Nowoczesne systemy ekspresji

genów

Ekspresja genów

w organizmach żywych

GEN - pojęcia podstawowe

Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą

do wytworzenia jednego rodzaju białka (definicja jest prawdziwa w

odniesieniu do większości genów komórki, ale istnieją też geny, które

kodują na przykład cząsteczki rRNA i tRNA)

Cistron - sekwencja kodująca RNA, której ekspresja prowadzi do

powstania pojedynczego łańcucha polipeptydowego

promotor sekwencja kodująca RNA terminator

gen

GEN - pojęcia podstawowe

Promotor

Część genu, do której przyłączają się czynniki

transkrypcyjne i polimeraza RNA. Jest jedną z części

regulatorowych genu. Od przyłączenia polimerazy

RNA do promotora rozpoczyna się transkrypcja

Terminator

Odcinek genu, na którym kończy się transkrypcja

GEN - pojęcia podstawowe

Sekwencje regulatorowe – części genu, które nie zawierają informacji genetycznej, ale kierują jej odczytywaniem

wzmacniacze ekspresji (Wz)

wygaszacze ekspresji (Wy)

inne - niezwiązane z działaniem czynników transkrypcyjnych, np. sekwencje liderowe DNA

Ekspresja genów

Ekspresja genów może zachodzić z różną wydajnością w

zależności od środowiska i warunków

AA AA A A B

gen a gen b

Ekspresja genów w organizmach

prokariotycznych i eukariotycznych

Prokariota

Transkrypcja Transkrypcja jest połączona z

translacją

Geny transkrybowane są przez jeden rodzaj polimerazy RNA

Pod kontrolą jednego promotora może znajdować się więcej niż jeden cistron – taką jednostkę ekspresyjną nazywamy operonem

Eukariota

Transkrypcja Transkrypcja jest rozdzielona

od translacji

Geny są transkrybowane przez trzy różne polimerazy RNA

Pod kontrolą jednego promotora znajduje się jeden cistron

Systemy ekspresji (nadekspresji)

genów

Nadekspresja białek - sens zastosowania

Eksperyment – badanie represora lac

10 cząstek białka w jednej komórce

1 μmol cząsteczek potrzebny do badań biochemicznych

1 μmol = 6x1017 cząsteczek białka

Czyli do eksperymentu potrzeba 6x1016 komórek

1 litr hodowli E. coli w fazie stacjonarnej zawiera ~4x1011

komórek

Czyli (zakładając 100% wydajność procesu oczyszczania)

1 μmol represora lac

= 150000 litrów hodowli E. coli

Zastosowanie

Badania podstawowe:

określenie struktury białek (NMR, krystalografia)

enzymologia

manipulacje genetyczne (mutageneza)

badanie oddziaływań międzycząsteczkowych

Zastosowania terapeutyczne i komercyjne:

medycyna

diagnostyka

przemysł chemiczny

przemysł spożywczy

Schemat postępowania

Klonowanie eukariotycznego cDNA lub genu

prokariotycznego

(Przeklonowanie sekwencji do wektora ekspresyjnego)

Przeniesienie konstruktu do komórek

gospodarza/komórek

Charakterystyka produktu (białka):

oczyszczanie

testy enzymatyczne

Przygotowanie do eksperymentu

Wybór gospodarza

systemy in vivo (przykłady)

Escherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

Pichia pastoris

hodowla tkankowa komórek ssaczych

organizmy transgeniczne

wyspecjalizowane systemy in vitro

Przygotowanie do eksperymentu

Wybór wektora

wydajność

sposób oczyszczania

modyfikacje potranslacyjne

konieczność przeprowadzenia modyfikacji genu/cDNA

koszt

stopień trudności

http://www.biotech-

nantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22

http://www.biotech-

nantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22

Przygotowanie do eksperymentu

wybór protokołu klonowania/ekspresji

rodzaj białka

rozpuszczalność i stabilność białka

miejsce produkcji białka (cytoplazma, pożywka)

sposób oczyszczania białka

Etap I

– poszukiwanie informacji

Źródła informacji gdy sekwencja genu

jest znana

1. Publikacje naukowe

― zawierają informacje o systemach ekspresyjnych użytych do

ekspresji danego genu

― powinny zawierać odnośnik do sekwencji genu w postaci

tzw. „Accession No.” dla wybranej bazy danych dostępnej w

internecie np. NCBI (www.ncbi.nih.gov)

Źródła informacji gdy sekwencja genu

jest znana

2. Bazy sekwencji nukleotydowych

― NCBI: National Centre for Biotechnology Information (Rockville Pike, Bethesda)

― Dostęp do sekwencji genów można uzyskiwać poprzez:

podanie accession no. uzyskany z publikacji (Vonakis et al. J. Biol. Chem. 272 (38), 24072-24080 (1997))

Accession No: AF000301

Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja

jego nie jest znana –

ale znana jest sekwencja białka lub jej fragmenty

Sekwencję białka mozna poznać dysponując jego

czystym preparatem dzięki ograniczonej

proteolizie i sekwencjonowaniu uzyskanych

peptydów

Jak zdobyć informacje o genie jeśli jego

sekwencja nie jest znana

W oparciu o sekwencje białka można zaprojektować

zdegenerowane startery, które użyjemy w reakcji PCR i

uzyskamy:

Który prążek wybrać do

sekwencjonowania???

Należy oprzeć się o

przybliżenie: 1 kD

białka – 333 par zasad

DNA i znaną masę

białka (w kD)

Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja jego nie

jest znana i nie jest znana sekwencja białka ale:

Znamy właściwości fizykochemiczne białka, przede

wszystkim jego Mw:

W przypadku Prokariota możemy stworzyć bibliotekę

DNA genomowego w celu uzyskania sekwencji

W przypadku Eukariota możemy stworzyć bibliotekę DNA

genomowego w celu uzyskania sekwencji

Jak zdobyć informacje o genie jeśli nie jest

znana jego sekwencja, ani sekwencja

kodowanego przez niego białka

Wykorzystując dane uzyskane z bibliotek cDNA

możemy uzyskać sekwencję genów interesujących nas

białek

Jak zdobyć informacje o genie, jeśli znamy

tylko jego źródło?

Istnieje możliwość zastosowania zasady genomiki porównawczej:

Odnalezienie informacji o dostępności sekwencji analogicznych genów z najbliższych „taksonomicznie” krewnych

Porównanie sekwencji nukleotydowych wybranych genów z organizmów pokrewnych do organizmu źródłowego

Programy komputerowe

Gene doc

Programy komputerowe

VectorNTI (INVITROGEN)

Contig Express

AlignX

AlignX

1 14010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130(1)

-------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-MfAJ252337 (1)

--------TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-McAY213657 (1)

-------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-MeAJ252330 (1)

ACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCNGGCCG--GAGGCTGGCCCCCCACGAT---A------------GGGACCGACGTTCA--TCAGGGGTGAGCAGACGT-GCGCCGGCCGTACGCCCCrubrumAJ270808 (1)

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC Consensus (1)

255 394260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380(255)

CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMfAJ252337(222)

CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMcAY213657(245)

CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMeAJ252330(222)

CGCCCGCCGGAGGACAGACACCAAGAAAAAATTCTCTGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTTAGCAAGCACAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATArubrumAJ270808(219)

CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAConsensus(255)