Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja

Maszyneria transkrypcyjna - prokarionty

• Mechanizmy regulacji ekspresji genów różnią się zasadniczo u eukariontów i prokariontów.

• U prokariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest nierestrykcyjny (brak ograniczenia dostępności do DNA dla kompleksu RNA polimerazy). Negatywna regulacja jest rzadka i zależy od represorów specyficznych dla konkretnych sekwencji.

• U prokariontów sieć regulatorowa genów ma niską złożoność. Pojedynczy TF reguluje średnio 3 geny, a pojedynczy gen jest pod kontrolą średnio dwóch TF. Wiele promotorów regulowanych jest przez pojedynczy regulator. Regulatory te rzadko regulują transkrypcję innych TF.

• U prokariontów, wiążące się z DNA, specyficzne sekwencyjnie TF na ogół rozpoznają długie sekwencje (>12 par zasad).

Maszyneria transkrypcyjna - eukarionty

• U eukariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest restrykcyjny, co wynika z upakowania DNA w chromatynę, która uniemożliwia rozpoznawania standardowych promotorów przez podstawową maszynerie transkrypcyjną.

• Wpływ struktury chromatynowej promotora na jego dostępność czyni niezbędnym udział w regulacji transkrypcji czynników modyfikujących chromatynę. Określa to w zasadniczy sposób model regulacji transkrypcji u eukariontów. W systemie regulacji uczestniczą nie tylko składniki podstawowej maszynerii transkrypcyjnej i wielka liczba TF wiążących się ze specyficznymi sekwencjami DNA, ale także bardzo liczne i rozmaite białka związane z chromatyną.

• U eukariontów regulatory transkrypcji działają według logiki kombinatorycznej, co skutecznie zwiększa liczbę i różnorodność aktywności regulatorowych i prowadzi do dużej złożoności sieci regulacyjnych. Sekwencje rozpoznawane przez eukariotyczne TF mają długość 5-10 par zasad.

Polimerazy RNA u eu- i prokariontów

• Pro: podjednostki 2Xalfa, β, β’, ω (omega)

(Holoenzym ca. 500 000 D)

• Eu: 12 podjednostek

(Holoenzym ca. 550 000 D)

Promotor prokariotyczny

• Obejmuje dwie podstawowe sekwencje zaangażowane w kontrolę transkrypcji: TATAAT (-10 pz) i TTGACA (-35 pz)

Inicjacja transkrypcji u prokariontów

• Polimeraza RNA wiąże się do DNA i przesuwa się po nim aż do odnalezienia promotora

• Podjednostka sigma rozpoznaje sekwencję -35 pz i powoduje ścisłe związanie polimerazy.

• Na obszarze -10 pz następuje rozplatanie podwójnej helisy DNA

Inicjacja i elongacja transkrypcji u prokariontów

• Podjednostka sigma odłącza się od czterech pozostałych podjednostek polimerazy.

• Polimeraza kontynuuje transkrypcję

System regulacji operonowej u bakterii

Represor lambda (helix-turn-helix)

Elementy regulatorowe genów eukariotycznych

Białka związane z transkrypcją u eukariontów należą do 4 zróżnicowanych funkcjonalnie grup

• 1. Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors)

• 2. Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF).

• 3. Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów.

• 4.Białka związane z chromatyną

Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors)

• Pol II - podjednostkowy holoenzym, wymaga dodatkowych czynników (TFII: A, B, D, E, F, H) dla rozpoznania promotora i inicjacji.

• TFIIB – umiejscawia Pol II na promotorze

• TFIIH – rozplata DNA• TFIID – podjednostkowy

kompleks odpowiedzialny za ogólne rozpoznanie promotora (zawiera TBP i TAFs (TBP-Assiociated Factors – odpowiedzialne za specyficzność i różnorodność odpowiedzi transkrypcyjnych)

Funkcja TBP-Associated Factors (TAFs)

Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów.

Białka z AT-hook, zdolne do zginania DNA

Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF).

Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF) - 2

Czynnik transkrypcyjny AP-1 (Leu-Zip)

Czynnik transkrypcyjny Sp1

Funkcja enhancerów

Izolatory rozgraniczają domeny kontrolowane przez różne promotory

Meyerowitz 2002

Rodziny czynników transkrypcyjnych w Arabidopsis

Rodziny Homeobox (HB) i Zinc-Finger-Homeobox (ZF-HB) w Arabidopsis

• Rodzina Homeobox w Arabidopsis zawiera klasy z różnymi kombinacjami domen białkowych, różnice wynikają też z fiologenezy domeny HB.

• Specyficzny układ domen (leucine zipper, PHD finger, STAR) wynika z ich mieszania charakterystycznego dla roślin, nie występuje w innych królestwach (Drosophila, C. elegans, drożdże).

• Białka ZF-HB mają specyficzny tylko dla roślin motyw koordynujący cynk.

Porównanie rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

Zawartość i rozkład rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

Rodzina czynników transkrypcyjnych: AP2/EREBP i profile ekspresyjne z mikromacierzy dla różnych części i organów. Wzrost transkrypcji: czerwone – ponad 8-krotny, różowe - 2- do 8-krotny; żółte - ±2-krotny; Spadek transkrypcji: zielone ponad 2-krotny. Brak transkrypcji – szare.

Chromatyna w regulacji transkrypcji

Chromatin regulators act as common modifiers of diverse signaling pathways

• Systematic mapping of genetic interactions in C. elegans identified six ‘hub’ genes that enhance the phenotypic consequences of mutations in many different pathways.

• All six hub genes encode components of chromatin modifying complexes.

• Chromatin modifiers may function as genetic buffers (similar to hsp90) preventing cumulation of effects of mutations in multiple functionally unrelated genes and in many otherwise unlinked pathways.

Interaction network for EGF signaling. Lehner et al. Nature Genet. (2006)

Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie

H2A

H2B

H3

H4H4

H3

H2A

H2B

Acetylacja lizyny

Modyfikacje histonów

ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPH

SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR

DFKTD

Lysine acetylation

Arginine Methylation

Lysine Methylation

KRKTV

Serine Phosphorylarion

H3

H4

Modyfikacje histonów

SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV

PEPSKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRK

PKKTE

Lysine acetylation

Arginine Methylation

Lysine Methylation

VTKYT

Serine Phosphorylarion

H2A

H2B

Lysine Ubiquitination

Kod histonowy

Wzór metylacji H3K9 w Arabidopsis

DAPI H3K9

After Jackson et al., Chromosoma 112: 308-315

min. 0 15 30 45 60 90 120 3%aktyna

Tsi1

NtC7

osmotyna

Analiza odpowiedzi tytoniowych komórek BY-2 na 250mM NaCl

anty-fosfo(S10)-H3

anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3

intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min.

0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min.

0 5 10 15 20 30 45 60 90 min.

anty-acetyl-H4

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 15 30 45 60 90 120

Tsi1

Ntc7

osmotyna

0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min.

0 5 10 15 20 30 45 60 90 min.

0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min.

0 15 30 60 90 min.

0 15 30 60 90 min.

0 15 30 60 90 min.anty-fosfo(S10)-H3

DREB1A

DREB2A

RD29A

COR15A

aktyna

kontrola pozytywna

0 15 30 60 90

00,20,4

0,60,8

11,2

1,41,6

0 15 30 60 90

RD29A

COR15A

DREB2A

DREB1A

Analiza odpowiedzi linii Arabidopsis thaliana T87 na 250mM NaCl

intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3

0 15 30 60 90 min.

Metylacja cytozyn w DNA

• Reaction: • Cytosine → 5-methylcytosine (5mC)• Enzymes: • Diverse group of DNA methyltransferases (Dnmt’s)• Sequence context: • CpG – animals• CpG (major), CpNpG, CpNpNp - plants

Kingston, R.E., Narlikar, G.J.Genes&Development 13:2339-2352(1999)

ATP dependent Chromatin Remodeling

ATPases of DEXD/H family are motor subunits of chromatin remodeling complexes

DEXD/H

HelicCDEXD/H

HelicC

SNF2_N

ATPase ATPaseATPase ChromodomainSANT/SLIDEBromodomain

Major types of ATP-dependent chromatin remodeling complexes

Mi2Swp73

Swi3Swi3Snf5

Snf2 ISWIISWI

SWI/SNF ISWI Mi2

Visualization of the remodeling activity: ‘sliding assay’ with

nucleosomes reconstituted on 248bp rDNA

End position Center position

Sliding of nucleosomes induced by Arabidopsis ATPase DDM1

(Decrease in DNA Methylation 1)

DDM1

A

-ATP

DDM1 -ATP

B Brzeski&JerzmanowskiJ.Biol.Chem. 2003

Modyfikacje histonów w aktywacji i wyciszaniu tranaskrypcji

Interferencja RNA (RNAi) w ustanawianiu stanu nieaktywnej chromatyny

Chromatynowy system aktywacji i hamowania transkrypcji

From: Stevenson & Jarvis

AtSWP73

AtSWI3AtSWI3

BSH(SNF5)

AtSNF2

Hipotetyczny kompleks SWI/SNF w Arabidopsis

Major remodeling ATPases

SWI/SNFclass

ATPase

SNF 2 HelicC Bromodomain

SANT

CHROMODOMAIN

SLIDE

ISWIclass

CHD (Mi-2)class

INO80, SWRIclass

Two distinct and highly conserved subclasses of SWI/SNF complexes occur in yeast and animals

• Subfamily SWI/SNF/BAP/BAF Subfamily RSC/pBAP/pBAF• (non-essential) (essential)• ______________________________________________________________________________________________________________________• • SWI/SNF BAP BAF RSC pBAP pBAF• yeast Drosophila human yeast Drosophila human• ______________________________________________________________________________________________________________________

• Swi2/Snf2 Brahma BRG1 or hBRM Sth1/Nsp1 Brahma BRG1

Swi3 BAP155/Moira BAF170 and BAF155 Rsc8 BAP155/Moira BAF170&BAF155 • Snf5 Snr1 hSNF5/INI1 Sfh1 Snr1 hSNF5/INI1 • • Swp73/Snf12 BAP60 BAF60a Rsc6 BAP60 BAF60a or BAF60b

• Swp61/Arp7 BAP55 BAF53 Rsc11/Arp7 BAP55 BAF53 • • Swp59/Arp9 Rsc12/Arp9• Actin Actin Actin Actin

• Swi1 OSA (ARID-domain protein) BAF250 • Rsc1,Rsc2,Rsc4 Polybromo BAF180

• Swp82 •

Snf6

• • Swp29/TafII30• • Snf11 • Rsc5,7,10,13-15

• Rsc3, Rsc30

Is a functional pattern of SWI/SNF specialization maintained in plants?

SWI/SNF family

Signature subunit: OSA

Yeast SWI/SNFDrosophila BAPHuman BAF

Plants?

Signature subunit:Polybromo

Yeast RSCDrosophila pBAPHuman pBAF

Plants?

Non-essential Essential

Arabidopsis SWI/SNF complexes – the landscape of possibilities

SWI3

AtSWI3A

AtSWI3C

AtSWI3B

AtSWI3D

SWP73

SWP73A

CHR12

SYD

BRM

CHR23

SWP73B

SNF5

BSH

Plant SWI/SNFchromatin remodeling

complex

ARPBromo-proteins

OSA

Swi2/Snf2ATPase

Non-coresubunits

Hypothetical organization of SWI/SNF remodeling in Arabidopsis

Early embryonic stage

Adult stage

SYD

SYD

BRM

BRM

BSH

BSH

BSH

BSH

AtSWI3A - AtSWI3B

AtSWI3D - AtSWI3B

AtSWI3A - AtSWI3B

AtSWI3C - AtSWI3B

AtSWP73

AtSWI3AtSWI3

BSH(SNF5)

AtSNF2

Hipotetyczny kompleks SWI/SNF w Arabidopsis

Homologi SWI3 w A. thaliana

AtSWI3B (At2g33610)

AtSWI3C (At1g21700)

AtSWI3A (At2g47620)

AtSWI3D (At4g34430)

ySWI3

Drzewo filogenetyczne białek typu SWI3

BIP2(3-32)

HD2A

ATSWI3C

ATSWI3A ATSWI3B

FCA

ATSWI3D

AtBRM

ATSWP73A

HD2B

PRL2 AMIDASE

PRL1

AKIN 10/11

BSH

CobW

PIRIN

Farrona et. al., 2004

SAHH

Interactions identifiedIn Csaba Koncz’ laboratory Interactions verified inpGBT9/pGAD424 systemInteractions verified in pGBT9/pACT2 systemWeak interactions identified in pGBT9/pACT2 system

Interactions identified by other researchers from our laboratoryin the pGBT9/pGAD424 system

Proteins studied in Csaba Koncz’ laboratory

Core subunits of theSWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein

Proteins identified through the yeast two hybrd screen

ATPase

BIP1(1-57)

PUX2

SRC2

ANAC102

JMJC

RPT3

AAA

ATGP4

Di19

COP9

E3

ATAF2

ARM

BIP3(3-45)

RPL12

esterase family protein

BIP5 (1-30)

BIP4(3-46)

BIP6(11-16)

BIP7(11-17)