Oznaczanie RNA w materiale roślinnym Prowadzący: mgr inż. Sebastian Derfla Opracował: mgr inż. Sebastian Derfla

Celem ćwiczenia jest poznanie metody ekstrakcji, oczyszczania i spektrofotometrycznego oznaczania całkowitej zawartości kwasów rybonukleinowych w materiale roślinnym.

Wprowadzenie

Kwasy nukleinowe Kwasy te są podstawowymi składnikami komórek wszystkich organizmów żywych. W komórkach eukariotycznych wysterują głównie w jądrze komórkowym, a w mniejszych ilościach w cytoplazmie, mitochondriach i chloroplastach. Cegiełkami budulcowymi kwasów nukleinowych są nukleotydy powiązane między sobą wiązaniem fosfodiestrowym (3´→ 5´). Nukleotydy składają się z zasady organicznej purynowej lub pirymidynowej, cukrowca pentozy i reszty kwasu fosforowego. Zależnie od rodzaju od rodzaju pentozy wyróżnia się kwasy deoksyrybonukleinowe (DNA), zawierające β-D-deoksyrybozę, i rybonukleinowe (RNA), zawierające β-D-rybozę. Głównymi zasadami purynowymi w DNA i RNA są adenina (A) i guanina (G), a pirymidynowymi cytozyna (C) w DNA i RNA są tymina (T) w DNAi uracyl (U) w RNA. Zasady azotowe są aromatyczne, heterocykliczne i połączonez C-1 cukrowca przez N-9 puryn lub N-1 pirymidyn. Grupy fosforanowe mogą być przyłączone do C-2 (w rybozie), C-3 lub C-5 (w deoksyrybozie i rybozie), tworząc odpowiednio 2´-,3´- i 5´-nukleotydy. W komórkach w znacznych ilościach wystepują tylko 5´-nukleotydy, gdyż reakcje zarówno syntezy, jak i hydrolizy kwasów nukleinowych przebiegają z ich udziałem. Cząsteczki RNA zbudowane są z jednej nici, aczkolwiek zawierają rejony komplementarne typu spinki do włosów (w tRNA około50% zasad jest sparowanych w ten sposób). Rola większości kwasów rybonukleinowych w komórce wiąże się z procesem syntezy białka zwanym translacją. W translacji uczestniczą trzy rodzaje kwasów nukleinowych:

• Informacyjny RNA (mRNA) – w procesie transkrypcji na mRNA przenoszona jest informacja z DNA w postaci kolejnych trójek nukletydów (kodonów) specyfikujących określone aminokwasy i tym samym sekwencję tych aminokwasów w białkach,

• Transportujący (transferowy) RNA (tRNA) – uczestniczący w aktywacji i nanoszeniu aminikwasów na rybosom, pełni też funkcję adaptorową, gdyż za pośrednictwem antykodonu łączy się z odpowiednim kodonem mRNA,

• Rybosomowy RNA (rRNA) – składnik rybosomów, pełniący funkcję strukturalną i katalityczną w procesie translacji.

W jądrze i cytoplazmie komórek eukariotycznych występuje wiele niskocząsteczkowych RNA, określanych jako snRNA (small nuclear RNAs) i scRNA ( small cytoplasmatic RNAs). Niskocząsteczkowy snRNA jest składnikiem małych jądrowych rybonukleoprotein (snRNP), które z kolei tworzą kompleksy, tzw. sliceosomy z prekursorowym RNA (pre-mRNA). W spliceosomach odbywa się splicing (czyt. slajsing), czyli jeden z etapów przekształcania pre-mRNA w mRNA (tzw. dojrzewania). Splicing polega na rozcięciu pre-mRNA, usuwaniu intronów (sekwencje niekodujące) i łączeniu eksonów (sekwencje kodujące). Funkcję katalityczną pełni tu RNA, a nie białko. Innym przykładem katalitycznego działania RNA jest wykryty u pierwotniaka Tetrahymena thermophila RNA L-19, uczestniczący w tzw. splicingu autokatalitycznym rRNA. Jest on zbudowany z 395 nukleotydów,

wykazuje aktywność nukleozową i polimerazową, jako kofaktory prawdopodobnie wykorzystuje guanozynę i jony metali; zachowuje się zatem jak prawdziwy enzym. Podobnie w rybonukleazie P (nukleoproteina) uczestniczącej w dojrzewaniu tRNA funkcję katalityczną pełni RNA, gdyż rozpoznaje miejsce w transkrypcie mające ulec rozszczepieniu i rozcina je, a białko tylko zwiększa szybkość reakcji. Dla odróżnienia od białkowych katalizatorów – enzymów, kwasy rybonukleinowe wykazujące zdolność katalityczną nazwano rybozymami. Cytoplazmatyczny, niskocząsteczkowy RNA – scRNA uczestniczy w kierowaniu nowoutworzonych białek do określonych przedziałów komórkowych lub na zewnątrz komórki. Polimeraza RNA II zlokalizowana w nukleoplazmie transkrybuje geny kodujące białko (katalizuje syntezę pre-mRNA) i wiekszość genów kodujących snRNA. Wszystkie produkty tego enzymu nazywa się heterogennym jądrowym RNA (hnRNA), a te transkryptory, które po procesie dojrzewania staną się cząsteczkami mRNA, nazywa się pre-mRNA. Wytworzony mRNA przenoszony jest do cytoplazmy i tworzy kompleksy z białkami, co przypuszczalnie stanowi dodatkową ochronę (poza kapem i ogonem poli A) przed nukleazami. Białka te odłączane są przed przyłączeniem mRNA do rybosomu. Informacyjny RNA wykazuje znaczne zróżnicowanie pod względem masy cząsteczkowej i trwałości. Półokres życia tego kwasu może wynosić od kilku minut do wielu godzin. W nasionach roślin występuje tak zwany długowieczny mRNA, który wykorzystywany jest w początkowym okresie kiełkowania. Polimeraza RNA III zlokalizowana w nukleoplazmie transkrybuje między innymi geny kodujące tRNA. Wytwarzane są duże cząsteczki pre-tRNA, z których przy udziale rybonukleazy P i rybonukleazy D powstają dojrzałe cząsteczki tRNA, zawierające od 73 do 93 rybonukleotydów o masie cząsteczkowej około 25 kDa. Cechą wyróżniającą tRNA od innych RNA jest występowanie, oprócz A, U, G i C, innych zasad, takich jak:hipoksantyna (nukleozyd inozyna), pseudouracyl, dihydrouracyl oraz pochodnych guaniny, hipoksantyny i cytozyny. Te nietypowe zasady powstają podczas dojrzewania tRNA. Proces ten obejmuje również przyłączenie trójki nukleotydów (CCA) do końca 3´, gdzie wiązany jest aminokwas, oraz wytworzenie charakterystycznej struktury wtórnej. U roślin wykrytoi scharakteryzowano 110 rodzajów tRNA, z których połowa występuje w cytoplazmie, a reszta w chloroplastach i mitichondriach. Dla każdego z 20 aminokwasów białkowych istnieje co najmniej jeden tRNA, a dla niektórych kilka różnych. Rybosomowy RNA syntetyzowany jest głównie z udziałem polimerazy I zlokalizowanej w jąderku. Powstaje duża (45S) cząsteczka pre-tRNA i w nastepstwie specyficznych cięć enzymatycznych tworzą się z niej cząsteczki składowe zbudowane z białka i rRNA podjednostek rybosomów. Wiele swoistych metylacji ryboz, przebiegajacych w czasie dojrzewania pre-rRNA, odbywa się dzięki oddziaływaniom z małymi jądrowymi cząstkami rybonukleoproteinowymi (snRNA). Występujące tutaj snRNA często określa się jako małe jąderkowe RNA (snoRNA). U roślin rRNA charakteryzuje się znaczną zawartością zasad zmetylowanych i przewagą par zasad G + C nad A + U. Jest to najobficiej reprezentowany rodzaj kwasów rybonukleinowych, gdyż stanowi około 80% całej puli RNA w komórce, podczas gdy tRNA około 15%, a mRNA około 5%. Zawartość RNA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RNA wynosi 0,1-0,2% św.m. W liściach i korzeniach starzejących się czy poddanych głodzeniu stężenie to ulega wyraźnemu obniżeniu.

Badanie kwasów rybonukleinowych W komórce RNA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. Naturalne mieszniny RNA można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach, wirowania w gradiencie sacharozy. Do wyodrębnienia mRNA z materiału biologicznego wykorzystuje się chromatografię powinowactwa w agarozie lub celulozie z kowalencyjnie związanym poli(U), który wiąże się komplementarnie z ogonem poli(A) mRNA. Zabieg przeprowadza się w niskiej temperaturze i przy wysokim stężeniu soli, zmieniając warunki można odzyskać mRNA. Badanie składników RNA możne przeprowadzać na preparatach nie hydrolizowanych, wykonując reakcje barwne, na przykład reakcję Biala na rybozę, lub badając składniki po hydrolizie. Hydroliza enzymatyczna polega na kolejnym dzieleniu specyficznymi enzymami, to jest nukleazami (otrzymuję się nukleotydy), nukleotydazą (nukleozydy +Pn) i nukleozydazą (trzymuje się zasady organiczne i rybozę). RNA i DNA znacznie różnią się wrażliwością na działanie czynników chemicznych (kwasy, zasady) i fizycznych (temperatura). DNA ulegają całkowitej hydrolizie dopiero pod działaniem stężonych kwasów i w podwyższonej temperaturze, na przykład w 12 M kwasie nadchlorowym, w czasie jednej godziny, w temperaturze 100ºC. Natomiast hydroliza RNA jest łatwiejsza do przeprowadzenia, bo już w wyniku działania 1 M kwasu solnego (1 godzina, 100ºC), uwalniane są zasady purynowe (adenina i guanina), fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe (cytydyno-3´-fosforan i urydyno-3´-fosforan). Wiązania N-glikozydowe w nukleotydach pirymidynowych są znacznie trwalsze od tych w nukleotydach purynowych i zasady można z nich uwolnić dopiero w 12 M kwasie nadchlorowym. Ogrzewanie RNA w 0,5 M wodorotlenku potasu (40ºC) powoduje jego hydrolizę do 2´-, 3´-cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DNA, który nie ma grup 2´-hydroksylowych). Dalsze ogrzewanie (do 1 godziny, 40ºC) prowadzi do utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2´- i 3´-nukleotydów – AMP, GMP, CMP, i UMP (rys.1), których ilość można oznaczyć spektrofotometrycznie. Produkty hydrolizy kwasów nukleinowych można rozdzielić metodami chromatografii bibułowej, HPLC w odwróconej fazie i jonowymiennej lub elektroforenezy, a następnie oznaczać. I tak na przykład, oglądając chromatogram w świetle nadfioletowym (260-280 nm), można wykrywać i identyfikować nukleotydy, nukleozydy oraz zasady purynowe i pirymidynowe, gdyż związki te wygaszając (pochłaniając) promieniowanie, widoczne są jako ciemne plamy na tle jasno fluoryzującej bibuły. Na ćwiczeniach do oznaczania RNA będzie wykorzystana adaptowana do materiału roslinnego i uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera. Polega ona na usunięciu z materiału barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DNA. Pozostałe RNA hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu i powstające 2´- i 3´-mononukleotydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną absorbancję przy około 260 nm (rys. 2). Ponadto mierzy się absorbancję roztworu przy 300 nm w celu wprowadzenia poprawki wynikającej z obecnością innych związków pochłaniających

promieniowanie o tej długości fali. Wielkość absorbancji przy 300 nm jest wskaźnikiem poprawności wykonania procedury oczyszczania RNA.

O

OH

H H

O

HH

CH2

HN

N

O

O

HO

P

O

O

O

O

O

H H

OH

HH

CH2HO

P

O

O

O

N

NHN

NH2N

O

N

NN

N

NH2

O

OH

H H

O

HH

CH2HO

P

O

O

O

O

O

H H

OH

HH

CH2HO

P

O

O

O

N

N

NH2

O

5'

4'

3' 2'

1'

5'

4'

3' 2'

1'

5'

4'

3' 2'

1'

5'

4'

3' 2'

1'

Rysunek 1. Wzory niektórych 2´- i 3´-nukleotydów powstających w wyniku łagodnej hydrolizy RNA

Rysunek 2. Widmo absorpcyjne oczyszczonego RNA z liścieni grochu

Odczynniki i materiały (1) 95-procentowy etanol (może być skażony 2-procentowym acetonem). (2) 80-procentowy etanol. (3) Eter naftowy. (4) 0,2 M kwas nadchlorowy (schłodzony). (5) 1,0 M kwas nadchlorowy (schłodzony, 111ml 60-procentowego do 1000ml). (6) 0,5 M wodorotlenek potasu. (7) 8-10-dniowe siewki (pszenica, pszenżyto).

Szkło i inne wyposażenie Kolba stożkowa o pojemności 250 ml, moździerz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym, pompa wodna (2 na grupę), kolby ssawkowe z probówką, probówka wirówkowa o pojemności 20 ml z zamknięciem, termometr, cylinder o pojemności 10 ml, pipety, lód, łaźnia elektryczna (100ºC), folia aluminiowa, łaźnia o temperaturze 40ºC, spektrofotometr, kuwety kwarcowe, twarde sączki z bibuły o średnicy około 9 cm.

Wykonanie

Otrzymywanie oczyszczonych nukleotydów

Etap Sposób wykonania Uzyskany efekt

I Naważkę 300 mg liści pociąć na 2-3 milimetrowe fragmenty. Kolbę stożkową o pojemności 250 ml zawierającą 100 ml 80-procentowego etanolu przykryć folią aluminiową. Wstawić do wrzącej elektrycznej łaźni wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć, stopniowo dodawać za pomocą pęsety pocięte liście w takim tempie, aby alkohol ciągle wrzał. Kolbę przykryć folią i ogrzewać przez dalsze 4 minuty. Nie dopuścić do znacznego odparowania alkoholu!

Usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów.

II Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić. Pozostałość przenieść do moździerza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95-procentowego etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę przenieść na lejek szklany z sączkiem z bibuły (nie karbowany) i odsączyć alkohol pod słabą próżnią. Moździerz przepłukać 10 ml 95-procentowego etanolu i roztwór przenieść na sączek. Osad na sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć przy słabym podciśnieniu

Usunięcie chlorofilu, lipidów, karetenoidów.

III Osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2 M kwasem nadchlorowym. W celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95-procentowym etanolem.

Usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów oraz kwasu nadchlorkowego.

IV Po osączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej, dodać 5 ml 0,5 M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. Probówkę zamknąć i wstawić na 1 godzinę do łaźni wodnej o temperaturze 40ºC.

Hydroliza RNA do 2´- i do 3´-mononukleotydów, rozpuszczenie ścian komórkowych, białek i DNA.

V Probówkę chłodzić przez 10 minut w wodzie z lodem (mieszając zawartość bagietką), a następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorkowego (temperatura około 0ºC zapobiega hydrolizie DNA) i łagodnie wymieszać bagietką. Przetrzymać probówkę 15 minut w wodzie z lodem.

Powstanie osadu; nadchloranu potasu, DNA, białka, ścian komórkowych.

VI Całość wirować 7 minut w wirówce z chłodzeniem przy 10 500g (12 000obr.· min-1, K 24), supernatant ostrożnie zdekantować do cylinderka o pojemności 10 ml.

Uzyskanie roztworu oczyszczonych 2´- i 3´-nukleotydów.

Oznaczanie ilości nukleotydów Do probówki odmierzyć 1 ml roztworu nukleotydów RNA, dodać 3 ml wody, wymieszać i przenieść do kuwety kwarcowej. Absorbancję zmierzyć przy 260 i 300 nm w spektrofotometrze wyzerowanym na wodę.

Opracowywanie wyników Obliczyć całkowitą ilość RNA w materiale wziętym do ekstrakcji, posługując się równaniem:

mg RNA = 0,031 (A260 – A300)(rozcieńczenie × ml RNA) gdzie: 0,031 – „średnia wartość” absorbancji dla nukleotydów występujących w RNA, A260, A300 – zmierzone wartości przy 260 i 300 nm, rozcieńczenie – w tym przypadku 4 (1ml +3 ml wody), ml RNA – 10 ml. Wyrazić w procentach (w/w) zawartość RNA w badanym materiale.