Praca oryginalna • Original Article

203

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory DiagnosticsDiagn Lab 2015; 51(3): 203-208

Ocena makroprolaktynemii po precypitacji glikolem polietylenowym – porównanie różnych wariantów wirowania

Evaluation of macroprolactinaemia after precipitation with polyethylene glycol – the assessment of the various spin variants

Karolina Beda-Maluga, Aleksandra Cendlewska, Hanna Pisarek, Jacek Świętosławski, Katarzyna Winczyk

Zakład Neuroendokrynologii, Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi

StreszczenieWstęp: Jedną z przyczyn hiperprolaktynemii, czyli podwyższonego stężenia prolaktyny (PRL) we krwi może być obecność znacznej ilości makroprolaktyny (MaPRL). Do wykrywania makrocząsteczek najczęściej stosowana jest metoda precypitacji glikolem polietylenowym (PEG). W literaturze przedmiotu brak jest jednak danych na temat wpływu parametrów wirowania mieszaniny PEG-u i badanej surowicy na ilość cząsteczek MaPRL wytrącanych w procesie precypitacji.Cel: Celem pracy było zbadanie, czy skrócenie czasu wirowania przy odpowiednio zmodyfikowanej prędkości rotacji próbki ma wpływ na ilość osadzonych makrocząsteczek. Materiał i metody: Badaniu poddano 86 surowic: z prawidłowym stężeniem PRL – grupa A, z hiperprolaktynemią nie przekraczającą 100 ng/mL – grupa B i z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/mL – grupa C. Mieszaniny surowicy i glikolu wirowano w trzech wariantach: I – 3000 rpm/30 min, II – 6000 rpm/8 min, III – 9000 rpm/4 min. W nadsączach oznaczono PRL i oceniono zarówno wartość rzeczywi-stego stężenia PRL, jak i procentowy odzysk aktywnej cząsteczki hormonu. Pomiaru stężenia PRL dokonano na analizatorze Immulite 1000 (Siemens).Wyniki: Różnice pomiędzy rzeczywistymi stężeniami PRL i procentowymi odzyskami hormonu uzyskane po zastosowaniu różnych wa-riantów wynosiły: w grupie A – 0,65 ng/mL i 3,18%, w grupie B – 1,30 ng/mL i 2,76%, a w grupie C – 16,54 ng/mL i 4,23%. We wszystkich badanych grupach uzyskane różnice były istotne statystycznie, ale większość z nich mieściła się w granicach błędu zestawu pomiarowego. Wnioski: Zmiana prędkości i czasu wirowania powoduje wytrącanie odmiennych ilości makroform PRL, jednakże małe różnice liczbowe nie zmieniają klinicznej oceny wyniku. Zatem, skrócenie czasu wirowania przy odpowiednio zwiększonej prędkości rotacji pozwala utrzymać właściwą efektywność sedymentacji.

SummaryIntroduction: One of the causes of hyperprolactinemia, that means elevated prolactin (PRL) level, can be a significant amount of macro-prolactin (MaPRL) in the blood. The most common method of macromolecules detection is precipitation with polyethylene glycol (PEG). However, there is no data concerning the influence of spinning parameters of PEG and serum mixture on the number of precipitated MaPRL particles.Aim: The aim was to check whether the shortened spinning time with a suitably modified speed affects the amount of sedimented macromolecules. Material and methods: The study involved 86 sera: with normal serum PRL level – group A, with hyperprolactinaemia below 100 ng/mL – group B and with hyperprolactinaemia above 100 ng/mL – group C. Serum and PEG mixtures were centrifuged at three variants: I – 3000 rpm/30 min, II – 6000 rpm/8 min, III – 9000 rpm/4 min. In supernatants the PRL level was determined and then both the real PRL concentration and the percentage recovery of the hormone were evaluated. PRL concentrations were determined with Immulite 1000 (Siemens).Results: The difference between the real PRL concentration and the percentage recovery of hormone obtained with use different va-riants of spinning were (averaged): in group A – 0.65 ng/ml and 3.18%, in group B – 1.30 ng/ml and 2.76%, in group C – 16.54 ng/mL and 4.23%. In all groups differences were statistically significant, but most of them were within the range of coefficient of variation of used immunotest.Conclusion: Change of spin speed and time causes precipitation of different amounts of PRL macroforms, but the small numerical dif-ferences do not alter the clinical assessment of the results. Therefore, shortened spin time with appropriately increased rotation speed let to maintain the proper sedimentation efficiency.

www.diagnostykalaboratoryjna.eu

204

WstępHiperprolaktynemia, czyli podwyższone stężenie prolaktyny (PRL) we krwi, najczęściej jest objawem zaburzeń czynnościowych lub chorób ogólnoustrojowych takich, jak niedoczynność tarczycy, nie-wydolność wątroby czy nerek. Może także być następstwem zmian organicznych w okolicy podwzgórzowo-przysadkowej (głównie prolactinoma) lub mieć charakter polekowy. Jednak podwyższo-ne stężenie hormonu może również wynikać ze zwiększonej ilości makroform PRL we krwi. Makroprolaktyna (MaPRL) to kompleks monomerycznej cząsteczki hormonu z przeciwciałem anty-PRL. W warunkach fizjologicznych stanowi ona nie więcej niż 2% całko-witej ilości krążącej PRL [1-7]. Makroforma ta nie wywołuje efektów biologicznych, jest jednakże, podobnie jak monomeryczna postać hormonu, rozpoznawana przez przeciwciała zawarte w zestawach diagnostycznych. Z tego powodu, jej zwiększona ilość we krwi może powodować w badaniach laboratoryjnych zawyżenie stężenia PRL do wartości przekraczających zakresy referencyjne i prowadzić do rozpoznania hiperprolaktynemii u osób z prawidłową ilością aktyw-nych biologicznie form hormonu [8-11]. Obecnie więc, w procesie ustalania przyczyn podwyższonego stężenia PRL zarówno Polskie Towarzystwo Endokrynologiczne, jak i Endocrine Society zalecają wykonanie badań oceniających makroprolaktynemię [4, 12]. Naj-częściej stosowaną techniką wykrywania makroform we krwi jest, prosta w wykonaniu i niezbyt kosztowna, precypitacja komplek-sów MaPRL za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Zgodnie z większością publikacji wartość odzysku hormonu mniejsza niż 40% świadczy o dominacji MaPRL w badanej próbce [2, 13, 14]. Jednakże, według ostatnich doniesień literaturowych, bardziej przydatnym diagnostycznie sposobem oceny hiperprolaktynemii jest analiza wartości PRL po precypitacji makroform, tj. rzeczywistego stężenia hormonu. Pomiar rzeczywistego stężenia PRL, czyli ilości monome-rycznej – aktywnej biologicznie formy hormonu, pozwala odróż-nić hiperprolaktynemię prawdziwą od rzekomej (wywołanej przez MaPRL) [15, 16, 17]. Opisywane w literaturze warianty techniczne metody precypitacji są dość zróżnicowane – odmienność dotyczy przede wszystkim parametrów wirowania mieszaniny surowicy i gli-kolu. W pierwszych opublikowanych pracach związanych z tym tematem próbki wirowano z niewielką prędkością przez dość długi czas (nawet do 30 minut). Natomiast obecnie, wraz z rosnącymi moż-liwościami technicznymi aparatury laboratoryjnej, preferowane jest stosowanie krótszego czasu wirowania przy zwiększonej prędkości [10, 18, 19, 20]. Brak jest jednak danych, czy zmiana parametrów rotacji próbek ma wpływ na efektywność sedymentacji makroform PRL. W związku z tym, celem pracy było zbadanie, czy zastosowanie krótszego czasu wirowania próbki (umożliwiające szybsze uzyskanie wyniku) przy odpowiednio zmodyfikowanej prędkości zmienia ilość makrocząsteczek osadzonych po zastosowaniu polietylenoglikolu.

Materiały i metodyDo badania wykorzystano surowice krwi żylnej uzyskane od pacjentów leczonych w Poradni Endokrynologicznej Uniwersy-

teckiego Szpitala Klinicznego im. WAM – Centralnego Szpitala Weteranów w Łodzi lub hospitalizowanych w Klinice Endokryno-logii Katedry Endokrynologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Krew pobierano rano, na czczo, a następnie oznaczano stężenie PRL. Pozostałą surowicę zamrażano w temp. -20°C do momentu przeprowadzenia doświadczenia. Łącznie badaniu poddano 86 próbek, które w zależności od wyjściowego stężenia PRL w suro-wicy krwi podzielono na trzy grupy:

• grupa A: 30 surowic z prawidłowym stężeniem PRL tzn. miesz-czącym się w zakresie wartości referencyjnych podanych przez producenta zestawu Prolactin Immulite (kobiety: 1,9 – 25 ng/mL, mężczyźni: 2,5 – 17 ng/mL);

• grupa B: 44 surowice z podwyższonym stężeniem PRL, w któ-rych wartość hormonu nie przekraczała 100 ng/mL;

• grupa C: 12 surowic z podwyższonym stężeniem PRL, w któ-rych wartość hormonu była wyższa niż 100 ng/mL.

Stężenie PRL w surowicy krwi zarówno przed, jak i po precypitacji PEG-iem oznaczano metodą chemiluminescencji wzmocnionej enzymatycznie (EACLIA) na platformie analizatora immunoche-micznego Immulite 1000 firmy Siemens. Zakres liniowości metody zawarty jest w granicach 0,5 – 150 ng/mL. Współczynnik zmienno-ści CV, określający powtarzalność wyników uzyskanych za pomocą testu Prolactin Immulite, w zależności od wyjściowego stężenia PRL, waha się w granicach 5,7 – 6,8% [21].Do przeprowadzenia precypitacji wykorzystano opis procedury przedstawiony przez Olukogę i wsp. [18] w modyfikacji własnej [17, 22]. Jednakowe objętości (200 µL) świeżo przygotowanego 25% roztworu PEG-u (Sigma-Aldrich, nr kat. P2139) i badanych surowic poddawano 10-sekundowemu mieszaniu na mieszadle typu Vortex i inkubowano przez 10 minut w temperaturze poko-jowej. W celu zbadania wpływu parametrów wirowania na ilość wytrącanych makroform PRL, próbki wirowano stosując trzy różne prędkości i czasy rotacji:

• I wariant: prędkość – 3000 rpm (2000 g), czas – 30 min• II wariant: prędkość – 6000 rpm (8000 g), czas – 8 min• III wariant: prędkość – 9000 rpm (18 000 g), czas – 4 min

Powstały po odwirowaniu nadsącz, zawierający monomeryczne cząsteczki hormonu, mieszano z diluentem w celu uzyskania koń-cowego 10-krotnego rozcieńczenia i, podobnie jak w surowicy natywnej (przed precypitacją PEG-iem), oznaczano stężenie PRL. Następnie oceniano wartość rzeczywistego stężenia PRL i procen-towy odzysk aktywnej biologicznie cząsteczki hormonu, wyliczony wg następującego wzoru [2]:

gdzie: PRLPEG – stężenie prolaktyny w supernatancie uzyskanym po precypitacji PEG-iem, PRL – stężenie prolaktyny w próbce natywnej surowicy

Słowa kluczowe: hiperprolaktynemia, makroprolaktyna, polietylenoglikol, precypitacja.Key words: hyperprolactinaemia, macroprolactin, polyethylene glycol, precipitation.

% odzysku PRL = x 100%PRLPEG [ng/mL]PRL [ng/mL]

205

Diagn Lab 2015; 51(3): 203-208

Część doświadczalną pracy wykonano w Pracowni Diagnostyki Hormonalnej Laboratorium Endokrynologicznego Uniwersytec-kiego Szpitala Klinicznego im. Wojskowej Akademii Medycznej – Centralnego Szpitala Weteranów w Łodzi. Na przeprowadzenie badania uzyskano zgodę Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycz-nego w Łodzi z dnia 19.11.2013 roku nr RNN/732/13/KB.

Uzyskane dane zapisano w arkuszach programu Excel (MS Offi-ce 2007). Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu statystycznego Statistica 10. Przeprowadzono test różnic wartości średnich stężeń dla poszczególnych wariantów wirowania. Za poziom istotności przyjęto p<0,05. Na podstawie danych po-danych przez producenta zestawu wyznaczono zależność funk-cyjną wartości współczynnika zmienności wewnątrzseryjnej od mierzonej wielkości. Korzystając z uzyskanego wzoru, obliczono wielkości przedziałów, zbadano jaki odsetek wyników mieścił się w granicach błędu metody EACLIA.

WynikiGrupę badaną stanowiły 74 kobiety i 12 mężczyzn w wieku od 19 do 83 lat diagnozowanych z powodu zaburzeń hormonalnych o podłożu organicznym (guz przysadki, niedoczynność przednie-

go płata przysadki), czynnościowym (choroba tarczycy, zespół policystycznych jajników) lub wynikających z przyjmowania leków (tabela I).W  grupie osób z  prawidłowym wyjściowym stężeniem hor-monu najwyższe wartości zarówno rzeczywistych stężeń, jak i  procentowych odzysków PRL po precypitacji z  zastosowa-niem poszczególnych wariantów wirowania obserwowa-no głównie (24/30 surowic) w  przypadku wirowania próbek z  najmniejszą prędkością i  przez najdłuższy okres czasu tj. 3000 rpm/30min. Natomiast najniższe stężenia i  najmniej-sze procentowe odzyski hormonu odnotowano w  po-nad połowie surowic (18/30) wirowanych z  prędkością 9000 rpm przez 4 minuty. Wśród 44 surowic z hiperprolaktynemią nie przekraczającą 100 ng/mL, najwyższe rzeczywiste stężenia i procentowe odzyski hormonu po precypitacji uzyskano w 20 próbkach wirowanych wg wariantu II, w 16 surowicach po zasto-sowaniu wariantu III i tylko w 8 przy wykorzystaniu parametrów wariantu I. Z kolei, najniższe stężenia i procentowe odzyski PRL odnotowano głównie (32 próbki) po wirowaniu z prędkością 3000 rpm przez 30 minut (I wariant). W grupie pacjentów z wyj-ściowym stężeniem PRL powyżej 100 ng/mL najwyższe warto-ści stężeń i procentowych odzysków monomeru hormonu po

precypitacji PEG-iem od-notowano głównie (10/12 surowic) po wirowaniu z  największą prędkością w  najkrótszym czasie (9000 rpm/4 min), nato-miast większość wartości najniższych (9/12 surowic) stwierdzono w  próbkach wirowanych z prędkością 3000 rpm przez 30 minut. Podsumowanie wyników uzyskanych w trzech róż-nych wariantach wirowa-nia przedstawia tabela II.Oceniając bezwzględne wartości różnic pomiędzy stężeniami i procentowymi odzyskami PRL po wirowa-niu wg poszczególnych wariantów, w grupie A i C największe różnice odnoto-wano pomiędzy wynikami otrzymanymi po zastoso-waniu parametrów warian-tu I i III, natomiast w grupie B – po wirowaniu według wariantu I  i  II. We wszyst-kich badanych grupach najmniejsze bezwzględne różnice między stężeniami i procentowymi odzyskami hormonu po precypitacji

Tabela I. Charakterystyka osób objętych badaniem.

grupa APRL ≤ 25 (K)

PRL ≤ 17 (M)*

grupa BPRL ≤ 100

grupa CPRL > 100 Razem

K 25 41 8 74

M 5 3 4 12

wiek [lata](średnia)

23 – 66(~40)

19 – 83(~35)

26 – 79(~45)

19 – 83(~38)

PRL [ng/mL](średnia ± SEM)

16,9 – 24,4(20,0 ± 0,89)

31,8 – 99,4(49,2 ± 2,77)

113 – 1830(370,7± 142,59)

16,9 – 1830(112,9 ± 34,73)

* – zakresy wartości prawidłowych podane przez producenta zestawu Prolactin Immulite, kobiety: 1,9 – 25 ng/mL, mężczyźni: 2,5 – 17 ng/mL; PRL – stężenie prolaktyny w surowicy krwi; K – kobieta; M – mężczyzna.

Tabela II. Podstawowe parametry statystyczne wyliczone dla rzeczywistych stężeń PRL [ng/ml] i dla wartości odzysków [%] otrzymanych po zastosowaniu różnych wariantów wirowania próbek w poszczególnych grupach badanych i w całej populacji.

stężenie PRL / odzysk średnia SEM max min

grup

a A

wariant I 11,82 / 59,9 1,43 / 6,8 19,00 / 90,5 4,84 / 24,1

wariant II 11,33 / 57,5 1,35 / 6,4 17,80 / 82,4 4,90 / 21,6

wariant III 11,02 / 55,8 1,31 / 6,3 17,10 / 84,4 4,88 / 22,5

grup

a B wariant I 29,16 / 60,6 1,74 / 2,2 53,00 / 76,0 8,97 / 14,4

wariant II 30,17 / 62,5 1,88 / 2,3 54,10 / 84,2 10,00 / 16,1

wariant III 29,84 / 62,0 1,78 / 2,3 54,00 / 80,1 10,10 / 16,3

grup

a C wariant I 269,88 / 71,7 101,27 / 5,4 1336,00 / 97,3 33,60 / 14,9

wariant II 283,53 / 73,3 108,30 / 5,3 1413,00 / 92,2 34,80 / 15,5

wariant III 289,58 / 76,3 109,23 / 5,6 1439,00 / 102,0 38,30 / 17,0

cała

gru

pa wariant I 77,65 / 62,9 25,78 / 2,2 1336,00 / 97,3 4,84 / 14,4

wariant II 81,09 / 63,9 27,46 / 2,3 1413,00 / 92,2 4,90 / 15,5

wariant III 82,14 / 64,0 27,81 / 2,3 1439,00 / 102 4,88 / 16,3

www.diagnostykalaboratoryjna.eu

206

zaobserwowano pomiędzy wartościami uzyskanymi po wirowa-niu próbek wg wariantu II i wariantu III – tabela III.

W celu oceny, czy bezwzględne różnice pomiędzy stężeniami PRL i pomiędzy wartościami procentowego odzysku hormonu po precypitacji makroform są istotne statystycznie, przeprowa-

dzono test różnic. Wykazano, że w grupach badanych znamienne statystycznie (tzn. poziom istotności p<0,05) są różnice pomiędzy

wynikami uzyskanymi po wirowaniu wg I i III warian-tu, a dodatkowo w grupach A  i  B – różnice pomiędzy wartościami otrzymanymi po zastosowaniu warian-tów I i II.

Wyliczono, jaki procent wyjściowej wartości PRL stanowi różnica między rzeczywistymi stężeniami hormonu w danej próbce otrzymanymi po zastoso-waniu dwóch wariantów wirowania – tj. względne różnice pomiędzy rze-czywistymi stężeniami PRL. Wyniki te  porówna-no z przeciętną wartością współczynnika zmienności

(CV = 6%) podaną przez producenta zestawu Prolactin Immulite dla oznaczeń hormonu metodą EACLIA. Wykazano, że spośród 258 wyników (86 surowic x 3 oznaczenia) PRL po precypitacji,

Tabela III. Parametry statystyczne wyliczone dla wartości bezwzględnych różnic pomiędzy wynikami uzyskanymi po zastosowaniu trzech badanych wariantów wirowania w poszczególnych grupach badanych i w całej populacji.

stężenie PRL / odzysk średnia max min

grup

a A

w. I vs. w. II 0,61 / 3,00 1,36 / 8,05 0,06 / 0,31

w. I vs. w. III 0,86 / 4,33 1,90 / 9,14 0,04 / 0,21

w. II vs. w. III 0,42 / 2,20 1,20 / 6,86 0,02 / 0,10

grup

a B w. I vs. w. II 1,49 / 3,00 4,40 / 8,19 0,00 / 0,00

w. I vs. w. III 1,25 / 2,79 3,60 / 9,60 0,10 / 0,13

w. II vs. w. III 1,18 / 2,49 5,40 / 8,06 0,00 / 0,00

grup

a C w. I vs. w. II 19,54 / 4,29 77,00 / 11,67 1,00 / 0,53

w. I vs. w. III 19,70 / 4,67 103,00 / 8,95 1,00 / 0,71

w. II vs. w. III 10,39 / 3,75 42,00 / 16,34 0,00 / 0,00

cała

gru

pa w. I vs. w. II 5,20 / 3,27 77,00 / 11,67 0,00 / 0,00

w. I vs. w. III 5,13 / 3,47 103,00 / 9,60 0,04 / 0,13

w. II vs. w. III 3,02 / 2,71 42,00 / 16,34 0,00 / 0,00

Rycina 1. Rozkład względnych wartości różnic [%] pomiędzy stężeniami PRL otrzymanymi po zastosowaniu trzech wariantów wirowania próbki w zależności od wyj-ściowego stężenia hormonu i w porównaniu ze współczynnikiem zmienności (CV) podawanym przed producenta testu Immulite 1000.

207

Diagn Lab 2015; 51(3): 203-208

210 (81,4%) wartości różnic mieściły się w zakresie błędu metody oznaczania hormonu (±6%), a w 48 (18,6%) przypadkach różnice te były większe niż wartość współczynnika CV (rycina 1).

DyskusjaWykrywanie MaPRL za pomocą metody precypitacji PEG-iem stosowane jest od lat 90-tych ubiegłego wieku. Początkowo próbki wirowano przez dość długi czas – około 30 minut ze stosunkowo małą prędkością – około 2000 g [8, 18, 23]. Z ko-lei, w ostatnio publikowanych pracach stosowano przeważnie krótki czas (od 2 do 10 minut) i dużą prędkość wirowania (9500 – 14 000 g) [10, 24, 25]. W metodyce publikowanych prac brak jest jednakże uzasadnienia wyboru danego wariantu wirowania. Można założyć, że modyfikacje techniczne procesu precypitacji z jednej strony wynikają z rosnących możliwości aparaturowych, a z drugiej – są związane ze stawianymi współczesnej diagno-styce laboratoryjnej oczekiwaniami jak najszybszego uzyskania wyniku badania. Co więcej, w piśmiennictwie brak jest danych na temat wpływu różnych parametrów wirowania na efektywność precypitacji PEG-iem. Jest to dość zastanawiające, gdyż wiadomo, że od ilości osadzonych makrocząsteczek zależy wartość rzeczy-wistego stężenia PRL i jej procentowego odzysku. Na  podstawie tych wartości stwierdza się także, czy przyczyną hiperprolakty-nemii jest nadmiar MaPRL, czy nadmiar aktywnej biologicznie – monomerycznej postaci PRL we krwi. Brak danych literaturo-wych na temat zależności efektywności precypitacji od czasu i prędkości wirowania ogranicza prowadzenie typowej dyskusji, dlatego w tej części pracy zostaną dokładnie przeanalizowane wyniki badań z uwzględnieniem ich wykorzystania w rutynowej pracy laboratoryjnej. Ustalając parametry dla poszczególnych wariantów wirowania, zgodnie z  prawami fizyki przyjęto, że w standardowym roztworze ilość makrocząsteczek osadzonych przy zastosowaniu różnych parametrów wirowania powinna być porównywalna, o ile parametry te zostaną ustalone w oparciu o równanie Lamma opisujące natężenie sedymentacji w zależ-ności od prędkości i czasu wirowania. Według tego równania, skracając czas wirowania i dążąc do całkowitego osadzenia się wytrąconych makrocząsteczek, należy odpowiednio zwiększyć prędkość rotacji [26]. Zatem, odpowiedni dobór prędkości i czasu wirowania powinien skutkować otrzymaniem porównywalnych wyników. Wyniki naszej pracy wskazują, że w grupie osób z prawi-dłowym stężeniem PRL najwięcej makroform uległo sedymentacji podczas wirowania z największą prędkością w krótkim czasie, a najmniej przy zastosowaniu najmniejszej prędkości i długiego okresu rotacji próbek. Z drugiej strony, wśród pacjentów z hiper-prolaktynemią przekraczającą 100 ng/mL zależność pomiędzy efektywnością sedymentacji a parametrami wirowania była od-wrotna. Stwierdzone różnice wynikają prawdopodobnie z fizycz-nych oddziaływań cząsteczek podczas procesu sedymentacji. Jeśli ilość cząstek w roztworze jest niewielka – tak jak w przypadku próbek z prawidłowymi stężeniami PRL – to osadzanie przebiega w sposób swobodny, gdyż na opadające cząsteczki nie oddziałują inne molekuły znajdujące się w roztworze. W przypadku, gdy stę-żenia hormonu są wysokie – tak jak u osób z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/mL – sedymentacja jest ograniczona, bowiem

duże zagęszczenie molekuł powoduje, że cząstki w wyniku wza-jemnych oddziaływań utrudniają swobodną sedymentację [27]. Możemy założyć, że w przypadku dużej ilości cząstek w surowicy krwi, nie prędkość a czas wirowania ma kluczowe znaczenie dla efektywności sedymentacji i wówczas zastosowanie dłuższego okresu rotacji pozwala wytrąconym przez PEG makrocząsteczkom na właściwą sedymentację. Potwierdzeniem powyższego założe-nia jest także fakt, że w całej grupie ze średnimi wartościami PRL (do 100 ng/mL) nie zaobserwowano dominującej zależności mię-dzy zmianą parametrów wirowania a ilością osadzanych cząstek. Jednakże, w próbkach ze stężeniem PRL przekraczającym 50 ng/mL większą efektywność wirowania stwierdzono po zastosowaniu niskiej prędkości i długiego czasu rotacji. Uzyskane przez nas wartości wskazują, że zarówno stężenia, jak i procentowe odzyski PRL po precypitacji PEG-iem różnią się w poszczególnych próbkach w zależności od zastosowanego wa-riantu wirowania. Przeprowadzona analiza wykazała, że różnice te, w większości przypadków, są znamienne statystycznie, co sugero-wałoby, że modyfikacja procedury precypitacji glikolem wpływa na efektywność przeprowadzanego procesu. Jednakże, oceniając wartości rzeczywistych stężeń i procentowych odzysków hormo-nu uzyskane w trzech badanych wariantach, można zauważyć, że są one zbliżone. U osób ze stężeniami PRL poniżej 100 ng/mL otrzymane wartości różnią się, co najwyżej, o kilka procent lub ng/mL. W grupie chorych z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/mL odnotowano większe rozbieżności pomiędzy uzyskanymi warto-ściami, lecz rząd wielkości zarówno rzeczywistych stężeń, jak i pro-centowych odzysków hormonu nie uległ zmianie. Sugeruje to za-tem, że skrócenie czasu rotacji przy odpowiednio dostosowanej prędkości, pozwala uzyskać podobną efektywność precypitacji. Należy także zaznaczyć, że większość względnych różnic (81,4%) między oznaczeniami PRL po precypitacji PEG-iem mieściła się w granicach błędu zestawu pomiarowego dla PRL. Wydaje się zatem, że różnice wynikające z zastosowania różnych parametrów wirowania nie mają, większego niż zmienność metody, wpływu na uzyskany wynik. Zależności zaobserwowane w poszczególnych grupach bada-nych (szczególnie w próbkach z prawidłowym stężeniem PRL i próbkach ze stężeniem hormonu przekraczającycm 100 ng/mL) mogły wynikać ze wspomnianych oddziaływań fizycznych pomiędzy cząsteczkami, ale mogły także być spowodowane wy-trącaniem przez PEG nie tylko cząsteczek MaPRL, ale także różnych izoform PRL, m.in. dimerów czy oligomerów. Przypuszczalnie, stosowanie wysokich obrotów podczas wirowania w przypadku surowic z prawidłowym stężeniem PRL, ale zawierających dimery i/lub oligomery hormonu, może powodować szybsze opadanie cząsteczek, szczególnie tych o większej masie cząsteczkowej. Tłumaczyło by to uzyskanie najniższych stężeń PRL i najmniej-szych procentowych odzysków w przypadku wirowania próbek z największą prędkością, ale przez krótki czas (wariant III). Z kolei, w surowicach z hiperprolaktynemia przekraczającą 100 ng/mL najwięcej cząsteczek ulegało osadzeniu po wirowaniu z niewielką prędkością, ale przez dłuższy czas. Jeżeli założymy, że w próbkach tych występowały dimery i/lub oligomery PRL, można przypusz-czać, że większe znaczenie w procesie sedymentacji cząsteczek

www.diagnostykalaboratoryjna.eu

208

ma ich zagęszczenie w roztworze i czas rotacji próbek niż wystę-powanie różnych postaci hormonu. Jednakże zweryfikowanie tej tezy wymaga dalszych szczegółowych badań. Podsumowując, można stwierdzić, że ze względu na różnice w se-dymentacji cząsteczek w zależności od ich zagęszczenia w roz-tworze, optymalnym rozwiązaniem metodycznym dla procedury precypitacji byłoby dopasowywanie parametrów wirowania do wyjściowego stężenia PRL. Jednakże, z praktycznego punktu widzenia taki sposób postępowania zdecydowanie utrudniłby codzienną pracę laboratoryjną. Z drugiej strony, wykazano, że modyfikacja parametrów wirowania nie powoduje istotnych dia-gnostycznie i klinicznie różnic między wynikami pomiarów hor-monu, jeżeli prędkość i czas rotacji próbek są dobrane względem siebie zgodnie z prawami fizyki. Dlatego też, w rutynowej pracy laboratoryjnej poprawne byłoby stosowanie dla wszystkich bada-nych próbek jednego wariantu z krótkim czasem wirowania i od-powiednio zwiększoną prędkością rotacji. Pozwoliłoby to spełnić wymagania w zakresie szybkości wykonywania oznaczeń stawiane współczesnej diagnostyce laboratoryjnej, przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniej jakości badań.

Praca finansowana z działalności statutowej Zakładu Neuroendo-krynologii nr 503/5-020– 02/503-01.

Piśmiennictwo1. Pawlikowski M. Zarys Endokrynologii Klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa 1996; 23-40.

2. Bartoszewicz Z. Makroprolaktynemia – hiperprolaktynemia charakteryzująca

się obecnością wysokocząsteczkowej makroprolaktyny. LabForum 2003; 14: 4-5.

3. Lewiński A. Podwzgórze i przysadka [w:] Endokrynologia ogólna i kliniczna.

Greenspan FS, Gardner DG, red. nauk. wyd. pol. Lewiński A. Wydawnictwo

Czelej, Lublin 2004; 123-125.

4. Zgliczyński W, Zdunowski P. Hiperprolaktynemia – pułapki w oznaczaniu PRL.

Endokrynol Pol 2005; 6: 980-985.

5. Karasek M, Pawlikowski M, Lewiński A. Hiperprolaktynemia: przyczyny, diagno-

styka, leczenie. Endokrynol Pol 2006; 6: 656–662.

6. Jeske W. Przyczyny rozbieżności wyników oznaczeń prolaktyny i  powody

prawdziwej albo pozornej niezgodności ze stanem klinicznym. Endokrynol

Pol 2008; 59: 30-32.

7. Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z elementami bio-

chemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Wydanie III poprawione

i uzupełnione. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010: 120-126, 777-778.

8. Smith TP, Suliman AM, Fahie-Wilson MN, et al. Gross-variability in the detection

of prolactin in sera containing big big prolactin (macroprolactin) by commercial

immunoassays. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 5410–5415.

9. De Schepper J, Schiettecatte J, Velkeniers B, et al. Clinical and biological charac-

terization of macroprolactinemia with and without prolactin-IgG complexes.

Eur J Endocrinol 2003; 149: 201-207.

10. Beltran L, Fahie-Wilson MN, McKenna TJ, et al. Serum total prolactin and mo-

nomeric prolactin reference intervals determined by precipitation with poly-

ethylene glycol: evaluation and validation on common immunoassay platforms.

Clin Chem 2008; 54: 1673-1681.

11. Beda K, Winczyk K. Makroprolaktyna – występowanie, metody diagnostyczne

i znaczenie kliniczne. Fol Med Lodz 2009; 36: 87-110.

12. Melmed S, Casanueva F, Hoffman A, et al. Diagnosis & Treatment of Hyperpro-

lactinemia: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol

Metab 2011; 96: 273–288.

13. Leslie H, Courtney CH, Bell PM, et al. Laboratory and clinical experience in 55

patients with macroprolactinemia identified by a simple polyethylene glycol

precipitation method. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 2743-2746.

14. Germano L, Mormile A, Filtri L, et al. Evaluation of polyethylene glycol precipita-

tion as screening test for macroprolactinemia using Architect immunoanalyser.

Biol Spéc 2005; 20: 402-407.

15. Suliman AM, Smith TP, Gibney J, et al. Frequent misdiagnosis and mismanage-

ment of hyperprolactinemic patients before the introduction of macroprolactin

screening: application of a new strict laboratory definition of macroprolactine-

mia. Clin Chem 2003; 49: 1504-1509.

16. Fahie-Wilson M, Smith TP. Determination of prolactin: The macroprolactin pro-

blem. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2013; 27: 725–742.

17. Beda-Maluga K, Pisarek H, Komorowski J, et al. Evaluation of hyperprolactina-

emia with the use of the intervals for prolactin after macroforms separation.

J Physiol Pharmacol 2014: 65: 359-364.

18. Olukoga AO, Kane JW. Macroprolactinaemia: validation and application of

the polyethylene glycol precipitation test and clinical characterization of the

condition. Clin Endocrinol 1999; 51: 119-126.

19. Rivero A, Alonso E, Grijalba A. Decision cut-off of the polyethylene glycol pre-

cipitation technique in screening for macroprolactinemia on Immulite 2000.

Clin Chem Lab Med 2004; 42: 566-568.

20. Jeske W, Glinicki P, Kapuścińska R, et al. 140 Cases of Macroprolactinemia: Se-

lected Clinical and Technical Laboratory Aspects. Int J Endocrinol Metab 2012;

10: 394-398.

21. Materiały informacyjne dołączone do zestawu Immulite/Immulite 1000 Prolac-

tin. Siemens Healthcare Diagnostic Products.

22. Beda-Maluga K, Pisarek H, Komorowski J, et al. The detection of macroprolactin

by precipitation and ultrafiltration methods. Endokrynol Pol 2011; 62: 529-536.

23. Hattori N. The frequency of macroprolactinemia in pregnant women and the

heterogeneity of its etiologies. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 586-590.

24. Kavanagh-Wright L, Smith TP, Gibney J, et al. Characterization of macroprolactin

and assessment of markers of autoimmunity in macroprolactinaemic patients.

Clin Endocrinol 2009; 70: 599-605.

25. Hattori N, Adachi T, Ishihara T, et al. The natural history of macroprolactinaemia.

Eur J Endocrinol 2012; 166: 625-629.

26. www.brain.fuw.edu.pl

27. http://kip.po.opole.pl/files/C-7.pdf; Badanie procesu sedymentacji [w:] Mecha-

nika płynów – laboratorium. http://www.pomoc-dydaktyczna.tce.put.poznan.pl

Adres do korespondencji:dr n. med. Karolina Beda-MalugaZakład NeuroendokrynologiiMiędzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i MolekularnejUniwersytet Medyczny w Łodzi91-425 Łódź, ul. Sterlinga 3tel. +48 42 6644371e-mail: karolina.beda@umed.lodz.pl

Zaakceptowano do druku: 30.10.2015