1

WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKA PODZIAŁU OKTANOL/WODA

SUBSTANCJI TOKSYCZNYCH TECHNIKĄ HPLC

WPROWADZENIE

Aktywność biologiczna związku chemicznego wiąże się w sposób bezpośredni

z jego cechami fizykochemicznymi. Najbardziej użytecznym parametrem

w przewidywaniu aktywności biologicznej danej substancji, a także prognozowania jej

aktywności toksycznej jest lipofilowość - parametr będący wypadkową kilku cech.

Lipofilowość charakteryzuje powinowactwo związku chemicznego do fazy lipidowej i

wodnej, a jej miarą jest stosunek równowagowych stężeń rozpuszczonej substancji w

układzie dwufazowym, składającym się z dwóch niemieszających się rozpuszczalników.

Zgodnie z prawem Nernsta, w warunkach równowagi termodynamicznej, w stałej

temperaturze i przy stałym ciśnieniu, stosunek stężeń (a dokładniej aktywności)

rozpuszczonej substancji w obu takich rozpuszczalnikach jest wielkością stałą, zwaną

współczynnikiem podziału. Należy zaznaczyć, iż wartość współczynnika podziału nie

zależy od aktywności substancji rozpuszczonej, jest natomiast cechą charakterystyczną

dla danego układu dwóch rozpuszczalników i jednej substancji rozpuszczonej, zależną

od temperatury i ciśnienia. Lipofilowość jest ważnym parametrem charakteryzującym

substancje czynne biologicznie jakimi są leki czy środki ochrony roślin.

Działanie substancji chemicznej (leku lub trucizny) na żywy organizm to szereg

procesów biofizycznych i biochemicznych, które podzielić można na trzy fazy:

farmaceutyczną, na którą składa się forma w jakiej przyjmowana substancja

dociera do organizmu, sposób jej podania oraz uwalniania się w organizmie;

farmakokinetyczną, czyli transport cząsteczek substancji w organizmie, ich

metabolizm i eliminacja;

farmakodynamiczną, czyli oddziaływanie cząsteczki substancji z

farmakoreceptorem przynoszące pożądany efekt farmaceutyczny.

2

Choć każdy z tych etapów jest związany z charakterem lipofilowym substancji, to

najistotniejszy wpływ wywiera lipofilowość na procesy dystrybucji związku

chemicznego w organizmie, czyli na fazę farmakokinetyczną. Szczególną uwagę należy

zwrócić na zachowanie się danej substancji podczas przenikania przez lipofilowe błony

komórkowe oddzielające środowiska wodne. Lipofilowość jest opisywana przez procesy

podziałowe między dwiema fazami: niepolarną (organiczną) i polarną (najczęściej

wodną). Przyjęto, że rozpuszczalnikami najlepiej odwzorowującymi układ faz polarnych

i niepolarnych w ustroju biologicznym oraz środowisku naturalnym są n-oktanol i woda.

Rozpuszczalniki te po zmieszaniu tworzą dwie rozseparowane fazy, przy czym ze

względu na wzajemną częściową rozpuszczalność jest to układ zawierający oktanol

nasycony wodą (2,3 mol/L) oraz wodę nasyconą oktanolem (4,5.10-3 mol/L).

Współczynnik podziału P jest wyrażany ilorazem dwóch stężeń substancji

rozpuszczonej:

𝑷 = 𝑪𝒐𝒌𝒕

𝑪𝒘 (1)

gdzie: Cokt (mol/L) stężenie molowe substancji w oktanolu, a Cw (mol/L) stężenie

molowe substancji w wodzie.

Współczynnik taki mierzy się w 25°C, przy stężeniu substancji badanej nie

wyższym niż 0,01 mol/L. W takim układzie, jeżeli większa ilość cząsteczek badanego

związku chemicznego znajdzie się w fazie oktanolowej, to mamy do czynienia ze

związkiem lipofilowym (hydrofobowym). Jeżeli zaś większość pozostanie w fazie

wodnej, będzie to związek lipofobowy (hydrofilowy). W fazie oktanolowej,

dominującymi staną się oddziaływania dyspersyjne pomiędzy hydrofobowymi

fragmentami cząsteczki rozpuszczonego związku a łańcuchem alkilowym n-oktanolu,

podczas gdy nieco mniejsze znaczenie odgrywać tu będą oddziaływania dipol-dipol czy

wiązania wodorowe z grupą hydroksylową alkoholu. Wynika stąd jednak, iż n-oktanol

posiada zarówno właściwości lipo- jak i hydrofilowe, a cechę taką nazywa się

amfifilowością. Zjawisko to przedstawiono schematycznie na rys. 1, gdzie uwidoczniono

cząsteczkę rozpuszczonego benzenu w n-oktanolu (oddziaływania dyspersyjne), w

którym równocześnie rozpuszczona jest woda (oddziaływania dipol-dipol i wiązania

wodorowe). W fazie wodnej z kolei, występować będą niemal wyłącznie wiązania

wodorowe oraz oddziaływania dipol-dipol pomiędzy polarnymi fragmentami cząsteczki

związku rozpuszczonego a wodą.

3

Rys.1. Oddziaływania międzycząsteczkowe substancji rozpuszczonych w n-oktanolu

Wartość współczynnika podziału zależy zarówno od budowy chemicznej

cząsteczki rozpuszczonego związku (liczba i rodzaj różnych grup funkcyjnych, udział

miejsc nienasyconych, fragmentów alkilowych, wartość momentu dipolowego i in.) jak i,

w dużej mierze, od jej wielkości. W trakcie mieszania obu rozpuszczalników (proces

spontaniczny) całkowita entropia takiego układu gwałtownie wzrasta, jednak jej

uprzywilejowany wzrost będzie ograniczany spadkiem entropii w fazie wodnej,

związanym ze stopniowym uporządkowywaniem cząsteczek wody w otoczce

hydratacyjnej solwatowanego związku. Ponieważ większe rozmiary cząsteczki wymagać

będą coraz większej wnęki w rozpuszczalniku (większej otoczki hydratacyjnej)

powodować to będzie nieuprzywilejowany spadek entropii całego układu. W takiej

sytuacji korzystniejsze termodynamicznie staje się obniżenie rozpuszczalności

cząsteczek o dużych rozmiarach w fazie wodnej, co wpływa na zwiększenie

współczynnika podziału. Stąd też nawet stosunkowo duże cząsteczki, ale zawierające w

swojej strukturze układy nienasycone, rozgałęzione i in., ułatwiające zmniejszenie

rozmiaru molekularnego, charakteryzują się dużo niższymi współczynnikami podziału

od swoich analogów pozbawionych tych cech. Współczynnik podziału oktanol – woda

zmierzony dla typowych zanieczyszczeń środowiska mieści się w bardzo szerokim

zakresie od 0,01 dla związków o wysokiej polarności do 1010 dla substancji wysoce

hydrofobowych. Na rysunku 2 przedstawiono zakres wartości współczynnika podziału

dla wybranych toksycznych związków organicznych.

4

Rys.2. Wartości współczynnika podziału P dla wybranych toksycznych związków organicznych

Tak rozpięty zakres wartości współczynnika spowodował, że wyraża się go w

formie logarytmicznej:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = 𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒐𝒌𝒕 − 𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒘 (2)

Dla tak obliczonego współczynnika podziału przyjmuje się, iż związki których log

P jest mniejsze od jedności, mogą być charakteryzowane jako hydrofilowe, a więc takie,

które nie ulegają bioakumulacji. Związki dla których 1 < log P < 3, charakteryzują się

średnią lipofilowością i mogą ulegać częściowej bioakumulacji. Natomiast związki,

których log P > 3, charakteryzują się wysoką lipofilowością i wysokim potencjałem

bioakumulacji. Jest to typowa wartość współczynnika podziału dla większości tzw.

trwałych zanieczyszczeń organicznych (chlorowane węglowodory, PCB, WWA,

polichlorowane dibenzodioksyny i furany).

Tak jak przedstawiono wcześniej, oddziaływania międzycząsteczkowe

zachodzące pomiędzy substancją rozpuszczoną a n-oktanolem i wodą zależą od jej

budowy chemicznej i wielkości ale też od obecności ugrupowań kwaśnych bądź

zasadowych. Mając do czynienia z kwasami bądź zasadami organicznymi, kolejnym

bardzo ważnym czynnikiem wpływającym na podział staje się również wartość pH

układu, która determinuje stopień zjonizowania substancji rozpuszczonej. W przypadku

kwasów i zasad podziałowi pomiędzy fazy ulegają nie tylko związki neutralne, ale

również formy zjonizowane oraz formy zasocjowane tych związków. Dodatkowo,

występowanie związku w formie zjonizowanej może stać się poważnym ograniczeniem

5

technicznym w wyznaczeniu współczynnika podziału. Jeżeli związek taki w swojej

strukturze zawierałby także obszerny fragment hydrofobowy (np. kilku- lub

kilkunastowęglowy łańcuch alkilowy), to swoją budową przypominałby substancję

powierzchniowo czynną. Na ogół, substancje takie ulegają emulsyfikacji na granicy faz

dwóch niemieszających się rozpuszczalników, co utrudnia a w zasadzie uniemożliwia

wyznaczenie dla nich wiarygodnego współczynnika podziału. Na rys. 3 przedstawiono

przykład podziału kwasu octowego pomiędzy oktanol i wodę z uwzględnieniem

wszystkich możliwych form występowania.

Rys.3. Formy występowania kwasu octowego w układzie n-oktanol – woda

W fazie wodnej kwas występować będzie zarówno w formie zjonizowanej jak i

obojętnej. Im większy będzie udział formy zjonizowanej, tym większa ilość cząsteczek

kwasu znajdzie się w tej właśnie fazie. Oczywiście, jeżeli pH układu uległoby obniżeniu,

to przeważałaby forma obojętna, a poniżej wartości 4,8 (wartość pKa dla kwasu

octowego) byłaby formą dominującą. W miarę protonowania grupy karboksylowej część

cząsteczek kwasu przechodzić będzie do fazy oktanolowej. Oprócz formy obojętnej

w fazie n-oktanolu utworzyć się mogą także dimery kwasu octowego powstałe w wyniku

asocjacji. Asocjacja ma miejsce w niepolarnych rozpuszczalnikach i określą ją stałą

równowagi reakcji asocjacji. Polega ona na tworzeniu cząstek zawierających dwie lub

więcej cząsteczek związanych wiązaniami wodorowymi. Strukturę dimeru kwasu

octowego przedstawiono na rys. 4.

Rys.4. Asocjat dwóch cząsteczek kwasu octowego

Jeżeli kwas asocjuje w fazie oktanolowej, to jego współczynnik podziału

pomiędzy fazę oktanolową i wodną przyjmuje następującą postać:

6

𝑷 =√𝑪𝒐𝒌𝒕

𝒏

𝑪𝒘 (3)

gdzie n to liczba asocjujących cząsteczek. Zlogarytmowana postać tego równania to:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = 𝟏

𝒏𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒐𝒌𝒕 − 𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒘 (4)

Po przekształceniu uzyskujemy równanie liniowe, gdzie log P jest punktem przecięcia

prostej z osią y przy x = 0, a 1/n jest współczynnikiem kierunkowym prostej:

𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒘 = 𝟏

𝒏𝐥𝐨𝐠 𝑪𝒐𝒌𝒕 − 𝐥𝐨𝐠 𝑷 (5)

Równanie to pozwala na podstawie wykresu wyznaczyć współczynnik podziału P

oraz liczbę cząsteczek n tworzących asocjaty w fazie oktanolowej. Do obliczenia log P

należy analitycznie określić aktywność substancji rozpuszczonej w obydwóch fazach, co

w przypadku roztworów rozcieńczonych sprowadza się do wyznaczenia stężenia. W tym

celu stosuje się szereg metod np. miareczkowanie, oznaczanie kolorymetrycznie,

chromatografię cieczową lub gazową. Pomiędzy log P a parametrami retencji z RP HPLC

można zauważyć ścisłą zależność jeżeli układ chromatograficzny przypomina układ

podziałowy n-oktanol/woda. Dlatego też współczynnik podziału można wyznaczać

metodami pośrednimi, z użyciem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub

metodami obliczeniowymi.

1. Metoda HPLC

Hydrofobowość można zdefiniować jako tendencję danego związku do

“preferowania” środowiska niewodnego względem wodnego, pojęcie to może być

rozumiane jako tendencja cząsteczek związku rozpuszczonego do agregacji w

roztworach wodnych. Właściwości hydrofobowe są sumą oddziaływań

fizykochemicznych: orientacyjnych, indukcyjnych, dyspersyjnych, wiązania

wodorowego i przeniesienia ładunku. W przypadku oddziaływań hydrofobowych siły te

zależą głównie od właściwości rozpuszczalników, a nie od substancji rozpuszczonych.

Od czasu wprowadzenia chromatografii cieczowej z fazami odwróconymi jest ona

szczególnie odpowiednia do oznaczania hydrofobowości. W przypadku metody z

wykorzystaniem HPLC zakłada się, iż retencja badanej substancji w odwróconym

układzie faz odpowiada jej podziałowi pomiędzy dwie nie mieszające się fazy i jako taka

jest proporcjonalna do współczynnika podziału P. W takim układzie, jedną z faz (faza

stacjonarna) stanowią ziarna krzemionki chemicznie zmodyfikowane warstwą

hydrofobową złożoną z podstawników n-alkilowych o różnej długości łańcucha (C8 –

7

C18), natomiast drugą fazę (faza ruchoma) stanowi polarny rozpuszczalnik, na ogół

mieszanina wody i metanolu. Podstawowa zaleta oznaczania hydrofobowości tą metodą

to możliwość użycia modyfikatorów organicznych jako składników binarnych

(dwuskładnikowych) eluentów. Jednak obecność modyfikatora organicznego powoduje

podniesienie stopnia skomplikowania natury oddziaływań wpływających na rozdział

chromatograficzny. Przy zastosowaniu ustalonego składu eluentu badany związek może

okazywać się bardziej hydrofobowy niż inny związek, podczas gdy sytuacja taka może

przedstawiać się odwrotnie przy innym składzie eluentu. Dlatego też stosuje się metodę

polegającą na wykreśleniu log k względem procentowej objętościowej zawartości

modyfikatora. W trakcie przemieszczania się przez kolumnę chromatograficzną badana

substancja ulega podziałowi pomiędzy hydrofobową warstwą w fazie stacjonarnej a

polarnym rozpuszczalnikiem w fazie ruchomej. Podobnie jak to ma miejsce w metodzie

wyznaczania równowagowego współczynnika podziału pomiędzy oktanolem a wodą, im

bardziej substancja będzie lipofilową tym większe będzie jej powinowactwo do

stacjonarnej fazy hydrofobowej. W praktyce oznacza to, iż w układzie

chromatograficznym substancja taka będzie dłużej zatrzymywana, a więc wzrastać

będzie jej czas retencji. Dla dużej grupy związków chemicznych wykazano liniową

zależność pomiędzy czasem retencji a współczynnikiem podziału wg następującego

równania:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = 𝒂 𝐥𝐨𝐠 𝒕𝑹 + 𝒃 (6)

przy czym a i b są charakterystyczne dla danej grupy związków (homologów,

kongenerów, izomerów itp.). Rys. 5 przedstawia tę korelację dla wybranych związków

aromatycznych, których współczynnik podziału mieści się w szerokim zakresie 4

rzędów wielkości. Najprostszym, praktycznym zastosowaniem tej metody jest

wyznaczenie kilkunastu współczynników retencji dla grupy związków referencyjnych, o

znanych współczynnikach podziału a następnie, w oparciu o uzyskaną korelację

szacowanie tych współczynników dla związków nieznanych na podstawie ich czasów

retencji w tych samych warunkach chromatograficznych.

8

Rys.5. Linowa zależność pomiędzy współczynnikiem retencji log P a czasem retencji log tR

Należy jednak zauważyć, iż pomiędzy współczynnikiem podziału n-oktanol/woda

a współczynnikiem wyznaczonym metodą chromatograficzną występuje różnica w

składzie faz. O ile można przyjąć, iż stacjonarna faza hydrofobowa oraz wolne

ugrupowania silanolowe na powierzchni krzemionki przypominają do pewnego stopnia

strukturę n-oktanolu (rys. 6), o tyle faza polarna zawiera nie tylko wodę lecz również

modyfikator organiczny jakim jest metanol. Powoduje to, że układ chromatograficzny

zawiera dodatkowy czynnik wpływający na rozpuszczalność, a tym samym na podział

badanej substancji, co zwłaszcza przy wysokiej zawartości metanolu może poważnie

zakłócić omawianą korelację.

Rys.6. Porównanie chromatograficznej fazy odwróconej i n-oktanolu

Logicznym wydałoby się więc użycie czystej wody jako fazy ruchomej. Jest to

jednak niemożliwe w odwróconym układzie faz, w którym silnie uwodnione układy

wywołują efekt „kładzenia” się podstawników alkilowych, co znacznie ogranicza

sprawność kolumny chromatograficznej (rys. 7).

9

Rys.7. Porównanie struktury hydrofobowej fazy stacjonarnej w przypadku użycia czystej wody (A)

oraz wody z metanolem (B) jako faz ruchomych

Dlatego do chromatograficznego wyznaczania współczynnika podziału stosuje się

metodę ekstrapolacyjną. W skrócie, polega ona na wyznaczeniu czasów

(współczynników) retencji badanego związku dla kilku faz ruchomych o różnej

zawartości metanolu i wykreśleniu powstałej zależności według następującego,

liniowego równania:

𝐥𝐨𝐠 𝒌 = 𝐥𝐨𝐠 𝒌𝒘 − 𝑺𝝓 (7)

nazywanego równaniem Snydera-Soczewińskiego, które jest jedną z podstawowych

zależności w chromatografii w odwróconym układzie faz. W równaniu, k to

współczynnik retencji (lub współczynnik objętościowy) wyznaczony z zależności:

k = (tR – t0)/t0 (8)

gdzie t0 to czas martwy układu; kw to wartość współczynnika retencji odpowiadająca

fazie zawierającej wyłącznie wodę (0% metanolu). Z podanych powyżej ograniczeń

wartość tę wyznacza się ekstrapolując wyniki uzyskane dla faz zawierających metanol

do punktu przecięcia z osią y. Stąd, log kw uznaje się za chromatograficzny współczynnik

podziału (odpowiadający podziałowi pomiędzy wodę a fazę hydrofobową). S to

nachylenie wykreślonej prostej, charakterystyczne dla badanego związku a φ to udział

metanolu w fazie ruchomej (%). Rys. 8 przedstawia opisaną zależność.

Rys.8. Zależność Snydera – Soczewińskiego, z której wyznacza się chromatograficzny współczynnik

podziału log kw

10

W metodzie HPLC substancje o bardzo niskiej rozpuszczalności w n-oktanolu

wykazują tendencję do dawania zaniżonych wartości log P. Piki takich związków czasem

towarzyszą czołu rozpuszczalnika. Dzieje się tak dlatego, iż w takiej sytuacji proces

podziału jest zbyt powolny do uzyskania równowagi w czasie branym pod uwagę przy

zwykłym rozdzielaniu metodą HPLC. Zmniejszenie szybkości przepływu i/lub obniżenie

stosunku metanol/woda może być w tym przypadku pożądane, aby uzyskać rzeczywistą

wartość. Wartość pH eluentu jest krytyczna dla związków ulegających jonizacji. Powinno

być ono w obrębie zakresu roboczego pH kolumny, które zwykle wynosi między 2 i 8.

Zalecane jest buforowanie. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do wytrącania

się soli i zniszczenia kolumny, co zachodzi dla niektórych mieszanin faza

organiczna/bufor. Pomiary HPLC faz stacjonarnych opartych na krzemionce powyżej pH

8 nie są polecane, gdyż użycie zasadowej fazy ruchomej powoduje gwałtowne

pogorszenie się wydajności kolumny. Warto dodać, iż prowadzono badania nad użyciem

wypełnień innych, niż oparte na chemicznie związanej krzemionce. Przebadano między

innymi następujące wypełnienia: kopolimery poli(styrenodiwinylobenzenowe),

kopolimer oktadecylopoliwinylowy, tlenek glinowy, tlenek cyrkonowy, oraz niedawno

wprowadzony materiał do pakowania kolumn tzw. immobilizowana sztuczna

membrana (IAM). W przypadku ODS proponuje się modyfikację fazy stacjonarnej bądź

też ruchomej polegającej na np.: zastosowaniu pH od 2,5 do 3,5 i wyższych stężeń

buforu, zastąpienie soli sodowych potasowymi i dodatek modyfikatorów aminowych

(dimetylooktyloamina, trimetyloamina), dodanie oktanolu i decylaminy do fazy

ruchomej składającej się między innymi z MeOH. Jednak nie istnieje sposób który

umożliwiałby uczynienie układu RP HPLC identycznym z układem n-oktanol/woda.

2. Metody obliczeniowe

Wszystkie metody obliczeniowe są oparte o formalną fragmentację cząsteczki na

odpowiednie podstruktury dla których pewne przyrosty wartości log P są znane z

eksperymentu. Wartość log P całej cząsteczki jest następnie obliczana jako suma

wartości odpowiadająca jej fragmentom plus suma składników korekcji dla oddziaływań

wewnątrzcząsteczkowych. Wiarygodność metod obliczeniowych obniża się ze wzrostem

złożoności badanych związków. W przypadku prostych cząsteczek o niskiej masie

cząsteczkowej i jednej lub dwu grupach funkcyjnych, można oczekiwać odchylenia od

0,1 do 0,3 jednostek log P między wynikami różnych metod fragmentaryzacji i

11

wartościami zmierzonymi. Jedną z pierwszych stosowanych półempirycznych metod

obliczeniowych była metoda stałej podstawienia hydrofobowego π, definiowaną jako:

𝝅𝒙 = 𝒍𝒐𝒈 𝑷(𝑷𝒉𝑿) − 𝒍𝒐𝒈𝑷 (𝑷𝒉𝑯) (9)

gdzie P (PhX) jest współczynnikiem podziału pochodnej aromatycznej, a P (PhH)

związku macierzystego.

Metoda stosowana jest głównie dla podstawienia aromatycznego. Wartości dla

większej liczby podstawników zostały stabelaryzowane w licznych pozycjach

literaturowych. Są one stosowane dla obliczeń log P cząsteczek aromatycznych lub

podstruktur. Stosuje się również metodę Rekkera w której wartość log P jest obliczana z

następującej zależności:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = ∑ 𝒂𝒊𝒇𝒊 + ∑ 𝑪𝒋𝒋𝒊 (10)

gdzie fi reprezentuje różne stałe fragmentów cząsteczki, natomiast ai, częstotliwość ich

występowania w badanej cząsteczce. Składniki korekcji są wyrażone jako całkowita

wielokrotność pojedynczej stałej Cj. Stałe fragmentu fi, i Cj zostały ustalone z wykazu z

ponad tysiąca doświadczalnych wartości współczynnika podziału P. Dla prostych

cząsteczek, równanie przyjmuje uproszczoną postać, gdzie suma składników korekcji

wynosi 0,229:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = ∑ 𝒂𝒊𝒇𝒊 + 𝟎, 𝟐𝟐𝟗𝒊 (11)

Najbardziej zaawansowanym sposobem wyznaczania współczynnika podziału

jest metoda Hansch-Leo zgodnie z którą wartość log P jest obliczana z:

𝐥𝐨𝐠 𝑷 = ∑ 𝒂𝒊𝒇𝒊 + ∑ 𝒃𝒋𝒋𝒊 𝑭𝒋 (12)

gdzie fi przedstawia różne stałe fragmentu cząsteczkowego, Fj składniki korekcji oraz ai,

bi odpowiadające częstotliwości występowania. Wyprowadzony z doświadczalnych

wartości współczynników podziału wykaz atomowych i cząsteczkowych grup wartości,

oraz wykaz składników korekcji Fj zostały ustalone metodą prób i błędów. Składniki

korekcji zostały uporządkowane w kilka różnych klas. Wzięcie pod uwagę wszystkich

zasad i składników korekcji jest względnie skomplikowane i zużywające czas. Dlatego

współcześnie istnieje szereg programów komputerowych obliczających lipofilowość

związku na podstawie zadanej struktury.

12

Celem ćwiczenia jest wyznaczanie współczynnika podziału oktanol/woda

wybranych związków organicznych o działaniu toksycznym techniką

wysokosprawnej chromatografii cieczowej oraz metodą obliczeniową.

Odczynniki:

metanol cz. HPLC, woda cz. HPLC, wodny roztwór fenolu (1 mmol/dm3), wodny roztwór

o-nitrofenolu (1 mmol/dm3)

Sprzęt laboratoryjny i aparatura pomiarowa:

chromatograf HP 1050 z detektorem UV-Vis i pętlą nastrzykową o objętości 20 mm3,

kolumna chromatograficzna oktadecylosilanowa ODS (RP-18) 125x4 mm, 5 m.

SPOSÓB WYKONANIA

1. Wyznaczyć czas martwy teoretyczny układu chromatograficznego ze wzoru:

F

Vt m0

,

gdzie:

Vm - martwa objętość kolumny (objętość fazy ruchomej w kolumnie) w cm3,

F - przepływ przez kolumnę w cm3/min.

Martwą objętość kolumny można wyznaczyć z przybliżonego wzoru:

25,0 cm dLV ,

gdzie:

L - długość kolumny w cm,

dc - wewnętrzna średnica kolumny w cm.

2. Przeprowadzić rozdzielenie chromatograficzne roztworów fenolu i o-nitrofenolu o

stężeniach 1 mmol/dm3 w trzech układach elucyjnych metanol–woda: 50:50, 60:40,

70:30 (v/v) przy przepływie 0,8 cm3/min. Detekcję przeprowadzić przy długości fali

278 nm.

Dla każdej z faz ruchomych należy wykonać nastrzyk po 25-30 μL każdego z

roztworów i określić czasy retencji badanych związków. Na ich podstawie wyznaczyć

współczynniki retencji k.

3. W trakcie wykonywania analiz należy obliczyć współczynniki podziału dla

związków z Tabeli 1.

13

W tym celu należy skorzystać z programu EpiSuite, udostępnionego przez US EPA.

Po otwarciu programu wybieramy po lewej stronie okna moduł KOWWIN, w kolejnym

oknie NameLookup, w kolejnym wpisujemy nazwę związku i potwierdzamy OK. W

otwartym oknie wyboru potwierdzamy nasz wybór lub wyszukujemy na liście żądany

związek. W uzupełnionym o dane związku oknie programu KOWWIN wybieramy

Calculate.

Wyniki: przewidywany współczynnik podziału (w czerwonej ramce) oraz wartość

literaturową (Exp Log P) wpisujemy do tabeli. Jeśli brakuje wartości eksperymentalnej,

pozostawiamy wolne miejsce. Program KOWWIN wykorzystuje do obliczeń algorytm

identyczny z opisanym w ćwiczeniu.

Tabela 1. Wartości eksperymentalne i przewidywane dla szeregu homologicznego kwasów

karboksylowych

Liczba atomów

węgla Nazwa

log P

obliczony

log P

eksperymentalny

2 acetic acid

6 hexanoic acid

10 decanoic acid

14 tetradecanoic acid

20 eicosanoic acid

24 tetracosanoic acid

28 octacosanoic acid

32 dotriacontanoic acid

14

OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Należy wykreślić zależność log k od procentowego udziału MeOH w fazie

ruchomej zgodnie z równaniem Snydera-Soczewińskiego i odczytać wartość

log kw.

2. Dla analizowanych związków należy obliczyć współczynniki podziału korzystając

z równania (11) oraz stałych fi fragmentów cząsteczkowych zawartych w Tabeli 2.

Tabela 2. Wartości stałych fi fragmentów cząsteczkowych

Fragment fi

alifatyczny –CH3 0,5473

alifatyczny –CH2 - 0,4911

aromatyczny C lub CH 0,2940

Br- (połączony z aromatem) 0,8900

Cl- (połączony z aromatem) 0,6445

OH- (połączony z aromatem) -0,4802

aromatyczny –NH2 -0,9170

aromatyczny –NO2 -0,1823

3. Na podstawie uzupełnionej Tabeli 1 wykonać na jednym rysunku wykresy

zależności log P eksperymentalnego oraz log P przewidywanego (y) od liczby atomów

węgla w cząsteczce (x). Czy przebieg obu zależności jest liniowy? Dokonaj ekstrapolacji

uzyskanej zależności przewidywanej dla kwasów o 35 i 40 atomach węgla w cząsteczce.

Instrukcja opracowana na podstawie: Chemia fizyczna, Pigoń K., Podstawy chromatografii, Witkiewicz Z.,

Fizykochemiczne metody analizy w chemii środowiska, red. B. Buszewski, P. Kosobucki, Ćwiczenia

laboratoryjne z chemii wody, B. i E. Gomółkowie.

Opracowali: B. Krawczyk, D. Szczukocki