Zależne od TP53 zróżnicowanie odpowiedzi

na promieniowanie jonizujące - badanie na poziomie transkryptu

MW

CEL PRACY

Celem niniejszej pracy było zbadanie jakie cechy strukturalne transkryptów mogą korelować ze zmianami po napromieniowaniu w komórkach HCT 116, oraz wpływu białka P53 na stabilizację i destabilizację transkryptów.

Zakres pracy obejmuje:

Analizę długości i składu nukleotydowego części kodującej i końców 3’ (3’ UTR) transkryptów

Obecności motywów sekwencyjnych wiążących miRNA

Komplementarności motywów wiążących miRNA obecnych w sekwencji kodującej i końca 3’

Zbadanie struktury genów o przeciwnych kierunkach zmian ekspresji w liniach HCT 116 p53+/+ i HCT 116 p53 -/-

Materiał analizowanyDane z mikromacierzy AffyMetrix dotyczace

transkryptomu komórek:HCT_p53PK1.CEL P KHCT_p53MK1.CEL N KHCT_p53P0h.CEL P 0HCT_p53M0h.CEL N 0P-pozytywny N-zmutowane (p53-/-) K-kontrola, 0h-czas bezpośrednio po

napromienieniu.22283 zestawów sond Affymertix

Elementy analizy

Wczytanie danych i normalizacja oraz usunięcie szumu

Podział genów na grupy dla kryterium zmian 150%:

Grupa I geny których ekspresja wzrosła

Grupa II geny których ekspresja zmalała

Grupa III geny których ekspresja nie uległa zmianie

Zmiany poziomu transkryptomu pod wpływem promieniowania w komórkach HCT 116

Analiza długości sekwencji kodujących transkryptów, porównanie grupy I i II dla

linii HCT116 p53+/+Wykres średnich długości sekwencji kodujących po odrzuceniu wartości odstających

Wyniki testu Welcha i Wilcoxona nie wykazują istotnej statystycznie różnicy w długościach części kodującej transkryptów pomiędzy Grupą I (UP) i Grupą II (DOWN)

Średnia: 1685,6

Średnia: 1593,6

0

1000

2000

DOWN UP

Dłu

go

ść (

pz)

Analiza długości sekwencji kodujących transkryptów, porównanie grupy I i II dla

linii HCT116 p53-/-Wykres średnich długości sekwencji kodujących po odrzuceniu wartości odstających

Wyniki testu Welcha i Wilcoxona wykazują różnicę istotną statystycznie w długościach części kodującej transkryptów pomiędzy Grupą I (UP) i Grupą II (DOWN)

Średnia: 1747,9

Średnia: 1587,3

0

1000

2000

DOWN UP

Dłu

go

ść (

pz)

Podobna analiza wykonana dla sekwencji 3’ UTR transkryptów nie wykazała istotnych różnic długości między grupami w

żadnej z linii komórek

Porównanie składu nukleotydowego sekwencji

kodujących i końca 3’ w genach „UP” i „DOWN” P53+/+ CDS P53-/-

P53+/+ 3’ UTR P53-/-

0,00

10,00

20,00

30,00

A T G C

%

DOWN

UP

0,00

10,00

20,00

30,00

A T G C

%

DOWN

UP

0,00

10,00

20,00

30,00

A T G C

%

DOWN

UP

0,00

10,00

20,00

30,00

A T G C

%

down

up

Transkrypty których poziom zmieniał się różnie w komórkach zawierających i nie

zawierających białka P53 (grupa transkryptów „różnicujacych”)

Ilość genów o zmiennej ekspresji w zależności od linii komórkowej - „geny różnicujące”.

Ilość genów których ekspresja wzrosła w HCT 116 p53 +/+ i zmalała w HCT 116 p53 -/- (grupa R1)

Ilość genów których ekspresja zmalała w HCT 116 p53 +/+ i wzrosła w HCT 116 p53 -/-(grupa R2)

55 54

Analiza długości sekwencji 3’ UTR w transkryptach grup R1 i R2

Długości sekwencji 3’ UTR grup R1 i R2 różnią się na poziomie istotności p=0.057 (test Wilcoxona)

Średnia: 1258

Średnia: 1653,2

0

1000

2000

HCT 116 p53 +/+ UP, p53 -/- DOWN ; HCT 116 p53 +/+ DOWN, p53 -/- UP

Dłu

go

ść (

pz)

Wyszukiwanie motywów miRNA w transkryptach

714 miRNAmirnada (open source Linux)http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do

Parametry:Score cutoff S>= 140 Energy cutoff E<= -7.0 Gap opening: -9.0 Gap extension -4.0

Przykłady miRNA o największej grupie genów docelowych

Motywy rozpoznawane przez miRNA występują w częściach 3’ UTR i sekwencjach kodujących

Pierwsze 10 miRNA posortowane wg największej ilości transkryptów mogących dołączać miRNA do sekwencji końca 3’ dla genów których ekspresja wzrosła w HCT 116 p53-/-.

miRNA

Liczba transkryptów docelowych w 3’ UTR

Liczba transkryptów docelowych w CDS

hsa-miR-608 472 610

hsa-miR-1207-5p 449 508

hsa-miR-612 435 621

hsa-miR-765 427 494

hsa-miR-762 414 569

hsa-miR-661 413 573

hsa-miR-637 410 637

hsa-miR-939 410 572

hsa-miR-1252 397 265

hsa-miR-185 395 259

Nie wszystkie motywy są całkowicie komplementarne do swoich miRNA

0,00

100,00

200,00

p53 minus p53 plus

Śre

dn

ia w

art

oś

ć d

op

as

ow

an

ia

UP

DOWN

Wskaźnik dopasowania motywów miRNA jest jednakowy dla transkryptów w grupach UP i DOWN

Wskaźnik dopasowania motywów miRNA różni się dla motywów obecnych w częsciach kodujacych i cześciach 3’ UTR transkryptów we wszystkich badanych grupach (p<0.05, testy Wilcoxona i Welcha)

0,00

100,00

200,00

3' UTR CDS

Śre

dn

ia w

arto

ść d

op

aso

wan

ia

146,92

187,48

WNIOSKI

Stabilizacja lub destabilizacja transkryptów w komórkach HCT 116 nie jest związana z mechanizmami operującymi na końcu 3’ transkryptu ponieważ nie obserwujemy różnic w strukturze końców 3’ transkryptów, których ekspresja wzrosła lub zmalała pod wpływem promieniowaniaIstnienie różnicy w długości części kodującej transkryptów ulegających stabilizacji (UP) lub destabilizacji (DOWN) sugeruje, że w komórkach nie zawierających białka P53 istnieją czynniki stabilizujące, oddziaływujące z częścią kodującą transkryptu.We wszystkich badanych grupach istnieją różnice pomiędzy częścią kodująca i 3’ UTR w dopsowaniu motywów rozpoznawanych przez miRNA (w częsci kodującej motywy są znacznie lepiej dopasowane – charakteryzuje je wyższy współczynnik)

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ