Stężenie wybranych biomarkerów toksyczności dymu tytoniowego u osób palących tytoń chorych na...

Rak krtani jest najcz´Êciej spotykanym nowo-tworem z∏oÊliwym g∏owy i szyi. Do chwili obecnejpoznano kilka czynników zwi´kszajàcych ryzykozachorowania na raka krtani. Jednym z nich jest pa-

lenie tytoniu. W Polsce od poczàtku lat osiemdzie-siàtych ubieg∏ego wieku obserwuje si´ tendencj´spadkowà cz´stoÊci palenia, a pomimo to Polskanale˝y do krajów o najwy˝szej konsumpcji tytoniu

39Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1

St´˝enie wybranych biomarkerów toksycznoÊci dymutytoniowego u osób palàcych tytoƒ chorych na raka krtani

The concentration of the chosen smoke toxicity biomarkers among smokers suffering from larynx cancer

Beata Winiarczyk1, Grzegorz Namys∏owski2, Mariusz Oleksiak1

1 Oddzia∏ Laryngologii, Szpital Specjalistyczny w Dàbrowie GórniczejOrdynator: lek. med. M. Oleksiak

2 II Katedra i Oddzia∏ Kliniczny Laryngologii Âl.AM w ZabrzuKierownik: prof. dr hab. n. med. G. Namys∏owski

SummaryIntroduction: An incidence of laryngeal cancer is strongly connected with exposure to tobacco smoke containing dozens ofcarcinogens. Genotoxic agents such as polycyclic aromatic hydrocarbons present in tobacco smoke are responsible for lesionsof structure DNA and formation of DNA adducts by metabolically activated intermediates. Detecting the presence of DNAadducts in human tissues is therefore, a tool for studies of cancer. An evidence demonstrates that DNA adducts are usefulmarkers of carcinogen exposure. The aim of this work was estimation of relationship between cigarette smoke exposure,determined as urinary cotinine and urinary 1-hydroxypyrene concentration, and number of aromatic-DNA adducts in bloodlymphocytes. Material and methods: The study group consisted of 60 men at the age of 45 up to 65 years – 20 healthy non-smokers, 20 healthy current smokers and 20 current smokers with primary larynx cancer, which was classified histopatho-logically as squamous cell carcinoma. The cotinine and 1-hydroxypyrene were determined in the urine with high perfor-mance liquid chromatography. Analysis of DNA adducts was performed by the 32P – postlabelling method. Results: Urinarycotinine concentration in healthy smokers and cancer subjects in comparison with non-smokers was significant higher thanin non-smokers, respectively, 29- and 31-fold higher but differences between healthy and sicks smokers were insignificant.Concentration of 1-hydroxypyrene in urine of healthy and cancer subjects was significantly higher (9- and 10-fold higher,respectively) compared with non-smokers. The highest level of aromatic-DNA adducts was found in lympfocytes of healthysmokers but differences between number of adducts in healthy smokers compared with non-smokers (+35%) and cancer sub-jects (+7,1%) were insignificant. The Pearson’s coefficient (r) for the correlation between aromatic-DNA level and urinarycotinine or 1-hydroxypyrene concentration were significant only in cancer subjects group (r = 0,676, p = 0,011 and r = 0,465,p = 0,039, respectivelly). Conclusions: The results suggest that cotinine and 1-hydroxypyrene concentration in urine are use-ful biomarkers of the tobacco smoke exposure. In contrast the levels of aromatic-DNA adducts in lymphocytes are not suit-able for that purpose. It seems that none of investigated compounds are the risk predictor of larynx cancer.

H a s ∏ a i n d e k s o w e : rak krtani, addukty WWA-DNA, palenie papierosów

K e y w o r d s : larynx cancer, DNA-PAH, tobacco smoking

Otolaryngol Pol 2007; LXI (1): 39–46 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów G∏owy i Szyi

F

F

Autorzy nie zg∏aszajà konfliktu interesów.

na Êwiecie. Wed∏ug raportu Âwiatowej OrganizacjiZdrowia – WHO z 2002 roku, w Polsce dziennie pa-li∏o papierosy 51% m´˝czyzn i 29% kobiet powy˝ejpi´tnastego roku ˝ycia [34]. Dym tytoniowy jest he-terogennà mieszaninà gazów, nieskondensowanejpary lotnych zwiàzków chemicznych i substancjismolistych. Liczb´ zwiàzków chemicznych wcho-dzàcych w sk∏ad dymu tytoniowego ocenia si´ naok. 4800. Wed∏ug Mi´dzynarodowej Agencji Badaƒnad Rakiem – IARC, w dymie tytoniowym wyst´-puje 67 zwiàzków o w∏asnoÊciach rakotwórczych[12–14]. Wyst´pujàce w dymie tytoniowym sub-stancje kancerogenne powodujà zmiany w struktu-rze DNA. Aminy aromatyczne i wielopierÊcienio-we w´glowodory aromatyczne (WWA) tworzà obj´-toÊciowe addukty, N-nitrozoaminy alkilujà zasadyDNA, a reaktywne formy tlenu prowadzà do po-wstania utlenionych zasad purynowych i pirymi-dynowych. Ponadto wymienione grupy kanceroge-nów indukujà powstawanie jednoniciowychprzerw w ∏aƒcuchu DNA [26]. Warunkiem powsta-nia adduktów DNA-WWA jest obecnoÊç miejscao zwi´kszonej g´stoÊci elektronowej w obr´bie w´-glowodoru. Obszar ten nazywany jest bay region.Szczególnie podatne na tworzenie adduktów sàstruktury epoksydów dihydrodioli [29]. Mierni-kiem umo˝liwiajàcym ocen´ zagro˝enia cz∏owiekazwiàzanego z obecnoÊcià czynników szkodliwychw Êrodowisku jest analiza jego tkanek lub p∏ynówustrojowych prowadzàca do wykrycia w nich egzo-gennych substancji chemicznych, ich metabolitów,zmienionych poziomów aktywnoÊci enzymatycz-nej oraz innych substancji biochemicznych zwiàza-nych z interakcjà szkodliwych zwiàzków chemicz-nych z systemem biologicznym cz∏owieka [21].Zwiàzki oznaczane w tych analizach nazywamymarkerami biologicznymi (biomarkerami). Biomar-kery stanowià konkretne ogniwa nast´pujàcych posobie przemian zapoczàtkowanych ekspozycjà naczynniki szkodliwe i zakoƒczonych stanem choro-bowym. W zale˝noÊci od tego, jakie procesy sàokreÊlane z u˝yciem biomarkerów, klasyfikuje si´je jako biomarkery nara˝enia/ekspozycji (dostarcza-jàce informacji o rozmiarach nara˝enia), biomarke-ry efektu biologicznego (informujàce o skutkachbiologicznych, jakie powodujà czynniki szkodliwe)oraz biomarkery wra˝liwoÊci osobniczej (pozwala-jàce identyfikowaç osoby o szczególnie wysokimryzyku zachorowania) [7]. Biologicznymi biomar-kerami dymu tytoniowego mogà byç zarówno nie-które jego sk∏adniki, jak i powstajàce w ustroju me-tabolity poszczególnych sk∏adników dymu tytonio-

wego. Przeglàd piÊmiennictwa pozwala na wyod-r´bnienie dwóch grup biomarkerów. Grupa pierw-sza obejmuje zwiàzki, które pe∏nià przede wszyst-kim rol´ markerów nara˝enia na zwiàzki o w∏asno-Êciach rakotwórczych znajdujàce si´ w dymie tyto-niowym (metabolity wielopierÊcieniowych w´glo-wodorów aromatycznych). Do drugiej grupy nale˝yzaliczyç powszechnie stosowane biomarkery, zapomocà których oznaczamy nara˝enie na dym tyto-niowy (nikotyna, kotynina, 1-hydroksypiren). Naj-cz´Êciej stosowanym biomarkerem nara˝enia nask∏adniki dymu tytoniowego jest kotynina, metabo-lit nikotyny. Kotynina jest najodpowiedniejszymbiomarkerem nara˝enia na dym tytoniowy, a po-miar st´˝enia kotyniny w moczu jest uwa˝any zanajbardziej niezawodnà metod´ oceny indywidual-nego nara˝enia na dym tytoniowy i to wÊród pala-czy zarówno czynnych, jak i biernych. Mocz wyda-je si´ najlepszym materia∏em do oznaczania kotyni-ny, poniewa˝ w jego przypadku istnieje mo˝liwoÊçnieinwazyjnego pobierania próbek. Jednak wydala-nie kotyniny zale˝y od sprawnoÊci funkcjonowanianerek i pH moczu [18]. Aby wyeliminowaç b∏´dywynikajàce z nieprawid∏owego funkcjonowania ne-rek oraz w celu uwzgl´dnienia stopnia zag´szcza-nia/rozrzedzania moczu wielu autorów pos∏ugujesi´ wartoÊcià ilorazu st´˝eƒ kotynina/kreatyninaw moczu [8, 10, 28]. Z kolei st´˝enie 1-hydroksypi-renu jest powszechnie akceptowane jako wskaêniknara˝enia na wielopierÊcieniowe w´glowodory aro-matyczne zawarte zarówno w dymie tytoniowym,jak i pochodzàce z innych êróde∏. Piren jest sta∏ymsk∏adnikiem WWA wyst´pujàcych w dymie tyto-niowym. W przeciwieƒstwie do metabolitów WWAo wy˝szych od niego masach czàsteczkowych jestwydzielany w postaci 1-OHP z moczem, który jest∏atwo dost´pnym materia∏em do analizy [15]. Ad-dukty DNA-WWA nale˝à do grupy biomarkerówefektu biologicznego.

Celem pracy by∏o:– okreÊlenie st´˝enia biomarkerów nara˝enia (ko-

tynina i 1-hydroksypiren) w moczu oraz biomarkeraefektu biologicznego (addukty aromatyczne – DNA)w limfocytach niepalàcych i palàcych osób zdro-wych oraz palàcych osób chorych na raka krtani,

– ocenienie na drodze analizy korelacyjnej,uwzgl´dniajàcej wyniki oznaczeƒ kotyniny, mo˝li-woÊci wykorzystania 1-hydroksypirenu i adduktówaromatycznych DNA jako wskaêników nara˝eniana dym tytoniowy,

– weryfikacja mo˝liwoÊci zastosowania oznacza-nia st´˝enia adduktów aromatycznych DNA w lim-

B. Winiarczyk i inni

40 Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1

focytach jako biomarkera efektu biologicznego,– dokonanie analizy, czy badane parametry bio-

chemiczne (kotynina, 1-hydroksypiren, adduktyDNA-WWA) mogà byç czynnikami prognostyczny-mi ryzyka zachorowania na raka krtani.

MATERIA∏ I METODY

Do badaƒ w∏àczono 60 m´˝czyzn w wieku45–65 lat (Êrednia 53 lata) podzielonych na 3 pod-grupy:

– grupa kontrolna – 20 m´˝czyzn, niepalàcychi niezamieszkujàcych we wspólnych pomieszcze-niach z osobami palàcymi papierosy,

– grupa palàcych zdrowych – 20 m´˝czyzn wy-palajàcych dziennie Êrednio 19,5 ± 5,1 papierosówi palàcych przez okres 28,3 ± 6,5 lat. Dziewi´cium´˝czyzn pali∏o papierosy bez filtra.

– grupa palàcych chorych – 20 m´˝czyzn z po-twierdzonym histopatologicznie rakiem krtani, wy-palajàcych Êrednio 22,8 ± 5,0 papierosów dzienniei palàcych przez okres 30,5 ± 5,6 lat. Dwunastum´˝czyzn pali∏o papierosy bez filtra.

Pacjenci zamieszkiwali region Górnego Âlàska,˝adna z badanych osób nie by∏a zatrudniona w jakiej-kolwiek ga∏´zi przemys∏u chemicznego bàdê kok-sowniczego. Na podstawie standardowych badaƒbiochemicznych u ˝adnej z osób nie stwierdzono cu-krzycy, zaburzeƒ funkcji wàtroby, trzustki, uk∏adupokarmowego oraz zaburzeƒ gospodarki lipidowej.U nikogo nie stwierdzono ostrych stanów zapalnych.Wszyscy palàcy byli palaczami czynnymi w chwiliprzyj´cia na oddzia∏. Chorzy z histopatologicznie po-twierdzonym rakiem krtani zostali zakwalifikowanido grupy T3N0M0. Badaniem histopatologicznymrozpoznano 20 przypadków carcinoma planoepithe-liale. U czternastu chorych guz zajmowa∏ górne pi´-tro krtani a u szeÊciu pi´tro Êrodkowe. Charakterysty-k´ osób badanych przedstawiono w tabeli I.

Materia∏ do badaƒ stanowi∏a krew ˝ylna w iloÊci2 ml – w materiale tym oznaczano w limfocytachaddukty DNA-WWA technikà 32P-postlabelling (tra-wienie P1 nukleazà, rozdzia∏ mieszaniny poreak-cyjnej za pomocà HPLC, detekcja sygna∏u za pomo-cà autoradiografii) w 30 ml moczu z rannej zbiórki– oznaczano st´˝enie kotyniny – metodà Nakajima[24], st´˝enie 1-hydroksypirenu – metodà Jongene-elena [19] oraz st´˝enie kreatyniny – podstawàoznaczenia by∏a reakcja Jaffe’go. Do oznaczeƒ u˝y-wano zestawu diagnostycznego „Biochemtest- Kre-atynina” firmy POCH, Gliwice, nr kat. 178196149.St´˝enie kreatyniny oznaczano w celu wyelimino-wania b∏´du wynikajàcego z nieprawid∏owegofunkcjonowania nerek oraz w celu uwzgl´dnieniastopnia zag´szczenia/rozcieƒczenia moczu. Próbkido badaƒ pobierano rano przed wypaleniem pierw-szego papierosa. Uzyskane wyniki przedstawionow tabelach II i III.

WYNIKI

W stosunku do grupy niepalàcych, która w pre-zentowanych badaniach jest grupà kontrolnà, od-notowano ponad 29-krotnie wi´ksze st´˝enie koty-niny w moczu zdrowych osób palàcych papierosyoraz prawie 31-krotnie wi´ksze st´˝enie kotyniny

St´˝enie biomarkerów toksycznoÊci


Ryc. 1. Przyk∏adowe radiogramy kontroli enzymatycznej, wzor-ca dG – BPDE oraz adduktów DNA izolowanych z limfocytów

Tabela I. Charakterystyka osób badanych

Parametr Niepalàcy Palàcy zdrowi Palàcy chorzy na raka krtani

LiczebnoÊç 20 20 20Wiek (lata) 52,2 ± 4,9 54,6 ± 7,0 53,3 ± 6,3Przedzia∏ wieku (lata) 45 – 60 45 – 65 45 – 65Liczba dziennie wypalonych papierosów (szt.) – 19,5 ± 5,1 22,8 ± 5,0Okres palenia (lata) – 28,3 ± 6,5 30,5 ± 5,6IloÊç spo˝ywanego alkoholu (ml/tydzieƒ) 55 ± 40 138 ± 85 355 ± 245Kreatynina w moczu (mmol/l) 9,0 ± 1,4 9,3 ± 1,5 8,5 ± 1,2

w moczu palàcych chorych na raka krtani. W bar-dzo zbli˝ony sposób kszta∏tujà si´ relacje pomi´dzywartoÊciami stosunku kotynina/kreatynina w mo-czu w poszczególnych grupach. Omawiana wartoÊçw grupie zdrowych osób palàcych papierosy jestprawie 29-krotnie wi´ksza ni˝ w grupie kontrolnej,a w grupie osób palàcych papierosy chorych na ra-ka krtani jest nieca∏e 34 razy wi´ksza. Analogiczneobliczenia przeprowadzono dla st´˝enia 1-OHPoznaczonego w moczu badanych osób. W stosunkudo st´˝enia 1-OHP w moczu osób z grupy kontrol-nej, jego st´˝enie w moczu osób palàcych papiero-sy zdrowych i chorych jest odpowiednio 9,1 razyi 10 razy wi´ksze. Przeliczenie st´˝enia 1-OHP nast´˝enie kreatyniny w moczu nie powoduje zmian

zale˝noÊci. Poziom wartoÊci ilorazu st´˝eƒ 1-OHP/kreatynina jest wi´kszy 9,3 razy (osoby palàcezdrowe) oraz 11,1 razy (osoby palàce chore na rakakrtani) od wartoÊci tego stosunku w grupie kontro-lnej. Analizujàc st´˝enie adduktów DNA w limfo-cytach zauwa˝amy, ˝e osoby palàce zdrowe wyka-zujà o 35% a palacze chorzy o 26% wy˝sze st´˝enieadduktu DNA w limfocytach w porównaniu z gru-pà kontrolnà. Do tej pory w publikowanych pra-cach porównywano st´˝enie adduktów DNA-WWAu osób niepalàcych i palàcych chorych na raka krta-ni. W omawianej pracy porównano st´˝enie adduk-tów DNA-WWA u osób palàcych zdrowych i palà-cych chorych na raka krtani i stwierdzono, ˝e oso-by palàce zdrowe mogà mieç wy˝sze st´˝enie ad-



Tabela II. Wyniki oznaczania st´˝enia kotyniny i stosunku st´˝eƒ kotynina/kreatynina w moczu, st´˝enia 1-OHP i stosunku st´˝eƒ1-OHP/kreatynina w moczu oraz st´˝enia adduktów DNA w limfocytach

Parametr Niepalàcy Palàcy zdrowi Palàcy chorzy na raka krtani x ± SD x ± SD x ± SD

(min: max) (min: max) (min: max)

Kotynina (μg /l) 65,5±49,9 (2,3:156,7) 1910±473 (1045:2876) 2021±554 (1199:3245)Kotynina/kreatynina (μg /g) 64,3±50,0 (2,2:147,8) 1854±569 (1100:3507) 2172±726 (1376:3687)1-hydroksypiren (1-OHP) μg/l 0,22±0,11 (0,05:0,44) 2,01±1,04 (0,24:4,56) 2,20±0,77 (0,98:3,32)1-OHP/kreatynina (μmol/mol) 0,11±0,055 (0,025:0,20) 1,02±0,62 (0,14:2,88) 1,20±0,43 (0,40:2,21)Addukty DNA (fmol/μgDNA) 0,123±0,091 (0,034:0,354) 0,166±0,121 (0,050:0,586) 0,155±0,108 (0,028:0,466)Liczba adduktów /108 nukleotydów 4,10±0,45 (1,13:11,8) 5,55±4,04 (1,67:19,5) 5,18±3,60 (0,9:15,5)x±SD – wartoÊç Êrednia i jej odchylenie standardowe; min, max wartoÊç minimalna i maksymalna

Tabela III. Wspó∏czynnik korelacji Pearsona (r), poziom istotnoÊci (p) dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny oraz 1-OHP wmoczu a wartoÊciami ilorazu tych st´˝eƒ do st´˝enia kreatyniny w moczu, dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny oraz 1-OHP wmoczu, dla zale˝noÊci pomi´dzy st´˝eniem kotyniny i 1-OHP w moczu a st´˝eniem adduktów DNA w limfocytach.

Zale˝noÊç (zmienna 1 vs zmienna 2) Grupa Parametr (r) Parametr (p)

Kotynina (μg/l) vs. kotynina /kreatynina (μg/g) Niepalàcy 0,971 < 0,001Palàcy zdrowi 0,920 < 0,001Palàcy chorzy 0,922 < 0,001

1-OHP (μmol/l) vs. 1-OHP/kreatynina (mol/mol) Niepalàcy 0,953 < 0,001Palàcy zdrowi 0,959 < 0,001Palàcy chorzy 0,908 < 0,001

Kotynina (μg/l) vs. 1-OHP (μg/l) Niepalàcy 0,074 NsPalàcy zdrowi 0,501 0,025Palàcy chorzy 0,397 0,083

Kotynina (μg/l) vs. addukty DNA (fmol/g DNA) Niepalàcy 0,306 0,189Palàcy zdrowi 0,251 0,286Palàcy chorzy 0,676 0,011

1-OHP (μg/l) vs. addukty DNA (fmol/g DNA) Niepalàcy 0,014 0,953Palàcy zdrowi 0,336 0,147Palàcy chorzy 0,465 0,039

ns – nieznamienne statystycznie

duktów DNA-WWA ni˝ osoby palàce chore na rakakrtani.

We wszystkich badanych grupach wspó∏czyn-nik korelacji r mi´dzy st´˝eniem kotyniny a warto-Êcià stosunku kotynina/kreatynina w moczu osóbbadanych osiàga wartoÊci powy˝ej 0,9, co oznaczakorelacj´ prawie pe∏nà. Bardzo podobne wartoÊcir i p znaleziono dla zale˝noÊci st´˝enia 1-OHP odwartoÊci stosunku st´˝eƒ 1-OHP/kreatynina.W grupie kontrolnej korelacja pomi´dzy st´˝eniemkotyniny a st´˝eniem 1- OHP w moczu osób bada-nych jest nik∏a. Natomiast osoby palàce papierosyzarówno zdrowe jak i chore na raka krtani wykazu-jà korelacj´ przeci´tnà pomi´dzy badanymi wielko-Êciami. W grupie niepalàcych st´˝enie adduktóww limfocytach wykazuje przeci´tnà korelacj´ ze st´-˝eniem kotyniny oraz nik∏à ze st´˝eniem 1-OHPw moczu. W grupie osób palàcych zdrowych, kore-lacja pomi´dzy st´˝eniem kotyniny i 1-OHP w mo-czu a st´˝eniem adduktów w limfocytach jest s∏abadla kotyniny, a dla 1-OHP przeci´tna. Natomiastw grupie palàcych chorych korelacja pomi´dzy st´-˝eniem kotyniny a st´˝eniem adduktów DNA jestwysoka, a pomi´dzy st´˝eniem 1-OHP a st´˝eniemadduktów DNA wyst´puje korelacja przeci´tna.

DYSKUSJA

Monitorowanie ryzyka wystàpienia schorzeƒwywo∏anych paleniem tytoniu powinno byç zwià-zane ze Êledzeniem i ocenà wielkoÊci nara˝enia nadym tytoniowy i to zarówno wÊród palaczy czyn-nych, jak i osób niepalàcych, ale nara˝onych nadym tytoniowy. Wymaga to zastosowania obiek-tywnych wskaêników nara˝enia, efektu i wra˝liwo-Êci. Sà nimi biomarkery umo˝liwiajàce wykrywa-nia zmian o charakterze przedklinicznym, które po-przedzajà wystàpienie jawnej postaci choroby, costwarza warunki dla podejmowania bardziej sku-tecznych dzia∏aƒ profilaktycznych. Kotynina jestnajodpowiedniejszym biomarkerem nara˝enia nadym tytoniowy, a pomiar st´˝enia kotyniny w oso-czu lub moczu uwa˝any jest za najbardziej nieza-wodnà i wiarygodnà metod´ oceny indywidualne-go nara˝enia na dym tytoniowy i to wÊród palaczyzarówno czynnych, jak i biernych. Znalaz∏o to od-zwierciedlenie w zaleceniach komisji powo∏anejw ramach Society for Research on Nicotine and To-bacco (SRNT, 2002). Najcz´Êciej przyjmowanew piÊmiennictwie wartoÊci graniczne, na podsta-wie których dokonuje si´ rozgraniczenia osób nie-

palàcych i niepalàcych, ale nara˝onych na ETS (pa-lacze bierni) to 50 μg/l [16, 17, 27] lub 100 μg/l [9,11]. W prezentowanej pracy wykazano, ˝e Êredniest´˝enie kotyniny w moczu osób niepalàcych i nie-nara˝onych na dym tytoniowy wynosi 65,5 μg/li cechuje si´ znacznà rozpi´toÊcià wyników od 2,3do 156,7 μg/l. Niewàtpliwie jest to spowodowanetym, ˝e cz´Êç badanych osób tej grupy, chocia˝ niezamieszkiwa∏a wspólnie z osobà palàcà, to mog∏abyç nara˝ona na ETS w miejscu pracy lub w innymÊrodowisku. Ârednia wartoÊç st´˝enia kotyninyw moczu osób zdrowych, palàcych papierosy, obli-czona w wyniku przeprowadzonych badaƒ, wynosi1910 μg/l. Osoby chore na raka krtani, palàce pa-pierosy, wykazujà podobne st´˝enie kotyninyw moczu – 2021 μg/l. Nieznacznie wi´ksza, ale sta-tystycznie nieznamienna wartoÊç st´˝enia kotyninyw moczu osób chorych, w porównaniu z osobamizdrowymi, mo˝e mieç swojà przyczyn´ w wi´kszejliczbie spalanych papierosów, jak i w wi´kszymokresie ich palenia deklarowanym przez osoby cho-re na raka krtani. Zdaniem niektórych badaczy st´-˝enie kotyniny w moczu powinno si´ przeliczaç nast´˝enie kreatyniny wydzielanej wraz z moczem.Ma to zwiàzek ze sprawnoÊcià funkcjonowania ne-rek oraz mo˝liwymi przypadkami zag´szcza-nia/rozcieƒczania moczu [5, 31]. Majàc to na uwa-dze przeprowadzono oznaczenia kreatyniny w mo-czu wszystkich badanych osób i wyznaczono war-toÊç stosunku st´˝eƒ kotynina/kreatynina. Stwier-dzono, ˝e wyznaczone parametry sà ze sobà ÊciÊleskorelowane. Z grupy biomarkerów nara˝enia naWWA na pierwszy plan wysuwa si´ g∏ówny meta-bolit 1-OHP [20].

Zdecydowana wi´kszoÊç badaczy stwierdzaznamiennie wi´ksze st´˝enie 1-OHP w moczu osóbpalàcych tytoƒ w porównaniu z grupà kontrolnàniepalàcych. W obecnej pracy st´˝enie 1-OHPw moczu palaczy zdrowych i chorych na raka krta-ni, w porównaniu z grupà kontrolnà, wzrasta∏o od-powiednio 9,3 razy i 11,1 razy. Obserwowane ró˝-nice krotnoÊci wzrostu st´˝enia 1-OHP w moczuosób palàcych w stosunku do jego st´˝enia w mo-czu niepalàcych wynikajà przypuszczalnie z kilkupowodów. Pierwszy to obecnoÊç egzogennych êró-de∏ WWA (a tym samym pirenu), wyst´pujàcychszczególnie w aglomeracjach miejskich. Drugi po-wód to odniesienie zmian w st´˝eniu 1-OHP doliczby wypalanych papierosów (wywiad ankieto-wy), co nie musi odzwierciedlaç iloÊci WWA inha-lowanych wraz z dymem tytoniowym. Natomiastinne powody to ró˝na ekspozycja zawodowa na



WWA (hutnicy, koksownicy, pracujàcy przy pro-dukcji asfaltu), czy te˝ mo˝liwoÊç pojawienia si´polimorfizmu genetycznego enzymów metabolizu-jàcych WWA w organizmie [1, 23, 25, 32]. Podob-nie jak w przypadku kotyniny, przeliczenie st´˝e-nia 1-OHP na iloÊç kreatyniny wydalanej z moczemda∏o bardzo zbli˝one wyniki. Wspó∏czynnik korela-cji Pearsona pomi´dzy st´˝eniem 1-OHP oraz war-toÊcià stosunku st´˝enia 1-OHP/kreatynina w mo-czu we wszystkich trzech grupach osiàga wartoÊçpowy˝ej 0,9 przy wysokiej znamiennoÊci staty-stycznej p< 0,001, co oznacza korelacj´ prawie pe∏-nà. Wzrost nara˝enia na dym tytoniowy powinienskutkowaç zwi´kszonà iloÊcià sk∏adników dymutytoniowego i ich metabolitów w organizmie cz∏o-wieka. Oznacza to, ˝e wzrost st´˝enia kotyninyw moczu powinien odpowiadaç zwi´kszonej iloÊciWWA dostajàcych si´ do organizmu osoby palàcej.Tymczasem w opublikowanych w piÊmiennictwiedanych, a tak˝e z badaƒ w∏asnych wynika, ˝e kore-lacja st´˝enia kotyniny i 1-OHP nie osiàga wartoÊciprzypisanych korelacji bardzo wysokiej lub prawiepe∏nej. Niewàtpliwie przyczynà jest spalanie przezosoby badane papierosów o ró˝nej zawartoÊci niko-tyny (prekursora kotyniny) i substancji smolistych(g∏ównego êród∏a WWA). Wysokiej zawartoÊci ni-kotyny mo˝e towarzyszyç niska zawartoÊç substan-cji smolistych lub na odwrót. Rozpatrujàc st´˝enieadduktów DNA w materiale biologicznym nale˝a-∏oby spodziewaç si´ Êcis∏ej korelacji pomi´dzy ichst´˝eniem a nara˝eniem na dym tytoniowy. Tym-czasem nale˝y zwróciç uwag´ na warunki, któremuszà byç spe∏nione, aby dosz∏o do powstania ad-duktów DNA. Tworzenie adduktów jest mo˝liwetylko w okreÊlonych miejscach ∏aƒcucha DNA;WWA musi posiadaç miejsce o zwi´kszonej g´sto-Êci elektronowej. Mo˝na za∏o˝yç, ˝e w pewnymmomencie nast´puje wysycenie miejsc zdolnychdo przy∏àczenia struktur aromatycznych. W zwiàz-ku z tym, zwi´kszenie nara˝enia na WWA od pew-nego momentu nie b´dzie powodowaç wzrostuliczby adduktów. Takie wnioski wyciàgn´li niektó-rzy badacze stwierdzajàc, ˝e st´˝enie adduktówDNA w limfocytach zwi´ksza si´ wraz z liczbà wy-palanych papierosów, ale poczàwszy od ponaddwudziestu papierosów wypalanych dziennie ju˝si´ nie zmienia [3, 4, 33]. Nale˝y równie˝ zwróciçuwag´ na funkcjonowanie mechanizmów obron-nych organizmu cz∏owieka. Komórki majà bardzosprawny mechanizm prowadzàcy do wykrywaniai usuwania uszkodzeƒ DNA. Tak˝e du˝à rol´ od-grywa metabolizm kancerogenów, po wnikni´ciu

wraz z dymem tytoniowym do organizmu. Substan-cje te ulegajà aktywacji metabolicznej polegajàcejna zmianie w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych czà-steczki celem zwi´kszenia jej rozpuszczalnoÊci.Wià˝e si´ to zazwyczaj ze zwi´kszeniem reaktyw-noÊci chemicznej takiego metabolitu. Aktywacjametaboliczna przebiega przy udziale enzymów ak-tywacyjnych, które nale˝à do bia∏ek zale˝nych odcytochromu P450. Gen CYP1A1 koduje bia∏ka akty-wujàce policykliczne w´glowodory aromatyczne.Wykazano, ˝e polimorfizm genu CYP1A1, bioràce-go udzia∏ w biotransformacji WWA do fenolii epoksydów, wp∏ywa na poziom aromatycznychadduktów DNA w organizmie osób palàcych tytoƒ[30]. Ekspresja tego genu w tkance mo˝e zmieniaçsi´ nawet 50-krotnie, co t∏umaczy du˝e mi´dzy-osobnicze ró˝nice w metabolizmie WWA [2].Stwierdzono zwiàzek pomi´dzy polimorfizmem ge-nów katalizujàcych mechanizmy naprawy DNAa uszkodzeniami DNA w leukocytach krwi obwo-dowej zdrowych osób palàcych papierosy [22]. Naj-wy˝szy wspó∏czynnik korelacji pomi´dzy pozio-mem adduktów DNA a obni˝eniem potencja∏u na-prawy stwierdzono dla genu XPD, który uczestni-czy w naprawie DNA wed∏ug mechanizmu NER(nucleotide excision repair), polegajàcego na wyci-naniu zmienionych nukleotydów. W Êwietle obec-nych badaƒ wydaje si´, ˝e st´˝enie adduktówWWA-DNA w organizmie osoby palàcej jest wy-padkowà wielu czynników, nie tylko iloÊci WWAdostajàcych si´ do organizmu wraz z dymem tyto-niowym, ale równie˝ aktywnoÊci enzymów akty-wacyjnych, detoksykacyjnych oraz naprawczych.Oznacza to, ˝e polimorfizm genów odpowiedzial-nych za aktywacj´, detoksykacj´ i napraw´ uszko-dzeƒ DNA ma wp∏yw na oznaczany poziom adduk-tów WWA-DNA. Âwiadczà o tym tak˝e wynikiotrzymane w prezentowanej pracy.

Przypisanie paleniu papierosów g∏ównej roliw etiologii raka krtani nie budzi wàtpliwoÊci, alestawia pytania o udzia∏ indywidualnej podatnoÊcina szkodliwe dzia∏anie dymu tytoniowego. Chocia˝uwa˝a si´, ˝e palenie tytoniu odpowiada za wystà-pienie ponad 35% wszystkich nowotworów, to na-wet w grupach intensywnych palaczy papierosówtylko u cz´Êci rozwijajà si´ nowotwory [35]. Utwo-rzenie adduktów DNA jest niewàtpliwie dowodemkontaktu z kancerogenem, ale nie dowodzi podj´ciaprocesu kancerogenezy. W prezentowanych bada-niach liczba adduktów aromatycznych DNA, nara-˝enie na dym tytoniowy (okreÊlone przez st´˝eniekotyniny i 1-OHP), czas palenia i wiek badanych sà



na zbli˝onym poziomie wÊród osób palàcych, a mi-mo to jedynie u cz´Êci palaczy wykryto raka krtani.Zatem sama wartoÊç st´˝enia aromatycznych ad-duktów DNA nie jest prognostykiem wystàpieniaraka krtani. Obecnie uwa˝a si´, ˝e g∏ównà rol´w etiologii raka krtani odgrywa polimorfizm genówCYP1A1, NAT2, GSTM1 i XPD. Tym samym okre-Êlenie genotypów mo˝e byç wykorzystane w cha-rakterze markerów przebiegu choroby i prognozy,ale wymaga to dalszych badaƒ [6]. Przeprowadzonekorelacje pomi´dzy st´˝eniami kotyniny i 1-OHPw moczu a st´˝eniem adduktów DNA w limfocy-tach pozwoli∏y wyciàgnàç nast´pujàce wnioski:

– badanie st´˝enia kotyniny i stosunku st´˝eƒkotynina/kreatynina w moczu sà u˝ytecznymi me-todami okreÊlenia wielkoÊci ekspozycji na dym ty-toniowy, u osób zarówno zdrowych, jak i chorychna raka krtani,

– pomiar st´˝enia 1-hydroksypirenu lub warto-Êci stosunku st´˝eƒ 1-hydroksypiren/kreatyninaw moczu mo˝e byç wykorzystany do oceny nara˝e-nia na dym tytoniowy,

– wartoÊç diagnostyczna oznaczania st´˝eniaadduktów DNA w limfocytach, jako biomarkeraefektu biologicznego, jest nieprzydatna w ocenienara˝enia na dym tytoniowy,

– ˝aden z badanych biomarkerów (kotynina,1-hydroksypiren, addukty DNA), analizowany od-dzielnie lub wspólnie z innymi, nie jest czynnikiemprognostycznym ryzyka powstania raka krtani.

PIÂMIENNICTWO

01. Alexandrie AK, Warholm M, Carstensen U, Axmon A, Hag-mar L, Levin JO, i wsp. CYP1A1 and GSTM1 polymorphismaffect urinary 1-hydroxypyrene levels after PAH exposure.Carcinogenesis 2000; 21: 669–676.

02. Alexandrov K, Cascorbi I, Rojas M, Bouvier G, Kriek E,Bartsch H. CYP1A1 and GSTM1 genotypes affect benzo(a)py-rene DNA adducts in smokersí lung: comparison with aro-matic/hydrophobic adduct formation. Carcinogenesis 2002;23: 1969–1977.

03. Banaszewski J, Szmeja Z, Szyfter W, Szyfter K, Baran-czewski P, Moller M. Analysis of aromatic DNA adductsin laryngeal biopsies. Eur Arch Otorhinolaryngol 2000;257; 149–153.

04. Dallinga JW, Pachen DM, Wijnhoven SW, Breedijk A,vanít Veer L, Wigbout G, i wsp. The use of 4-aminobiphenylhemoglobin adducts and aromatic DNA adducts in lympho-cytes of smokers as biomarkers of exposure. Cancer Epide-miol Biomarkers Prev 1998; 7: 571–577.

05. Fried PA, Perkins SL, Watkinson B, McCartney JS. Associa-tion between creatinine-adjusted and unadjusted urine coti-nine values in children and the motherís report of exposureto environmental tobacco smoke. Clin Biochem 1995; 28:415–420.

06. Gajecka M, Rydzanicz M, Jasku∏a-Sztul R, Kujawski M, Szy-fter W, Szyfter K. CYP1A1, CYP2D6, CYP2E1, NAT2, GSTMand polymorphisms or their combinations are associatedwith the increased risk of the laryngeal squamous cell carci-noma. Mutat Res. 2005; 574: 112–123.

07. Grandjean P. Biomarkers in epidemiology. Clin Chem 1995;41: 1800–1803.

08. Greaves R, Trotter L, Brennecke S, Janus E. A simple high-pressure liquid chromatography cotinine assay: validation ofsmoking status in pregnant women. Ann Clin Biochem 2001;38: 333–338.

09. Haufroid V, Lison D. Urinary cotinine as a tobacco-smokeexposure index: a minireview. Int Arch Occup Environ He-alth 1998; 71: 162–168.

10. Henderson FW, Reid HF, Morris R, Wang OL, Hu PC, HelmsRW, i wsp. Home air nicotine levels and urinary cotinineexcretion in preschool children. Am Rev Respir Dis 1989;140: 197–201.

11. Holl RW, Grabert M, Heinze E, Debatin KM. Objective asses-sment of smoking habits by urinary cotinine measurement inaddescents and young adults with type 1 diabetes. DiabetesCare 1998; 21: 787–791.

12. IARC (International Agency for Research on Cancer). Mono-graphs Programme on the Evaluation of Carcinogenic Risk toHumans. Tobacco smoke and involuntary smoking. 2002;Vol.83

13. IARC (Inernational Agency for Research on Cancer). Poly-nuclear aromatic compounds. Part1. Chemical, environmen-tal and experimental data. IARC Monographs on the Evalu-ation of Carcinogenic Risks to Human 1983; Vol. 32.

14. IARC (International Agency for Research on Cancer). To-bacco smoking. IARC Monographs on the evaluation of car-cinogenetic risk of chemicals to humans. 1986; Vol. 38,Lyon, France.

15. Jacob J, Seidel A. Biomonitoring of polycyclic aromatic hy-drocarbons in human urine. J Chromatogr B 2002; 778:31–47.

16. Jarvis MJ, Russel MAH, Benowitz NL, Feyerabend C. Elimi-nation of cotinine from body fluids: implications for non-in-vasive measurement of tobacco smokers exposure. Am J Pu-blic Health 1988; 78: 696–698.

17. Jarvis MJ, Tunstall-Pedoe H, Feyerabend C, Vesey C, SaloojeeY. Comparison of tests used to distinguish smokers fromnonsmokers. Am J Public Health 1987; 77: 1435–1438.

18. Jatlow P, McKee S, O’Malley SS. Correction of urine cotini-ne concentrations for creatinine excretion: is it useful? ClinChem 2003; 49: 1932–1934.



19. Jongeneelen FJ. 1-Hydroxypyrene. W: Angerer J, SchallerKH, red. Analyses of hazardous substances in biological ma-terials. Deutscheforschunggemeinschaft 1990; 3: 151–169.

20. Kim JY, Hecht SS, Mukherjee S, Carmella SG, Rodrigues EG,Christiani DC. A urinary metabolite of phenanthrene asa biomarker of polycyclic hydrocarbon metabolic activationin workers exposed to residual oil fly ash. Cancer EpidemiolBiomarkers Prev 2005; 14: 687–692.

21. Miel˝yƒska D. Nara˝enie na substancje o dzia∏aniu kancero-gennym – biomarkery nara˝enia. (http://www.ietu.katowi-ce.pl/wpr/Dokumenty/Materia∏y szkoleniowe/Szkol2/09-mielzynska.pdf).

22. Matullo G, Palli D, Peluso M, Guarrera S, Carturan S, Celen-tano E, i wsp. XRCC1, XRCC3, XPD gene polymorphisms,smoking and 32P-DNA adducts in a healthy subjects. Cance-rogenesis 2001; 22: 593–597.

23. Nan HM, Kim H, Lim HS, Choi JK, Kawamoto T, Kang JW,i wsp. Effects of occupation, lifestyle and genetic polymor-phisms of CYP1A1, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 on urinary1-hydroxypyrene and 2-naphthol concentrations. Carcinoge-nesis 2001; 22: 787–793.

24. Nakajima M, Yamamoto T, Kuroiwa Y, Nunoya T. Improvedhighly sensitive method for determination of nicotine andcotinine in human plasma by high-performance liquid chro-matography. J Chromatogr B 2000; 742: 211-215.

25. Nerurkar PV, Okinaka L, Aoki C, Seifried A, Lum-Jones A,Wilkens LR, i wsp. CYP1A1, GSTM1, and GSTP1 genetic po-lymorphisms and urinary 1-hydroxypyrene excretion in non-occupationally exposed individuals. Cancer Epidemiol Bio-markers Prev 2000; 9: 1119–1122.

26. Philips DH. Smoking-related DNA and protein adducts inhuman tissues. Carcinogenesis 2002; 23: 1979–2004.

27. Savitz DA, Dle N, Terry Jr JW, Zhou H, Throp Jr JM. Smokingand pregnancy outcome among African-American and whitewomen in Central North Carolina. Epidemiology 2001; 12:636–642.

28. Secker-Walker RH, Vacek PM, Fynn BS, Mead PB. Exhaledcarbon monoxide and urinary cotinine as measures of smo-king in pregnancy. Addict Behav 1997; 22: 671–684.

29. Szeliga J, Dipple A. DNA adduct formation by polycyclic aro-matic hydrocarbon dihydrodiol epoxides. Chem Res Toxicol1998; 11: 1–11.

30. Teixeira JP, Gaspar J, Martinho G, Silva S, Rodrigues S, May-an O, i wsp. Aromatic DNA adduct levels in coke oven wor-kers: correlation with polymorphisms in genes GSTP1,GSTM1, GSTT1 and CYP1A1. Mutat Res 2002; 517: 147–155.

31. Thompson SG, Barlow RD, Wald NJ, Van Vunakis H. Howshould urinary concentrations be adjusted for urinary creati-nine concentration? Clin Chim Acta 1990; 187: 289–296.

32. Van Delft JH, Steenwinkel MS, van Asten JG, de Vogel N, Bru-ijntjes-Rozier TC, Schouten T, i wsp. Biological monitoring ofthe exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons of coke ovenworkers in relation to smoking and genetic polymorphism forGSTM1 and GSTT1. Ann Occup Hyg 2001; 45: 395–408.

33. Van Schooten FJ, Godschalk RW, Breedijk A, Maas LM, KriekE, Sakai H, i wsp. 32 P-postlabelling of aromatic DNA adductsin white blood cells and alveolar macrophages of smokers: sa-turation at high exposures. Mutat Res 1997; 378: 65–75.

34. WHO Regional Office for Europe, The European Health Ra-port 2002, Copenhagen, European Series No97.

35. Zatoƒski W, Becher H, Lissowska J, Wahrendorf J. Tobacco, alco-hol and diet in the etiology of laryngeal cancer: a population ba-sed case-control study. Cancer Causes Control 1991; 2: 3–10.

Adres autora:Oddzia∏ Laryngologii Szpital Specjalistyczny ul. Szpitalna 1341-300 Dàbrowa Górnicza

Prac´ nades∏ano: 15.05.2006 r.



Stężenie wybranych biomarkerów toksyczności dymu tytoniowego u osób palących tytoń chorych na...

Documents

Transcript of Stężenie wybranych biomarkerów toksyczności dymu tytoniowego u osób palących tytoń chorych na...