Kontrola ekspresji genów przez hipoksję Wykład 3

Kontrola ekspresji genów przez hipoksję

Wykład 3

21.10.2016

Biochemia stresu oksydacyjnego

Literatura:

Grzegorz Bartosz „Druga twarz tlenu”

Barry Halliwell & John Gutteridge „Free radicals in biology and medicine”

Hipoksja – fizjologiczne i biochemiczne mechanizmy reakcji na niedobór tlenu

Biochemiczne mechanizmy regulacji

aktywności czynnika transkrypcyjnego HIF-1: rola hydroksylacji i hydroksylaz prolinowych.

UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA

Funkcje układu oddechowego:

Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem

Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze

Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej

Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla

gó

rne

dro

gi

od

de

ch

ow

e

do

lne

dro

gi

od

de

ch

ow

e

Wymianę gazową w płucach warunkuje sprawne współdziałanie układów wentylacyjnego i krążeniowego

Układ wentylacyjny płuc ma za zadanie usuwać dwutlenek węgla i dostarczać tlen do pęcherzyków płucnych

Krążenie płucne zapewnia ciągły przepływ krwi przez układ naczyń włosowatych płuc, dzięki temu nadmiar dwutlenku węgla przenoszony jest do pęcherzyków płucnych, a tlen przechodzi z pęcherzyków płucnych do krwi

Mechanika oddychania polega na cyklicznych ruchach oddechowych klatki piersiowej na zasadzie pracy pompy ssącej, które poprzez zmianę ciśnienia powodują przepływ powietrza do płuc i z płuc na zewnątrz, czyli powodują ich wentylację

WENTYLACJA PŁUC

WYMIANA GAZOWA

Wymiana gazowa w płucach odbywa się dzięki różnicy ciśnień tlenu i dwutlenku węgla we krwi tętniczej i żylnej

WYMIANA GAZOWA

CO2 + H2O <=> H+ + HCO3-

Anhydraza węglanowa (CA) katalizuje odwracalną reakcję powstawania jonu wodorowęglanowego HCO3

- z wody i dwutlenku węgla.

CA

Brahimi-Horn et al., 2007

Ciśnienie parcjalne tlenu w różnych tkankach i narządach jest różne

21%

~15-20%

~14 % ~5 %

~0.5-2.5 %

~0.1-1.5 %

Stan kliniczny, w którym utlenowanie tkanek jest niewystarczające

Może występować zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych

Może dotyczyć całego organizmu lub ograniczać się do jednego narządu

http://www.diffusionpharma.com/?page_id=15

HIPOKSJA

Uszkodzenie mięśnia sercowego Wrodzone wady serca

Choroby układu oddechowego

Choroby układu krążenia

Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach

2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w

tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)

3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy

4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza

5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych

RODZAJE HIPOKSJI

HIPOKSJA HIPOKSYCZNA

Zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach spowodowane:

niskim ciśnieniem parcjalnym tlenu w powietrzu atmosferycznym zaburzeniami oddychania (choroby serca lub płuc) obecnością ciał obcych w drogach oddechowych obturacją oskrzeli

copyright 1999-2010 Getty Images, Inc.







RODZAJE HIPOKSJI

HIPOKSJA HISTOTOKSYCZNA Zahamowanie czynności enzymów biorących udział w reakcjach wykorzystujących tlen (mimo dostępności tlenu tkanki nie są zdolne do jego wykorzystania, co wywołuje sytuację analogiczną do jego braku).

Działanie trujące polega na blokowaniu procesu oddychania na poziomie komórkowym poprzez nieodwracalną inhibicję oksydazy cytochromowej, będącej kluczowym enzymem łańcucha oddechowego (kompleks IV) i fosforylacji oksydacyjnej.

T. F. Cummings , Occupational Medicine 2004

cyjanek (CN-) siarkowodór (H2S)

azydek tlenek węgla (CO)







RODZAJE HIPOKSJI

HIPOKSJA ZASTOINOWA

http://www.elements4health.com/oxygen-during-stroke-can-

reduce-damage-to-brain-tissue.html

Powstaje wskutek niedokrwienia

Może być przykładem hipoksji przewlekłej

Uwarunkowana spowolnionym przepływem krwi przez narządy, np. w następstwie niewydolności mięśnia sercowego, wstrząsu, zakażenia lub oderwanej blaszki miażdżycowej blokującej światło naczynia

Może prowadzić do uszkodzeń serca, wątroby, mózgu i nerek

ischemic stroke – udar niedokrwienny







RODZAJE HIPOKSJI

HIPOKSJA WYSOKOŚCIOWA

Choroba wysokościowa (choroba d'Acosty, ang. acute mountain sickness, ASM) - Z reguły pojawia się na wysokościach powyżej 2500 m n.p.m., gdzie dostępność tlenu w powietrzu zaczyna być za mała na potrzeby organizmu człowieka

Image courtesy © Photographer: Jörg Jahn | Agency: Dreamstime.com

Początkowo dochodzi do wzrostu ciśnienia krwi i tętna, a w dalszej kolejności do spadku ciśnienia krwi, co skutkuje omdleniem

Zwiększa się ilość erytrocytów we krwi co powoduje jej zagęszczenie

Może dojść do obrzęku płuc i obrzęku mózgu, a w przypadku braku interwencji lekarskiej ASM może zakończyć się zgonem

Profilaktyka – stopniowa, powolna aklimatyzacja i adaptacja do warunków panujących na dużych wysokościach







RODZAJE HIPOKSJI

Niewystarczające

stężenie hemoglobiny (Hb) w krwinkach czerwonych, co powoduje zmniejszoną zawartość tlenu we krwi

Odpowiedź

organizmu: Stymulacja produkcji

czerwonych krwinek

HIPOKSJA ANEMICZNA zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. przez zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych pod wpływem dużego krwotoku

Erytropoetyna (EPO) – glikoproteinowy hormon peptydowy, którego główną funkcją jest stymulacja różnych etapów erytropoezy, co prowadzi do zwiększenia produkcji erytrocytów przez szpik kostny.

HIPOKSJA ANEMICZNA

Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek

Niedotlenienie objawia się różnie w zależności od prędkości pojawiania się, stopnia obniżenia prężności tlenu oraz od możliwości rekompensowania niedoboru tlenu

Znaczne niedotlenienie pojawiające się nagle (np. dekompresja kabiny

samolotu) wywołuje utratę przytomności w ciągu 15-20 sekund, a po upływie ok. 5 minut prowadzi do nieodwracalnego zniszczenia tkanki mózgowej

Ostre niedotlenienie objawia się zaburzeniami koordynacji ruchowej, niewyraźną mową, może również prowadzić do utraty przytomności

Przy niedotlenieniu przewlekłym (choroba serca lub płuc, długotrwałe przebywanie na wysokości 3500-6000 m n.p.m.) pojawia się duszność, trudności w oddychaniu, występuje oddech typu Cheyne'a-Stokesa (cykle narastających a następnie zmniejszających się ruchów oddechowych powtarzane w nieregularnych odstępach)

Klinicznie objawy niedotlenienia: sinica (widoczna najlepiej na wargach, płatkach usznych i pod płytkami paznokciowymi), tachykardia oraz wzrost częstości i głębokości oddychania

OBJAWY NIEDOTLENIENIA

Bez względu na rodzaj występującej hipoksji każdy organizm posiada zdolności adaptacyjne

umożliwiające adaptację komórek i tkanek do stanu niskiej ilości tlenu.

Kluczowym elementem związanym z adaptacją

organizmu do niskiego stężenia tlenu jest czynnik indukowany hipoksją

HIF (ang. Hypoxia Inducible Factor)

Reakcja komórek na obniżone ciśnienie parcjalne tlenu

Lopez-Barneo , J Appl Physiol, 2004

1) Odpowiedź ostra – poprzez aktywację kanałów jonowych wrażliwych na tlen; w komórkach dochodzi do szeregu zmian związanych z pobudliwością, kurczliwością i funkcjami wydzielniczymi

2) Odpowiedź przewlekła – poprzez wzrost ekspresji czynników transkrypcyjnych indukowanych niedotlenieniem (HIFs – ang. hypoxia inducible factors), które z kolei zmieniają ekspresję genów kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiające adaptację komórek do hipoksji

Kłębek szyjny (łac. glomus caroticum; ang. carotid body) – chemoreceptor obwodowy, okrągły twór o średnicy około 4-6 milimetrów, leżący w rozwidleniu tętnicy szyjnej wspólnej. Jest unaczyniony przez gałązkę tętnicy szyjnej zewnętrznej a unerwiony jest przez gałązkę nerwu językowo-gardłowego. Ma właściwości chemorecepcyjne, jest wrażliwy na • zwiększone stężenie dwutlenku węgla

(hiperkapnia) • spadek ciśnienia tlenu (hipoksja) • kwasicę które pobudzając kłębek szyjny, doprowadzają do skurczu tętnic, zwolnienia akcji serca oraz hiperwentylacji.

ODPOWIEDŹ OSTRA

http://www.smkdds.com/cms/index.php?q=book/export/html/206

Kłębki szyjne, jako najważniejsze obwodowe chemoreceptory

W generowaniu reakcji na bodziec hipoksyjny biorą udział głównie kłębki szyjne oraz kłębki aortalne.

• kłębki szyjne odpowiadają za ok. 90% odpowiedzi na hipoksję, zaś ich udział w

procesie oddychania w warunkach normalnych wynosi ok. 10-20% • kłębki szyjne składają się z dwóch typów komórek: komórek typu I i typu II.

Komórki typu I są komórkami chemosensorycznymi, zaś komórki typu drugiego pełnią rolę podporową

• w komórkach typu I występują liczne ziarnistości zawierające neuroprzekaźniki, takie jak aminy katecholowe (w tym dopamina), acetylocholina, substancja P, czy co wskazuje zaangażowanie wielu neuroprzekaźników i neuromodulatorów w przekaźnictwo bodźca

• pobudzenie kłębków szyjnych przez bodziec hipoksyjny powoduje zmianę potencjału błonowego i wydzielenie z pęcherzyków presynaptycznych neuroprzekaźników, które, już na poziomie nerwu, w zależności od swojego charakteru odpowiednio modulują jego aktywność

Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model membranowy”

Lopez-Barneo et al., Eur Respir J, 2008

Reakcja komórek kłębka szyjnego na zmniejszone ciśnienie parcjalne tlenu

depolaryzacja

HIPOKSJA Zamknięcie

kanału K+O2

Depolaryzacja

komórek kłębka

typu I

Otwarcie

kanałów Ca2+

zależnych od

potencjału

Pobudzenie

zakończenia

nerwowego

EGZOCYTOZA

NEURO-

TRANSMITERA

Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model membranowy”

Prawdopodobnie

neurotransmiterem

pobudzającym zakończenia

nerwowe jest acetylocholina

Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006

Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model mitochondrialny”

Mo

de

l m

em

bra

no

wy

potencjał oksydoredukcyjny

Postuluje się różne mechanizmy łączące zmiany zachodzące w mitochondriach oraz depolaryzację błony komórkowej i/lub uwalnianie neurotransmitera. Uważa się, iż jednym z czynników łączących te dwa zjawiska może być czynnik transkrypcyjny HIF-1, który odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy tlenowej.

HIF-1 w roli łącznika?

Komórki hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu i w obecności inhibitorów łańcucha oddechowego w mitochondriach wykazują obniżoną aktywność czynnika HIF-1α.

U myszy pozbawionych jednego allelu genu Hif1α (Hif1α+/-) dochodzi do upośledzenia depolaryzacji komórek kłębka w odpowiedzi na nagłą hipoksję i do braku poprawy wentylacji płuc.

HIF-1 w roli łącznika?

Baby, S.M. et al., communicated , 2005

Peng, YJ et al., J Physiol , 2006

CIH – ang. chronic intermittent hypoxia tzw. przerywana, przewlekła hipoksja, naśladująca epizody hipoksji obserwowane u chorych z zespołem bezdechu sennego

HIF-1

HIF-1α HIF-1β +

(HYPOXIA INDUCIBLE FACTORS – HIFs)

Badania poświęcone elementowi odpowiedzi na hipoksję (hypoxia response element - HRE) w genie erytropoetyny doprowadziły do odkrycia czynnika transkrypcyjnego HIF-1 (Semenza i Wang, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454)

HIF-1 reguluje ekspresję wielu genów, m. in. erytropoezy, angiogenezy, enzymów szlaku glikolitycznego

HIF-2 ma szczególne znaczenia dla stymulacji produkcji erytropoetyny w wątrobie

Rola biologiczna HIF-3 nie jest do końca poznana, przy czym wiadomo, że przynajmniej jeden wariant splicingowy negatywnie reguluje ekspresję HIF-1 i HIF-2

CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM

Mole et al., IUBM, 2001

AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α

HIF-1β

&

pVHL-

Białko von Hippel-Lindau

REGULACJA HIFα

HIF-1 HIF-1

2-KETOGLUTARAN

O2 CO2

HYDROKSYLAZY PROLINOWE

OH OH pVHL

Fe2+

BURSZTYNIAN

NORMOKSJA HIPOKSJA

zależna od ubikwityny

degradacja w proteasomach

stabilizacja

e.g. VEGF

STABILIZACJA HIF-1α w WARUNKACH NIEDOTLENIENIA

Acker & Plate 2007

CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM

HIFs to heterodimer zbudowany z podjednostek: HIF i HIF

p300

p300

bHLH

bHLH

PAS

PAS

TAD

TAD

HIF-1α

HIF-2α

P402 P564 N803

P405 P531 N847

ODD

ODD

N-TAD C-TAD

P402 P564 N803

O2 + 2-ketoglutaran CO2 + bursztynian

FIH-1

p300 PHDs


PHD1 – hydroksylacja P402 & P564 PHD2 - hydroksylacja P402 & P564 PHD3 - hydroksylacja P564

kofaktory: tlen, żelazo, α-ketoglutaran, kwas askorbinowy

FIH-1 – ang. factor inhibiting HIF Hydroksylaza asparaginowa

AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α

Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006

HIF-1

Utrzymanie optymalnej dostawy tlenu Erytropoeza • Erytropoetyna Transport żelaza • Transferyna • Receptor transferyny • Ceruloplazmina

Regulacja proliferacji i żywotności Zatrzymanie cyklu komórkowego • p21 Autofagia • BNIP3 Czynniki wzrostowe • IGF-1 • białka wiążące IGF-1 i 3 (IGFBP-1 i 3)

Metabolizm energetyczny komórki Glikoliza • LDH • kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) • aldolaza A i C Transport glukozy • transporter glukozy 1 i 3 (GLUT1 i 3) Inne białka • Dehydrogenaza fosfo-3-glicerolu

Kontrola układu naczyniowego Angiogeneza • VEGF • VEGFR-1 • PAI-1 Napięcie ściany naczyń • iNOS • endotelina-1 • oksygenaza hemowa -1 (HO-1)

O2

ODPOWIEDŹ PRZEWLEKŁA

Zmiany metaboliczne w komórce niedotlenionej

Cadenas et al., Cardiovasc Res, 2010

wzrost ekspresji transporterów glukozy GLUT1 oraz GLUT3;

wzrost ekspresji enzymów glikolitycznych;

wzrost ekspresji dehydrogenazy mleczanowej A (LDH-A);

wzrost ekspresji dehydrogenazy pirogronianowej (PDK);

zmiana w podjednostce COX (COX4-1 na COX4-2);

autofagia mitochondriów – proces adaptacyjny służący

ochronie komórki przed skutkami stresu i śmiercią

W odpowiedzi na niedotlenienie, wzrost aktywności HIF-1 prowadzi do • zwiększonego transportu glukozy do komórek, • nasilenia glikolizy, • konwersji pirogronianu do mleczanu,

HIF-1

Cell. 2007 Apr 6;129(1):111-22. HIF-1 regulates cytochrome oxidase subunits to optimize efficiency of respiration in hypoxic cells. Fukuda R, Zhang H, Kim JW, Shimoda L, Dang CV, Semenza GL. Abstract O(2) is the ultimate electron acceptor for mitochondrial respiration, a process catalyzed by cytochrome c oxidase (COX). In yeast, COX subunit composition is regulated by COX5a and COX5b gene transcription in response to high and low O(2), respectively. Here we demonstrate that in mammalian cells, expression of the COX4-1 and COX4-2 isoforms is O(2) regulated. Under conditions of reduced O(2) availability, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) reciprocally regulates COX4 subunit expression by activating transcription of the genes encoding COX4-2 and LON, a mitochondrial protease that is required for COX4-1 degradation. The effects of manipulating COX4 subunit expression on COX activity, ATP production, O(2) consumption, and reactive oxygen species generation indicate that the COX4 subunit switch is a homeostatic response that optimizes the efficiency of respiration at different O(2) concentrations. Thus, mammalian cells respond to hypoxia by altering COX subunit composition, as previously observed in yeast, but by a completely different molecular mechanism.

HIF-1 REGULUJE EKSPRESJĘ PODJEDNOSTEK OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ

Element odpowiedzi na hipoksję (HRE) 5’-A/GCGTG-3’

HIF-1 HIF-2

kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

anhydraza węglanowa IX (CAIX) BNIP-3

erytropoetyna Oct-4 (Oct-3/4)

CYCLIN D1 TWIST1 TGF-

VEGF adrenomedullina

GLUT-1,-3

HIF-1 vs HIF-2

płuca

nerki

śródbłonek naczyniowy

serce

HIF-1 vs HIF-2

HIF-1 ulega ekspresji w wielu różnych tkankach i narządach, natomiast ekspresja HIF-2 jest ograniczona do następujących:

HIF-2α jest stabilizowany w wyższych stężeniach tlenu

akumulacja HIF-2α w niedokrwionych organach wskazuje, iż czynnik ten może odgrywać istotną rolę w procesie adaptacji do hipoksji

Patel and Simon, Cell Death and Differentiation 2008

w warunkach hipoksji (1% O2), HIF-1α ulega przejściowej stabilizacji i powoduje szybką odpowiedź tkanek na hipoksję, natomiast HIF-2α ulega stopniowej, powolnej akumulacji i powoduje późną odpowiedź tkanek na hipoksję

HIF-1 vs HIF-2

Lorenz Poellinger, communicated Smolenice 2010

HIPOKSJA W LABORATORIUM

INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs

HIF-1 HIF-1

2-KETOGLUTARAN

O2 CO2


OH OH pVHL

Fe2+

BURSZTYNIAN

NORMOKSJA HIPOKSJA



stabilizacja

e.g. VEGF

DMOG

Deferoksamina

CoCl2

Inhibitor kompetycyjny wrażliwych na tlen hydroksylaz prolinowych (PHDs)

Stabilizuje ekspresję HIF w warunkach normalnego (fizjologicznego) ciśnienia parcjalnego tlenu

Powszechnie stosowany jako czynnik naśladujący hipoksję

DMOG (Dimethyloxaloylglycine)

DMOG 2-ketoglutaran

MODEL IN VITRO

Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1) ważna funkcja w procesie angiogenezy unieśmiertelniona linia komórkowa produkują VEGF w ilościach możliwych do oznaczenia dostępnymi testami ELISA

AKTYWACJA HIFs W HMEC-1

Western blot

HIF-1α

α-tubulin

normoxia hypoxia

α-tubulin

HIF-1α

control DMOG

500 µM

HIF-2α

control DMOG

500 µM

α-tubulin

HIF-2α

α-tubulin

normoxia hypoxia

AdHIF-2α (MOI)

HIF-1α

α-tubulin

control AdGFP

100 MOI

10 50 100

HIF-2α

α-tubulin

control AdGFP

100 MOI AdHIF-1α (MOI)

10 50 100


0

1

2

3

lucif

era

se a

cti

vit

y

[rela

tive u

nit

s]

DMOG (M)

# #

control 250 1000

HRE – hypoxia response element element odpowiedzi na niedotlenienie

HRE luciferaza

HIFs

Badanie aktywności

genu reporterowego

# p<0,05 vs control, *p<0,05 vs cells treated with DMOG


HIF-1

DMOG 250 μM

0 30’ 1h 3h 6h 12h 24h

EMSA

0

200

400

600

800

control DMOG DMOG +

Mutated

competitor

DMOG +

Wild type

competitor

*

#

HIF

1α

acti

vit

y

[% o

f co

ntr

ol]

TransAm ELISA

VEGF promotor lucyferaza

Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF

*

AdGFP AdHIF-1α

0

1

2

3

VE

GF

mR

NA

[r

ela

tive

ex

pre

ss

ion

]

*

AdGFP AdHIF-2α 0

10

20

VE

GF

mR

NA

[r

ela

tive e

xp

ressio

n]

*

*

AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α 0

500

1000

1500

VE

GF

pro

mo

ter

acti

vit

y

[% o

f co

ntr

ol]

Badanie aktywności

genu reporterowego

Real-time PCR

*p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation

Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF

*

AdGFP AdHIF-2α 0

200

400

600

800

VE

GF

pro

tein

[% o

f co

ntr

ol]

*

AdHIF-1α

con

tro

l 3

h

DM

OG

3h

con

tro

l 6

h

DM

OG

6h

con

tro

l 1

2h

DM

OG

12

h

con

tro

l 2

4h

DM

OG

24

h

VEGF

Northern blot #

normoxia 0

100

200

300

400

hypoxia

500

VE

GF

p

rote

in

[% o

f c

on

tro

l]

ELISA

ELISA

# p<0,05 vs normoxia, *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation

INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs

HIF-1 HIF-1

2-KETOGLUTARAN

O2 CO2


OH OH pVHL

Fe2+

BURSZTYNIAN

NORMOKSJA HIPOKSJA



stabilizacja

e.g. VEGF

Deferoksamina

CoCl2

CoCl2 AKTYWUJE HIF

Zwiększenie poziomu białka HIF-1α pod wpływem CoCl2 w osteoblastach

Kim at al., Cytokine. 2002

CoCl2 zwiększa aktywność HRE oraz aktywację promotora VEGF

VEGF promotor lucyferaza

HRE

HRE lucyferaza

ak

tyw

no

ść l

ucy

fera

zy

[%

ko

ntr

oli

]

0

100

200

300

400

kontrola

*

CoCl2

250 M

*

Loboda A et al., 2006

Guzy and Schumacker, Exp Physiol, 2006

REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1

REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1

Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010

Hipoteza redystrybucji tlenu Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT)

zakłada, iż mitochondrialna oksydaza cytochromowa mająca większe powinowactwo do tlenu niż PHDs i FIH-1 w warunkach hipoksji zmniejsza dostępność tlenu dla tych enzymów, hamując ich aktywność, co prowadzi do stabilizacji HIF-α.

zakłada, iż zwiększenie produkcji O2·–

przez mitochondrialny kompleks III podczas hipoksji prowadzi do zwiększenia poziomu RFT w cytoplaźmie, które bezpośrednio lub pośrednio hamują aktywność PHDs i FIH-1 zwiększając poziom HIF-α.

Hagen T, Taylor CT, Lam F, Moncada S (2003) Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science 302: 1975-1978

Chandel NS, Maltepe E, Goldwasser E, Mathieu CE, Simon MC, Schumacker PT, (1998) Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 11715-11720

Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT)

Komórki Rho(0), pozbawione mitochondrialnego DNA Brak mitochondrialnego DNA powoduje upośledzenie funkcjonowania mitochondriów i zmniejsza generację RFT w hipoksji. W komórkach Rho(0) w warunkach niedotlenienia nie występuje aktywacja ekspresji genów regulowanych przez HIF

Dodanie H2O2 do komórek typu dzikiego jak i do komórek Rho(0) stabilizuje HIF-1α zarówno w normoksji jak i w hipoksji.

Rola produkowanych przez mitochondria RFT w indukowanej przez niedotlenienie stabilizacji HIF-α została potwierdzona w komórkach nie posiadających kluczowych elementów łańcucha oddechowego (cytochrom c, żelazowo-siarkowe białka Rieske), po zastosowaniu inhibitorów kompleksu I (rotenon) i kompleksu III (jak myksotiazol i stigmatelina), lub genetycznej delecji kompleksów łancucha oddechowego

Klimova i wsp. zaproponowali hipotezę dotyczącą szczególnej roli kompleksu III w stabilizacji HIF-α podczas niedotlenienia

ROLA KOMPLEKSU III W STABILIZACJI HIF

Mimo, iż zarówno kompleks I i III mogą generować anionorodnik ponadtlenkowy tylko kompleks III może go uwalniać zarówno do przestrzeni międzybłonowej jak i do macierzy mitochondrialnej.

Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla drobnocząsteczkowych związków anionorodnik ponadtlenkowy uwalniany do macierzy mitochondrialnej nie jest przenoszony do cytozolu tylko przekształcany do H2O2 poprzez MnSOD Rodnik uwolniony do przestrzeni międzybłonowej, może przechodzić do do cytozolu

HIPOTEZA REAKTYWNYCH FORMY TLENU

Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010

ROS mogą hamować aktywność PHDs na kilka sposobów:

mogą wpływać na szlaki przekazywania sygnału prowadząc do potranslacyjnych modyfikacji PHDs

mogą modyfikować mostki disiarczkowe w PHDs mogą utleniać Fe2+ zmniejszając jego dostępność dla PHDs

α-KETOGLUTARAN

O2 CO2


Fe2+

BURSZTYNIAN

ANTYOKSYDANTY OBNIŻAJĄ POZIOM HIF-1α

DPI (ang. diphenyleneiodonium chloride)

PDTC (ang. ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)

NAC (ang. N-acetyl-cysteine)

Mechanizm patogenezy H.pylori

Park HJ et al., Clin Cancer Res. 2003

ROS wytwarzane przez bakterie H. pylori przyczyniają się do stabilizacji HIF-1a, nawet w warunkach normoksji, co może tłumaczyć kancerogenny wpływ tego drobnoustroju na komórki błony śluzowej żołądka

Mitochondria mogą regulować aktywność HIF nie tylko przez RFT, ale również poprzez związki uczestniczące w cyklu kwasu cytrynowego, który ma miejsce w macierzy mitrochondrialnej.

PHDs

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO vs HIF-1

bursztynian

fumaran HIF-1α

szczawiooctan

HIF-1α

Aktywacja HIF-1 niezależna od hipoksji

trombina Czynniki wzrostu: PDGF TGF-β HGF

angiotensyna II

CoCl2

Cytokiny: IL-1 TNF-α

Wiele z tych czynników może działać poprzez generację RFT

LPS

NO

CO

siarkowodór

Siarkowodór aktywuje HIF-1 in vivo

Caenorhabditis elegans

Wzrost ekspresji HIF-1 i translokacja do jądra komórkowego

Budde & Roth, Mol Biol Cell, 2010

0,5% 50ppm

(0,5%)

(50ppm)

Aktywacja HIF-1 przez tlenek węgla

Western blot

CORM – cząsteczka uwalniająca tlenek węgla, ang. carbon monoxide releasing molecule

EMSA

Aktywność genu reporterowego po transfekcji pHIF-1α-luc

Makrofagi RAW 264.7

Immunofluorescencja

CO indukuje także ekspresję HIF-1 in vivo Tu: makrofagi pęcherzykowe wyizolowane z myszy C57Bl/6 po ekspozycji na CO lub powietrze przez 2 h

po

wie

trz

e

CO

(2

50

pp

m)

Chin BY, PNAS, 2007

PODSUMOWANIE

Hipoksja to stan, w którym stopień utlenowania tkanek jest niewystarczający

Związanie czynnika HIF-1 ze specyficzną sekwencją DNA (5’-(A/GCGTG-3’), tzw. elementem odpowiedzi na niedotlenienie (HRE), oraz przyłączenie szeregu kofaktorów uruchamia transkrypcję wielu genów, których produkty białkowe są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiają adaptację komórek do hipoksji

Wiele czynników może aktywować HIF-1 niezależnie od hipoksji, np. poprzez RFT, zmniejszając tym samym skuteczność terapii antynowotworowych

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

Zapraszam na wykład 4

Kontrola ekspresji genów przez hipoksję Wykład 3

Documents

Transcript of Kontrola ekspresji genów przez hipoksję Wykład 3