ZARZĄDZENIE NR 2/2012 Dyrektora Instytutu Immunologii i Terapii ...
Dr n. med. Michał Pikuła Zakład Immunologii Klinicznej i ...
Transcript of Dr n. med. Michał Pikuła Zakład Immunologii Klinicznej i ...
Załącznik nr 2 do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego dra Michała Pikuły z dnia
27.11.2015r.
Autoreferat
Dr n. med. Michał Pikuła
Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii
Katedra Immunologii
Wydział Lekarski
Gdański Uniwersytet Medyczny
Gdańsk, 2015
2
1. Imię i nazwisko: Michał Pikuła
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i
roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
2010-2011 Studia Podyplomowe „Zarządzanie firmą w opiece zdrowotnej”, Wydział
Zarządzania i Ekonomii, Politechnika Gdańska (Gdańsk, 08.06.2011r.)
13.12.2007 Akademia Medyczna w Gdańsku, Uchwała Rady Wydziału Lekarskiego z
dnia 13.12.207, uzyskanie stopnia doktora nauk medycznych w zakresie
biologii medycznej, specjalność: biologia komórki. Tytuł pracy:
Charakterystyka ludzkich komórek macierzystych naskórka i próba
wykorzystania ich do odtworzenia naskórka z uwzględnieniem różnego
wieku dawców. Promotor pracy doktorskiej: prof. dr hab. med. Andrzej
Myśliwski
2000-2005 Akademia Medyczna w Gdańsku, Wydział Farmaceutyczny, kierunek:
farmacja, specjalność: farmacja apteczna (mgr farmacji, Gdańsk
31.12.2005r. z uwzględnieniem stażu, ocena końcowa: bardzo dobra)
1998-2003 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii,
kierunek: biologia, specjalność: biologia molekularna (mgr biologii
molekularnej, Gdańsk, 25.06.2003r., ocena końcowa: bardzo dobra)
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/
artystycznych.
2009-do teraz Adiunkt, Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra
Immunologii, Wydział Lekarski, Gdański Uniwersytet Medyczny
(Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. Piotr Trzonkowski)
2006-2009 Asystent, Zakład Histologii, Katedra Histologii i Immunologii, Wydział
Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku (Kierownik Zakładu: Prof. dr
hab. med. Andrzej Myśliwski, od roku 2008 Prof. dr hab. med. Zbigniew
Kmieć)
2003-2006 Doktorant, Dzienne Studia Doktoranckie Akademii Medycznej w
Gdańsku, Wydział Lekarski, Zakład Histologii, Katedra Histologii i
Immunologii (Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. Andrzej Myśliwski)
3
4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca
2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w
zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego:
Badania związków przeciwbakteryjnych i wspomagających prawidłowe gojenie ran z
wykorzystaniem modeli komórkowych in vitro.
Łączna wartość prac objętych cyklem: IF=10,748 MNiSW=154
b) wykaz publikacji (autorzy, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa, rok wydania)
Prace poglądowe
1. Pikuła M.#, Langa P., Kosikowska P., Trzonkowski P. Komórki macierzyste i czynniki
wzrostu w gojeniu ran. Post Hig Med Dośw. 2015; 69: 874-885. #Autor korespondencyjny
IF= 0,573; MNiSW=15
2. Pikuła M.#, Imko-Walczuk B., Nowacka-Pikuła D., Okuniewska A., Langa P.,
Jaśkiewicz J., Trzonkowski P. Możliwości hodowli keratynocytów oraz komórek
macierzystych naskórka i ich zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran. Przegl
Dermatol. 2012; 99(3): 222-229. #Autor korespondencyjny
IF=0.00; MNiSW=5
Prace oryginalne
3. Kosikowska P.*, Pikuła M.*, Langa P., Trzonkowski P., Obuchowski M., Lesner A.
Synthesis and evaluation of biological activity of antimicrobial – pro-proliferative
peptide conjugates. PlosOne. 2015 Oct 16;10(10):e0140377. doi: 10.1371/
journal.pone.0140377. eCollection 2015.
*równy udział w pracy
IF=3,234; MNiSW=40
4. Barańska-Rybak W., Pikuła M., Dawgul M., Kamysz W., Trzonkowski P.,
Roszkiewicz J. Safety profile of antimicrobial peptides: camel, citropin, protegrin,
temporin a and lipopeptide on HaCaT keratinocytes. Acta Pol Pharm. 2013; 70(5):
795-801.
IF=0,693; MNiSW=15.
4
5. Pikuła M.#, Zieliński M., Specjalski K., Barańska-Rybak W., Dawgul M., Langa P.,
Jassem E., Kamysz W., Trzonkowski P. In vitro evaluation of the allergic potential of
antibacterial peptides: camel and citropin. Chem Biol Drug Des. 2015 Nov 18. doi:
10.1111/cbdd.12688. #Autor korespondencyjny
IF=2,485; MNiSW=25
6. Dębowski D., Lukajtis R., Lęgowska A., Karna N., Pikuła M., Wysocka M.,
Maliszewska I., Sieńczyk M., Lesner A., Rolka K. Inhibitory and antimicrobial
activities of OGTI and HV-BBI peptides, fragments and analogs derived from
amphibian skin. Peptides. 2012; 35(2): 276-284.
IF=2,522; MNiSW=25
7. Pikuła M.#, Żebrowska M.E., Pobłocka-Olech L., Krauze-Baranowska M.,
Sznitowska M., Trzonkowski P. Effect of enoxaparin and onion extract on human skin
fibroblast cell line - Therapeutic implications for the treatment of keloids. Pharm Biol.
2014; 52(2): 262-267. # Autor korespondencyjny
IF=1,241; MNiSW=20
8. Pikuła M.#, Żebrowska M.E., Trzonkowski P., Myśliwski A., Sznitowska M. Effects
of enoxaparin and onion extract on cytokine production in skin fibroblasts. Centr Eur
J Immunol. 2009; 34(2): 68-71. # Autor korespondencyjny
IF=0,00; MNiSW=9
c) Omówienie celu naukowego /artystycznego ww. prac i osiągniętych wyników
wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.
Wprowadzenie
Skóra stanowi największy organ ludzkiego organizmu, spełniający szereg niezwykle
istotnych funkcji. Stanowi ona warstwę ochronną przed działaniem szkodliwych czynników
zewnętrznych, w tym chemicznych (substancje toksyczne), fizycznych (promieniowanie), czy
biologicznych (patogeny). Skóra bierze udział także w termoregulacji, odbieraniu bodźców,
utrzymaniu równowagi hormonalnej oraz funkcjonowaniu układu immunologicznego.
Krytycznym czynnikiem dla prawidłowego działania skóry, jak i całego organizmu, jest
zapewnienie jej ciągłości. Rany oraz ubytki skóry mogą prowadzić do zakażeń miejscowych i
systemowych, jak również do uogólnionych zaburzeń homeostazy organizmu. Ocenia się, że
w Polsce ok. 0,5 mln osób cierpi z powodu ran przewlekłych, co stanowi nie tylko istotny
5
problem medyczny, ale również społeczny, ekonomiczny i psychologiczny. Etiologia ran
przewlekłych związana jest z szeregiem czynników, m. in. niedokrwieniem, cukrzycą,
chorobami autoimmunologicznymi oraz zakażeniami bakteryjnymi i grzybiczymi.
Szczególnym problemem są zakażenia wywołane przez bakterie wielooporne np. niektóre
szczepy Staphylococcus aureus.
Dodatkowym zagadnieniem medycznym związanym z nieprawidłowym gojeniem ran
są blizny przerostowe i keloidy. Zmiany te mają różną etiologię i są związane przede
wszystkim z aktywacją fibroblastów, nadmiernym odkładaniem się włókien kolagenowych i
macierzy zewnątrzkomórkowej w skórze, nieprawidłową angiogenezą i procesem zapalnym.
Szczególnym problemem są keloidy, które są wynikiem nadmiernego, niekontrolowanego
procesu naprawczego, który przekracza granice pierwotnego urazu. Ryzyko powstania
keloidów zwiększają dodatkowo wtórne infekcje bakteryjne. Zarówno blizny przerostowe jak
i keloidy są bardzo trudne w leczeniu, przede wszystkim z uwagi na duże ryzyko nawrotu
choroby (po usunięciu chirurgicznym zmiany), działania niepożądane stosowanych tu leków,
jak również ich niską efektywność. W leczeniu blizn przerostowych i keloidów wykorzystuje
się wiele technik i leków: kortykosteroidy, interferon α2b, bleomycynę, żele silikonowe,
terapię uciskową. Istnieją na rynku także preparaty oparte na heparynie oraz wyciągach z
cebuli. Ich skuteczność jest wciąż dyskutowana, a potencjalny mechanizm działania nie do
końca poznany.
Wciąż poszukuje się zatem leków wspomagających prawidłowe gojenie ran,
szczególnie ran przewlekłych oraz keloidów. W odkrywaniu potencjalnych leków
dermatologicznych bardzo ważnym elementem są modele in vitro. W modelach tych
wykorzystywane są głównie keratynocyty i ich progenitory – komórki macierzyste oraz
fibroblasty skórne. Mimo, iż jak powiedział słynny farmakolog Howard Skipper „model to
kłamstwo, które pomaga ci ujrzeć prawdę” (ang. "A model is a lie that helps you see the
truth") to właśnie modele in vitro pozwalają nam na zbadanie aktywności biologicznej
różnych związków chemicznych a także umożliwiają wczesną ich selekcję i dają podstawy do
przejścia do fazy badań na zwierzętach i badań klinicznych.
Dzięki moim wcześniejszym badaniom wykazałem, iż komórki linii transformowanej
HaCaT stanowią wiarygodny model badawczy komórek pierwotnych (Zbytek B., Pikuła M.
et. al., Br J Dermatol. 2005;152(3):474-80). Jak pokazały również badania innych Autorów,
komórki te reagują na hormony peptydowe podobnie do komórek pacjentów. Dzięki moim
badaniom, udało się rozwinąć metodę izolacji oraz hodowli komórek progenitorowych
naskórka, a także scharakteryzować te komórki pod kątem biologicznym(dynamika
proliferacji, ekspresja markerów, analiza długości telomerów) (Pikuła M., et. al., Cell Biol Int.
2010;34(9):911-5). Wykorzystane powyżej metody, szczególnie izolacja enzymatyczna oraz
cytometria przepływowa stanowiły ważne wsparcie metodyczne w moich dalszych
badaniach. Obie przywołane publikacje (poza cyklem habilitacyjnym), stanowiły ważny
punkt wyjścia i podstawę metodyczną do właściwych badań oceniających potencjał związków
dermatologicznych.
W poszukiwaniu nowych leków dermatologicznych, szczególnie przeciwbakteryjnych
coraz większą uwagę skupia się na peptydach otrzymywanych drogą syntezy chemicznej,
których struktura oparta jest na związkach naturalnych. Duże zainteresowanie tymi
związkami w ostatnich latach wynika m.in. z faktu, iż peptydy mogą działać selektywnie na
6
dane receptory i rodzaje komórek oraz mogą być dowolnie modyfikowane chemicznie. W ten
sposób możliwe jest dostosowywanie ich aktywności, specyficzności oraz parametrów
farmakokinetycznych do odpowiedniej terapii. Następuje aktualnie powrót do poszukiwania
aktywnych substancji/związków izolowanych z roślin. Przykładem czego jest Nagroda Nobla
w dziedzinie medycyny i fizjologii przyznana w roku bieżącym (2015) Dr Tu Youyou za
odkrycie metody leczenia malarii związkami pochodzenia roślinnego.
W niniejszym cyklu prac przedstawiam działanie biologiczne wybranych związków
chemicznych, które mogą być wykorzystane w leczeniu zakażeń skóry, ran przewlekłych oraz
blizn przerostowych i keloidów. W przedstawianym cyklu prac obok badania syntetycznie
otrzymanych peptydów (powstałych na bazie peptydów naturalnych) oceniałem również
aktywność enoksaparyny (pochodnej heparyny) oraz wyciągu z cebuli. Na wszystkie
przedstawiane badania uzyskałem zgody Niezależnej Komisji Bioetycznej ds. Badań
Naukowych przy Gdańskim Uniwersytecie Medycznym. Badania były finansowane z
grantów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowego Centrum Nauki,
które są wyszczególnione w punkcie 7 niniejszego autoreferatu.
Tabela przedstawiająca wybrane patomechanizmy prowadzące do powstania ran przewlekłych i
keloidów oraz możliwości ich terapii w oparciu o związki przedstawione w rozprawie habilitacyjnej.
Faza gojenia rany
Wybrane
patomechanizmy
Efekt kliniczny Koncepcja badawcza
potencjalna terapia
Zapalenie
(1-3 dni)
Zakażenia bakteryjne i
grzybicze (szczególnie
szczepy wielooporne)
Infekcja miejscowa
lub ogólnoustrojowa
Zastosowanie
peptydów
przeciwbakteryjnych
bezpiecznych dla
komórek skóry,
opornych na działanie
proteaz, o dodatkowym
działaniu
stymulującym gojenie
rany. Ocena
przedklinczna
właściwości
alergogennych
peptydów w modelu in
vitro
Proliferacja
(2 tygodnie)
Zakażenia bakteryjne i
grzybicze, nadprodukacja
enzymów proteolitycznych
Zaburzenia proliferacji i
migracji keratynocytów
oraz fibroblastów
Infekcja miejscowa
lub ogólnoustrojowa,
zaburzenia
homeostazy
organizmu, utrudnione
gojenie rany
Rana przewlekła
Przebudowa
(do dwóch lat)
Aktywacja fibroblastów
przez czynniki
niespecyficzne i
specyficzne, stan zapalny
Blizna przerostowa/
keloid
Zastosowanie
enoksaparyny i
wyciągu z cebuli
7
Cel naukowy
Celem naukowym przedstawianego osiągnięcia naukowego było zbadanie w modelach
komórkowych in vitro związków o działaniu przeciwbakteryjnym i wspomagającym
prawidłowe gojenie rany.
Podstawy teoretyczne i doświadczenia własne – modele komórkowe i możliwości
wspomagania prawidłowego gojenia ran
W pracy (przeglądowej) nr 1 (Post Hig Med Dośw. 2015;69:874-885) omówiono
dokładnie rolę czynników wzrostu i różnych rodzajów komórek macierzystych w
prawidłowym i patologicznym gojeniu ran. Szczególnie skupiono się na czynnikach z rodzin
PDGF, EGF, FGF, VEGF, TGF-beta oraz na peptydach otrzymywanych drogą syntezy
chemicznej lub otrzymywanych ze źródeł naturalnych. W pracy przedstawiono również
mechanizmy receptorowe/wewnątrzkomórkowe działania czynników wzrostu. Wiedza ta
może być pomocna w projektowaniu nowych leków peptydowych, które będą imitowały
działanie naturalnie występujących czynników wzrostu.
W pracy omówiłem także rolę komórek macierzystych w procesach gojenia ran, w
tym przede wszystkim komórek macierzystych naskórka, tkanki tłuszczowej oraz szpiku.
Wiedza na temat właściwości tych komórek jest niezbędna do projektowania nowych leków
dermatologicznych wpływających na proces gojenia ran. W publikacji zwracam też uwagę na
możliwość połączenia terapii peptydowej/białkowej z terapiami komórkowymi.
Przedstawiamy ponadto nasze własne doświadczenia uzyskane zarówno z modeli
eksperymentalnych in vitro jak również badań klinicznych. W pracy zwracamy uwagę na
pewne ograniczenia terapii białkowych i komórkowych oraz aktualne drogi ulepszania i
modyfikacji tych terapii (modyfikacje genetyczne, chemiczne). W podsumowaniu, praca
oprócz aktualnego przeglądu piśmiennictwa, dostarcza podstaw do poszukiwania nowych
związków, które mogą być wykorzystane w leczeniu ran przewlekłych i keloidów.
W drugiej pracy (przeglądowej) nr 2 (Przegl Dermatol. 2012;99(3):222-229)
przedstawiliśmy zarówno własne, jak również innych Autorów doświadczenia dotyczące
izolacji i hodowli keratynocytów. W pracy zwracamy uwagę na to, iż za prawidłową odnowę
i odbudowę naskórka po zranieniu odpowiadają komórki macierzyste naskórka. Komórki te
zapewniają jednocześnie odpowiednie warunki hodowli komórek in vitro. Tak wyhodowane
komórki mogą być wykorzystane następnie w modelach gojenia ran, jak również w terapii
komórkowej trudno gojących się ran. W pracy przedstawiono dokładnie procedurę izolacji
komórek ze skóry przy pomocy metody enzymatycznej połączonej z mechaniczną. Dzięki
zastosowaniu enzymów możliwa jest izolacja zarówno keratynocytów (dyspaza, trypsyna),
jak również fibroblastów skórnych (dyspaza, kolagenaza). Dodatkowo zaprezentowano
możliwości izolacji specyficznej komórek macierzystych przy pomocy sortera komórkowego
na podstawie ekspresji beta-1 integryny oraz receptora CD71. W pracy przedstawiono
również aktualnie stosowane modele hodowli keratynocytów oraz komórek macierzystych.
Zwróciliśmy uwagę na kwestię powierzchni hodowlanych (plastik, białka macierzy) oraz
8
kluczową rolę składu pożywek hodowlanych. Należy pamiętać, iż rutynowo stosowana w
hodowli płodowa surowica bydlęca posiada wiele ograniczeń i może indukować efekty
niespecyficzne. W związku z tym, dla utrzymania komórek progenitorowych w stanie
niezróżnicowania powinno się dążyć do eliminacji surowicy i hodowli komórek w mediach
opartych na rekombinowanych czynnikach wzrostu. Jest to szczególnie istotne przy
testowaniu nowych leków w modelach in vitro. Surowica może bowiem niwelować pewne
efekty biologiczne, niespecyficznie stymulować komórki a także działać ochronnie, przez co
utrudniać obiektywną ocenę toksyczności potencjalnych leków dermatologicznych. W pracy
przedstawiliśmy także bardziej złożone modele hodowli naskórka, w których keratynocyty
ulegają różnicowaniu tworząc wielowarstwowy naskórek. Mimo znacznego postępu w tych
technikach badawczych, uzyskany naskórek różni się pod pewnymi względami od
naturalnego (różna przepuszczalność, skład białkowy). Dodatkowym problem jest duża
zmienność osobnicza w proliferacji i zachowaniu keratynocytów in vitro.
Podsumowując, praca jest opisem metod hodowli keratynocytów zarówno dla celów
badań przedklinicznych (testowania nowych leków), jak również klinicznych (terapia
komórkowa). W pracy zwracamy także uwagę na istotną kwestię eradykacji bakterii
(szczególnie podczas terapii komórkowej), które mogą utrudniać proces gojenia ran.
Peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym i stymulującym gojenie ran
Jak zaznaczono we wprowadzeniu, patogenna flora bakteryjna utrudnia prawidłowe
gojenie ran, co często prowadzi do powstawania przewlekłych, trudno gojących się ran. Jest
to wynikiem m. in. zaburzenia naturalnych mechanizmów naprawczych przez przewlekły stan
zapalny oraz wytwarzanie toksyn i enzymów bakteryjnych. Dlatego kluczowym jest
znalezienie leków, które będą posiadały zarówno działanie przeciwbakteryjne jak i
stymulujące gojenie rany. Dodatkowo, czynnikiem krytycznym leków podawanych na rany
jest ich cytotoksyczność, która często towarzyszy związkom o silnym działaniu
przeciwbakteryjnym i przeciwgrzybiczym. Celem opisywanej pracy nr 3 (PlosOne. 2015;
16;10(10):e0140377) było uzyskanie stosunkowo krótkich (do 20 aminokwasów),
bifunkcyjnych peptydów, które będą posiadały zarówno działanie przeciwbakteryjne, jak
również stymulujące gojenie ran. Peptydy pierwszej grupy oparte były na temporynie
(peptyd występujący u płazów) oraz KSLW (peptyd syntetyczny), natomiast w drugiej grupie
znalazły się pochodne: enkefaliny (DAL, dalargina), karnozyny (CAR) oraz
sześcioaminokwasowy fragment tenascyny X (CTEN2), której zwiększona ekspresja
zachodzi m.in. podczas embriogenezy i procesów naprawczych tkanek. Zastosowana przez
nas strategia opierała się na łączeniu dwóch peptydów o różnych funkcjach przy pomocy
związku PEG. Co ważne PEG jest związkiem zaaprobowanym przez FDA i jest dodawany do
leków białkowych/peptydowych w celu przedłużenia ich okresu półtrwania. W pracy łącznie
ocenialiśmy 15 związków, włączając pojedyncze peptydy oraz ich koniugaty. Ocenie
podlegały właściwości chemiczne, działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,
proproliferacyjne oraz promigracyjne wobec pierwotnych fibroblastów skórnych (pacjentów)
oraz keratynocytów linii HaCaT. Aktywność przeciwbakteryjną testowano m.in. wobec
bakterii: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa, Proteus mirabilis, natomiast przeciwgrzybiczą wobec grzybów: Candida
albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida tropicalis. Nasze
9
badania wykazały, iż niektóre peptydy natywne (syntetyczne DK5, LK6, KSLW) są bardzo
wrażliwe na modyfikacje chemiczne, które diametralnie zmieniają właściwości
przeciwbakteryjne (w większości zmniejszają).
W przypadku S. aureus największy potencjał przeciwbakteryjny wykazywały peptydy:
KSLW i DAL-PEG-LK6 (MIC 25 µg/mL) oraz DAL-PEG-DK5 (MIC 50 µg/mL). Oceniając
działanie wobec bakterii gram-ujemnych, wykazaliśmy, że P. mirabilis jest całkowicie oporny
na testowane peptydy. Może to być związane z wytwarzanym przez przez P. mirabilis
enzymem ZapA (mirabilizyna), dla którego substratem mogą być testowane peptydy jak
również ich koniugaty oraz in vivo inne ważne związki biorące udział w odpowiedzi
przeciwbakteryjnej (przeciwciała, układ dopełniacza, endogenne peptydy przeciwbakteryjne,
np. LL-37, hBD1). Natomiast wzrost E. coli oraz P. aeruginosa był zahamowany przez
KSLW (odpowiednio MIC 10 µg/mL oraz 25 µg/mL) oraz DAL-PEG-LK6 (w obu
przypadkach MIC 25 µg/mL). Najsilniejsze właściwości przeciwgrzybicze wykazywały
związki: KSLW, DAL-PEG-DK5 oraz DAL-PEG-LK6. Natomiast związkami o
najsilniejszych właściwościach proproliferacyjnych wobec skórnych fibroblastów były:
KSLW (50 µg/mL) oraz CTEN2 (1,0 oraz 10,0 µg/mL), natomiast wobec keratynocytów
HaCaT: Dal (10 µg/mL) oraz koniugaty peptydu CAR z DKS (1,0 oraz 10 µg/mL).
Związkami, które wykazywały właściwości promigracyjne wobec keratynocytów HaCaT
były: KSLW, DAL-PEG-KSLW oraz CAR (efekt zbliżony do kontroli pozytywnej, tj. 10%
surowicy płodowej). Natomiast wobec fibroblastów efekt promigracyjny obserwowano
głównie dla KSLW oraz DAL-PEG-KSLW. Co ciekawe dla peptydu DK5 obserwowano
znaczący hamujący wpływ na migrację fibroblastów. W opisywanej pracy zastosowaliśmy
transformowane keratynocyty (HaCaT) jako model komórkowy, który zachowuje
fizjologiczne właściwości pierwotnych keratynocytów, np. potencjał do różnicowania.
Dodatkowo, z powodu braku różnic międzyosobniczych, które zawsze istnieją w hodowlach
pierwotnych, komórki HaCaT oferują wiarygodne i powtarzalne wyniki.
Podsumowując, praca wskazuje, iż nasza strategia łączenia peptydów może być
obiecującym i innowacyjnym narzędziem w poszukiwaniu nowych związków ułatwiających
gojenie ran. Należy jednak pamiętać, iż tego typu modyfikacje mogą również prowadzić do
zwiększania toksyczności niektórych peptydów wobec komórek skóry lub utracenia ich
właściwości przeciwbakteryjnych. W naszej ocenie najbardziej obiecującym koniugatem jest
DAL-PEG-KSLW, którego badania powinno się kontynuować pod kątem zarówno
chemicznym, jak i biologicznym (modele zwierzęce).
W pracy nr 4 (Acta Pol Pharm. 2013;70(5):795-801) przedstawiliśmy działanie
przeciwbakteryjne wybranych peptydów otrzymanych drogą syntezy chemicznej oraz ich
wpływ na ludzkie keratynocyty linii HaCaT. W ludzkiej skórze syntezie ulega szereg
peptydów przeciwbakteryjnych, które stanowią ważny element odporności wrodzonej
organizmu. Ekspresja tych peptydów często ulega zmianie w różnych chorobach skóry, np. w
atopowym zapaleniu skóry. Może to być jednym z czynników zwiększonej podatności tych
pacjentów na skórne zakażenia bakteryjne, np. Staphylococcus aureus. Naturalnie
występujące w skórze człowieka peptydy przeciwbakteryjne, jak i występujące u innych
gatunków zwierząt, mogą być punktem wyjścia do projektowania i syntezy nowych
10
pochodnych o silnym działaniu przeciwbakteryjnym przy jednoczesnych niewielkich
skutkach ubocznych.
W pierwszej części pracy ocenialiśmy obecność bakterii Staphylococcus aureus w
skórze pacjentów z erytrodermią (materiał pochodził od 50 pacjentów z różnymi
schorzeniami pierwotnymi). Wykazaliśmy, iż w 37 pobranych próbkach znajdował się S.
aureus. Natomiast 13 próbek negatywnych pochodziło od pacjentów cierpiących na łuszczycę
(8 pacjentów) oraz pacjentów u których zmiany skórne związane były z przyjmowanymi
lekami (5 pacjentów). W dalszej części pracy oceniano aktywność przeciwbakteryjną
otrzymanych syntetycznie peptydów: camel, citropiny 1.1, lipopeptydu, protegryny,
temporyny (pochodne przebadane w pracy 3). Jednocześnie aktywność tą porównywano z
działaniem antybiotyków konwencjonalnych: chloramfenikolu, erytromycyny, kwasu
fusydowego i mupirocyny. Spośród peptydów najniższe wartości MIC50 oraz MIC90
(najsilniejsze działanie) wobec S. aureus posiadały: camel, lipopeptyd oraz protegryna (dla
wszystkich trzech wymienionych MIC50 oraz MIC90 wynosiły odpowiednio 4 oraz 8
µg/mL). Spośród badanych antybiotyków konwencjonalnych najniższe wartości MIC50 oraz
MIC90 wykazywał kwas fusydowy (0,25 µg/mL) oraz mupirocyna (0,25 oraz 2,0 µg/mL). W
pracy badano również wpływ zarówno peptydów jak również antybiotyków na toksyczność
wobec ludzkich keratynocytów linii HaCaT. Badania wykazały, że największą toksycznością
spośród peptydów cechował się lipopeptyd, który już w stężeniu 1 µg/mL okazał się
cytotoksyczny wobec keratynocytów. Może to być tłumaczone jego właściwościami
chemicznymi, w tym dużą hydrofobowością i co za tym idzie możliwością penetracji błony
komórkowej. W przypadku pozostałych peptydów toksyczność była widoczna przy wyższych
stężeniach: 25, 50 i 100 µg/mL (camel oraz protegryna) oraz 50, 100 µg/mL (citropina 1.1 i
temporyna). Co ważne w zastosowanym układzie doświadczalnym medium pozbawione było
surowicy co powodowało wyeliminowanie efektów niespecyficznych (czynniki wzrostu,
inhibitory, hormony etc.). Mając na uwadze efekty przeciwbakteryjne, cytotoksyczność
związków a także inne właściwości biologicznie, np. przeciwnowotworowe działanie peptydu
camel udowodnione przez innych Autorów, związkami które posiadają najwyższy potencjał
aplikacyjny mogą być camel i citropina 1.1. Oba peptydy stanowiły przedmiot moich
dalszych intensywnych badań, co zostało przedstawione i opublikowane w pracy poniżej (nr
5).
Peptydy, jak wspomniano we wstępie, stanowią bardzo obiecującą grupę
potencjalnych leków. Posiadają one jednak stosunkowe wysokie ryzyko wywołania reakcji
alergicznej, którą trudno przewidzieć na podstawie sekwencji aminokwasowej danego
peptydu lub jego właściwości chemicznych. W pracy nr 5 (Chem Biol Drug Des. 2015, doi:
10.1111/cbdd.12688) zaproponowaliśmy metodę oceny ryzyka wywołania reakcji alergicznej
przez potencjalne leki peptydowe; w tym wypadku były to peptydy przeciwbakteryjne
przebadane wcześniej: camel i citropina 1.1. Materiał do badań stanowiła krew obwodowa
pochodząca łącznie od 53 pacjentów spośród których 38 cierpiało na różnego rodzaju alergie
a 15 stanowiło kontrolę (pacjenci zdrowi, odpowiednio dobrani pod kątem płci i wieku). W
pracy oceniano cytometrycznie ekspresję trzech markerów CCR3 (marker bazofili), CD63
oraz CD203c (markery aktywacji bazofili). W doświadczeniach jako kontrolę pozytywną
zastosowano tripeptyd fMLP (aktywujący bazofile w sposób specyficzny, jak i
11
niespecyficzny) oraz przeciwciała FcεRI (aktywacja w mechanizmie immunologicznym).
Wyniki pracy wskazują, iż peptydy przeciwbakteryjne mogą indukować aktywację bazofili
oraz posiadają pewne podobieństwo do powszechnie występujących w środowisku alergenów
(analiza dokonana na podstawie dostępnej bazy danych alergenów). Dodatkowo, stopień
aktywacji bazofili stymulowanych peptydami silnie korelował z ich aktywacją pod wpływem
kwasu acetylosalicylowego. Aktywacja ta była szczególnie widoczna u osób cierpiących na
alergie i występowała częściej w przypadku inkubacji z peptydem camel. Wnioskujemy
zatem, iż po podaniu peptydów istnieje potencjalnie ryzyko bezpośredniej aktywacji bazofili,
jak również wystąpienia reakcji krzyżowej z przeciwciałami IgE skierowanymi przeciwko
alergenom środowiskowym. Ryzyko to dotyczy przede wszystkich osób uczulonych, które
powinno się brać pod uwagę na przedklinicznym etapie badań bezpieczeństwa nowych leków.
Według mojej wiedzy jako pierwsi zaproponowaliśmy wykorzystanie testu aktywacji bazofili
(BAT) w połączeniu z bazą danych alergenów środowiskowych w celu oceny ryzyka indukcji
reakcji alergicznej potencjalnych leków peptydowych. W pracy zaprezentowaliśmy również
pełną sekwencję procesu badania nowych peptydów przeciwbakteryjnych – od fazy
koncepcyjnej do fazy rejestracji.
W pracy nr 6 (Peptides 2012; 35(2): 276-284), stanowiącej wynik interdyscyplinarnej
współpracy, przedstawiliśmy właściwości chemiczne i biologiczne peptydów, będących
pochodnymi skórnych peptydów antybakteryjnych (Antimicrobial peptides, AMPs)
występujących u płazów (OGTI and HV-BBI). Peptydy przeciwbakteryjne stanowią bardzo
obiecującą grupę potencjalnych leków, przede wszystkim z uwagi na ich wysoką aktywność
antydrobnoustrojową (przeciw bakteriom, grzybom, wirusom) oraz rzadko występującą
oporność bakterii na te związki. Peptydy te są szeroko rozpowszechnione zarówno u zwierząt
jak i roślin i stanowią rodzaj wrodzonej odporności na mikroorganizmy. Jednak, podobnie jak
inne peptydy/białka, peptydy AMPs są bardzo wrażliwe na degradację proteolityczną przez
enzymy endogenne gospodarza, jak również przez proteazy bakteryjne. Dlatego peptydy o
podwójnej aktywności- przeciwbakteryjnej i jednocześnie antyproteolitycznej stanowią
obiecującą klasę nowych leków przeciwbakteryjnych. W pracy aktywność przeciwbakteryjną
oceniano wobec: bakterii E. coli, oraz S. aureus, jak również szczepów klinicznie
izolowanych: Enterococcus sp., Staphylococcus sp, S. epidermidis i Streptococcus sp. W
badaniu oceniano także efekt hamujący peptydów wobec trypsyny, chymotrypsyny,
katepsyny G oraz elastazy. Na podstawie badań cytotoksyczności wobec ludzkich
fibroblastów oraz aktywności przeciwbakteryjnej, najbardziej obiecującym związkiem
przeciwko skórnym zakażeniom S. aureus okazał się 17 aminokwasowy peptyd OGTI
(1949,4 Da).
Peptyd ten wykazywał niewielką toksyczność (spadek liczby komórek o średnio 8%)
tylko w najwyższym badanym stężeniu (100 µg/mL). Peptyd ten ulegał jednak częściowej
hydrolizie pod wpływem trypsyny. Spośród innych peptydów analogi HV-BBI (IX, X, XI)
posiadały wysoką aktywność przeciwbakteryjną, jednak dwa z nich (X, XI) były toksyczne
wobec fibroblastów skórnych we wszystkich przebadanych stężeniach (25, 50, 100 µg/mL).
W pracy podkreślamy konieczność wykonywania testów cytotoksyczności wobec ludzkich
komórek skóry, które powinny stanowić jeden z wcześniejszych etapów badania nowych
peptydów przeciwbakteryjnych. Dzięki testom biologicznym możliwa jest modyfikacja
12
metody chemicznej w celu zmniejszenia efektów ubocznych zaprojektowanych peptydów lub
zwiększenia ich biologicznych właściwości. Praca wskazuje również na potrzebę tworzenia
projektów o charakterze interdyscyplinarnym, dzięki którym możliwe jest połączenie
wyników wielu badań i kompleksowej analizy potencjalnych leków.
Związki hamujące powstawanie blizn przerostowych i keloidów
Jak zaznaczono we wstępie, keloidy stanowią poważny problem medyczny i
wyzwanie dla współczesnej dermatologii i chirurgii. Powstają one m.in. jako wynik
nadmiernej proliferacji skórnych fibroblastów, w których ponadto obserwuje się zaburzenia
apoptozy. Dodatkowo komórki te cechuje podwyższona ekspresja integryn, która powoduje,
iż komórki te mają zdolność do zwiększonej migracji, będącej jednym z czynników
powodujących progresję keloidu. W pracy nr 7 (Pharm Biol. 2014; 52(2): 262-267)
postanowiliśmy zbadać efekt wyciągu z cebuli (uzyskanego zmodyfikowaną metodą) oraz
enoksaparyny na proliferację, apoptozę i ekspresję integryn beta-1 w hodowanych in vitro
skórnych fibroblastach (linia BR.1N). Cebula [Allium cepa L. (Alliaceae)] zawiera wiele
organicznych związków siarkowych, flawonoidów, saponin, witamin (B1, B2, B6, C, E) oraz
innych związków chemicznych, z których część niestety może ulegać degradacji podczas
ekstrakcji. Cebula posiada wiele udowodnionych efektów biologicznych, w tym
przeciwbakteryjnych, przeciwwirusowych, antyoksydacyjnych, a także wg niektórych
autorów, antynowotworowych. Heparyna stanowi natomiast polisacharyd należący do rodziny
glikozaminoglikanów (GAG) i jest stosowana od wielu lat jako antykoagulant. Od kilku lat
rutynowo stosowane są również heparyny drobnocząsteczkowe (Low molecular weight
derivatives of heparyn, LMWH), takie jak enoksaparyna, dalteparyna, nadroparyna
posiadające podobne właściwości biologiczne co heparyna. W opisywanej pracy
wykazaliśmy, że zarówno enoksaparyna jak również wyciąg z cebuli we wszystkich badanych
stężeniach silnie hamują proliferację ludzkich fibroblastów in vitro (linia BR.1N).
Zahamowanie to było najsilniejsze dla najwyższego stężenia enoksaparyny (500 µg/mL) oraz
wyciągu z cebuli (250 µg/mL) - redukcja proliferacji odpowiednio o 91,5 i 50,8%. Co ważne,
badania te przeprowadziliśmy wykorzystując bardzo czułą radioizotopową metodę
inkorporacji tymidyny znakowanej trytem. W pracy badaliśmy również, przy użyciu
cytometrii przepływowej, wpływ enoksaparyny i wyciągu z cebuli na apoptozę fibroblastów.
Co ciekawe, obserwowaliśmy niewielki wpływ badanych substancji na indukcję zarówno
wczesnej jak i późnej apoptozy (wzrost tylko dla najwyższych stężeń enoksaparyny i wyciągu
z cebuli). Dodatkowo w pracy wykazaliśmy, że enoksaparyna (20 µg/mL) i wyciąg z cebuli
(1000 µg/mL) hamują w nieznacznym stopniu ekspresję integryny beta-1. Efekt ten był
jednak szczególnie widoczny gdy komórki stymulowano łącznie enoksaparyną i wyciągiem z
cebuli. Warto dodać, że badania innych autorów wskazują, iż przyjmowanie
drobnocząsteczkowych heparyn przedłuża długość życia pacjentów onkologicznych, co jest
aktualnie przedmiotem intensywnych badań (J Clin Oncol. 2005;23:2123-9). Niewykluczone,
iż efekt ten może być związany z wykazanym przez nas mechanizmem antyproliferacyjnym.
Podsumowując, praca dowodzi, iż enoksaparyna oraz wyciąg z cebuli mogą być
wykorzystane w terapii keloidów. Dodatkowo, nasze wyniki mogą być przesłanką do
kolejnych badań nad zastosowaniem analizowanych związków w terapii innych schorzeń, w
których dochodzi do aktywacji fibroblastów np. w twardzinie.
13
W pracy nr 8 oceniano wpływ wyciągu z cebuli oraz enoksaparyny na produkcję
przez fibroblasty skórne (linia 46 BR.1N) cytokin: TNF-α (czynnik martwicy nowotworów
alfa), IL-6 oraz VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego). Pomiaru dokonywano
metodą cytometrii przepływowej (FlexSet) z materiału pochodzącego z nadsączy
komórkowych. Badania wykazały, że pod wpływem enoksaparyny oraz wyciągu z cebuli
dochodzi do spadku produkcji IL-6 i VEGF przez fibroblasty. W przypadku IL-6 spadek ten
obserwowany był dla stężeń 20 i 500 µg/mL enoksaparyny, 50 i 1000 µg/mL wyciągu z
cebuli oraz łącznej stymulacji enoksaparyny i wyciągu z cebuli (odpowiednio w stężeniach
500 µg/mL i 250 µg/mL). Poziom VEGF obniżał się po stymulacji enoksaparyną w stężeniu
20 oraz 500 µg/mL jak również po inkubacji z wyciągiem z cebuli (50 µg/mL). Połączenie
wyciągu z cebuli razem z enoksaparyną nie wpłynęło natomiast na produkcję VEGF. W tym
miejscu należy zaznaczyć, iż stosowana w naszym modelu enoksaparyna posiada niższą masą
cząsteczkową niż heparyna, stosowana w maściach i kremach (odpowiednio 4500 Da oraz
12–15 kDa). Jak pokazały badania innych autorów enoksaparyna efektywniej przechodzi
przez barierę naskórkową osiągając wyższe stężenia w skórze właściwej w porównaniu do
heparyny (Int J Pharm. 2015 Mar 15;481(1-2):79-83). W związku z tym, enoksaparyna może
być ciekawą i efektywną alternatywą dla heparyny. Coraz większa liczba dowodów wskazuje
że za udział w tworzeniu i rozwoju blizn przerostowych oraz keloidów odpowiedzialne są
czynniki wzrostu i niektóre cytokiny. IL-6 powoduje stymulację proliferacji fibroblastów oraz
syntezę kolagenu a jej podwyższona ekspresja obserwowana jest w tkance keloidu. Natomiast
VEGF stymuluje zarówno proliferację jak również migrację komórek śródbłonka oraz
tworzenie nowych naczyń krwionośnych, w tym także obecnych w tkance keloidu. Stąd
wydaje się, iż zastosowane przez nas związki mogą hamować rozwój blizn przerostowych i
keloidów. Co ciekawe ostatnio udowodniono, iż poziom VEGF w surowicy, jak i liczba
progenitorów komórek śródbłonka obecnych we krwi pacjentów z keloidami, jest wyższa niż
u osób zdrowych (Clin Exp Dermatol. 2015 Jun 30. doi: 10.1111/ced.12695). W przyszłości
możliwe jest zatem rozważenie terapii systemowej a nie tylko miejscowej keloidów w oparciu
o badane związki.
Co warte podkreślenia, wyniki uzyskane między innymi dzięki powyższym badaniom
(prace nr 7 i 8), były punktem wyjścia do opracowania nowej technologii otrzymywania
opatrunku medycznego. Wynalazek “Adhezyjny opatrunek silikonowy, zawierający suchy
wyciąg z cebuli i heparynę drobnocząsteczkową oraz sposób jego otrzymywania” otrzymał 2
listopada 2015 roku Dokument Patentowy z Urzędu Patentowego Rzeczpospolitej Polskiej o
numerze 220765 przyznany na rzecz Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego.
Podsumowanie
Prezentowany cykl prac przedstawia obiecujące związki peptydowe, które potencjalnie
mogą być wykorzystane w leczeniu trudno gojących się ran, szczególnie powstałych na tle
zakażeń bakteryjnych. Enoksaparyna i wyciąg z cebuli wykazały natomiast in vitro potencjał
do hamowania rozwoju blizn przerostowych i keloidów. Przedstawione osiągniecie wskazuje
również strategię opracowywania nowych leków dermatologicznych. Założenie tej strategii
opiera się przede wszystkim na odpowiednich modyfikacjach chemicznych naturalnie
14
występujących peptydów, szczególnie występujących u człowieka i płazów, a następnie
testowaniu ich przy użyciu modeli komórkowych in vitro. W osiągnieciu habilitacyjnym
przedstawiam również innowacyjną metodę oceny ryzyka wywołania reakcji alergicznej
przez leki peptydowe przy użyciu dostępnych baz danych oraz modeli in vitro (bezpiecznych
dla pacjenta).
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo‐badawczych (artystycznych)
a) Komórki macierzyste w leczeniu ran przewlekłych – modele in vitro oraz badania
kliniczne
Równolegle do prowadzonych przeze mnie badań potencjalnych leków dermatologicznych,
rozwijam również w Zakładzie Immunologii Klinicznej i Transplantologii Gdańskiego
Uniwersytetu Medycznego metodę terapii komórkowej trudno gojących się ran. W ramach części
realizowanych przeze mnie grantów KBN/NCN w których pełniłem/pełnię funkcję głównego
wykonawcy (2009-2012) lub kierownika (2012- do teraz) zajmuję się optymalizacją izolacji,
hodowli i odpowiednej aplikacji klinicznej komórek macierzystych naskórka. Podstawą tych badań
była wcześniejsza charakterystyka komórek macierzystych naskórka oraz opracowanie
odpowiednich technik ich efektywnej ekspansji (Postepy Hig Med Dosw. 2009;63:449-56; Cell
Biol Int. 2010;34(9):911-915). Badania kliniczne wykazały m.in., iż aplikowane na ranę komórki
dla odpowiedniego efektu terapeutycznego, powinny być połączone/zawieszone w odpowiednim,
bezpiecznym materiale, ułatwiającym adherencję komórek do podłoża oraz ich właściwą aktywację
(Przegl. Dermatol. 2012; 99(3):230-234). Rezultatem tych obserwacji było zastosowanie przez nas
żelu fibrynowego, który, jak pokazały nasze dokładne analizy (mikroskopia elektronowa) oraz
badania innych Autorów, jest w pełni bezpieczny dla komórek oraz pacjenta (komercyjnie dostępny
lek). Wyniki tych prac zostały dotychczas przedstawione w opracowaniach książkowych oraz w
prezentacjach na konferencjach krajowych i międzynarodowych (spis wybranych pozycji poniżej).
Badania te wpisują się również w nurt cyklu moich prac habilitacyjnych. Ideą współczesnej
medycyny regeneracyjnej opartej na inżynierii tkankowej, którą chciałbym dalej rozwijać, jest
bowiem połączenie odpowiednio przygotowanych komórek, czynników wzrostu/peptydów oraz
nośników, np. rusztowań/biomateriałów (ang. tissue engineering triad). Kontynuacją tych badań
jest aktualnie realizowany przeze mnie projekt finansowany z funduszy NCBiR STRATEGMED I,
w ramach którego poszukujemy związków o charakterze proregeneracyjnym oraz
biokompatybilnych rusztowań, które będą mogły tworzyć złożone układy przyspieszające gojenie
ran zakażonych i /lub przewlekłych. Badane związki/konstrukty mają w założeniu stymulować
głównie komórki macierzyste naskórka oraz komórki macierzyste mezenchymalne. Oba
wspomniane rodzaje komórek są dla mnie również przedmiotem aktualnych badań (Expert Opin
Biol Ther. 2013;13(10):1357-1370). Podsumowując, przedstawiona część drugiego osiągniecia jest
kompatybilna z cyklem prac habilitacyjnych. Jednocześnie uzyskane wyniki mogą stanowić ważne
wskazówki dla ośrodków przeszczepiających hodowane in vitro komórki macierzyste w celu
leczenia ran przewlekłych.
15
Prace oryginalne
Pikuła M., Kondej K., Jaśkiewicz J., Skokowski J., Trzonkowski P. Flow cytometric sorting and
analysis of human epidermal stem cell candidates. Cell Biol Int. 2010; 34(9): 911-915.
IF=1,747; MNiSW=13.
Imko-walczuk B., Okuniewska A., Pikuła M., Nowacka-Pikuła D., Jaśkiewicz J., Trzonkowski P.
Możliwość klinicznego wykorzystania hodowli keratynocytów i komórek macierzystych naskórka w
leczeniu przewlekłych owrzodzeń podudzi: doniesienie wstępne. Przegl Dermatol. 2012; 99(3): 230-
234.
IF=0,00; MNiSW=5
Prace przeglądowe
Pikuła M., Marek-Trzonkowska N., Wardowska A., Renkielska A., Trzonkowski P. Adipose tissue-
derived stem cells in clinical applications. Expert Opin Biol Ther. 2013, 13(10): 1357-1370.
IF=3,653; MNiSW=30
Pikuła M., Trzonkowski P. Biology of epidermal stem cells: impact on medicine. Postepy Hig Med
Dosw. 2009; 63: 449-56.
IF=0,654; MNiSW=15
Książki
Michał Pikuła. Karcynogeneza skórna. W: Problemy dermatologiczne chorych po
przeszczepieniu narządów. Red. Beata Imko-Walczuk, Alicja Dębska-Ślizień, Jacek
Szepietowski, Bolesław Rutkowski. Cornetis, Wrocław, 2014.
Piotr Trzonkowski, Michał Pikuła, Natalia Marek-Trzonkowska. „Cellular therapy in
medicine.” Intercollegiate Faculty of Biotechnology UG & MUG, Gdansk, 2013. Książka dla
Studentów i Doktorantów Wydziału Biotechnologii UG-GUMed.
Wybrane doniesienia konferencyjne (pełen wykaz znajduje się w załączniku nr 4)
M. Pikuła, P. Langa, A. Wardowska, J. Zieliński, K. Kondej, A. Renkielska, P. Trzonkowski.
Medical applications of epidermal progenitor cells. Central European Conference on Regenerative
Medicine, Bydgoszcz, Poland, 14-15 March 2015.
M. Pikuła. Isolation, expansion, and clinical application of autologous epidermal progenitor cells.
J. Tissue Eng. Regen. Med. 2014; vol. 8, Tissue Engineering & Regenerative Medicine
International Society, Genova, Italy, 10-13 June, 2014.
P. Langa, M. Pikuła, K. Kondej, A. Wardowska, J. Zieliński, A. Renkielska, P. Trzonkowski.
Epidermal progenitor cell culture and quality control using flow cytometry: a way to improve
chronic wounds cell therapy. XXIX Congress of the International Society for Advancement of
Cytometry: Cytometry Advancing Science, Ft. Lauderdale, USA, May 17-21, 2014.
16
b) Badania właściwości biologicznych peptydów – inhibitorów/substratów enzymów
proteolitycznych
Dzięki możliwości współpracy m.in. z naukowcami z Uniwersytetu Gdańskiego mogłem także
uczestniczyć w interdyscyplinarnych badaniach, które są rozszerzeniem mojej pracy habilitacyjnej.
W przedstawionych poniżej publikacjach wykazaliśmy m.in., że niektóre inhibitory trypsyny
(pochodne SFTI) mogą również hamować aktywność proteasomów. To doniesienie może mieć
istotne znaczenie w leczeniu schorzeń związanych z defektami degradacji białek, np. chorób
nowotworowych (PLoS One. 2014;9(2):e89465). Podobne inhibitory mogą również tworzyć trwałe
koniugaty ze znacznikami fluorescencyjnymi i być internalizowane zarówno przez komórki
nowotworowe, jak i komórki zdrowe (fibroblasty skórne). Proponowanym przez nas mechanizmem
odpowiedzialnym za ten efekt może być makropinocytoza (oceniana wstępnie przy pomocy
mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej). To może pozwolić w przyszłości na
tworzenie znaczników, dzięki którym możliwe będzie śledzenie losów aktywnych biologicznie
związków in vitro oraz in vivo (Biopolymers Pept Sci. 2014;102(1):124-135). Dodatkowo postuluje
się, że nadmierna aktywność enzymów proteolitycznych bierze udział w patogenezie ran
przewlekłych. Stąd badane przez nas inhibitory mogą stanowić w przyszłości alternatywę w
leczeniu ran przewlekłych. Nasze badania wykazały również różną aktywność enzymu katepsyny
(Cat L) w skórnych komórkach nowotworowych i keratynocytach linii HaCaT. Enzym Cat L jest
proteazą zaangażowaną m.in. w dojrzewanie białek MHC II oraz modyfikacje histonów H3.
Zaprezentowana w pracy ultraczuła metoda detekcji tego enzymu może być pomocna w przyszłości
w monitorowaniu i prognozowaniu niektórych schorzeń, w tym chorób nowotworowych lub chorób
skóry (Anal Biochem. 2014;466:30-37).
Artykuły oryginalne
Dębowski D., Pikuła M., Lubos M., Langa P., Trzonkowski P., Lesner A., Łęgowska A., Rolka K.
Inhibition of human and yeast 20S proteasome by analogues of 1 trypsin inhibitor SFTI-1. PLoS
One. 2014; 9(2):e89465.
IF=3,234; MNiSW=40
Lesner A., Karna N., Psurski M., Łęgowska A., Wysocka M., Guzow K., Sieradzan A., Sieńczyk
M., Trzonkowski P., Pikuła M., Zieliński M., Kosikowska P., Łukajtis R., Łęgowska M., Dębowski
D., Wiczk W., Rolka K. Fluorescent analogs of trypsin inhibitor SFTI-1 isolated from sunflower
seeds: synthesis and applications. Biopolymers. Pept Sci. 2014; 102(1): 124-135.
IF=2,879; MNiSW=20
Łęgowska M., Wysocka M., Burster T., Pikuła M., Rolka K., Lesner A. Ultrasensitive internally
quenched substrates of human cathepsin L. Anal Biochem. 2014; 466: 30-37.
IF=2,305; MNiSzW=25
17
c) Cytomeria przepływowa jako narzędzie do badania fenotypu komórek oraz oznaczeń
cytokin
Cytometria przepływowa jest jedną z podstawowych technik badawczych, służącą m. in. do
wieloparametrycznej analizy komórek, jak również oceny stężenia białek zawartych np. w surowicy
lub mediach komórkowych. Metoda ta posiada ogromne spektrum możliwości i aplikacji stąd
pojawia się dziś w większości prac z dziedziny nauk o życiu. W pracach wyszczególnionych
poniżej zajmowałem się analizą cytometryczną hodowanych in vitro komórek oraz badaniami
cytokin w supernatanantach komórkowych lub surowicach pacjentów. Wspólnie z innymi
zespołami wykazaliśmy m.in. że witamina D3 hamuję ekspresję integryn oraz cytokin prozapalnych
w hodowanych in vitro komórkach mięśniówki gładkiej (J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(1-
2):208-211). Wykazaliśmy również, iż hodowane in vitro podocyty pod wpływem wysokich stężeń
glukozy zmieniają ekspresję reduktazy aldozowej, co może mieć istotne implikacje kliniczne dla
monitorowania i leczenia pacjentów z cukrzycą (Exp Diabetes Res. 2011, Volume 2011 (2011),
doi:10.1155/2011/278963). Ostatnio wykazaliśmy także, iż silny wzrost stężenia cytokin
prozapalnych u pacjentów po zawale mięśnia sercowego zwiększa ryzyko pojawienia się u nich w
późniejszym czasie depresji. Może to stanowić ważny element tłumaczący udział mechanizmów
immunologicznych w rozwoju depresji (Psychiatr Pol. 2015; 49,3:455-46).
Tukaj C., Trzonkowski P., Pikuła M., Hallmann A., Tukaj S. Increased migratory properties of
aortal smooth muscle cells exposed to calcitriol in culture. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;
121(1-2): 208-211.
IF=2,886; MNiSW=27
Lewko B., Latawiec E., Maryn A., Barczyńska A., Pikuła M., Zieliński M., Rybczyńska A.
Osmolarity and glucose differentially regulate aldose reductase activity in cultured mouse
podocytes. Exp Diabetes Res. 2011, Volume 2011 (2011), doi:10.1155/2011/278963.
IF=1,200; MNiSW=30
Wilkowska A., Pikuła M., Rynkiewicz A., Wdowczyk-Szulc J., Trzonkowski P., Landowski J.
Wzrost stężenia cytokin prozapalnych w osoczu pacjentów po zawale mięśnia sercowego a
obecność depresji w okresie następnych 6 miesięcy. [Increased plasma pro-inflammatory cytokine
concentrations after myocardial infarction and the presence of depression during next 6-months].
Psychiatr Pol. 2015; 49,3:455-46.
IF= 0,733; MNiSW=15
6. Analiza bibliometryczna
Łączna wartość prac objętych cyklem: IF=10,748 MNiSW=154
Liczba punktów
z wyłączeniem osiągnięcia: IF=21,035 MNiSW= 243
18
Liczba cytowań: Web of Science=56 Scopus=63
Wartość indeksu h: h=3 (WoS) h=4 (Scopus)
Łączna liczba streszczeń zjazdowych: 44
Pełen wykaz publikacji, opracowań książkowych, doniesień konferencyjnych znajduje się w
załączniku nr 4.
Szczegółowa analiza bibliometryczna znajduje się w załączniku nr 5.
7. Kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział w
takich projektach.
Projekty w trakcie realizacji
1. „Nowe technologie farmakologicznej stymulacji regeneracji” (2014 – 2017). Grant
finansowany przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Akronim-Regennova, konsorcjum
naukowe PhaStER), realizowany w ramach programu strategicznego „Profilaktyka i leczenie
chorób cywilizacyjnych” - STRATEGMED I (umowa nr STRATEGMED1/235077/9/NCBR/2014).
Łączna kwota projektu: 17 769 556 PLN. Charakter udziału: kierownik/lider 3 z 13 pakietów
zadań (WP4: Selekcja wstępna oddziaływań peptydów oraz rusztowań na unieśmiertelnione linie
komórkowe; WP5: Pozyskiwanie, charakterystyka i bankowanie komórek macierzystych; WP6:
Badanie in vitro potencjału regeneracyjnego wybranych peptydów i rusztowań).
2. „Profil ekspresji genów w hodowlach ludzkich komórek progenitorowych naskórka i jego
wpływ na powodzenie terapii ran u ludzi” (2012 – 2016). Grant finansowany przez Narodowe
Centrum Nauki (2011/03/D/NZ5/00555); kwota projektu: 402 780 PLN. Zakład Immunologii
Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika Chirurgii Plastycznej, Gdański Uniwersytet
Medyczny. Charakter udziału: kierownik projektu.
3. „Zmiany epigenetyczne w toczniu rumieniowatym trzewnym - znaczenie metylacji DNA”
(2013 – 2016). Grant finansowany przez Narodowe Centrum Nauki (2012/05/D/NZ5/01224).
Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych,
Chorób Tkanki Łącznej i Geriatrii, Gdański Uniwersytet Medyczny. Charakter udziału: główny
wykonawca.
Projekty zakończone
4. „Badanie aktywności i toksyczności wybranych antybiotyków peptydowych pod kątem ich
zastosowania w gronkowcowych zakażeniach skórnych” (2010 – 2013). Grant finansowany
przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N405 627838). Gdański Uniwersytet
Medyczny, Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Zakład Immunologii
Klinicznej i Transplantologii, Katedra Chemii Nieorganicznej. Charakter udziału: główny
wykonawca.
19
5. „Leczenie trudno gojących się ran u ludzi z zastosowaniem autologicznych przeszczepów
hodowanych in vitro komórek macierzystych naskórka oraz keratynocytów” (2009 – 2013).
Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N403 089335), Gdański
Uniwersytet Medyczny, Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Katedra i Klinika
Chirurgii Plastycznej. Charakter udziału: główny wykonawca.
6. „Preparaty silikonowe z wyciągiem z cebuli i heparyną na keloidy i blizny przerostowe”
(2008 – 2010). Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego “Preparaty
silikonowe z wyciągiem z cebuli i heparyną na keloidy i blizny przerostowe” (N N405 008320528).
Gdański Uniwersytet Medyczny, Katedra Histologii i Immunologii, Katedra Farmacji Stosowanej,
Katedra Farmakognozji. Charakter udziału: wykonawca.
7. "Optymalizacja namnażania ludzkich komórek macierzystych naskórka z uwzględnieniem
dawców w wieku podeszłym" (2005 – 2008). Grant finansowany przez Ministerstwo Nauki i
Szkolnictwa Wyższego (2 P05A 00928). Gdański Uniwersytet Medyczny, Katedra Histologii i
Immunologii (40 000 PLN). Charakter udziału: główny wykonawca/współautor (grant
promotorski).
8. Członkostwo w międzynarodowych i krajowych organizacjach oraz towarzystwach
naukowych.
Członek Międzynarodowego Towarzystwa Przeszczepienia Narządów (ESOT) (05.2015 – do teraz)
Przewodniczący Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Immunologii Doświadczalnej i
Klinicznej (05.06.2014 – do teraz)
Członek Międzynarodowego Towarzystwa Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej,
TERMIS (2012 – do teraz)
Sekretarz Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Immunologii Doświadczalnej i Klinicznej
(2011 – 2014)
Skarbnik Gdańskiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Histochemii i Cytochemii (2006 – 2009)
9. Udział w konsorcjach naukowych
Członek konsorcjum naukowego PhaStER powstałego w ramach współpracy i realizacji grantu
NCBiR STRATEGMED I („Nowe technologie farmakologicznej stymulacji regeneracji”
Regennova). Skład Konsorcjum: Gdański Uniwersytet Medyczny, Uniwersytet Gdański,
Politechnika Gdańska, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN w Warszawie,
ProScience Polska, MedVentures. Charakter udziału: lider trzech pakietów zadań z ramienia
GUMed.
20
10. Praca dydaktyczna i popularyzacja nauki
2014-do teraz „Nowatorskie sposoby prezentacji historii odkryć naukowych oraz
wynalazków jako sposób na popularyzację nauki”, II Edycja programu
ENGAGE2014 Fundacji na rzecz Nauki Polskiej. Charakter udziału:
główny wykonawca (wykłady/prezentacje w liceach ogólnokształcących
dotyczące historycznych i dzisiejszych odkryć naukowych)
2014-do teraz Przewodniczący Gdańskiego Oddziału PTIKiD - organizowanie spotkań
naukowych oraz wykładów otwartych dla studentów, pracowników
naukowych i klinicystów (wykłady gości – specjalistów m.in. z dziedziny
diagnostyki i leczenia chorób o podłożu immunologicznym)
2013 „Cellular therapy in medicine”, Trzonkowski P., Pikuła M., Marek-
Trzonkowska N. Wyd. MUW Biotechnologii UG-GUMed, Gdańsk, 2013.
Podręcznik dla studentów i doktorantów (praca w języku angielskim)
2013-do teraz Promotor pomocniczy dwóch prac doktorskich (prace w trakcie) na
stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej (GUMed)
2009-2014 Promotor dwóch prac magisterskich studentów Wydziału Biotechnologii
UG-GUMed (zakończone 2009, 2010) oraz bezpośredni opiekun dwóch
prac magisterskich studentów Analityki Medycznej Wydziału
Farmaceutycznego GUMed (zakończone 2013, 2014; obie prace z
wyróżnieniem)
2011-2013 Kształcenie podyplomowe. Kurs dla diagnostów laboratoryjnych w
ramach specjalizacji z laboratoryjnej diagnostyki medycznej (temat kursu:
"Badania układu odpornościowego”). Charakter udziału: Wykładowca
2011 „Wielka Encyklopedia Medyczna” (t.1-23), wydanie polskie, Warszawa,
2011. Charakter udziału: członek kolegium naukowego wydania polskiego
2009-do teraz
(Adiunkt)
Immunopatologia - seminaria dla studentów kierunku Analityka
Medyczna, Wydziału Farmaceutycznego GUMed
Immunologia - ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku Analityka Medyczna,
Wydziału Farmaceutycznego GUMed
Immunologia - seminaria dla studentów II-go i IV-go roku Wydziału
Lekarskiego GUMed, kierunek lekarski (polskojęzycznych i
angielskojęzycznych)
Komórki macierzyste w medycynie - zajęcia fakultatywne dla studentów
polskojęzycznych i angielskojęzycznych kierunku lekarskiego Wydziału
Lekarskiego GUMed. Charakter udziału: współautor kursu/wykładowca
2006-2009
Asystent
Histofizjologia i biologia komórki - ćwiczenia oraz seminaria dla
studentów Wydziału Lekarskiego (prowadzone w języku polskim i
angielskim) oraz ćwiczenia dla studentów Wydziału Farmaceutycznego
21
2003-2006
Doktorant
Histofizjologia i biologia komórki - ćwiczenia oraz seminaria dla
studentów Wydziału Lekarskiego (prowadzone w języku polskim i
angielskim)
11. Wybrane staże naukowe i kursy
Wielka Brytania, Uniwersytet w Oksfordzie, Nuffield Department of Surgical Sciences,
Transplantation Research Immunology Group, 02.08.2015 – 29.08.2015, pobyt naukowy
(„Academic Visitor”) w ramach grantu Europejskiego Towarzystwa Przeszczepiania
Narządów (ESOT)
Francja, Reims, Uniwersytet w Reims, Laboratorium Biochemii i Biologii Molekularnej-
wyjazd z programu „LLP-Erasmus Programme, Teaching Staff Mobility”, 29.09 –
03.10.2008
Belgia, Erembodegem, Becton Dickinson, szkolenie z zakresu izolacji i analizy komórek przy
użyciu cytometru sortującego, 5.02 – 10.02.2005
Polska, Uniwersytet Warszawski, Zakład Cytologii, Kurs Hodowli Komórek Zwierzęcych
(dla zaawansowanych), 13.06 – 15.06.2005
Polska, Uniwersytet Gdański, kurs pedagogiczny (obejmujący przedmioty z zakresu
psychologii, pedagogiki, socjologii, dydaktyki), 2001 – 2002
12. Wyróżnienia
Otrzymanie grantu Europejskiego Towarzystwa Przeszczepiania Narządów (European
Society for Organ Transplantation) na wyjazd i pobyt naukowy w celu wykonania
projektu „Induced pluripotent stem cells as a source of insulin-producing cells for
transplantation” realizowanego we współpracy z naukowcami z Uniwersytetu w
Oxfordzie (Short Stay and Study Grant), sierpień, 2015
Nagroda Rektora II-go stopnia za osiągnięcia dydaktyczne, Gdańsk, 2014
Wyróżnienie w 13. Międzynarodowej Konferencji Naukowej Studentów i Młodych
Lekarzy w Gdańsku, "PhD student report session", 2005
Zajęcie I-szego miejsca w Sesji Biologii Molekularnej 11. Międzynarodowej Konferencji
Naukowej Studentów i Młodych Lekarzy w Gdańsku, 2003
Gdańsk, 27.11.2015 Michał Pikuła