U M

Artur Pałasz

Zakład Histologii Katedry Histologii i Embriologii Ś ląsk iego Uniwersytetu Medycznego w Ka towicach

AUTOREFERAT

Uczony jest w swojej pracowni nie tylko techn ikiem, lecz równ ież dzieckiem wpatrzonym w zjawiska przyrody, wzruszaji}ce jak czarodziejska baśń. Jestem z tych, którzy wierzą, że Nauka jest czymś bardzo pięknym.

Autoreferat

1. Imię i Nazwisko: Artur Pałasz

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowel artystyczne -z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

2004 - dr n. med. Praca doktorska (wyróżniona) pl . .Aktywność kompleksu cytochromu P450 w jelicie cienkim szczura w rćtnych fazach tycia osobniczego" wykonana w Katedrze Histologii i Embriologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach pod kierunkiem dr hab. n. med. Ryszarda Wiaderkiewicza, recenzenci; prof. dr hab. n. farm . Mirosław M. Szutowski (Akademia Medyczna w Warszawie) . pro!. dr hab. n. med. Jan Gmiński (Śląska Akademia Medyczna w Katowicach).

1998 - mgr biologii. Praca magisterska pl .,Badania histologiczne ośrodków sekrecyjnych podwzgórza jaszczurki zwinki Lacerta agilis L. w stanie odrętwienia indukowanego niską temperaturą" wykonana w Katedrze Histologii i Embriologii Zwierząt Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach pod kierunkiem dr n. przyr. Mariana Biczyckiego, recenzent; prof. dr hab. n. przyr. Jerzy Klag (Uniwersytet Śląski w Katowicach i Uniwersytet Jagielloński w Krakowie) .

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowychI artystycznych.

1999 2004 Śląska Akademia Medyczna, II Katedra Katowice st. referent tech . i Zakład Histologii i Embriologii

2004 2006 Śląska Akademia Medyczna, 11 Katedra Katowice biolog i Zakład Histologii i Embriologii

2006 2008 Sląski Uniwersytet Medyczny, Katowice wykładowca

Katedra Morfologii, Zakład Histologii

2008 2013 Śląsk i Uniwersytet Medyczny, Katowice asystent Katedra Morfologii, Zakład Histologii

2013 nadal Sląski Uniwersytet Medyczny, Katowice adiunkt Katedra Histologii i Embriologii,

Zakład Histologii

4. Wskazanie osiągn ięcia· wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dn ia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopn iach i tytule w zakresie sztuki (Oz. u . nr 65, poz. 595 ze zm.):

a) tytuł os iągn ięcia naukowego/artystycznego,

Leki antypsychotyczne jako modulatory sygnalizacj i neuropeptydowej oraz neurogenezy w mózgu szczura.

b) (autor/autorzy, tytulltytuły publ ikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa),

1. Artur Pałasz, Ewa Rojczyk. Neuroleptics affect neuropeptide S and NPSR mRNA levels in the rat brain. Journa/ ot Mo/ecu/ar Neuroscience 2015 Vol.57, No.3, p. 352-7 . /F: 2,352; MNiSzW: 20

Mój wkład w powsIanie lej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczeII , analizie i inrerpre/acji wyników badań, napisaniu całości manuskryptu. Mój udzial procenlawy szacuję na 70%.

2. Artur Palasz, Ewa Rojczyk, Milosz Gołyszny, Łukasz Fi lipczyk, John J. Worth ington, Ryszard Wiaderkiewicz. Long-term treatment with haloperidol affects neuropeptide S and NPSR mRNA levels in the rat brain. Acta Neuropsychiatrica 2016 Vol.28, No.2, p.110-6. /F: 0,760; MNiSzW: 15

Mój wkład w powsranie Tej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczell , wykonaniu części oznaczeń. analizie i interpretacji wyników badań, napisaniu całości manuskrypru. Mój udział procenlOwy szacuję na 65%

3. Artur Palasz, Magdalena Bandyszewska, Ewa Rojczyk, Ryszard Wiaderkiewicz Effect ol extended olanzapine administration on POMC and neuropeptide Y mRNA levels in the male rat amygdala and hippocampus. Pharmac%gica/ Reports 201 6; Vol. 68, No.2 p.292-6. /F: 2,251; MNiSzW: 25

Mój wkład w powsranie tej pracy polegał I/a zaplanowaniu doświadcze,i , wykonaniu części oznacze,i , analizie i inrerpretacji wyników badatl, napisaniu całości manuskrypru. Mój udział procentowy szacuję l IG 65%

4. Artur Palasz, Ewa Rojczyk, Katarzyna Bogus, John, J. Worthington, Ryszard Wiaderkiewicz. The novel neuropeptide phoenixin is highly co-expressed with neslatin-1 in the rat hypothalamus, an immunohistochemical study. Neuroscience Letters 2015; Vol.592, p.17-21 . /F: 2,107; MNiSzW: 20

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu doświadczeń, wykonaniu części oznacze'l immul1ojluorescencyjnych, analizie i interpretacji wyników badmi, napisaniu c%ści manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 65%

5. Artur Pałasz, Ewa Rojczyk, Aleksandra Suszka-Świtek, Ryszard Wiaderkiewicz. Neuroleptics affect kisspeptin mRNA levels in the male rat hypothalamus and hippocampus. Pharmacopsychiatry 201 6 (w druku) DOI: 1055/s-0042-109870 Pharmacopsychiatry 2016; 49: 1-5. /F: 1,474 MNiSzW: 25

Mój wkład w powstanie tej pracy polega/" na zaplanowaniu doświadczeń, wyJronaniu części oznaczeń, interpretacji wyników badań, napisaniu całości manuskryptu. Mój udzial procentowy szacuję na 65%

6. Ewa Rojczyk, Artur Pałasz, Ryszard Wiaderkiewicz. Effect ol short and lon9-term treatment with antipsychotics on orexigenic/anorexigenic neuropeptides expression in the rat hypothalamus. Neuropeptides 2015 Vol.51 , p.31-42./F: 2, 726; MNiSzW: 20

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na wspólplanowaniu eksperymentu, wykonaniu części oznaczeń, interpretacji wyników badań, napisaniu polowy manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 45%

7. Ewa Rojczyk, Artur Pałasz, Ryszard Wiaderkiewicz. Effects ol neuro leptics administrałion on adult neurogenesis in the rat hypothalamus. Pharmac%gica/ Reports 2015 Vo1.67, NO.6, p.1208-1214. /F: 2,251; MNiSzW: 25

Mój wkład w powstanie tej pracy polegal na wspólplanowanill eksperymentu, wykonaniu części oznaczeń, interpretacji wyników badań, napisaniu polowy manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 45%

Łączna wartość Impact Factor: 13,921 punktacja MNiSzW: 150

c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.

Wprowadzenie

Farmakologia lekówantypsychotycznych należy do niezwykle istotnych

zagadnień współczesnej neurofizjologii i psychiatrii stosowanej. W dniu dzisiejszym

stosunkowo dobrze poznano receptorowe mechanizmy działania owych substancji , a

hipotezy wyzwalania przez nie efektu terapeutycznego w trakcie leczenia dysfunkcji

psychicznych są w szerokim zakresie udokumentowane. Informacje te wpisują się

istotnie w zakrojone na szeroką skalę badania patogenezy depresji , schizofrenii ,

krytycznie modyfikując i uzupełniając obowiązujące modele dopaminergiczny i

serotoninergiczny. Klinicznie uznane neuroleptyki charakteryzują się stosunkowo

szerokim spektrum efektów farmakologicznych wykraczających poza redukcję

objawów wytwórczych w tym również licznymi działaniami niepożądanymi ,

związanymi z ich odmiennym wpływem na określone struktury mózgowia.

Wzrastająca , choć wciąż dalece ograniczona liczba danych sugeruje, że neuroleptyki

mogą w sposób pośredni lubli bezpośredni wptywać na peptydergiczne szlaki

sygnałowe w różnych formacjach neuronalnych. Przykładowo , zarówno

chlorpromazyna jak i klozapina modulują ekspresję hormonu uwalniającego

kortykotropinę (CRH) prawdopodobnie drogą aktywacji kaskady sygnałowej

PI3K1Akt, choć sugerowany jest również udział szlaku kinazy białkowej C (PKC).

Haloperidol stymuluje wzrost ekspresji mRNA zarówno CRH jak i GnRH w

podwzgórzu szczura. Kwetiapina i olanzapina natomiast hamują uwalnianie CRH w

izolowanych skrawkach podwzgórza i hipokampa szczura. Haloperidol podwyższa ,

risperidon natomiast obniża poziom neurotensyny w prążkowiu , hipokampie i korze

czołowej szczura. Skutkiem chronicznego podawania haloperidolu jest z kolei

obniżenie poziomu mRNA neuropeptydu Y (NPY) w ciele migdałowatym i

hipokampie, olanzapina i klozapina wywołują ten sam efekt w prążkowiu , jądrze

półleżącym i przedniej części kory obręczy. Długotrwałe narażenie na risperidon

obniża ekspresję NPY mRNA w podwzgórzu szczura. Z drugiej strony istnieją

sugestie, że pod przewlekłe dawkowanie olanzapiny stymuluje sygnalizację

neuropeptydu Y (NPY) . Zaobserwowano ponadto, że olanzapina podwyższa poziom

peptydu pokrewnego kalcytoninie (CGRP, calcitonin gene-related peptide) w mózgu

szczura. W dniu dzisiejszymi pojawiają się coraz częściej uzasadnione

przypuszczenia , że patogeneza schizofrenii i innych zaburzeń psychicznych może

mieć co najmniej pośredni związek w zaburzeniami w zakresie szlaków

peptydergicznych mózgowia. Zmiany te mogą być związane z dysfunkcjami

sygnalizacji aminergicznej, która ma swój istotny udział w procesie kontroli syntezy i

uwalniania neuropeptydów przez wyspecjalizowane grupy neuronów. Również

stosowane współcześnie leki antypsychotyczne, będące antagonistami receptorów

dopaminergicznych i serotoninergicznych mogą w sposób pośredni wpływać na

ekspresję neuropeptyd6w w różnych obszarach mózgu. Nie można tez wykluczyć , że

cząsteczki tych leków mogą charakteryzować się pewnym powinowactwem do

określonych receptorów neuropeptydowch, jednak wiele z tych receptorów wciąż nie

zostało zidentyfikowanych.

Pomimo obserwowanego w ostatnim czasIe wzrostu liczby badań

neurochemicznych, informacje na temat wpływu neuroleptyków na sygnalizację

neuropeptydową są wciąż raczej znikome. Szczególnie mało danych dotyczy

odkrytych w ostatnich latach mózgowych czynników regulatorowych jak neuropeptyd

S, nesfatyna-1 , kisspeptyna czy feniksyna. W przedstawionym projekcie badawczym

opartym na modelu zwierzęcym poczyniliśmy starania mające na celu uzupełnienie

tej luki.

Znany problem kliniczny stanowi szybki wzrost masy ciała poważnie

komplikujący proces terapeutyczny u pacjentów przyjmujących przewlekle leki

antypsychotyczne. Jedną z przyczyn owej dysfunkcji jest z pewnością wpływ

wymienionych leków na ośrodki homeostazy energetycznej zlokalizowane w

podwzgórzu . Pomimo faktu, iż opisane zjawisko jest od wielu lat przedmiotem

licznych badań , nie jest wciąż do końca jasne, które elementy szlaków neuronalnych

tej okolicy mózgu są dodatkowym celem działania lekówantypsychotycznych, a co

za tym idzie nie istnieje spójny model wyjaśniający genezą owych zaburzeń na

poziomie czynników regulatorowych podwzgórza i ich receptorów. Nie został również

wypracowany zadowalający zwierzęcy plan badawczy dotyczący wzrostu masy ciała

indukowanego lekami antypsychotycznymi . W ostatnich latach daje się zauważyć

istotny postęp w zakresie wyjaśniania i rozumienia podwzgórzowych mechanizmów

regulacji przyjmowania pokarmu równowagi energetycznej organizmu,

udoskonalono funkcjonalny opis interakcji międzykomórkowych w jądrach

podwzgórza , scharakteryzowano nowe populacje neuronów, odkryto nieznane dotąd

neuropeptydy regulatorowe (oreksyny, nesfatyna-1), wreszcie zidentyfikowano

szereg nowych receptorów. Pojawiły się również interesujące sugestie, iż proces

neurogenezy w dojrzałym podwzgórzu może mieć swój udział w kontroli bilansu

energetycznego organizmu. Istnieje załem uprawnione przypuszczenie, iż

określone elementy tego zbioru mogą być modyfikowane działaniem wymienionych

leków neuropsychiatrycznych. Niemniej w chwili obecnej stosunkowo ograniczona

liczba prac badawczych koncentruje się na analizie bezpośredniego wpływu leków

neuropsychiatrycznych na systemy neuronalne podwzgórza , przedstawiony plan

badawczy ma w swym założeniu uzupełnienie tej luki o szereg nowych informacji

uwzględniających najnowsze dane dotyczące neurofizjologii podwzgórza. W dniu

dzisiejszym zaproponowano wiele hipotez dotyczących indukcji wzrostu masy ciała ,

zdecydowana większość z nich sugeruje, że kluczową rolę w owym mechanizmie

może odgrywać działanie leków na ośrodki podwzgórza. Sugeruje się między innymi,

że neuroleptyki wchodzą w interakcje z receptorami neuronów podwzgórza , blokując

przede wszystkim receptory serotoninowe typu 5-HT2C i 5-HT2A oraz histaminowe

typu H1 i być może dopaminowe typu D2. Niewykluczone, że modulują one również

aktywność receptorów kanabinoidowych GB, . Prawdopodobnie dochodzi również do

zaburzenia regulacji syntezy neuropeptydów np. zwiększenie poziomu leptyny, oraz

cytokin. Ogólnoustrojową konsekwencją owych oddziaływań jest spowolnienie tempa

metabolizmu , prawdopodobnie w postaci osłabienia metabolizmu tłuszczów i

wodorowęglanów, indukcja odkładania się tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej,

związana prawdopodobnie z zaburzeniami poziomu leptyny, zatrzymanie płynów na

obwodzie organizmu oraz nieprawidłowości hormonalne.

Podstawą teoretyczną tej części projektu badawczego była hipoteza

zakładająca , że leki antypsychotyczne; olanzapina, chlorpromazyna i haloperidol

oddziaływają na określone , odpowiedzialne za proces regulacji pobierania pokarmu

populacje neuronów podwzgórza zlokalizowane w jądrze łukowatym , jądrach

środkowych i podwzgórzu bocznym. Manifestacją owego wpływu winny być zatem

zmiany ekspresji syntezowanych i uwalnianych przez te komórki czynników

oreksygennych i anoreksygennych. Wiedząc, że terapia z udziałem wszystkich

wymienionych leków prowadzi do wzrostu masy pacjentów, przyjęliśmy założenie , że

ich podanie zwierzętom spowoduje osłabienie sygnalizacji warunkującej poczucie

sytości lubli aktywację szlaków promujących pobierania pokarmu. Uwzględniliśmy

rzecz jasna kluczowy fakt, że efekty obserwowane u zwierząt , nie muszą

korespondować z profilem zmian obserwowanym u ludzi. Dawkowanie leków oparto

na standardach farmakologicznych opracowanych dla tej grupy leków w badaniach

przed klinicznych. Celem udzielenia odpowiedzi na zasadnicze pytanie , które drogi

sygnalizacyjne podwzgórza są modyfikowane dzialaniem neuroleptyków,

prześledziliśmy poziom ekspresji neuropeptydów i receptorów oreksygennych

(AgRP, NPY, oreksyna A. receptor Y" receptor OX,R) oraz anoreksygennych (a­

MSH, nesfatyna-1 , receptor MC.R). Przeprowadzono reakcje RT-PCR,

uwidaczniające poziomy ekspresji mRNA badanych neuropeptydów i ich receptorów

oraz reakcje immunohistochemiczne uwidaczniające obecność bialkowych form

badanych czynników regulatorowych w komórkach nerwowych jader podwzgórza . W

ostatnim czasie pojawiły się doniesienia sugerujące , że zachodzący w podwzgórzu w

proces neurogenezy, może mieć swój udział w realizowanych przez te struktura

procesach regulacyjnych. Jest to hipoteza budząca sporo kontrowersji , zważywszy,

że zjawisko powstawania nowych komórek w podwzgórzu jest wciąż

kwestionowane , Niemniej ten nowy punkt widzenia stanowi podstawę do dalszych

prac doświadczalnych , w związku z czym planowany projekt badawczy zostal

uzupełniony o ocenę dynamiki proliferacji komórek na obszarze podwzgórza w

wykorzystaniem techniki immunohistochemicznego wykrywania niedojrzalych

neuronów z ekspresją doublekortyny (DCX) oraz Ki-6? pozytywnych komórek w

stadium podziału mitotycznego.

Celem zrealizowanego projektu badawczego bylo znalezienie odpowiedzi na następujące pytania ;

1, W jaki sposób krótko- i długoterminowa ekspozycja zwierząt na leki

antypsychotyczne; klozapinę , olanzapinę i haloperidol wplywa na profil

ekspresji wybranych peptydów regulatorowych w tym szczególnie

neuropeptydu S, nesfatyny-1 i kisspeptyny w mózgu szczura?

2. Czy istnieje różnica pomiędzy klasycznymi a atypowymi leki

antypsychotycznymi w zakresie ich wplywu na poziom ekspresji badanych

substancji regulatorowych?

3. Czy aktywność wymienionych leków w OUN jest związana z ich

oddziaływaniem na proces powstawania nowych neuronów w

podwzgórzowych ośrodkach kontroli homeostazy energetycznej?

4. Które z badanych neuropeptydów odgrywają wiodącą rolę w modelu działania

badanych leków na obszarze podwzgórza?

5. Czy istnieją teoretyczne perspektywy farmakologicznej modulacji badanych

szlaków peptydegicznych mózgowia, w tym również potencjalnej redukcji

niepożądanych efektów terapii lekówantypsychotycznych?

4. Materiał i metody

Badania przeprowadzono na 64 dorosłych szczurach Sprague-Dawley na

terenie Centrum Medycyny Doświadczalnej SUM w Katowicach na podstawie

zgody Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach nr. 36/2012.

Zwierzęta zostały podzielone na 8 grup badawczych , po 10 osobników w

każdej z nich. W czasie trwania eksperymentu odnotowywano wszelkie

zmiany zachowań konsumacyjnych zwierząt i kontrolowano masę ich ciała .

1. Grupa kontrolna I (nie poddawana działaniu leków, przyjmująca roztwór soli fizjologicznej codziennie przez 4 tygodnie)

2. Zwierzęta przyjmujące olanzapinę w dawce 5 mg/kg dziennie przez 4 tygodnie

3. Zwierzęta przyjmujące chlorpromazynę w dawce 5 mg/kg dziennie przez 4 tygodnie

4. Zwierzęta przyjmujące haloperidol w dawce 2 mg/kg dziennie przez 4 tygodnie

5. Grupa kontrolna II (nie poddawana działaniu leków, przyjmująca

jednorazowe wstrzyknięcie roztworu soli fizjologicznej) 6. Zwierzęta przyjmujące jednorazowe wstrzyknięcie olanzapiny (5 mg/kg) 7. Zwierzęta przyjmujące jednorazowe wstrzyknięcie chlorpromazyny (5

mg/kg) 8. Zwierzęta przyjmujące jednorazowe wstrzyknięcie haloperidolu (2 mg/kg).

Wszystkie zwierzęta były dekapitowane w stanie anestezji, po czym

wypreparowane zostały mózgowia; 4 mózgowia utrwalono z zbuforowanym

roztworze formaldehydu przygotowano do procedury badań

immunohistochemicznych, z 6 wyizolowano podwzgórze, hipokamp, ciało

migdałowate , prążkowie i pień mózgu. Wypreparowane okolice mózgowia poddano

zostaną homogenizacji i procesowi izolacji RNA do techniki RT-PCR. Z

homogenatów tkankowych wyizolowano całkowity RNA, a następnie wykonano

reakcje RT-PCR w wersji klasycznej ("end point" - wizualizacja na żelu agarozowym)

lub w czasie rzeczywistym Real-Time PCR z użyciem odpowiednich primerów celem

określenia ekspresji następujących genów:

A.) neuropeptydu S (NPS) B.) receptora NPSR C.) nesfatyny-1 D.) kisspeptyny 1 E.) proopiomelanokortyny (POMC) F.) neuropeptydu Y (NPY) G.) receptora MC,R

Utrwalone i przepojone sacharozą preparaty mózgowia zostały pokrojone w

płaszczyźnie koronalnej przy użyciu kriostatu na skrawki (7mm) i naklejone na

szkiełka podstawowe. Na skrawkach zawierających badane ośrodki podwzgórza;

jadra łukowate , środkowe , przykomorowe oraz podwzgórze boczne (ustalonych na

podstawie standardowego atlasu Paxinosa i Watsona) przeprowadzono reakcje

immunohisłochemiczne z użyciem odpowiednich przeciwciał, celem oceny ekspresji

następujących oreksygennych i anoreksygennych czynników regulatorowych i ich

receptorów:

1. oreksyny A 2. a-melanotropiny (a-MSH) 3. nesfatyny-1 4. Receptora NPY typu Y, 5. Receptora oreksynergicznego OX, R 6. Receptora melanokortynowego MC,R

a także ekspresji endogennych wskaźników proliferacji komórkowej mitotycznych Ki-

67, oraz markera niedojrzałych komórek nerwowych (neuroblastów) - doublekortyny

(DCX).

Dyskusja wyni ków badań

Neuropeptyd S

Neuropeptyd S (NPS) jest selektywnym 20-aminokwasowym ligandem

sprężonego z białkami Gs i Gq receptora NPSR uprzednio identyfikowanego jako

sierocy receptor GPR 154 Gen NPS składa się u człowieka z 9 egzonów i

zlokalizowany jest na chromosomie 7p14, jego liczne polimorfizmy istotnie korelują

ze zwiększonym ryzykiem schorzeń układu oddechowego oraz zaburzeń rytmów

okołodobowych, Kluczową rolę w aktywacji receptora NPSR odgrywa wspomniana

już N-końcowa sekwencja aminokwasów (Ser-Phe-Arg), natomiast środkowy

helikalny fragment cząsteczki wykazuje cechy domeny regulatorowej hamującej ten

proces

Spośród 8 odmiennych strukturalnie i topologicznie izoform błonowego

receptora NPSR człowieka (NPSR A, Bk'''k;, B dI"g;, C-G) , jedynie 3; A, B''''g; i G są

funkcjonalnymi receptorami wbudowywanymi w błonę neuronu. Homologia

strukturalna NSPR człowieka i gryzoni wynosi około 89%. Efektem aktywacji

receptora NPSR jest zarówno uwolnienie rezerw Ca2+ do neuroplazmy jak i wzrost

poziomu cAMP , co skutkuje pobudzeniem komórki nerwowej . I stnieją też sugestie , że

stymulacja receptora NPSR pociąga za sobą fosforylację kinazy białkowej MAPK.

Neuropeptyd S jest neuromodulatorem o szerokim spektrum aktywności

fizjologicznej w OUN, wykazuje działanie anksjolityczne stabilizuje stan czuwania,

zwiększa aktywność motoryczną , uczestniczy w procesie regulacj i przyjmowania

pokarmu, odgrywa też rolę w patomechanizmie uzależnień . Zastosowanie RTI-118

selektywnego antagonisty NSPR, zmniejsza samopodawanie kokainy u szczurów nie

zaburzając przyjmowania pokarmu . Blokada NPSR wydaje się być zatem obiecującą

strategią w terapii uzależnień. Neuropeptyd S jest też elementem mechanizmów

konsolidacji pamięci zarówno awersyjnej jak i neutralnej. Ostatnie doniesienia

ujawniają rolę NPS i NPSR w mechanizmach utrzymywania prawidłowej architektury

snu, egzogenny NPS stabilizuje stan czuwania. Nie mniej interesujący wydaje się być

wpływ NPS na układ pozapiramidowy, zaobserwowano, że opóźnia on indukowane

6-0HOA zaburzenia ruchowe u myszy, prawdopodobnie drogą stymulacji transmisji

dopaminergicznej . Niewykluczone zatem , że agon iści NSPR mogą stać się

alternatywnym rozwiązaniem w terapii choroby Parkinsona.

Ekspresję NPS manifestuje ograniczona przestrzennie populacja

glutaminergicznych neuronów pnia mózgu gryzoni, skupionych w okolicy miejsca

sinawego. U szczura jedynymi strukturami, w których wykazano obecność NPS są :

miejsce sinawe w części sąsiadującej z jądrem Barringtona, główne jądro czuciowe

nerwu trójdzielnego i boczne jądro okołoramienne, u myszy natomiast jądro Kbllikera­

Fuse oraz okolica okołosinawa. Pewna liczba komórek NPS jadra okoloramiennego

odznacza się koekspresją CRF. Większość neuronów NPS okolicy okołosinawej to

komórki glutaminergiczne, jedynie ich niewielka, bocznie ulokowana grupa wykazuje

ekspresję acetylocholiny. Gęsta sieć wlókien oreksynergicznych otaczająca neurony

NPS, może sugerować modulujący wplyw tego neuropeptydu na ich czynność. U

szczura , ekspresję mRNA neuropeptydu S wykazują też nieliczne neurony

rozproszone w podwzgórzu i ciele migdałowatym . Ekspresją mRNA receptora NPSR

odznaczają liczne okolice mózgu: opuszka węchowa , kora przedgruszkowata i

śródgruszkowata , ciało migdałowate , jądro przykomorowe i przedwzrokowe

podwzgórza, jądra śródblaszkowe wzgórza , jądro guzowo-suteczkowate.

Najistotniejszą z punktu widzenia neuropsychiatrii rolą NPS wydaje się być

jego aktywność na poziomie szlaków neuronalnych związanych z neurobiologią lęku.

Szereg przeprowadzonych na szczurach testów behawioralnych dowodzi , iż

ośrodkowe podanie NPS wyzwala u nich silny efekt anksjolityczny, dochodzi też do

aktywacji osi HPA. Ozialanie przeciwlękowe NPS wydaje się być związane ze

zwiększeniem uwalniania dopaminy w przyśrodkowej korze przed czołowej przy

jednoczesnym braku wpływu na sygnalizację serotoninergiczną . Zaobserwowano, że

polimorfizmy genu receptora NPSR u ludzi są związane z osobniczymi

zmiennościami w zakresie odczuwania lęku oraz występowaniem lęku panicznego.

Ekspozycja na stres wydaje się być czynnikiem aktywującym uwalnianie NPS w

określonych okolicach mózgowia. Najnowsze badania dowiodly, że populacja

neuronów brzusznego hipokampa szczura wykazuje zdolność wychwytu NPS

podanego donosowo, co skutkuje efektem anksjolitycznym. Również aplikacja

neuropeptydu do organotypicznych skrawków mózgu aktywuje neurotransm isję i

plastyczność synaps w polach CA 1 i CA3 a celowana mikroiniekcja NPS

bezpośrednio do brzusznego CA 1 jest wystarczająca do redukcji zachowań lękowych

u myszy. Co więcej. NPS dzialając za pośrednictwem swego receptora gwaHownie

oslabia strumień aktywności neuronów od zakrętu zębatego do CA 1 w warunkach in

vitro. Transgeniczne myszy pozbawione genu NPSR manifestują fenotyp

anksjogenny, bez behawioralnych oznak depresyjnych. Jednym z proponowanych

mechanizmów anksjolitycznego dzialania NPS, jest jego wpływ na procesy pamięci .

Wprowadzenie NPS do ciała migdalowatego myszy prowadzi do zniesienia lęku

warunkowego, nie wywiera natomiast tego efektu , gdy ma miejsce przed procesem

warunkowania. Istnieją również sugestie, że NPS stymuluje plastyczność

synaptyczną mózgu promuje konsolidację wszystkich typów pamięci.

Przeprowadzono również badania kliniczne mające na celu ocenę znaczenia NPS i

NPSR w patogenezie lęku i innych dysfunkcji psychicznych. Identyfikacja

polimorfizmu w genie kodującym NSPR, stała się żródlem odkrycia, że T-allele

wykazują związek z występowaniem lęku panicznego i zwiększoną wrażliwością na

bodżce lękowe . Badania obrazowe z wykorzystaniem czynnościowego MRI dowiodły ,

że zwiększona aktywność podstawno-bocznego ciala migdalowatego koreluje z

obecnością T-alleli genu NPSR u zdrowych ochotników poddanych stymulacji

awersyjnej. W ostatnim czasie pojawiły się również sugestie, że T-allele NSPR mogą

mieć związek lękiem , nadmierną reakcją na stres i zwiększonym pObudzeniem osi

HPA u ludzi zdrowych.

W chwili obecnej brak danych dotyczących zmian ekspresji NPS związanych

z działaniem lekówantypsychotycznych. Badania nad wpływem tej grupy leków na

peptydergiczne szlaki regulacyjne mogą być żródlem hipotez sugerujących istnienie

alternatywnych dróg ich działania farmakologicznego. W naszym modelu badawczym

skupiliśmy się na analizie ekspresji NPS i NPSR mRNA w wybranych strukturach

mózgu szczurów poddanych dlugotrwalemu dzialaniu neuroleptyków (Pałasz et

Rojczyk 2015, Journal ol Molecular Neuroscience, Pałasz et al. 2016, Acta

Neuropsychiatrica).

Zaobserwowaliśmy wzrost poziomu NPS mRNA w podwzgórzu zarówno po

krótkotrwałym jak i chronicznym podawaniu olanzapiny. Biorąc pod uwagę , że NPS

wykazuje niezależny od NPY hamujący wpływ na przyjmowanie pokarmu,

prawdopodobna wydaje się być hipoteza sugerująca, że olanzapina może

modulować homeostazę energetyczną zachowania konsumacyjne drogą

alternatywną poprzez regulację ekspresji genu NPS.

Poziom NPSR mRNA był istotnie obniżony w hipokampie i prążkowiu zwierząt

poddanych chronicznemu działaniu olanzapiny i chlorpromazyny. W podwzgórzu

natomiast obserwowany był spadek ekspresji NPSR mRNA zarówno po

krótkotrwałym jak i długoterminowym podawaniu chloropromazyny. Być może wzrost

poziomu NPS mRNA w podwzgórzu odzwierciedla zwiększone uwalnianie

neuropeptydu w tej okolicy mózgu. Należy też rozważać możliwość, że spadek

ekspresji NPSR mRNA może stanowić kompensacyjną odpowiedź na zwiększone

stężenie NPS.

Można przypuszczać , że dopamina hamuje ekspresję genu NPS w

określonych strukturach mózgu. Blokada receptorów dopaminowych przez leki

antypsychotyczne skutkuje w tych warunkach kompensacyjnym wzrostem ekspresji

tego neuropeptydu. W ostatnim czasie udowodniono, że spadek poziomu

internalizacji NPSR w neuronach układu limbicznego i obniżona ekspresja NPS w

miejscu sinawym szczura związane są z odczuwaniem lęku i bólu. Co interesujące ,

dokomorowa iniekcja NPS powodowała zniesienie tych efektów u badanych zwierząt.

Stymulacja szlaku sygnałowego NPS może zatem w sposób istotny wpływać na

regulację zachowań lękowych i odczuwanie przewlekłego bólu. Co więcej , NPS może

również być zaangażowany w funkcjonowanie osi HPA, stanowiąc element

negatywnego sprzężenia zwrotnego w odpowiedzi na bodźce stresowe.

Bardzo znaczny wzrost poziomu NPS mRNA w pniu mózgu u zwierząt

poddanych długotrwałemu działaniu haloperidolu pozostaje w zgodzie z opisanymi

we wstępie ograniczonymi danymi prezentującymi modulujący wpływ leków

antypsychotycznych na ekspresję szeregu neuropeptydów w różnych okolicach

mózgu. Niemniej interpretacja zaobserwowanego zjawiska nie jest obecnie łatwym

zadaniem. Istnieją sugestie, że haloperidol może indukować zaburzenia bilansu

oksydacyjnego neuronów. Być może obserwowany wzrost ekspresji NPS jest częścią

mechanizmu ochrony neuronów w sytuacji długotrwałego narażenia na ten

neuroleptyk. Co więcej, stwierdzono, że NPS może osłabiać proces peroksydacji

lipidów w korze mózgu myszy, co potwierdza jego działanie neuroprotekcyjne w

stanie stresu oksydacyjnego. Warto też odnotować , że pojedyncze dawki

haloperidolu i innych klasycznych neuroleptyków zwiększają liczbę spontanicznie

aktywnych komórek dopaminergicznych w bogatych w NPS obszarach Ag a A10 pnia

mózgu, natomiast olanzapiny i leków atypowych stymulują wybiórczo populację

komórek jedyne w polu A10. Długotrwale podawanie haloperidolu zmniejsza liczbę

aktywnych neuronów w polach Ag a A 10 a olanzapiny jedynie w polu A 10.

Co ciekawe, chroniczne narażenie na haloperidol spowodowało obniżenie

poziomu NPSR mRNA zarówno w hipokampie jak i prążkowiu . Efekt ten jest trudny

do wyjaśnienia bez dokonanie precyzyjnej analizy potencjalnych interakcji pomiędzy

NPSR a sygnalizacją dopaminergiczną. Być może haloperidol moduluje zależną od

NPS plastyczność synaptyczną w hipokampie pośrednicząc w generowaniu reakcji

lękowych. Prawdopodobnie wysoki wzrost poziomu NPS mRNA w pniu mózgu może

sugerować wzmożoną syntezę i uwalnianie neuropeptydu do formacji hipokampa i

prązkowia. Zatem, możliwym jest, że obserwowany spadek ekspresji NPSR mRNA

może być kompensacyjną odpowiedzią na wzrost stężenia NPS w tych strukturach.

Poziom NPSR mRNA w pniu mózgu po dlugotrwalym podawaniu haloperidolu był

równ ież istotnie podniesiony. Teoretycznie, lek ten powinien zwiększać pobudliwość

i/lub aktywność sygnalizacji NPS w pniu mózgu i w konsekwencji uruchamiać

zawiera liczną populację mechanizmy anksjolityczne.

neuronów aminergicznych z

Co istotne, pień

ekspresją NPSR,

mózgu

odgrywającą kluczową rolę w w

modulowaniu korowej transmisji glutaminergicznej i utrzymywaniu stanu czuwania.

Można zatem sformulować hipotezę , że haloperidol wptywa na nie w sposób

pośredni drogą stymulacji szlaku NPS. Przewlekłe podawanie haloperidolu powoduje

szereg istotnych efektów niepożądanych jak przediużona sedacja, dyskinezja i inne

zaburzenia ruchowe. Najnowsze doniesienia przypisują istotną rolę NPS w

ośrodkowych mechanizmach motorycznych, sugerując jednocześnie , iż realizują się

one poprzez wptyw na sygnalizację dopaminową. Zaobserwowano również , że

celowana infuzja NPS do prążkowia i istoty czarnej pobudza aktywność motoryczną

u szczura. Efekt ten jest zniesiony podaniem SHA68, selektywnego antagonisty

NPSR oraz antalarminy, blokera receptora CRF-1 . Wskazuje to jednoznacznie na

udział CRF w NPS-zależnej kontroli aktywności ruchowej. Również ośrodkowa

iniekcja NPS redukuje zaburzenia ruchowe spowodowane zasłosowaniem

dopaminergicznej neurotoksyny 6-0HDA. Prawdopodobnie NPS może stymulować

uwalnianie dopaminy drogą selektywnej aktywacji NPSR w neuronach układu

pozapiramidowego.

Obserwowany spadek ekspresji NPSR mRNA w prążkowiu sugeruje, że

aktywność farmakologiczna haloperidolu może realizować się również na poziomie

sygnalizacji NPS w jądrach podstawnych, będąc jedną z alternatywnych dróg

wyzwalania objawów dyskinetycznych przez ten neuroleptyk. Co więcej , ostatnie

badania dowodzą, że haloperidol hamuje łączność czynnościową pomiędzy istotą

czarną i korą ruchową, czego efektem są dysfunkcje motoryczne.

Niewykluczone, że dopamina może hamować ekspresję genów kodujących

pewne neuropeptydy w tym NPS w określonych obszarach mózgu. Blokada

receptorów dopaminowych przez haloperidol skutkuje zatem kompensacyjnym

wzrostem ekspresji wymienionych peptydów. Mechanizm anksjolitycznego działania

haloperidolu nie został w pełni wyjaśniony, sugerowany jest tu przede wszystkim

antagonizm względem receptorów dopaminowych O2 oraz serotoninowych 5-HT2. Z

drugiej strony warto odnotować, że neuroleptyki atypowe klozapina i olanzapina , ale

nie haloperidol mogą zwiększać poziom dwu pozytywnych sterydowych modulatorów

receptora GABAA allopregnenolonu i THDOC (allotetrahydrodeoksykortykosteron) w

mózgu szczura.

Podsumowując, fakt iż leki antypsychotyczne wpływają na poziom ekspresji

NPS i NPSR mRNA w mózgu szczura może potwierdzać hipotezę postulującą j rolę

NPS zarówno w przeciwlękowym działaniu neuroleptyków jak i w patofizjologii

zaburzeń psychicznych. Warto dodać, że syntetyczny NPS wykazuje silny efekt

anksjolityczny u gryzoni z wrodzoną predyspozycją do wzmożonych reakcji

lękowych. Istnieją zatem uzasadnione przypuszczenia, że NPS może być

obiecującym lekiem w terapii zaburzeń lękowych u pewnych grup pacjentów.

Otrzymane przez nas intrygujące wyniki wymagają dalszych wnikliwych badań

zarówno farmakologicznych jak i behawioralnych uwzględniających m.in. szersze

spektrum lekówantypsychotycznych oraz wykorzystujące zdobycze biologii

molekularnej zwłaszcza w zakresie modulacji czynnościowej receptora NPSR

Niemniej już w tej chwili pozwalają one sugerować istnienie szeregu nieznanych

dotąd interakcji pomiędzy receptorami dopaminowymi a szlakiem sygnałowym NPS,

przez co otwierają potencjalne perspektywy klinicznych zastosowań

farmakomodulacji szlaków peptydergicznych. Pragnę w tym miejscu podkreślić, że

przedstawione wyniki stanowią w chwili obecnej jedyne dostępne w literaturze źródło

informacji na temat potencjalnych związków pomiędzy lekami antypsychotycznymi a

neuropeptydem S.

Nesfatyna-1

Kolejnym intrygującym neuropeptydem regulatorowym o szerokim spektrum działania

jest odkryta w roku 2006 przez Oh i wsp. nesfatyna-1 Nesfatyna-1 jest produktem

potranslacyjnej modyfikacji prohormonu NEFAlnukleobindyny-2 (NUCB2) przy

udziale odpowiedniej konwertazy. Prekursorowe białko NUCB2 jest polipeptydem

złożonym z 396 aminokwasów, poprzedzonym 24-aminokwasowym peptydem

sygnałowym. Charakteryzuje się ono znaczną , ponad 85% homologią sekwencji

pomiędzy człowiekiem i ssakami a nawet niższymi kręgowcami . Cząsteczkę

nesfatyny-1 budują 3 domeny N-terminalna (N23), środkowa (M30) i C-terminalna

(C29). Kluczowa rolę w wyzwalaniu efektów fizjologicznych peptydu zdaje się

odgrywać fragment M30. Skutkiem obróbki cząsteczki NUCB2 jest powstanie

również innych pochodnych: nesfatyny 2 i 3, peptydów nie wykazujących aktywności

nesfatyny-1 .

W pocwzgórzu szczura, ekspresją nesfatyny-1 odznaczają się neurony

zlokalizowane w jądrze łukowatym , jądrze przykomorowym, jądrze nadwzrokowym,

grzbietowo-przyśrodkowym i bocznym podwzgórzu , są one również wykrywalne w

warstwie niepewnej. Przyjmuje się , że anoreksygenne działanie peptydu realizowane

jest w głównej mierze o obrębie pierwszych trzech kluczowych podwzgórzowych

centrów regulacyjnych . Neuronami zdolnymi do syntezy nesfatyny-1 , są również

zlokalizowane w pniu mózgu serotoninergiczne komórki jądra bladego i ciemnego

szwu oraz komórki cholinergiczne jądra dodatkowego nerwu okoruchowego (jądro

Westphala-Edingera, EW), i jądra grzbietowego nerwu błędnego . Ponieważ pewna

liczba współczulnych aksonów wychodzących z jader szwu dociera do komórek

tkanki tłuszczowej brunatnej, sugerowany jest udział nesfatyny-1 w regulacji

termogenezy. Niewykluczone również, że nesfatyna-1 uwalniana z zakończeń nelWu

błędnego może wpływać na sekrecyjną i motoryczną aktywność przewodu

pokarmowego i regulować proces trawienia, natomiast jej udział w fizjologii nerwu

okoruchowego nie jest jednoznacznie wyjaśniony . Immunoreaktywnością nesfatyny-

1 charakteryzują się ponadto perykariony kory gruszkowatej , wyspowej i obręczy

jądra śródgruszkowatego, bocznej przegrody, korowego przedniego i środkowego

jądra migdałowatego, jądra łożowego prążka krańcowego (BNST) oraz jądra

śródmiąższowego spoidła przedniego. Zidentyfikowano Ją również w innych

strukturach pnia mózgu, w jadra grzbietowego szwu, jądra wielkiego szwu,

wielkokomórkowego jądra siatkowatego, bocznego jądra okołoramiennego , jądra

dwuznacznego, istoty szarej okołowodociągowej a nawet w komórkach Purkyne'go

kory móżdżku. Co więcej, obecność nesfatyny-1 wykry10 również we współczulnych i

przywspółczulnych neuronach przedzwojowych biorących swój początek w

piersiowym, lędźwiowym i krzyżowym odcinku rdzenia kręgowego. Efektem

naj nowszych prac eksperymentalnych jest wykazanie obecności nesfatyny-1 w tych

okolicach mózgu zwierząt, w których dotychczas nie była zidenty1ikowana.

Nesfatyna-1 jest obecna w perykarionach autonomicznych ośrodków mózgowia ,

przedzwojowych trzewnych neuronach motorycznych rdzenia kręgowego oraz

jądrach kresomózgowia zaangażowanych w odczuwanie bólu i procesy poznawcze

wydaje się potwierdzać przypuszczenie, że fizjologiczna rola tego neuropeptydu

dalece wykracza poza sferę regulacji przyjmowania pokarmu i uczestniczy ona

również w mechanizmach naczynioruchowych, neurosekrecyjnych i emocjonalnych.

Nesfatyna-1 jest czynnikiem wybitnie anoreksygennym, wyzwalającym

poczucie sytości, hamującym przyjmowanie pokarmu i wody. Podana bezpośrednio

do komory bocznej mózgu szczura, powoduje zależną od dawki redukcję zachowań

konsumacyjnych , natomiast efektem prowadzenia ciągłego wlewu do komory III jest

istotna redukcja masy ciała i spadek zawartości żółtej tkanki tłuszczowej . Iniekcja

dootrzewnowa nesfatyny-1 wywołuje u myszy 3 godzinną supresję przyjmowania

pokarmu, podanie podskórne wyzwala identyczny efekt a działanie anoreksygenne

utrzymuje się przez 14 godzin. Powtarzalne dawki dootrzewnowe znacząco hamują

przyrost masy ciała w ciągu 6 dni. Poziom nesfatyny-1 w surowicy jest znacząco

obniżony w słanie głodu, ponowne przyjmowanie pokarmu prowadzi do jego

normalizacji. Nesfatyna-1 pokonuje ba rierę krew-mózg , co stwarza potencjalną

możliwość zasłosowania jej, jako leku, który po osiągnięciu ośrodków podwzgórza

wywoła efekt hamujący apetyt i przyjmowanie pokarmu. Zaobserwowano ostatnio, że

u ludzi stosunek stężenia nesfatyny-1 w relacji płyn mózgowo-rdzeniowy/surowica był

znacząco negatywnie skorelowany z 8MI i masą ciała, co może sugerować , że

nesfatyna-1 jest neuropeptydem wiązanym w surowicy. Postawiono też hipotezę , że

zależne od masy ciała zmiany efektywności wychwy1u nesfatyny-1 przez CSF mogą

być spowodowane wysyceniem jej transporterów.

Szereg przeprowadzonych ostatnio badań sugeruje, że ostry stres jest jednym

z czynników aktywujących neurony nesfatynowe PVN, SON, NTS oraz EW.

Całkowita adrenalektomia prowadzi do wzrostu ekspresji mRNA NUCB2 w PVN,

natomiast dokamorowa iniekcja nesfatyny-1 skutkuje wzrostem poziomu hormonów

stresowych ACTH i kortykosteron w surowicy. Nesfatyna-1 wydaje się też

uczestniczyć w powstawaniu uogólnionych objawy stresu. Podanie peptydu do komór

bocznych mózgu szczura powodowało wzrost ciśnienia krwi. Sugeruje się , że

presyjne efekty podanej centralnie nesfatyny-1 są również skutkiem stymulacji

nerkowych włókien współczulnych realizowanej za pośrednictwem szlaków

melanokortynowych podwzgórza . Zaobserwowano również istotne podwyższenie

ekspresji nesfatyny-1 w neuronach jąder szwu i Le i EW u szczurów poddanych

działaniu różnych czynników stresowych. Nesfatyna-1 aktywuje wrażliwe na stres

neurony serotoninergiczne jąder szwu i noradrenergiczne Le, co pobudza neurony

CRF w PVN i ostatecznie uruchamia oś HPA. Jak wiadomo, jądra szwu i LC są

również kluczowymi ośrodkami sygnalizacji serotoninergicznej i noradrenergicznej

mózgu a ich dysfunkcje są ściśle skorelowane z patogenezą depresji i lęku . Nasuwa

to przypuszczenie, ze nesfatyna-1 może odgrywać w tych mechanizmach

hipotetyczną , w chwili obecnej niesprecyzowana role. Pojawiły się już sugestie, że

nesfatyna-1 wyzwala reakcje lękowe być może również depresyjne, drogą aktywacji

szlaków melanokortynowych, skutkującej hamowaniem neuronów GABA-ergicznych

lub alternatywnie poprzez hiperpolaryzację neuronów NPY w jądrze łukowatym . U

pacjentów z MDD wykazano wyższy poziom nesfatyny-1 w surowicy w porównaniu z

obserwowanym w zdrowej populacji . Wyniki te zasadniczo potwierdzają

dwukierunkową przepuszczalność bariery krew-mózg dla nesfatyny-1 są jednak w

chwili obecnej trudne do szerszej interpretacji. Nie wiadomo bowiem , które populacje

neuronalne mózgowia odpowiadają za podwyższoną sekrecję nesfatyny-1 u chorych

z MDD i jaki jest mechanizm tego zjawiska . Co więcej , nie można też wykluczyć, że

dodatkowym żródłem krążącej nesfatyny-1 mogą być również aktywowane w1órnie

komórki usytuowane poza CNS.

W wyniku przeprowadzonego eksperymentu wykazaliśmy po raz pierwszy, że

leki antypsychotyczne są w stanie modulować ekspresję NUCB2 i nesfatyny-1

(Rojczyk et al. 2015, Neuropeptides). Efekt ten wydaje się być szybki , ponieważ już

pojedyncza dawka olanzapiny, chlorpromazyny i haloperidolu silnie zmniejszyła

ekspresję mRNA dla NUCB2. Równocześnie poziom białka nesfatyny-1 zmniejszył

się po jednorazowym wstrzyknięciu, ale tylko w jądrze brzuszno-przyśrodkowym i

tylko po podaniu chloropromazyny. Stało się tak przypuszczalnie dlatego, że zmiany

w ekspresji genu zamanifestowały się na poziomie białka jakiś czas póżniej . W

istocie, dopiero po chronicznym podaniu neuroleptyków nastąpił znaczący spadek

poziomu białka nesfatyny-1 w jądrze łukowatym , podwzgórzu bocznym i jądrze

brzuszno-przyśrodkowym . Pewien efekt hamujący zaobselWowaliśmy również w

jądrze przykomorowym po długotlWałym pOdawaniu chloropromazyny i haloperidolu.

Z kolei reakcja PCR po chronicznym podaniu neuroleptyków wykazała , że spośród

trzech badanych leków tylko olanzapina zmniejszyła poziom mRNA dla NUCB2.

Sugeruje to, że efekt chloropromazyny i haloperidolu jest raczej szybki i niestabilny w

czasie - po początkowym szybkim spadku mRNA dla NUCB2 wraca on po 4

tygodniach do stanu podstawowego (charakterystycznego dla grupy kontrolnej).

Natomiast w przypadku olanzapiny podobne zmiany mogą być bardziej stabilne i

długotlWałe. Biorąc pod uwagę , że spośród badanych przez nas leków właśnie

olanzapina powoduje najbardziej znaczące przybieranie na wadze pacjentów, można

wysunąć hipotezę , że ten powszechny skutek uboczny jest częściowo związany ze

spadkiem ekspresji nesfatyny-1 . Receptor dla tego białka nie jest jeszcze znany,

zatem zagadnienie to wymaga szeregu dalszych badań.

Kisspeptyna

Kisspeptyna jest C-terminalnie amidowanym neuropeptydem, transkryptem

genu Kiss1. Jako ligand metabotropowego receptora Kiss1 R (GPRS54) odgrywa

kluczową rolę w regulacji cyklu jajnikowego. Kisspeptyna reguluje wydzielanie

hormonu gonadotropowego (GnRH) przez neurony podwzgórza drogą stymulacji ich

wyładowań i depolaryzacj i. Ekspresja genu Kiss-1 pozostaje pod ścisłą kontrolą

uwalnianych do krwiobiegu estrogenów i testosteronu .

Ostatnie badania ujawniły, że myszy z selektywną delecją genu Kiss-l w

genomie neuronów GnRH charakteryzowały się zaburzonym zr6znicowaniem

płciowym na poziomie mózgowym. Co również istotne, neurony kisspeptynowe

wysyłają projekcje aksonalne do oreksygennych (NPY/AgRP) oraz anoreksygennych

(POMC/CART) neuronów jądra łukowatego podwzgórza . Dowiedziono, że

kisspeptyna może bezpośrednio pobudzać neurony POMC/CART i pośrednio

hamować NPY/AgRP poprzez wzmocnienie transmisji GABA-ergicznej . Neuropeptyd

ten hamuje przyjmowanie pokarmu i może być uznany za kolejny podwzgórzowy

czynnik anoreksygenny. Pomimo licznych badań dotyczących funkcji kisspeptyny, jej

rola w regulacji bilansu energetycznego i zachowali pokarmowych nie została

jeszcze wyjaśniona .

Dotychczasowe badania były skoncentrowane wyłącznie na podwzgórzowej

aktywności kisspeptyny, niewiele wiadomo na temat potencjalnej roli tego

neuropeptydu w innych okolicach mózgu. Ekspresję Kiss-1 mRNA zarejestrowano w

hipokampie, gdzie jest ona jednak 5-100 razy słabsza niż w podwzgórzu. Wiadomo,

że szereg neuropeptydów m.in . NPY i somatostatyna wpływa na plastyczność i

pobudliwość neuronów hipokampa. Model działania kisspeptyny wydaje się być

unikalny, bowiem powoduje ona wzrost pobudzającej odpowiedzi neuronów drogą

modulacji sygnalizacji postsynaptycznej. Kisspeptyna pobudza transmisję

synapłyczną hipokampa drogą akływacji szlaku sygnałowego kinazy MAP (MAPK) w

neuronach ziarnistych zakrętu zębatego . Być może ten system regulacyjny odgrywa

nieznaną jeszcze rolę w mechanizmach uczenia się i patogenezie epilepsji. Co

szczególnie interesujące , ekspresja genu Kiss-1 w hipokampie wydaje się być

zależna od obwodowego stężenia estrogenów i progesteronu.

Indukowane przez neuroleptyki zaburzenia homeostazy energetycznej są

zjawiskiem często obserwowanym w praktyce klinicznej, jednak wpływ tych leków na

sygnalizację peptydergiczną podwzgórza jest wciąż słabo poznany. Potencjalne

działanie lekówantypsychotycznych jako antagonistów receptorów dopaminowych

na ekspresję kisspeptyny nie zostało wyjaśnione . W chwili obecnej brak w

piśmiennictwie danych dotyczących związków pomiędzy lekami antypsychotycznymi

a ekspresją kisspeptyny. Przedstawione badanie miało zatem za cel ustalenie jak

wybrane klasyczne i atypowe neuroleptyki wpływają na poziom Kiss-1 mRNA w

podwzgórzu i hipokampie szczura (pałasz et al. 2016, Pharmacopsychiatry) .

Istotny spadek poziomu Kiss-1 mRNA w podwzgórzu po dlugotrwałym

podawaniu neuroleptyków koresponduje z naszymi wcześniejszymi badaniami, w

których wykazaliśmy w analogicznych warunkach obniżenie ekspresji

NUCB2/nesfatyny-1 mRNA Pozostaje też w zgodzie z doniesieniem, że haloperidol

obniża ekspresję NPY mRNA w ciele migdalowatym i hipokampie szczura, natomiast

olanzapina czyni ten sam efekt w jądrze półleżącym , prążkowi u i korze zakrętu

obręczy. Z drugiej strony nasze wyniki pozostają w sprzeczności z nielicznymi

danymi sugerującymi, że neuroleptyki promują ekspresję neuropeptydów w

podwzgórzu . Przykladowo, haloperidol zwiększa wydzielanie GnRH sugerując

możliwą rolę tego neurohormonu w mechanizmie działania tego leku , jak również

podnosi poziom CRF mRNA w tym obszarze.

Mając na uwadze fakt, że kisspeptyna pobudza neurony POMC/CART i

hamuje antagonistycznie funkcjonujące komórki NPY/AgRP, można zaproponować

hipotezę , że badane neuroleptyki mogą stymulować pobieranie pokarmu w sposób

pośredni drogą zwiększenia ekspresji genu Kiss-1 w określonych neuronach

podwzgórza . Nie jest też w związku z tym wykluczone , że obserwowany efekt może

również odgrywać alternatywną rolę w centralnych mechanizmach odpowiedzialnych

za zależny od neuroleptyków wzrost masy ciała . W naszym badaniu wykazaliśmy po

raz pierwszy zmiany ekspresji Kiss-1 mRNA w różnych obszarach mózgu szczurów

poddanych działaniu neuroleptyków. Pewnym ograniczeniem był niewątpliwie brak

oznaczenia poziomu białka neuropeptydu, co będzie przedmiotem naszym dalszych

prac eksperymentalnych wykorzystujących techniki immunohistochemiczne.

Efektem ubocznym terapii z wykorzystaniem lekówantypsychotycznych mogą

być również dysfunkcje układu rozrodczego związane z potencjalnym wpływem tych

leków na podwzgórzowe systemy regulacyjne wchodzące w skład osi

podwzgórzowo-przysadkowo-gonadalnej (HPG). Stwierdzono między innymi, że

haloperidol i risperidon istotnie zaburzają cykl jajnikowy u szczurów. Z kolei

olanzapina indukuje wzrost masy ciała bez istotnego wpływu na stężenia estrogenów

i prolaktyny. Otrzymane przez nas wyniki mogą sugerować , że potencjalne zmiany w

osi HPG u osobników męskich traktowanych neuroleptykami mogą być

spowodowane ich wpływem na podwzgórzową ekspresję kisspeptyny. Modulujący

efekt neuroleptyków poziom Kiss-1 mRNA w mózgu szczura pozwala na wysunięcie

przypuszczenia, że kisspeptyna może być nieznanym dotąd elementem

patomechanizmu wyzwalanych przez te leki działań niepożądanych . Przedstawione

przez nas wyniki rzucają nowe światło na problem związku pomiędzy farmakologią

neuroleptyków a sygnalizację kisspeptynową mózgu, wymagając jednocześnie

szeregu dalszych badań neurofizjologicznych, molekularnych i behawioralnych.

Feniksyna

Feniksyna (PNX) to zidentyfikowany niedawno, skrajnie mało zbadany

neuropeptyd regulatorowy mózgowia. Dotychczas wiadomo jedynie, iż reguluje on

przysadkową sekrecję gonadotropin poprzez modulację ekspresji receptora dla

gonadoliberyny (GnRH-R). Wstępne badania sugerują, że feniksyna raczej

uwrażliwia przysadkę na działanie innych czynników uwalniających , niż bezpośrednio

stymuluje egzocytozę pęcherzyków wydzielniczych w przysadkowych komórkach

endokrynnych. Dzięki badaniom immunohistochemicznym wykazano obecność PNX

w ograniczonych przestrzennie populacjach neuronów podwzgórza , rogu

grzbietowego rdzenia kręgowego , pasma rdzeniowego nerwu trójdzielnego, jądra

pasma samotnego, oraz w komórkach zwojów czuciowych. Zaobserwowano również ,

że feniksyna podana z zewnątrz może preferencyjnie hamować ból trzewny w

porównaniu do bólu termicznego. Najnowsze doniesienia sugerują , że mechanizmem

transdukcji sygnału uruchamianym przez PNX jest szlak MAP KlERK. W toku analizy

anatomicznej dystrybucji feniksyny w podwzgórzu szczura interseująca okazałą się

prawidłowość , iż pokrywa się ona w znacznym stopniu z lokalizacją neuronów z

ekspresją nesfatyny-1. Zarysowało się zatem przypuszczenie, że pewna populacja

neuronów jąder

Przeprowadzony

podwzgórza wykazuje koekspresję obydwu neuropeptydów.

eksperyment dowiódł, iż w istocie znaczny procent neuronów

nesfatynowych charakteryzuje się immunoreaktywnością względem feniksyny

(Pałasz et ał. 2015, Neuroscience Letters). Sugeruje to istnienie potencjalnych

korelacji funkcjonalnych pomiędzy badanymi czynnikami regulatorowymi na obszarze

podwzgórza . Na podkreślenie zasługuje fakt, że opublikowane wyniki są jednymi z

nielicznych dostępnych na Świecie danych dotyczących feniksyny i pierwszymi

uzyskanymi przez europejski zespół badawczy.

Neurogeneza podwzg6rzowa

Najnowsze badania wykazały, że leki antypsychotyczne (neuroleptyki)

wpływają na tempo i wydajność procesu neurogenezy w klasycznych niszach

neuronalnych komórek macierzystych (SVZ, SGZ) mózgu dojrzałego . W ostatnich

latach udowodniono, że znacznie mniej intensywny, ale utrwalony w czasie proces

konstytutywnego powstawania nowych komórek nerwowych przebiega również w

podwzgórzu. Mając na uwadze fakt , że region ten jest potencjalnie istotnym,

alternatywnym celem działania leków neuropsychiatrycznych, można wysunąć

hipotezę , że jednym z mechanizmów działania tych substancji jest ich wpływ na

procesu neurogenezy podwzgórzowej . Założenie to opiera się na najnowszych

doniesieniach sugerujących iż neurogeneza może stanowić jedno z ogniw

mechanizmu regulacji bilansu energetycznego organizmu.

Przeprowadzone badania dostarczyły pierwszych dowodów na obecnośc

istotnych zmian w zakresie proliferacji komórek podwzgórza dorosłych szczurów pod

wpływem wybranych lekówantypsychotycznych (Rojczyk et al. 2015,

Pharmacological Reports). I tak po jednorazowym podaniu wszystkich badanych

neuroleptyków, średnia liczba komórek DCX-pozytywnych znacząco zmniejszyła się

w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Jednocześnie nie zaobserwowano

znaczących zmian w ekspresji markera proliferacji (Ki-57). Natomiast

długoterminowa ekspozycja na olanzapinę nie wpłynęła na tworzenie się

neuroblastów, a zróżnicowany efekt wystąpił po chronicznym podaniu

chlorpromazyny i haloperidolu - chlorpromazyna zwiększyła liczbę komórek DCX+, a

haloperidol zmniejszył ją. Ponadto, wszystkie badane neuroleptyki podawane

chronicznie miały zdolność do zdecydowanego zwiększenia liczby komórek Ki67+,

jednak różnica względem kontroli była najbardziej znacząca dla chlorpromazyny i

haloperidolu. została przeprowadzona w celu wykrycia różnic w liczbie neuroblastów

pomiędzy grupami badawczymi przeprowadzono ocenę liczby komórek DCX+.

Wykazaliśmy, ze pojedyncze wstrzyknięcie wszystkich badanych leków znacząco

zmniejszyło intensywność powstawania neuroblastów. Nie można wykluczyć , że

proliferujące komórki macierzyste poddane zostały reakcji szokowej , w wyniku

której zablokowane zostało różnicowanie neuroblastów. Równocześnie nie

zaobserwowaliśmy jednak istotnych statystycznie różnic w ekspresji markera

proliferacji (Ki-67) po jednorazowym podaniu leków - występuje jedynie trend w

kierunku zmniejszenia poziomu proliferacji dla olanzapiny i haloperidolu i w kierunku

jego zwiększenia dla chloropromazyny. Biorąc pod uwagę specyficzność OCX dla

neurogenezy (marker ten nie wykrywa gliogenezy), zmniejszenie liczby komórek

OCX+ bez zmiany w liczbie komórek Ki-67+ może być rezultatem różnicowania

progenitorów w komórki glejowe a nie nerwowe. Jest to o tyle godne uwagi , że w

literaturze nie ma obecnie żadnych danych na temat wpływu pojedynczej dawki

neuroleptyków na neurogenezę.

Gdy te same leki zostały podane w sposób chroniczny, wykryliśmy pewien

wzrost w liczbie komórek Ki-67+ we wszystkich grupach badanych, który był

najbardziej znaczący po podaniu chlorpromazyny i haloperidolu . Zaobserwowaliśmy

też, że szczury po podaniu haloperidolu wykazały zaburzone różnicowanie komórek

w neurony (spadek liczby komórek OCX+), co zgadza się częściowo z wynikami

badań na gryzoniach dotyczącymi klasycznych miejsc neurogenezy. Wykazano w

nich, że w kulturach komórek hipokampa powstało mniej neuronów po podaniu

haloperidolu niż po podaniu atypowych neuroleptyków. Ponadto, haloperidol nie

zwiększył liczby komórek mitotycznych w szczurzej korze przedczołowej , w

prążkowiu i SVZ. Nie był też zdolny do zwiększenia liczby komórek proliferujących w

hipokampie (w przeciwieństwie do klozapiny) ani do odwrócenia utraty neuronów

spowodowanej podaniem kwasu kainowego (w przeciwieństwie do olanzapiny).

Istnieją jednak inne badania, które wskazują na efekt neuroprotekcyjny haloperidolu.

Przykładowo, chroniczne podawanie haloperidolu zwiększyło liczbę neuronalnych

komórek macierzystych (NSCs) w szczurzym SVZ, co mogło być zależne od

receptorów dopaminowych 02. Ponadto, haloperidol odwrócił spadek intensywności

neurogenezy spowodowany niedoborem matczynej witaminy D w rozwojowym

modelu schizofrenii i promował przeżywalność młodych neuronów w schizofrenii

indukowanej ketaminą przypuszczalnie poprzez wzmacnianie sygnału

antyapoptycznego. Z kolei w naszych badaniach wykazaliśmy, że pomimo iż

haloperidol zwiększył ogólną proliferację komórek, efekt ten nie przełożył się na

poziom ich różnicowania w neurony. Może to wskazywać, że neurogeneza zosłała w

pewnym stopniu zablokowana, z drugiej jednak strony może sugerować hamowanie

przeżywalności neuroblastów lub różnicowanie się podwzgórzowych NSCs w inny

typ komórek. Aby zweryfikować tą hipotezę pomocne byłoby przeprowadzenie

wielokrotnych barwień im mu no histochemicznych, które ujawniłyby losy nowo

powstałych komórek.

Po długotrwałym podawaniu olanzapiny nie zaobserwowaliśmy istotnych

zmian w liczbie neuroblastów (DCX+) i podwzgórzu [36]. Jednak biorąc pod uwagę ,

że jednorazowa dawka tego leku zaburzyła różnicowanie komórek macierzystych w

neuroblasty można przypuszczać , że wystąpił efekt kompensacyjny - po

początkowym szybkim spadku neurogenezy, jej poziom wrócił do stanu

podstawowego (charakterystycznego dla grupy kontrolnej) po czterech tygodniach

podawania leku. Podobny, lub nawet bardziej znaczący efekt miał prawdopodobnie

miejsce po podaniu chloropromazyny, ponieważ zwiększyła ona liczbę neuroblastów

powyżej poziomu kontroli. Stymulujący efekt antypsychotyków drugiej generacji na

proliferację i różnicowanie komórek w podwzgórzu znajduje swoje odzwierciedlenie w

literaturze. Badania na analogicznym modelu zwierzęcym wykazały, że olanzapina

ma działanie promitotyczne, zwiększa liczbę nowo powstałych komórek w

hipokampie i SVZ oraz zapobiega utracie neuronów w tej okolicy. Podobny efekt

obserwowano w przypadku neuroleptyków atypowych takich jak klozapina i

risperidon oraz antydepresantów.

Leki neuropsychiatryczne, w tym zwłaszcza antypsychotyczne

antydepresyjne, w istotnym stopniu promuje powstawanie i przeżywalność nowo

powstałych neuronów w strefach podkomorowych i w zakręcie zębatym .

Stwierdzono, iż pociąga to za sobą określone konsekwencje behawioralne i

biochemiczne, co uzasadnia sens dalszych badań neurogenezy w aspekcie

farmakologicznym . Jednak, aby móc określić czy farmakomodulacja procesu

neurogenezy zarówno w miejscach klasycznych jak i nowo zidentyfikowanych ma

jakikolwiek związek z mechanizmami wyzwalania szeregu efektów ubocznych

neuroleptyków, zwłaszcza związanych ze wzrostem masy ciała , konieczne jest

przeprowadzenie dalszych szeroko zakrojonych badań podstawowych. Winny one

obejmować ocenę koekspresji markerów neurogenezy oraz licznych neuropeptydów j

ich receptorów, analizę czynności receptorów dopaminowych, serotoninowych oraz

systemów zwrotnego wychwytu monaomin ze szczeliny synaptycznej.

Wiadomo z drugiej strony, że proces neurogenezy może być istotnie

zaburzony przez choroby metaboliczne, zapalne, neurodegeneracyjne, zaburzenia

hormonalne oraz szerokie spektrum schorzeń neuropsychiatrycznych (60).

Wartościową perspektywę zarysowałoby zatem zbadanie, czy modulujący wpływ

neuroleptyków na proces neurogenezy podwzgórzowej może być jednocześnie

czynnikiem chroniącym mózg przed zaburzeniami związanymi z obniżoną dynamiką

proliferacji neuronów tej istotnej struktury. Z kolei stworzenie specyficznych ,

podwzgórzowych linii NSCs in vitro pozwoliłoby na lepsze scharakteryzowanie tych

komórek oraz poznanie mechanizmów ich różnicowania , zwłaszcza w kontekście

oddziaływań farmakologicznych .

Klasyczne neuropeptydy oreksy- i anoreksygenne podwzgórza

Przeprowadzony eksperyment ujawnił istotne zmiany w ekspresji wybranych

neuropeptydów i ich receptorów w podwzgórzu (Rojczyk et al. 2015.

Neuropeptides). Jedynym neuropeptydem którego poziom mRNA pozostał stały

podaniu neuroleptyków był NPY. Wynik ten był zbieżny z danymi otrzymanymi po

subchronicznym, doustnym podaniu olanzapiny szczurom Inne badania uwidoczniły

natomiast stymulujący efekt długotrwałego podawania olanzapiny na ekspresję NPY.

Jednak zmiany te wykazano przy użyciu hybrydyzacji in situ w samym jądrze

łukowatym , natomiast w naszym badaniu przeprowadziliśmy reakcje peR w oparciu

o całkowity podwzg6rzowy RNA, co nie jest metodą na tyle dokładną żeby wykryć

subtelne zmiany neurochemiczne w poszczególnych jądrach tej okolicy. Warto też

wspomnieć, że istnieją dane wskazujące , że inny neuroleptyk - klozapina - nie

wpływa na immunoreaktywność NPY po podaniu dootrzewnowym przez 28 dni. To

samo badanie wykazało stymulujący efekt haloperidolu i chlorpromazyny na

podwzgórzową ekspresję NPY, jednak użyte dawki leków były w tym przypadku inne

niż w naszych eksperymentach. Z kolei ostatnie eksperymenty na tym samym

modelu zwierzęcym , ale z użyciem risperidonu pokazały , że podwzgórzowy poziom

mRNA dla NPY zmniejszył się po chronicznym podaniu leku bez równoczesnego

zmniejszenia się poziomu NPY w surowicy.

Co ciekawe, wykazaliśmy jednak znaczące zmiany w ekspresji Y1 R - pOZiom

jego mRNA wzrósł po chronicznym podawaniu chloropromazyny i haloperidolu, co

miało swoje odzwierciedlenie w poziomie białka zwłaszcza w podwzgórzu bocznym,

ale również Uedynie dla chlorpromazyny) w jądrze łukowatym i przykomorowym.

Ponadto po jednorazowym podaniu leków, barwienia immunohisłochemiczne

wykazały niewielkie lokalne zmiany w ekspresji białka Y1 R w jądrze przykomorowym

i w podwzgórzu bocznym. Nie można wykluczyć, że zmiany te były indukowane

subtelnymi zmianami stężenia NPY występującymi od razu lub po kilku godzinach od

podania leków. W naszym modelu badaliśmy bowiem ekspresję NPY dopiero po 24

godzinach od ostatniego wstrzyknięcia leków, więc do tego czasu mógł wystąpić

pewien efekt kompensacyjny. Aby wesprzeć tą hipotezę warto wspomnieć , że

wykazano, że zmiany ekspresji mRNA indukowane neuroleptykami wykry1e 2

godziny po ostatnim podaniu leków zostały prawie całkowicie znormalizowane już 46

godzin póżniej . Ponadto, synteza NPY w jądrze łukowatym i jego uwalnianie w jądrze

przykomorowym są stale hamowane przez leptynę i insulinę, które są uwalniane do

surowicy pulsacyjnie , co dodatkowo może destabilizować ekspresję NPY prowadząc

do fluktuacji dziennych. Istotnie, są badania wskazujące, że NPY wykazuje pewne

dzienne zmiany w ekspresji mRNA.

Pomimo że nie wykazaliśmy wpływu żadnego z badanych leków na ekspresję

NPY, udało się otrzymać znaczący wzrost poziomu mRNA innego neuropeptydu

oreksygennego - PPOX - po długotrwałym podawaniu olanzapiny i haloperidolu. Jak

przewidzieliśmy , ten wzrost przekładał się na zwiększony poziom białka oreksyny A

(produktu obróbki potranslacyjnej PPOX) w podwzgórzu bocznym po chronicznym

podaniu wszystkich leków oraz w jądrze łukowatym po chlorpromazynie i

haloperidolu . Wynik ten znajduje potwierdzenie w ograniczonej liczbie danych

wskazujących , że neuroleptyki modulują ścieżki oreksynowe w podwzgórzu.

Udowodniono, że znaczący odsetek (do 50%) komórek poddanych działaniu

olanzapiny wykazuje ekspresję oreksyny A. Ponadto, podanie antagonisty OX1 R

odwróciło wyindukowany olanzapiną wzrost endogennej produkcji glukozy u

szczurów, co sugeruje, że skutki uboczne neuroleptyków są związane z oreksynami i

ich receptorami. W naszych eksperymentach poziom mRNA dla OX1 R nie zmienił się

po podaniu neuroleptyków, ale zaobserwowaliśmy znaczący wzrost ekspresji OX2R

zarówno po jednorazowym, jak i wielokrotnym wstrzyknięciu haloperidolu. Może to

wskazywać na to, stymulacja syntezy oreksyny A przez haloperidol zachodzi w

większym stopniu za pośrednictwem receptora OX2R niż OX1 R.

Co ciekawe, zaobserwowaliśmy wzrost ekspresji innego czynnika

anoreksygennego - POMC - oraz produktu jego cięcia posttranslacyjnego (a-MSH) .

Wzrost ten nastąpił dopiero po chronicznym podaniu antypsychotyków, ale dotyczył

całego podwzgórza - udowodniliśmy zwiększenie się poziomu białka a-MSH we

wszystkich jądrach podwzgórza, a w szczególności w jądrze brzuszno­

przyśrodkowym i w podwzgórzu bocznym. Poziomy mRNA dla POMC również

znacząco się zwiększyły , ale tylko w przypadku podania chlorpromazyny i

haloperidolu. Wyniki te są podobne do otrzymanych po subchronicznym

wstrzyknięciu fluoksetyny, ale stoją w opozycji do eksperymentów wykazujących

spadek ekspresji POMC po podaniu olanzapiny. Jednak w przeciwieństwie do

naszych eksperymentów, w przytoczonych badaniach nie sprawdzano stężenia

białka a-MSH. Trzeba więc wziąć pod uwagę, że POMC jest prekursorem nie tylko

anoreksygennego a-MSH, lecz również wielu innych peptydów regulatorowych,

dlatego nie można w pełni odnieść tych danych do przedstawionych przez nas

wyników. Ponadto (podobnie jak w przypadku NPY) istnieją pewne okołodobowe

fluktuacje ekspresji genu POMC, co mogło wpłynąć na otrzymane wyniki.

Melanotropina (a-MSH) jest agonistą receptora MC4R, którego ekspresja

również wzrosła po chronicznym podaniu neuroleptyków zarówno na poziomie

mRNA, jak i białka . Olanzapina, chlorpromazyna i haloperidol zwiększyły poziom

mRNA dla MC4R oraz ekspresję tego białka w podwzgórzu bocznym. Z drugiej

strony, poziom białka MC4R w jądrze przykomorowym zwiększył się po długotrwałym

podaniu olanzapiny i haloperidolu. T en wykazany przez nas stymulujący efekt

neuroleptyków na ekspresję MC4R może być związany z subtelnymi interakcjami

pomiędzy oreksygennymi (NPY/AgRP) i anoreksygennymi (POMC/CART) neuronami

w jądrze łukowatym . Można postawić hipotezę, że indukowany lekami wzrost

poziomu mRNA dla POMC mógł zmniejszyć aktywność GABA-ergiczną komórek

POMC/CART prowadząc do częściowego odwrócenia inhibicji komórek NPY/AgRP.

W rezultacie uwolnione w dużych stężeniach AgRP mogło zablokować receptor

MC4R, ponieważ działa jak jego antagonista (w przeciwieństwie do podstawowego

agonisty a-MSH). Doprowadziło to być może do kompensacyjnego zwiększenia

ekspresji MC4R.

Oznaczyliśmy również ekspresję mRNA POMC i NPY w ciele migdalowatym

oraz hipokampie szczurów poddanych przewiekiemu dzialaniu olanzapiny (pałasz et

al. 2016, Pharmacological Reports) . Wzrost poziomu POMC mRNA zarówno w

hipokampie jak i ciele migdalowatym pozostaje w zgodności z danymi ukazującymi

wzmożoną ekspresję genu tego neuropeptydu w podwzgórzu szczurów poddanych

dlugotrwałemu wpływowi olanzapiny i haloperidolu . Z drugie strony. jest on sprzeczny

w stosunku do doniesień ujawniających spadek ekspresji POMC w podwzgórzu

zwierząt traktowanych olanzapiną. Antypsychotyki należą do modulatorów poziomu

neuropeptydów mózgu m.in . haloperidol stymuluje sekrecję GnRH i ekspresję CRF

mRNA w podwzgórzu szczura oraz poziom neurotensyny w korze czołowej ,

hipokampie i prążkowiu. Risperidon natomiast redukuje ekspresję neurotensyny w

korze skroniowej. Nasze poprzednie badania ujawniły również spadek ekspresji

NUCB2 mRNA i nesfatyny-1 w podwzgórzu szczurów poddanych chronicznemu

działaniu haloperidolu. Badania dowodzą. że chroniczne narażenie na alkohol może

powodować spadek poziomu a-MSH w podwzgórzu i ukladzie limbicznym szczura .

co prowadzi do zmian ekspresji POMC mRNA. Niewykluczone. że POMC-zależny

melanokortynowy szlak sygnalowy odgrywa istotną rolę w odpowiedzi na alkohol a

jego farmakomodulacja może być potencjalnym nowym rozwiązaniem w terapii

uzależnień .

Nie wykazaliśmy istotnych statystycznie zmian ekspresji NPY mRNA w ciele

migdałowatym hipokampie szczurów poddanych przewiekiemu dzialaniu

olanzapiny. Stanowi to potwierdzenie poprzednich doniesień sugerujących brak

wpływu neuroleptyków na ekspresję NPY w mózgu tych gryzoni. Istnieją jednak

odmienne dane sugerujące stymulujący wpływ podawanej podprzewlekle olanzapiny

na poziom NPY w podwzgórzu szczura. Inne prace raportują z kolei. że dlugotrwale

podawanie olanzapiny obniża poziom ekspresji NPY mRNA w jądrze pólleżącym .

prążkowiu , bocznej przegrodzie i przedniej korze obręczy szczura , natomiast

haloperidol wywoluje identyczny efekt w ciele migdalowatym i hipokampie. Pojawiły

się również sugestie, że przeciwlękowe działanie agmatyny, egzogennego

neurotransmitera jest wynikiem jej modulującego wpływu na poziom NPY w jądrze

środkowym ciala migdalowatego. Istnieją też doniesienia , że w ciele migdałowatym

ma miejsce interakcja pomiędzy receptorem galaniny GALR2 a Y,. Może mieć ona

związek z mechanizmami odpowiedzi lękowych.

Uwzględniając daleko idące strukturalne I czynnościowe różnice pomiędzy

podwzgórzem a ciałem migdałowatym i hipokampem otrzymane wyniki winny być

interpretowane w sposób ostrożny , unikający daleko idących wniosków. Niemniej,

obserwowane zmiany ekspresji neuropeptydów sugerują, że aktywność

farmakologiczna olanzapiny manifestuje się również na poziomie szlaków

peptydergicznych ciała migdalowatego, będąc jedną z alternatywnych dróg

wyzwalania przez ten lek metabolicznych efektów ubocznych.

Jako że leki antypsychotyczne działają poprzez szereg receptorów, w tym

receptory serotoninowe, dopaminowe i muskarynowe, które mają swoją ekspresję

również w podwzgórzu, większość zmian ekspresji neuropeptydów (na poziomie

mRNA i białka) może być od ich w istotnej mierze zależna . W drugiej części projektu

(dotyczącej neuropeptydów) , wykazaliśmy więc, że pomimo faktu że leki

antypsychotyczne nie mają bezpośredniego powinowactwa do receptorów dla

neuropeptydów oreksygennych i anoreksygennych (takich jak Y1R, MC4R, OX1R,

OX2R), indukują pewne zmiany ich ekspresji. Sugeruje to, że działanie leków

antypsychotycznych prowadzące do wzrostu masy ciała oraz zaburzeń

metabolicznych może mieć charakter bezpośrednie lub pośrednie, co wymaga

dalszych badań podstawowych.

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (artystycznych).

W kręgu moich zainteresowań badawczych znalazły się również

farmakologiczne zagadnienia związane z glutaminergiczną teorią schizofrenii. Ich

efektem było współautorstwo dwu prac dotyczących wpływu długotrwałego

podawania lekówantypsychotycznych; haloperidolu, klozapiny i olanzapiny na profil

ekspresji podjednostek receptora NMDA w mózgu szczura (Krzystanek et al. 2015,

Krzystanek et al. 2016, Pharmacological Reports). Postulat hipofunkcji receptora

NMDA (NMDA·R) w patogenezie schizofrenii opiera się na danych klinicznych,

wskazujących, iż jego antagoniści mogą powodować typowe dla tego schorzenia

zaburzenia poznawcze, percepcji, oraz objawy wytwórcze i negatywne. Receptory

NMDA regulują w sposób pośredni uwalnianie dopaminy w korze mózgu, co

sugeruje, że typowa dla schizofrenii niedoczynność dopaminergiczna może być

wtórna w stosunku do glutaminergicznej. Z drugiej jednak strony receptory

dopaminergiczne uczestniczą w regulacji ekspresji receptora NMDA, zatem

ostateczne ustalenie sekwencji zdarzeń sygnałowych leżących u podstaw

schizofrenii jest wciąż sprawą otwartą. U chorych dotkniętych schizofrenią

zaobserwowano spadek ekspresji podjednostki NR1 w hipokampie stwierdzono

również jej obniżoną fosforylację w innych obszarach mózgu. Wydaje się jednak, że

farmakologiczna aktywność receptora NMDA jest determinowana głównie przez

podjednostki NR2, a różne ich klasy mogą warunkować odmienną wrażliwość

receptora na działanie leków. Haloperidol , klozapina i olanzapina, neuroleptyki z

grupy antagonistów receptorów dopaminergicznych, pomimo braku powinowactwa

do receptora NMDA istotnie nasilają przekażnictwo glutaminergiczne Istnieją

sugestie, że efektem blokowania receptorów dopaminergicznych D2 i D4 przez

haloperidol jest zwiększenie fosforylacji podjednostki NR1 przez kinazę białkową A,

co prowadzi do uwrażliwienia receptora na glutaminian. Klozapina , natomiast może

również w pośredni sposób wpływać na aktywność układu glutaminergicznego,

poprzez hamowanie wychwytu zwrotnego glutaminianu drogą obniżenia ekspresji

transporterów EAAT 3 i 2 w komórkach nerwowych i glejowych. Niewykluczone, że

zmiany w składzie podjednostek NMDA-R mogłyby tłumaczyć różnice w zakresie

modyfikacji procesów poznawczych u pacjentów schizofrenicznych leczonych

klasycznymi i atypowymi lekami antypsychotycznymi . W niniejszym badaniu

wykazano zmniejszenie ekspresji podjednostki NR2A w polu CA 1 po podaniu

klozapiny i olanzapiny, ale nie haloperidolu. Wyniki te częściowo korespondują z

danymi ujawniającymi zmniejszenie syntezy podjednostek NR2A w hipokampie w

brzusznej i tylnej części CA 1 po 6 miesięcznym podawaniu tych leków.

Prawdopodobnie, różne grupy neuroleptyków w sposób odmienny modyfikują

ekspresję podjednostek NMDA-R w poszczególnych strukturach mózgu.

W przeprowadzonym badaniu podawanie haloperidolu nie spowodowało

zwiększenia ekspresji białek receptora NR1. Pozostaje to w pewnej sprzeczności z

poprzednimi doniesieniami , w których efektem działania haloperidolu był wzrost

ekspresji mRNA podjednostki NR1 w polu CA1 hipokampa. Mechanizm działania

haloperidolu nie opiera się prawdopodobnie na modyfikacji transkrypcji genu

receptora . Zmniejszenie ekspresji receptorów NMDA w błonach komórkowych

neuronów hipokampa może się odbywać poprzez interakcje ze szlakami

serotoninergicznymi i dopaminergicznymi. Olanzapina i klozapina wpływają na

obydwa systemy, natomiast haloperidol selektywnie blokuje receptory

dopaminergiczne.

Receptory dopaminergiczne D, mogą pozostawać w funkcjonalnej opozycji w

stosunku do receptorów NMDA. Przewlekła blokada receptorów D, przez

neuroleptyki i ich regulacja "w górę" prowadzi do zmniejszenia ekspresji NMDA-R.

W przeprowadzonym eksperymencie nie wykazano wpływu klozapiny

olanzapiny na ekspresję podjednostki NR2B. Warto podkreślić , że zaburzenia

receptorów NMDA zawierających podjednostki NR2B wydają się być szczególnie

istotne w patogenezie schizofrenii. Podjednostki te zaangażowane są w generowanie

LTP w CA1 a zmniejszenie ich liczby w strukturze NMDA-R skutkuje zabur2eniami

uczenia się i deficytami pamięci . Pr2ewaga podjednostki NR2B w strukturze NMDA-R

może być wynikiem zarówno zwiększenia jej ekspresji jak również zmniejszenia

ekspresji podjednostki NR2A. W pr2eprowadzonym badaniu stosowanie klozapiny i

olanzapiny u szczura spowodowało zmniejszenie ekspresji podjednostek NR2A w

polu CA 1 hipokampa bez znaczącego wpływu na ekspresję podjednostek NR2B.

Efektem tego typu zmiany może być wzrost aktywności receptorów NMDA.

W polu CA 1 hipokampa szczura klozapina również nie zmieniała znacząco

ekspresji podjednostek NR2B osłabiała ekspresję podjednostek NR2A.

Teoretycznie klozapina mogłaby więc zwiększać wrażliwość NMDA-R i aktywność

układu glutaminergicznego w polu CA 1 i w konsekwencji usprawniać mechanizmy

pamięci .

Warto podkreślić, że zależny od neuroleptyków spadek ekspresji podjednostek

receptora NMDA nie było dotąd opisany we wzgórzu. Działanie to może mieć istotne

znaczenie w regulacji zaburzeń regulacji przekaźnietwa glutaminergicznego w pętli

korowo-prążkowiowo-wzgórzowo-korowej w schizofrenii. W myśl glutaminergicznej

teorii schizofrenii dysfunkcja receptorów NMDA powoduje nieprawidłową , wzmożoną

aktywność piramidalnych neuronów glutaminergicznych kory mózgu i zwiększoną

transmisję glutaminergiczną. Neuroleptyki mogłyby ograniczać ową nad aktywność

układu glutaminergicznego poprzez zmniejszenie liczby tych receptorów.

Zwiększenie ekspresji NR1 w podwzgórzu może być związane z blokadą receptorów

D2 pr2ez neuroleptyki. Receptory dopaminergiczne D2 i NMDA pozostają w stosunku

do siebie w czynnościowym antagonizmie. Przewlekła blokada receptorów D2 przez

neuroleptyki i ich regulacja "w górę" prowadzi do zmniejszenia ekspresji NMDA-R.

Ponadto, zmniejszenie ekspresji podjednostek NR2A promuje udział podjednostek

regulatorowych NR2B, co może również zwiększyć aktywność receptora NMDA.

Reasumując, wszystkie badane neuroleptyki mogą stymulują przekażnictwo

glutaminergiczne w podwzgórzu szczura.

Na szczególną uwagę zasługuje porównanie otrzymanych wyników ze

zmianami w ekspresji podjednostek receptora NMDA u chorych na schizofrenię.

Badania u ludzi wykazują wzrost ekspresji podjednostek NR2B w hipokampie i

wzgórzu oraz w niektórych częściach kory mózgu. Jest to efekt przeciwny

hamowaniu ekspresji podjednostek NR2B u zwierząt eksponowanych na

neuroleptyki. Może to sugerować , że zwiększenie ekspresji podjednostek NR2B jest

związane z patogenezą schizofrenii, a nie z działaniem zastosowanych

terapeutycznie neuroleptyków. Niewykluczone, że hamujące działanie neuroleptyków

na ekspresję receptorów NMDA zmniejszanie przez nie aktywności

glutaminergicznej we wzgórzu może być ważnym elementem mechanizmu działania

tej grupy leków u pacjentów dotkniętych schizofrenią. Zagadnienie to warte jest

dalszych szeroko zakrojonych badań podstawowych i klinicznych .

W ostatnich latach współpracowałem z zespołem badawczym działającym w

Katedrze i Zakładzie Medycyny Sądowej i Toksykologii Sądowo-Lekarskiej SUM

czego efektem jest współautorstwo publikacji dotyczących zmian morfologicznych w

strukturze i dystrybucji neurofilamentów w stanie stłuczenia mózgu (Kobek et al.

2016, Folia Neuropathologica, Kobek et al. 2015, Archiwum Medyny Sądowej i

Kryminologii) . Celem wymienionych prac było określenie potencjalnej przydatności

immunohistochernicznej oceny zmian morfologicznych cytoszkieletu neuronalnego w

precyzyjnym ustaleniu czasu śmierci osób po ciężkich urazach czaszkowo­

mózgowych. .J'

Publikacje pełnotekstowe ; li Ogólnie publikacji: 52, po uzyskaniu stopnia doktora: 47

Łączna wartość Impact Factor: 38,939; punktacja MNiSzW:

Liczba cytowań wg bazy Scopus: 235; Indeks Hirscha: 6

592.

rl'

9'Y t<'

~r t ·

\