Ekologia molekularna

wykład 1

Podręczniki

wykład 1/2

Egzamin: 31 stycznia,12:30, w tej sali

Agnieszka KlochZakład Ekologiiakloch@biol.uw.edu.plCNBiCh, IV p, pok. 4.37

Podręczniki

wykład 1/3

DL Hartl, AG ClarkPodstawy genetyki populacyjnej

JC AviseMarkery molekularne

JR FreelandEkologia molekularna

Kalosze vs. fartuchy

wykład 1/4

Ekologia molekularna nie jest prostym zastosowaniem metod molekularnych do „starych” problemów ekologicznych. To nowa dziedzina biologii.

Informacjagenetyczna

Informacja genetyczna

wykład 1/6

1. Informacja jest zakodowana w kodzie DNA3 zasady = 1 kodon = 1 aminokwas

2. Kod genetyczny jest zdegenerowanyKilka kodonów koduje jeden aminokwas

DNA ACG GCT CTT

białko Met Ala Leu

GCTGCAGCCGCG

 → alanina

CCG  → prolina

Informacja genetyczna

wykład 1/7

3. Główny paradygmat biologii molekularnej (Crick 1958)

Informacja genetyczna

wykład 1/8

3. Polimeraza się myli źródło mutacji→

Nie mają zdolności naprawczych:polimeraza III prokariotycznapolimerazy RNA

Tempo mutacji związanych z polimerazą:10-4 – pomyłka polimerazy

10-8 – po naprawie błędów

tempo mutacji u człowieka ● 1/40 000 000 na zasadę na pokolenie● genom człowieka ma 3 mld par zasad

→ 75 zasad mutuje co pokolenie!

Poziomy zmienności

wykład 1/9

1. sekwencje nukleotydowe

SNP – single nucleotide polymorphism

2. sekwencje aminokwasowe (obszary kodujące)

ACGTCCTGGAAGCT.G......C......C......A..........G..T.....

AGG TCC TGCArg Ser Cys 

AGG TCG TGT Thr Ser Cys

Poziomy zmienności

wykład 1/10

3. Zmiany epigenetyczne

Dziedziczne cechy kodowane poza sekwencją DNA:● metylacja DNA i histonów● wygaszanie genów przez miRNA● priony

Dynamika metylacji w rozwoju zarodkowym myszy

Poziomy zmienności

wykład 1/11

4. Zmiany chromosomowe

● mogą występować jako samodzielne chromosomy akrocentryczne lub łączyć się w chromosomy metacentryczne (fuzje Robertsona)

● 2n = od 20 do 33● kilkadziesiąt ras chromosomowych

Wójcik i in. 2002, Acta Theriol. 47

ryjówka aksamitna

Genom prokariotyczny

nukleoid - region komórki zawierający materiał genetyczny (kolisty chromosom)

plazmid -mała cząsteczka DNA poza chromosomem

Wielkość genomu (E. coli):4.6 mln bp2584 operonów

bp = base pairs = par zasad

Genom mitochondrialny (mtDNA)

Genom mitochondrialny (mtDNA)

Genom mitochondrialny (zwierzęta)● kolista jednoniciowa cząsteczka, 12-15bp ● 37 genów (22 tRNA, 2 rRNA, 13mRNA)● geny mRNA – białka szlaku oddechowego

Region kontrolny (~1000bp)● obszar niekodującego DNA● regulacja replikacji i transkrypcji● najbardziej zmienna część mtDNA (w tym 3 regiony hiperzmienne)

Genom mitochondrialny zwierząt

wykład 1/15

● dziedziczony w linii matczynej*● homoplazmia (brak zmienności wewnątrz osobnika)● duża zmienność między osobnikami● szybko mutuje, zwłaszcza w regionie kontrolnym

* Mytilus (omułki)♀ → ♂ i ♀♂ → tylko ♂może zachodzić rekombinacja między mtDNA od każdego z rodziców

Genom mitochondrialny roślin

wykład 1/16

● Duże różnice międzygatunkowe w rozmiarze (200-2500 Kbp)● Duża zmienność wewnątrzosobnicza, rekombinacje● Szybsza niż u zwierząt ewolucja na poziomie ułożenia genów● 100x wolniejsze tempo mutacji na poziomie sekwencji

→ słabo się nadaje do ekologii molekularnej

Genom chloroplastowy (cpDNA)

wykład 1/17

● zwykle dziedziczone po matce, ale np. u nagozalążkowych po ojcu● wolne tempo ewolucji● analogiem regionu kontrolnego jest gen rbcL

Budowa● 2 dwa fragmentów (LSC, SSC) zawierających sekwencje unikatowe● 2 x zduplikowany, odwrócony region IR

Genom jądrowy eukariontów

wykład 1/18

● w jądrze komórkowym● zorganizowany w liniowe chromosomy

nawinięte na białka (histony)

Genom eukariotyczny

wykład 1/19

Budowa genomu eukariotycznego● geny (<30%)● introny● elementy powtarzające się:

● powtórzenia tandemowe● transpozony● LTR (długie powtórzenia końcowe)● i inne

człowiek C. elegans

genom (bp) 3 200 000 000 102 000 000

geny 30 000 20 400

% kodujący ~1% ~25%

Technikimolekularne

Skąd wziąć DNA?

wykład 1/21

W ekologii molekularnej:

W biologii molekularnej

Skąd wziąć DNA?

wykład 1/22

Bezpośrednio od organizmu:

zaletydużo DNAwiadomo, od kogo pobrane

wadyproblem z gatunkami rzadkimimałe osobniki – zabicieczasem mało DNA

Metody pośrednie:zaletybez niszczenia/niepokojenia organizmów

wadynieznana tożsamość dawcymało DNAczęsto DNA złej jakości

Skąd wziąć DNA?

wykład 1/23

Metody pośrednie

wypluwki, odchody

pióra

włosy („pułapki włosowe”)

Wypadanie alleli

wykład 1/24

Ryzyko „wypadnięcia allelu” w zależności od wyjściowej ilości DNA.

Taberlet et al. Trens Ecol Evol 1999

ilość DNA(1=DNA z 1 komórki 2n)

p-stwo

Przechowywanie

wykład 1/25karty FTA (Whatman)

odwadnianie (żel krzemionkowy):rośliny, bezkręgowce

mrożenie

odwadnianie / konserwacja:- w 70% alkoholu etylowym- w specjalnym buforze (np. ATL Qiagen)

Izolacja DNA

wykład 1/26

Ogólna zasada (etapy)

1. Trawienie tkanki: rozbicie błon komórkowych

2. Strącenie roztworem soli niechcianych elementów (białka, RNA, etc)

3. Wytrącenie DNA etanolem

Istnieje wiele modyfikacji w zależności od● ilości materiału● sposobu konserwacji ● ilości tkanki

PCR (polimerase chain reaction)

wykład 1/27

Ilość produktu rośnie wykładniczo:2 4 8 16 cząsteczek→ → →30 cykli 2→ 30 = 1 073 741 824

obszar docelowy

dołączenie primerów

synteza nicipowstają 2 nowe kopie

PCR: odkrycie 1983

wykład 1/28

Kary Banks MullisNagroda Nobla (1993)

Elektroforeza

wykład 1/29

● cząsteczka DNA ma ładunek● wędruje od – do +● małe (krótkie) cząsteczki wędrują szybciej niż duże (długie)

prąd

znacznik wielkości

krótsze

dłuższe

Sekwencjonowanie

wykład 1/30

Technologia Sangera ● synteza nici DNA● losowo przyłączany nukleotyd kończący syntezę● odczyt na żelu (w sekwenatrorze)

Sekwencjonowanie nowej generacji● Illumina● 454 Roche● Ion Proton / Ion Torrent

Sekwencjonowanie nowej nowej generacji● PacBio● Oxford Nanopore MinION

dNTP

ACA T C TGCCA T ACGGT T A

ACA T C T

AC TG

ddNTP

AG

C T

A

A

C

T

CT

G

Sekwencjonowanie Sangera

Sekwencjonowanie NGS

wykład 1/32

1. Enzymatyczne pocięcie DNA

2. Dodanie adapterów i barcodów

Metzker, Nat Rev Genet 11, 2010

● amplifikacja mostkowa matryc unieruchomionych na złożu● od 75 do 200bp● detekcja znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów

Sekwencjonowanie NGS (Illumina)

Metzker, Nat Rev Genet 11, 2010

● amplifikacja na kulkach (złożach) w emulsji

● do 400bp● przyłączenie nukleotydu wywołuje

reakcję świetlną (lucyferaza)

Sekwencjonowanie NGS (454)

praca „mokra”

analiza danych

Sanger NGS

input wyizolowana sekwencja prawie dowolny

dł. fragmentu max. 800-1000bp max. 250bp

dokładność wysoka zależy od projektu

czas pracy

Porównanie technologii

Markerymolekularne

Markery molekularne

wykład 1/37

Podstawowe narzędzie ekologii molekularnej.= Dziedziczne cechy wykazujące zmienność (polimorficzne) w RNA, DNA, lub białkach (dawniej).

Markery służą do identyfikacji: • pozycji w obrębie genomu (mapy genetyczne)• komórek i tkanek (np. nowotworowych)• osobników (analizy rodzicielstwa, medycyna sądowa)• populacji• gatunków

Analiza restrykcyjna

wykład 1/38

Endonukleaza II (enzym restrykcyjny) rozpoznaje i tnie określoną sekwencję.

5' XXXXXXXGAATTCXXXXX 3'3' XXXXXXXCTTAAGXXXXX 5'

5' XXXXXXXG3' XXXXXXXCTTAA

AATTCXXXXX 3'    GXXXXX 5'

EcoRI

Analiza restrykcyjna

wykład 1/39

RFLP – restriction fragment length polymorphism

mtDNA, 2 enzymy, 2 populacjewzór RFLP charakterystyczny dla populacji

łosoś Clarka

Forbes, 1990

PCR + kombinacje

wykład 1/40

RAPDrandomly amplified polymorphic DNA

1. Weź losowe startery długości 10bp

2. Zrób PCR

3. Jeżeli starter przyłączy się w 2 miejscach blisko siebie, powstaje produkt PCR

4. Zrób elektroforezę. Układ prążków jest charakterystyczny dla osobnika (zależy od jego sekwencji DNA)

Zalety:

łatwa i tania

Wady:

problem z powtarzalnością

Raczej technika historyczna

10bp

10bp

10bp

10bp

10bp10bp

10bp

10bp 10bp

10bp 10bp

10bp 10bp

PCR + kombinacje

wykład 1/41

AFLPamplified fragment length polymorphism

1. Potnij DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi

2. Przyłącz do „lepkich końców” adaptory.

3. Zrób PCR (primery pasują do adaptorów)

4. Zrób elektroforezę

5. Powstaje układ prążków zależny od występowania miejsc restrykcyjnych.

→ zmienność w pobliżu miejsc restrykcyjnych (SNP, indele)

Mikrosatelity

wykład 1/42

= STR, short tandem repeatswielokrotne powtórzenia tego samego motywu dł 2-6bpnp. -CA-CA-CA-, -GTCGG-GTCGG-GTCGG-

sekwencja wyjściowa

Mikrosatelity są wysoce zmienne● przed replikacją niektóre powtórzenia mogą się „wypętlić”● podczas amplifikacji polimeraza może „przegapić” kilka powtórzeń

→ wysoka zmienność długości fragmentów → prawie każdy osobnik ma inną, właściwą dla siebie liczbę

powtórzeń w danym locus

błąd replikacji

Mikrosatelity

wykład 1/43

W identyfikacji osobników analizuje się naraz kilka (>10) loci mikrosatelitarnych

locus 1-CAA-CAA-CAA--CAA-CAA-CAA-CAA-CAA

-CAA-CAA-CAA-CAA--CAA-CAA-CAA-CAA-

-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA--CAA-CAA-CAA-CAA-

locus 2-GT-GT-GT-GT-GT-GT--GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-

-GT-GT-GT-GT-GT-GT--GT-GT-GT-GT-GT-

-GT-GT-GT-GT-GT--GT-GT-GT-GT-GT-GT-

locus 3...

osobnik 1

osobnik 2

osobnik 3

Mikrosatelity

wykład 1/44

Rozdział na żelu (1 locus np. CA-CA-CA-CA-CA)

bp

18

16

14

12

10

8

6

A B C D E F

wskaźnik wielkości (długość w bp)

osobniki

genotypy 10+14 10 12 8+14 10+12 12+14

Rozdział w kapilarze (w sekwenatorze)

wiele loci naraz (multiplex)

długość cząsteczki

locus 1

locus 2standard wielkości ryciny: LifeTechnologies

Mikrosatelity

Mikrosatelity