Tok badania bakteriologicznego.

Klasyczne metody stosowane w

diagnostyce bakteriologicznej.

(identyfikacja bakterii i oznaczanie

lekowrażliwości).

mgr Michał Piotrowski

Katedra i Zakład Mikrobiologii

Lekarskiej WUM

DIAGNOSTYKA

MIKROBIOLOGICZNA

• Identyfikacja czynnika etiologicznego

• Określenie lekowrażliwości

• Nadzór epidemiologiczny zakażeń

POBIERANIE MATERIAŁÓW DO

BADANIA MIKROBIOLOGICZNEGO

• Materiał powinen być adekwatny do toczącego się procesu chorobowego.

• Ilość materiału powinna być wystarczająca do przeprowadzenia badania.

• Materiał powinien być pobrany przed antybiotykoterapią.

• Materiał powinien być oznakowany i zaopatrzony w odpowiednią dokumentację.

RODZAJE MATERIAŁÓW

KLINICZYCH DO BADANIA

Wymazy: błony śluzowe, oczy, odbyt, szyjka

macicy, cewka moczowa, rany

Mocz, kał

Krew, płyn mózgowo-rdzeniowy

Płyn opłucnowy, płyn otrzewnowy,

plwocina

Bioptaty, wycinki

Aspiraty z ropni

METODY DIAGNOSTYCZNE

BEZPOŚREDNIE Wykrycie drobnoustroju

lub jego fragmentu

POŚREDNIE Wykrycie swoistych

przeciwciał w surowicy lub płynach ustrojowych

NIEHODOWLANE

•Mikroskopia bezpośrednia

•Wykrywanie białek, toksyn,

kwasów nukleinowych

HODOWLANE

• Wykrywanie drobnoustroju:

Namnażanie, izolacja,

identyfikacja, oznaczenie

lekowrażliwości

BADANIE MIKROSKOPOWE

• PREPARAT BEZPOŚREDNI - preparat

wykonany bezpośrednio z materiału

klinicznego pobranego od pacjenta

• Preparat wykonany z wyhodowanych na

podłożach czystych kolonii

PREPARAT BEZPOŚREDNI

Wykonujemy obowiązkowo z następujących materiałów klinicznych:

• wydzielina z kanału szyjki macicy, pochwy, cewki moczowej

• płyn mózgowo-rdzeniowy

• plwocina, BAL, aspiraty z oskrzeli i płuc

• wymazy z oka

• płyn z opłucnej, otrzewnej

PREPARAT BEZPOŚREDNI

Nie wykonujemy z następujących materiałów klinicznych:

• Wymaz z gardła

Wyjątek: podejrzenie anginy Plauta-Vincenta lub zakażenia grzybiczego

• Kał

Wyjątek: kał od nowordków,

Podejrzenie kampylobakteriozy lub cholery

ROLA PREPARATU

BEZPOŚREDNIEGO

• Metoda szybka i tania

• W próbce pochodzącej z jałowych materiałów klinicznych będzie się znajdować tylko czynnik etiologiczny

• Możliwość różnicowania na bakterie Gram + i Gram –

• Rozpoznanie kształtu i układu komórek bakteryjnych

Można w nim zauważyć bakterie gdy ich liczba wynosi 104 – 105 CFU/mL materiału klinicznego

HODOWLA DROBNOUSTROJÓW

• Podłoże bakteriologiczne

• Atmosfera gazowa: bezwzględne tlenowce, względne beztlenowce, bezwzględne beztlenowce, mikroaerofilne

• Temperatura 35˚C-37˚C, 26˚C-30˚C

• Ciśnienie osmotyczno – izotoniczne 0,9% NaCl

• pH 6,8 – 7,5

• Czas 24h-48h, dni, tygodnie

POSIEW REDUKCYJNY

Jest wykonywany w celu otrzymania pojedyńczej

kolonii drobnoustroju.

RODZAJE PODŁOŻY BAKTERIOLOGICZNYCH

WYBIÓRCZO NAMNAŻAJĄCE

WYBIÓRCZO RÓŻNICUJĄCE

•Pożywka SF

•Bulion z żółcią

•Podłoże Chapmana

•Podłoże MacConkeya

•Podłoże SS

•Podłoże Wilsona-Blaira

PODŁOŻE CHAPMANA

Czynnik wybiórczy – 7,5 – 10% NaCl

Czynnik różnicujący – mannitol

Wskaźnik – czerwień fenolowa

Szczepy rozkładające mannitol zmieniają

zabarwienie podłoża na żółte, szczepy nie

rozkładające mannitolu nie powodują

zmiany barwy pożywki.

PODŁOŻE MACCONKEYA

Czynnik wybiórczy – sole żółciowe, fiolet

krystaliczny

Czynnik różnicujący – laktoza

Wskaźnik – czerwień obojętna

Bakterie rozkładające laktozę tworzą

różowo zabarwione kolonie, natomiast nie

rozkładające pozostają niewybarwione

PODŁOŻE MACCONKEYA

Laktozo dodatnie

Np. Escherichia,

Klebsiella

Laktozo ujemne

Np. Salmonella, Shigella

HODOWLA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW NA PODSTAWIE CECH BIOCHEMICZNYCH

• Testy API

• Zautomatyzowany system Vitek

PRÓBA NA KATALAZĘ

Katalaza jest enzymem, który rozkłada toksyczny

dla komórki H2O2 do H2O i tlenu.

Na szkiełko podstawowe należy nanieść kroplę

3% roztworu H2O2 i zawiesić w niej pobraną

kolonię; pęcherzyki gazu wskazują na obecność

katalazy.

Staphylococcus

Micrococcus

Listeria

Enterobacteriacea

+ Streptococcus

Enterococcus

Lactococcus

-

METODY SEROLOGICZNE

Odczyny immunologiczne:

• Precypitacji

• Aglutynacji

• Immunofluorescencji

• Immunoenzymatyczne (ELISA)

Przykład – lateks wieloważny dla pałeczek rodzaju Salmonella

Bakterie Salmonella posiadają antygeny somatyczne (O), otoczkowe (Vi) oraz rzęskowe (H). Ich identyfikacja jest niezbędna do prawidłowego serologicznego zakwalifikowania badanego szczepu.

Surowice zawierają przeciwciała przeciwko specyficznym antygenom somatycznym lub rzęskowym. Aglutynacja szkiełkowa przebiega na zasadzie przyłączania się przeciwciał do antygenów bakterii i tworzenia tzw. agregatów/strątów które są widoczne gołym okiem.

Rodzaj Salmonella podzielony jest na dwa gatunki:

1. Salmonella enterica, w obrębie którego wyróżniono sześć

podgatunków (subspecies):

• S. enterica subsp. enterica (przykładowe serowary:

Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar,

Mbandaka, Newport)

• S. enterica subsp. salamae

• S. enterica subsp. Arizonae

• S. enterica subsp. diarizonae

• S. enterica subsp. houtenae

• S. enterica subsp. indica

2. Salmonella bongori.

A - S. pyogenes, nieliczne szczepy S. anginosus i S. constelatus

B - S. agalactiae

C - S. dysgalactiae subsp. equisimilis

D - S. bovis (=equinus), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,

Paciorkowce nie wytwarzające wielocukru C to między innymi:

• S. pneumoniae

• S. mitis

• S. thermopohilus

Paciorkowce Grupy serologiczne

wg schematu Lancefield

Podział paciorkowców ze względu na wytwarzanie wielocukru C.

Wielocukier ten różni się w zależności od gatunku bakterii.

METODA IMMUNOENZYMATYCZNA ELISA

Łączenie się antygenu ze specyficznym przeciwciałem (reakcja antygen-przeciwciało) uwidacznia reakcja barwna, powstająca dzięki odpowiednim enzymom.

OZNACZANIE LOKOWRAŻLIWOŚCI

Metoda jakościowa – dyfuzyjno krążkowa

OZNACZANIE LOKOWRAŻLIWOŚCI

Metody ilościowe:

• E-test

• Seryjne rozcieńczenia w podłożu

• Vitek

• MIC - minimalne stężenie hamujące – najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego hamujące wzrost drobnoustrojów

• MBC - minimalne stężenie hamujące – najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów

METODY MOLEKULARNE

Poszukiwanie kwasów nukleinowych w materiale klinicznym lub hodowli drobnoustrojów

Metoda PCR

• Impuls laserowy po dotarciu do materiału matrycy, która zawiera

badana próbkę wywołuje zjawisko desorpcji i jonizacji, w wyniku

czego powstają duże dodatnio naładowane jony, które oddalają się

w kierunku detektora masowego.

• Pomiar masy cząsteczkowej analizowanego związku odbywa się

w spektrometrze masowym (MS). Detektor ten został

zmodyfikowany i w technice MALDI mierzy czas przelotu jonów Tof

(ang. time of flight)

• Ostatecznym rezultatem analizy MALDI-ToF-MS jest

otrzymanie widma spektrometrycznego, na którym widoczne są

sygnały od mas powstałych jonów

SPEKTROMETRIA MASOWA MALDI-TOF

SZCZEPY ALARMOWE

1. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) oporny na metycylinę (MRSA) lub glikopeptydy (VISA lub VRSA) lub oksazolidynony.

2. Enterokoki (Enterococcus spp.) oporne na glikopeptydy (VRE) lub oksazolidynony.

3. Pałeczki Gram-ujemne Enterobacteriaceae spp. wytwarzające beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (np. ESBL,AMPc,KPC) lub oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny.

4. Pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) oporna na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny.

5. Pałeczki niefermentujące z rodzaju Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny.

6. Szczepy chorobotwórcze laseczki beztlenowej Clostridium difficile oraz wytwarzane przez nie toksyny A i B.

7. Laseczka beztlenowa Clostridium perfringens.

8. Dwoinka zapalenie płuc (Streptococcus pneumoniae) oporna na cefalosporyny III generacji lub penicylinę.

9. Grzyby Candida oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn.

10. Grzyby Aspergillus.

11. Rotawirus (rotavirus).

12. Norowirus (norovirus).

13. Wirus syncytialny (RSV)

14. Wirus zapalenia wątroby typu B

15. Wirus zapalenia wątroby typu C.

16. Wirus nabytego niedoboru odporności u ludzi (HIV).

17. Biologiczne czynniki chorobotwórcze izolowane z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, odpowiedzialne za uogólnione lub inwazyjne zakażenia