praca magisterska Agaty.pdf

7/25/2019 praca magisterska Agaty.pdf

1/109

UNIWERSYSTET WROCAWSKIWYDZIA NAUK PRZYRODNICZYCH

INSTYTUT BIOCHEMII I BIOLOGII MOLEKULARNEJ

AGATA KOPE

KWANY FIBROBLASTYCZNY CZYNNIK WZROSTU

BADANIE STABILNOI I ODDZIAYWANIA Z INNYMI

BIAKAMI

Wrocaw 2000

Praca magisterska wykonanaw Zakadzie Inynierii Biakapod kierunkiem prof. dr hab.Jacka Otlewskiego.


2/109

Skadam serdeczne podzikowania profesorowi

Jackowi Otlewskiemu za stworzenie moliwoci

realizacji pracy magisterskiej w Zakadzie Inynierii

Biaka oraz za opieki cenne uwagi.

Pragn rwnie gorco podzikowa mgr

Agnieszce Grzesiak i mgr Katarzynie Kocielskiej za

nieocenionpomoc oraz wszystkim osobom , ktre w

akikolwiek sposb przyczyniy si do powstania

niniejszej pracy magisterskiej.


3/109

moim rodzicom


4/109

Spis treci - i -

Spis treci

SPIS TRECI I

RYSUNKI V

TABELE VII

STRESZCZENIE VIII

1 WSTP 1

1.1 Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych 1

1.2 Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn 3

1.3 Funkcja aFGF w komrce 7

1.4 Aktywnojdrowa aFGF 9

1.4.1 Mutant aFGF-CAAX 10

1.4.2 Mutant aFGF K132E 12

1.4.3 FIBP - biako wewntrzkomrkowe wice aFGF 13

2 CEL PRACY 15

3 MATERIAY 16

3.1 Odczynniki 16

3.2 Enzymy 17

3.3 Markery masy 17

3.4 Odczynniki do sekwencjonowania 18

3.5 Antybiotyki i skadniki poywek 18

3.6 Szczepy bakteryjne i fagowe 19

3.6.1 Opornona antybiotyki poszczeglnych szczepw bakteryjnych 20

3.7 Plazmidy i ich mapy restrykcyjne 20

3.8 Oligonukleotydy 25

4 SPRZT 26


5/109

Spis treci - ii -

5 METODY 27

5.1 Preparacja bakterii kompetentnych 27

5.2 Transformacja bakterii kompetentnych 27

5.3 Elektroporacja 28

5.4 Elektroforeza welu agarozowym 28

5.4.1 Okrelanie stenia DNA naelu agarozowym 29

5.4.2 Elektroforeza preparatywna welu agarozowym 30

5.5 Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II 30

5.6 Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i kwasw nukleinowych 31

5.7 Izolacja plazmidowego DNA za pomocmetody QIAGEN-tip-20 32

5.8 Ukierunkowana mutageneza 34

5.8.1 Preparacja matrycy zaznaczonej uracylem 37

5.8.2 Przygotowanie oligonukleotydu do wprowadzenia mutacji 38

5.8.3 Waciwa reakcja mutagenezyin vitro 39

5.8.4 Transformacja mieszaniny reakcyjnej do bakterii kompetentnych szczepu MM 294 40

5.9 Trawienie restrykcyjne 40

5.9.1 Trawienie restrykcyjne plazmidu pBSN-FIBPf 41

5.9.2 Trawienie restrykcyjne plazmidu pMal-c2 42

5.9.3 Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+) 42

5.10 Reacja PCR 43

5.11 Reakcja ligacji 43

5.12 Sekwencjonowanie 44

5.12.1 Przygotowanie plazmidowej matrycy do sekwencjonowania 46

5.12.2 Przyczenie startera 46

5.12.3 Znakowanie radioizotopem i sekwencjonowanie 46

5.12.4 Przygotowanieelu i warunki przeprowadzenia elektroforezy 47

5.13 Ekspresja FIBP w systemie pMal-c2 jako biako fuzyjne z MBP 48

5.13.1 Oczyszczanie biaka fuzyjnego MBP-FIBP na kolumnie z immobilizowanamyloz 48

5.14 Ekspresja aFGF w systemie pET-3c 49

5.14.1 Oczyszczanie aFGF na kolumnie z immobilizowanheparyn 50

5.15 Elektroforeza biakowa w warunkach denaturujcych (ang. SDS-PAGE) 50

5.16 Techniki spektroskopowe 52


6/109


7/109

Spis treci - iv -

7.1 Ekspresja i oczyszczanie obu form FIBP w systemie pMal-c2 91

7.2 Ekspresja i oczyszczanie FIBPs w systemie pET-25b(+) 93

7.3 Badanie stabilnoci aFGF 94

8 LITERATURA 96


8/109

Rysunki - v -

Rysunki

Rysunek 1. Struktura krystaliczna ludzkiego aFGF (Blaber i wsp., 1996). ____________________________ 4

Rysunek 2. Widok centralnej jamki w strukturze aFGF. __________________________________________ 4

Rysunek 3. Czsteczka siarczanu heparyny. ____________________________________________________ 6

Rysunek 4. Transdukcja sygnau do wntrza komrki po zwizaniu siaFGF z receptorem

powierzchniowym. ________________________________________________________________ 9

Rysunek 5. Schemat reakcji farnezylacji (wg L. Stryer Biochemia PWN). _________________________ 11

Rysunek 6. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-3c. _______________________________________________ 21

Rysunek 7. Mapa restrykcyjna plazmidu pBSN-1. ______________________________________________ 22

Rysunek 8. Mapa restrykcyjna plazmidu pMal-c2. ______________________________________________ 23

Rysunek 9. Mapa restrykcyjna plazmidu pET-25b(+). ___________________________________________ 24

Rysunek 10. Schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej metodKunkela. __________ 36

Rysunek 11. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pBSN-FIBPf. _____________________________ 41

Rysunek 12. Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pMal-c2._________________________________ 42

Rysunek 13. Schemat trawienia restrykcyjnego wektora pET-25b(+). _______________________________ 42

Rysunek 14. Schemat przedstawiajcy metodsekwencjonowania z uyciem dideoksy analogw

rybonukleotydowych. _____________________________________________________________ 45

Rysunek 15. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA kodujcego FIBPsz plazmidu

pBSN-FIBPfdo wektora pMal-c2. __________________________________________________ 54

Rysunek 16. Wynik elekroforezy analitycznej - okrelanie stenia insertu FIBPsoraz wektora pMal-c2. __ 57

Rysunek 17. Wynik elektroforezy analitycznej - selekcja wyizolowanego DNA poprzez trawienie

restrykcyjne. ____________________________________________________________________ 60

Rysunek 18. Autoradiogram z sekwencjonowania plazmidu pMal-c2-FIBPs._________________________ 61

Rysunek 19. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych. __________________________________ 63

Rysunek 20. Profil elucyjny kolumny z immobilizowanamyloz oczyszczanie biaka fuzyjnego MBP-

FIBPs._________________________________________________________________________ 64

Rysunek 21. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP czynnikiem Xa. _______________________________ 65Rysunek 22. Wynik SDS-PAGE - cicie FIBP-MBP czynnikiem Xa przez 48 godz. ____________________ 65

Rysunek 23. Schemat kolejnych etapw procesu klonowania fragmentu DNA kodujcego FIBPsz plazmidu

pMal-c2 do wektora pET25b(+). ____________________________________________________ 67

Rysunek 24. Wynik analizy elektroforetycznej prb zawierajcych plazmid pET-25b(+) w formie ssDNA

(cieka nr 1,2,3);cieka 4 - marker ssDNA. _________________________________________ 68

Rysunek 25. Analiza elektoforetyczna zmutowanych form plazmidu pET-25b(+) poddanych trawienu

restrykcyjnemu enzymem SpeI. _____________________________________________________ 69

Rysunek 26. Analiza elektroforetyczna wstpnej reakcji PCR._____________________________________ 72

Rysunek 27. Wyznaczanie stenia wypreparowanego wektora i produktu reakcji PCR. ________________ 74


9/109

Rysunki - vi -

Rysunek 28. Wynik elekroforezy analitycznej przeprowadzonej w celu ustalenia stenia fragmentu DNA

kodujcego FIBPs. _______________________________________________________________ 75

Rysunek 29. Wynik elektroforezy analitycznej - trawienie plazmidu pET-25b(+)-FIBPsenzymem

SpeI i NcoI. ____________________________________________________________________ 78

Rysunek 30. Wynik elektroforezy w warunkach denaturujcych. __________________________________ 79Rysunek 31. Wykres zalenoci ruchliwoci elektroforetycznej skadnikw biakowego markera masy (Wide

range MW) w 12% elu poliakrylamidowym od logarytmu ich mas.________________________ 80

Rysunek 32. Profil elucyjny kolumny z immobilizowanheparyn- oczyszanie dzikiego typu aFGF. _____ 81

Rysunek 33. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 5.0 bez dodatku i z dodatkiem heparyny. ____ 84

Rysunek 34. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w pH 4.0 bez dodatku i z dodatkiem heparyny. ____ 84

Rysunek 35. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF i jego mutantw w pH 4.0. ____________________ 85

Rysunek 36. Widma fluorescencji dzikiego typu aFGF w obecnoci heparyny oraz mutanta Cys43-Cys139 bez

dodatku heparyny w pH 4.0. _______________________________________________________ 86

Rysunek 37. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH. ______________________________________ 87

Rysunek 38. Widma CD dzikiego typu aFGF w funkcji pH w obecnoci i bez dodatku heparyny._________ 87

Rysunek 39. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH dla dzikiego typu aFGF oraz mutanta Cys11-Cys59. ____ 88

Rysunek 40. Widma CD obu mutantw aFGF w pH 2.0 i 5.0 w obecnoci i bez dodatku heparyny. _______ 89

Rysunek 41. Krzywe denaturacyjne w funkcji pH obu mutantw aFGF w obecnoci i bez dodatku heparyny.90


10/109

Tabele - vii -

Tabele

Tabela 1. Charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (Burgess i wsp., 1989).______ 2

Tabela 2: Sekwencje aminokwasowe aFGF i jego homologw._____________________________________ 5

Tabela 3. Fragment sekwencji aminokwasowej aFGF rnych przedstawicieli (Klingenberg i wsp., 1995)._ 12

Tabela 4. Charakterystyka stosowanych enzymw restrykcyjnych. _________________________________ 17

Tabela 5. Opornona antybiotyki uywanych szczepw bakteryjnych i fagowych. ____________________ 20

Tabela 6. Charakterystyka uywanych oligonukleotydw. ________________________________________ 25

Tabela 7. Zalenoprocentowocielu agarozowego od wielkoci rozdzielanych fragmentw DNA. _____ 29

Tabela 8. Skady buforw stosowanych w preparacji plazmidowego DNA metodQiagen (wgQiagen

Plasmid Mini Handbook). ________________________________________________________ 34Tabela 9. Objtoci poszczeglnych roztworw wykorzystywanych przy preparacji DNA plazmidowego na

kolumienkach Qiagen-tip 20 (wgQiagen Plasmid Mini Handbook). ______________________ 34

Tabela 10. Skad roztworw z zestawu do sekwencjonowania (wgStep-by-step protocols for DNA

sequencing).____________________________________________________________________ 47

Tabela 11. Skad buforw uywanych w elektroforezie w warunkach denaturujcych. _________________ 51

Tabela 12. Skadelu rozdzielajcego w zalenoci od procentowoci. ______________________________ 51

Tabela 13. Skadelu zagszczajcego. _______________________________________________________ 51

Tabela 14. Bilans przeprowadzonych ekspresji biaka fuzyjnego MBP-FIBPf . _______________________ 64

Tabela 15. Skad mieszanin wstpnej reakcji PCR.______________________________________________ 71

Tabela 16. Ruchliwoci elektroforetyczne oraz logarytmy mas skadnikw biakowego markera masy (Wide

range MW). ____________________________________________________________________ 80

Tabela 17. Bilans przeprowadzonych ekspresji dzikiego typu aFGF i jego mutantw. __________________ 82


11/109

STRESZCZENIE - viii -

STRESZCZENIE

aFGF jest jednym z pierwszych biaek mitogennych, dla ktrych udowodniony zosta

podwjny sposb przekazywania sygnau polegajcy zarwno na oddziaywaniu z receptorem

powierzchniowym, jak i wymagajcy obecnoci mitogenu w jdrze. Podczas przekazywania

sygnau przez aFGF niezbdny jest wic etap translokacji biaka przez bon, ktry jak dotd

nie zosta wyjaniony. Nieznana pozostaje te funkcja aFGF w jdrze komrkowym.

Prawdopodobnie jest ona powizana z innymi biakami, ktre oddziaujc z aFGF mog

mediowa jego aktywno wewntrzkomrkow. Jak dotd oprcz heparyny

wewntrzkomrkowe oddziaywanie z aFGF stwierdzono dla biaka FIBP (ang. aFGF

intracellular binding protein) znalezionego w bibliotece genomowej metod two-hybrid

system (Kolpakova i wsp., 1998). Scharakteryzowano dwie formy FIBP tzw. FIBPs (ang.

FIBP short) pozbawione 54 reszt aminokwasowych na N-kocu oraz FIBPf(ang. FIBP full

length) o sekwencji obejmujcej caramkodczytu.

Niniejsza praca opisuje ekspansjw komrkach bakteryjnych szczepu E.coliobu form

rekombinowanego biaka FIBP w systemie pMal-c2, jego oczyszczanie na kolumnie z

immobilizowan amyloz oraz prby przeprowadzenia proteolizy biaka fuzyjnego

czynnikiem Xa. Ekspresj biaka fuzyjnego FIBPs przeprowadzono z wydajnoci15 mg/l,

natomiast w przypadku FIBPfwydajnowyniosa 10 mg/l. Niestety nie udao siefektywnie

rozdzieli biaka fuzyjnego przez proteoliz czynnikiem krzepnicia Xa ze wzgldu na

precypitacjwolnego FIBP. Aby ominproblem zwijaniain vitroprzeklonowano geny FIBP

do peryplazmatycznego systemu ekspresyjnego pET-25b(+), ktry umoliwia otrzymanie

natywnej formy biaka w fuzji z ogonkiem histydynowym na C-kocu FIBP.

Drugim celem pracy bya ekspresja i zbadanie stabilnoci dzikiego typu aFGF wobecnoci i bez dodatku heparyny. Wczesne badania dotyczce denaturacji aFGF wskazuj,

e jest to biako mao stabilne (Burke i wsp., 1993). Naturalnym ligandem podwyszajcym

stabilno aFGF jest heparyna. W niniejszej pracy zosta udowodniony jej stabilizujcy

wpyw poprzez widma fluorescencji i CD. Stwierdzono,e w obecnoci heparyny w niskim

pH aFGF nie denaturuje zupenie, ale pozostaje w stanie MG. Najprawdopodobniej aFGF

przechodzi przez bon do wntrza komrki wanie w stanie MG. Podjto rwnie prby

podniesienia stabilnoci aFGF poprzez wprowadzenie mostka disiarczkowego naturalnie wczsteczce nie wystpujcego. Otrzymano dwa rekombinowane mutanty aFGF z mostkami w


12/109

STRESZCZENIE - ix -

pozycjach: Cys11-Cys59 i Cys43-Cys139. Po ich oczyszczeniu na kolumnie z

immobilizowanheparynbadano ich stabilnometodami CD i fluorescencji. W przypadku

mutanta Cys43-Cys139 stwierdzono stabilizujacy wpyw mostka disiarczkowego na

czsteczkaFGF.


13/109

Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych

WSTP - 1 -

1 WSTP

1.1 Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych

czynnikw wzrostowych

Rodzina fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (FGF, ang. fibroblast growth

factor) obejmuje czternacie biaek, wykazujcych wysok homologi sekwencyjn i

strukturaln, co wskazuje na pochodzenie od tego samego genu. Wspln cech dla

wszystkich biaek z rodziny FGF jest rwnie zdolno wizania heparyny. Pomimo

strukturalnych i sekwencyjnych podobiestw, biaka te wykazuj du rnorodno w

aktywnoci biologicznej. Oprcz dziaania na fibroblasty, czynniki te indukuj rnorodn

odpowiedbiologicznm.in. komrek nerwowych, miniowych, siatkwki, embrionowych

komrek egzo- i endodermy, makrofagw czy komrek nowotworowych (Tabela 1). Kwany

fibroblastyczny czynnik wzrostu (aFGF, ang. acidic FGF) oraz zasadowy fibroblastyczny

czynnik wzrostu (bFGF, ang. basic FGF) s gwnymi, a zarazem pierwszymi

zidentyfikowanymi przedstawicielami rodziny FGF. Ludzki aFGF zbudowany jest ze 155

reszt aminokwasowych. W swojej sekwencji, oprcz dwch konserwatywnych reszt Cys

(pozycja 30 i 97), posiada dodatkowresztcysteinoww pozycji 131. Cysteiny nie tworz

jednak wewntrzczsteczkowych mostkw disiarczkowych. Cech charakterystyczn jest

take brak sekwencji liderowej, bdcej sygnaem do sekrecji syntetyzowanych biaek na

zewntrz komrki drog przez retikulum endoplazmatyczne i aparat Golgiego. Badania

wykazay jednak, e aFGF po biosyntezie jako biako cytosolowe moe bywydzielany na

zewntrz przez niepoznany jeszcze mechanizm (Jackson i wsp., 1992) lub translokowany do

jdra komrkowego (Immamura i wsp., 1990; Zhan i wsp., 1992, 1993; Immamura i wsp.,

1994; Widocha i wsp., 1994).


14/109

Oglna charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych

WSTP - 2 -

Tabela 1. Charakterystyka rodziny fibroblastycznych czynnikw wzrostowych (Burgess i wsp.,1989).

Przedstawicielrodziny

Masaczsteczkowa

[kDa]

Sekwencjasygnaowa

Miejsceglikozylacji

Miejsce wytwarzania

aFGF 17 - 18 brak brak

komrki mini gadkich,komrki nabonka,

neurony,hepatocyty,fibroblasty,makrofagi,keranocyty

bFGF

1822

22.524

formy rnisimiejscem start

translacji

brak brak

komrki siatkwki (astrocyty),komrki T,pytki krwi,keranocyty,

megakariocyty,fibroblasty,

neurony,komrki nabonka,

embrionowe komrki,egzo- i endodermy

int-2 27 - 32 wystpuje wystpuje tkanki embrionowe,nowotwr piersihst-1 22 wystpuje wystpuje tkanki embrionowe

hst-2 25 wystpuje wystpuje minie szkieletoweczynnikwzrostu

Kaposiego32 - 38 wystpuje wystpuje

tkanki embrionowe,miniak Kaposiego

czynnikwzrostu

keranocytwK-GF

28 wystpuje wystpuje

fibroblasty,minie gadkiecian pcherza

moczowego,komrki mezenchymy

embrionalnejczynnikwzrostu

indukowanyandrogenem

28 wystpuje wystpuje ektoderma embrionowa (tylko

u myszy)

czynnikwzrostu

osonkiglejowej

30 3 reszty wystpuje nowotwr tkanki nerwowej


15/109

Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn

WSTP - 3 -

1.2 Struktura aFGF i oddziaywanie z heparyn

Badania krystalograficzne przeprowadzone przez Zhu X. i wsp. (1990) doprowadziy do

okrelenia struktury ludzkiego aFGF. Biako zbudowane jest z 12 wkien , uoonych

wzgldem siebie antyrwnolegle, stanowicych 50 - 60% struktury. Reszt struktury

stanowi: 20% zgicia, 10%-helisy, 15% struktury nieuporzdkowane (Rysunek 1).

Ludzki aFGF jest przykadem interesujcego typu zwinicia biaka, okrelanego jako

struktura -koniczynki. Podobna konformacja acucha gwnego do obserwowanej w

czynnikach wzrostu fibroblastw wystpuje w tak rnych biakach, jak sojowy inhibitor

trypsyny typu Kunitza (STI), hisaktofilina (Habazettl i wsp., 1991) czy interleukina 1

(Tabela 2).

W strukturze trzeciorzdowej wknaukadajsiw pary. Trzy z nich (1- 12, 4-

5, 8- 9) tworz baryk, a pozostae trzy pary tworz jej przykrycie. Ukad posiada

trjktnosymetrii. Powtarzajcym simotywem jest patek koniczynki, skadajcy siz

czterech wkieni ptli.

W strukturze aFGF odkryto wewntrznjamkw rdzeniu hydrofobowym uformowan

przez konserwowane reszty Leu14, Leu23, Leu44, Ile56, Leu65, Phe85, Tyr 97, Val109 i

Phe132 (Rysunek 2). Objtojamki wynosi okoo 20 48 3 (w zalenoci od tego, ktrzczterech czsteczek w jednostce asymetrycznej krysztau analizowano), a jej minimalny

promie1.2 . Prawdopodobnie przestrzetmogwypenianieuporzdkowane czsteczki

wody, przyczyniajc sido niskiej stabilnoci aFGF (Blaber i wsp., 1996).


16/109


WSTP - 4 -

Rysunek 1.Struktura krystaliczna ludzkiego aFGF (Blaber i wsp., 1996).

Kolorem jasnoniebieskim przedstawiono struktury , koloremtym -helisy. Na schemacie zaznaczono wybrane resztyoddziaujce z: heparyn(kolor ciemnoniebieski), domenD2receptora aFGF (kolor zielony), domenD3 receptora aFGF(kolor czerwony).

Rysunek 2. Widok centralnej jamki w strukturze aFGF.


17/109


WSTP - 5 -

Tabela 2: Sekwencje aminokwasowe aFGF i jego homologw.

Tustym drukiem wyrniono reszty konserwatywne.

11 12 131415 16 17 21 222324 25 26 30 31 32 33 34 42 434445 46 47 48

aFGF 1-10

PKLLYCS 18-20

YFLRIL 27-29

TVDGT 35-41

IQLQLAA

bFGF PKRLYCK FFLRIH RVDGV IKLQLQA

IL-1 NCTLRDS KSLVMS ELKAL VVFSMS?

52 53 545556 57 58 59 63 646566 67 68 72 73 74 75 76 77 83 848586 87 88 89 90

aFGF 49-51 EVYIKST 60-62 QFLAMD 69-71 LLYGS 77-82 CLFLERI

bFGF VVSIKGV RYLAMK RLLSAS CFFFERI

IL-1 PVALGLK LYLSCV TLQLE FVFNKIE

94 95 969798 99 100 7 8910 11 12 16 17 18 19 20 40 414243 44 45

aFGF 90-93 YNTYISK 101-106 WFVGLK 113-115 RSKLG 121-139 ILFLPLP

bFGF YNTYRSR WYVALK QYKLG ILFLPMS

IL-1 KLEFESA WYISTS PVFLG TDFTMQ

Nawet w temperaturach fizjologicznych aFGF nie wystpuje w konformacji natywnej

(Mach i wsp., 1993). Najprawdopodobniej w temperaturach tych aFGF znajduje siw stanie

stopionej globuy (MG, ang. molten globule). Stan ten charakteryzuje si brakiem

oddziaywatrzeciorzdowych pomimo zachowania struktury drugorzdowej. Wystpowanie

aFGF w stanie MG wie si z jego waciwociami biologicznymi. Jedn z nich jest

zdolnoprzechodzenia przez bon(Widocha i wsp., 1992). Dowiedziono, e aby biako

przechodzio przez bon musi znajdowa si w stanie czciowego rozwinicia MG

(Bychkova i wsp., 1988; Ren i wsp., 1998).

Niekorzystne dla aFGF jest rwnie rodowisko kwane (Pineda-Lucena i wsp., 1994).

Naturalnym czynnikiem chronicym aFGF przed denaturacj, a take stymulujcym jego

aktywno, jest czsteczka heparyny (Burgess i wsp., 1989; Dabora i wsp., 1991).


18/109


WSTP - 6 -

Heparyna jest polisacharydem z grupy glikozaminoglikanw zbudowanych z

glukozaminy i kwasu glukuronowego powizanych wizaniem -14-glikozydowym.

Pocztkowo syntetyzowana jest jako pozbawiony grup siarczanowych proteoglikan, ktry

nastpnie ulega deacetylacji i przyczeniu grup siarczanowych (Rysunek 3). Ten ujemnie

naadowany polisacharyd wystpuje w granulocytach zasadochonnych i po jego pobudzeniu

wraz z innymi czsteczkami uwalniany jest w postaci gstych ziaren do przestrzeni

zewntrzkomrkowej (L. Stryer Biochemia PWN, Warszawa 1997).

Rysunek 3. Czsteczka siarczanu heparyny.

Oddziaywanie heparyny z aFGF ma charakter elektrostatyczny. Z ujemnie

naadowanymi grupami heparyny oddziauj dodatnio naadowane reszty aminokwasw

zasadowych aFGF (gwnie Lys112, Lys118, Arg122). Zostaa rwnie okrelona

stechiometria oddziaywania aFGF z heparyn (Mach i wsp., 1992, 1993). Pojedynczyacuch heparynowy o masie 16 kDa moe wiza14 15 czsteczek aFGF (z czego okoo

10 wizanych jest z wysokim powinowactwem), w taki sposb, e kada czsteczka aFGF

przypada na 5 - 7 monomerw sacharydowych acucha heparyny.

Nie poznano jeszcze dokadnie roli heparyny wicej siz aFGF. Przypuszcza si,e

heparyna dziaa poprzez stabilizowanie natywnej konformacji biaka. Wskazujna to wyniki

uzyskane z bada nad denaturacjaFGF w obecnoci mocznika. Denaturacja w obecnoci

mocznika przebiega wedug modelu dwch stanw, a punkt przejcia denaturacyjnego, wzalenoci od iloci stabilizujcego ligandu, znajduje si midzy 2M a 4M steniem

mocznika. W nieobecnoci heparyny aFGF denaturuje przy steniu mocznika [mocznik]=

2.3 M. Wartota wzrasta do 3.5 M w obecnoci 3x nadmiaru molowego heparyny. Podobnie

wzrasta Gapp wraz ze wzrostem stenia ligandu. Przy 3 - 10x nadmiarze heparyny

wystpuje efekt wysycenia dalszy wzrost stenia heparyny nie ma juwpywu na zmian

parametrw denaturacji. Jedynym wyjtkiem jest 0.1x nadmiar stenia heparyny, przy

ktrym Gapp jest nisze ni w przypadku nieobecnoci liganda. Mona to wytumaczy

moliwoci zaistnienia dodatkowych midzyczsteczkowych oddziaywa pomidzy

NHSO O-

2

COO-

COO-

CH OSO O-

2 2 CH OSO O-

2 2

OH OH NHSO O-

2 OSO O-

2 n


19/109

Funkcja aFGF w komrce

WSTP - 7 -

czsteczkami aFGF, znajdujcymi si na tym samym acuchu heparyny (Burke i wsp.,

1993).

Zostao dowiedzione rwnie, e jedynie w obecnoci heparyny nastpuje aktywacja

receptora aFGF (Spivak-Kroizman i wsp., 1994). Heparyna inukujc oligomeryzacj

czsteczek aFGF przyczynia sido powstania oddziaywania aFGF-receptor, ktre zachodzi

w stosunku 1:1. Jednoczesne zwizanie si dwch czsteczek aFGF do dwch czsteczek

receptora powoduje dimeryzacj tych ostatnich, a tym samym ich aktywacj i dalsze

przekazywanie sygnau do komrki, co opisano dokadnie w nastpnym rozdziale.

1.3 Funkcja aFGF w komrce

Podstawow funkcj aFGF jest pobudzanie mitogenezy w rnego typu komrkach.

aFGF stymuluje take komrki do migracji chemotaktycznej, co ma znaczenie w procesie

angiogenezy (rozwoju naczy) i gojenia si ran. Pod wpywem FGF komrki wydzielaj

proteazy, w tym aktywator plazminogenu, kolagenazy czyelatynazy. Zaobserwowano take

zdolno rnych typw komrek (m.in. fibroblastw) do rnicowania si pod wpywem

FGF (Klingenberg, 1999).

Badania nad przekazywaniem sygnau przez aFGF dowiody istnienia dwch typw

swoistych receptorw bonowych dla tego mitogenu. Wyrniono receptory o wysokimpowinowactwie do aFGF (HAR, ang.high affinity receptorlub FGFR, ang. FGF receptor) o

aktywnoci kinaz tyrozynowych oraz receptory niskiego powinowactwa (LAR, ang. low

affinity receptor) sklasyfikowane jako heparany powierzchniowe (Johnson i Williams, 1993;

Galzie i wsp., 1997).

Do tej pory sklonowano i scharakteryzowano 4 geny dla receptorw HAR. Kady z

nich koduje biako transmembranowe zawierajce w czci zewntrzkomrkowej dwie lub

trzy domeny z motywami ptli charakterystycznych dla czsteczek immunoglobulin (domenyIg-like). W czci cytoplazmatycznej znajdujsi natomiast domeny o aktywnoci kinaz

tyrozynowych, poprzez ktre odbywa si przewodnictwo sygnau do jdra. Domeny

zewntrz- i wewntrzkomrkowe receptora poczone s domen transmembranow.

Strukturalne warianty FGFR-1, FGFR-2, FGFR-3 i FGFR-4 powstaj przez alternatywny

splicing transkryptw mRNA.

Proces przekazywania sygnau przez bon polega na jednoczesnym zwizaniu si

dwch czsteczek czynnika FGF z dwoma czsteczkami swoistego receptora, co powodujedimeryzacj receptora i w konsekwencji doprowadza do jego autofosforylacji w czci


20/109

Funkcja aFGF w komrce

WSTP - 8 -

cytoplazmatycznej. Wyzwala to nastpnie kaskad zdarze zwizanych z przekazywaniem

sygnau do jdra komrkowego (ang. downsteram signaling cascade). Ufosforylowana

Tyr766 w cytoplazmatycznej czci receptora FGFR-1 suy jako miejsce wice dla biaek

posiadajcych domeny SH2 i SH3 (domeny homologii z kinazami tyrozynowymi z rodziny

Src), zwizanych z kolejnym etapem transdukcji sygnau. Naley do nich m.in. fosfolipaza

C(PLC, ang. phospholipase C) oraz podjednostka p85 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI-

3, ang. phosphoinositide 3-kinase). Aktywacja PLCprowadzi z kolei do aktywacji kinazy

biakowej C (PKC, ang. protein kinase C), a ta moe dalej aktywowa serynowo-treoninow

kinazRaf-1. Kinaza Raf moe bytake aktywowana przez biaka Ras (z rodziny biaek G).

Kolejnym ogniwem kaskady s kinazy MAP (MAPK, ang. mitogen actiavated protein

kinases), znajdyjce sipod kontrolkinaz Raf i MAPKK (kinazy kinaz MAP). Kinazy MAP

fosforyluj dalej czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za indukcj ekspresji genw.

Naley do nich kompleks transkrypcyjny AP-1 aktywowany poprzez fosforylacj jego

biakowych skadnikw Fos i Jun (Widocha, 1996).


21/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 9 -

Rysunek 4. Transdukcja sygnau do wntrza komrki po zwizaniu siaFGF z receptorem powierzchniowym.

(wg Konarska L. Molekularne mechanizmy przekazywaniasygnaw w komrce, PWN Warszawa 1995).

1.4 Aktywno jdrowa aFGF

Opisany wyej schemat przekazywania sygnau do wntrza komrki obowizywa od

lat 70 i by oglnie przyjtym paradygmatem transdukcji sygnau przez bon komrkow.

Dlatego tepierwsze prace dotyczce translokacji aFGF przez boni jego obecnoci w jdrze

komrkowym podczas mitozy wzbudziy wiele kontrowersji. Oglny model transportu biaek

przez bonkomrkownie uwzgldnia bowiem polipeptydw. Dodatkowo, wedug oglnie

przyjtych zasad, aFGF po aktywacji receptora powinien zosta strawiony w strukturach


22/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 10 -

lizosomalnych komrki. Budowa tego czynnika nie wskazuje na moliwotranslokacji przez

bon do cytosolu, gdy nie zawiera on powierzchniowych sekwencji hydrofobowych.

Uywajc toksyny dyfterytu jako wektora sucego do translokacji aFGF grupa naukowcw

z Oslo udowodnia istnienie podwjnego mechanizmu przekazywania sygnau przez aFGF i

pokazaa, e jego obecno w jdrze komrkowym jest niezbdna do syntezy DNA

(Widocha i wsp., 1994).

Postawiono wobec tego pytania: w jaki sposb sam aFGF jest translokowany przez boni

jaki efekt wywiera w jdrze komrkowym?

Pierwsze badania nad transportem aFGF do jdra pokazay, e jest to proces NLS

zaleny. Oznacza to, e na N-kocu biaka znajduje si sekwencja NLS (ang. nuclear

localization sequence), obejmujca cztery aminokwasy w kolejnoci KKPK, odpowiedzialna

za transport biaek z cytosolu do jdra. Mutanty aFGF nie zawierajce sekwencji NLS nie

posiadaj waciwoci mitogennych, chocia zdolne s do oddziaywania ze swoistym

receptorem, aktywacji go oraz kaskady prowadzcej do aktywacji szlaku sterowanego przez

kinazy MAP. Wklonowanie innej sekwencji NLS (z histonu drodowego 2B) cakowicie

przywraca aktywno mitogenn aFGF (Immamura i wsp., 1990). Dodatkowe badania

wykazay, e dodany z zewntrz aFGF transportowany jest do jdra podczas przejcia z fazy

G0do G1, czyli w momencie kiedy komrka dostaje sygna do mitozy (Zhan i wsp., 1993).

1.4.1 Mutant aFGF-CAAX

Niepodwaalnych dowodw na jdrowaktywnoaFGF dostarczyy dowiadczenia z

mutantem czynnika wzrostowego posiadajcym przy kocu C sekwencj aminokwasow

CAAX, gdzie X oznacza dowolny aminokwas. Sekwencja CAAX jest sygnaem do

izoprenylacji modyfikacji potranslacyjnej biaek zachodzcej tylko w cytosolu i

prawdopodobnie w jdrze. Polega ona na przyczeniu reszty izoprenylowej (farnezylowej lub

geranyl-geranylowej) do zawartej w sekwencji CAAX cysteiny, a nastpnie usuniciu trzech

ostatnich reszt aminokwasowych a przyczeniu reszty metylowej (Rysunek 5). W

konsekwencji tego procesu biaka, posiadajce C-kocow sekwencj CAAX, zostaj

zaopatrzone w acuch lipidowy umoliwiajcy zakotwiczenie zmodyfikowanego biaka w

bonach wewntrzkomrkowych (dotyczy to np.: biaek G tj. Ras, Rab, Rho). Ze wzgldu na

to, e enzymy odpowiedzialne za proces farnezylacji (m.in. transferaza reszty farnezylowej)

nie wystpuj w adnych innych przedziaach komrkowych oprcz cytosolu i jdra,

farnezylacja dodanego z zewntrz mutanta aFGF-CAAX byaby bezporednim dowodem na


23/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 11 -

zdolno przekroczenia bariery bony i osignicia przez ten czynnik cytosolu. Fragment A

toksyny z aFGF-CAAX by modyfikowany przez transferazreszty farnezylowej, zgodnie z

przewidywaniami, jedynie gdy znajdowa si w cytosolu (Widocha i wsp., 1995).

Farnezylacjzaobserwowano jedynie w przypadku gdy aFGF-CAAX dodany by do komrek

posiadajcych swoiste receptory dla aFGF. W komrkach bez FGFR mutant czynnika

wzrostu nie ulega modyfikacjom, chociawiza siz powierzchniowymi heparanami i by

internalizowany. Obecno farnezylowanego aFGF-CAAX stwierdzono take w jdrze.

Powysze obserwacje wskazuj na moliwo zwizku receptora z transportem aFGF do

cytosolu czy jdra.

Rysunek 5.Schemat reakcji farnezylacji (wg L. Stryer Biochemia PWN).


24/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 12 -

1.4.2 Mutant aFGF K132E

Kolejnym krokiem w badaniu wewntrzkomrkowej aktywnoci aFGF byy

dowiadczenia zwizane z mutantem K132E. Tabela 3 przedstawia sekwencjaminokwasow

aFGF z konserwatywnewolucyjnie resztlizyny w pozycji 132. Odpowiada ona m.in. zawizanie siczynnikw z rodziny FGF do heparyny. Jest rwniepozycj, ktra atwo ulega

metylacji w warunkachin vitro, co wskazuje na jej powierzchniowe pooenie.

Tabela 3. Fragment sekwencji aminokwasowej aFGF rnychprzedstawicieli (Klingenberg i wsp., 1995).

Tustym drukiem wyrniono reszty konserwatywne K

nalece do sekwencji fosforylowanej przez PKC

(podkrelone reszty).

POZYCJA

Przedstawiciel 125 132 140

czowiek L K K N G S CKR G P R T H Y G

winia L K K N G S CKR G P R T H Y G

krlik L K K N G S CKR G P R T H Y G

chomik L K K N G S CKR G P R T H Y G

bydo L K K N G R SKL G P R T H Y G

kurczak L K K N G N SKL G P R T H Y G

Zbadanie waciwoci mutanta K132E wykazao jego osabione oddziaywanie z

heparynoraz heparanami powierzchniowymi. Swoiste wizanie i aktywacja receptora FGFR

zachodzi natomiast z identycznwydajnocijak dla typu dzikiego aFGF. Rwnie proces

transportu mutanta do jdra (badania z uyciem toksyny boniczej jako nonika) przebiega

bez rnic, na co wskazuje obecno farnezylowanej formy mutanta K132E-CAAX w

cytosolu. W szeregu badadowiedziono jednak,e mutant K132E nie wykazuje aktywnoci

jdrowej nie stymuluje syntezy DNA oraz nie wie heparyny.

Okazuje si, e mutacja w pozycji 132 niszczy konsensus (S/T)X(R/K), (Tabela 3 -

podkrelone reszty aminokwasowe), dla fosforylacji przeprowadzanej przez kinazbiakow

C (PKC) na serynie lub tyrozynie. Proces ten moe mieznaczenie w aktywnoci jdrowej

aFGF (Klingenberg i wsp., 1995).


25/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 13 -

1.4.3 FIBP - biako wewntrzkomrkowe wice aFGF

Brak waciwoci mitogennych mutanta K132E, pomimo jego obecnoc i w jdrze,

wskazywa na prawdopodobiestwo istnienia dodatkowego biaka wewntrzkomrkowego

zwizanego z aktywnoci wewntrzkomrkow aFGF, ale nie mutanta K132E. Metodpozwalajcna identyfikacjoddziaujcych ze sobmakroczsteczek jest drodowy system

dwuhybrydowy (ang. two-hybrid system) (Chien i wsp., 1991). Opiera si ona o regulacj

ekspresji genu dla -galaktozydazy - enzymu niezbdnego do metabolizowania laktozy.

Metoda dwuhybrydowa wykorzystuje waciwoci drodowego czynnika transkrypcyjnego

GAL4. Biako to jest dwudomenowe: zawiera domen uatwiajc kontakt czynnika

transkrypcyjnego z DNA bd (ang. binding domain) oraz domen o aktywnoci

transkrypcyjnej ad (ang. activation domain). Metodami inynierii genetycznej monakonstruowa plazmidy kodujce biaka hybrydowe. Jedno z nich skada si z domeny bd

czynnika GAL4 oraz znanego biaka, dla ktrego poszukujemy partnera. Pozostae biaka

hybrydowe kodowane s przez plazmidy zawierajce cDNA domeny ad czynnika GAL4

poczone z cDNA rnych biaek z biblioteki genomowej. Tak przygotowane konstrukty

plazmidowe wprowadza si do komrek drodowych. Oddziaywanie midzy znanym

biakiem i biakiem z przeszukiwanych bibliotek powoduje odtworzenie czsteczki czynnika

GAL4, aktywacjgenu reporterowego zawierajcego miejsce wizania GAL4 i w nastpstwietranskrypcjgenu dla -galaktozydazy. Izolacja cDNA z klonw pozytywnych i oznaczenie

ich sekwencji pozwala na zidentyfikowanie szukanego biaka. Wiarygodno otrzymanych

wynikw jest wysoka ze wzgldu na prowadzenie poszukiwa w warunkachin vivo.

W celu odnalezienia partnera aFGF przeszukano bibliotek komrkow HeLa.

Zidentyfikowano hydrofilowe biako o masie ~42 kDa i pI rwnym 6.6, ktre nazwane

zostao FIBP (ang. aFGF intracellurar binding protein). Jako pierwszodkryto tzw. krtk

formFIBP (FIBPs, ang. FIBP short) zoonz 314 reszt aminokwasowych. Pniej okazao

si, e istnieje take forma pena (FIBPf, ang. FIBP full length) zawierajca 372 reszty

aminokwasowe. Obydwie formy FIBP rnisi powinowactwem do aFGF forma FIBPs

silniej wie dziki typ aFGF (informacja prywatna prof. S. Olsnesa). Wyniki pochodzce z

mikroskopii fluorescencyjnej i Northern blottingu wykazay, e FIBP jest biakiem

wystpujcym przede wszystkim w jdrze. W mniejszym stopniu wystpuje jako biako

zwizane z mitochondriami i innymi bonami komrkowymi, prawdopodobnie z RE.

Podobnie jak aFGF, FIBP nie zawiera N-terminalnej sekwencji sygnalnej niezbdnej do

transportu biaka do retikulum endoplazmatycznego i mitochondrium. Ekspresja genu FIBP


26/109

Aktywnojdrowa aFGF

WSTP - 14 -

zachodzi gwnie w miniach, mzgu i trzustce. Dowiedziono,e nie istnieje oddziaywanie

aFGF-FIBP w obecnoci 0.6M NaCl, co wskazuje na elekrostatyczny charakter

oddziaywania. Dodatek heparyny rwnie uniemoliwia oddziaywanie FIBP z aFGF. Nie

stwierdzono take oddziaywania pomidzy FIBP a mutantem K132E (Kolpakova i wsp.,

1998).

Nie wiadomo, niestety, jaka jest dokadnie rola FIBP. Fakt odnalezienia FIBP w jdrze

jak i zarwno w cytoplazmie wskazuje na moliwo jego krenia po komrce jako

transportera. Jednake obecno w jdrze rwnie mutanta aFGF K132E wyklucza funkcj

FIBP jako transportera aFGF do jdra. Moliwe,e aFGF po wnikniciu do komrki czy si

z FIBP i aktywuje komponent jdrowy zwizany z inicjacjsyntezy DNA.


27/109

Aktywnojdrowa aFGF

CEL PRACY - 15 -

2 CEL PRACY

Zasadniczym celem niniejszej pracy byo wyekspresjonowanie

wewntrzczsteczkowego biaka oddziaujcego z aFGF FIBP w systemie pMal-c2 jako

biaka fuzyjnego z MBP. Podjto rwnieprboczyszczania biaka MBP-FIBP na kolumnie

z immobilizowanamyloz, a nastpnie proteolitycznego odcicia FIBP z biaka fuzyjnego.

Drugim celem byo udowodnienie stabilizujcego wpywu heparyny na czsteczk

aFGF oraz zbadanie stabilnoci zarwno typu dzikiego, jak i mutantw aFGF z

wprowadzonymi mostkami disiarczkowymi (Cys11-Cys59 oraz Cys43-Cys139).


28/109

Odczynniki

MATERIAY - 16 -

3 MATERIAY

3.1 Odczynniki

IPTG (izopropylo--D-tiogalaktozyd) Bachem CaCl2(chlorek wapnia) Merck MgCl2(chlorek magnezu) Sigma NaCl (chlorek sodu) Riedel de Haen GmbH KCl (chlorek potasu) POCh DTT (1,4-ditiotreitol) Bachem

EDTA (etylenodiaminotetraoctowy kwas) Sigma Tris Sigma bromek etydyny Stratagene bkit bromofenolowy POCh bkit Coomasie G-250 Serva agaroza BioProducts glukoza POCh maltoza Sigma MBP (biako wice maltoz) New England BioLabs zoe amylozowe Pharmacia Biotech AB zoe heparynowe (Heparin Sepharose CL-6B) Pharmacia Biotech AB

mocznik Sigma SDS (dodecylo siarczan sodu) Sigma N,N'-metyleno-bis-akrylamid Sigma akrylamid Sigma APS (nadsiarczan amonu) Merck TEMED (N,N,N,N-tetrametylenodiamina) Merck MOPS (kwas (3-N-morfolino)propanosulfonowy) Sigma PEG (glikol polietylenowy) Sigma PMSF (fenylometylosulfonylofluorek) Sigma glicyna Polfa urydyna Sigma

2-propanol Merck fenol Merck etanol 96% ZPS "Polmos" S.A. butanol POCh chloroform POCh glicerol POCh dideoksynukleotydy dNTP United States Biochemicals kwas fosforanowy Fluka kwas borowy Merck kwas octowy POCh octan sodu POCh

cytrynian sodu POCh


29/109

Enzymy

MATERIAY - 17 -

3.2 Enzymy

restrykcyjne

Tabela 4. Charakterystyka stosowanych enzymw restrykcyjnych.

ENZYM RESTRYKCYJNYcharakterystyka

BamHI EcoRI NcoI SpeI

Rozpoznawanasekwencja

5 GGATCC 33 CCTAGG 5

5 GAATTC 33 CTTAAG 5

5 CCATGG 33 GGTACC 5

5 ACTAGT 33 TGATCA 5

BuforReakcyjny

B

100mM NaCl10mM Tris-HCl

5mM MgCl21mM DTT

1mM2-merkaptoetanol(pH 8.0 w 37C)

H


10mM MgCl21mM DTE

(pH 7.5 w 37C)

H


10mM MgCl21mM DTE

(pH 7.5 w 37C)

H


10mM MgCl21mM DTE

(pH 7.5 w 37C)

Temperaturainkubacji

37C 37C 37C 37C

Definicja jednostki

aktywnoci

1U trawi 1gDNA

(48502bp) w 1 godz.(5 miejsc restr.)

1U 1gDNA

(48502bp) w 1 godz.(5 miejsc restr.)

1U trawi 1gDNA

(48502bp) w 1 godz.(4 miejsca restr.)

1U trawi 1g AD2

DNA (35500bp) w 1godz. (3 miejsca restr.)

FirmaBoehringenMannheim

Boehringen Mannheim Boehringen Mannheim Boehringen Mannheim

czynnik Xa New England BioLabs

T4 ligaza United States Biochemicals

T4 DNA polimeraza Amersham

T4 DNA polimeraza Vent New England BioLabs

T4 kinaza Amersham

RNaza A Qiagen

3.3 Markery masy

DNA

Marker XIV Boehringen Mannheim

Marker XVII Boehringen MannheimRPL43A/EcoRI (plazmid zawierajcym cDNA


30/109

Odczynniki do sekwencjonowania

MATERIAY - 18 -

biaka rybosomalnego trawionyenzymem EcoRI)

Marker ssDNA (z faga M13) Amersham

Biaek

Wide range MW marker New England BioLabs

3.4 Odczynniki do sekwencjonowania

Radioizotop [-35S]dATP DuPont NEN

Zestaw do sekwencjonowania United States Biochemicals

Wywoywacz W16 do rcznej

obrbki bon rentgenowskich Foton, Bydgoszcz Utrwalacz U5 do rcznej

obrbki bon rentgenowskich Foton, Bydgoszcz

Bibua 3MM Whatman

3.5 Antybiotyki i skadniki poywek

Ampicylina Polfa

Chloramfenikol Sigma

Chlorowodorek tetracykiny Merck

poywka LB pynna (1 litr)

10 g ekstraktu drodowego Merck

5 g peptonu z kazeiny Merck

10 g NaCl

poywka LB-agar (1 litr)



10 g NaCl

15 g agaru Merck

poywka SB pynna (100ml)



1 g MOPS


31/109

Szczepy bakteryjne i fagowe

MATERIAY - 19 -

poywka SOC (40ml)

0.8 g peptonu z kazeiny Merck

0.2 g ekstraktu drodowego Merck

100l 1M KCl

80l 5M NaCl

oraz dodane po sterylizacji:

800l 20% glukozy

400l 1M MgCl2

3.6 Szczepy bakteryjne i fagowe

DH5

o genotypie F-80dlacZ(lacZYA-argF)V169deoRrecA1 endA1

hsdR17(rK-,mK

+)phoAsupE44 - tchi-1gyrA69relA1

firmy GibcoBRL

uywany do ekspresji rekombinowanych biaek i namnaania DNA

plazmidowego

BL(DE3)pLysS

o genotypie E. coliB F- dcm ompT hsdS(rB- mB

-)gal(DE3) [pLysS Camr]

firmy Stratagene

uywany do ekspresji rekombinowanych biaek

XL-1 blue

o genotypie recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[FproAB

lacIq

ZM15Tn10(Tetr

)]c

firmy Stratagene

uywany do elektroporacji

CJ236 dut-, ung-

o genotypie dut-, ung-, thi1, relA1/pCJ105(Cmr)

firmy Stratagene

uywany do namnaania jednoniciowego DNA zawierajcego reszty uracylu

zamiast reszt tyminy (mutageneza)


32/109

Plazmidy i ich mapy restrykcyjne

MATERIAY - 20 -

MM294 dut+, ung+

o genotypie dut+, ung+ endA1 hsdR17 supE44 thi-1

firmy Stratagene

uywany do namnaania DNA plazmidowego (m.in. w mutagenezie)

Fag pomocniczy VCS - M13

firmy Stratagene

uywany w reakcji mutagenezy

3.6.1 Oporno na antybiotyki poszczeglnych szczepw

bakteryjnych

Tabela 5. Oporno na antybiotyki uywanych szczepwbakteryjnych i fagowych.

ANTYBIOTYKI

stenie kocowe w poywce

20g/ml 12g/mlSzczep

chloramfenikol tetracyklina

DH5 - -

BL(DE3)pLysS + -

XL-1 blue - +

CJ236 dut-, ung- + -

MM294 dut+, ung+ - -

Fag M13 - -

3.7 Plazmidy i ich mapy restrykcyjne

pET-3c-aFGF

Wektor plazmidowy pET (ang. plasmid for expression by T7 RNA polymerase) o

wielkoci 4638 bp jest uywany do ekspresji rekombinowanych biaek w komrkach

bakteryjnych E.coli. Zawiera on promotor faga T7 rozpoznawany jedynie przez polimeraz

fagowRNA. Produkcja rekombinowanego biaka nastpuje wic dopiero po ekspresji RNA

polimerazy faga T7, inicjowanej przez infekcjfagowlub indukcjszczepu zawierajcego


33/109


MATERIAY - 21 -

kopigenu fagowej polimerazy (np.: szczep BL21(DE3), DH5 ). Wszystkie plazmidy typu

pET zawieraj miejsce pocztku replikacji ori ColE1. W skad wektora pET-3c wchodzi

rwnie gen opornoci na ampicylin oraz region z miejscami restrykcyjnymi, w obrbie

ktrego znajduj si przede wszystkim sekwencje rozpoznawane przez enzymy NcoI oraz

BamHI.

Plazmid pET-3c, zawierajcy wklonowan sekwencj kodujc aFGF, dostarczony

zosta przez zesp prof. S. Olsnesa z Wydziau Biochemii Instytutu Bada nad Rakiem w

Oslo. Rwnie plazmidy pET-3c zawierajce sekwencje kodujce mutanty aFGF ze

wstawionymi wewntrzczsteczkowymi mostkami disiarczkowymi (Cys11-Cys59, Cys43-

Cys139) pochodziy z powyszego zespou. Rysunek 6 przedstawia schemat wektora pET-3c

oraz maprestrykcyjnregionu do klonowania.

Rysunek 6.Mapa restrykcyjna plazmidu pET-3c.


34/109


MATERIAY - 22 -

pBSN-FIBPf

Rysunek 7. Mapa restrykcyjna plazmidu pBSN-1.

pMal-c2

Wektory pMal-2 su do ekspresji rekombinowanych biaek w formie fuzyjnej w

komrkach bakteryjnych E.coli. Wyrnia si wektory pMal-2 typu p i typu c

(odpowiednio od sowa peryplazmatyczny i cytoplazmatyczny). Rnisione od siebie

tym, e w wektorze pMal-c2 brakuje fragmentu 1531-1605, stanowicego sekwencj

sygnaln kwalifikujcdane biako do transportu do przestrzeni peryplazmatycznej. Biaka

ekspresjonowane w systemie pMal-c2 sotrzymywane jako cytoplazmatyczne biaka fuzyjne

z MBP (ang.maltose binding protein).

Dokonuje sitego poprzez insercjgenu dla danego biaka w obrbie tzw. policznika

(polilinkera) - odcinka DNA zawierajcego graniczce ze sob miejsca restrykcyjne dla

rnych enzymw zlokalizowanego za genem malE. Biako fuzyjne oczyszcza si

wykorzystujc naturalnwaciwo MBP wizania si do maltozy (metoda chromatografii

powinowactwa). Rozdzielenie sfuzjowanych biaek odbywa sinastpnie przez proteolityczne

cicie czynnikiem Xa, ktry rozpoznaje specyficznsekwencjIle-Glu-Gly-Arg, wystpujc

pomidzy MBP a biakiem rekombinowanym.


35/109


MATERIAY - 23 -

Transkrypcja wektorw pMal-2 zaczyna siod promotora Ptac, dla ktrego induktorem

jest IPTG dodawane z zewntrz, a represorem produkowana przez gen lacIq czsteczka

represora Lac. Promotor Ptac znajduje sitake pod kontrolterminatora. W skad wektorw

wchodz take geny opornoci na ampicylin oraz miejsca pocztku replikacji: bakteryjne

ColE1 ori oraz M13 ori pochodzce z bakteriofaga M13. To ostatnie pozwala na produkcj

jednoniciowego DNA poprzez infekcj komrek zawierajcych plazmid pMal-2 fagami

pomocniczymi. Jednoniciowe plazmidowe DNA moe by nastpnie wykorzystywane do

metody sekwencjonowania z uyciem startera lub mutagenezy ukierunkowanej (pMal-2

System Manual). Rysunek 8 przedstawia schemat wektora pMal-c2 oraz map restrykcyjn

policznika.

Rysunek 8.Mapa restrykcyjna plazmidu pMal-c2.


36/109


MATERIAY - 24 -

W niniejszej pracy badawczej uywano systemu pMal-c2 do ekspresji penej oraz

krtkiej formy FIBP. Wektor pMal-c2-FIBPfotrzymano gotowy z Oslo, natomiast wektor

pMal-c2-FIBPs skonstruowano samodzielnie metodami biologii molekularnej opisanymi w

rozdziale 5.

pET-25b(+)

Wektor pET-25b(+), zoony z 5547 bp, zawiera N-terminaln sekwencj sygnaln

pelB,dziki ktrej biako bdce produktem transkrypcji kierowane jest do peryplazmy.

Rysunek 9.Mapa restrykcyjna plazmidu pET-25b(+).


37/109

Oligonukleotydy

MATERIAY - 25 -

Wektor posiada rwniesekwencje umoliwiajce oczyszczanie wyekspresjonowanego

biaka. Jednz nich jest sekwencja His-Tag kodujca 6 reszt histydynowych, ktre w biaku

znajdowasibdna kocu C. Umoliwia ona oczyszczanie biaka metod chromatografii

na kolumnie z immobilizowanymi jonami niklu, ktry jest koordynowany przez 6 reszt His.

3.8 Oligonukleotydy

Wszystkie uywane oligonukleotydy pochodziy z firmy MWG-Biotech AG.

Tabela 6.Charakterystyka uywanych oligonukleotydw.

OligonukleotydpET25b (+SpeI)

sekwencja 5 - GTG GTG GTG GTG GTG ACT AGT ATC CTC GGG GTC TTC C - 3stenie 16.83 pm/l

masaczsteczkowa

11490 g/mol

Tm > 75C

OligonukleotydprNcoI(FIBP, 5)

sekwencja 5 - ATC GAG GGT AGG GCC ATG GAC - 3

stenie 38.98 pm/l

masaczsteczkowa

6536 g/mol

Tm 63.7C

OligonukleotydprSpeI(FIBP, 3)

sekwencja 5 - GAC GAG ACT AGT GAG CAA CTT TAT TGT CAG C - 3

stenie 71.65 pm/l

masaczsteczkowa

9559 g/mol

Tm 50C


38/109

Oligonukleotydy

Sprzt - 26 -

4 Sprzt

medyczna ania wodna LW102 Zakad UrzdzeElektronicznych

wirwka labolatoryjna 1-15 Sigma

wirwka MPW 375 Mechanika Precyzyjna, Warszawa

aparat do elektroforezy zanurzeniowej BioRad

zasilacz BioRad

lampa UV (312nm) TFX-20M

do analizyeli agarozowych CONSORT

aparat do PCR, DNA Engine MJ RESEARCH

aparat do sekwencjonowania DNA C.B.S SCIENTIFIC CO.

suszarka doeli poliakrylamidowych SLG

elektroporator-Electro cell Manipulator 600 BTX Electronic Genetics

spektrofotometr diodowy HP 8452A Hewlett Packard

waga labolatoryjna WPE-300 RADWAG

waga BP-110S Sartorius pH-metr Metrohm

wytrzsarka Roto-mix Barnstead / Thermolyne

wytrzsarka do hodowli bakterii INFORS AG

cieplarka do stacjonarnej hodowli bakterii ELKON

autoklaw Barnstead

komora gbokiego zamraania New Brunswick Scientific

spektrofluorymetr FP-750 Jasco spektropolarymetr J-715 Jasco


39/109

Preparacja bakterii kompetentnych

METODY - 27 -

5 METODY

5.1 Preparacja bakterii kompetentnych

Tradycyjnmetodpreparacji bakteryjnych komrek kompetentnych jest standardowa

metoda chemiczna z uyciem chlorku wapnia (Taketo i wsp., 1972). Potraktowanie komrek

bakteryjnych 50 mM CaCl2powoduje zwikszenie przepuszczalnoci ich bony komrkowej

dla DNA plazmidowego.

Kultury bakterii E.coli zwykle hodowane byy w 50 ml poywki selekcyjnej LB

(dodatek antybiotykw w zalenoci od szczepu Tabela 5) do wartoci OD650= 0.5. Po

osigniciu takiej wartoci komrki wirowano przy 6000 obr./min. przez 5 minut i

przemywano schodzonym do 4C fizjologicznym roztworem 10mM NaCl (w celu

odpukania komrek bakteryjnych z poywki pynnej). Nastpnie wirowanie powtrzono w

takich samych warunkach, a do osadu komrek bakteryjnych dodano schodzonego roztworu

50 mM CaCl2 i pozostawiono na 20 minut na lodzie. Po kolejnym wirowaniu komrki

zawieszono w objtoci pocztkowej CaCl2 i dodano glicerolu do stenia kocowego30%. Komrki kompetentne mona przechowywa w -70C przez kilka miesicy. Naley

jednak pamita, e wraz z upywem czasu spada ich wydajno w pniejszym procesie

transformacji.

5.2 Transformacja bakterii kompetentnych

Transformacj bakterii przygotowanych w sposb opisany wyej przeprowadzano zapomocmetody tzw. szoku cieplnego (ang. heat-shock). Do rozmroonej na lodzie porcji

bakterii kompetentnych (250 l) dodano 210 ng DNA plazmidowego i inkubowano na

lodzie (4C) przez 30 minut. Po tym czasie mieszaninpodgrzano do 42C przez 2 minuty i

ponownie schodzono na lodzie. Gwatowna zmiana temperatury jest czynnikiem, ktry w

obecnoci CaCl2 powoduje wnikanie DNA plazmidowego do komrek. Stransformowane

komrki hodowano w trzech objtociach medium (~750 l) w temperaturze 37C przez

godzin. Ostatnim krokiem byo wysianie posiadanej hodowli na stae podoe selekcyjne zantybiotykiem, ktrego opornogwarantuje plazmid.


40/109

Elektroporacja

METODY - 28 -

5.3 Elektroporacja

Znacznie wydajniejsz metod transformacji komrek bakteryjnych DNA

plazmidowym jest elektroporacja. Pozwala ona na okoo tysickrotne zwikszenie wydajnoci

w porwnaniu do metody szoku cieplnego. Elektroporacja polega na poddaniu komrek

elektrokompetentnych dziaaniu wysokiego napicia (ok. 2000V) przez kilka milisekund.

Reakcj przeprowadzano w specjalnych kuwetkach (o szczelinie 2 mm). Bakterie

elektrokompetentne (XL1-blue) uzyskano poprzez odpukanie ich z poywki, w ktrej

prowadzona bya hodowla, za pomoc wody, co doprowadzio do okoo tysickrotnego

zagszczenia hodowli. Tak przygotowane komrki przechowywano w 10% glicerolu w

-70C. Zastosowany puls elektryczny prowadzi do utworzenia kanaw w bonie

komrkowej, co z kolei przyczynia si chwilowo do zwikszenia transporu czsteczek downtrza komrki. Natychmiast po ustaniu pulsu mieszaninzawieszono w 5 ml poywki SOC

i hodowano przez godzin w 37C. W odpowiednio dobranych warunkach podczas

elektroporacji nie nastpuje uszkodzenie komrek. Mieszanina poddawana elektroporacji

powinna zawierabardzo mae stenie soli. W przeciwnym wypadku dojdzie do powstania

tzw. uku elektrycznego i zniszczenia elektroporowanej mieszaniny wraz z kuwetk.

5.4 Elektroforeza w elu agarozowym

Elektroforeza w elu agarozowym jest standardow metod stosowan do

rozdzielania, identyfikacji i oczyszczania fragmentw DNA (Sambrook i wsp., 1989).

Pooenie DNA w elu mona okreliprzy pomocy dodawanego do elu bromku etydyny,

ktry interkaluje kwasy nukleinowe i powoduje ich fluorescencj pod wpywem

promieniowania UV. Metoda ta pozwala na rozdzielanie fragmentw DNA o dugoci od 50

bp do 50 kb, w zalenoci od procentowoci stosowanegoelu (Tabela 7).


41/109

Elektroforeza welu agarozowym

METODY - 29 -

Tabela 7. Zaleno procentowoci elu agarozowego odwielkoci rozdzielanych fragmentw DNA.

Agaroza

[%]

Wielkorozdzielanych

fragmentw

0.3 5-60 kb0.5 1-30 kb

0.6 1-20 kb

0.7 0.8-12 kb

1.0 0.5-10 kb

1.2 0.4-7 kb

1.5 0.2-3 kb

2.0 50 bp-2 kb

Elektroforez w elu agarozowym prowadzono w orientacji horyzontalnej w polu

elektrycznym o staym napiciu i nateniu. W zalenoci od aparatu i wielkoci elu

stosowano napicie od 30 do 130 V. Wyjciowe stenie bromku etydyny wynosio 10

mg/ml, a kocowe stenie welu 0.5g/ml.

5.4.1 Okrelanie stenia DNA na elu agarozowym

W celu oznaczenia stenia maej iloci preparatu DNA (np.: po mini preparacji metod

Qiagen tip-20 - podrozdzia 5.7), stosuje si metod polegajc na porwnywaniu

intensywnoci wiecenia prkw w elu agarozowym z prkami pochodzcymi od

markerw masy (znane stenie DNA w danym prku). Generalnie, aby oznaczytmetod

stenie DNA plazmidowego, jako wzorca uywano roztworu tego samego plazmidu, ktrego

stenie byo wczeniej oznaczone spektrofotometrycznie (podrozdzia 5.6) oraz markerw

wielkoci DNA (wymienione w podrozdziale 3.3).Rozdzia elektroforetyczny przeprowadzano w elu agarozowym, o procentowoci

zalenej od rozdzielanych fragmentw DNA, w buforze 1xTBE (10xTBE = 0.9M Tris-boran,

20mM EDTA, pH 8.0) z dodatkiem bromku etydyny. Skady poszczeglnych prb

poddawanych rozdziaom elektroforetycznym podano w wynikach (rozdzia 6).


42/109

Izolacja DNA zelu agarozowego metoda QIAEX II

METODY - 30 -

5.4.2 Elektroforeza preparatywna w elu agarozowym

Aby wyizolowaDNA (np.: insert lub wektor po trawieniu z mieszaniny restrykcyjnej

patrz podrozdzia 5.9) przeprowadzano elektroforetyczny rozdzia mieszanin zawierajcych

DNA i wycinano zelu odpowiednie fragmenty. Elektroforezpreparatywnprowadzano welu agarozowym w buforze 1xTAE (50xTAE = 2M Tris-octan, 50mM EDTA, pH 8.0),

zapewniajcym wysz wydajno. Po wyciciu fragment elu przenoszono do zwaonej

wczeniej ependorfki (w celu okrelenia masy wycitego fragmentuelu).

5.5 Izolacja DNA z elu agarozowego metoda QIAEX II

Interesujce nas fragment DNA oczyszczano i izolowano z elu agarozowego przypomocy mleczka silikonowego QIAEX II. Metoda polega na rozpuszczeniu agarozy, a

nastpnie selektywnej i ilociowej adsorpcji DNA do silikonowego mleczka w warunkach

wysokiego stenia soli oraz pH poniej 7.5. Elucj DNA przeprowadzano za pomoc

roztworu o niskim steniu soli i pH z zakresu 7 8.5 (np.: 10mM Tris-HCl pH 8.0).

el zostaje rozpuszczony w 50C za pomocbuforu QX1, zawierajcego chaotropow

sl, w obecnoci ktrego rozerwane zostajwizania wodorowe midzy cukrami w agarozie.

Wizanie sido silikonowego mleczka fragmentw DNA o wielkoci mniejszej ni100 bp

wymaga dodatkowego zwikszenia stenia soli, co osiga si poprzez podwojenie iloci

dodawanego buforu QX1 (2 x 3 objtoci pocztkowe). Dokadny przepis postpowania

opisano poniej:

Do elu zawierajcego DNA dodano 3 objtoci buforu QX1 oraz 10 l zawiesiny

mleczka silikonowego.

Inkubowano 10 min. w 50C co chwilmieszajc na mieszadle.

Zwirowano krtko (30 sek.).

Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500l buforu QX1.


Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500l buforu PE.


Supernatant usunito, a pozostae mleczko zawieszono w 500l buforu PE.



43/109

Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i kwasw nukleinowych

METODY - 31 -

Supernatant dokadnie usunito, pozostae mleczko wysuszono poprzez pozostawienie

otwartych probwek na okoo 30 min.

Izolacj DNA z mleczka silikonowego przeprowadzono za pomoc10mM TrisHCl pH 8.0

postpujc wedug instrukcji:

Do suchego mleczka dodano 20l 10mM Tris-HCl pH 8.0 i inkubowano 10 min. w 50C.


Supernatant przeniesiono do nowej probwki.

Do pozostaego osadu dodano ponownie 20 l 10mM Tris-HCl pH 8.0 i inkubowano 10

min. w 50C.


Supernatant przeniesiono do probwki z wczeniejszym supernatantem. Zwirowano krtko (30 sek.) w celu zupenego pozbycia siresztek mleczka i supernatant,

w ktrym znajdowao siczyste DNA, przeniesiono do nowej probwki.

Skady buforw uywanych w metodzie QIAEX II chronione spatentem przez firm.

5.6 Spektrofotometryczne oznaczanie stenia biaek i

kwasw nukleinowych

Stenia biaek (FIBP, aFGF) wyznaczano spektrofotometrycznie w kuwetach

kwarcowych przy dugoci fali 280 nm (Pace i wsp., 1994). Przy obliczaniu wartoci stenia

korzystano z nastpujcych wielkoci molowego wspczynnika absorpcji:

dla aFGF = 17420 [M-1cm-1]

dla FIBPs = 24533 [M-1cm-1]

dla FIBPf = 31793 [M

-1

cm

-1

]i zalenoci:

l

Ac

=

280

gdzie dugodrogi optycznej 1=l .

Znajomo iloci DNA zawartego w posiadanej prbce jest istotna dla powodzenia

wielu technik biologii molekularnej oraz uzyskania powtarzalnych wynikw

przeprowadzanych eksperymentw. W celu dokadnego okrelenia iloci DNA w bardziej


44/109

Izolacja plazmidowego DNA za pomocmetody QIAGEN-tip-20

METODY - 32 -

stonych roztworach mierzono absorpcjprzy dugoci fali 260 nm w kuwecie kwarcowej, a

nastpnie z uzyskanej wartoci obliczono stenie DNA korzystajc z zalenoci:

stenie jednoniciowego DNA (np.: oligonukleotyd):

c = A260 33 [g / ml]

stenie dwuniciowego DNA (np.: plazmid):

c = A260 50 [g / ml]

5.7 Izolacja plazmidowego DNA za pomoc metody

QIAGEN-tip-20

Metoda oczyszczania DNA firmy QIAGEN oparta jest o metodzmodyfikowanej lizy

alkalicznej stransformowanych komrek bakteryjnych, a nastpnie zwizanie DNA

plazmidowego do ywicy anionowymiennej (QIAGEN Anion-Exchange Resin) przy

odpowiednio niskim steniu soli i odpowiednim pH. Stosowany w kolumienkach do

oczyszczania DNA nonik jest silnie dodatnio naadowan, makroporowat ywicorednicy

czstek wynoszcej 100 m, pokrytpolimerem z grupami DEAE (dietyloaminoetylowymi).

RNA, biaka, barwniki i niskoczsteczkowe zanieczyszczenia wymywane s z nonika

buforem orednim steniu soli. Czyste DNA plazmidowe eluowane jest buforem o wysokim

steniu soli (1.25M NaCl), a nastpnie zagszczane i odsalane przez strcanie

izopropanolem. Preparacj DNA metod Qiagen mona przeprowadza, w zalenoci od

potrzeb, na skal: mini, midi czy maxi.

Szczegowy opis preparacji na skalmini, skady uywanych buforw oraz ich iloci

stosowane w zalenoci od skali preparacji podano poniej.

W celu wyizolowania pojedynczych klonw plazmidw, koloniami z pytek po

transformacji zaszczepiono 3 mililitrowe hodowle pynne (o odpowiednim skadzie i

zawartoci antybiotykw do uywanych szczepw bakteryjnych). Po nocnej hodowli w 37C

przy 220 obr./min. hodowle bakteryjne zwirowano przy 5000 obr./min., 10 min., 4C.

Po usuniciu supernatantu, osady bakteryjne osuszono i pozostawiono na co najmniej 15min. w -20C.

Rozmroony osad zawieszono w 0.3 ml buforu P1.


45/109

Izolacja plazmidowego DNA za pomocmetody QIAGEN-tip-20

METODY - 33 -

Do zawiesiny dodano 0.3 ml buforu P2 (poddanie osadu bakteryjnego lizie za pomoc

SDS/NaOH w obecnoci RNazy A).

Wymieszano przez kilkakrotne odwrcenie probwki i inkubowano 5 min w temperaturze

pokojowej (zoptymalizowany czas lizy (5 min) zapewnia uwolnienie DNA plazmidowego

bez uwolnienia DNA chromosomalnego, jak rwniezabezpiecza przed nieodwracalnym

zdenaturowaniem plazmidu).

Dodano 0.3 ml schodzonego buforu P3 (neutralizacja lizatu prowadzca do poprawnej

renaturacji kowalencyjnie zamknitego DNA plazmidowego oraz wytrcenie razem z

kompleksami SDS-sl zdenaturowanych biaek, pozostaoci komrkowych razem z DNA

chromosomalnym).

Szybko wymieszano przez kilkakrotne odwrcenie probwki i inkubowano 5 min na

lodzie.

Wirowano 20 min. w 4C przy 13000 obr./min w celu usunicia biaek. W trakcie

wirowania naley zrwnowaykolumienki nanoszc po 1 ml buforu QBT.

Supernatanty ostronie przeniesiono na kolumienki (tak by nie nanie rwnie osadu

biaek).

Po wnikniciu caego roztworu w zoe, kadkolumienk przepukano czterokrotnie 1

ml buforu QC.

DNA ze zoa odmyto do sterylnej probwki za pomoc0.8 ml buforu QF.

Do roztworu DNA dodano 0.56 ml izopropanolu, a nastpnie zwirowano przy 13000

obr./min, 4C, 35 min.

Po ostronym usuniciu supernatantu, do osadu dodano 0.5 ml 70% etanolu (w celu

pozbycia si resztek izopropanolu) i ponownie wirowano przy 13000 obr./min, 4C, 10

min.

Po usuniciu supernatantu osad, zawierajcy wypreparowane DNA, wysuszono a

nastpnie zawieszono w 40 l sterylnej wody.


46/109

Ukierunkowana mutageneza

METODY - 34 -

Tabela 8. Skady buforw stosowanych w preparacji plazmidowego DNA metodQiagen (wgQiagen Plasmid Mini Handbook).

Bufor do zawieszaniaosadu bakteryjnego

P1 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 100g/ml RNazy A, pH 8.0

Bufor do lizy P2 200mM NaOH, 1% SDS

Bufor neutralizujcy P3 3M octan potasu, pH 5.5

Bufor dorwnowaenia nonika

QBT 750mM NaCl, 50mM MOPS, 15% izopropanol, 0.15% Triton X-100, pH 7.0

Bufor doprzepukiwania

nonika

QC 1M NaCl, 50mM MOPS, 15% izopropanol, pH 7.0

Bufor do elucji DNA QF 1.25M NaCl, 50mM Tris-HCl, 15% izopropanol, pH 8.5

Tabela 9. Objtoci poszczeglnych roztworw wykorzystywanych przy preparacji DNAplazmidowego na kolumienkach Qiagen-tip 20 (wg Qiagen Plasmid MiniHandbook).

roztwr Minipreparacja

QIAGEN-tip 20

Midipreparacja

QIAGEN-tip 20

Maxipreparacja

QIAGEN-tip 20

hodowla 3 ml 100 ml 500 ml

P1 0.3 ml 4 ml 10 ml

P2 0.3 ml 4 ml 10 ml

P3 0.3 ml 4 ml 10 ml

QBT 1 ml 4 ml 10 ml

QC 4 x 1 ml 2 x 10 ml 2 x 30 ml

QF 0.8 ml 5 ml 15 ml

izopropanol 0.56 ml 3.5 ml 10.5 ml

TE/woda 40 100 ml 500l 500l

5.8 Ukierunkowana mutageneza

Technika mutagenezy ukierunkowanej wykorzystana zostaa w celu wprowadzenia

miejsca restrykcyjnego dla enzymu SpeIna wektorze pET-25b(+), ktre nie wystpuje na

oryginalnym plazmidzie (mapa restrykcyjna podrozdzia 3.7). Reakcj mutagenezy

ukierunkowanej zaprojektowano tak, aby sekwencja rozpoznawana przez enzym SpeI

znajdowaa si w zmutowanym plazmidzie midzy sekwencj HSV-Tag a His-Tag.


47/109


METODY - 35 -

Restrykcja enzymatyczna (enzymem SpeI oraz NcoI) tak skonstruowanego wektora w

dalszych etapach bdzie prowadzi do otrzymania liniowej formy wektora z zachowan

sekwencjHis-Tag, niezbdndo oczyszczania wyekspresjonowanego biaka.

Istnieje kilka ronych technik umoliwiajcych wprowadzanie w sposb

ukierunkowany punktowych zmian do sekwencji DNA. Jednz nich jest stosowana metoda

Kunkela z wykorzystaniem jednoniciowej formy plazmidu. Polega ona na wprowadzeniu

mutacji do DNA zawierajcego zamiast reszt tyminy reszty uracylu. Taka forma DNA

produkowana jest przez mutanty bakterii E.coli - CJ236 o genotypie dut-, ung-, ktre nie

posidaj enzymw dUTP-azy oraz uracylo-N-glikozylazy, odpowiadajcych za rozkad

dUTP i usuwanie uracylu z nici DNA. W efekcie braku tych dwch enzymw moliwe jest

wbudowywanie reszt uracylu do dwuniciowego DNA. Uzyskanie jednoniciowej matrycy do

mutagenezy moliwe jest dziki skorzystaniu z pomocy fagw wkienkowych M13.

Jednz cech tych wirusw jest jednoniciowy genom, z rwnoczesn- obecnw trakcie

propagacji w komrkach - dwuniciow form replikacyjn. Plazmidy (zwane fagemidami),

dla ktrych moliwe jest wykorzystanie techniki mutagenezy opartej o jednoniciowmatryc,

muszzawieramidzygenowy segment DNA faga wkienkowego z informacj(sygnaem)

niezbdndo uzyskania DNA w postaci jednoniciowej i osonicia jej kapsydem fagowym.

Pozostae sekwencje, ktre dostarczajbiaek zwizanych z tymi procesami, pochodzz DNA

faga pomocniczego.

Waciwa reakcja mutagenezy przeprowadzana jest in vitrona matrycy z wbudowanym

uracylem. Po przyczeniu do jedniniciowej matrycy startera, ktrym jest oligonukleotyd

zawierajcy zmieniony kodon, nastpuje dobudowywanie drugiej nici DNA za pomocT4

DNA polimerazy. Dobudowywana ni zamykana jest nastpnie w form kolistza pomoc

T4 DNA ligazy. W kolejnym etapie mieszaninreakcyjntransformuje sibakterie szczepu

E.coli MM 294 o genotypie dut+, ung+, wewntrz ktrych ni zawierajca uracyl (i

jednoczenie dzik wersj mutowanego genu) jest degradowana. W efekcie uzyskuje siplazmid zawierajcy zmutowany kodon.

Rysunek 10 przedstawia schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej

metodKunkela oraz szczegowy tok postpowania.


48/109


METODY - 36 -

Rysunek 10.Schemat reakcji mutagenezy ukierunkowanej przeprowadzanej metodKunkela.

Zaznaczanie matrycy uracylem

Transformacja kompetentnych komrek szczepu E.coli CJ236lazmidem - matryc z wklonowanym genem, do ktrego ma by

wprowadzona mutacja. Hodowla transformowanych bakterii w

obecnoci odpowiednich antybiotykw (ampicylina, chloramfenikol) i

urydyny - umoliwienie namnoenia uracylowej wersji plazmidu.

Otrzymanie jednoniciowej matrycy (z uracylem)

Dodanie fagw pomocniczych do posiadanej hodowli bakterii w celu

umoliwienia upakowania czstek fagw zawierajcych jedn, zawsze

t sam, ni plazmidu. Izolacja czstek fagw z hodowli, a nastpnieizolacja z nich DNA (uzyskanie jednoniciowej, uracylowanej matrycy

do mutagenezy).

Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

Druga ni plazmidu odtwarzana jest poprzez T4 DNA polimeraz, a

nastpnie zamykana przez T4 DNA ligaz.

Doklejenie mutagennego oligonukleotydu

Do przygotowanej jednoniciowej matrycy doklejany jest

oligonukleotyd wprowadzajcy podanmutacj.

Namnoenie plazmidu o zmienionej sekwencji

Transformacja szczepu E.coli MM odtworzonym in vitro plazmidemmajca na celu usunicie uracylowej nici wyjciowego plazmidu, a

nastpnie namnoenie dwuniciowego plazmidu zawierajcego

wprowadzan mutacj. Wysianie bakterii na pytkach w celu

uzyskania pojedyczych kolonii, zawierajcych populacj

ednakowych wersji plazmidu.


49/109


METODY - 37 -

5.8.1 Preparacja matrycy zaznaczonej uracylem

Przygotowanie jednoniciowej matrycy polega na namnoeniu faga M13 zawierajcego

zamknity w kapsydzie jednoniciowy fagemid, ktry chcemy mutowa, a nastpnie na

izolacji DNA z otrzymanych fagw.

5.8.1.1 Namnoenie fagw

3 mililitrowe hodowle (LB + ampicylina + chloramfenikol) zaszczepiono pojedynczymi

koloniami CJ 236 uzyskanymi na pytkach po transformacji i hodowano przez noc w 37C

przy 200 obr./min.

Rano przeszczepiono po 50 l nocnych hodowli CJ do 1.5 ml poywki: LB + ampicylina

+ chloramfenikol + urydyna (stenie urydyny w poywce 25 g/ml).

Bakterie hodowano ok. 2 godzin, 37C, 220 obr./min. (hodowle powinny uzyskagsto

optycznOD650nm 0.5).

Hodowle odwirowano w eppendorfkach (po 1.5 ml) przy 5500 obr./min., 4C, 10 min.

Kadporcjosadu bakterii zawieszono w 50 l roztworu faga pomocniczego (ok. 100

czstek faga na 1 komrk) i hodowano przez 20 min. w 37C przy 180 obr./min.

Do kadej probwki dodano 1.5 ml LB (+ ampicylina + urydyna + chloramfenikol), a

nastpnie zawiesinbakterii przeniesiono do probwek do hodowli i hodowano w 37C

przy 220 obr./min. przez 4 godziny.

Hodowle zawierajce komrki bakterii oraz namnoone czstki fagw odwirowano w

eppendorfkach przy 5500 obr./min. w 4C przez 10 min.

Supernatanty przeniesiono do nowych eppendorfek po 750 l i strcono z nich fagi

dodajc po 150 l roztworu 20% PEG, 15% NaCl.

Po 30 min. inkubacji na lodzie wytrcone fagi zwirowano przy 13000 obr./min., 4C, 15

min.

Osady zawieszono w 100 l TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)i pozostawiono

na noc w -20C.

5.8.1.2 Izolacja DNA z fagw - ekstrakcja fenolem / chloroformem

Do roztworu fagw w TE dodano 50 l fenolu, wymieszano intensywnie i zwirowano.

Fazwodn(grn) przeniesiono do nowej eppendorfki. Do fazy wodnej dodano 50 l chloroformu, wymieszano intensywnie i zwirowano.


50/109


METODY - 38 -

Fazwodn(grn) przeniesiono do nowej eppendorfki.

Do fazy wodnej dodano 0.1 objtoci 3M octanu sodu, pH 4.5 oraz 2 objtoci 100%

zimnego etanolu.

Pozostawiono w -70C na 30 min. Prbki zwirowano przez 20 min., 13000 obr./min., 4C.

Supernatanty usunito.

Do osadw dodano 0.5 ml zimnego 70% etanolu i wirowano 10 min., 13000 obr./min.,

4C.

Supernatanty usunito.

Osady jednoniciowego DNA wysuszono, zawieszono w 15 l TE i pozostawiono na

lodzie.

5.8.1.3 Oznaczenie wypreparowanego ssDNA

W celu sprawdzenia czy wypreparowane DNA jest form jednoniciow(ssDNA ang.

single strand DNA) na 1% el agarozowy naniesiono prbki zawierajce 5 l DNA oraz

marker ssDNA. Rozdzia elektroforetyczny prowadzono w buforze TBE przy nateniu 50V.

5.8.2 Przygotowanie oligonukleotydu do wprowadzenia mutacji

5.8.2.1 Projektowanie oligonukleotydw

Technika mutagenezy ukierunkowanej wymaga zaprojektowania dla danej mutacji

jednego oligonukleotydu, zawierajcego zmianwprowadzanw sekwencji. Oligonukleotydy

projektuje si tak, by w centralnej czci zawieray zmienian sekwencj, a po obu jej

stronach posiaday po co najmniej 12 nukleotydw komplementarnych do sekwencji

mutowanej (sekwencjnukleotydu podano w podrozdziale 3.8)

5.8.2.2 Fosforylowanie oligonukleotydw

Mutagenny olignukleotyd suy jako starter DNA przez T4 DNA polimeraz, ktra na

jednoniciowej matrycy dobudowuje drug ni. Aby w nastpnym etapie T4 DNA ligaza

moga zamkn dosyntetyzowan ni potrzebna jest grupa fosforanowa na 5 kocu

oligokleotydu. Poniewa grupa ta nie znajduje si w zamawianych oligonukleotydach,

wprowadza si jza pomocT4 kinazy polinukleotydowej (przeniesienie z ATP na woln


51/109


METODY - 39 -

grup 5-OH oligonukleotydu). Reakcj t przeprowadza si przed przyczeniem

oligonukleotydu do matrycy jednoniciowej.

Reakcj fosforylowania przeprowadzono na 400 pmolach oligonukleotydu pET-25b(+),

po wczeniejszym oznaczeniu spekrofotometrycznie jego stenia (podrozdzia 5.6).

Do r-ru oligonukleotydu dodano 4 l stonego buforu dla kinazy (Kinase Buffer(10x) -

500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 100mM merkaptoetanol) oraz 4l 10mM ATP

i uzupeniono do 38l wod.

T4 kinaz polinukleotydow rozcieczono 10 razy buforem Kinase Dillution Buffer

(50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM 2-merkaptoetanol, 0.1M EDTA, 50% glicerol)

bezporednio przed reakcj i dodawano porcjami (po 2 l) do oligonukleotydu w 15

minutowych odstpach czasu (reakcjprowadzano przez 45 min. w 37C).

Reakcj zatrzymano przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 1 l 0.5M EDTA,

chelatujcego jony magnezowe niezbdne do dziaania enzymu.

Enzym dezaktywowano poprzez inkubacjroztworu w 70C przez 10 min.

Fosforylowany oligonukleotyd przechowywano do czasu waciwej reakcji mutagenezy w

-20C.

5.8.3 Waciwa reakcja mutagenezy in vitro

W celu przyczenia oligonukleotydu do matrycy (jednoniciowego DNA zawierajcego

uracyl) przygotowano mieszaninzawierajc:

5 l jednoniciowego DNA

1 l fosforylowanego oligonukleotydu (10 pmoli)

2.5 l 10x stonego buforu SSC (1.5M NaCl, 150mM cytrynian sodu, pH 7.0)

16.5l sterylnej wody Mieszaninpozostawiono w 70C przez 2 min., a nastpnie powoli schadzano przez 30

min.

Do schodzonej mieszaniny dodano:

20 l 5x stonegoPolymerase Mix(100mM Tris-HCl, pH 8.0,

10mM DTT, 50mM MgCl2, 2.5mM dNTP, 5mM ATP)

55 l sterylnej wody

Po zwirowaniu do prbki dodano:


52/109

Trawienie restrykcyjne

METODY - 40 -

2 l (2U) T4 ligazy

0.6 l (2.5U) T4 DNA polimerazy

Ponownie zwirowano.

Inkubowano 5 min. na lodzie, 5 min. w temperaturze pokojowej, a nastepnie 2 godziny w37C.

Reakcjzatrzymano przez dodanie 3 l 0.5M EDTA.

5.8.4 Transformacja mieszaniny reakcyjnej do bakterii

kompetentnych szczepu MM 294

Mieszanin po reakcji mutagenezy stransformowano bakterie kompetentne szczepu

E.coli MM 294 wedug metody opisanej w podrozdziale 5.2. Bakterie te przeprowadzaj

degradacjnici DNA zawierajcej uracyl (i jednoczenie dzik wersjmutowanego genu).

W efekcie uzyskuje siplazmid zawierajcy zmutowany kodon.

IzolacjDNA plazmidowego z pojedynczych kolonii po transformacji przeprowadzono

za pomocmetody Qiagen-tip20 opisanej w podrozdziale 5.7.

5.9 Trawienie restrykcyjne

Metoda trawienia restrykcyjnego uywana w biologii molekularnej wykorzystuje

naturalnaktywnoendonukleaz restrykcyjnych, polegajcna rozcinaniu obcego DNA.

Enzymy restrykcyjne rozpoznajbardzo specyficznie sekwencje od czterech do omiu par

zasad i hydrolizuj wizanie fosfodiestrowe kadej z obu nici tego rejonu DNA.

Rozpoznawane sekwencje maj charakter palindromowy, a miejsca zerwania nici DNA

usytuowane ssymetrycznie.

Tabela 4 zawiera uywane enzymy restrykcyjne oraz ich charakterystyk. Na podstawieinformacji doczanych przez firmprzy zakupie enzymu restrykcyjnego oraz korzystajc z

poniszego wzoru okrelano iloci jednostek aktywnoci poszczeglnych enzymw

potrzebnych do strawienia danego DNA w cigu godziny:

jednostka

DNAnaszymenzymu wdanegodlanychrestrykcyjmiejscilosc

DNAnaszegowielkosc

wzorcowymDNAenzymu wdanegodlanychrestrykcyjmiejscilosc

owzorcowegDNAwielkosc

1


53/109


METODY - 41 -

5.9.1 Trawienie restrykcyjne plazmidu pBSN-FIBPf

Jednym z celw pracy byo przeklonowanie z plazmidu pBSN-FIBPffragmentu DNA

kodujcego FIBPs do wektora pMal-c2. Umoliwioby to dalsz ekspresj biaka FIBPs w

systemie pMal-c2.Aby uzyska insert (FIBPs) plazmid zawierajcy sekwencj kodujcFIBPfpoddano

trawieniu nastpujcymi enzymami restrykcyjnymi: NcoI i BamHI(koniecznie zachowujc

kolejno trawie). Rysunek 11 przedstawia sekwencje nukleotydowe charakterystycznie

rozpoznawane przez te enzymy.

Rysunek 11.Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pBSN-FIBPf.

Powstapo trawieniu enzymem NcoI, liniowform plazmidu pBSN-FIBPfpoddano

reakcji tworzenia tzw. tpych kocw. Dokonano tego za pomocT4 DNA polimerazy,

ktra w obecnoci dodanych z zewntrz dezoksyrybonukleotydw (dNTP) dobudowuje

brakujce w nici plazmidowego DNA nukleotydy. Stosunek objtociowy dodanych dNTP do

mieszaniny restrykcyjnej (plazmidowe DNA + bufor dla enzymu + enzym restrykcyjny)

powinien wynosi1:10. Po dodaniu 0.5l T4 DNA polimerazy mieszaninpozostawiono na

godzin w temperaturze 37C. Po tym czasie do mieszaniny dodano 1 l 0.5M EDTA i

inkubowano w 65C przez 10 min. (w celu zahamowania aktywnoci polimerazy). DNA w

formie liniowej wyizolowano nastpnie z mieszaniny przeprowadzajc ekstrakcj

fenolem/chloroformem (analogicznie do podpunktu 5.8.1.2). Preparat liniowego DNA

poddano nastpnie drugiemu trawieniu restrykcyjnemu enzymemBamHI.


54/109


METODY - 42 -

5.9.2 Trawienie restrykcyjne plazmidu pMal-c2

W celu przygotowania wektora do klonowania plazmid pMal-c2 poddano trawieniu

enzymami restrykcyjnymi w nastpujcej kolejnoci:EcoRI,BamHI. Rysunek 12 przedstawia

sekwencje nukleotydowe specyficznie rozpoznawane przez te enzymy.

Rysunek 12.Schemat trawienia restrykcyjnego plazmidu pMal-c2.

Reakcj trawienia, izolacj wektorowego DNA i oznaczanie jego stenia

przeprowadzono w sposb analogiczny do opisanych powyej etapw dla insertu FIBPs

(punkt 5.9.1). Rny by tylko pierwszy stosowany enzym restrykcyjny.

5.9.3 Trawienie restrykcyjne zmutowanego plazmidu pET-25b(+)

Przeklonowanie genu FIBPsz wektora systemu ekspresyjnego pMal-c2 do pET25b(+)

wymagao trawienia restrykcyjnego plazmidu pET-25b(+), po jego wczeniejszy zmutowaniu

(podrozdzia 5.8), enzymami NcoIi SpeI. Rysunek 13 przedstawia sekwencje nukleotydowe

specyficznie rozpoznawane przez te enzymy.

Rysunek 13.Schemat trawienia restrykcyjnego wektora pET-25b(+).


55/109

Reacja PCR

METODY - 43 -

5.10 Reacja PCR

ReakcjPCR (ang. Polymerase Chain Reaction) wykorzystano w celu pozyskania genu

FIBPs, ktry nastpnie uyto jako insert do konstrukcji plazmidu pET25b(+)-FIBPs. Zalet

reakcji PCR jest moliwo rwnoczesnego otrzymania genu i wyposaenia go w

odpowiednie miejsca restrykcyjne, pozwalajce na ligacj z DNA wektorowym trawionym

takimi samymi enzymami. Jako matrycy do reakcji PCR uyto skonstruowanego poprzednio

plazmidu pMalc2-FIBPs. Insert namnoono poprzez zastosowanie zaprojektowanych

wczeniej starterw (ang. primer) komplementarnych do miejsc ograniczajcych sekwencj

FIBPs na matrycy (Tabela 6)oraz termostabilnej DNA polimerazy Vent. W tym celu

zastosowano kolejne cykle denaturacji termicznej (uzyskanie jednoniciowej matrycy),

przyczania starterw (ang. annealing) oraz aktywno polimerazow, prowadzc dopowstania na bazie matrycy komplementarnych fragmentw DNA. Korzystajac z poniszego

wzoru wyliczono temperatur annealingu dla komplementarnych do matrycy fragmentw

oligonukleotydw prNcoI(FIBP, 5) oraz prSpeI(FIBP, 3):

Tm = nAT 2C + nGC 4C

gdzie: Tm oznacza temperaturannealingu, nATi nGCodpowiednio liczbpar zasad

AT i GC w komplementarnym do matrycy fragmencie oligonukleotydu.

Oligonukleotyd prNcoI(FIBP, 5) by cakowicie komplementarny do matrycy, podczas

gdy w prSpeI (FIBP, 3) na kocu 5 obecna bya sekwencja GAC GAG ACT AGT

niekomplementarna, zawierajca miejsce restrykcyjne dla enzymu SpeI (ACT AGT). W

kolejnych cyklach reakcji PCR pocztkowo nie w peni komplementarny starter sta si

cakowicie kompatybilny do matrycy, na skutek wykorzystywania przez DNA polimeraz

nowo dosyntetyzowanych nici jako matryc w dalszej czci reakcji. Umoliwio to

wprowadzenie miejsca restrykcyjnego dla SpeI, a co za tym idzie ligacjpoprzez tzw. lepkie

koce insertu FIBPsz wektorem pET25b(+).

5.11 Reakcja ligacji

Standardowo ligacj, czyli reakcj czenia fragmentw DNA (insertu z wektorem),

przeprowadza siw mieszaninie zawierajcej insert do wektora w stosunku molowym 10:1 i

zawartoci DNA wektorowego ok. 20 - 40 ng na 10l mieszaniny. Dodatkowo przeprowadzasi rwnoczenie reakcj autoligacji (mieszanina nie zawierajca insertu). Celem jest


56/109

Sekwencjonowanie

METODY - 44 -

sprawdzenie w jakim stopniu poddany restrykcji wektor bdzie tworzy w obecnoci T4 DNA

ligazy polimeryczne formy lub podlega rekombinacjom, prowadzcym do powstania nie

interesujcych nas, a transformujacych sido bakterii i dalej replikujacych siplazmidw.

Reakcjligacji kadorazawo prowadzano przez noc w 16C. Powstana skutek ligacji

kolist form DNA plazmidowego wytrcano za pomoc n-butanolu. Do mieszaniny

ligacyjnej i autoligacyjnej dodawano po 1ml n-butanolu, wymieszano intensywnie do

zniknicia rozgraniczenia faz, inkubowano 2 godziny w -20C i wirowano 30 min. przy 13000

obr./min. w temp. 4C. Osad przepukano 0.5 ml 70% etanolu i wirowano 10 min. w

warunkach takich jak poprzednio. Po usuniciu supernatantu wysuszono osad i zawieszono w

10l sterylnej wody.

Po reakcji ligacji mieszanin ligacyjn i autoligacyjnwprowadza si do komrek

bakteryjnych zwykle na drodze elektroporacji (podrozdzia 5.3), ze wzgldu na wysz

wydajno tej metody w porwnaniu do transformacji metod szoku cieplnego. Po

namnoeniu stransformowanych komrek w poywce SOC wysiano je na pytki z poywk

selekcyjn. Pojedyncze klony plazmidw powstae po ligacji izolowano z komrek

bakteryjnych za pomocmetody QIAGEN tip-20 opisanej szczegowo w podrozdziale 5.7.

5.12 Sekwencjonowanie

W celu sprawdzenia prawidowoci przeprowadzonego klonowania przeprowadzono

reakcj sekwencjonowania przy uyciu zestawu do sekwencjonowania firmy United States

Biochemical, opart na metodzie Sangera (Sanger i wsp., 1997). Polega ona na

kontrolowanym przerywaniu enzymatycznej replikacji sekwencjonowanej nici DNA w

wyniku wczenia do nowo powstajcej nici dideoksy analogu odpowiedniego

dezoksyrybonukleotydu (2, 3-didezoksyrybonukleotyd). Reakcja przeprowadzana jest przez

genetycznie zmodyfikowanDNA polimeraz faga T7 (SequenaseTM

ver. 2.0) pozbawionaktywnoci 3-5 egzonukleazowej, posiadajcnatomiast zdolno wczania do nici DNA

analogw nukleotydw stosowanych w tej metodzie. Reakcj przeprowadzano w czterech

osobnych probwkach, gdzie kada z nich zawieraa dezoksrybonukleotydy (dNTP), z

ktrych jeden - dATP znakowany by 35S, oraz jeden didezoksyrybonukleotyd (ddNTP) w

kadej probwce inny, na ktrym zatrzyma si replikacja nici. Analiz sekwencji

przeprowadzano poprzez elektroforetyczny rozdzia powstajcych fragmentw DNA w

denaturujcym elu poliakrylamidowym. Wizualizacji obrazu dokonywano poprzez


57/109

Sekwencjonowanie

METODY - 45 -

zaczernienie kliszy fotograficznej, wywoanego promieniowaniem pochodzcym z 35S-

dATP wbudowanego do fragmentw DNA w trakcie reakcji sekwencjonowania.

Rysunek 14 przedstawia schematycznidesekwencjonowania.

Rysunek 14. Schemat przedstawiajcy metod sekwencjonowania z uyciem dideoksy analogwrybonukleotydowych.


58/109

Sekwencjonowanie

METODY - 46 -

5.12.1 Przygotowanie plazmidowej matrycy do

sekwencjonowania

Matryc do sekwencjonowania stanowi jednoniciowe DNA, ktre otrzymuje si zdwuniciowego kwasu dezoksyrybonukleinowego poddanego zasadowej denaturacji, a

nastpnie zagszczeniu i odsoleniu. Odpowiedniilowodnego roztworu DNA (po izolacji

metodQiagen-tip 20), zawierajcokoo 1.5 g DNA plazmidowego, inkubowano 10 min.

w 37C z 0.25 objtoci2N NaOH. Nastpnie roztwr neutralizowano przez dodanie 0.375

pocztkowej objtoci 3M octanu sodu pH 4.5 i rozcieczono za pomoc0.875 pocztkowej

objtoci wod. Zdenaturowan matryc strcono z roztworu przez dodanie 100% etanolu

(9.4 objtoci wyjciowej), inkubacj30 min. w -70C, a nastpnie zwirowanie przy 13000obr./min. przez 15 min. w 4C. Po przepukaniu za pomoc0.5 ml 70% etanolu, zwirowaniu

przez 10 min. w warunkach jak poprzednio i wysuszeniu, DNA zawieszono w 7l wody.

5.12.2 Przyczenie startera

Przyczenie (ang. annealing) startera do jednoniciowego DNA zachodzi podczas

dwuminutowej inkubacji w 65C, a nastpnie powolnego schadzania poniej 35C

mieszaniny zawierajcej: 7 l zdenaturowanej matrycy, 1 l primera (5 pm) oraz 2 lSequenase Reaction Buffer (Tabela 10 zawiera skady wszystkich roztworw z zestawu do

sekwencjonowania). Gotowdo sekwencjonowania matryctrzymano na lodzie do waciwej

reakcji sekwencjonowania.

5.12.3 Znakowanie radioizotopem i sekwencjonowanie

Do schodzonej mieszaniny po annealingu dodano 1 l 100mM DTT, 2 l 5x

rozcieczonego Labelling Mix, 0.5 l izotopu 35S-dATP oraz 2 l 8x rozcieczonej

polimerazy Sequenase. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej rozporcjowano po

3.5 l powyszej mieszaniny do czterech probwek z rozpipetowanymi uprzednio 2.5 l

odpowiednich ddNTP (Termination Mix). Po 5 minutach inkubacji w 37C do wszystki

praca magisterska Agaty.pdf

Documents

Transcript of praca magisterska Agaty.pdf