Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w j ądrowym DNA drzew le śnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w pos tępowaniu s ądowym

27.09.2012Leśny Bank Genów Kostrzyca

MikrosatelitarneMikrosatelitarne sekwencje DNAsekwencje DNAMaMałłgorzata Pagorzata Pa łłuckaucka

2

Spis treSpis tre śścici

I.I. DNADNAII.II. OgOgóólne zasady genetyki molekularnejlne zasady genetyki molekularnejIII.III.Reakcja PCRReakcja PCRIV.IV.Markery genetyczneMarkery genetyczneV.V.MikrosatelityMikrosatelity

3

• kwas deoksyrybonukleinowy(dawn. kwas dezoksyrybonukleinowy), w skrócie DNA DNA (od ang. deoxyribonucleic acid)

• wielkocząsteczkowy organiczny zwiorganiczny zwi ąązek chemiczny zek chemiczny należący do kwasów nukleinowych

• może być zlokalizowany w jądrze komórkowym i w cytoplazmie, u wirusów w kapsydach

• pełni rolę nonośśnika informacji genetycznej nika informacji genetycznej organizmorganizm óów w żżywychywych

• autorami modelu podwójnej helisy DNA są James James WatsonWatson i Francis i Francis CrickCrick , , na podstawie zdjęćkrystalografii rentgenowskiej wykonanych przez RosalindRosalind Franklin i Franklin i MauriceMaurice ’’aa WilkinsaWilkinsa (1953 r.)(1953 r.)

DNADNA

DNADNA

4

W komórkach DNA znajduje się w:

• jądrze komórkowym (nDNAnDNA-- jjąądrowy DNAdrowy DNA )

• chloroplastach (cpDNAcpDNA -- chloroplastowy DNAchloroplastowy DNA )

• mitochondriach (mtDNAmtDNA -- mitochondrialnymitochondrialny DNADNA)

DNADNA

DNADNA

5

DNADNA-- nieskomplikowana budowa chemicznanieskomplikowana budowa chemiczna

• przeważnie cząsteczka jest dwuniciowa, nici są skręcone spiralnie wokół siebie• koniec (5’) jednej nici leży naprzeciwko początku (3’) drugiej nici (usytuowanie naprzeciwległe)• podstawową jednostką budulcową jest nukleotydnukleotyd ::

cukier cukier (deoksyryboza lub ryboza) + zasada azotowa zasada azotowa + reszta kwasu fosforowegokwasu fosforowego

DNADNA

nukleotydnukleotyd

6

DNADNA-- nieskomplikowana budowa chemicznanieskomplikowana budowa chemiczna

Zasady azotowe dwóch przeciwległych nici łączą się ze sobą komplementarnie komplementarnie (łac. complementum – dopełnienie), tj. zawsze adenina łączy się z tyminą a cytozyna z guaniną

DNADNA

7

• Przepływ informacji genetycznej w komórce odbywa się jednokierunkowo:

DNA RNA BIADNA RNA BIA ŁŁKAKA

• Wszystkie komórki organizmu zawierają identyczną, pełną informację genetyczną

• Zależnie od rodzaju komórki, fazy cyklu życiowego, jej stanu i warunków

zewnętrznych- ekspresji ulegają inne fragmenty zapisu genetycznego

• Jednostki informacji genetycznej (m.in.):

�� NukleotydNukleotyd -- cukier (deoksyryboza lub ryboza) + zasada azotowa + reszta kwasu fosforowego

�� GenGen-- odcinek DNA odpowiedzialny za powstanie jednej cząsteczki białka, tRNA lub rRNA

�� ChromosomChromosom -- nić DNA połączona z białkami, która jako całość wędruje z komórki macierzystej do komórki potomnej

�� GenomGenom -- całość informacji genetycznej zawartej w komórce lub w określonym organellum np. genom chloroplastowy, genom mitochondrialny

OgOgóólne zasady genetyki molekularnejlne zasady genetyki molekularnej

8

� Każda cecha cecha fenotypowafenotypowa (np. kolor włosów) jest warunkowana przez zapis genetyczny w genach

�� LocusLocus (l. mnoga lociloci )- określony obszar chromosomu zajmowany przez gen. W obrębie chromosomu znajduje się wiele różnych loci. W locus mogą znajdować się rróóżżne ne warianty danego genuwarianty danego genu (różniące się sekwencjąnukleotydów w DNA) zwane allelamiallelami

OgOgóólne zasady genetyki molekularnejlne zasady genetyki molekularnej

�� Organizm haploidalny Organizm haploidalny ma zestaw pojedynczych chromosomów (NN)

�� Organizm diploidalny Organizm diploidalny ma zestaw chromosomów połączonych parami (2N2N)

9

PCRPCR-- Reakcja Reakcja łłaańńcuchowa cuchowa polimerazypolimerazy (ang. PPolymerase CChain RReaction) –metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych (w termocyklerze).

Składniki do przeprowadzenia PCR:1) wyizolowany, o odpowiedniej czystości DNA (z tkanek roślinnych, z krwi, z włosów itp.)2) środowisko reakcji (bufor, jony magnezowe oraz odpowiedniej czystości woda)3) primery (in. startery- czyli kilku do kilkunastu nukleotydowe sekwencje flankujące znany lub

nieznany odcinek DNA)4) dNTP (wolne nukleotydy)5) termostabilna (nie ulegająca degradacji w wysokich temperaturach) polimerazapolimeraza DNADNA

Reakcja PCRReakcja PCR

10

PCRPCR-- Reakcja Reakcja łłaańńcuchowa cuchowa polimerazypolimerazy (ang. PPolymerase CChain RReaction) –metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych.

Technika została wynaleziona w 1983 r. przez Karye’go Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 NagrodęNobla

PCR znajduje wiele zastosowań, m.in.:� w badaniach nad genomem

� charakterystyce ekspresji genów

� w klonowaniu genów� diagnostyce klinicznej

� identyfikacji osób zaginionych

� kryminalistyce� paleontologii

Reakcja PCRReakcja PCR

11

Reakcja PCRReakcja PCR

12

Markery genetyczneMarkery genetyczne

Markery genetyczne Markery genetyczne to cechy jakościowe organizmów podlegające prostym zasadom dziedziczenia zgodnie z prawami Mendla.

Można je podzieli ć na 3 główne klasy :I. Markery morfologiczne (brak chlorofilu, specyficzny kształt łusek szyszkowych czy blaszki

liściowej),

II. Markery biochemiczne (izoenzymy, terpeny, antygeny),III. Markery DNA (oparte na zmienności sekwencji nukleotydów).

Markery genetyczne słu żą m.in .:� badaniu zmienności genetycznej populacji

� umożliwiają identyfikację osobniczą, w tym analizę rodzicielstwa

� umożliwiają badanie śladów biologicznych w miejscu przestępstwa i porównanie ich z genotypami osób podejrzanych o jego popełnienie

� są szeroko wykorzystywane w badaniach populacyjnych drzew leśnych.

13

MikrosatelityMikrosatelity

Specyficznym rodzajem markerów DNA są sekwencje ekwencje mikrosatelitarnemikrosatelitarne czyli mikrosatelitymikrosatelity -- SSRSSR (ang. SSimple SSequence RRepeats)

� Występują jako tandemowe powtórzenia krótkich jednostek (sekwencji) o długości od 1 do 6 nukleotydów.

� O polimorfizmie (różnorodności) mikrosatelitów stanowi zmienno ść liczby powtórze ń krótkich sekwencji , która w zależności od locus może wahaćsię od kilku do ponad trzydziestu.

� Polimorfizm mikrosatelitów bada się poprzez analizę długo ści fragmentów DNA zawieraj ących mikrosatelity , wykorzystując mechanizm reakcji PCR, a różne allele identyfikuje się jako fragmenty DNA o różnej długości mierzone liczbą nukleotydów.

14

MikrosatelityMikrosatelity

MikrosatelityMikrosatelity -- SSR SSR (ang. SSimple SSequence RRepeats) należą do grupy powtarzających sięsekwencji DNA.

Występują jako tandemowe powtórzenia krótkich jednostek (sekwencji) o długości od 1 do 6 nukleotydów np. :

O polimorfizmie (różnorodności) mikrosatelitów stanowi zmienność liczby powtliczby powt óórzerzeńń krkr óótkich tkich sekwencjisekwencji , która w zależności od locus może wahać się od kilku do ponad trzydziestu:

15

MikrosatelityMikrosatelity

Typowy Typowy locuslocus mikrosatelitarnymikrosatelitarny składa się zatem z obszaru DNA, w ramach którego występują sekwencje powtarzające się, oraz z konserwatywnych fragmentów końcowych, które są podstawą do wyznaczenia (opracowania) starterów – oligonukleotydów o długości ok. 20 nukleotydów wykorzystywanych w reakcji PCR.

5’

5’3’

3’CTACCCGAA CACACACACACA TTTCGACATTA

GATGGGCTTGTGTGTGTGTGTAAAGCTGTAAT

mikrosatelitafragment ko ńcowy, flankuj ący fragment ko ńcowy, flankuj ący

16

Zalety i wady Zalety i wady mikrosatelitmikrosatelit óóww

ZaletyZalety• wykazują wysoki polimorfizm

• kodominacyjny system dziedziczenia

• genotyp można analizować na podstawie każdej tkanki, z której można wyizolować DNA• analizy laboratoryjne są wysoce powtarzalne, a sam proces można w dużym stopniu

zautomatyzować

WadyWady• stosunkowo wysokie koszty wyposażenia laboratoryjnego

• umiarkowanie wysokie koszty analiz laboratoryjnych• podawana przez niektórych autorów podatność tych markerów na zmienność mutacyjną

oraz błędy określania genotypów wynikające m.in. z występowania alleli null

MikrosatelityMikrosatelity

17

autorki prezentacji: E. Kaczmarek, A. Pasławska

DziDzięękujkuj ęę za uwagza uwag ęę

Malgorzata.Palucka@lbg.lasy.gov.pl

Zdjęcia w prezentacji:www.corbis.comInternetA.PasławskaM.Pałucka

Wykorzystano m.in.Markery mikrosatelitarne DNA i ich wykorzystanie w b adaniach z zakresu genetyki drzew le śnych, J.Burczyk