacje kom órek są pozbawione połączeń szczelinowych. Do tych należą komórki krwi oraz mięśni szkieletowych. W artykule przedstawiono krótki przegląd strukturalnych, molekularnych i funkcjonalnych własności połączeń szczelinowych na podstaw ie ostatnio dostępnej literatury i badań własnych.

Słow a kluczowe: połączenia szczelinowe, koneksyny

Sum m ary. In em bryonic and adult organisms, m ost tissues contain intercellular channels that connect each cell with all the neighbours that it contacts or divide the tissue into coupled subsets. These channels provide cytoplasm ic continuity with regards to ions and small m olecules, and their aggregates belong to a single ultrastructurally recognisable class: gap junctions. The evolutionary importance of a generalised in tercellular com m unication system can be appreciated when one considers the w idespread prevalence o f gap junctions within animals o f all multicellular phyla, and within almost all tissues o f vertebrates. O nly a few population o f cells such as skeletal muscle cells and circulating blood cells are not equipped w ith gap junctions. This paper provides a brief review o f the diverse structural, m olecular and functional aspects o f gap junctions as revealed by current research and our own studies.

K ey words: gap junctions, connexins

http://rcin.org.pl

340 A. F IERTAK, W. KILARSKI

1. WPROWADZENIE

Połączenia szczelinowe są wyspecjalizowanymi obszarami błony wielu komórek, dzięki którym komunikują się one między sobą (fot. 1). Tkanki i narządy nie są tylko sumą komórek, lecz są także obwodami regulacyjnymi, a ich fizjologiczna efektywność w dużej mierze zależy od zdolności komunikacyjnych. Istnieje kilka sposobów kooperacji międzykomórkowej. Komórka reaguje na różne typy sygnałów przez uwolnienie hormonów, czynników wzrostu, czy też innych mediatorów, które są wiązane przez specyficzne receptory. Bardziej lokalnie, komórki komunikują się przez glikoproteiny powierzchniowe lub molekuły adhezyjne, takie jak: kad- heryny, integryny czy też dużą grupę cząsteczek immunoglobulinopodobnych, które wymieniają informacje między komórkami oraz między komórkami i ich środo­wiskiem międzykomórkowym. Te molekularne oddziaływania są związane z mi­gracją, sortowaniem i grupowaniem komórek podczas rozwoju i prowadzą, co

*opisywał Gumbiner 69 ] , do powstania grup komórek, struktur wielokomórkowych, a w konsekwencji narządów. Występowanie zjawiska adhezji między komórkami nie ogranicza się tylko do stadiów rozwojowych. W zajemne oddziaływanie komórek, przynajmniej w tkankach nabłonkowych, wymaga, zgodnie z badaniami Chena i Óbrinka [69*], istnienia wyspecjalizowanych kompleksów połączeniowych lub po­łączeń przylegających, adhezyjnych - zonulae, maculae adhérentes.

Kooperacja sieciowa najszybciej osiągana jest przez tworzenie kanałów pomiędzy komórkami i ich wypustkami. Jednakże, dla kontrastu z wielką ilością różnorodnych kanałów jonowych rozmieszczonych na całej powierzchni komórki, kanały mię­dzykomórkowe muszą być tworzone przez dwie komórki, każda z nich bowiem dostarcza połowę kanału i oba półkanały muszą ściśle przylegać do siebie, aby uniemożliwić niespecyficzną wymianę z środowiskiem pozakomórkowym. W końcu, półkanały muszą dokładnie do siebie "pasować" w celu połączenia cytoplazmy obu komórek. Prawdopodobieństwo dowolnego łączenia się półkanałów wydaje się być małe. Jedyną możliwością jego zwiększenia byłoby nagromadzenie wielu półkanałów na określonej, niewielkiej przestrzeni błony komórkowej, która odpo­wiadałaby analogicznej przestrzeni na komórce przyległej. W ten sposób przebiegają skomplikowane procesy adhezji komórek poprzedzające tworzenie kanałów, jak sądzi Jongen [69*].

Połączenia szczelinowe odkryto około 30 lat temu. Dewey i Barr [69*] jako pierwsi opisali strukturę wykrytą przy użyciu mikroskopu elektronowego w ko­mórkach mięśni gładkich jelita czczego i nadali jej nazwę nexus. W rok później Robertson [69*] opisał heksagonalnie upakowane podjednostki w synapsach ele­ktrycznych pomiędzy komórkami M authnera w rdzeniu przedłużonym karasia, a Revel i Karnovsky [69*] znaleźli w wątrobie i sercu obszary błon komórkowych,

[69*] - patrz artykuł p rzeg lądow y W olburg i R olm ann.

http://rcin.org.pl

PO Ł ĄCZ EN IA SZ C Z E L IN O W E 341

Fot. 1. Przekrój podłużny przez połączenie szczelinowe łączące dwie wypustki kom órek m ięśni gładkich m acicy ludzkiej. W ycinek pobrano w czasie dokonywania cesarskiego cięcia. Zdjęcie w ykonane przy pomocy m ikroskopu elektronow ego wykazuje charakterystyczną pięciowarstw ową budowę połączenia szczelinow ego, która jest podstawym kryterium m orfologicznym do określenia tej struktury jako połącze­

nia szczelinowego. Pow iększenie około 300.000

kktóre oddzielała szczelina o szerokości 1-2 nm. Była ona przenikliwą dla mi- krocząsteczek wyznacznikowych i w ten sposób potwierdzili jej odmienność od strefy zamykającej, zonula occludens. Poprzez następne lata opisywano subtelną strukturę połączeń szczelinowych i, co ważniejsze, stało się oczywiste, że miejsca

http://rcin.org.pl

342 A. F1ERTAK, W. KILARSKI

niskiego oporu elektrycznego pomiędzy komórkami pobudliwymi odpowiadają po­łączeniom szczelinowym. Te połączenia były strukturalnie identyczne z połączeniami między wieloma innymi typami komórek i zostały nazwane synapsami elektrycznymi lub połączeniami elektrycznymi. Loewenstein i Kanno [69*] odkryli fascynujące zjawisko przemieszczania się barwnika z komórki nim zabarwionej do kom órek przyległych, co podniosło znaczenie czynnościowe połączeń szczelinowych. We wczesnych badaniach nad połączeniami szczelinowymi zauważono, że połączone komórki nowotworowe zachowują się odmiennie. Loewenstein [69*] dowiódł, że ich połączenia przenoszą barwniki, mają niski opór elektryczny, ale nie wiążą m e­tabolicznie komórek. Później wiele badań skupiało się nad tym generalnym pro­blemem, jak opisać zależność pomiędzy zdolnością do przepływu barwników, oporem elektrycznym i występowaniem połączeń w komórkach nowotworowych.

Używając neutralnych i negatywnie naładowanych związków o różnych masach cząsteczkowych, Simpson [69*] ocenił największą cząsteczkę mogącą przechodzić z jednej komórki gruczołu ślinowego larw ochotkowatych, Chironomus do drugiej na około 1158 daltonów (D). Masa cząsteczkowa substancji zastosowanej w tym doświadczeniu dobrze odpowiada średnicy kanału wynoszącej 1,4 nm. Obok sub­stancji syntetycznych, zastosowanych do badań nad przepuszczalnością połączeń szczelinowych uwzględniano przede wszystkim związki fizjologicznie występujące w komórce. Stwierdzono, że aminokwasy, cukry, nukleotydy - Pederson [69*], przekaźniki drugiego rzędu jak cAMP - Tsien i Weingart [69*] oraz Ca“+ [9,17] są przede wszystkim transportowane przez połączenia szczelinowe. M etaboliczne i elektryczne połączenie komórek we wspólną "sieć tkankową" stało się podstawą do zrozumienia skomplikowanych zależności w systemach komórkowych.

2. STRUKTURA I SKŁADANIE KANAŁÓW POŁĄCZEŃSZCZELINOWYCH

2.1. Budowanie bloków połączeń szczelinowych: koneksynyPołączenia szczelinowe są ewolucyjnie konserwatywnymi strukturami, w których

różne typy koneksyn wykazują około 59% homologii. Beyer [69*] przedstawił topologiczne modele koneksyn 32 i 43, z uwzględnieniem identycznych sekwencji aminokwasowych, w odniesieniu do pozycji w błonie komórkowej.

W spólną cechą rodziny koneksyn są cztery regiony śródbłonowe i dwie pętle zewnątrzkomórkowe. Domeny cytoplazmatyczne reprezentują regiony specyficzne dla różnych typów koneksyn (rys. 1). Co prawda dotychczas sklonowano 12 koneksyn [3], np. kurzą koneksynę 56 i owczą MP70 [60] czy koneksynę 43 [3,51], to jednak wiele zależności między nimi jest wciąż niejasne. Zaproponowano, że białko zwane

http://rcin.org.pl

PO Ł ĄC Z EN IA S Z C Z E L IN O W E 343

Rys. 1. M odel m olekularny obrazujący przestrzenne rozm ieszczenie cząstek koneksyny budujących dwa hydrofilow e półkanały - koneksony, które tworzą jeden, transm em branowy kanał połączenia szczelino­wego. Każda z sześciu podjednostek białkowych składa się z jednej cząsteczki koneksyny, która czterokrotnie przechodzi przez błonę kom órkową. Domeny 1 i 2 oraz 3 i 4 tworzą m iędzykom órkow e pętle połączone wiązaniem dwusiarczkowym . Domena 3 - hydrofilowa, tworzy jedną z sześciu polarnych

vvyściółek kanału koneksonu. Oba końce cząsteczki N i C znajdują się w cytoplazm ie komórki

duktyną jest częścią składową plazmodesm komórek roślinnych [20]. Dukty na wydaje się być identyczna z 16 kDa białkiem wyizolowanym wspólnie z połączeniami szczelinowymi z mózgu wołu przez Dermietzela [69*]. To białko najprawdopo­dobniej wchodzi w skład wakuolarnej H+-ATPazy, szeroko rozpowszechnionej w królestwie zwierząt [4].

Obok znacznego stopnia homologii różnych koneksyn kręgowców, sekwencje jednego typu koneksyn wykazują w wielu przypadkach podobieństwa międzyga- tunkowe: dla przykładu, koneksyna 43 Xenopus, kury, człowieka, myszy i krowy w zestawieniu z koneksyną 32 szczura czy koneksyną 30 żaby [3]. Co więcej, Herzberg i Skibbens [69*] wykazali, że przeciwciała dla koneksyny 27 występującej w wątrobie szczura wiązały się z odpowiednimi antygenami wątroby ssaków, ryb i ptaków.

http://rcin.org.pl

344 A. F IERTAK, W. KILARSKI

Porównanie rozwijającego się ptasiego systemu sercowonaczyniowego z jego ssaczym odpowiednikiem pozwoliło odkryć obecność koneksyny 43 w obu tych systemach. Badane tkanki ujawniły jednak różne właściwości elektrofizjologiczne. Ta niezgodność może być związana z dominacją innej koneksyny, 42 tzw. ptasiej, w sercu ptaków i faktem, że ekspresja koneksyny 43 jest ograniczona do spe­cyficznych miocytów [44]. Stąd, chociaż jeden typ koneksyn pojawia się w po­równywalnych narządach czy tkankach, to koegzystencja z innymi koneksynami i zależności ilościowe mogą determinować czynnościowe własności kanałów.

Geny kodujące różne koneksyny mogą być zlokalizowane na jednym lub wielu chromosomach. Geny koneksyn 37 i 40 znaleziono na ludzkim chromosomie 1 [68], a geny kodujące koneksynę 26 i 46 znaleziono odpowiednio na ludzkim chro­mosomie 13 [68] i na szczurzym chromosomie 14 [21 ]. Podobnie, geny dla koneksyn 31.3 i 30.3 zostały zlokalizowane na mysim chromosomie 4 [24], a dla koneksyn 37 i 31.1 na szczurzym chromosomie 4 [21]. Bliskie sąsiedztwo genów dla różnych koneksyn może sugerować podobieństwa we wzorach ekspresji i funkcji, co za­proponowano dla koneksyny 31.1 i 30.3 [24], a także dla koneksyny 37 i 40 [25,68]. Jednakże, nie stwierdzono korelacji między kolokalizacją i koekspresją dla ludzkiej koneksyny 26 i 46 [68].

W ten sposób, (1) podobieństwa różnych typów koneksyn, (2) podobieństwa jednego typu koneksyny różnych gatunków i (3) kolokalizacja genów koneksyn i wzory ich ekspresji mogłyby być wspólnymi kryteriami charakteryzującymi różne ich typy.

W jednej komórce jest możliwa ekspresja kilku różnych koneksyn. Na przykład, w mysich keratynocytach odkryto ich 5 typów [23], a w komórkach śródbłonka dwa, 37 i 43 [56]. Dwie koneksyny mogą występować także w obrębie jednego zespołu połączeniowego (połączenie heterotypowe), np. koneksyny 26 i 32 w he- patocytach [36] czy koneksyny 43 i 26 w komórkach epidermalnych [57]. Po mi- kroiniekcji odpowiednich transkryptów koneksyn, do oocytu Xenopus stwierdzono, że koneksyny 32 i 43 budują kanał heterologiczny [65]. Tak więc, na poziomie komórkowym różnorodność połączeń szczelinowych może być wzmocniona przez ekspresję różnych koneksyn i formowanie kanałów heterologicznych. Wciąż do końca nie wiadomo, czy różne koneksyny mogą tworzyć koneksony heterooligome- ryczne (heteroheksamery). Jednakże w badaniach nad połączeniami szczelinowymi w komórkach epidermalnych szczura Risek [57] dostarczył dowody na obecność homooligomerycznych koneksonów w połączeniach heterotypowych (rys. 2).

Studia nad rekonstytucją i biofizyczną charakterystyką kanałów połączeń szcze­linowych dostarczyły dowodów na to, że przewodność pojedynczego kanału, w zależności od typu koneksyny, z której jest on zbudowany, waha się pomiędzy 20 a 200 pico Siemensów (pS) [62]. W ielka różnorodność koneksyn obecnych w jednej komórce może być zatem systemem regulującym efektywność komunikacji między komórkami. Wyniki badań nad systemami modelowymi sugerują, że naj-

http://rcin.org.pl

PO Ł ĄC Z EN IA S Z CZ E L IN O W E 345

Rys. 2.. Schemat czterech kanałów połączeń szczelinowych o czterech możliwych kom pozycjach cząsteczkow ych dwóch typów koneksyn, każdy z koneksonów składa się z sześciu podjednostek białkow ych - koneksyn, które m oga być identyczne lub m ieszane: A - hom om eryczne, hom otypow e;B - heterom eryczne, hom otypow e; C - hom omeryczne, heterotypowe; D - heterom eryczne, heteroty

ważniejszą rolę w dopasowywaniu różnych typów koneksyn pełnią ich drugie domeny zewnątrzkomórkowe [66,67] (rys. 1). W erner udowodnił, że komórki tkanek Xenopus, produkujące koneksynę 38 mogą tworzyć połączenia z komórkami produkującymi szczurzą koneksynę 43, lecz nie z sąsiadującymi komórkami, w których ulega eks­presji koneksyna 32 [69*]. Teoretycznie, ten sposób łączenia zezwalałby na ko­munikację z pewnymi komórkami sąsiadującymi, a blokowałby łączność z innymi [21]. W włóknach Purkinjego ekspresji ulega koneksyna40, a w miokardium komory głównie koneksyna 43. Obie te izoformy nie mogą jednak tworzyć połączeń szcze­linowych, co być może stanowi o unikalnych właściwościach elektrycznych obu rejonów serca [7]. Obserwacje nad komórkami ścian naczyń krwionośnych zwróciły uwagę na fakt, że generalnie produkują one koneksynę 43. Każdy jednak z typów komórek ma dodatkowo inny rodzaj koneksyny, komórki endotelialne koneksynę 37, a komórki mięśniówki gładkiej koneksynę 40. Taki wzór ekspresji powoduje, że komórki te mogą wchodzić w specyficzne, indywidualne interakcje [56]. Innym przykładem może być różnicowanie się keratynocytów, podczas którego następuje kolejno zmiana jakościow a w ekspresji koneksyn. Koneksyny 26 i 43 są zastępowane przez koneksyny 31 i 31.1 [5]. Wiąże się to ze zmianami w przepuszczalności kanałów, co wyraża się spadkiem przenikania przez połączenia szczelinowe czą­steczek barwnika (żółcieni lucyferowej), pomimo że komórki pozostają nadal po­łączone elektrycznie [5].

2.2. Składanie koneksonówPołączenia szczelinowe są płytkami zbudowanymi z setek i tysięcy kanałów

wiążących przestrzeń między ściśle przylegającymi komórkami. Jako pierwszy stru­kturę pojedynczego kanału opisał Caspar [69*]. Każdy kanał składa się z dwóch koneksonów. Koneksony z kolei są kompleksami sześciu identycznych podjednostek będących białkami integralnymi błon - koneksynami (rys. 1).

W procesie translacji białek integralnych błony produkt wbudowuje się w pier­wszym etapie do błony ziarnistej siateczki śródplazmatycznej. Wydaje się to również prawdopodobne dla koneksyn, odkąd studia nad frakcjami subkomórkowymi wy­

http://rcin.org.pl

346 A. FIERTAK, W. KILARSKI

kazały ich obecność w błonach siateczki [18,53]. Jednakże, w przeciwieństwie do eksperymentów nad innymi białkami błonowymi, wstawieniu in vitro koneksyn przy użyciu błon mikrosomalnych, uzyskanych z trzustki psa, towarzyszyła błędna obróbka tych białek przez peptydazę sygnałową [18]. Polegała ona na przecięciu łańcucha białkowego przez peptydazę w obrębie sekwencji koneksyny, co normalnie w komórkach nie zachodzi. Podobną obróbkę obserwowano w różnych typach ko­mórek transfekowanych cDNA dla koneksyn, które wykazywały wysoki poziom ekspresji koneksyn [18], co sugeruje, że w normalnych warunkach błędna obróbka występuje wówczas, gdy zostanie przekroczony pewien poziom ekspresji koneksyn. Jak dotąd nie zostało wyjaśnione, czy w procesie wbudowywania się do błony i zwijania się cząsteczki koneksyny w środowisku hydrofobowym błony biorą udział białka ochronne, które stabilizują ich strukturę i zapobiegają przecinaniu, czy też komórka używa procesu cięcia jako mechanizmu regulującego syntezę lub kon­trolującego jakość koneksyn.

Badania nad procesami translacji oraz inkorporacji koneksyn do błon unaoczniły dwie istotne różnice między białkami połączeń szczelinowych, a innymi białkami integralnymi błon. Po pierwsze, mają one znacznie krótszy okres półtrwania, po drugie wydają się być składane w przedziale trans aparatu Golgiego [45], w prze­ciwieństwie do innych białek integralnych, których składanie zachodzi, jak ustalili Hurtley i Helenius [69*], w ziarnistej siateczce śródplazmatycznej. Postretikularne składanie koneksyn jest możliwe w późnych etapach transportu do błony dzięki wysokiej ich zawartości w aparacie Golgiego, co faworyzuje oligomeryzację. Ko­neksyny są zatem akumulowane w aparacie Golgiego in vitro [2] i prawdopodobnie in vivo [22]. Zaproponowano nawet, że koneksony są składane dopiero po wbu­dowaniu w błonę [53]. Późne składanie białek połączeń szczelinowych może prze­ciwdziałać tworzeniu się wewnątrzkomórkowych połączeń szczelinowych, np. pomiędzy błonami organelli [45]. Po oligomeryzacji koneksonów w przedziale trans aparatu Golgiego, mogłyby one być natychmiast transportowane do miejsc doce­lowych w błonie komórkowej.

Z drugiej strony istnieją dane wskazujące, że tworzenie oligomerów następuje już w ziarnistej siateczce śródplazmatycznej, co pokazał Kumar [34,35] badając komórki transfekowane koneksyną 32. Co prawda jeszcze nie wiadomo, czy oli- gomeryzacja w ziarnistej siateczce śródplazmatycznej może też zachodzić w ko­m órkach nietransfekowanych, lecz badania frakcji subkomórkowych wątroby szczura zdają się potwierdzać tę możliwość [18,53].

Odnalezienie koneksonów w komórkach nie tworzących połączeń szczelinowych w warunkach fizjologicznych, takich jak sarkoma S 180 czy fibroblasty L929, skłania do przypuszczeń, że międzykomórkowe połączenia adhezyjne czy fosforylacja ko­neksyn nie są warunkiem niezbędnym do budowy koneksonów [45]. Youngowi [69*] udało się wbudować połączenia szczelinowe do błony, lecz nie zdołał określić, czy 27 kDa białka istniały jako pojedyncze oligomery (półkanały) czy jako dwu­

http://rcin.org.pl

PO Ł ĄCZ EN IA SZ CZ E L IN O W E 347

dzielne oligomery (kompletne kanały). W każdym razie dane elektrofizjologiczne sugerują, że niesparowane koneksony mogą istnieć w błonie komórkowej [13]. Przy zastosowaniu specjalnych warunków eksperymentalnych, tj. wysokiego stężenia soli, wysokiego pH, substancji redukującej i detergentów, wyizolowano koneksony z połączeń szczelinowych wątroby [64]. Analiza spektralna tych koneksonów wy­kazała wyraźną przewagę symetrii heksagonalnej i średnicę około 8 nm, czego spodziewali się już Unwin i Zampighi [69*] analizując trójwymiarowe mapy po­łączeń szczelinowych. Obserwowana przy pomocy mikroskopu elektronowego fra­kcja połączeń szczelinowych izolowanych z wątroby szczura pozwoliła określić bliżej ich strukturę. Koneksony wydawały się być mniejsze, 4 -6 nm średnicy, w porównaniu z wynikami Staufera [64] oraz Unwina i Zampighiego. Odległość między środkami kanałów Hoh [69*] określił na 9,1 nm, a koneksony wystawały na 0,4-0,5 nm z powierzchni płytki. Sikerwar [69*] pokazał, że natywna struktura krystali­cznych, heksagonalnie upakowanych koneksonów owadów wykazuje podobne od­leg łości pom iędzy środkam i kanałów (8,5 nm) jak w przypadku połączeń szczelinowych z wątroby szczura i myszy. Trójwymiarowy obraz powierzchni przed­stawił koneksony jako anularne oligomery wystające na 3,0-4,5 nm do cytoplazmy. Kanał miał szerokość 4-4,5 nm w regionie zewnątrzkomórkowym.

Jak do tej pory, nie jest jasne, czy koneksony mogą być wbudowane w błonę kom órkową jako półkanały, a jeśli tak, czy mogą funkcjonować one jako prze­puszczalne dla wody kanały łączące komórkę z przestrzenią zewnątrzkomórkową. Musil i Goodenough [45] stwierdzili, że półkanały są najprawdopodobniej za­mknięte. Połączenia szczelinowe, jak wiele kanałów jonowych, są zależne od na­pięcia, chociaż stopień tej zależności zmienia się wraz z typem koneksyn [62]. Należy jednak zauważyć, że ciężar biologiczny tej zależności wciąż wymaga wy­jaśnienia. Co ciekawsze, koneksynom brakuje charakterystycznej sekwencji ami­nokwasów noszących ładunek elektryczny, która jest specyficzna dla typowych białek kanałowych bramkowanych napięciem, budujących np. kanały wapniowe czy sodowe.

2.3. Tworzenie się kanałów międzykomórkowych z dwu półkanałówObecność połączeń szczelinowych nie tylko implikuje wbudowanie koneksyn

do błony, ale także tworzenie całych kanałów. Komórki tworzące połączenia szcze­linowe in vivo tracą swoją integralność po zastosowaniu procedur izolacyjnych, chociaż półkanały pozostają w błonie nienaruszone. Jednakże, półkanały w izo­lowanych komórkach nie mogą być identyfikowane przez technikę mrożenia i łamania (freeze-fracture), ponieważ typowy obraz grup koneksonów na powierzchni E (Ex­ternal) znika przez boczną dyspersję wywołaną rozłączeniem kanałów (fot. 2).

W ytworzenie przeciwciał skierowanych przeciwko rozmaitym typom koneksyn pozwoliło na badania zachowań się kanałów połączeń szczelinowych w różnych

http://rcin.org.pl

348 A. FIERTAK, W. KILARSKI

Fot. 2. Replika płytki połączenia sz c ze lin o w eg o z m ięśn iów ki m acicy myszy. Próbkę z m ięś­niówki pobrano w ostatnim dniu ciąży (20 dzień). Zam rożony w ciekłym azocie fragm ent tkanki poddano rutynowej procedurze krio-rytow niczej i fo tografow a­no w m ikroskop ie e lek tro n o ­wym. C harakterystyczne, regu­larne ułożenie blisko siebie sku­pionych, okrągłych struktur - koneksonów w yróżnia połącze­nie szczelinowe od pozostałych elem entów błony kom ór- kowej: E (Externum) - cześć zew nętrz­na błony kom órkow ej, P (P las­ma) - c z ę ś ć w e w n ę tr z n a , docytoplazm atyczna błony ko­mórkowej (powiększenie około 200.000)

warunkach doświadczalnych i fizjologicznych komórek (fot. 3). Spray [69*] i Young [69*] badali własności elektryczne połączeń szczelinowych po wbudowaniu ich w sztuczną dwuwarstwową błonę lipidową. Przeciwciała skierowane przeciwko głównemu 27 kD białku blokowały przewodność kanałów. Z dowodów immuno- cytochemicznych Younga [69*], jak i elektrofizjologicznych Hertzberga [69*] wy­nika, że przeciwciała rozpoznają epitopy po cytoplazmatycznej stronie koneksonu. W ywołana przeciwciałami redukcja przewodności połączeń szczelinowych o przy­najmniej 90% skłoniła Spraya [69*] do wniosku, że prąd przepływa raczej przez całe kanały niż półkanały. Redukcja przewodności o więcej niż 50% może być wyjaśniona tylko wtedy, gdy domeny cytoplazmatyczne mogą być rozpoznane przez przeciwciała niezależnie od orientacji sztucznej dwuwarstwowej błony lipidowej w pipecie rejestrującej. Young [69*] nie zdołał określić, czy wbudowane białka istnieją jako oligomery czy kompletne kanały. W eksperymencie zaprojektowanym przez tegoż autora stopień, o jaki przeciwciała redukowały przewodność kanału wahał się między 30 a 90%. Ponadto w kilku, lecz nie we wszystkich, ekspe­rymentach miejsca wiążące przeciwciała znajdowały się po obu stronach sztucznej błony.

Koneksony wymagają stabilizacji przez lipidy [41], a w szczególności przez cholesterol, co zwiększa stopień asocjacji połączeń szczelinowych w komórkach hepatomy Novikoffa [43]. Te badania nad wpływem lipidów na komunikację przez połączenia szczelinowe sugerują znaczenie lipidowego mikrośrodowiska obu pół- kanałów dla funkcjonalnej integralności kompletnych kanałów.

http://rcin.org.pl

POŁ ĄC Z ENIA S Z C Z E L IN O W E 349

Fot. 3. Przekrój podłużny przez m ięsień sercow y szczura traktowany prze­ciw ciałam i skierow any­mi przeciw koneksynie 43. T echnika im m unocy- to c h e m ic z n a p o z w a la zlokalizow ać białka, ko­nek sy n ę 43, k tó ra je s t podstaw ow ym sk ładn i­kiem połączeń szczelino­wych zlokalizow anych w tym przypadku w okolicy d y sk ó w in te rk ala rn y ch łączących i spinających m iocyty serca. Podobną tech n ik ę , z zas to so w a­niem przeciw ciał skiero­w a n y c h p rz e c iw k o różnym typom koneksyn m oża zastosować do in­nych tkanek np. macicy, w ątroby itp. Pow iększe­nie 800

Siły wiążące półkanały w płaszczyźnie błony komórkowej są stabilizowane raczej przez wiązania wodorowe niż kowalencyjne. Dwie pętle zewnątrzkomórkowe ele­mentarnej jednostki białkowej koneksonu, koneksyny (rys. 1) są połączone we- wnątrzcząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym [27]. Te wiązania są niezbędne dla przestrzennej stabilizacji łańcucha białkowego i, w rezultacie, dla poprawnego ułożenia całego kanału w szczelinie międzykomórkowej. Manjunath i Page [69*] nie potrafili natomiast wykazać obecności międzycząsteczkowych wiązań dwusiar- czkowych, między dwoma półkanałami, co sugeruje, że integralność kompletnego dodekameru jest utrzymywana przez niekowalencyjne wiązania wodorowe. Eks­perymenty Barra [69*] wykorzystujące hypertoniczne roztwory, 0.5 M dwucukry lub 8 M mocznik do dysocjacji komórek w obrębie połączeń szczelinowych mogą posłużyć za dowód w powyższych rozumowaniach. Peracchia i Peracchia [69*] również wykorzystali tę metodę do uwidocznienia prawdziwej zewnętrznej po­wierzchni błony w obrębie połączenia i zaprezentowali zewnątrzkomórkowe fi- lamenty, które miały wiązać ze sobą koneksony. Mi Iks [69*] i Goodenough [69*] również używali rozbitych połączeń szczelinowych do zademonstrowania specy­ficznych miejsc wiążących przeciwciała skierowane przeciwko różnym sekwencjom łańcucha polipeptydowego koneksyn. Podczas, gdy obserwowane w mikroskopie elektronowym, sprzężone ze złotem przeciwciała skierowane przeciwko cytopla-

http://rcin.org.pl

350 A. FIERTAK, W. KILARSKI

zmatycznym domenom koneksyny znakowały zarówno nietknięte, jak i rozbite po­łączenia szczelinowe. Przeciwciała skierowane przeciwko sekwencjom aminokwa- sowym pętli zewnątrzkomórkowych polipeptydu znakowały tylko połączenia rozbite. W studiach nad oczyszczaniem kanałów z izolowanych połączeń szczelinowych wątroby Staufer [64] nie mógł otrzymać oddzielnych dodekamerów, ponieważ dy­socjują one do pojedynczych heksamerów. Jednakże jeśli oczyszczone koneksony inkubuje się w obecności 4% glikolu polietylenowego 2000 w temperaturze 4°C czy w obecności 10% glikolu polietylenowego 2000 w temperaturze 15°C, koneksony tworzą odpowiednio filamenty i krystaliczne warstwy. Był to dowód na to, że koneksony mogą rosnąć przez asocjację końca z końcem, lecz także, w zmienionych warunkach, przez asocjację boczną. Jak zostało pokazane przez Kistlera i Bullivanta [69*] oraz M anjunatha i Page’a [69*] koneksyny komórek włókien soczewki i mięśnia sercowego mogą być zachowane jako sparowane jednostki pomimo procedur solubilizujących. M azet [42] solubilizował połączenia szczelinowe koneksyny 32 z wątroby szczura i wprowadzał je do proteoliposomów. Badania te wykazały, że do błony komórkowej wbudowują się raczej całe kanały niż półkanały (koneksony). Istnienie heterologicznych połączeń szczelinowych (połączenia między różnymi ty­pami komórek syntetyzujące różne koneksyny) wymaga rozpoznania obszarów w zewnątrzkomórkowych domenach pętli koneksyn (rys. 1).Stabilność sekwencji ami- nokwasowych w tych domenach była prezentowana kilkakrotnie [3]. Pomimo tych właściwości występujących we wszystkich zbadanych do tej pory koneksynach i niekowalencyjnej natury wiązań międzycząsteczkowych [27], siła wiązań pomiędzy dwoma półkanałami wydaje się być tkankowo specyficzna. W każdym razie, domeny zewnątrzkomórkowe zdają się być konieczne dla tworzenia kanałów [35]. M imo to, żaden typ koneksyn nie jest związany wystarczająco silnie w obrębie szczeliny aby uniemożliwić przecięcie połączenia na dwa półkanały podczas procesu mrożenia i łamania.

Podstawowe pytanie, dlaczego koneksony w komórkach izolowanych nie są utrzy­mywane w grupach i jak powstają grupy koneksonów w czasie tworzenia połączeń szczelinowych, nie znajduje wystarczającej odpowiedzi w stwierdzeniu, że jest to spowodowane oddziaływaniem pomiędzy półkanałami w błonach sąsiadujących ko­mórek. Najprawdopodobniej wiązania wodorowe między półkanałami są warunkiem koniecznym do stabilizacji pojedynczego kanału spajającego komórki, lecz nie wy- jaśniajają, w jaki sposób tysiące sparowanych koneksonów tworzy połączenie szcze­linowe. W ogóle, wszystkie rozważania nad strukturalno-funkcjonalnymi relacjami w połączeniach szczelinowych uwzględniające odległości między koneksonami na­leży rozpocząć od stwierdzenia zależności wyników od procedur preparacyjnych. Raviola [69*] oraz Miller i Goodenough [69*] utrzymują, że utrwalanie tkanek powoduje dramatyczny wzrost upakowania koneksonów w połączeniach szczeli­nowych. W omawianych eksperymentach, procedura utrwalania jest zawsze podobna, a zatem nie może ona wpływać zasadniczo na różnice w gęstości koneksonów.

http://rcin.org.pl

PO Ł ĄCZ EN IA S Z C Z E L IN O W E 351

Jeśli bierze się pod uwagę agregujący wpływ glutaraldehydu, wszelkie dyspersje koneksonów są w rzeczywistości większe niż na replikach. Jednakże, Hoh [69*], który w studiach nad izolowanymi połączeniami szczelinowymi z wątroby używał mikroskopu elektronowego, nie był w stanie zaobserwować żadnych zmian w ich morfologii po utrwaleniu w glutaraldehydzie. Risek [57] próbował skorelować obe­cność agregatów ściśle i luźno upakowanych koneksonów w jednym połączeniu szczelinowym z heterotypowością połączenia (różne koneksyny w populacji pół- kanałów w obrębie jednej płytki połączeniowej). Zatem różne izoformy koneksyn byłyby odpowiedzialne za różne odległości między koneksonami.

M anjunath i Page [69*] analizowali połączenia szczelinowe z serca i wątroby na obecność połączeń dwusiarczkowych między koneksonami solubilizując błony komórkowe w deoksycholanie sodu i rozbijając wiązania dwusiarczkowe 2-mer- kaptoetanolem. Wynik ich doświadczeń był zaskakujący. Odkryli bowiem, że w połączeniach szczelinowych serca, w przeciwieństwie do wątroby, koneksony tworzą grupy pośrednie - międzypodjednostki i że istnieją międzykoneksonowe wiązania dwusiarczkowe. Swoje wyniki tłumaczyli różnymi obciążeniami mechanicznymi komórek serca i wątroby. Kardiomiocyty ciągle są narażone na działanie sił roz­ciągających w płaszczyźnie błony. Zatem ich skurcz wymaga szczególnie wysokiego stopnia stabilizacji i zaczepienia składowych połączeń szczelinowych w błonie, co wydaje się mniej istotne w przypadku wątroby. Nie tylko typy koneksyn w nich występujące różnią serce i wątrobę, ale i struktura powierzchni cytoplazmaty- cznych. Braun [69*] na podstawie statystyczno-mechanicznej analizy replik po­łączeń szczelinow ych w ątroby postulow ał, że agregaty koneksonów nie są utrzymywane przez siły przyciągające między koneksonami w płaszczyźnie błony, lecz przez minimalizację siły odpychającej między przylegającymi błonami. Po­łączenie koneksonów w poprzek przestrzeni międzykomórkowej wymaga przezwy­ciężenia sił elektrostatycznych. Energia potrzebna na przezwyciężenie odpychania jest minimalizowana przez zmniejszenie powierzchni ścisłego przylegania błon. Ponieważ ucieczka pojedynczych koneksonów z płytki połączenia szczelinowego zwiększa powierzchnię ścisłego przylegania zapewniającą siłę motoryczną dla ko­hezji, ten model zakłada wolne mchy boczne koneksonów w błonie i niezależność od cytoszkieletu. Rzeczywiście Hirokawa i Heuser [69*] oraz Shibata [69*] uwi­docznili powierzchnię cytoplazmatyczną połączeń szczelinowych w komórkach wą­troby przy zastosow aniu techniki tzw. głębokiego rytowania (cleep-etching) i stwierdzili, że jest ona pozbawiona miejsc przyczepu dla elementów cytoszkieletu. Z drugiej strony istnieją prace demonstmjące zmianę struktury połączeń szczeli­nowych pod wpływem inhibitorów cytoszkieletowych. Powstaje zatem pytanie, czy interakcje połączenia szczelinowe - cytoszkielet mają miejsce, czy też nie, podczas dynamicznych zmian w połączeniach.

http://rcin.org.pl

352 A. FIER TA K , W. KILAR SK I

3. POŁĄCZENIA SZCZELINOWE I ICH MOLEKULARNE ŚRODOWISKO

3.1. Interakcje pomiędzy koneksonami a cytoszkieletemDobrze znana obserwacja, że na replikach połączenia szczelinowe są stale zwią­

zane z powierzchnią P (Plasma), przynajmniej w tkankach kręgowców, sugeruje iż koneksony mogą być zakotwiczane w podbłonowej cytoplazmie. Związanie z powierzchnią P jest niezależne od tego, czy komponenty cytoplazmatyczne są obecne przy powierzchni cytoplazmy czy też nie [54]. Istnieje tylko jeden wyjątek opisany u kręgowców [39]: połączenia szczelinowe w włóknach soczewki myszy w części są związane z powierzchnią E. W tkankach niektórych bezkręgowców, takich jak skorupiaki czy owady, Bosch [69*] pokazał połączenia szczelinowe związane z powierzchnią E (Ekstracelnlar). Dla kontrastu w tkankach dżdżownicy, Eisenia foetida, Hama [69*] opisał cząstki połączeń szczelinowych związanych zarówno z powierzchnią P, jak i E, a połączenia szczelinowe głowonogów, np. Loligo pealei, badane przez Ginzberga [69*], są morfologicznie nierozróżnialne od tych opisanych w tkankach kręgowców (fot. 2)

Większość danych dotyczących interakcji pomiędzy błoną zawierającą połączenia szczelinowe a cytoplazmą pochodzi z badań nad zespołami komórek kręgowców. Rassat [69*] opisał wzrost liczby i rozmiarów połączeń szczelinowych w komórkach wątroby pod wpływem inhibitora mikrotubul - siarczanu winblastyny. Nie był jednak w stanie stwierdzić czy zauważone zmiany wynikają z syntezy de novo białek połączeń szczelinowych, czy też z agregacji istniejących już cząsteczek prekur- sorowych. Tadvalkar i Pinto da Silva [69*] opisali podobne zjawisko, ale tym razem w komórkach nabłonkowych gruczołu prostaty, gdzie gwałtowne powstawanie połączeń szczelinowych następowało pod wpływem kolchicyny i cytochalazyny B i powstawanie to zachodziło nawet w obecności inhibitora metabolizmu, dini- trofenolu czy inhibitora syntezy białek, cykloheksimidu. Na tej podstawie autorzy ci zaproponowali, że prekursory koneksonów znajdują się pod kontrolą elementów cytoszkieletu. W momencie rozbicia tych elementów koneksony migrują i łącząc się tworzą płytki połączeń szczelinowych. Wydaje się prawdopodobne, że tylko w tym ostatecznym miejscu przeznaczenia - płytce połączenia szczelinowego - zachodzi rozpoznanie pomiędzy półkanałami dwóch przylegających komórek, po­nieważ miejsce przylegania występuje tylko w tych rejonach, gdzie, np. na replikach, uwidocznione są grupy koneksonów. Poza połączeniami szczelinowymi odległość między komórkami jest większa, co uniemożliwia tworzenie całych kanałów. Na podstawie powyższych obserwacji można przypuszczać, że poza płytką połączenia szczelinowego istnieje w błonie pula podjednostek koneksonów, lecz jest ona nie­dostępna dla procesu integracyjnego ze względu na zakotwiczenie przez elementy cytoszkieletu. Jednakże różnice czynnościowo-strukturalne pomiędzy komórkami

http://rcin.org.pl

PO ŁĄ C ZEN IA SZ C Z EL IN O W E 353

wątroby, serca, soczewki czy siatkówki, na których te obserwacje prowadzono, uniemożliwiają sformułowanie ogólnych zasad co do roli cytoszkieletu w powsta­waniu połączeń szczelinowych. W połączeniach szczelinowych serca, Shibata i Yamamoto [69*] opisali powierzchnie cytoplazmatyczne wolne od elementów cyto­szkieletu. Hirokawa i Heuser [69*], Shibata [69*] i Kuraoka [36] opisali, że w przeciwieństwie do gładkiej powierzchni połączeń szczelinowych w wątrobie, błony połączeń szczelinowych serca zawierają granularne substruktury wrażliwe na bez- wapniowe roztwory fizjologiczne o wysokim stężeniu K+. Przytoczone wyniki są zgodne z publikowanymi wcześniej obserwacjami Manjunatha [69*]. Autor ten opisał białkową podjednostkę w połączeniach szczelinowych serca, którą można było wyizolować przy użyciu inhibitora proteaz serynowych - fluorku fenylometylo- sulfonylowego. Proteolizowane połączenia szczelinowe serca i połączenia szcze­linowe wątroby bez inhibitora proteazy wykazywały taką samą ultrastrukturę. Badając połączenia szczelinowe serca Kardami [69*] znalazł biochemiczne i ultra- strukturalne dowody na związek zasadowego czynnika wzrostowego fibroblastów (bFGF) z tymi połączeniami. Autor sugeruje, że przeciwciała skierowane przeciwko N-końcowej domenie bFGF rozpoznawały epitopy położone poniżej błony z po­łączeniami szczelinowymi, które mogą być częścią składową "wystrzępionej" otoczki znalezionej w połączeniach szczelinowych serca. Także, w połączeniach szczeli­nowych astrocytów (zbudowanych z koneksyny 43) Yamamoto zademonstrował immunoreaktywność bFGF na poziomie mikroskopu elektronowego. Ponieważ ko- neksyna 43 została zidentyfikowana przez Saeza [69*] jako substrat dla kinazy C, funkcja połączeń szczelinowych złożonych z koneksyny 43 może być regulowana w drodze fosforylacji bFGF.

W badaniach nad połączeniami szczelinowymi serca, techniką mrożenia i łamania, Green i Severs [69*] odkryli, że bruzdy na powierzchni P, płytki połączeniowej, które nie miały swoich odpowiedników na powierzchni E, miały bezpośredni zwią­zek z połączeniami szczelinowymi i występowały jedynie w kilka minut po śmierci komórki, kiedy można się było spodziewać jej reorganizacji. Sugerowano, że bruzdy te odzwierciedlają miejsca przyczepu cytoszkieletu do koneksonów podczas lub po ich przemieszczeniu się w błonie. Page [69*] wykazał, że perfuzja seca roztworem zawierającym Ca2+ powoduje, rozproszenie kilku koneksonów poza płytkę w po­łączeniach szczelinowych. Obserwacja ta usprawiedliwia przypuszczenie o reor­ganizacji błon w miejscach połączeń szczelinowych, w której uczestniczą elementy cytoszkieletu. Jednakże, w obrębie samych połączeń szczelinowych gęstość ko­neksonów, w kilka minut po śmierci komórki, zmienia się mniej dramatycznie, niż możnaby się było tego spodziewać, gdyby filamenty były aktywne w reorganizacji ich powierzchni. Konfiguracja koneksonów w połączeniach szczelinowych serca, dyskutowana przez Greena i Seversa [69*], ulega zmianie w zależności od czasu, jaki upłynie od momentu śmierci zwierzęcia do utrwalenia tkanki. Regularne upa­kowanie heksagonalne, obserwowane przy natychmiastowym zamrożeniu tkanki

http://rcin.org.pl

354 A. FIER TA K , W. KILARSKI

po śmierci zwierzęcia, zmienia się na mniej regularne, jeżeli zamrażanie nastąpi po upływie 20-40 min po śmierci zwierzęcia. W roku 1983 Page zaobserwował zmniejszenie się gęstości koneksonów w połączeniach szczelinowych serca po per- fuzji roztworem Ca~+. Przeciwnie, Dahl i Isenberg [69*] oraz Déléze i Hervé [69*] stwierdzili zmniejszenie się odległości między koneksonami po rozłączeniu komórek serca odpowiednio dihydrołabainą i heptanolem, a de Maziére i Scheuermann [69*] opisali wzrost gęstości koneksonów po hipoksji izolowanego serca szczurzego. Ber- nardini [69*] zademonstrował 14% spadek w międzykoneksonalnych odległościach w komórkach trzustki po zadziałaniu heptanolem. Peracchia i Girsch [69*] uważają, że obie procedury rozłączające powodują wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia. Zasugerowali zatem, że kalmodulina bierze udział w zależnym od wapnia mechanizmie rozłączania komórek, zajmując miejsca wiążące po stronie cytoplazmatycznej między C i N końcem koneksyn. Zmiany konformacyjne powinny iść w parze ze zmniejszeniem odległości między koneksonami. To przypuszczenie jest zgodne z pracami Chuanga [69*] oraz Unwina i Ennisa [69*] opisującymi wzrost gęstości koneksonów po poddaniu komórek procesowi dysocjacji. Jednakże, większość danych dotyczących odległości między koneksonami, a pochodzących z doświadczeń nad łączeniem i rozłączaniem komórek dotyczy jedynie niewielkich zmian rzędu 1 nm. W świetle krytycznych rozważań metodologicznych [54] można zapytać, czy odległości mniejsze od 1 nm mogą być rzetelnie mierzone przy za­stosowaniu technik replikacyjnych. Rzeczywiście Miller i Goodenough [69*], za­przeczają istnieniu różnic w upakowaniu koneksonów w rezultacie ekspery­mentalnych zmian w przewodności połączeń. Z drugiej zaś strony w ostrym kontraście do poprzednich odkryć we wszystkich innych, badanych do tej pory systemach, fizjologiczne i odwracalne zmiany w gęstościach koneksonów komórek poziomych siatkówki ryb są znacząco większe. Tutaj średnia zmiana w odległościach pomiędzy koneksonami waha się w granicach 20-40 nm [37].

W połączeniach szczelinowych zewnętrznych komórek poziomych siatkówki ka­rasia (Carassius auratus), Kurz-Isler i Wolburg [69*] opisali szybkie zmiany w zagęszczeniu koneksonów pod wpływem zmian warunków oświetlenia. W ciemności gęstość ta wynosiła 7000-8000 koneksonów/pm"; po adaptacji w świetle czerwonym spadła do 3000/pm 2. Poza tym podczas adaptacji w ciemności większość połączeń szczelinowych miała małe rozmiary i była podścielona elektronowo gęstym ma­teriałem. W wielu przypadkach był on związany z mikrotubulami i mikrofilamentami. W ystępowanie materiału elektronowo gęstego pod zagęszczonymi koneksonami po­łączeń szczelinowych w czasie długo trwającej adaptacji do ciemności przemawia na korzyść funkcjonalnych zależności pomiędzy cytoszkieletem i koneksonami. W krótkotrwałych eksperymentach, po zaledwie parę minut trwającej ekspozycji na światło czerwone, autorzy zaobserwowali, na ultracienkich skrawkach, łatkowaty wzór ułożenia materiału osmofilnego, który przypominał wzór grup koneksonów na odpowiadających im replikach. Zasugerowali oni, że koneksony w obrębie grupy

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 355

są ściślej związane z cytoszkieletem. Jednakże inne wyjaśnienia nie mogą być wykluczone. Obszary błony pomiędzy grupami koneksonów są tego samego rzędu wielkości co same grupy, jak i elektronowo gęste płytki. Dlatego, zagadnienie, która część połączenia szczelinowego jest związana z elektronowo gęstym materiałem nie jest ostatecznie wyjaśnione. Schimitz i Wolburg [69*] pokazali, że gęstość koneksonów w połączeniach szczelinowych zewnętrznych komórek poziomych siat­kówki karasia hodowanych in vitro jest wrażliwa na różne wartości pH. W pH 6.5 gęstość wynosiła 8000-9000 koneksonów/pm", w pH 7,1 6000-7000/pm “, a w pH 7,5 około 4000/pm 2. Najsilniej upakowane koneksony występowały w są­siedztwie związanego z błoną materiału elektronowo-gęstego. Materiał ten znikał w wyższych wartościach pH. Niezależnie od fizjologicznego stanu połączenia ko­mórek, reprezentowanego przez wysoką lub niską gęstość koneksonów w komórkach poziomych siatkówki, rezultaty Kurz-Islera i Wolburga [69*] oraz Schimitza i Wol- burga [69*] niezmiennie pokazują współzależność wysokiej gęstości koneksonów z ich połączeniem z cytoszkieletem. Duże zagęszczenie koneksonów wydaje się występować w obecności osmofilnego materiału cytoplazmatycznego. Z drugiej zaś strony interesujące jest, że Vaughan i Laster [69*] nie byli w stanie rozłączyć elektrycznie rybich komórek siatkówki przez poddanie ich działaniu cytochalazyny D, która depolimeryzuje F-aktynę. Jeśli łączenie systemów komórkowych ma miejsce przy dużym zagęszczeniu koneksonów, co zasugerowali Kurz-Isler i Wolburg [69*] oraz Kurz-Isler [37], to F-aktyna nie jest w tym przypadku odpowiedzialna za utrzymanie tej gęstości. Niestety nie ma dostępnych danych immunocytochemicznych czy też danych uzyskanych przy zastosowaniu techniki mrożenia-łamania demon­strujących efekt cytochalazyny D na los i kompozycję płytek cytoplazmatycznych oraz rozmieszczenia koneksonów podczas i po rozbiciu mikrofilamentów. W yjąt­kowo w soczewkach naczelnych połączenia szczelinowe są związane z pęczkami filamentów aktynowych, które najprawdopodobniej zapewniają soczewkom stru­kturalną stabilność [40]. Jak widać zatem z powyższych rozważań, nie udało się jednoznacznie stwierdzić, ani przedstawić ogólnej zasady opisującej interakcję po­łączeń szczelinowych z cytoszkieletem w procesie ich formowania i kontroli od­ległości między koneksonami.

3.2. Relacje między połączeniami szczelinowymi i ścisłymiPołączenia ścisłe (Maculae occludens) zostały opisane już w roku 1963 [19].

Tworzą one ciągłe pasmo wokół apikalnej części komórek nabłonkowych wyście­lających rozmaite kanały, np. przewód pokarmowy. Połączenia ścisłe zamykają szczelnie światło przewodu, np. jelita zapobiegając przeciekowi jego treści przez szczeliny międzykomórkowe. W rejonie połączeń ścisłych zewnętrzne warstwy błon komórkowych ulegają fuzji całkowicie eliminując w tym miejscu przestrzeń mię­

http://rcin.org.pl

356 A. FIER TA K , W. KILARSK I

dzykomórkową, a ponadto blokują swobodny przepływ białek w płaszczyźnie błony komórkowej tej strefy.

Połączenia szczelinowe i połączenia ścisłe są często wspólnie rozmieszczone w wielu typach komórek. Friend i Gilula [69*] opisali połączenia szczelinowe i ścisłe w dużej liczbie nabłonków m.in. w komórkach pęcherzykowych trzustki, wątrobie, korze nadnerczy, najądrzach, jelicie cienkim i dwunastnicy. Podczas gdy w nabłonku trzustki połączenia szczelinowe są całkowicie otoczone przez pasma połączeń ścisłych, w wątrobie oba rodzaje połączeń są "wymieszane" niezmiernie rzadko. W jelicie cienkim połączenia szczelinowe nie leżą pomiędzy połączeniami ścisłymi; podobnie w najądrzu sieć połączeń ścisłych jest wolna od połączeń szcze­linowych. W przypadku kory nadnerczy, autorom trudno było zdecydować, czy szeregi przylegające do dużych płytek połączeń szczelinowych to liniowo ułożone połączenia szczelinowe czy paciorkowane brzegi połączeń ścisłych.

Peracchia [69*] pokazał, że połączenia szczelinowe są oddzielone od ścisłych w płaszczyźnie bocznej błony komórek śluzowych z żołądka szczura. Dla kontrastu, według badań Bernardiniego [69*], w komórkach nabłonkowych żołądka szczura pasma połączeń ścisłych występują na przemian z połączeniami szczelinowymi. W splocie naczyniówkowym szczura, Van Deurs i Koehler [69*] opisali sieć pasm połączeń ścisłych, o połączeniach szczelinowych, natomiast, nie wspomnieli. W strefie przejściowej pomiędzy komórkami ependymalnymi (tylko połączenia szcze­linowe) a komórkami splotu naczyniówkowego (tylko połączenia ścisłe) Mack [69*] znalazł połączenia ścisłe ze wstawionymi połączeniami szczelinowymi. W badaniach rozwojowych nad splotem naczyniówkowym kurczęcia Dermietzel [69*] znalazł obydwa typy połączeń. Pierwsze struktury połączeniowe nie rozwijają się przed 5 dniem rozwoju embrionalnego, w którym cząstki zaczynają tworzyć pasma i grupy.

W kompleksie oocytarno-folikularnym myszy Van den Hoef [69*] odkrył, obok niezidentyfikowanych rzędów romboidalnych cząstek, heterologiczne połączenia szczelinowe pomiędzy oocytem a otaczającymi go komórkami folikularnymi. Po defolikulacji oocyty zyskały szeregi przypominające połączenia ścisłe, które były sporadycznie związane z małymi połączeniami szczelinowymi. Liniowe struktury mogą nie być oryginalnymi połączeniami ścisłymi, lecz fragmentami połączeń szcze­linowych przeorganizowanych w wyniku defolikulacji.W zdysocjowanych i po­nownie zagregowanych komórkach B trzustki szczura In ’t Veld [69*] opisał połączenia ścisłe i szczelinowe tworzące nieregularne agregaty pasm i grup ko­neksonów. M eda [69*] opisał struktury ułożone liniowo i zasugerował, że repre­zentują one niezwykłe formy połączeń szczelinowych lub etap pośredni w tworzeniu połączeń ścisłych, a być może nawet stadium przejściowe pomiędzy połączeniami szczelinowymi i ścisłymi. Decker i Friend [69*], po badaniach nad zarodkiem płazim w stadium neurulacji, sugerowali rolę podporową połączeń ścisłych wobec wczesnych połączeń szczelinowych. W innych badaniach, na skórze podudzia za­

http://rcin.org.pl

PO ŁĄ C ZEN IA SZ C Z EL IN O W E 357

rodka kurczęcia, Elias i Friend [69*] obserwowali proces proliferacji połączeń szcze­linowych wywołany kwasem retinowym, który poprzedzał proces powstawania po­łączeń ścisłych. Dermietzel [69*] i Larsen [69*] rozważali możliwość istnienia wspólnej puli cząstek błonowych dla tych dwóch typów połączeń, co wydaje się jednak mało prawdopodobne. Odmiennie, w teoretycznej analizie dotyczącej two­rzenia połączeń Weinbaum [69*] założył, że cząstki o różnych biochemicznych i elektrycznych właściwościach są ściśle związane. Bardziej bezpośrednio, Simonescu [69*] pokazał w komórkach endotelialnych tętnic i żył istnienie, obok typowych połączeń ścisłych i szczelinowych, tzw. połączeń specjalnych, które składały się ze ściśle przylegających koneksonów i pasm połączeń ścisłych. Być może połączenia ścisłe spełniają jakąś rolę w stabilizacji koneksonów w płaszczyźnie błony.

Rozważania nad bliskimi zależnościami topograficznymi pomiędzy połączeniami szczelinowymi i ścisłymi są szczególnie interesujące, jeżeli weźmie się pod uwagę ostatnie obserwacje. Furuse [69*] zidentyfikował pierwsze błonowe białko integralne połączeń ścisłych nazwane okludyną. To 55.9 kDabiałko zostało zsekwencjonowane, a mapa hydrofilności odkryła 4 domniemane domeny transbłonowe z dwoma zewną- trzkomórkowymi pętlami. Co prawda okludyna nie wykazuje podobieństwa do ko­neksyn pod względem sekwencji aminokwasów, lecz struktura molekularna może sugerować podobieństwo funkcjonalne. W przeciwieństwie do koneksyn, które są składane w cylindryczne struktury z kanałem w środku, cząsteczki okludyny są składane w sposób liniowy. Dziwne podobieństwo niektórych połączeń szczeli­nowych do połączeń ścisłych i ich topograficzne nakładanie się w niektórych typach komórek, zgodnie z propozycjami W einbauma [69*], sugeruje ich wzajemne związki. Jednakże, te związki nie mają generalnego znaczenia dla tworzenia połączeń, po­nieważ w wielu komórkach występuje tylko jeden lub drugi typ połączenia.

3.3. Połączenia szczelinowe a wewnątrzkomórkowe stężenie wapniaWapń był pierwszym opisanym czynnikiem cytoplazmatycznym biorącym udział

w regulowaniu funkcji połączeń szczelinowych. Może on pełnić rolę czynnika bram­kującego kanał, jak i substancji przenoszonej przez kanał w drodze dyfuzji. W zrost stężenia wapnia związano z redukcją komunikacji przez połączenia szczelinowe, co jednak zachodziło przy niefizjologicznych stężeniach Ca“+. Należy jednak przy­puszczać, że proces ten może zachodzić również w warunkach patologicznych.

Ostatnio pojawiło się wiele obserwacji, które wskazują, że zmiany oscylacyjne w stężeniu wapnia i międzykomórkowe przenoszenie fali wolnego wapnia może służyć do koordynowania wielu czynności tkanek w różnych warunkach fizjologi­cznych, na przykład w interakcjach pomiędzy komórkami nerwowymi i glejowymi. Pewne dane wskazują, że zmiany poziomu wapnia w komórkach glejowych mogą powodować zmiany w poziomie wapnia w przyległych komórkach nerwowych, a proces ten zachodzi przy udziale połączeń szczelinowych łączących obydwa typy

http://rcin.org.pl

358 A. FIER TA K , W. KILARSK I

komórek [46]. Istnieje jednak trudność związana interpretacją tego zjawiska. W astrocytach ulega bowiem ekspresji koneksyna 43, podczas gdy neurony wytwarzają koneksynę 32 [15], a z badań nad oocytami Xenopus wynika, że te dwie izoformy koneksyn są "niekompatybilne" [67]. Tak więc, pozostaje do ustalenia fakt, czy inne "kompatybilne" koneksyny nie występują w tych dwóch typach komórek. Z drugiej strony mogą istnieć inne mechanizmy pozwalające na przekazanie sygnału z astrocytów do neuronów, na przykład komunikacja przez kanały bramkowane glutationem [50].

4. REGULACJA FUNKCJI POŁĄCZEŃ SZCZELINOWYCH

4.1. Synteza i regulacja ekspresji koneksynPomimo 30 lat badań nad połączeniami szczelinowymi, regulacja ich syntezy,

czasu trwania w błonie i usuwania jest wciąż enigmatyczna. Obecnie badane są dwa etapy regulacji tworzenia połączeń szczelinowych: szybkość obrotu koneksyn (badana głównie w wątrobie) oraz modyfikacje postranslacyjne koneksyn przed wbudowaniem ich w błonę. Ogólnie rzecz biorąc, białka mające kluczowe znaczenie w procesach regulacyjnych mają zazwyczaj krótkie okresy półtrwania. Wczesne badania Gurda i Evansa [69*], w których zastosowali oni technikę podwójnego znakowania izotopem, wykazały wolny obrót frakcji opornej na sarkozynę, tj. frakcji błon komórek wątroby zawierającej połączenia szczelinowe. Jednakże, co sugerują Fallon i Goodenough [69*], wysoka zawartość kolagenu w tej frakcji mogła ją zanieczyścić. Yancey [69*] wykorzystując pulsową iniekcję znakowanej metioniny wykazał szczyt wbudowywania białek o masie 10 000 D do izolowanych z wątroby połączeń szczelinowych po 3 godzinach. W ten sposób określono czas półtrwania białek połączeń szczelinowych w wątrobie szczura na około 19 godzin. Jednak z powodu powtórnego wykorzystania radioaktywnych aminokwasów, prawdziwy czas półtrwania został zawyżony dwukrotnie. Porównując obrót białek połączeń szczelinowych wątroby do innych białek obecnych w błonie jej komórek o czasie półtrwania 3,6 dnia, Yancey [69*] stwierdził, że jest on 4,5-krotnie szybszy. Krótki czas półtrwania białek połączeń szczelinowych powoduje, że przerwa w ich syntezie daje natychmiastowy efekt w postaci zniknięcia połączeń, co obok rozłączenia przez zamknięcie kanałów, może być drugim mechanizmem regulującym komunikację międzykomórkową. W doświadczeniach in vivo z zastosowaniem dwuwęglanu zna­kowanego C 14 Fallon i Goodenough [69*] pokazali jak do tej pory najkrótszy czas półtrwania połączeń szczelinowych w wątrobie szczura - 5 godzin. Kilka badań in vitro dotyczących syntezy koneksyn wykazało ich czas półtrwania rzędu 1^4 godzin [3]. Czas półtrwania koneksyny 43 w kardiomiocytach wynosił 1-2 godzin [38].

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 359

Z jednej strony, wydaje się prawdopodobne, że komunikacja międzykomórkowa przez połączenia szczelinowe jest kontrolowana na poziomie syntezy i degradacji białek, a nie przez odwracalne zmiany konformacyjne cząsteczek na poziomie po­jedynczych koneksonów. Z drugiej zaś strony, szybki obrót białek połączeń szcze­linowych zależy od obróbki podczas przem ieszczania tych białek do błony komórkowej. W kulturach kardiomiocytów pozyskiwanych od szczura Puranam [52] studiował biosyntezę i translokację koneksyny 43 używając jako inhibitora tych procesów jonoforu monezyny. Znalazł 40 i 41 kD izoformy koneksyny 43 zmagazynowane w pęcherzykach aparatu Golgiego i jednocześnie wykrył spadek liczby płytek połączeń szczelinowych w błonie. Te rezultaty sugerują, że koneksyna 43 na swojej drodze do błony jest wstępnie fosforylowana w siateczce śródpla- zmatycznej lub w przedziale cis aparatu Golgiego z formy 40 do 41 kD. Formy ufosforylowane do 42 i 44 kD pojawiają się, dystalnie od zablokowanych cząsteczek, w przedziale trans aparatu Golgiego. Spray [69*] udowodnił, że składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, na przykład, proteoglikany i glikozaminoglikany, także, na wielu poziomach, mają wpływ na ekspresję białek połączeń szczelinowych. Innymi cząsteczkami regulującymi dynamikę połączeń szczelinowych są, według C ole’a i Garfielda [69*], hormony, zgodnie z badaniami Kesslera [69*] pochodne cAMP, a także kinazy [17,59].

Kumulujące się dowody, z badań nad różnymi liniami komórkowymi, sugerują że koneksyny mogą tworzyć pule białkowe przed wbudowaniem w błonę komórkową [22]. To wyjaśnia, dlaczego inhibitory transkrypcji i translacji, w niektórych przy­padkach, nie mają istotnego wpływu na tworzenie funkcjonalnej komunikacji przez połączenia szczelinowe. Procesy kontrolujące poziom koneksyn 43, 32 i 26 zostały, jednak, pokazane w regenerującej wątrobie [33]. Mechanizmy potranskrypcyjne, wśród których stabilność mRNA może być czynnikiem krytycznym, są uważane za dynamiczne regulatory w tym systemie [33].

W komórkach B trzustki, In’t Veld [69*] opisał wzrost ilości koneksonów w odpowiedzi na dibutyryl-cAM P i na inhibitor fosfodwuesterazy. Jednak, autor ten nie stwierdził, czy wzrost liczby połączeń szczelinowych ma odbicie w wyższym poziomie komunikacji międzykomórkowej. W ludzkich komórkach nowotworowych kory nadnerczy badanych przez M urray’a i Taylora [69*] oraz w szczurzych ko­mórkach parenchymalnych wątroby badanych przez De M aziere’a i Scheuermanna [69*], obszary połączeń szczelinowych zwiększają się w wyniku podania dibu- tyryl-cAM P. W serii eksperymentów, Flagg-Newton, Flagg-Newton i Foewenstein oraz A zam ia [69*] badali wpływ cAMP na komunikację międzykomórkową i mor­fologię połączeń szczelinowych w liniach nowotworowych komórek mysich. Studia te sugerują znaczenie modulacji połączeń szczelinowych przez zależną od cAMP fosforylację. Saez [69*] bezpośrednio zademonstrował efekt cAMP na fosforylację 27 kD białka połączeń szczelinowych w komórkach wątroby, która podnosi prze­wodność połączeń. W kardiomiocytach szczura in vitro [49] i w kulturach komórek

http://rcin.org.pl

360 A. FIER TA K , W . KILAR SK I

epitelialnych soczewek szczura i wołu [26], koneksyna 43 i 46 były fosforylowane w czasie hodowli. Zasugerowano, że fosforylacja wspomaga łączenie się komórek i jest kontrolowana przez wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia [11]. Stwierdzono, że aktywacja kinazy C powodowała fosforylację koneksyny 32 w hepatocytach. W innych doświadczeniach, Oh [48] badał linię zmutowanych klonów komórkowych wyprowadzonych z komórek epitelialnych wątroby szczura, niezdolnych do mię­dzykomórkowej komunikacji (GJIC' ). Zaproponował on, że nieobecność hyper- fosforylowanych form koneksyny 43 jest odpowiedzialna za niezdolność mutantów do komunikacji. Ponieważ rozmieszczenie koneksyny 43 nie różniło się w komórkach GJIC i GJIC+ nieobecność fosforylacji najwyraźniej nie upośledziła wbudowywania białek połączeń szczelinowych w błony. Niestety obecność i stan fosforylacji głów­nego białka połączeń szczelinowych wątroby, koneksyny 32 [35,36], w tej zmu­towanej linii hepatocytów nie zostały zbadane. Z drugiej strony, poparcie znajduje hipoteza przeciwna, mówiąca o zablokowaniu komunikacji przez połączenia szcze­linowe w wyniku fosforylacji koneksyn na resztach tyrozynowych. Badania nad komunikacyjnie kompetentnymi kardiomiocytami wykazały że miejsca zawierające tyrozynę i treoninę nie są fosforylowane w koneksynie 43 [38]. Evans [69*] opisał utratę zdolności rozpoznawania 60 kD białka błonowego (MP60) w centrum roz­wijającej się mysiej soczewki przez przeciwciała monoklonalne. W świetle prac Voortera i Kistlera [69*], zgodnie z którymi kinaza A fosforyluje koneksyny tylko w korze, lecz nie w jądrze soczewki, odkrycie Evansa może sugerować cięcie białek połączeń szczelinowych w jądrze soczewki połączone z utratą miejsc fo­sforylacji, i rozpoznawanych przez przeciwciało. Nieobecność miejsc fosforylacji zapewniłaby stałe połączenie metaboliczne w centrum soczewki, które jest konieczne do przezwyciężenia braków w zaopatrzeniu w substancje odżywcze.

Kolejna grupa cząsteczek biorących udział w regulacji funkcji połączeń szcze­linowych to czynniki wzrostu. Na przykład, według Laua [69*], epidermalny czynnik wzrostu (EGF) może powodować destrukcję połączeń szczelinowych w wyniku fosforylacji koneksyn na resztach serynowych.

4.2. Dynamika połączeń szczelinowych podczas rozwojuOd najwcześniejszych stadiów rozwojowych, połączenia szczelinowe biorą udział

w przekazywaniu sygnałów morfogenetycznych. Jednym z najlepiej znanych przy­kładów na znaczenie przekazu sygnałów przez połączenia szczelinowe jest rozwój stułbi, Hydra sp. (jamochłony), badany przez Greena [69*]. Ustalona tarcza gębowa uwalnia rozchodzący się wzdłuż ciała poprzez połączenia szczelinowe inhibitor zapobiegający tworzeniu dodatkowych części tarcz gębowych. Zablokowanie ko­munikacji poprzez połączenia szczelinowe w wyniku transplantacji tkanki części z okolicy tarczy gębowej dawcy, nastrzykanej przeciwciałami przeciwko białkom połączeń szczelinowych, do organizmu biorcy, powodowało, co zademonstrował

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 361

Fraser [69*], ograniczenie zdolności istniejącej tarczy gębowej do inhibicji tworzenia dodatkowych tarcz gębowych. Podobny wpływ połączeń szczelinowych na kształ­towanie ciała obserwowano we wczesnych zarodkach płazów [69*], zarodkach ku­rzych [14] oraz zarodkach pijawek [70]. Zeng [69*] śledził efekt przeciwciał skierowanych przeciwko 26 kD białku, występującemu w połączeniach szczeli­nowych wątroby szczura, na tworzenie połączeń szczelinowych w zarodku Xenopus i stwierdził ich małe rozmiary w porównaniu z kontrolą. Osłabienie grupowania koneksonów przez anty-koneksyny było również postulowane przez M eyera [69*], który badał przekazywanie znacznika fluorescencyjnego i morfologię połączeń szcze­linowych w rozproszonych i powtórnie zagregowanych komórkach hepatomy No- v ikoffa po poddaniu ich działaniu fragm entu Fab przeciwciał skierowanych przeciwko zewnątrzkomórkowym domenom koneksyn. Autor nie stwierdził na re­plikach wielu połączeń szczelinowych, co sugeruje, że domeny zewnątrzkomórkowe mają szczególny udział w tworzeniu tych połączeń.

Nową kartę w badaniach nad połączeniami szczelinowymi otworzyło odkrycie, że w regulacji i tworzeniu komunikacji poprzez te połączenia istotną rolę pełnią cząsteczki adhezyjne. Kanno [69*] doniósł, że przeciwciała monoklonalne rozpo­znające uwomorulinę (kadherynę E) zakłócały zależną od wapnia adhezję i wstrzy­mywały przekazywanie barwnika fluoryzującego, żółcieni lucyferowej, pomiędzy komórkami teratokarcinomy. Kolejnego dowodu na udział kadheryn w funkcjo­nowaniu połączeń szczelinowych dostarczył Mege [69*], który transfekował cDNA molekuł adhezyjnych (L-CAM) do komórek sarkomy mysiej, nie produkujących L-CAM i nie wykazujących komunikacji przez połączenia szczelinowe. Potransfekcji pojawiły się funkcjonujące połączenia szczelinowe. Podobnie, Musil [69*] pokazał, że po transfekcji L-CAM cDNA linie komórkowe S I80 i L929 odzyskiwały ko­munikację przez połączenia. Należy zaznaczyć, że przed transfekcją komórki te nie produkowały molekuł adhezyjnych i wykazywały ekspresję nie w pełni fo- sforylowanej koneksyny 43. Jongen [69*] odkrył w komórkach nabłonkowych myszy korelację pomiędzy zależną od wapnia komunikacją przez połączenia szczelinowe i ekspresją kadheryny E, co sugeruje, żejest ona zaangażowana w regulację tworzenia i funkcji koneksyny 43. W komórkach hepatomy Novikoffa, które również zawierają koneksynę 43, M eyer [69*] opisał inną kadherynę, kadherynę N (A-CAM), biorącą udział w regulacji połączeń szczelinowych. Komórki traktowane fragmentem Fab przeciwciał przeciwko A-CAM nie były zdolne do tworzenia połączeń szczeli­nowych. Z kolei, anty-koneksyna hamowała przyleganie komórek. Powyższe ob­serwacje pokazują bliskie związki pomiędzy cząsteczkami adhezyjnymi a tworzeniem połączeń szczelinowych podczas rozwoju.

W ydaje się bardzo prawdopodobnym, że kontakty poprzez cząsteczki adhezyjne są warunkiem i muszą poprzedzać tworzenie połączeń szczelinowych. Większość prac wskazuje, że kompetentnymi cząsteczkami adhezyjnymi są zależne od wapnia kadheryny, lecz, jak pokazał Keane [69*], N-CAM, członek niezależnej od wapnia

http://rcin.org.pl

362 A. FIER TA K , W. K ILARSK I

nadrodziny immunoglobulin, również bierze udział w regulacji funkcji połączeń szczelinowych. Co więcej, Churchill [10] odkrył istnienie międzykomórkowych prądów przenoszonych przez połączenia szczelinowe w hodowanych in vitro he- mocytach karalucha przy nieobecności Ca"+.

4.3. Połączenia szczelinowe w onkogenezieZakłócenia w komunikacji poprzez połączenia szczelinowe wydają się być jednym

z etapów transformacji nowotworowej. Hipotezę taką postawił już w roku 1967 Loewenstein [69*]. Równocześnie, zaobserwowano, że namnażanie się komórek neoplastycznych jest hamowane przez utrzymywanie połączeń szczelinowych między tymi komórkami [9,72]. Inwazyjność jest jedną z cech komórek neoplastycznych. Chen i Óbrink [69*] wykazali, że własności inwazyjne zostają nabyte przez komórki po utracie połączeń adhezyjnych tworzonych przez kadherynę E. Kadheryna E jest istotna dla zapoczątkowania komunikacji przez połączenia szczelinowe podczas rozwoju. Istnieje zatem bezpośredni związek pomiędzy inwazyjnością komórek a utratą komunikacji przez połączenia szczelinowe.

Istnieje szereg dowodów na to, że aktywacja kinazy C przez produkowane przez guzy estry forbolu koreluje ze zmianami w stanie fosforylacji koneksyn i ze zmniej­szeniem komunikacji przez połączenia szczelinowe. Jednakże, jak zauważył Chanson [69*], estry forbolu zmniejszająprzepuszczalność połączeń tylko w ustalonych liniach komórkowych, a nie, na przykład, pomiędzy komórkami wydzielniczymi egzo- krynowej części trzustki szczura. Fosforylowanie koneksyny 43 na resztach ty- rozynowych związane jest z zahamowaniem komunikacji międzykomórkowej przez połączenia szczelinowe [11]. Zgodnie z tym, Goldberg i Lau [69*] pokazali, że transformacja fibroblastów onkogenem pp60v s'L prowadzi do obfitej fosforylacji reszt tyrozynowych, podczas gdy w komórkach nietransformowanych, utrzymu­jących komunikację z innymi, analogicznej fosforylacji nie zaobserwowano. Jednakże poziom mRNA dla koneksyny 43 i samej koneksyny w komórkach transformowanych wzrósł a nie, jak można się było spodziewać, zmalał. W linii komórek wypro­wadzonych z nabłonka wątroby szczura, immunoreaktywność przeciw koneksynie 43 zniknęła po potraktowaniu ich estrami forbolu, co sugeruje wycofywanie ko­neksonów z błony [2]. W przeciwieństwie, Hiilser i Brummer [69*] pokazali sto­pniow y spadek w rozprzestrzenian iu się barw nika fluoryzującego, żółcieni lucyferowej, w kulturach sferoidów komórek guza BICR/M1R-K przy jednoczesnej obecności płytek połączeń szczelinowych, co obserwowano na replikach. Naus [69*] doniósł o spadku poziomu mRNA dla koneksyny 43 w komórkach glejaka C6 w porównaniu do astrocytów. Traktowanie astrocytów estrami forbolu blokowało komunikację przez połączenia szczelinowe i rozprzestrzenianie się fali Ca"+ [17], która jest wskaźnikiem ruchu jonów wapnia i innych przekaźników takich jak trój- fosforan inozytolu. Jeśli komórki glejaka C6 były transfekowane cDNA dla ko-

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 363

neksyny 43, to poziom ich proliferacji gwałtownie spadał, tworzyły się połączenia szczelinowe, a przechodzenie barwnika z komórki do komórki wzrastało [9]. Ponadto Zhu [69*] wykazał, że poziom proliferacji komórek C6 spadał, jeżeli były hodowane one w medium po komórkach transfekowanych cDNA dla koneksyny 43. Sugeruje to uwalnianie substancji kontrolujących wzrost przez komórki zdolne do komunikacji. Tak więc, połączenia szczelinowe mogą wpływać na syntezę i/lub uwalnianie in­hibitorów wzrostu.

Studia nad ekspresją koneksyn w wątrobie szczura podczas onkogenezy pokazują złożoność relacji pomiędzy ekspresją koneksyn a rozwojem komórek neoplasty- cznych [47]. Komórki wątroby, transformowane dietylonitrozoaminą wykazywały brak koneksyny 32 i 26. Jednakże, analiza poziomu mRNA nie wykazała spadku ekspresji transkryptu dla tych koneksyn, co sugeruje, że niektóre guzy zmniejszają immunoreaktywność koneksyn niezależnie od ekspresji mRNA.

4.4. Rola połączeń szczelinowych w chorobach dziedzicznychSzerokie rozpowszechnienie koneksyn, jak i skomplikowane procesy modula-

cyjne, którym podlegają te białka, zarówno na poziomie transkrypcji jak i gotowego produktu, wskazują na ich fundamentalne znaczenie dla funkcjonowania komórki. Nieprawidłowości w ekspresji koneksyn mogą wywoływać nowotwory, niedokrwie­nie czy przerost mięśnia sercowego. Ostatnio, dzięki studiom nad dwiema chorobami dziedzicznymi: chorobą Charcota, Marie i Tootha (CMT) oraz zespołem heterotaksji trzewnoprzedsionkowej (VAH) pojawiły się dane pozwalające spojrzeć z innej strony na funkcje połączeń szczelinowych.

CM T jest chorobą nerwów obwodowych upośledzającą funkcje nerwów zarówno czuciowych, jak i ruchowych. Najbardziej powszechne nieprawidłowości dotyczą białka osłonki mielinowej obwodowego układu nerwowego - PMP 22. Inna forma choroby (CMTX) jest związana z chromosomem X, na którym występują mutacje w regionie kodującym koneksynę 32 [1]. Analiza tych mutacji w oocytach Xenopus jasno wskazuje, że mają one bezpośredni wpływ na aktywność kanałów połączeń szczelinowych [8]. Koneksyną 32 jest szeroko rozpowszechniona w wielu tkankach, uwzględniając wątrobę, z których większość wydaje się nie być dotknięta przez CMTX. M ożna zaproponować kilka wyjaśnień faktu, że zmutowana koneksyną 32 nie zmienia funkcji innych komórek poza komórkami Schwanna. Najprostsze opiera się na założeniu, że komunikacja zachodzi nie tylko przez połączenia szcze­linowe tworzone przez koneksynę 32, ale także przez inne koneksyny. Zatem istnieje możliwość, że w komórkach Schwanna pacjentów z CMTX występują koneksyny, które tworzą z koneksyną 32 kanały niefunkcjonalne lub nie mogą zastąpić funkcji koneksyny 32.

Niektóre mutacje CMTX prowadzą do utraty funkcji koneksyny 32 [8]. Stąd, w zależności od rodzaju koneksyny ulegającej ekspresji, ścieżki komunikacyjne

http://rcin.org.pl

364 A. F IER TA K , W . KILARSK I

mogą być ograniczone lub zupełnie nie zmienione w tkankach pacjentów z CMTX, które obok koneksyny 32 produkują wiele innych koneksyn. Inne wyjaśnienie bierze pod uwagę możliwość indukcji ekspresji koneksyn, które normalnie nie ulegają ekspresji w tych tkankach i nie oligomeryzują ze zmutowaną koneksyną 32. Dla przykładu, pokazano, że w wątrobie gryzoni gen dla koneksyny 43 jest równie aktywny transkrypcyjnie jak gen dla koneksyny 26 [33], jednakże, na poziomie stabilnego transkryptu lub białka koneksyny tej jest bardzo mało. Być może, za­kłócenie funkcji koneksyny 32 wywołuje stabilizację koneksyny 43. To wymagałoby kilku mechanizmów wspierających regulację biosyntezy koneksyn.

Intrygujące są rozważania na temat mechanizmów pozwalających ustalić asymetrię wielu narządów zwierząt kręgowych. Geny biorące udział w sygnalizacji m iędzyko­mórkowej partycypują także w regulacji rozwoju asymetrii [73]. Na przykład w rozwoju serca mutacja w genie dla koneksyny 43 związana jest z wadą wisce- ralnoprzedsionkowej heterotaksji serca, VAH [6]. Choroba ta może przyjmować wiele form, od łagodnych do śmiertelnych, a jest spowodowana niewydolnością serca. Powstaje przez fundamentalne zaburzenia w kształtowaniu symetrii serca. Używając reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do zbadania końca C genu dla koneksyny 43, ustalono, że u pacjentów z VAH obecne są mutacje punktowe w miejscach kodujących serynę lub treoninę. Wiadomo, że koneksyną 43 jest fo- sforylowana w wielu miejscach, a ta modyfikacja może wpływać na składanie i bramkowanie połączeń szczelinowych [35]. Analizy komórek transfekowanych jed ­nym ze zmutowanych genów dla koneksyny 43 wykazały, że kinazy nieprawidłowo regulowały funkcje koneksyn. Dotychczas nie ustalono, czy defekty w pozostałych regionach koneksyny 43 są odpowiedzialne za inne typy defektów serca.

Dowody wskazujące na znaczenie koneksyny 43 w rozwoju i fizjologii serca myszy uzyskano stosując celowe niszczenie genu dla koneksyny 43 [55]. Homozygoty noszące niefunkcjonalny gen dla koneksyny 43 rozwijały się przez pewien czas prawidłowo, lecz umierały wkrótce po urodzeniu. Histologiczna analiza serc tych myszy uwidaczniała nabrzmienie i blokadę szlaku wyprowadzającego krew z prawej komory serca, co prawdopodobnie powodowało śmierć zwierzęcia poprzez zaha­mowanie wymiany gazów. Zaburzenia obserwowane u myszy poddanych ekspery­m entowi m ogą nie być identyczne z tymi, które w ystępują w organizm ach posiadających tylko mutację w genie dla koneksyny 43. Na przykład, mogą istnieć mutacje, które pozwalają na funkcjonowanie koneksyn na pewnym zmniejszonym poziomie lub ze zmienionymi właściwościami dotyczącymi bramkowania czy prze­puszczalności kanału. M utacje mogą spowodować również, że jedna z koneksyn nabierze właściwości inhibicyjnych w stosunku do innych koneksyn lub białek regulacyjnych.

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 365

4.5. Rola połączeń szczelinowych w okresie ciąży i poroduJak już powiedzieliśmy poprzednio, połączenia szczelinowe wiążą ze sobą me­

tabolicznie i elektrycznie wszystkie komórki przez całe ich życie z wyjątkiem mięśni szkieletowych, kości i komórek krwi. Istnieją jednak narządy, których komórki są jedynie okresowo połączone matabolicznie i elektrycznie przez połączenia szcze­linowe. Do takich narządów należy macica, a przede wszystkim jej mięśniówka. W okresie tzw. ciszy biologicznej mięśniówki macicy, którą można ograniczyć do okresów międzyciążowych, komórki mięśni gładkich mięśniówki nie są ze sobą metabolicznie i elektrycznie połączone. Jeżeli nawet występują połączenia szcze­linowe w okresie ciszy biologicznej macicy w jej mięśniówce, to są one bardzo nieliczne, a co za tym idzie niewykrywalne dostępnymi nam metodami.

Połączenia szczelinowe pojawiają się w mięśniówce macicy dopiero na kilka lub kilkanaście godzin przed porodem. Proces ten objawia się, dobrze znanym klinicystom - położnikom zjawiskiem występowania synchronicznych skurczów macicy, które w efekcie prowadzą do spontanicznego porodu.

Nagromadziło się sporo dowodów, że połączenia w dużym stopniu regulują mo- toryczne czynności macicy w końcowej fazie ciąży. Doświadczalna owariektomia, podanie dużej dawki prostataglandyn czy też estrogenów wywoływały pojawienie się połączeń szczelinowych w mięśniówce macicy i przedwczesny poród [12]. Po­dawanie pod koniec ciąży owariektomizowanym szczurom progesteronu lub jego pochodnych hamowało formowanie się połączeń sczelinowych i przedłużało poród. Obserwacje prowadzone na wielu gatunkach wskazywały jednoznacznie, że tuż przed porodem wzrastała istotnie ilość połączeń szczelinowych. Obecność połączeń nie była jednak warunkiem bezwzględnym do zakończenia ciąży. I tak, odnerwienie miednicy ciężarnych szczurów zapobiegało porodowi, ale nie blokowało formowania połączeń szczelinowych. Podawanie zaś dużych dawek estrogenów w okresie ciąży stymulowało przedwczesne formowanie się połączeń szczelinowych bez nastąpienia równocześnie przedwczesnego porodu [12].

Obserwacje prowadzone głównie na zwierzętach laboratoryjnych, szczurach, królikach, powiązały formowanie się połączeń szczelinowych w mięśniówce macicy z poziomem dwóch głównych hormonów: progesteronu i estradiolu. W ysokie stężenie progesteronu w krwi matczynej było związane z tzw. blokiem ciążowym, a rów­nocześnie z jego inhibującym wpływem na formowanie się połączeń szczelinowych. W zrost poziomu estradiolu, pod koniec ciąży w wyniku metabolizowania proge­steronu do estradiolu, znosił inhibujący efekt tego pierwszego oraz inicjował for­mowanie się połączeń szczelinowych i terminację ciąży.

W przypadku ciąży ludzkiej udział zarówno estrogenów, jak i progesteronu w jej utrzymaniu i terminacji pozostaje bezsporny, aczkolwiek niejednoznaczny. Za­równo bowiem poziom progesteronu w krwi matczynej może się wahać w znacznym stopniu i nie pozostawać w efektywnej korelacji z rozwiązaniem, ani też z inicjacją

http://rcin.org.pl

366 A. F IER TA K , W. KILARSKI

formowania się połączeń szczelinowych. Estradiol w organizmie kobiety ciężarnej nie powstaje, jak to ma miejsce u szczurów z progesteronu pod wpływem 17 a hydroksylazy, lecz jest pochodzenia łożyskowego i zarodkowego, gdzie jest syn­tetyzowany z siarczanu dehydroisoandrosteronu [61], a tym samym nie następuje obniżenie stężenia progestereronu pod koniec ciąży.

W spólne badania prowadzone w Krakowie, Uppsali i Londynie nad 62 przy­padkami ciąży nie wykazały istotnej różnicy w ilości połączeń szczelinowych w mięśniówce kobiet rodzących normalnie, odpornych na oksytocynę i kobiet nie wykazujących żadnych skurczów macicy w terminie porodu. Nie zaleziono również istotnej zależności pomiędzy tymi trzema grupami pacjentek a poziomem proge­steronu w ich krwi. Nie oznacza to jednak, że połączenia szczelinowe nie odgrywają żadnej roli w procesie porodu. Analizę połączeń szczelinowych prowadzono przy pom ocy mikroskopu elektronowego [29] oraz metody immunocytochemicznej [28,29]. Obie te metody pozwalają jedynie na stwierdzenie, albo obecności połączeń szczelinowych w postaci uformowanej (mikroskopia elektronowa) (fot. 1 i fot. 4), albo obecności białek, koneksyny 43 (immunohistochemia) (fot. 3). Żadna z tych metod nie informuje natomiast o czynnościowym stanie kanałów - koneksonów. Nie możemy bowiem dostępnymi technikami zmierzyć in vivo, czy kanał jest otwarty czy nie. Uzyskane in vitro wyniki nie są jednoznaczne [58]. Zabiegi techniczne poprzedzające fizjologiczną analizę wycinków macic mogą bowiem wpływać de- formacyjnie na stan czynnościowy koneksonów. Można było jedynie stwierdzić, że poziom białek połączeń szczelinowych, koneksyny 43, macic kobiet rodzących normalnie, pozostaje w korelacji dodatniej ze stosunkiem estradiolu do progesteronu (E/P). Badania in vitro wycinków mięśniówki macicy pozyskanych przy pomocy cesarskiego cięcia, wykazały istotną zależność skurczów od ilości koneksyny 43, która była zależna od wysokiego stężenia estradiolu, progesteronu i oksytocyny w płynie doświadczalnym i utrzym ywała poziom tych białek przez 5 godzin [30,31,32].

4.5. Degradacja połączeń szczelinowychPodczas rozwoju, różne mechanizmy mogą regulować komunikację poprzez po­

łączenia szczelinowe. Jak już wspomniano, procedury rozłączające mogą, między innymi, obejmować fosforylację koneksyn, zależne od wapnia wiązanie kalmoduliny, czy zmiany w zagęszczeniu koneksonów w płaszczyźnie błony komórkowej. Ko­lejnym ważnym mechanizmem wydaje się być degradacja połączeń szczelinowych, która zachodzi poprzez rozpraszanie się płytek połączeń szczelinowych (na przykład podczas metamorfozy motyla z rodziny zawisakowatych, Manchica sexta [69*]), lub częściej poprzez pojawianie się tzw. anularnych połączeń szczelinowych. Opi­sywane one były w komórkach jajowych przez Koike [69*], mięśniu sercowym przez Spraya [69*], neuroepitelium zarodka szczura przez Schustera [69*], śluzówce

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 367

Fot. 4. Przekrój przez trzy wypustki komórek mięśni gładkich m ięśniówki m acicy ludzkiej. W ycinek pobrano w czasie dokonyw ania cesarskiego cięcia. Połączenia szczelinow e zaznaczono strzałkami

(powiększenie około 80 000)

torby policzkowej chomika przez W hite’a [69*], siatkówce ryb przez Vaughana i Lasatera [69*] czy wreszcie w mięśniówce macicy kobiet tuż po przebytym porodzie przez Kilarskiego (nie publ.) (fot. 5). Główną siłą w kształtowaniu anularnych połączeń szczelinowych wydaje się być endocytoza zależna od aktyny opisana przez Larsena [69*], która kończy się degradacją cząsteczek w lizosomach. Z drugiej strony, rozległe obszary związków filamentów aktynowych z połączeniami szcze-

http://rcin.org.pl

368 A. FIER TA K , W. K ILARSK I

Fot. 5. Przekrój podłużny przez postać anularną połączenia szczelinowego, które znajduje się w stadium degradacji w kom órce m ięśnia gładkiego macicy ludzkiej. W ycinek pobrano w czasie dokonyw ania

cesarskiego cięcia (pow. około 200 000)

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 369

linowymi nie mogą brać udziału w ich usuwaniu, lecz raczej w stabilizowaniu struktury błony, jak to zostało pokazane przez Lo [40] w soczewkach ssaków na­czelnych.

Mamy niewiele informacji o związkach pomiędzy morfologicznymi i enzymolo- gicznymi aspektami degradacji z jednej strony a molekularnymi z drugiej. W każdym razie, wiele badań wskazuje na to, że fosforylacja aminokwasów ma miejsce podczas degradacji połączeń szczelinowych i istnieją dowody, że większość białek jest de­gradowana w stanie największej fosforylacji [11]. W dodatku, fosforylacja ma różny wpływ na proteolizę koneksyny 32 in vitro w zależności od rodzaju kinazy (kinaza A lub kinaza C) [16]. Okazuje się, że rola fosforylacji nie ogranicza się tylko do bramkowania kanałów połączeń szczelinowych [16], lecz wpływa także na ich degradację. Jednakże, mechanizmy fosforylacji biorące udział w blokowaniu komunikacji pomiędzy komórkami poprzez degradację połączeń szczelinowych, wciąż wymagają intensywnych badań.

Miejmy nadzieję, że dynamicznie rozwijające się techniki i metody badawcze pozwolą na ostateczne wyjaśnienie mechanizmów powstawania, trwania i degradacji, wciąż jeszcze enigmatycznych połączeń szczelinowych.

LITERATURA

[1] B E R G O F F E N J, S C H E R E R SS, W A N G S, SC O T T M O , B O N E LJ, P A U L DL, C H E N K, L E N S C H M W , C H A N C E PF, F IS H B E C K KH. C onnex in m uta tions in X -linked C harco t-M a- rie-T ooth d isease. S c ien ce 1993; 262: 2 0 3 9 -2 0 4 2 .

[2] B E R T H O U D V M , L E D B E T T E R M L S, H E R T Z B E R G EL, SA E Z JC . C onnex in 43 in M D C K cells: R eg u la tio n by a tu m o r-p ro m o tin g phorbol e ster and C a2+. E u r J Cell B io l 1992; 57: 4 0 -5 0 .

[3] B E Y E R EC . G ap ju n c tio n s, h it R ev C yto l 1993; 137: 1-37.[4] B O H R M A N N J. A n tisera ag ainst a ch an n el-fo rm ing 16 kD a pro tein inh ib it dye-co u p lin g and

b ind to cell m em branes in D ro so p h ila ovarian fo llicles. J C ell Sc i 1993; 105: 513-518 .[5] B R IS E T T E JL, K U M A R N M , G IL U L A N B , H A L L JE , D O T T O GP. Sw itch in gap ju n c tio n

pro te in express io n is a ssoc iated w ith se lec tive changes in ju n c tio n a l p e rm eab ility during k e ra tin o c ite d ifferen tia tion . P roc N a tl A ca d Sc i USA 1994; 91: 6453-6457 .

[6] B R IT Z -C U N N IN G H A M SH , SH A H M M , Z U P P A N C W , F L E T C H E R W H . M uta tio n s o f the con n ex in 43 g ap -junction gene in patien ts w ith heart m alfo rm ations and defec ts o f laterality . N E n g l J M e d 1 9 9 5 :3 3 2 : 132 3 -1 3 2 9 .

[7] B R U Z Z O N E R, H A E F L IG E R JA, G IM L IC H LR, P A U L D L. C onnex in 40, a co m p o n en t o f gap ju n c tio n s in v ascu la r endo the lium , is restric ted in its ab ility to in te rac t w ith o th er connex ins. M o l B io l C ell 1993; 4: 7 -2 0 .

[8] B R U Z Z O N E R, W H IT E T W , S C H E R E R SS, F IS H B E C K KH , P A U L DL. N ull m u ta tions o f co n n ex in 32 in patien ts w ith X -linked C h arco t-M arie -T o o th d isease. N eu ro n 1994; 13: 1253— 1260.

[9] C H A R L E S A C , N A U S C C G , Z H U D, K ID D E R G M , D IR K S E N ER, S A N D E R S O N J. In te rce llu la r calc ium sig na lling v ia gap ju n c tio n s in g lio m a cells. J C ell B io l 1992; 118: 195 -2 0 1 .

http://rcin.org.pl

370 A. FIER TA K , W. KILARSK I

10] C H U R C H IL L D, C O O D IN S, SH IV E R S RR, C A V E N E Y S. R apid de novo fo rm atio n o f gap ju n c tio n s be tw een insect hem ocy tes in vitro: A freeze-fraclure, dye-tran sfe r and p a tch -c lam p study. J C ell Se i 1993; 104: 7 6 3 -7 7 2 .

11] C R O W D S, B E Y E R E C , PA U L D L, K O B E SS, L A U AF. P h o sp hory la tion o f co n n ex in 43 gap ju n c tio n p ro tein in un in fec ted and R S V -transfo rm ed m am m alian fibroblasts. M o l C ell B io l 1990; 10: 1754-1763 .

12] D A N IE L EE. G ap Ju n ctions in sm ooth m uscle, [w]: C ell-toC ell C om m u n icatio n . D e M ello W [red.], P lenum Press, N ew Y ork and L ondon 1987.

13] D E V R IE S SH, S C H W A R T Z EA . H em i-gap-junc tion channels in so litary h o rizo n tal ce lls o f the catfish retina. J P h is io l London 1992; 445: 2 0 1 -2 3 0 .

14] D E A L Y CN , B E Y E R E C , K O S H E R RA. E xpression patterns o f m R N A s fo r the g ap junction p ro te ins connex in 43 and connexin 42 suggest their in vo lvem en t in ch ick lim b m orp h o g en esis and sp ec ifica tion o f the a rteria l vascu la tu re . D ev D yn 1994; 199: 1 56-167 .

15] D E R M IE T Z E L R, SP R A Y DC. G ap ju n c tio n s in the brain: W here , w hat type, how m any and w hy? T rends N eu ro sc i 1993; 16: 1 8 6 -192 .

16] E L V IR A M , D IE T JA , W A N G K K W , V IL L A L O B O A. P hosphory la tion o f con n ex in 32 by pro te in k inase C preven ts its p ro teo lysis by -calpain and m -calpain . B io l C hem 1993; 268: 14 2 9 4 -14300 .

17] E N K V IS T M O , M C C A R T H Y KD . A ctiva tion o f p ro tein kinase C b locks a stro g lia l gap ju n c tio n co m m unica tion and inh ib its the spread o f calc ium w aves. J N eu ro c h em 1992; 59: 5 1 9 -5 2 6 .

18] F A L K M M , K U M A R N M , G IL U L A N B . M em brane insertion o f gap ju n c tio n connex ins: p o ly top ic channel fo rm ing m em brane p ro te in s .J C ell B io l 1994; 127: 3 4 3 -3 5 5 .

19] F A R Q U H A R G M , P A L A D E GE. Junctional com plexes in various e p ith e lia ../ C ell B io l 1963; 17: 375—412.

20] F IN B O W M E, PIT T S JD . Is the gap ju n c tio n channel- the connexon- m ade o f co n n ex in or ductin? J C ell S e i 1993; 106: 4 6 3 M 7 2 .

21] H A E F L IG E R JA , B R U Z Z O N E R, JE N K IN S N A , G IL B E R T DJ, C O P E L A N D N G , PA U L L. F o u r novel m em bers o f the connexin fam ily o f gap ju n c tio n p roteins. B io l C hem 1992: 267: 2 0 5 7 -2 0 6 4 .

22] H E N D R IX EM , M A O SJ, E V E R SO N W , L A R S E N W J. M yom étria l connex in tra ffick in g and gap ju n c tio n assem bly at term and in p reterm labor. M o l R ep ro d D ev 1992; 33: 2 7 -3 8 .

23] H E N N E M A N N H, S C H W A R Z HJ, W IL L E C K E K. C h arac teriza tion o f gap ju n c tio n genes ex p ressed in F9 em b ryon ic carc in o m a cells: M olecu lar c lon ing o f m ouse co n n ex in and 45 cD N A s. E a r J C ell B io l 1992; 57: 5 1 -5 8 .

24] H E N N E M A N N H, D A H L E, W H IT E JB , SC H W A R Z HJ, L A L L E Y PA , C H A N G S, N IC H O L S O N J, W IL L E C K E K. T w o gap ju n c tio n genes, connex in 31.1 and 30.3, are c losely linked on m ouse ch ro m o so m e 4 and preferen tia lly ex p ressed in skin. ./ B io l C hem 1992; 267: 17 2 2 5 -17233 .

25] H E N N E M A N N H, S U C H Y N A T, L IC H T E N B E R G -F R A T E H, JU N G B L U T H S, D A H L E, S C H W A R Z J, N IC H O L S O N BJ, W IL L E C K E K. M olecu lar c lon ing and fu n c tio n al ex p ression o f m ouse con n ex in 40 a second gap junction gene preferen tia lly expressed in lung. C ell B io l 1992; 1117: 1 2 9 9 -1310 .

26] JIA N G JX , P A U L DL, G O O D E N O U G H DA . P o s ttransla tional pho sp h o ry la tio n o f lens fiber co nnex in 46: a slow occurrence. In vest O p h tha lm ol Vis Sei 1993; 34: 3 5 5 8 -3 5 6 5 .

27] JO H N SA , R E V E L JP. C o nnexon in tegrity is m ain tained by n o n -covalen t bonds: In tram o le ­cu la r d isu lfide bonds link the ex trace llu la r dom ains in rat connex in 43. B iochem B io p h ys R es C om m un 1991; 178: 1 3 1 2 -1318 .

28] K IL A R S K I W M , S E V E R S N J, G O U R D IE R G , R E Z A P O U R M , B Ä C K S T R Ö M T, R O - O M A N S G M U L M S T E N U. G ap Junction D ensity in H um an M yom etrium at T erm R evealed

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z EL IN O W E 371

by an A n ti-P ep tide A ntibody and L aser S canning C onfocal M icroscopy . F olia H isto ch em C ytob io l 1993; 31: 4, 1 5 5 -1 6 0

[29] K IL A R S K I W M , R E Z A P O U R M, B Ä C K ST R Ö M T, R O O M A N S G M . U L M S T E N U. M o rp h o m etrie A nalysis o f G ap Junction D ensity in H um an M yom etrium at T erm . A cta O bste t G yn eco l 1994; 73: 3 7 7 -3 8 0

[30] K IL A R S K I W M , W IT C Z U K B, P L U C IŃ S K I T, K U PR Y S Z E W S K I G, R O O M A N S G M , U L M S T E N U. A n tisera against th ree connex in 43 fragm ents react w ith a 43 -kD p ro le in loca lised to gap ju n ctio n s in m yocard ium and hum an m yom etrium . Folia H istochem C ytob io l 1995; 32: 4, 2 1 9 -2 2 4

[31] K IL A R S K I W M , X IN FU , B Ä C K S T R Ö M T, R O O M A N S G M U L M S T E N U. D ecrease o f gap junction pro te in in hum an m y o m etriu m at term in vitro. F olia H istochem C ytob io l 1995; 33: 3, 151-155

[32] K IL A R S K I W M , X IN FU , B Ä C K ST R Ö M T, R O O M A N S G M , U L M S T E N U. P rogeste rone, estrad io l and oxy tocin and their in vitro effect on m ain ta in ing the n um ber o f gap ju n c tio n p laques in hum an m yom etrium at term . A cta P h ysio log ica Scan d in a v ica 1996; 157: 4 6 1 -4 6 9

[33] K R E N BT, K U M A R N M , W A N G S, G IL U L A N B , ST E E R CJ. D ifferen tia l regu la tion o f m u ltip le gap ju n c tio n transcrip ts and p ro teins during rat liver regeneration . C ell B io l 1993; 123: 7 0 7 -7 1 8 .

[34] K U M A R N M , F R IE N D DS, G IL U L A NB. Synthesis and assem bly o f hum an 1 gap ju n c tio n s in B H K cells by D N A transfec tion w ith the hum an 1 cD N A . J C ell Sei 1995; 108: 3 7 2 5 -3 7 3 4 .

[35] K U M A R N M , G IL U L A N B . T he gap ju n c tio n co m m unica tion channel. C ell 1996; 84: 3 8 1 -3 8 8 .

[36] K U R A O K A A, U D A H, H A T A E T, SH IB A T A Y, IT O H M , K U R IT A T. L oca lization o f gap ju n c tio n p ro te ins, con n ex in -3 2 and connex in -26 , in rat and gu inea pig liver as revea led by qu ick -freeze , deep -e tch im m unoelectron m icroscopy. J H istochem C ytochem 1993; 41: 9 7 1 - 980.

[37] K U R Z -IS L E R G, V O IG T T, W O L B U R G H. M odu la tion o f connexon densities in gap ju n c tio n s o f horizon tal cell perikarya and axon term inals in fish retina: E ffects o f ligh t/ dark cy cles , in te rrup tion o f the op tic nerve and app lication o f dopam ine. C ell T issue R es 1992; 268: 2 6 7 -2 7 5 .

[38] L A IR D D W , P U R A N A M KL, R E V E L JP. T urn o v er and pho sp h o ry la tio n dy n am ics o f co n n ex in 43 gap ju n c tio n p rotein in cu ltu red card iac m yocytes. B iotliem ./ 1991; 273: 6 7 -7 2 .

[39] L O W K , R E E S E TS. M ultip le structural types o f gap ju n c tio n s in m ouse le n s . ./ C ell Se i 1993; 106: 2 2 7 -2 3 5 .

[40] L O W K , M IL L S A, K U C K JFR . A ctin filam ent bund les are assoc iated w ith fiber gap ju n c tio n s in the p rim ate lens. E xp E ye R es 1994; 58: 189-196 .

[41] M A L E W IC Z B, K U M A R V V , JO H N S O N R G , B A U M A N N W J. L ip ids in gap ju n ctio n assem bly and function . L ip id s 1990; 25: 419^427 .

[42] M A Z E T JL , JA N Y T , G R O S D, M A Z E T F . V oltage depen d en ce o f liver gap ju n c tio n ch annels recon stitu ted in to liposom es and inco rpora ted into p lanar b ilayers. E u r B io ch em 1992; 210: 2 4 9 -2 5 6 .

[43] M E Y E R R A , M A L E W IC Z B, B A U M A N N W J, JO H N S O N RG. Increased gap ju n c tio n assem bly be tw een cu ltu red cells upon cho lestero l supplem en tation . ./ C ell Se i 1990; 96: 2 3 1 -2 3 8 .

[44] M IN K O F F R, R U N D U S V R , P A R K E R SB, B E Y E R EC , H E R T Z B E R G EL. C onnex in express io n in the d ev elop ing avian card io v ascu la r system . C irc R es 1993; 73: 7 1 -7 8 .

[45] M U S IL L S, G O O D E N O U G H DA . M ultisubun it assem bly o f an in tegral p lasm a m em brane ch an n e l p ro tein , gap ju n c tio n connexin 43, occurs afte r ex it from the ER. C ell C am bridge M ass 1993; 74: 1 0 6 5-1078 .

[46] N E D E R G A A R D M . D irect signa ling from astrocy tes to neu rons in cu ltu res o f m am m alian b rain cells. S c ien ce 1994; 263: 1768-1771 .

http://rcin.org.pl

372 A. FIER TA K , W . KILARSK I

[47] N E V E U M J, H U L L Y JR, B A B C O C K KL, H E R T Z B E R G EL, N IC H O L S O N B J, P A U L L, P IT O T H C. M ultip le m echan ism s are responsib le for a ltered expression o f gap ju n c tio n genes du ring o n cogenesis in rat liver. J C ell Sei 1994; 107: 8 3 -9 5 .

[48] O H SY , D U P O N T E, M A D H U K A R B V , B R IA N D JP , C H A N G CC, B E Y E R E, T R O S K O JE. C h arac te riza tio n o f gap junctional co m m u n ica tio n -d efic ien t m utan ts o f a rat liver ep ith e lia l cell line. E a r J C ell B io l 1993; 60: 2 5 0 -2 5 5 .

[49] O Y A M A D A M , K IM U R A H, O Y A M A D A Y, M IY A M O T O A, O H SH IK A H. M O R I M . T he ex p ression , p h o sphory la tion and localization o f connex in 43 and gap-junctional in te rce llu la r co m m u n ica tio n during the e stab lish m en t o f a synchron ized con traction o f cu ltu red n eo n ata l rat card iac m yocytes. E xp C ell R es 1994; 212: 3 5 1 -3 5 8 .

[50] P A R P U R A V , B A S A R S K Y T A , L IU F, JE F T IN IJA K, JE F T IN IJA S, H A Y D O N PG. G lu tam ate m ed ia ted astrocy te neuron signalling . N ature 1994; 369: 7 4 4 -7 4 7 .

[51] P A U L DL. N ew functions fo r gap ju n c tio n s. C urr O pin C ell B io l 1995; 7: 665-672.[52] P U R A N A M KL, L A IR D D W , R E V E L JP. T rapping an in te rm ed iate form o f co n n ex in 43 in

the G olgi. E xp C ell R es 1993; 206: 8 5 -9 2 .[53] R A H M A N S, C A R L IL E G, E V A N S W H . A ssem bly o f hepatic gap ju n ctio n s. T o p o g rap h y

and d istribu tion o f connexin 32 in in trace llu la r and p lasm a m em branes de te rm in ed using seq u en ce-sp ecific an tibodies. J B io l C hem 1993; 268: 1260-1265 .

[54] R A S H JE, Y A S U M U R A T. Im proved structural deta il in freeze-fractu re rep licas:H ig h -an g le sh adow ing o f gap ju n c tio n s coo led below -1 7 0 °C and p ro tected by liquid n itro g en -co o led shrouds. M icro sc R es Tech 1992; 20: 187-204 .

[55] R E A U M E A G , D E S O U SA PA , K U L K A R N I S, L A N G IL L E B L , Z H U D, D A V IE S TC , JU E N JA SC, K ID D E R G M , R O S S A N T J. C ard iac m alfo rm ation in neonatal m ice lack ing co nnex in 43. Science 1995; 267: 1831-1834 .

[56] R E E D KE, W E S T P H A L E EM , L A R SO N D M , W A N G HZ, V E E N S T R A R D , B E Y E R C. M o lecu lar c lon ing and functional expression o f hum an connex in 37, an endo the lia l cell gap ju n c tio n protein . J C lin In ves t 1993; 91: 9 9 7 -1 0 0 4 .

[57] R IS E K B, K L IE R FG , G IL U L A NB. D evelopm en ta l regu lation and structural o rg an iza tio n o f conn ex in s in ep iderm al gap ju n ctio n s. D evelop B io l 1994; 164: 183-196 .

[58] R O O M A N S G M , K IL A R S K I W M , C IR A Y N, PR E S S O N B E, B Ä C S T R Ö M T, U L M S T E N U. S tructural and Functional S tud ies o f G ap Junctions in H um an M yom etrium . E a r J M o rp h o l 19 9 3 ,3 1 : 1 -2 , 5 5 -5 9 .

[59] R O S E N B E R G E, SP R A Y D C , R E ID LM . M atrix regu lation o f gap ju n c tio n s and o f ex citab ility in cells, [w]: E x trace llu la r M atrix , Z ern M A , R eid LM [red.], N ew Y ork and B asel 1993; 4 49—462.

[60] R U P D M , V E E N S T R A R D , W A N G HZ, B R IN K PR , B E Y E R EC. C hick c o nnex in 56, a novel lens gap ju n c tio n protein . J B io l C hem 1993; 268: 7 0 6 -7 1 2 .

[61] SO L O M O N S. T he p lacen ta as an endocrine organ: stero ids, [w]: T he Physio logy o f R ep ro ­duction , K nobil E, N eil J [red.], R aven Press, N ew Y ork 1988; 51

[62] S P R A Y DC. P h isio log ica l and pharm aco log ica l regu la tion o f gap ju n ctio n channels , [w]: M o lecu lar M ech an ism s o f E pithelial C ell Junctions: F rom D evelopm en t to D isease, C iti S [red.], L G L an d es C om pany , A ustin , T exas 1994; 195-215 .

[63] S P R A Y D C , D E R M IE T Z E L R. X -Iinked dom inan t C h arco t-M arie-T oo th d isease and o th er poten tial gap ju n c tio n d isease o f the nervous system . Trends N eu ro sc i 1995; 18: 2 5 6 -2 6 2 .

[64] S T A U F F E R K A , K U M A R N M , G IL U L A N B , U N W IN N. Iso la tion and p u rification o f gap ju n c tio n channels. J C ell B io l 1991; 115: 141-150 .

[65] W E R N E R R, L E V IN E E, R A B A D A N -D IE H L C, D A H L G. G ating p roperties o f co nnex in 32 cell-cell ch annels and their m utan ts expressed in X enopus oocytes. P roc R Soc L on d o n 1991; S e rB 243: 5 -1 1 .

[66 ] W H IT E T W , B R U Z Z O N E R, W O L F R A M S, P A U L D L, G O O D E N O U G H DA. S e lec tive in te rac tions am ong the m ultip le connexin p ro teins expressed in the v erteb rate lens: the second

http://rcin.org.pl

PO Ł Ą C Z EN IA SZ C Z E L IN O W E 373

ex trace llu la r dom ain is a determ inan t o f com patib ility betw een connexins. J C ell B io l 1994; 125: 8 7 9 -8 9 2 .

[67] W H IT E T W , PA U L DL, G O O D E N O U G H D A , B R U Z Z O N E R. F unctional analysis o f se lec tiv e in te rac tions am ong rodent connexins. M o l B io l C ell 1995; 6 : 4 5 9 -4 7 0 .

[68] W IL L E C K E K, JU N G B L U T H S, D A H L E, H E N N E M A N N H, H E Y N K E S R, G R Z E S C H IKH. Six g enes o f the hum an connexin gene fam ily cod ing for gap ju n ctio n al p ro te ins are assigned to fo u r d ifferen t hum an ch rom osom es. E u r J C ell B io l 1990; 53: 2 7 5 -2 8 0 .

[69] W O L B U R G H, R O H L M A N N A. S truc tu re-F unction R ela tionsh ips in G ap Ju n ctions. In t R ev C yto l 1995; 157: 3 1 5 -3 7 3 .

[70] W O L S Z O N LR , G A O W Q , PA S S A N I M B, M A C A G N O ER. G row th cone "collapse" in vivo: A re inh ib ito ry in te rac tions m ediated by gap ju n c tio n s? J N eu ro sc i 1994; 14; 9 9 9 -1 0 1 0 .

[71] Y A M A M O T O T, K A R D A M I E, N A G Y JI. B asic fib rob last g row th fac to r in rat brain. L o ca liza tio n to g lial gap ju n c tio n s co rre la tes w ith co nnex in 43 d istribu tion . Brain Res 1991; 5 5 4 :3 3 6 -3 4 3 .

[72] Y A M A S A K I H, N A U S C C G . R ole o f connex in genes in grow th contro l. C arcin o g en esis 1996; 6 :1 1 9 9 -1 2 1 3

[73] Y O S T HJ. V erteb ra te left-righ t developm ent. C ell 1995; 82: 689-692.

R edaktor prow adzący - Szczepan Biliński

O trzym ano: 1 2 .0 3 .1 9 9 7 r.P rzy ję to : 2 2 .0 4 .1 9 9 7 r.A d re s au tora : In s ty tu t Z o o lo g ii UJ,3 0 -0 6 0 K raków , u l R. Ing a rd en a 6

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

PO STĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (375-386)

BIAŁKA SURFAKTANTU

T H E P R O T E IN S O F T H E S U R F A C T A N T

Krzysztof HELEW SKI, Grażyna KOW ALCZYK-ZIOMEK, Janusz KONECKI,Maria GŁOW ACKA

I Katedra i Zakład Histologii i Embriologii Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu

Streszczenie : W niniejszej pracy autorzy opisują budowę, funkcję i wydzielanie specyficznych białek surfaktantu płucnego. Ws'rod tych białek wyróżnia się białko A (SP-A), białko B (SP-B), białko C (SP-C) i białko D (SP-D). Dwa z nich, SP-A i SP-D są duże i hydrofilne, a pozostałe dwa SP-B i SP-C są małe i silnie hydrofobowe.

Słow a kluczowe: surfaktant płucny, białka surfaktantu, komórki pęcherzykow e typu II

Summary: The authors describe structure, function and secretion o f specific proteins o f the lung surfactant.From these proteins one distinguishes: surfactant protein A (SP-A), protein B (SP-B), protein C (SP-C ), protein D (SP-D). SP-A and SP-D are big and hydrophilous and the rem ainder, namely SP-B and SP-C are small and hydrophobously strong.

Key words: lung surfactant, surfactant proteins, alveolar type II cells

WSTĘP

Charakterystyczną cechą komórek pęcherzykowych typu II jest występowanie w ich cytoplazmie ciałek blaszkowatych odpowiedzialnych za magazynowanie sur­faktantu [45,68]. Surfaktant wyścielający nabłonek pęcherzyków płucnych ma wła­ściw ości detergentu obniżającego napięcie pow ierzchniow e w ystępujące w pęcherzykach płucnych. Zapobiega to zapadaniu się pęcherzyków płucnych w czasie wydechu oraz gromadzeniu się płynu w ich świetle. Surfaktant wpływa także po­średnio na wilgotność powietrza oddechowego stabilizując zawartość wody w hi-

http://rcin.org.pl

376 K. H ELEW SK I ET AL.

pofazie oraz bierze udział w systemie obronnym organizmu zwiększając między innymi fagocytozę drobnoustrojów przez makrofagi pęcherzykowe [29,50].

Głównym składnikiem chemicznym surfaktantu stanowiącym około 90% są lipidy. Ponadto surfaktant składa się w 7-10% z białek i w około 2% z węglowodanów [29]. Pod względem morfologicznym surfaktant składa się z dwóch warstw. Pierwszą z nich, przylegającą bezpośrednio do nabłonka oddechowego jest hipofaza, składająca się z hydrofilnej substancji bogatej w białka. Leżąca nad nią epifaza jest cieńsza i zawiera przede wszystkim fosfolipidy, wśród których przeważa dwupalmitynian fosfatydylocholiny.

Najlepiej poznanym składnikiem surfaktantu są fosfolipidy, natomiast stosunkowo niewiele wiadomo o białkach, wśród których wyróżnia się cztery białka specyficzne określane jako apoproteiny surfaktantu. W surfaktancie występują również niewielkie ilości białek surowicy, takich jak: albuminy, immunoglobulina G i fibrynogen [36,49,73].

Niniejsza praca ma na celu omówienie budowy, funkcji i wydzielania specy­ficznych białek surfaktantu. Do apoprotein surfaktantu należą białko A (SP-A), białko B (SP-B), białko C (SP-C) i białko D (SP-D). Dwa z nich SP-A i SP-D są duże i rozpuszczalne w wodzie, podczas gdy SP-B i SP-C są małe, silnie hy­drofobowe i stanowią 1-2% masy surfaktantu, przy czym stosunek molarny SP-B /SP-C wynosi około 1: 2 [26].

BIAŁKO A SURFAKTANTU

Do najwcześniej zidentyfikowanych białek surfaktantu należy sialoglikoproteina określana mianem białka A surfaktantu. Została ona opisana po raz pierwszy w roku 1972 przez R. Kinga i J. Clementsa [28]. SP-A stanowi prawie 50% całkowitej ilości białek surfaktantu i obejmuje grupę cząsteczek o różnej masie (26-38 kDa) oraz różnym ładunku elektrycznym (punkty izoelektryczne pH 4-5) [26,36]. Różnice te są spowodowane dużą ilością modyfikacji post-translacyjnych jego cząsteczek. Białko A składa się z łańcuchów polipeptydowych, zawierających na końcu N sekwencje podobne do kolagenu, a na końcu C reszty charakterystyczne dla lektyny typu C [4,22,47]. W pęcherzyku płucnym białko A surfaktantu występuje jako polimer złożony z sześciu potrójnych spiral łańcuchów polipeptydowych (18 łańcuchów) o masie cząsteczkowej około 700 kDa, co w mikroskopie elektronowym widziane jest w postaci charakterystycznej struktury "bukietu tulipanów" [ 4,20]. Poznanie składu i sekwencji aminokwasów tego białka stało się możliwe po wyizolowaniu genu odpowiedzialnego za jego syntezę. Białko A jest uważane za lektynę typu C lub zależną od jonów wapnia i podobnie jak kilka innych związków o podobnych właściwościach należy do grupy białek zwanych kolektynami [ 44]. Istnieją sprzeczne

http://rcin.org.pl

BIA ŁK A SU R FA K TA N T U 377

informacje dotyczące komórkowego rozmieszczenia SP-A. Uważa się, że białko A występuje głównie w ciałkach blaszkowatych [1,72], choć istnieją doniesienia dotyczące izolowanych ciałek blaszkowatych płuc szczura [40] oraz ciałek bla­szkowatych pochodzących z hodowli płodowych płuc ludzkich [17], w których ilość SP-A jest stosunkowo niewielka. Pogodzeniem tych dwóch sprzecznych kon­cepcji mogą być opublikowane przez Groniowskiego jeszcze w roku 1983 wyniki wskazujące na dwa kierunki rozmieszczenia SP-A w pneumocytach typu Ił. Jeden z nich prowadzi od aparatu Golgiego do wewnętrznej powierzchni błony otaczającej ciałka blaszkowate, a drugi pomijając ciałka blaszkowate prowadzi do błony pla- zmatycznej komórki pęcherzykowej typu II i tworzy na jej powierzchni pokład hydrofilny [19]. Co więcej doświadczenia przeprowadzone in vivo sugerują, że białko A surfaktantu jest wydzielane z komórek typu II inną drogą niż ciałka bla­szkowate [ 18,23].Wydaje się również, że wydzielanie SP-A z izolowanych komórek typu II ma określony poziom i nie podlega regulacji [18,46]. Z drugiej strony wiadomo jednak, że SP-A bierze udział w regulacji ilości pęcherzykowego .sur­faktantu w drodze sprzężenia zwrotnego i może powodować regulację wydzielania samego SP-A.

Białko A surfaktantu ma zdolność wiązania lipidów i węglowodanów oraz od­działywania ze specyficznymi receptorami powierzchni komórek pęcherzykowych typu II [67]. W iązanie SP-A z receptorami jest możliwe dzięki obecności reszt węglowodanowych, natomiast reakcja z lipidami zachodzi przez hydrofobową część cząsteczki [33]. SP-A mocno związane z fosfolipidami surfaktantu, w obecności SP-B, SP-C i jonów wapnia powoduje przekształcanie się ciałek blaszkowatych w tubularne struktury mielinowe [47]. Białko A surfaktantu przy współudziale SP-B i SP-C bierze także udział w tworzeniu cienkiej fosfolipidowej warstwy wyścielającej powierzchnię pęcherzyków płucnych, powodującej zmniejszenie napięcia powie­rzchniowego [21,55]. Mimo iż SP-A jest organizatorem struktur tubularnych, to jego brak nie upośledza w sposób znaczący aktywności surfaktantu jako całości.

Białko A zwiększa wchłanianie fosfolipidów z przestrzeni pęcherzykowej i hamuje w ydzielanie fosfatydylocholiny surfaktantu przez izolowane komórki typu II [8,22,29,33,57]. Procesy te zachodzą poprzez połączenie się SP-A z wysoce spe­cyficznymi receptorami zlokalizowanymi na szczytowej powierzchni komórek typu II [22,51] dzięki resztom końca C o sekwencji niepodobnej do kolagenu [35].

Istotną funkcją SP-A jest również udział w mechanizmach obronnych płuc. W y­kazano, że SP-A wiąże się z makrofagami pęcherzykowymi [56,73] zwiększając ich zdolność do migracji i fagocytozy w odpowiedzi na endotoksyny [26,34,41,69]. W łaściwości związane z obroną organizmu przed drobnoustrojami potwierdza po­dobieństwo budowy tego białka do składnika C lq dopełniacza [62]. Białko A surfaktantu wpływa także na funkcję komórek immunologicznych w płucach, re­gulując produkcję cytokinin i wydzielanie immunoglobulin. SP-A zwiększa poziom mediatorów zapalenia, takich jak czynnik T N F -a oraz interleukiny - l a , -1[3 i

http://rcin.org.pl

378 K. H ELEW SK I ET AL.

6 [29]. Cytokininy te powodują proliferację i różnicowanie się limfocytów oraz oddziaływują na makrofagi, neutrofile i komórki śródbłonkowe. Pobudzają one również wzrost produkcji kolagenu przez fibroblasty, co może mieć szkodliwy wpływ na strukturę płuc. Udowodniono także, że SP-A zwiększa produkcję immu- noglobulin IgA, IgG i IgM [29]. W związku z hamującym działaniem lipidów surfaktantu na wyżej opisane procesy sugeruje się, że normalna równowaga immu­nologiczna jest wynikiem odpowiednich proporcji lipidów i białka A surfaktantu. Całkowite lub względne zwiększenie ilości SP-A prowadzi do pobudzenia funkcji komórek immunologicznych. Potwierdzeniem tego jest wzrost ilości SP-A przy niskim poziomie lipidów surfaktantu u pacjentów z zapaleniem płuc wywołanym przez P. carinii [24,42] czy spadek ilości lipidów u chorych zarażonych wirusem HIV [15].

BIAŁKO B SURFAKTANTU

Białko B surfaktantu (SP-B) ma właściwości silnie hydrofobowe, charaktery­styczne dla białek wbudowanych w struktury błon komórkowych. Ten proteolipid pozostaje związany z fosfolipidami surfaktantu nawet podczas ekstrahowania rozpu­szczalnikami organicznymi [21]. Świadczy to o rozmieszczeniu cząsteczek SP-B w głębi blaszek lipidowych ciałek blaszkowatych, a także innych struktur surfaktantu [47,66].

Białko B surfaktantu jest syntetyzowane w postaci prekursorowego polipeptydu0 masie cząsteczkowej 40-42 kDa. Proteolipid pochodzący z formy prekursorowej ma masę cząsteczkową 7 kDa w formie zredukowanej i 18 kDa w formie nie- zredukowanej [47]. SP-B składa się z 79 aminokwasów [32], zawiera siedem reszt cysternowych, z których sześć tworzy trzy wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiar- czkowe. Siódma bierze udział w wiązaniu dwusiarczkowym pomiędzy dwoma czą­steczkami SP-B tworzącymi dimer [25,26,64].

SP-B ma biofizyczne cechy zwiększające efektywność surfaktantu. W pływa ono na fosfolipidy, powodując szybką ich adsorbcję na granicy faz, co prowadzi do znacznego obniżenia napięcia powierzchniowego [21,24,54]. Wraz z białkiem A1 C surfaktantu SP-B bierze udział w tworzeniu tubularnych struktur mielinowych [26]. U dzieci z dziedzicznym niedoborem SP-B w przebiegu proteinozy pęche­rzykowej obserwowano nie tylko brak tworzenia się tubularnych struktur mieli­nowych,ale i zaburzenia w ilości i rozmieszczeniu białka A i białka C. Ilościowemu wzrostowi tych białek towarzyszyło nieprawidłowe ich rozmieszczenie między ko­mórkami pęcherzykowymi typu II a ich błoną podstawną pomimo nieuszkodzonych złącz komórkowych [14]. Może to sugerować istotną rolę SP-B w wydzielaniu surfaktantu.

http://rcin.org.pl

BIA ŁK A SU RFA K TA N T U 379

Ponadto SP-B bierze udział w stabilizacji fosfolipidów surfaktantu. Cząsteczki tego białka połączone są z fosfolipidami specjalnymi wiązaniami, co ułatwia i przy­spiesza obniżanie napięcia powierzchniowego [52,73].

Dodać należy, że badania immunocytochemiczne wskazują, iż SP-A i SP-B są także syntetyzowane w nieorzęsionych komórkach oskrzelikowych tzw. komórkach Clara. Nie wiadomo jednak, czy synteza tych białek dostarcza znaczących ilości białek do systemu pęcherzykowego surfaktantu [26].

BIAŁKO C SURFAKTANTU

Białko C surfaktantu (SP-C), podobnie jak SP-B, jest silnie hydrofobowym pro- teolipidem otrzymanym przez proteolizę z prekursora o masie cząsteczkowej 22 kDa. Jego forma niezredukowana ma masę 10 kDa, a zredukowana 5 kDa [47]. SP-C składa się z około 35 aminokwasów o unikalnym układzie poliwaliny i zawiera dwie reszty kwasu palmitynowego połączone kowalentnie z cysteiną na końcu ami­nowym białka [13,26], co decyduje o jego hydrofobowych właściwościach [63]. W części środkowej dojrzałego peptydu 20 hydrofobowych aminokwasów tworzy a-helisę, odpowiedzialną za powstanie podwójnej warstwy lipidowej surfaktantu [26,58]. Sposób wydzielania SP-B i SP-C nie jest dokładnie poznany, ale wiadomo, że występują one w ciałkach blaszkowatych [40]. SP-C podobnie jak białko B surfaktantu bierze udział w obniżaniu napięcia powierzchniowego, lecz jego działanie jest słabsze [21,24]. Znaczenie tych białek podkreśla fakt, że u dzieci z zespołem zaburzeń oddychania (RDS) leczenie za pomocą surfaktantu zawierającego SP-B i SP-C jest skuteczniejsze niż przy użyciu syntetycznego surfaktantu pozbawionego tych białek [26].

BIAŁKO D SURFAKTANTU

Białko D surfaktantu (SP-D) jest lektyną kolagenową typu C [39] o budowie podobnej do SP-A, białka surowicy wiążącego mannozę oraz konglutyniny bydlęcej [9,12]. Sekwencja podobna do kolagenu w białku D surfaktantu jest znacznie dłuższa od tej występującej w SP-A [12]. SP-D jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej około 43 kDa [10,11]. Składa się ono z czterech trójłańcuchowych podjednostek tworzących 12-mer, który następnie może łączyć się w cząsteczki o bardziej złożonej strukturze [7,9,26]. Natomiast pojedynczy łańcuch SP-D składa się z krótkiej se­kwencji niepodobnej do kolagenu zawierającej 2 reszty cysteiny na końcu aminowym, sekwencję podobną do kolagenu, krótki fragment ułożony w a-helisę oraz nie­

http://rcin.org.pl

380 K. H ELEW SK I ET AL.

podobny do kolagenu odcinek na końcu C wykazujący duże podobieństwo z innymi lektynami typu C [10,12]. Ze względu na fakt, że wykazano obecność SP-D zarówno w komórkach pęcherzykowych typu II, jak i w ziarnach wydzielniczych komórek Clara [11] oraz w makrofagach pęcherzykowych [61] jest ono wydzielane nie tylko na powierzchnię pęcherzyków płucnych, ale i do światła dystalnych dróg odde­chowych [9]. Jednakże ciałka blaszkowate nie zawierają SP-D [61]. Ze względu na podobieństwo budowy SP-D do białka A surfaktantu mają one podobne znaczenie. Wykazano, że SP-D bierze udział w mechanizmach obronnych płuc. Białko to oddziaływuje z wieloma mikroorganizmami (Escherichia coli) oraz łączy się z m akrofagam i, pow odując przy dużych stężeniach aglutynację bakterii [10,26,30]. O ile SP-A łączy się z dipalmitylofosfatydylocholiną, to białko D sur­faktantu wybiórczo łączy się z fosfatydyloinozytolem [37]. Sugeruje to, że wraz z białkiem A surfaktantu, SP-D bierze udział w zewnątrzkomórkowym metabolizmie surfaktantu [9,10,37].

REGULACJA WYDZIELANIA BIAŁEK SURFAKTANTU

Synteza białek surfaktantu jest zależna zarówno od wieku płodu jak i od wpływu szeregu czynników hormonalnych [47,65]. SP-B i SP-C pojawiają się we wcześ­niejszym okresie ciąży niż SP-A, co potwierdza fakt, że mRNA dla ludzkiego SP-B i SP-C są wykrywane od drugiego trymestru, podczas gdy mRNA dla SP-A pojawia się od trzeciego trymestru ciąży [31]. Wiadomo również, że u zarodków myszy tworzenie ciałek blaszkowatych poprzedza pojawienie się SP-A. W ewnątrz­komórkowe przekształcenia i wydzielanie SP-A jest uwarunkowane hydroksylacją proliny, natomiast SP-B i SP-C jest prawdopodobnie regulowane niezależnie po­nieważ nie stwierdzono wyraźnych zależności między poziomami ich odpowiednich mRNA w płucach [31].

Jednym z najważniejszych hormonów regulujących syntezę białek surfaktantu są wydzielane przez korę nadnerczy glikokortykoidy. Wykazano, że poziom SP-B i SP-C w płucach płodu wzrasta po podaniu glikokortykoidów [2], przy czym w przypadku SP-B działanie to polega na wzroście transkrypcji i stabilności mRNA, a w przypadku SP-C na wzroście tylko transkrypcji bez zmian w stabilności mRNA [60]. Natomiast wpływ glikokortykoidów na syntezę SP-A nie jest jednoznaczny. Opisano zarówno pobudzający, jak i hamujący wpływ tego hormonu na syntezę SP-A i jego mRNA [47]. W yjaśnieniem takiego wpływu jest prawdopodobnie fakt, że SP-A wykazuje zależną od dawki odpowiedź na podawanie glikokortykoidów, gdzie za pobudzenie lub hamowanie jego syntezy są odpowiedzialne odpowiednio wzrost transkrypcji i zmniejszenie stabilności mRNA. Pobudzający wpływ gliko-

http://rcin.org.pl

BIAŁKA SU R FA K TA N T U 381

kortykoidów na poziom SP-A może być także zależny od gatunku oraz okresu rozwoju płodu, w którym działanie tych hormonów się rozpoczęło [47].

Innym istotnym czynnikiem regulującym syntezę białek surfaktantu jest cAMP i jego analogi. Podanie ich powoduje wzrost poziomu mRNA i syntezy SP-A w płodowych płucach królika oraz płucach ludzkich zarodków. W odróżnieniu od- znacznego efektu analogów cAMP na syntezę SP-A, w przypadku SP-B i SP-C obserwuje się jedynie nieznaczny ich wpływ na poziomy odpowiednich mRNA w płucach ludzkich płodu [31]. Jednakże badania płodowych płuc szczura wskazują na mniejszy wpływ analogów cAMP na poziom mRNA dla SP-B [16], a większy w przypadku mRNA dla SP-C [59]. W badaniach płodowych płuc królika wykazano, że analogi cAMP powodują dwukrotny wzrost gromadzenia się mRNA dla SP-C po 48 godzinach od ich podania [5]. Istnieją także doniesienia, że wpływ gliko- kortykoidów i cAMP jest sumujący się w odniesieniu do syntezy SP-A i SP-B [26].

Synteza SP-D ma ścisły związek z okresem rozwojowym płodu. W badaniach płodowych płuc szczura SP-D pojawiało się po raz pierwszy w 19 dniu ciąży i następnie jego ilość szybko wzrastała do poziomu obserwowanego w płucach do­rosłych osobników [38]. W innych badaniach, mRNA dla SP-D oznaczono po raz pierwszy w płodowych płucach szczura w 21 dniu ciąży [11]. Badania te wskazują, że synteza SP-D zachodzi w okresie późniejszym niż synteza fosfolipidów oraz innych białek surfaktantu.

RECYLKULACJA BIAŁEK SURFAKTANTU

Po spełnieniu roli czynnika obniżającego napięcie powierzchniowe, surfaktant jest usuwany z pęcherzyków płucnych pozostawiając miejsce dla nowo syntety­zowanych i wydzielanych cząsteczek. Większość fosfolipidów opuszcza pęcherzyki płucne i wchodzi ponownie do komórek typu II [68]. Ponadto niewielka ilość sur­faktantu jest pochłaniana i rozkładana przez makrofagi pęcherzykowe [70], a na­stępnie usuwana przez drogi oddechowe i układ krążenia.

W iadomo również, że wraz z lipidami SP-A, SP-B i SP-C także wchodzą ponownie do komórek pęcherzykowych typu II [3,6,71]. Co więcej istnieją dane mówiące, że SP-C przechodzi do komórek pęcherzykowych typu II szybciej niż fosfatydy- locholina [3]. W yższa zawartość SP-A niż SP-B czy SP-C w pęcherzykach płucnych w zestawieniu z niższą zawartością SP-A w porównaniu z SP-B czy SP-C w ciałkach blaszkowatych, może sugerować dłuższy okres przebywania SP-A w pęcherzyku płucnym lub inne drogi wydzielania dla SP-A i białek hydrofobowych surfaktantu [18]. W ykazano, że w przypadku SP-A przechodzenie do komórek pęcherzykowych

http://rcin.org.pl

382 K. H ELEW SK I E T AL.

typu II jest procesem endocytozy pośredniczonej przez receptor o wysokim po­winowactwie do tego białka.

Autoradiografiaz zastosowaniem mikroskopu elektronowego wykazała, że jedynie komórki pęcherzykowe typu II oraz makrofagi pęcherzykowe pochłaniają znaczące ilości znakowanego SP-A czy fosfatydylocholiny [71]. Inne komórki przegrody pęcherzykowej, a także komórki Clara nie uczestniczą w recyrkulacji.

Po przejściu przez błonę komórkową komórek pęcherzykowych typu II SP-A i SP-B oraz fosfatydylocholina są obecne początkowo w ciałkach wielopęcherzy- kowych, a w kilka minut później są już znajdowane w ciałkach blaszkowatych. SP-A znajduje się jedynie w ciałkach wielopęcherzykowych jasnych elektronowo podczas gdy fosfatydylocholina występuje zarówno w ciałkach wielopęcherzyko­wych jasnych elektronowo, jak i gęstych elektronowo [71]. Istnieje możliwość, że ciałka wielopęcherzykowe gęste elektronowo zawierają materiał podlegający rozkładowi i ponownemu użyciu do syntezy, podczas gdy ciałka wielopęcherzykowe jasne elektronowo wbudowywują swoją zawartość bezpośrednio do ciałek blasz­kowatych. Tak więc SP-A wprowadza podlegającą recyrkulacji pulę fosfolipidów do ciałek blaszkowatych chroniąc je przed rozkładem [47].

W związku z faktem, że lektyny są wchłaniane przez komórki pęcherzykowe typu II i przenoszone do ciałek blaszkowatych, SP-D podobnie jak SP-A mając cechy budowy lektyny może brać udział w recyrkulacji surfaktantu [26].

ZAKOŃCZENIE

Badania nad białkami surfaktantu nabierają szczególnego znaczenia ze względu na zastosowanie kliniczne egzogennych preparatów surfaktantu [43,48,53].

M etabolizm surfaktantu obejmuje zarówno rozkład lipidów i białek, jak i ich recyrkulację do ciałek blaszkowatych. Niezbędne jest poznanie mechanizmów ko­mórkowych określających, które składniki surfaktantu są rozkładane, a które pod­legają recyrkulacji. Zrozumienie tych procesów pozwoli na bardziej skuteczne zastosowanie leków w leczeniu RDS oraz programowanie składu egzogennych pre­paratów surfaktantu. Stwierdzono bowiem wyższą efektywność leczenia prepa­ratami surfaktantu zawierającym i białka [27].Szczególną rolę odgrywają tutaj hydrofobowe białka SP-B i SP-C, którym przypisuje się główną rolę w obniżaniu napięcia powierzchniowego.

LITERATURA

[1] A L C O R N IL, M E N D E L S O N C R .T ra ffick ing o f su rfactan t p ro tein A in fetal rabb it lung inorgan cu ltu re. A m J P h ysio l 1993; 264: L 2 7 -L 35.

http://rcin.org.pl

BIA ŁK A SU R FA K TA N T U 383

[2] B A L L A R D PL, E R T S E Y R, G O N Z A L E S LW , G O N Z A L E S J. T ranscrip tiona l regu la tion o f hum an pu lm onary su rfactan t pro teins SP-B and SP-C by g lucocortico ids. A m J R esp ir C ell M ol B io l 1996; 14: 5 9 9 -6 0 7 .

[3] B A R IT U S S IO A, P E T T E N A Z Z O A , B E N E V E N T O M, A L B E R T I A, G A M B A P. S urfactan t p ro te in C is recycled from the a lveoli to the lam ellar bodies. A m J P hysio l 1992; 263: L 6 0 7 -L 611.

[4] B A T E S SR, D O D IA C, F IS H E R AB. Surfactan t protein A regu lates up take o f pu lm onary su rfactan t by lung type II cells on m icroporous m em branes. A m J P hysio l 1994: 267: (L ung Cell M ol Physio l) L 7 5 3 -L 760.

[5] B O G G A R A M V, M A R G A N A RK. R abbit su rfactan t p rotein C: cD N A clo n in g and regu la tion o f a lte rna tive ly sp liced su rfactan t p ro tein C m R N A s. A m J P hysio l 1992; 263: L 6 3 4 -L 644.

[6] B R E S L IN JS, W E A V E R T. B ind ing , uptake, and localization o f su rfactan t pro tein B in iso lated ra t a lv eo lar type II cells. A m J P hysio l 1992; 262: L 699 - L 707.

[7] B R O W N A U G S B U R G E R P, C H A N G D, R U S T K, C R O U C H EC. B iosyn thesis o f surfactan t p ro te in D. C o n tribu tions o f conserved N H 2-term inal cyste ine residues and co llagen helix fo rm atio n to assem bly and secretion . J B io l C hem 1996; 271: 18912-18919 .

[8] C O R B E T A, B E D I H, O W E N S M , T A E U S C H W . Surfactan t p ro tein -A inh ib its lavage-indu­ced su rfactan t secretion in new born rabbits. A m J M ed Sc i 1992; 304: 2 4 6 -2 5 1 .

[9] C R O U C H E, C H A N G D, R U S T K, PE R S SO N A, H E U S E R J. R eco m b in an t pu lm onary su rfac tan t protein D. P ost-transla tional m odification and m olecu lar assem bly . ./ B iol C hem 1 9 9 4 ;2 6 9 :1 5 8 0 8 -1 5 8 1 3 .

[10] C R O U C H E, P E R S SO N A, C H A N G D, H E U S E R J. M olecu lar struc tu re o f pu lm onary su rfac tan t p ro te in D (SP-D ). J B io l C hem 1994; 269: 17311-17319 .

[11] C R O U C H E, R U S T K, M A R IE N C H E K W , P A R G H ID , C H A N G D, PE R S S O N A. D ev elo p ­m ental ex p ression o f pu lm onary surfactan t p ro tein D (SP-D ). A m J R esp C ell M ol B io l 1991; 5: 13-18 .

[12] C R O U C H E, R U S T K, V E IL E R, D O N IS - K E L L E R H, G R O SS O L. G enom ic o rgan ization o f hum an su rfactan t protein D (S P -D ).S P -D is encoded on ch ro m osom e 10 q 2 2 .2 -2 3 .1 ../ B io l C hem 1993; 268: 2 9 7 6 -2 9 8 3 .

[13] C U R S T E D T T , JO H A N S S O N J, P E R S SO N P, E K L U N D A, R O B E R T S O N B. L O W E N A D ­L E R B, JO R N V A L L H. H ydrophobic surfactan t - associated po lypep tides : SP-C is a Iipopep- tide w ith tw o p a lm itoy la ted cysteine residues, w hereas SP-B lacks covalen tly linked fatty acyl g roups. P roc N a tl A c a d Sci USA 1990; 87: 2 9 8 5 -2 9 8 9 .

[14] D eM eL L O D E , H E Y M A N S, P H E L PS DS, H A M V A S A, N O G E E L, C O L E S, C O L T E N H R . U ltras tru c tu re o f lung in su rfactan t p ro tein B defic iency . A m J R esp ir M ol B iol 1994; 11: 2 3 0 -2 3 9 .

[15] E S C A M IL L A R, P R E V O S T M C, C A R IV E N C, H E R M A N T C ,K R E M P F M , C H A P H. B ro n ch o a lv eo la r lavage phospho lip id abnorm alities in H IV -in fected patients. E u r R esp ir J 1993; 6 : 1301 -1 3 0 7 .

[16] F L O R O S J, G R O S S I, N IC H O L S KV , V E L E T Z A SV , D Y N IA D W , LU H, W IL S O N C M , P E T E R E C SM . H orm onal e ffects on the surfactan t protein B (SP-B ) m R N A in cu ltu red fetal ra t lung. A m J R esp C ell M ol B io l 1991; 4: 4 4 9 -4 5 4 .

[17] F R O H D, B A L L A R D PL, W IL L IA M S M C , G O N Z A L E S J, G O E R K E J. O D O M M W , G O N Z A L E S L W . L am ellar bodies o f cu ltu red hum an fetal lung : con ten t o f su rfactan t p ro tein A (SP -A ), su rface film form ation and structu ral transfo rm ation in vitro. B ioch im B iophvs A cta 1990; 1052: 7 8 -8 9 .

[18] F R O H D, G O N Z A L E S LW , B A L L A R D PL. Secretion o f surfactan t p ro tein A and p h o sp h a ti­d y lch o lin e from type II cells o f hum an fetal lung. A m J R esp ir C ell M o ll B io l 1993; 8 : 5 5 6 -5 6 1 .

[19] G R O N IO W S K I J. U ltrastruc tu re o f the P u lm onary A lv eo la r L in ing L ayer. P u b lished for the N a tio n a l L ib ra ry o f M ed icine and the N ational Sc ience F oundation . W ash in g to n D .C .: W arsaw 1983.

http://rcin.org.pl

384 K. H ELEW SK I E T AL.

[20] H A T T O R I A, K U R O K I Y, SO H M A H, O G A S A W A R A Y, A K IN O T. H um an su rfactan t p ro tein A w ith tw o d istinct o ligom eric structu res w hich exh ib it d ifferen t cap acitie s to in te rac t w ith a lveo lar type II cells. B iochem J 1996; 317: 9 3 9 -9 4 4 .

[21] H A W G O O D S, SH IFF E R K. S tructures and p roperties o f the su rfac tan t - asso c ia ted p ro teins. A n n a R ev P hysio l 1991; 53: 37 5 -3 9 4 .

[22] H IR A IK E N, SO H M A H, K U R O K I Y, A K IN O T. E pitope m app ing for m o noclonal antibody against hum an surfactan t pro tein A (SP-A ) that a lters recep to r b ind ing o f SP-A and the S P -A -dependen t regu la tion o f phospho lip id secretion by a lveo lar type II cells. B ioch im B iophys A cta 1995; 1257: 2 1 4 -2 2 2 .

[23] IK E G A M IM , L E W IS JF, T A B O R B, R ID E R ED , JO B E AH. Surfactan t p ro te in A m etabo lism in p re term ven tilated lam bs. A m J P hysio l 1992; 262: L 7 6 5 -L 772.

[24] JA V O R K A K, C A L K O V S K A A. P lucny surfak tan tovy faktor. Sucasne p oznatky , sm ery vyskum u a pouzitie u k lin ickej praxi. B ra tis l L ek L isty 1994; 95: 4 5 2 -4 5 6 .

[25] JO H A N S S O N J, C U R S T E D T T, JO R N V A L L H. Surfactan t pro tein B : d isu lfid e bridges, struc tura l p roperties , and k ring le sim ilarities. B iochem istry 1991; 30: 6 9 1 7 -6 9 2 1 .

[26] JO H A N S S O N J, C U R S T E D T T, R O B E R T S O N B. T he pro teins o f the su rfactan t system . E u r R e s p ir J 1994; 7: 3 7 2 -3 9 1 .

[27] JO H A N S S O N J, C U R S T E D T T, R O B E R T S O N B. Synthetic pro tein an alo g u es in artificial su rfactan ts . A cta P ed ia tr 1996; 85: 6 4 2 -6 4 6 .

[28] K IN G R J, C L E M E N T S JA . Surface-active m ateria ls from dog lung. I. M ethod o f iso lation . A m J P h ysio l 1972; 223: 7 0 7 -7 1 4 .

[29] K R E M L E V SG , P H E L PS DS. Surfactan t protein A stim ula tion o f in flam m ato ry cy tok ine and im m unog lobu lin production . A m J P hysio l 1994; 11: L 7 1 2 - L 719.

[30] K U A N SF, R U S T K, C R O U C H E. In teractions o f su rfactan t protein D w ith bacteria l lipopo lysaccharides. Surfactan t pro tein D is an E scherich ia co li - b ind ing protein in b roncho- a lv eo lar lavage. J Clin In ves t 1992; 90: 9 7 -1 0 6 .

[31] L IL E Y H G , W H IT E RT, W A R R RG , B E N S O N BJ, H A W G O O D S, B A L L A R D PL. R eg u la tio n o f m essen g er R N A s fo r the hydrophob ic su rfactan t p ro te ins in hum an lu n g . ./ Clin In vest 1989; 83: 1191-1197 .

[32] L IN S, A K IN B I HT, B R E S L IN JS, W E A V E R TE. S tructural requ irem en ts for targ e tin g o f su rfactan t p ro te in B (SP-B ) to secretory g ranu les in vitro and in vivo. J B io l C hem 1996; 271: 1 9 6 8 9 -19695 .

[33] M cC O R M A C K FX , K U R O K I Y, S T E W A R T JJ, M A SO N RJ, V O E L K E R DR .S urfac tan t pro tein A am ino acids G lu 195 and A rg 197 are essen tia l fo r recep to r b ind ing phospho lip id aggrega tion , regu la tion o f secre tion and the facilitated up take o f p hospho lip id bv type II cells. J B io l C hem 1994; 269: 2 9 8 0 1 -2 9 8 0 7 .

[34] M cN E E L Y TB , C O O N R O D JD . C o m parison o f the opsonic activ ity o f hum an surfactan t p ro te in A fo r S ta p h ylo co ccu s aureus and S trep to co ccu s p n eu m o n ia e w ith rabb it and hum an m a c ro p h a g e s ../ In fec t D is 1993; 167: 9 1 -9 7 .

[35] M U R A T A Y, K U R O K I Y, A K IN O T. R ole o f th eC -te rm in a l dom ain o f pu lm onary surfactan t pro tein A in b ind ing to a lv eo lar type II cells and regu la tion o f phospho lip id secretion . B iochem J 1993; 291: 7 1 -7 6 .

[36] N G V L, H E R N D O N V L, M E N D E L S O N CR, SN Y D E R JM . C h arac te riza tion o f rabbit su rfac tan t-asso c ia ted p ro teins. B ioch im B iophys A cta 1983; 754: 2 1 8 -2 2 6 .

[37] O G A S A W A R A Y, K U R O K I Y, A K IN O T . Pu lm onary surfactan t p ro tein D sp ec ifica lly binds to p h o sp h a tidy linosito l. J B io l C hem 1992; 267: 2 1 2 4 4 -2 1 2 4 9 .

[38] O G A S A W A R A Y, K U R O K I Y, S H IR A T O R IM , SH IM IZ U H, M IY A M U R A K, A K IN O T. O n togeny o f su rfactan t apopro te in D, SP-D , in the rat lung. B iochim B iophys A cta 1991; 1083: 2 5 2 -2 5 6 .

http://rcin.org.pl

BIA ŁK A SU R FA K TA N T U 385

[39] O G A S A W A R A Y, V O E L K E R D R . T he role o f the am ino-term ina l dom ain and the co llag e­nous reg ion in the structure and the function o f rat su rfactan t pro tein D. J B io l Client 1995; 270: 1 9 0 5 2 -19058 .

[40] O O S T E R L A K E N - D IJK ST E R H U IS M A , van E IJK M , van B U E L B L M , van G O L D E L M G , H A A G S M A N HP. Surfactan t p ro tein com position o f lam ellar bod ies iso lated from rat lung. B io ch em J 1991; 274: 115-119 .

[41] PH E L P S DS. Pu lm onary surfactan t m odula tion o f host-defense function. A p p l C ard iopu lm P cithophysiol 1995; 5; 2 2 1 -2 2 9 .

[42] PH E L P S D S, U M S T E A D T M , R O SE RM , F IS H M A N IA. Surfactan t p ro te in -A levels increase du ring P neu m o cystis carin ii p neum onia in the rat. E u r R esp ir J 1996; 9: 56 5 -5 7 0 .

143] R A JA K, L A N G E N B O R G P. P u lm onary hem orrhage and exogenus surfactan t therapy: A m etaana lysis . J P ed 1993; 123: 6 0 3 -6 1 0 .

[44] R E ID K BM . S tructure / function re la tionsh ips in the co llectin s ( m am m alian lectins co n ta in ing co llag en -lik e reg ions ). B iochem Soc Trans 1993; 21: 4 6 4 -4 6 8 .

[45] R IS C O C, R O M E R O C, B O S C H M A , P IN T O da S IL V A P. T ype II p n eum ocy tes rev is ited : in trace llu la r m em branous system s, surface characte ris tics , and lam ellar body secretion . Lab In v es t 1994; 70: 4 0 7 -4 1 7 .

[46] R O O N E Y SA, G O B R A N LI, U M ST E A D T M , PH E L PS DS. S ecretion o f su rfactan t pro tein A from rat type II pneum ocytes. A m J P hysio l 1993; 265: L 5 8 6 -L 590.

[47] R O O N E Y SA , Y O U N G SL, M E N D E L S O N CR. M olecu lar and cellu la r p rocessing o f lung surfactan t. F A SE B J 1994; 8 : 9 5 7 -9 6 7 .

[48] R U T K O W S K A M. K ry teria kw alifikacji do leczen ia sz tucznym surfak tan tem n o w orodków z zespo łem zaburzeń odd y ch an ia (R D S). A n es t In ten Ter 1993; 25: 157-168 .

[49] R U T K O W S K A M . S u rfak tan t p łucny: od fizjopato log ii do zas tosow an ia w praktyce. K lin P ed ia t 1995; 3: 2 4 -2 8 .

[50] S H E R M A N M P, G A N Z T. H ost defense in pu lm onary alveoli. A nnu R ev P h ysio l 1992; 54: 3 3 1 -3 5 0 .

[51] S T R A Y E R D S, P IN D E R R, C H A N D E R A. R ecep to r-m ed ia ted regu la tion o f pu lm onary su rfactan t secretion . E xp C ell R es 1996; 226: 9 0 -9 7 .

[52] S Z Y M A N K IE W IC Z M , G A D Z IN O W S K I J. B iałka surfak tan tu . K lin iczna P erin a to lo g ia i G in eko log ia 1994.

[53] S Z Y M A N K IE W IC Z M , G A D Z IN O W S K I J, B R Ę B O W IC Z G. Podan ie su rfak tan tu p ro fila ­k tyczne czy leczn icze? K lin iczna P erina to log ia i G ineko log ia 1994.

[54] T A N E V A SG , K E O U G H KM . C alc ium ions and in teractions o f pu lm onary su rfactan t pro te ins SP-B and SP-C w ith p h o sp ho lip ids in spread m onolayers at the a ir /w a te r in terface . B iochim B io p h ys A cta 1995; 1236: 185-195 .

[55] T A N E V A S, M cE A C H R E N T, ST E W A R T J, K E O U G H KM . P ulm onary su rfactan t p ro tein SP-A w ith p h o sp h o lip id s in spread m onolayers at the air- w ater in terface. B io ch em is try 1995; 3 4 :1 0 2 7 9 -1 0 2 8 9 .

[56] T IN O M J, W R IG H T JR. Surfactan t pro tein A stim u la tes p hagocy tosis o f specific pu lm onary p a th o g en s by a lv eo lar m acrophages. A m J P hysio l 1996; 270; L 6 7 7 -L 688 .

[57] T S U Z U K I A, K U R O K I Y, A K IN O T. P u lm onary surfactan t p ro tein A - m ed ia ted up take o f p h o sp h a tid y lch o lin e by a lv eo lar type II cells. A m J P hysio l 1993; 265 (L ung Cell M ol Physio l 9): L 1 9 3 -L 199.

[58] V A N D E N B U S S C H E G, C L E R C X A, C U R S T E D T T, JO H A N S S O N J, JO R N V A L L H, R U Y S S C H A E R T JM . S tructure and orien tation o f the surfactan t - assoc ia ted pro tein C in a lipid bi layer. E u r J B io ch em 1992; 203: 2 0 1 -2 0 9 .

[59] V E L E T Z A SV , N IC H O L S KV , G R O SS I, L U H, D Y N IA D W , FL O R O S J. S u rfactan t pro tein C : ho rm onal con tro l o f SP-C m R N A levels in vitro. A m J P h ysio l 1992; 262: L 6 8 4 -L 687.

http://rcin.org.pl

386 K. H ELEW SK I ET AL.

[60] V E N K A T E S H V C , JA N N U Z Z I D M , E R T S E Y R, B A L L A R D PL. D ifferen tia l g luco co rtico id regu la tion o f the pu lm onary hydrophob ic surfactan t p ro teins SP-B and SP-C . A m J R esp ir C ell M o l B io l 1993; 8: 2 2 2 -2 2 8 .

[61] V O O R H O U T W F, V E E N E D A A L T, K U R O K I Y, O G A S A W A R A Y, van G O L D E L M G , G E U Z E HJ. Im m u nocy tochem ical localization o f su rfactan t p rotein D (SP-D ) in type II cells, C lara cells and a lveo lar m acrophages o f ra t lung. J H istochem C ytochem 1992; 40 : 1 589-1597 .

[62] V O SS T, M E L C H E R S K, SC H E IR L E G, S C H A F E R KP. S tructural com parison o f re co m ­binan t pu lm onary surfactan t p ro tein SP-A derived from tw o hum an coding sequences : im p li­cations fo r the chain com position o f natural hum an SP-A . A m J R esp ir C ell M ol B iol 1991 ; 4: 8 8 -9 4 .

[63] W A N G Z , G U R E L O , B A A T Z JE ,N O T T E R R H . A cy lation o f pu lm onary su rfac tan t p ro te in -C is requ ired for its op tim al surface active in teractions w ith phospholip ids. J B io l C hem 1996; 271: 19 1 0 4 -19109 .

[64] W A R IN G AJ, F A U L L K F, L E U N G C, C H A N G -C H IE N A, M E R C A D O P, T A E U S C H H W , G O R D O N LM . Synthesis, secondary structure and fo ld ing o f the bend reg ion o f lung su rfactan t pro te in B. P ep t R es 1996; 9: 2 8 -3 9 .

[65] W E A V E R TE, W H IT S E T T JA . F unction and regu lation o f expression o f p u lm onary su rfac ­tan t-asso c ia ted p roteins. B io ch em J 1991; 273: 2 4 9 -2 6 4 .

[66] W H IT S E T T JA , N O G E E LM , W E A V E R TE, H O R O W IT Z A D . H um an su rfactan t p ro tein B: structure , function , regu la tion , and genetic disease. P hysio l R ev 1995; 75: 1 4 9 -1 5 1 .

[67] W R IG H T JR, B O R C H E L T JD , H A W G O O D S. L ung surfactan t apoprotein SP -A (26-32 kD a) b inds w ith h igh affin ity to iso lated a lveo lar type II cells. P roc N atl A ca d Sc i USA 1989; 8 6 : 5 4 1 0 -5 4 1 4 .

[68 ] W R IG H T JR , D O B B S LG. R egu la tion o f pu lm onary surfactan t secretion and c learance. A nna R ev P hysio l 1991; 53: 395^114 .

[69] W R IG H T JR , Y O U M A N S D C . P u lm onary surfactan t pro tein A stim ula tes ch em o tax is o f a lv eo lar m acrophage . A m J P hysio l 1993; 264 (L ung C ell M ol Physio l 8): L 3 3 8 -L 344.

[70 ] W R IG H T JR, Y O U M A N S D C. D egradation o f surfactan t lipids and su rfactan t pro tein A by a lv eo lar m acrophages in vitro. A m J P hysio l 1995; 268: L 7 7 2 -L 780.

[71] Y O U N G SL, FR A M EK , L A R SO N E, W R IG H T JR. R ecycling o f su rfactan t lip id and apopro te in - A stud ied by e lectron m icroskopic au torad iograhpy . A m J P h ysio l 1993; 265: L 1 9 -L 26.

[72] Y O U N G SL, H O YS, S IL B A JO R IS RA. S urfactan t apopro te in in adult rat lung co m partm en ts is increased by dexam ethasone . A m J P hysio l 1991; 260 : L 161-L 167.

[73] Z U P A N V, L A C A Z E -M A S M O N T E IL T. L e surfactan t pu lm onaire : de la p h y siopa tho log ie a la thérapeu tique. M ed ec in e /sc ien ces 1993; 9: 2 7 7 -2 8 7 .

Redaktor prow adzący - M aciej Zabel

O trzym ano: 2 0 .0 3 .1 9 9 7 r.P rzyjęto : 2 4 .0 4 .1 9 9 7 r.A d res au tora: I K atedra i Z a k ła d H isto log ii i E m brio log ii SIAM,4 1 -8 0 8 Zabrze , ul. Jo rdana 19

http://rcin.org.pl

PO STĘPY BIOLOGII KOM ÓRKI TOM 24, NR 3 1997 (387-398)

KARBOKSYLAZA/OKSYGENAZA RY BULO ZO -l,5-BISFO SFO RA NU - KLUCZOW Y

ENZYM FOTOSYNTEZY I FOTOODDYCHANIA* - OSTATNIA DEKADA BADAŃ

R IB U L O S E -1,5-B ISP H O SP H A T E C A R B O X Y L A S E /O X Y G E N A S E - T H E K E Y E N Z Y M E IN P H O T O S Y N T H E S IS A N D P H O T O R E S P IR A T IO N -

T H E L A ST D E C A D E R E SE A R C H

Stanisław MALESZEW SKI, Bożena KOZŁOW SKA-SZERENOS

Instytut B io lo g ii , U n iw ersy tet W arszaw sk i, F ilia w B ia łym stoku

Streszczenie : K arboksylaza/oksygenaza rybulozo-l,5-b isfosforanu (rubisco), dwufunkcyjny enzym chloroplastow y, inicjuje fotosyntetyczną asymilację dwutlenku węgla i fotooddychanie. Od aktywności tego enzym u zależy natężenie fotosyntezy i produktywność roślin. Prowadzone w ostatnich latach badania dostarczyły nowych informacji o jego budowie, syntezie i regulacji.

Słow a kluczow e : karboksylaza/oksygenaza rybu lozo-1,5-bisfosforanu, rubisco, fotosynteza, fotooddy­chanie

Sum m ary. R ibulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (rubisco), bifunctional chloroplast enzy­m e, initiates photosynthetic assim ilation o f carbon dioxide and photorespiration. The photosynthetic rate and plant productivity depend on this enzyme. Recent studies supplied new information concerning its structure, synthesis and regulation.

K ey w ords : ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, rubisco, photosynthesis, photorespiration

W ykaz stosow anych skrótów: C A 1P - 2-karboks^-arabin ito lo-l-fosforan, E C M - trójskładnikowy kom pleks zaktywowanej rubisco (Enzym -C0 2 -M g"+), L - duża podjednostka rubisco, PA R - prom ie­n iow anie aktyw ne fotosyntetycznie, PG A - kwas 3-fosfoglicerynowy, rośliny C 3 — rośliny, u których

* Artykuł na taki sam temat, autorstwa S. M aleszew skiego, był zam ieszczony w Postępach B iologii K omórki 1988, tom 15, nr 3, str. 2 3 3 -2 5 4 . * Artykuł został napisany podczas realizacji przez B. K ozłow ską-Szerenos grantu K B N nr 6 P 0 4 C 104 10

http://rcin.org.pl

388 S. M A L ESZEW SK I, B. K O ZŁ O W SK A -SZE R E N O S

pierwszym trwałym produktem asymilacji CO2 jest PGA, rośliny C4 - rośliny, u których pierwszym produktem wiązania CO2 jest kwas szczawiooctowy, RuBP - rybulozo-l,5-bisfosforan, rubisco - karboksylaza/oksygenaza RuBP, S - mała podjednostka rubisco, SF (specificity factor) - współczynnik powinowactwa substratowego CO2/O 2 rubisco.

WPROWADZENIE

Energia fotosyntetycznie aktywnego promieniowania słonecznego z zakresu dłu­gości fal 400-700 nm (PAR), pochłonięta i przetworzona przez rośliny w energię chemiczną związków organicznych, jest następnie wykorzystywana we wszystkich procesach biologicznych. Nagromadzona w pokładach węgla kamiennego, ropy i gazu ziemnego nadal zaspokaja większość potrzeb energetycznych człowieka. Tlen atmosferyczny, "uboczny" produkt fotosyntezy, pełniąc funkcje końcowego akcep­tora elektronów w oddychaniu, umożliwia wysoką sprawność energetyczną kata- bolicznych przemian komórkowych. W ystępowanie tlenu w atmosferze ziemskiej pozwoliło na ewolucyjne wyjście życia z oceanów, gdyż tworzy on filtr osłaniający organizmy lądowe przed zabójczym działaniem słonecznego promieniowania ultra­fioletowego.

Rośliny, w naturalnych zespołach jak i w uprawach rolniczych, wiążą foto­syntetycznie tylko od 5 do 12% padającego na nie PAR, a globalna sprawność fotosyntezy jest nawet znacznie mniejsza niż 1 % [27,29]. Mimo to całkowita roczna fotosyntetyczna asymilacja C 0 2, oceniana na około 1011 ton, wielokrotnie prze­wyższa obecne roczne światowe zużycie ropy naftowej, wynoszące około 3 x 109 ton [46]. W ydajność pochłaniania i przetwarzania energii w reakcjach fotosyntezy określa biologiczną produkcję pierwotną i ilość energii przepływającą przez bio­cenozy. Analiza czynników ograniczających wydajność fotosyntetyczną oraz zna­lezienie sposobów jej podniesienia są nadrzędnymi celami we współczesnych badaniach nad fotosyntezą i produktywnością roślin.

Kluczowe znaczenie rubisco dla sprawności fotosyntetycznej asymilacji dwu­tlenku węgla jest powodem prowadzenia szczególnie intensywnych i wielostronnych badań nad tym enzymem. Wyniki prac sprzed 1987 roku były przedstawiane w polskim piśmiennictwie [5, 21,22,24,25,28,30,35,36]. Nowsze osiągnięcia są wy­czerpująco omówione w kilku artykułach przeglądowych, które niedawno ukazały się w czasopismach międzynarodowych [14,16,26,53]. Oksygenacyjną funkcję ru­bisco oraz próby jej modyfikacji autorzy tego artykułu opisali w ubiegłorocznym Kosmosie [31].

http://rcin.org.pl

K A R B O K SY L A Z A /O K SY G E N A Z A R uBP 389

FUNKCJE RUBISCO

Karboksylaza/oksygenaza rybulozo-l,5-bisfosforanu (rubisco, EC 4.1.1.39) ka­talizuje reakcję karboksylacji (RuBP + C 0 9 —> 2 PGA), inicjującą procesy foto- syntetycznego wiązania C 0 9, redukcji węgla i akumulacji energii w związkach organicznych. Ten bifunkcyjny enzym katalizuje także reakcję oksygenacji (RuBP + Ot —> PGA + P-glikolan), zapoczątkowującą fotooddechowy cykl utleniania zw iąz­ków węgla oraz fotooddychanie. Bezpośrednim akceptorem zarówno CO?, jak i 0 2 jest przejściowy metabolit 2,3-enodiol RuBP (enol-RuBP) [8, 28, 31]. Stosunek szybkości karboksylacji/oksygenacji RuBP zależy od stężeń obu gazowych sub­stratów i kinetycznych parametrów rubisco:

V vo = v c K<yv o KC [C 0 2]/[0 2],

g d z ie :

VC’ v0 “ szybkość karboksylacji, oksygenacji;Vc , V q - szybkość maksymalna karboksylacji, oksygenacji;Kc , K0 - powinowactwo do CO?, 0 2;[C 0 2], [ 0 2] - stężenie CCT, Oo w miejscu działania enzymu.

W artość wyrażenia V c K q / V q K c , zwanego współczynnikiem powinowactwa substratowego C 0 2/ 0 2 rubisco (SF, ang. specifity factor), jest podobna u różnych fotosyntetycznych typów roślin wyższych C 3, C4 oraz pośredniego typu C 3-C4 i wynosi około 80. SF jest niższy u glonów (około 60) i sinic (około 50). Wartość SF jest szczególnie niska u fotosyntetyzujących bakterii Rhodopseudomonas sphae- roides (około 9) i Rhodospirillum rubrum (około 15), co jest prawdopodobnie związane z opisaną niżej, prostszą czwartorzędową strukturą ich rubisco [8,17,18,53]. Przy podanych wyżej wartościach SF i stężeniach C 0 2 i 0 9 występujących podczas zrównoważonej fotosyntezy w miejscu działania rubisco, ocenianych odpowiednio na około 10,5 |lM i 258 pM , stosunek vc/vQ u roślin wyższych ma wartość około 3, zaś u innych fotoautotrofów jest odpowiednio mniejszy [8,20,33].

Rubisco charakteryzuje się skrajnie niską aktywnością katalityczną, co wyraża mała liczba obrotów (3 obr. • s *), lecz osiąga w stromie chloroplastów wyjątkowo duże stężenie. Prawdopodobnie jest białkiem występującym w biosferze w naj­większej ilości [46]. Aktywność rubisco w liściach roślin C3 jest zwykle nieco większa niż u roślin C4 [4].

STRUKTURA

Rubisco roślin wyższych i większości innych fotoautotrofów ma jednakow ą stru­kturę czwartorzędową. Składa się z ośmiu dużych 55 kD (L) i ośmiu małych

http://rcin.org.pl

390 S. M A L ESZEW SK I, B. K O ZŁ O W SK A -SZE R E N O S

15 kD podjednostek (S), tworzących heksadekameryczny 560 kD holoenzym (LgSg). Prostszą strukturę czwartorzędową rubisco L2 stwierdzono jedynie u bakterii Rho- clospirillum rubrum i Rhodobacter sphaeroides [46]. Katalityczna aktywność en­zymu jest związana z dużymi podjednostkami. Małe podjednostki pełnią funkcje regulacyjne i zwiększają aktywność karboksylacyjną holoenzymu rubisco ponad 100-krotnie [1, 26]. Znana jest struktura pierwszorzędowa - liczba aminokwasów oraz ich liniowa sekwencja - obu podjednostek rubisco wielu fotoautotrofów. Pod­jednostki L enzymów typu LgSg są zbudowane z niespełna 500 (475 u szpinaku) reszt aminokwasowych. Podjednostki te, pochodzące z różnych roślin, charakteryzują się wysoką około 80% homologią sekwencyjną. Natomiast homologia podjednostek L enzymów o budowie LgSg i L2 z R. rubrum wynosi tylko około 25%. Dużym konserwatyzmem ewolucyjnym charakteryzują się zwłaszcza rejony tworzące miej­sce aktywne [26].

W badaniach krystalograficznych stwierdzono, że struktura drugo- i trzeciorzę­dowa - przestrzenna organizacja łańcucha peptydowego - podjednostek L z różnych fotoautotrofów wykazuje również duże podobieństwo. Dotyczy to również enzymów0 niskiej homologii sekwencji reszt aminokwasowych. Podjednostka ta składa się z dwu wyraźnie zarysowanych domen o różnej wielkości: mniejszej, obejmującej reszty aminokwasowe 1-150 końca N łańcucha białkowego (domena N-terminalna)1 większej, zbudowanej z aminokwasów 151-475 końca C (domena C-terminalna). Centralnym motywem domeny N-terminalnej jest pięcioodcinkowa, mieszana stru­ktura (3 z dwoma heliksami a (ang. a -helices) na końcu. Domena C-terminalna ma ośmioodcinkową, współbieżną strukturę a/[3-baryłkową (ang. cc/$-barrel stru- cture), występującą także w innych enzymach, np. izomerazie triozofosforanowej i oksydazie glikolanowej [26,46].

W budowie miejsca aktywnego rubisco, wspólnego dla reakcji karboksylacji i reakcji oksygenacji, uczestniczą obie domeny. Znajduje się ono na styku domeny C-terminalnej jednej podjednostki L i domeny N-terminalnej drugiej podjednostki L, przy karboksylowym końcu baryłkowej struktury [3. W pętlach peptydowych, łączących struktury [3 i heliksy a baryłki, występuje większość konserwatywnych reszt aminokwasowych łańcucha podjednostki. Reszty te uczestniczą zarówno w wiązaniu substratów, jak i w procesie katalizy [46]. W miejscu aktywnym rubisco zidentyfikowano dwie reszty lizynowe, które prawdopodobnie mają istotne zna­czenie dla katalitycznych funkcji enzymu. W rubisco z R. rubrum zajmują one pozycje 166 i 329, a w enzymie ze szpinaku 175 i 334, w odległości 12 A od siebie [46].

Podjednostka S rubisco szpinaku jest zbudowana z 123 reszt aminokwasowych tworzących czteroodcinkową przeciwbieżną strukturę [3 przykrytą z jednej strony dwoma heliksami a . Pierwsze 20 reszt aminokwasowych końca N jej łańcucha polipeptydowego tworzy nieregularne ramię, które rozciąga się od korpusu tej stru­ktury do sąsiedniej małej podjednostki oligomeru LgSg [26].

http://rcin.org.pl

K A R B O K SY L A Z A /O K SY G E N A Z A RuBP 391

Dimer L 2, będący podstawową jednostką strukturalną rubisco, jest zniekształconą elipsoidą o wymiarach 45 x 70 x 105 A. Rdzeń dimeru tworzą C-terminalne domeny obu podjednostek. Holoenzym L8S8 ma kształt sześcianu o zaokrąglonych brzegach i długości boków około 110 A. Małe podjednostki (S) wypełniają głębokie bruzdy utworzone na czterech powierzchniach sześcianu przez przylegające do siebie dimery L2. Szczegółowe wyniki krystalograficznej analizy rubisco szpinaku są zamieszczone w obszernej publikacji Knight i wsp. [26].

SYNTEZA

Geny rubisco roślin wyższych należą do dwu odmiennych genomów. Jednostka L jest kodowana w genomie chloroplastowym, natomiast gen podjednostki S jest częścią genomu jądrowego.

W cząsteczce chloroplastowego DNA jest tylko jeden gen (rbcL) kodujący pod- jednostkę L. Chociaż każdy chloroplast zawiera wiele kopii DNA, a w komórce mogą występować liczne chloroplasty, to rośliny nie będące hybrydami charakte­ryzują się tylko jedną specyficzną sekwencją białka podjednostki L. Z małymi wyjątkami gen rbcL nie zawiera intronów i koduje około 475 aminokwasów. Trans- krypcyjne i translacyjne sekwencje rozpoznające genu rbcL, tak jak i wielu innych genów chloroplastowych, są podobne do sekwencji występujących u organizmów prokariotycznych. Dowodem tego jest możliwość ekspresji tego genu u Escheńchia coli [13]. Na transkrypcję genu rbcL, oprócz jego promotora, ma wpływ sąsiedni promotor atpB, znajdujący się w odległości około 100 par zasad w przeciwległej orientacji [16,50].

Podjednostkę S w genomie jądrowym koduje rodzina genów (rbcS), licząca od 2 do 12 genów, które mogą wykazywać odmienną ekspresję w różnych typach komórek i fazach rozwojowych rośliny [50, 51]. Jądrowe geny rbcS zawierają od 1 do 3 intronów i są bardziej zróżnicowane niż chloroplastowe geny dużej podjednostki. Kodują one polipeptyd przejściowy, dłuższy od dojrzałej S o około 50 reszt aminokwasowych. Ekspresja rbcS zwiększa się na świetle, a w procesie tym uczestniczy zarówno fitochrom, jak i specyficzny fotoreceptor światła nie­bieskiego [12,16,50,52]. Przejściowy polipeptyd podjednostki S ulega transformacji polegającej na skróceniu końca N i po przetransportowaniu z cytosolu do chloroplastu łączy się z L tworząc holoenzym rubisco. W ostatnim procesie uczestniczą tzw. białka towarzyszące (ang. chaperon protein), które zapewniają właściwą konfor­mację końcowej postaci enzymu [9,14,15,46].

http://rcin.org.pl

392 S. M A L ESZEW SK I, B. K O ZŁ O W SK A -SZE RE N O S

AKTYWACJA I REGULACJA AKTYWNOŚCI

Aktywność rubisco zależy od wielu czynników i jest regulowana przez złożony mechanizm, którego działanie, zwłaszcza in vivo, nie jest zadowalająco poznane.

W doświadczeniach in vitro wyizolowany i częściowo oczyszczony enzym (E), obu znanych typów (L-, i L8S8), dla uzyskania maksymalnej aktywności musi być poddany specyficznej aktywacji. Podczas tego procesu następuje najpierw, zależne od pH, samorzutne przyłączenie aktywującej cząsteczki CO ? (C) do e-aminowej grupy Lys-201, zlokalizowanej na dużej podjednostce w pobliżu centrum aktywnego. W ytworzony karbaminian (EC) jest następnie stabilizowany przez przyłączenie M g"+ (M), co prowadzi do powstania trójskładnikowego kompleksu enzym -C 02-Mg (ECM), stanowiącego katalitycznie aktywną formę enzymu, wiążącą RuBP (R). Końcowy stan równowagi pomiędzy zaktywowaną formą enzymu a jej prekursorami (stopień aktywacji) zależy od warunków, w jakich akty wacja przebiega: [H+], [CO0],

O i

[Mg ]. W obecności RuBP i innych fotosyntetycznych fosforanów cukrów (S) aktywacja rubisco ma przebieg bardziej złożony. Substraty te łączą się bowiem ze wszystkimi formami enzymu, tworząc ES, ECS i ECMS. Uniemożliwia to przejścia pomiędzy E, EC i ECM oraz tworzenie kompleksu ECMR [37].

W ytwarzanie ukarbamylowanego trójskładnikowego kompleksu ECM jest zw ią­zane ze zmianami chemicznych właściwości enzymu. Karbamylacja wpływa na reaktywność i nukleofilność reszt lizynowych znajdujących się w jego miejscu aktywnym. Proces ten wpływa na powinowactwo enzymu do RuBP i innych fos­foranów cukrów [46].

AKTYWAZA

Aktywacja rubisco in vitro, wyizolowanego i częściowo oczyszczonego enzymu, do poziomu odpowiadającego natężeniu fotosyntezy in vivo wymaga bardzo wysokich stężeń C 0 2 i M g2+. W komórce natomiast może przebiegać przy fizjologicznych, znacznie niższych stężeniach tych czynników i zależy od warunków środowi­skowych: poziomu żywienia fosforowego i azotowego, stężeń CO-, i 0 2 oraz tem­peratury. W doświadczeniach z różnymi gatunkami fotoautotrofów stwierdzono też, że ważnym czynnikiem wpływającym na aktywację rubisco in situ jest światło. Badania nad tym ostatnim zjawiskiem doprowadziły do odkrycia [43] rozpusz­czalnego białka chloroplastowego, aktywazy rubisco, enzymu "odpowiedzialnego" za właściwości i przebieg aktywacji rubisco in vivo. Aktywaza, występująca u wszystkich badanych pod tym względem fotoautotrofów, umożliwia osiągnięcie w oświetlanych komórkach przy atmosferycznym stężeniu CO-> i obecności RuBP aktywności rubisco zbliżonej do maksymalnej [37,38,39,42].

http://rcin.org.pl

K A R B O K SY L A Z A /O K SY G E N A Z A RuBP 393

Mechanizm funkcjonowania aktywazy rubisco nie został jeszcze szczegółowo poznany, niewątpliwie jednak polega na oddziaływaniu na kompleksy rubisco - fosforany cukrów (ECMS) [32]. Aktywaza znosi niekorzystny wpływ silnie wią­żących się fosforanów cukrów na aktywację rubisco. Umożliwia też karbamylację oraz przebieg reakcji katalizowanych przez rubisco przy niskim poziomie CO0 w chloroplastach. Funkcjonowanie aktywazy jest regulowane przez stosunek stężeń ATP/ADP, zależny od warunków świetlnych. Enzym ten jest więc też kluczowym elementem koordynacji świetlnej i ciemnej fazy fotosyntezy [42].

Aktywaza rubisco licznych gatunków roślin składa się z dwu różnych polipep- tydów mieszczących się w zakresie 41-46 kDa. Są one syntetyzowane na cyto- solowych rybosomach w postaci nieco dłuższych prekursorów i transportowane do chloroplastów. Pierwszorzędowa struktura tego enzymu wykazuje ponad 80% poziom konserwatyzmu ewolucyjnego [42].

Zakładając, że aktywaza jest tetramerem zbudowanym z podjednostek 47 kDa [37] obliczono, że w liściach tytoniu molowy stosunek tego enzymu do rubisco jest 1:10 [32].

SPECYFICZNY INHIBITOR

Drugim elementem mechanizmu regulacji rubisco jest wytwarzany podczas cie­mności specyficzny inhibitor 2-karboksy-arabinitolo-l-fosforan (CA1P). Nie wy­stępuje on jednak u wszystkich roślin. Inhibitor ten budową przypomina pośredni produkt karboksylacji RuBP 2-karboksy-3-keto-arabinitolo-l,5-bisfosforan. Nie jest wyjaśnione, jaką drogą powstaje w chloroplastach i jakim przemianom ulega. CA 1P wiąże się bardzo silnie z zaktywowaną postacią rubisco ECM i hamuje katalizę w sposób niekompetycyjny. Poziom inhibitora zależy od warunków świetlnych; zwiększa się w ciemności, a zmniejsza na świetle [3,47,48].

Początkowo sądzono, że pomiędzy działaniem aktywazy rubisco i CA1P istnieje bezpośredni związek. Jednakże obecność aktywazy u wszystkich badanych pod tym względem roślin wyższych, a inhibitora tylko u niektórych przeczy takiej sugestii. W ydaje się, że udział obu omówionych czynników w mechanizmie regulacji rubisco u różnych roślin jest zróżnicowany. U szpinaku, który nie gromadzi CA1P w cie­mności, regulacja rubisco następuje prawdopodobnie wyłącznie przy udziale akty­wazy. U fasoli zaś, u której poziom CA1P może być bardzo wysoki i w dużym stopniu jest zależny od warunków świetlnych, regulacja rubisco odbywa się głównie przy jego udziale. U większości roślin regulacja aktywności rubisco przebiega jednak z udziałem obu czynników [37,41].

http://rcin.org.pl

394 S. M A L ESZEW SK I, B. K O ZŁ O W SK A -SZE RE N O S

INNE CZYNNIKI REGULACJI

Wartość współczynnika powinowactwa substratowego rubisco (SF) ma istotne znaczenie dla stosunku vc/v0, natężenia fotosyntetycznego wiązania CO-, netto oraz produktywności roślin. Z tego względu podejmowano liczne badania mające na celu znalezienie czynników powodujących modyfikacje tego współczynnika.

W katalitycznie aktywnym trójskładnikowym kompleksie ECM jon Mg~+ może być zastąpiony przez jony innych metali: M n2+, Fe~+, Cu2+, N F +. Osiągnięty stopień aktywności enzymu zależy wówczas zarówno od przyłączonego metalu, jak i typu rubisco. Rodzaj aktywującego metalu ma także wpływ na SF i stosunek obu aktyw­ności vc/vQ rubisco. Podobne zmiany stwierdzono także po zmianie reszt amino- kwasowych, zlokalizowanych w pobliżu centrum aktywnego enzymu [46].

Od dawna znany jest też wpływ temperatury na vc/v0 rubisco. Niewątpliwie efekt ten częściowo można tłumaczyć różnym działaniem temperatury na rozpu­szczalność C O t i 0 9 oraz na stężenie tych substratów w stromie chloroplastów [28]. Ostatnio wykazano jednak, że temperatura wpływa także bezpośrednio na SF rubisco. Reakcja pomiędzy enolo-RuBP i O-, ma bowiem wyższą swobodną energię aktywacji (AG0) niż odpowiednia reakcja z C 0 2 (AGC). Z tego powodu oksygenacja jest bardziej wrażliwa na zmiany temperatury niż karboksylacja. W y­stępuje też wyraźny związek pomiędzy wartością SF rubisco odmienną u różnych grup fotoautotrofów a wielkością różnicy AG0-A G C [8,17,53].

W ykazano ścisłą korelację pomiędzy aktywnością rubisco a stosunkiem stężeń ATP/ADP w chloroplastach. Prawdopodobnie związek ten jest pośredni i spowo­dowany głównie wspomnianą wyżej zależnością aktywazy rubisco od stosunku ATP/ADP [42].

Częściowo oczyszczona i całkowicie zaktywowana rubisco in vitro inkubowana z RuBP stopniowo traci aktywność podczas wiązania CCF [55]. Uzyskano dane wskazujące, że zjawisko to jest spowodowane akumulacją inhibitora, wiążącego się silnie w miejscu katalitycznym enzymu. Prawdopodobnie jest nim ksylulozo- 1,5-bisfosforan lub 3-ketoarabinitolo-l ,5-bisfosforan [10,11]. Obecność w miesza­ninie inkubacyjnej aktywazy rubisco i ATP zapobiega lub nawet odwraca tę inaktywację. Przypuszcza się, że akty waza rubisco zwiększa szybkość dysocjacji przyłączonego inhibitora, podobnie jak w przypadku RuBP i CA1P [37,40].

Ostatnio doniesiono, że u pszenicy (Triticum aestivum), która należy do roślin nie akumulujących CA1P, dobowa regulacja rubisco następuje przy udziale niezi­dentyfikowanego inhibitora innego niż wymienione wyżej [34,48]. W ysunięto przy­puszczenie, że może to być prekursor CA1P lub związek o podobnej budowie działający w procesie aktywacji rubisco na etapie karbamylacji [23].

Rubisco i inne enzymy cyklu Calvina tworzą w chloroplaście zintegrowany system, którego równowagę działania regulują mechanizmy sprzężenia zwrotnego (feedback)

http://rcin.org.pl

K A R B O K SY L A Z A /O K SY G EN A ZA RuBP 395

i sprzężenia do przodu {feedforward) funkcjonujące przy udziale wspólnych me­tabolitów. Na szybkość reakcji katalizowanych przez rubisco pozytywny efekt, oprócz bezpośrednich substratów tego enzymu, wywierają produkty świetlnej fazy foto­syntezy: ATP i NADPH. Negatywny wpływ ma PGA. RuBP działa hamująco na fosforybulokinazę, enzym katalizujący odtwarzanie RuBP [49]. Dużo uwagi po­święcono też działaniu nieorganicznego ortofosforanu (Pi), który w reakcjach fo­tosyntezy jest substratem, produktem oraz czynnikiem regulacji enzymów [54]. Od stężenia Pi może zależeć stopień aktywacji [44,45] oraz współczynnik powi­nowactwa substratowego C 0 2/ 0 2 rubisco [18]. Uzyskano dane świadczące, że Pi jest ważnym czynnikiem wzmagającym karbamylację rubisco, wielokrotnie zwię­kszającym powinowactwo rubisco do aktywującego C 0 2 [2].

W doświadczeniach z mutantami Arabidopsis thaliana z defektami w szlaku fotooddechowym stwierdzono, że glioksylan - pośredni metabolit fotooddychania - może zmniejszać aktywację rubisco [7]. Glioksylan in vitro wykazywał takie działanie tylko przy stężeniu dwuwęglanu odpowiadającym atmosferycznemu stę­żeniu C 0 2 i w obecności błon tylakoidów. Sugeruje to, że w zależnym od światła procesie aktywacji rubisco pośredniczy jakiś nieznany składnik, wrażliwy na glio­ksylan [6]. W ydaje się jednak, że regulacja rubisco przy udziale glioksylanu może nie mieć istotnego znaczenia przy normalnym przebiegu fotosyntezy u roślin od­powiednio zaopatrzonych w azot. Metabolit ten nie gromadzi się bowiem w liściu, lecz w wyniku transaminacji przekształcany jest w glicynę [6,38].

UWAGI KOŃCOWE

W rezultacie badań prowadzonych w ostatnich latach wiedza o rubisco, kluczowym enzymie fotosyntezy i fotooddychania, uległa znacznemu wzbogaceniu. Dokonano istotnych ustaleń dotyczących struktury i genetycznych aspektów enzymu. M echa­nizm aktywacji został uzupełniony o działanie fosforanów cukrów i światła. Fun­damentalnym osiągnięciem było odkrycie specyficznych inhibitorów oraz akty wazy, które uczestniczą w zależnej od światła i ciemności dobowej regulacji rubisco. Nie udały się natomiast próby zmiany współczynnika powinowactwa substratowego COo/Oo rubisco w kierunku zwiększenia aktywności karboksylacyjnej, korzystnym dla fotosyntetycznej produktywności roślin. Modyfikacje enzymu powodowały bo­wiem zawsze efekt odwrotny od pożądanego. Nie wyjaśniono też, czym jest bez­pośrednio uwarunkowana większa wartość współczynnika charakterystyczna dla postaci enzymu LgSg niż dla postaci L2. Dalsze badania powinny doprowadzić do lepszego rozumienia zasad integracji rubisco z pozostałymi składnikami aparatu fotosyntetycznego oraz z innymi procesami przebiegającymi w chloroplaście, ko­mórce i całej roślinie.

http://rcin.org.pl

396 S. M A L ESZEW SK I, B. K O Z tO W S K A -S Z E R E N O S

LITERATURA

[1] A N D R E W S TJ. Catalysis by cyanobacterial ribulose-bisphosphate carboxylase large subunits in the com plete absence o f small subunit. J B io l C hem 1988; 263: 12 1 3 -1219 .

[2]A N W A R U Z Z A M A N , SA W A D A S, U S U D A H, YO K OTA A. R egulation o f ribulose 1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase activation by inorganic phosphate through stim ulating the binding o f the activator C O 2 to activation sites. P la n t C ell P hysio l 1995; 36(3): 4 2 5 ^433 .

[3] BERR Y JA, LORIM ER GH, PIERCE J, SE E M A N N JR. M EEK J, FR E A S S. Isolation, identification, and synthesis o f 2-carboxyarabinitol 1-phosphate, a diurnal regulator o f ribulo­se-bisphosphate carboxylase activity. P roc N a tl A c a d Sc i USA 1987; 84: 7 3 4 -7 3 8 .

[4] BR O W N HR, B O U T O N JH. P hysiology and genetics o f interspecific hybrids betw een photosynthetic types. A n n R ev P la n t P h ysio l P la n t M o l B io l 1993; 44: 4 3 5 -4 5 6 .

[5] B Y T N IE W SK A K. K arboksylaza/oksygenaza rybulozodwufosforanu. P o st B iochem 1978; 24: 3 3 3 -3 4 6 .

[6] CA M PBELL WJ, O GREN WL. G lyoxylate inhibition o f ribulosebis-phosphate carboxyla­se /oxygen ase activation in intact, lysed, and reconstituted chloroplasts. P h o to syn th R es 1990; 23: 2 5 7 -2 6 8 .

[7] C H A ST A IN CJ, OGREN WL. G lyoxylate inhibition o f ribulosebis-phosphate carboxyla­se /oxygen ase activation state in vivo. P la n t C ell P hysio l 1989; 30 : 9 3 7 -9 4 4 .

[8] CH EN Z, SPREITZER RJ. H ow various factors influence the C O 2/O 2 sp ecificy o f ribulose-1.5-bisphosphate caboxylase/oxygenase. P hotosyn th R es 1992, 31: 157-164 .

[9] ELLIS RJ. M olecular chaperones: The plant connection. S cience 1990; 250: 9 5 4 -9 5 9 .[10]E D M O N D SO N DL, B A D G E R MR, A N D R E W S TJ. S low inactivation o f ribulose bisphos-

phate carboxylase during catalysis is not due to decarbamylation o f catalytic site. P la n t P hysio l 1990; 93: 1 3 8 3 -1389 .

[ 1 1JEDM O NDSON DL, B A D G E R MR, A N D R E W S TJ. S low inactivation o f ribulose bisphos- phate carboxylase during catalysis caused by accum ulation o f a slow , tight-binding inhibitor at catalytic site. P la n t P hysio l 1990; 93: 1 3 9 0 -1397 .

[12]FL U H R R, C H U A N-H . D evelopm ental regulation o f two genes encoding ribulose-bisphos­phate carboxylase small subunit in pea and transgenic petunia plants: Phytochrom e response and blue-light induction. P roc N a tl A c a d Sc i USA 1986, 83: 2 3 5 8 -2 3 6 2 .

[13JG A T E N B Y A A , C A STLETO N JA, SA U L M W . Expression in E. co li o f m aize and wheat chloroplast genes for large subunit o f ribulose bisphosphate carboxylase. N a tu re 1981, 291: 117-121 .

[14]G A T E N B Y A A , ELLIS RJ. Chaperone function: the assem bly o f ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase. A n n u R ev C ell B io l 1990; 6 : 125-149 .

[15]G O L O U B IN O FF P, G A T E N B Y A A , LORIM ER GH. GroE heat-shock proteins promote assem bly o f foreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligom ers in E scherich ia coli. N a tu re 1989; 337: 4 4 -4 7 .

[16]G U T T E R ID G E S, G A T E N B Y AA . R ubisco synthesis, assem bly, m echanism , and regulation. The P la n t C ell 1995, 7: 8 0 9 -8 1 9 .

[17]H A R T M A N FC, H ARPEL MR. Structure, function, regulation, and assem bly o f D -ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. A n n u R ev B iochem 1994, 63: 1 9 7 -234 .

[18]JA C O B J, LAW LO R DW . Extreme phosphate deficiency decreases the in vivo CO 2/O 2

specific ity factor o f ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in intact leaves o f sun­flower. J E xp B o t 1993; 44: 1635-1641 .

[19]JO R D A N D B , O G R EN WL. A sensitive assay procedure for sim ultaneous determ ination o f ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and oxygenase activity. P la n t P h ysio l 1981, 67: 2 3 7 - 245.

http://rcin.org.pl

K A R B O K SY L A Z A /O K SY G E N A Z A RuBP 397

[20 ]JO R D A N D B , O G R E N W L. S pecies varia tion in k inetic p roperties o f R uB P ca rb o x y lase /o x y ­genase. A rch B iochem B io p h ys 1983, 227: 4 2 5 M 3 3 .

[2 1JK A N IU G A Z. R eg u lac ja w łączan ia C O 2 w procesie fo tosyntezy . P o st B iochem 1976; 22: 2 4 7 -3 0 5 .

[2 2 ]K A N IU G A Z. R eg u lacja fo tooddychan ia . Z esz N auk U niv Ja g ie ll 1977; 464: 7 5 -8 6 .[23JK E Y S A J, M A JO R I, PA R R Y AJ. Is there ano ther p ley er in the gam e o f rub isco regu la tion?

J E x p B o t 1995; 46: 1245-1251 .[2 4 ]K L E C Z K O W S K IL. "A ktyw aza" k a rb oksy lazy /oksygenazy ry b u lo zo -l,5 -d ifo sfo ra n u i fo sfo ­

ran ka rb o k sy arab in ito lu - k lucze do ro zu m ien ia m echan izm u regulacji fo tosyn tezy? P ost B iochem 1987; 33: 6 2 9 -6 3 3 .

[2 5 ]K L E C Z K O W S K I LA , L O B O D A T, N A L B O R C Z Y K E. Pom iary fo to o d d y ch an ia u roślin w yższych . W iad B o t 1988; 32: 2 2 7 -2 4 0 .

[2 6 ]K N IG H T S, A N D E R S S O N I, B R A N D E N CI. C ry sta llo g rap h ic analysis o f ribu lose 1,5 -b is­p ho sp h a te carb o x y lase from sp inach at 2 .4 A resolu tion . J M ol B io l 1990; 215: 113-160 .

[2 7 ]L A R C H E R W . P h ysio log ica l p lan t eco logy . B erlin , H eidelberg , N ew Y ork: S p rin g er V erlag 1980.

[2 8 ]M A L E S Z E W S K I S. K arb o k sy laza /o k sy g en aza ry b u lo zo -l,5 -b isfo sfo ran u - k luczow y enzym fo tosy n tezy i fo tooddychan ia . P o st B io l K om 1988; 15(3): 2 3 3 -2 5 4 .

[2 9 ]M A L E S Z E W S K I S, B Y S T R Z E JE W S K A G. C zynnik i b io fizyczne i b io ch em iczn e w aru n k u ­ją c e p ro d u k ty w n o ść roślin . P o st B io l K om 1981; 8(3): 2 1 1 -2 2 5 .

[3 0 ]M A L E S Z E W S K I S, K A M IŃ S K A Z. D ziałan ie tlenu w fo tosyn tetycznym m etabo lizm ie w ęgla. P o st B iochem 1884; 30: 3 1 7 -3 3 4 .

[3 1 ]M A L E S Z E W S K I S, K O Z Ł O W S K A B. C zy fo to oddychan ie je s t "m arno traw nym " procesem b io lo g iczn y m ? K osm os 1995; 4 4 (3 -4 ): 653A368.

[3 2 ]M A T E C J, von C A E M M E R E R S, E V A N S JR , H U D S O N G S, A N D R E W S TJ. T he re la tio n ­sh ip b e tw een C 0 2 -assim ila tion rate, R ub isco carb am yla tion and R ub isco activase con ten t in activ ase -d e fic ien t transgen ic to bacco suggest a sim ple m ode o f ac tivase action. P lanta 1996; 198: 6 0 4 -6 1 3 .

[3 3 ]O G R E N W L. P h o to resp ira tion : Pathw ays, regu la tion , and m odification . A nn R ev P la n t P hysio l 1 9 8 4 ,3 5 : 415 ^1 4 2 .

[34 ]P E R C H O R O W IC Z JT, R A Y N E S DA, JE N S E N RG. L ight lim ita tion o f ph o to sy n th es is and ac tiv a tio n o f ribu lose b isp hosphate carboxy lase in w heat seedlings. P roc N a tl A ca d Sci USA 1981; 78: 2 9 8 5 -2 9 8 9 .

[3 5 ]P O S K U T A J. F o to o d d y ch an ie u roślin . W iadom B o t 1970; 14: 4 3 -5 4 .[3 6 ]P O S K U T A J. Z ależn o ść pom iędzy fo to sy n tezą i o d dychan iem u roślin . W iadom B o t 1992; 36:

7 -5 2 .[37JP O R T IS A R Jr. R u b isco activase . B ioch im B iophys A cta 1990; 1015: 15-28 .[38 ]P O R T IS A R Jr. R eg u la tio n o f ribu lose 1,5 -b isp h o sp h ate ca rb o x y lase / oxy g en ase activ ity . A n n u

R ev P la n t P h ysio l P la n t M o l B io l 1992; 43: 4 1 5 -4 3 7 .[39JP O R T IS A R Jr. T h e regu la tion o f rub isco by rub isco activase . J E xp B ot 1995; 46: 1285-1291 .[4 0 JR O B IN S O N SP, PO R T IS A R Jr. R ibu lose 1 ,5 -b isphosphate ca rb o x y lase / o x y g en ase activase

pro te in p rev en ts the in vitro d ecline in activ ity o f ribu lose 1 ,5 -b isphosphate c a rb o x y lase /o x y ­genase. P la n t P h ysio l 1989; 90: 9 6 8 -9 7 1 .

[41JS A L V U C C I M E. R eg u la tion o f rub isco activ ity in vivo. P h ysio l P la n t 1989; 77: 164-171 .[4 2 ]S A L V U C C I M E, O G R E N W L. T he m echan ism o f rub isco activase: In sigh ts from stud ies o f

the p ro p e rties and s truc tu re o f enzym e. P hotosyn th R es 1996; 47: 1 -11 .[4 3 ]S A L V U C C I M E, P O R T IS A R Jr O G R E N W L. A so lub le ch lo ro p las ts p ro tein cata lyzes

rib u lo seb isp h o sp h ate carb o x y lase /o x y g en ase activation in vivo. P h o tosyn th R es 1985; 7: 193— 201 .

http://rcin.org.pl

398 S. M A L ESZEW SK I, B. K O ZŁ O W SK A -SZE RE N O S

[44 ]S A W A D A S, U S U D A H, T S U K U IT . P artic ipation o f inorgan ic o rth o p h o sp h a te in regu la tion o f the ribu lose 1 ,5 -b isphosphate carboxy late activ ity in response to changes in the p h o to sy n ­thetic so u rce-s ink balance. P lan t C ell P hysio l 1992; 33: 9 4 3 -9 4 9 .

[45JS H A R K E Y TD . F eedback lim ita tions o f photosyn thesis and the physio log ica l role o f ribu lose1,5-b isphosphate carboxy lase carbam ylation . B ot M ag Tokyo Specia l Issue 1990; 2: 8 7 -1 0 5 .

[46JS C H N E ID E R G, L IN D Q V IS T Y, B R Ä N D E N C l. R ubisco: structu re and m echanism . A n n u R ev B io p h ys B iom ol S tru c t 1992; 21: 119-143.

[47]S E E M A N N JR, B E R R Y JA , FR E A S SM , K R U M P M A . R egulation o f ribu lose b isphosphate carb o x y lase activ ity in vivo by a ligh t-m odu la ted inh ib ito r o f catalysis. P roc N a ta l Acacl Se i USA. 1985; 82: 8 0 2 4 -8 0 2 8 .

[48 ]S E E M A N N JR, K O B Z A J, M O O R E B. M etabo lism o f 2 -carboxyarab in ito l 1-p h o sphate and regu la tion o f ribu lose 1 ,5 -b isphosphate carboxy lase activity . P hotosxn th R es 1990; 23: 1 1 9 - 130.

[49JS E R V A IT E S JC , G E IG E R D R. R egulation o f ribu lose 1 ,5-bisphosphate ca rb o x y lase /o x y g e ­nase by m etabolites. J E xp B o t 1995; 46: 1277-1283 .

[50JS P R E IT Z E R R J. G enetic d issec tion o f R ub isco structure and function . A n n u R ev P la n t P h ysio l P la n t M o l B io l 1993; 44: 411^134 .

[51JS PR E IT Z E R RJ, T H O W G, Z H U G. Pseudoreversion substitu tion at large-subun it re sid u e 54 in fluences the C O 2/O 2 specifity o f ch lo rop last rib u lose-b isphosphate carbox y lase /o x y g en ase . P la n t P hysio l 1995; 109: 6 8 1 -6 8 5 .

[52JT O B IN E M , S IL V E R T H O R N E J. L igh t regu la tion o f gene expression in h igher p lan ts. A n n u R ev P lan t P hysio l 1985, 36: 5 6 9 -5 9 3 .

[53JW IL D N E R G F, S C H L IT T E R J, M Ü L L E R M . R ubisco , and old challenge w ith new p e rsp ec ­tives. Z N a tu rfo rsch 1 9 9 6 ,5 1 c : 2 6 3 -2 7 6 .

[5 4 ]W O O D R O W IE , B E R R Y JA . E nzym atic regu lation o f p h o tosyn thetic CO2 fixation in C3

p lants. A n n u R ev P la n t P hysio l P lan t M ol B io l 1988; 39: 5 3 3 -5 9 4 .[55]Z H U G, JE N S E N R G . F a ilo v er o f ribu lose 1 ,5 -b isphosphate carb o x y lase /o x y g en ase activ ity .

D ecarb am y la tio n o f cataly tic sites depends on pH . P lan t P hysio l 1991; 97: 1 3 5 4 -1358 .

Redaktor prow adzący - Szczepan Biliński

O trzym ano: 14 ,11 .1996 r.P rzy ję to : 20.03. 1997 r.15-950 B iałystok, ul. Św ierko w a 20h

http://rcin.org.pl

399

KOMUNIKATY

Komunikat Fundacji Biologii Komórki i Biologii MolekularnejZarząd Fundacji Biologii Komórki i Biologii Molekularnej przyznaje doroczną

nagrodę naukową, w tym również w roku 1996 i 1997, za wyróżniającą się oryginalną pracę z zakresu biologii komórki, indywidualną lub zespołową, wykonaną wyłącznie w krajowej placówce naukowej, opublikowaną w ostatnich dwóch latach w cza­sopiśmie figurującym w Current Content bądź Medline.

Zgłoszenia wraz z dwoma odbitkami należy kierować do dnia 15 listopada każdego roku pod adresem Fundacji. Regulamin nagrody poniżej.

Fundacja Biologii Komórki i Biologii Molekularnej ul. Marymoncka 99, 01-813 Warszawa tel. 34-03-44, fax 3404470

Regulamindorocznej nagrody F undacji B iologii K om órki i B io log ii M oleku larne j

1. Raz w roku przyznawana będzie jedna nagroda za wyróżniającą się, oryginalną pracę z zakresu biologii komórki, indywidualną lub zespołową, wykonaną wyłącznie w krajowej placówce naukowe.2. Praca musi być wydrukowana w czasopiśmie naukowym referowanym

w Current Content.

3. Praca powinna być opublikowana nie wcześniej niż w ostatnich dwóch latach poprzedzających nadanie nagrody.4. Preferowane będą prace młodych autorow.5. W ysokość nagrody w danym roku kalendarzowym ustala Zarząd Funda­

cji.6. Zgłaszać pracę do nagrody może każdy.7. Pracę należy zgłaszać do Zarządu Fundacji ul. M arymoncka 99,

01-813 Warszawa, pokój 314 do 15 października każdego roku.8. Ocenę kwalifikującą prace do nagrody przeprowadza Komisja Nagród

powołana przez Zarząd Fundacji zasięgając w razie potrzeby opinii specjali­stów.

9. Decyzja Komisji ogłaszana będzie w "Postępach Biologii Komórki".10. Nagroda wręczana będzie w czasie jednej z konferencji naukowych z zakresu biologii komórki.

http://rcin.org.pl

400

Wskazówki przygotowania rysunków do publikacji w PBKDostarczane na dyskietkach teksty powinny być napisane w W ordzie, wersja

6,0 lub wcześniejsza. Jeśli w tekst zostały wstawione rysunki, powinny one zostać umieszczone osobno na dyskietce. Powinny to być albo mapy bitowe (.TIF, .PCX), albo pliki z Corela, wersja 5,0 lub wcześniejsza. Każda wersja W orda lub Corela pozwalana zachowanie pracy w formacie wersji wcześniejszej.

Zamawianie odbitek prac przez AutorówAutorzy, którzy chcą otrzymać odbitki swoich artykułów, są proszeni o przesłanie

zamówienia wraz z korektą pracy.Cennik odbitek prac dla Autorów

Liczba odbitek 50 100 200 400Cena zł 40,00 60,00 80,00 100,00

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

IN F O R M A C JE D L A A U T O R Ó W

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI drukują artykuły przeglądowe z zakresu najnowszych osiągnięć biologii komórki, nie publikowane dotąd w innych wydawnictwach. Autorzy odpowiadają za ścisłość podawanych informacji. Obowiązuje terminologia zgodna z polskim mianownictwem biochemicznym, histologicznym, anatomicznym i embriologicznym. Artykuły drukowane w POSTĘPACH BIOLOGII KOMÓRKI nie mogą być bez zgody redakcji publikowane w innych periodykach. Prosimy Autorów o nadsyłanie prac bezpośrednio do Redaktorów odpowiedniej specjalności (adresy na 2 str. okładki), a do Redakcji w Warszawie tylko te artykuły, które nie odpowiadają żadnej z wymienionych specjalności.

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI zamieszczają:1) artykuły przeglądowe nie przekraczające 20 stron maszynopisu i do 100 pozycji bibliograficznych w zasadzie z ostatnich 5 lat

(do 10% pozycji bibliograficznych starszych);2) doniesienia z ostatniej chwili na 3-5 stronach maszynopisu z kilkoma pozycjami bibliograficznymi ostatniego roku (licząc od

daty wysłania do redakcji);3) listy do redakcji ( do 1 strony maszynopisu).Tekst pracy i załączniki należy przesyłać w dwóch egzemplarzach. Maszynopis powinien być pisany jednostron­

nie na papierze formatu A4 z podwójną interlinią i marginesem 4 cm po lewej stronie. Strony powinny być kolejno numerowane. Nadesłanie tekstu pracy, poprawionego po recenzjach i rysunków na dyskietce (wskazówki na s. 400) przyspieszy publikację.Pierwsza strona nie numerowana przeznaczona dla redakcji powinna zawierać: imiona i nazwiska autorów oraz ich tytuły naukowe, adresy w pracy i domowy wraz z telefonem, tytuł pracy w języku polskim i angielskim oraz liczbę stron maszynopisu, liczbę tabel i rysunków. Na pierwszej (numerowanej) stronie należy podać kolejno tytuł pracy w języku polskim i angielskim, imiona (w pełnym brzmieniu) i nazwiska autorów, nazwę zakładu naukowego, nazwisko i adres autora prowadzącego korespondencję, informację o dofinansowaniu pracy oraz skrót tytułu (do 40 znaków). Następna strona powinna zawierać w języku polskim i angielskim streszczenie (do 150 słów) oraz słowa kluczowe - 3 do 10 słów zgodnych z terminami w Medical Subject Headings (Index Medicus), o ile są tam zawarte. W tytule i streszczeniu można stosować jedynie powszechnie przyjęte skróty, np. DNA. Tekst artykułu należy rozpocząć od nowej strony. W tekście nie zamieszczać tabel, schematów lub rysunków, a jedynie zaznaczyć ołówkiem na marginesie ich lokalizację (np. tab. 1, rys. 1 itp.). Dla przejrzystości tekst można podzielić na tytułowane i numerowane rozdziały oraz podrozdziały. Od nowej strony należy podać spis literatury. Skróty nazw czasopism podawać należy według Index Medicus (listy czasopism publikowane są corocznie w numerze styczniowym). Powołanie w tekście następuje przez podanie kolejnego numeru pozycji w spisie literatury w nawiasie kwadratowym ( np. [5]). Spis literatury należy zestawić alfabetycznie według następującego wzoru:

[1] HNILICA LS, McLURE ME, SPELTZBERG TC. Histone biosynthesis and the cell cycle, [w] Philips MP, Schwartz E [red. jHistone and Nucleohistones. London, New York: Philips, Plenum Press 1977: 60-64.

[2] SACHSENMAJER W, REMY V, PLATTNER R. Initiation of synchronous mitosis in Physarium poly- cephalum. Exptl Cell Res 1980; 2: 41-48.

Tabele, opisy schematów i rysunków powinny być załączone na oddzielnych stronach. Schematy i rysunki muszą być wykonane w postaci nadającej się do reprodukcji. Fotografie powinny być kontrastowe i wykonane na błyszczą­cym papierze. Wymiary poszczególnych rysunków, schematów i fotografii nie mogą przekraczać 125 x 180 mm lub ich połowy. Jeżeli załączniki są zapożyczone z innych źródeł, należy podać, skąd zostały zaczerpnięte i dołączyć zgodę autora i wydawnictwa na reprodukcję, jeżeli materiały te zamieszcza się w niezmienionej formie. Wszystkie załączniki muszą być opatrzone na odwrocie nazwiskiem pierwszego autora i oznaczeniem góry i dołu ilustracji. Stosowane jednostki miar muszą być zgodne z układem SI.

Redakcja zastrzega sobie prawo dokonywania skrótów uzgodnionych z Autorem. Autor zobowiązany jest do wykonania korekty autorskiej i zwrócenia jej w ciągu doby. Autorzy otrzymują bezpłatnie 1 egz. zeszytu PBK z opublikowaną pracą oraz mogą zamówić odbitki odpłatnie odsyłając korektę, cennik na s. 400. Redakcja prosi o propozycję do 5 osób (nazwisko, imię, adres, fax), które byłyby odpowiednimi recenzentami maszynopisu, nie powinny jednak być pracownikami instytucji, w której pracuje autor, ani jego współpracownikami.Redakcja prosi także głównego Autora o dołączenie do maszynopisu podpisanej odpowiedzi na następujące pytania:Dołączono 2 kopie maszynopisu, Treść pracy nie była uprzednio publikowana i nie zostałatabel i rycin. tak nie wysłana do innej redakcji. tak nieWszyscy Autorzy znają i akceptują pracę, tak nie Dołączono kopię pracy na dyskietce z podaniem nazwyJest zgoda osób, których informacje niepubli- pliku i użytego programu edycyjnego z komputera IBM tak niekowane są zamieszczone w tekście artykułu tak nie Odpowiadam za całość pracy opisanej w zał. maszyn, tak nieWyrażam zgodę na to, że artykuł po przyjęciu do druku w "Postępach Biologii Komórki" przechodzi na własność reda­kcji i jego reprodukcja wymaga zgody redakcji. podpis

http://rcin.org.pl

PO STĘPY BIO LO G II KO M ÓRK I TOM 24, NR 3, 1997 (301-400)

TREŚĆ

W tym Z eszy c ie 301Ż B IK O W S K A H. M .: M etabo lizm se lenu w kom órce i o rgan izm ie czło w iek a 303Ż B IK O W S K A H. M .: A n tyk arcy n n o g en n e dzia łan ie selenu 315W ID Ł A K P.: S tru k tu ra n u k leo so m o w a chrom atyny a nap raw a D N A 325F E R T A K A ., K IL A R S K I W .: P o łączen ia szcze linow e 339H E L E W S K IK ., K O W A L C Z Y K -Z IO M E K G „ K O N E C K I J„ G Ł O W A C K A M .: B ia łk a su rfa ­

k tan tu 375M A L E S Z E W S K I S., K O Z Ł O W S K A -S Z E R E N O S B .:K arb o k sy laza /o k sy g en aza ry b u lozo-1 ,5 -

b isfo sfo ran u - K luczow y enzym fo tosyn tezy i fo to o ddychan ia - O sta tn ia dek ad a b adań 387 K o m u n ik aty 399W sk azó w k i p rzy g o to w an ia rysunków 40 0

Warunki prenumeraty kwartalnika POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI

Prenumerata na rok 1998Redakcja przyjmuje opłatę prenumeraty za rok 1998 na konto:

FUNDACJA BIOLOGII KOMORKII BIOLOGII MOLEKULARNEJ, ul. Marymoncka 99, 01-813 Warszawa; Bank Polska Kasa Opieki S. A.,IV OAVarszawa 12401053-40006576-2700-401112-001.Cena prenumeraty rocznika na rok 1998:

dla instytucji (bibliotek) wynosi 60 zł, a dla odbiorców indywidualnych 20 zł.

Subscription orders for POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI for 1998 should be placed at local press distributors or directly at Editorial Board o f POSTĘPY BIOLOGII KO­MÓRKI, Marymoncka str. 99, 01-813 Warszawa /Poland, account No:

FUNDACJA BIOLOGII KOMÓRKI I BIOLOGII MOLEKULARNEJ, ul. Mary­moncka 99, 01-813 Warszawa; Bank Polska Kasa Opieki S. A.,IV OAVarszawa 12401053-40006576-2700-401112-001.Price per year 20 dollars USA. Indeks 369705

http://rcin.org.pl