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　総　　説 北里医学 2015; 45: 79-85　

Received 28 April 2015, accepted 12 May 2015連絡先: 佐藤俊哉 (北里大学医学部実験動物学)〒252-0374 神奈川県相模原市南区北里1-15-1E-mail: serendip@med.kitasato-u.ac.jp

TDP-43の生理的機能とALS病態における意義

佐藤　俊哉

北里大学医学部実験動物学

　筋萎縮性側索硬化症 (ALS) の残存運動神経内に蓄積するTAR DNA-binding protein (TDP-43) の生理的機能を中心に概説した。TDP-43は二つのRNA認識モチーフ (RRM) を有する不均一核内リボ核酸蛋白 (hnRNP) で，RNA代謝の多くの過程に関与する。生物種間で比較すると，TDP-43の保存性

は高いが，スプライシングに及ぼす効果は異なる。結合蛋白の網羅的解析からは，核内ではスプラ

イシング，細胞質内では翻訳との強い関連性が指摘されている。またTDP-43が自身のmRNAに結合して発現を制御するオートレギュレーション機構も明らかにされ，これらの生理的機能の理解が

ALS病態を解明する突破口になる可能性がある。

Key words: 筋萎縮性側索硬化症，TDP-43，生理的機能，スプライシング，オートレギュレーション

はじめに

　筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は，運動神経特異的な変

性を特徴とする神経難病である。ALSの予後はきわめ

て不良で，神経内科医をはじめとする多くの研究者

が，ALSの治療法開発を目指しているものの，未だ有

効な治療法は存在しない1。またALSの病態に関しても

「ALSは手がかりを残さない完全犯罪」と，東京大学名

誉教授の故豊倉康夫先生が述べられたように，長らく

不明の状態が続いていた。しかし近年の神経変性疾患

に対する解析法の進歩により，ALS病態解明の糸口が

少しずつ見えてきた。

　原因不明の神経変性疾患を解明する突破口として，

脳内に蓄積する蛋白の同定，孤発例と同じ病理変化を

きたす家族例からの原因遺伝子同定があり，このよう

な解析法で成果をあげたのが，アルツハイマー病の先

行研究である2,3。ALSにおいても同様の研究手法が使

われたが，病理学的マーカーとして有名なブニナ小体

の構造は小さく，その構成蛋白は明確にされていな

い。ブニナ小体の代わりに標的にされたのが，タウや

αシヌクレインに陰性で，ユビキチンのみに陽性を示

す封入体である。2006年秋，孤発性ALSに認められる

ユビキチン陽性skein-like inclusionの主要な構成蛋白と

してTAR DNA-binding protein (TDP-43) が報告され4,5，

TDP-43は一躍注目を集める分子となった。このTDP-43

陽性封入体は，発見当初より前頭側頭葉変性症 (FTLD)

にも認められることが報告され，さらに複数の疾患で

も認められたため6，神経変性の二次的な結果である可

能性も指摘された。しかし遺伝性ALSとして最初に発

見されたCu/Zn superoxide disumutase 1 (SOD1) 変異を

有するALS症例ではTDP-43陽性封入体が認められず7,8，

二次的な結果ではないとする意見もあった。このよう

な議論に終止符を打ったのが，TDP-43をコードする

TARDBP遺伝子における変異の発見である。常染色体

優性遺伝性形式をとる複数のALS家系から，独立した

複数のミスセンス変異が報告され，TDP-43がALS発症

の一次的な役割を担うことが明らかとなった9-13。

TDP-43の構造と研究における2つの潮流

　TDP-43は二つのRNA認識モチーフ (RRM) を有する

不均一核内リボ核酸蛋白 (hnRNP) であり，その構造と

変異の分布を図1に示す。多くのTARDBP遺伝子変異が

報告されているが，家族例に限ったとしても30種類程

度のミスセンス変異と1種類のインフレーム変異が知ら

れ，それらは全てTDP-43のC末領域に集中している14。

変異の種類が非常に多いことから，筆者はC末領域の

機能低下が病因ではないかと疑っているが，それ以外

の視点からも多くの仮説が提唱されており，一定の見

解を得ていない。またTDP-43は核移行シグナル (NLS)

を有する核蛋白であるが，凝集体を形成した細胞で

は，TDP-43が核から消失する現象が知られており4，

核内で本来有する生理的機能を喪失するという仮説も

ある。

　現在のALS研究の中心がTDP-43であることには間違

いないが，その流れとしては，(1) RNA代謝の異常，

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図1. TDP-43の構造と家族性ALSに認められた変異の分布

　TDP-43は二つのRNA認識モチーフ (RRM1，RRM2)，核移行シグナル (NLS)，核外移行シグナル (NES) を有する。C末領域には，グリシンリッチ領域 (GRR: 274-314) とQ/Nリッチ領域 (Q/N: 320-367) が存在する。家族性ALSに認められた変異を中・下段に示したが，家族例で確認された変異は，全てC末領域に集中している。本図は文献14と20の図を改変して作成した。

佐藤　俊哉

図2. TARDBP遺伝子の構造とオートレギュレーション機構

　TARDBP遺伝子は6つのエクソンよりなるが，最終エクソンに潜在的スプライス部位 (int) が存在する。int6にはスプライス供与および受容部位が各4つあり，その組み合わせにより11種類以上のアイソフォームができるが，蛋白 (TDP-S) として翻訳されている証拠はない。int7にはTDP-43が結合する領域 (TDPBR) があり，TDP-43が自身のmRNAに結合することにより，負のフィードバック機構が働く。int7がスプライシングされると，理論的にはNMDを受ける構造をとるが，文献32ではNMD以外の機構が推定されており，文献33ではpolyA付加シグナル (pA) の選択を変化させることも要因であると報告されている。本図は文献33の図を改変して作成した。

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TDP-43の生理的機能とALS病態における意義

(2) 蛋白凝集による細胞毒性という2つの方向から研究

が進められている。(1) の理由は，ALSの原因遺伝子と

して以下に示すRNA代謝に関与する遺伝子が次々と

発見されたためである。TARDBP遺伝子以外に頻度

の高い原因遺伝子としては，FUS (Fused in sarcoma)，

C9ORF72 (Chromosome 9 open reading frame 72)，頻度

の低い原因遺伝子としては，HNRNPA2B1，ELP3

(elongator protein 3)，SETX (Senataxin)，HNRNPA1が知ら

れ15，昨年にはTDP-43と相互作用するMATR3 (Matrin 3)

遺伝子の変異も報告された16。(2) に関しては，神経変

性疾患の研究に共通した流れであるが，蛋白の品質管

理に関する遺伝子，すなわちSQSTM1 (Sequestosome)，

VCP (Valosin-containing protein)，UBQLN2 (Ubiquilin 2)

などの変異が発見されたことからも支持されている15。

この蛋白凝集に着目する方法は，治療の分子標的を考

える上では非常に有用である。しかし，より深いレベ

ルでALS病態を理解するためには，TDP-43の生理的機

能であるRNA代謝の観点から研究する必要があると考

え，本総説では生理的機能に重点をおいて解説する。

TDP-43発見の歴史

　TDP-43がALSの原因遺伝子であると報告される以前

の歴史について，時系列を追って眺めてみる。TDP-43

の発見は1995年まで遡り，Human immunodeficiency

virus type 1 (HIV-1) 遺伝子 (プロウィルスゲノム) の末

端反復配列 (long terminal repeat) 内にあるTrans-activation

response element (TAR) に結合する蛋白として最初に発

見された17。この結合部位はHIV-1遺伝子の転写活性化

因子であるTrans-activator of transcription (Tat) が結合す

るTAR RNAではなく，二本鎖TAR DNAであり，この

DNA配列に結合してHIV-1転写を抑制する宿主側因子

として報告されたため，TAR DNA-binding proteinと命

名された。

　既に1995年の最初の報告においてもTDP-43とhnRNP

の相同性が高いことが示されていたが，2001年にな

り，TDP-43がRNA結合蛋白としての性質を有すること

をイタリアの研究グループが報告した18。これは 胞

性線維症の原因の一つであるCFTR遺伝子エクソン9の

スキッピングに注目し，その制御に関与する因子を検

索した報告である。CFTR遺伝子イントロン8にある

TG (実際にはUG) 配列多型に結合している蛋白をプル

ダウンし，アミノ酸配列決定にてTDP-43を同定するこ

とにより，TDP-43がスプライシングを促進する因子で

あることを証明した。また同研究グループは，TDP-43

のRNA/DNA結合特性についても解析をおこなった19。

その結果，TDP-43は6リピート以上の一本鎖UGまたは

TG配列に結合し，リピート数に依存して結合が強まる

こと，さらに二つのRRMのうちRRM1が結合に重要な

役割を持ち，RRM1内の保存された2か所のフェニルア

ラニンを改変 (F147L，F149L) することにより，RNA/

DNA結合能が失われることを示した。

　ここまでの研究は，43 kDaの分子量をもつTDP-43の

全長型を対象としていたが，TDP-43には選択的スプラ

イシングにより11種類以上のアイソフォームが存在

し，全長型とは異なる細胞内局在や機能を示すこと

が報告された20,21。この選択的スプライシングは，ALS

の変異が集中する第6最終エクソン内にある潜在的スプ

ライス部位の活性化によるもので (図2)，予想される翻

訳産物はTDP-43のC末領域が欠失した構造をとる (論文

内ではTDP-Sと総称されている)。このTDP-Sが内在性

蛋白として翻訳されているかどうかは明確ではない

が，C末領域に限れば，線虫 (C. elegans) のTDP-43

(TDP-1) と良く似た構造であることは興味深い。

　一般的に蛋白の機能を推定する場合，生物種間の保

存性を検討すること多いが，ヒト・マウス・ショウ

ジョウバエ (D. melanogaster)・線虫の間で，TDP-43は

良く保存され，N末からRRM2領域までは55%程度の相

同性を示している2 1。しかしC末領域の相同性は低

く，ショウジョウバエのTDP-43 (dTDP) は哺乳類より

図3. TDP-43のオーソログの構造

　ヒト・マウス・ショウジョウバエ (D. melanogaster)・線虫 (C. elegans) におけるTDP-43のオーソログの構造を模式的に示した。線虫のC末領域は短く，この領域にグリシンリッチ領域は存在しない。本図は文献14の図を改変して作成した。

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長いC末領域を有しているが，線虫のTDP-1ではC末領

域のグリシンリッチ領域がない (図3)。またこの4種の

オーソログの機能を解析すると，核酸への結合特性は

類似しているものの，線虫のTDP-1とC末領域を欠失さ

せたTDP-43 (TDP-S) では，スプライシングを誘導する

効果が認められないことから21,22，C末領域を介して結

合した蛋白により，スプライシングが誘導される可能

性が高い。

個体におけるTDP-43の役割

　2006年に孤発性ALSとTDP-43の関係が明らかになっ

て以降，TDP-43に関する論文は爆発的に増加してい

る。その中で，TDP-43の必要性や機能が，生物種によ

り異なることが明らかになってきた。哺乳類における

TDP-43の生理的機能を端的に示しているのが，TDP-43

遺伝子欠損マウスの結果で，全ての報告で着床 (胎生

4.5日) 前後に致死となることが報告された23-26。筆者ら

もTDP-43遺伝子欠損マウスの解析をおこなっている

が，TDP-43は母性効果遺伝子，すなわち雌親マウス

(ヘテロ個体) のゲノムから転写されたTDP-43 mRNAが

未受精卵内に蓄えられた状態にあるため，初期胚発生

は進むものの，mRNAの寿命となる着床前後に発生が

停止すると考えられた。一般的に遺伝子欠損マウスが

着床前後に致死を示す場合は，母性効果遺伝子である

場合が多く，着床以前の初期発生に不要な遺伝子なの

ではない。これを裏付ける結果として，TDP-43がES細

胞の生存に必須であることも示されている26。

　マウスのみならず哺乳類全般においてTDP-43は必須

と考えられるが，dTDPを欠損させたショウジョウバエ

では致死とならず，外見的には正常に近いものの，運

動性と寿命の低下を認め，その原因として運動神経終

末の減少が指摘されている27。ただショウジョウバエ

の表現型は系統差が大きいようで，その後の報告では

運動神経終末の増加という反対の結果も示されている

が28，dTDPが運動神経に対して重要な役割を有してい

ることは確かなようである。一方，TDP-1を欠損させ

た線虫では，繁殖力の低下 (雌雄同体から生まれる卵が

野生型の約半分)，成長および運動性の低下などを認め

るが，いずれも軽度の変化であった29。このような異

常は，ヒトTDP-43遺伝子の導入によりレスキューでき

ることから，機能的にはTDP-1がヒトTDP-43のオーソ

ログであると考えられる。ただ上記のような異常を認

めながらも，TDP-1を欠損させた線虫の寿命は，野生

型より長いことが示されている。これは哺乳類やショ

ウジョウバエの機能と逆のようにも見えるが，TDP-1

が加齢を促進させる遺伝子である可能性を示唆してお

り，非常に興味深い発見である。

TDP-43の発現量は厳密に制御されている

　TDP-43遺伝子欠損マウスの研究から，TDP-43が生存

に必須であるだけでなく，その量が厳密に制御されて

いる可能性が指摘された。遺伝子欠損マウスを作成し

た場合，変異アリルからの発現は，Nonsense-mediated

mRNA Decay (NMD) という機構により，mRNAレベル

で抑制されることが知られている30。しかしTDP-43遺

伝子欠損マウスのヘテロ個体では，mRNAレベルおよ

び蛋白レベルでの低下がないことから，オートレギュ

レーション機構の存在が疑われた23-26。その後，TDP-

43が自身のmRNAの3'UTR (図2のTDPBRで示す) に結

合し，近傍の選択的スプライシング (図2のint7で示す)

やpolyA選択を変化させることにより，自身の発現を

制御していることが報告された31-33。この制御機構の発

見を契機に，オートレギュレーション機構の破綻によ

りALSが発症する可能性が議論されている。

　一般的にhnRNPファミリーでは，選択的スプライシ

ングによりmRNA量を変化させる現象が知られてい

る34。これらの遺伝子のイントロン内には，ヒトとマ

ウスの間で極めてよく保存されたultraconserved element

があり，これが選択的スプライシングにより除かれる

ことにより，NMDを生じて量調節がおこなわれる。ま

たSR蛋白の一つであるSC35など，複数のスプライシン

グ因子では，TDP-43と同様なオートレギュレーション

機構の存在も知られている35-37。TDP-43遺伝子の第6エ

クソンにおいてもヒトとマウスの間で保存された配列

があることから，選択的スプライシング→NMDという

機構によりオートレギュレーションが働いている可能

性があるが，それ以外の機構として，選択的スプライ

シング→未知の分解機構，ポリAサイトの選択などが

働いている可能性も指摘されている32,33。このような分

解機構の詳細は不明なものの，負のフィードバックに

よるオートレギュレーション機構の存在は，発現量の

低下のみならず増加にも鋭敏であることを示すもので

ある。これを裏付ける証拠として，変異型のみならず

野生型TDP-43を過剰発現させた場合でも，酵母から

ラットにいたる生物種において，TDP-43の強い毒性が

認められている38-50。

網羅的解析からの機能予測

　TDP-43の生理的機能の解析に関しては，hnRNPとの

相同性から類推されるスプライシング因子としての検

討から始まり，TDP-43と結合する蛋白についても，C

末領域を介する他のhnRNP (hnRNP A1，A2/B1，C1/C2，

A3) との結合が報告されていた51。しかし結合蛋白を網

羅的に解析すると，異なる機能が見えてくる52。HEK-

293T細胞を用いて261種類のTDP-43結合蛋白を同定

し，蛋白質間相互作用を予測するSTRINGを用いて解

佐藤　俊哉

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析すると，結合蛋白が2つのクラスター，すなわち

「Nuclear/Splicing Cluster」と「Cytoplasmic/Translation

Cluster」に集約されることが明らかにされた。この結

果は，核内だけではなく細胞質内におけるTDP-43の機

能を明確にしていく必要性があることを示している。

実際にTDP-43が核−細胞質間をシャトルしているこ

と53，刺激に応じて細胞質内に形成されるストレス顆

粒にTDP-43が存在することも報告されており54，TDP-

43の生理的機能に関しては幅広く検討することが重要

である。

　TDP-43が結合するRNA領域に関しても，次世代シー

クエンサーを用いた網羅的解析の報告がある31 ,55。

TDP-43の結合部位は，約6,000種のRNA上の40,000弱の

部位にわたり，特に長いイントロンの中央部 (Distal

intron) に結合部位が多い。配列としてはUGUGUG配列

に最も良く結合するが，この配列が必要条件でも充分

条件でもないようで，結合部位の特異性に関しては不

明な点があった。しかし最近の報告では，線虫のTDP-

1の結合部位を網羅的に解析した結果，転写直後に生じ

る二本鎖RNAの構造を認識して，その構造を阻害する

ためにRNAに結合している可能性が指摘されている56。

この論文は二本鎖RNAを認識するJ2抗体を用い，状況

証拠を積み上げる証明法を取っているが，結果は非常

にシンプルであり，また線虫を用いているため，TDP-

43の最も基本的な機能を表している可能性があり，興

味深い仮説と思われた。

おわりに

　TDP-43の生理的機能に関しては，相同性からの推測

だけでなく，個体レベルあるいは網羅的な解析が加わ

ることにより，その全体像がバランスよく検討されて

いる。またオートレギュレーション機構の存在は，病

態の悪循環を説明しやすいなど，ALS病態の理解に必

要な材料は揃ってきているが，未だ病態の核心には

至っていない。この理由として，誰もが納得できる優

れた病態モデルがないことが原因の一つと考えられ

る。筆者は20年以上に渡って神経変性疾患モデルの開

発を続けているが，モデル作成には変異の効果を増強

する工夫が必要であると考えている。ALSモデル開発

においても，最近開発されたゲノム編集技術を用いれ

ば，内在性TDP-43にさまざまな変異を導入することが

可能であり，変異の効果を確認しながらモデル作成が

できる。現時点では真のALSモデルといえるようなマ

ウスは完成していないが，TDP-43の生理的機能を考慮

しながら，病態を忠実に反映したモデルを開発し，

ALS治療に貢献できるよう今後も努力を続けたいと考

えている。

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佐藤　俊哉

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Physiological functions of TDP-43 and implications forALS pathogenesis

Toshiya Sato

Department of Laboratory Animal Science, Kitasato University School of Medicine

The physiological functions of TAR DNA-binding protein (TDP-43) were summarized, of which inclusionsin residual motor neurons are a pathological hallmark of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). TDP-43 is amember of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) family carrying two RNA recognitionmotifs (RRMs) and involved in various processes of RNA metabolism. The gene encoding TDP-43 is conservedin human, mouse, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans, whereas the functional differencesin the splicing effect were observed. As a result of global proteomic analysis, TDP-43 interacting proteinswere divided mainly into two clusters of distinct interaction networks, a nuclear/splicing cluster and acytoplasmic/translation cluster. It was also found that TDP-43 binds to its own mRNA, which regulates themRNA at a steady-state level through a negative feedback loop, namely TDP-43 autoregulation. Although thepathophysiological mechanisms of ALS are becoming clearer, understanding the physiological functions ofTDP-43 could offer a therapeutic breakthrough of ALS.

Key words: ALS, TDP-43, physiological function, splicing, autoregulation

TDP-43の生理的機能とALS病態における意義