Wpływ niespecyficznego Wpływ niespecyficznego inhibitora kinaz białkowych 6-inhibitora kinaz białkowych 6-dimetyloaminopuryny na aktywacje dimetyloaminopuryny na aktywacje oocytów myszy.oocytów myszy.

Dojrzewanie oocytów kręgowców wstrzymane Dojrzewanie oocytów kręgowców wstrzymane jest w metafazie II podziału mejotycznego.jest w metafazie II podziału mejotycznego.

Możliwe jest ono dzięki działaniu CSF , który Możliwe jest ono dzięki działaniu CSF , który stabilizuje aktywność MPF.stabilizuje aktywność MPF.

Po wniknięciu do oocytu plemnika dochodzi do Po wniknięciu do oocytu plemnika dochodzi do inaktywacji CSF i MPF, co powoduje aktywacje inaktywacji CSF i MPF, co powoduje aktywacje oocytu- opuszczenie stadium metafazy II , oocytu- opuszczenie stadium metafazy II , ukończenie mejozy z odcięciem drugiego ciałka ukończenie mejozy z odcięciem drugiego ciałka kierunkowego oraz dekondensacje chromatyny kierunkowego oraz dekondensacje chromatyny oocytu i plemnika , z których powstaje oocytu i plemnika , z których powstaje przedjądrze męskie i żeńskie .przedjądrze męskie i żeńskie .

Inaktywacja MPF powoduje przejście do inerfazy.Inaktywacja MPF powoduje przejście do inerfazy.

6-DMAP powoduje formowanie jądra oraz 6-DMAP powoduje formowanie jądra oraz inaktywacje CSF i MPF w oocytach inaktywacje CSF i MPF w oocytach zatrzymanych w metafazie II u zatrzymanych w metafazie II u Patella i Patella i Xenopus.Xenopus.

U myszy 6-DMAP indukuje dekondensacje U myszy 6-DMAP indukuje dekondensacje chromosomów w każdym stadium chromosomów w każdym stadium mejotycznego cyklu komórkowego – od mejotycznego cyklu komórkowego – od prometafazy I do telofazy I – jednak nie prometafazy I do telofazy I – jednak nie powoduje tego w metafazie II.powoduje tego w metafazie II.

Praca ta ma na celu wyjaśnienie efektów jakie wywołuje Praca ta ma na celu wyjaśnienie efektów jakie wywołuje 6-DMAP w oocytach w stadium metafazy jak i w 6-DMAP w oocytach w stadium metafazy jak i w oocytach zaktywowanych.oocytach zaktywowanych.

Owulowane oocyty traktowane były 6-DMAP oraz 6-Owulowane oocyty traktowane były 6-DMAP oraz 6-DMAP w połączeniu z czynnikami partenogentycznymi : DMAP w połączeniu z czynnikami partenogentycznymi : przenośnikiem jonów wapniowych-A23187, inhibitorem przenośnikiem jonów wapniowych-A23187, inhibitorem syntez białkowych –cykloheksymidem i estrem forbolu -syntez białkowych –cykloheksymidem i estrem forbolu -PMA.PMA.

Traktowanie oocytów A23187 powoduje odcięcie Traktowanie oocytów A23187 powoduje odcięcie drugiego ciałka kierunkowego, ale oocty zatrzymane sa drugiego ciałka kierunkowego, ale oocty zatrzymane sa w metafazie III.w metafazie III.

6-DMAP zapobiega zatrzymaniu w metafazie III- oocyty 6-DMAP zapobiega zatrzymaniu w metafazie III- oocyty wchodzą w interfaze . W połączeniu z czynnikiem wchodzą w interfaze . W połączeniu z czynnikiem partenogentycznym przyspiesza wejście w interfaze . partenogentycznym przyspiesza wejście w interfaze .

Materiały i metodyMateriały i metody

Oocyty otoczone komórkami pęcherzykowymi Oocyty otoczone komórkami pęcherzykowymi wyizolowano z jajowodów 9-12 tygodniowych samic wyizolowano z jajowodów 9-12 tygodniowych samic myszy CD-1 , którym wstrzyknięto dootrzewnowo 5 I.U. myszy CD-1 , którym wstrzyknięto dootrzewnowo 5 I.U. serogonadotropiny źrebnej klaczy (PMSG) oraz ludzką serogonadotropiny źrebnej klaczy (PMSG) oraz ludzką gonadotropinę kosmówkową (HCG)- 61 -65 lub 13-17 gonadotropinę kosmówkową (HCG)- 61 -65 lub 13-17 godzin przed wyizolowaniem.godzin przed wyizolowaniem.

Oocyty inkubowane były w pożywce MEM z Oocyty inkubowane były w pożywce MEM z hialuronidazą a następnie w MEM.hialuronidazą a następnie w MEM.

Kontrolne oocyty poddane zostały działaniu MEM Kontrolne oocyty poddane zostały działaniu MEM zawierającej takie stężenie DMSO jakie jest w roztworach zawierającej takie stężenie DMSO jakie jest w roztworach czynników partenogenetycznych.czynników partenogenetycznych.

Zapłodnienie in-vitro przeprowadzono w MEM .Zapłodnienie in-vitro przeprowadzono w MEM .

RezultatyRezultaty6-DMAP + A231876-DMAP + A23187

Oocyty 13 h po iniekcji HCG traktowane były A23187 , Oocyty 13 h po iniekcji HCG traktowane były A23187 , 6-DMAP lub A23187 + 6-DMAP6-DMAP lub A23187 + 6-DMAP

Oocyty zapłodnione , uzyskane 17h po iniekcji HCG , Oocyty zapłodnione , uzyskane 17h po iniekcji HCG , potraktowane A23187 użyto jako pozytywnej kontroli.potraktowane A23187 użyto jako pozytywnej kontroli.

Oocyty kontrolowane były co godzinę od momentu Oocyty kontrolowane były co godzinę od momentu poddania ich działaniu czynników.poddania ich działaniu czynników.

11 22 33 44 88KontrolaKontrola 006-DMAP6-DMAP 88A23187A23187 2222A23187+6-A23187+6-DMAPDMAP

8383 100100

ZapłodnioneZapłodnione 00 1515 5858 9393A23187 A23187 (17h)(17h)

00 44 6363 9292

Tabela przedstawia jaki procent oocytów Tabela przedstawia jaki procent oocytów poddanych działaniu określonych czynników poddanych działaniu określonych czynników utworzył jądro w określonym czasie.utworzył jądro w określonym czasie.

* Mniej niż 25% oocytów uzyskanych po 13h * Mniej niż 25% oocytów uzyskanych po 13h po potraktowaniu HCG oraz poddanych po potraktowaniu HCG oraz poddanych działaniu A23187 utworzyło jądro , chociaż działaniu A23187 utworzyło jądro , chociaż drugie ciałko kierunkowe pojawiło się u drugie ciałko kierunkowe pojawiło się u ponad 90% badanych oocytów. W większości ponad 90% badanych oocytów. W większości przypadków zaobserwowano rozproszone przypadków zaobserwowano rozproszone chromosomy.chromosomy.

* 80% oocytów potraktowanyvh A23187 oraz * 80% oocytów potraktowanyvh A23187 oraz 6-DMAP uformowało jądro w przeciągu 1h a 6-DMAP uformowało jądro w przeciągu 1h a 100% uformowało jądro w przeciągu 2h. 100% uformowało jądro w przeciągu 2h.

A: Kontrolne oocyty w A: Kontrolne oocyty w metafazie IImetafazie II

B:6-DMAPB:6-DMAP C:Zapłodnione oocyty –C:Zapłodnione oocyty –

utworzone przedjądrze utworzone przedjądrze odcięte drugie ciałko odcięte drugie ciałko kierunkowekierunkowe

D:A23187 17h obecne D:A23187 17h obecne przedjądrzeprzedjądrze

E:A23187 13h odcięte E:A23187 13h odcięte drugie ciałko kierynkowe, drugie ciałko kierynkowe, zatrzymane w metafazie zatrzymane w metafazie IIIIII

F:A23187+6-DMAP 13 h F:A23187+6-DMAP 13 h obecne dwa przedjądrzaobecne dwa przedjądrza

6-DMAP + PMA lub CHX6-DMAP + PMA lub CHX PMA i CHX użyto , aby sprawdzić czy PMA i CHX użyto , aby sprawdzić czy

6-DMAP przyspiesza wejście w 6-DMAP przyspiesza wejście w interfaze także w ich obecności.interfaze także w ich obecności.

Przyspiesza, ale nie tak silnie jak w Przyspiesza, ale nie tak silnie jak w obecności A23187.obecności A23187.

Tabela przedstawia jaki procent oocytów Tabela przedstawia jaki procent oocytów poddanych działaniu określonych czynników poddanych działaniu określonych czynników utworzył jądro w określonym czasie.utworzył jądro w określonym czasie.

11 22 33 44 88KontrolaKontrola 006-DMAP6-DMAP 1515PMAPMA 44 55 1515 3838 8080PMA+6-PMA+6-DMAPDMAP

1313 8181 8989

CHXCHX 00 33 1717 3838 8787CHX+6-CHX+6-DMAPDMAP

77 2424 5050 8585

6-DMAP6-DMAP W oocytach traktowanych 6-DMAP wrzeciono W oocytach traktowanych 6-DMAP wrzeciono

podzialowe zaniklo w ciągu 3-4h. Chromosomy podzialowe zaniklo w ciągu 3-4h. Chromosomy pozostały skupione razem; oocyty pozostały w pozostały skupione razem; oocyty pozostały w metafazie- były krótsze i grubsze niż w kontroli.metafazie- były krótsze i grubsze niż w kontroli.

Niewielka liczba oocytów uległo aktywacji.Niewielka liczba oocytów uległo aktywacji. Brak korelacji pomiędzy procentem oocytów Brak korelacji pomiędzy procentem oocytów

zaktywowanych w kontroli i poddanych działaniu 6-zaktywowanych w kontroli i poddanych działaniu 6-DMAP.DMAP.

Zwiększenie stężenia 6-DMAP nie powoduje Zwiększenie stężenia 6-DMAP nie powoduje zwiększenia liczby oocytów zaktywowanych. zwiększenia liczby oocytów zaktywowanych.

Oocyty przeniesione do MEM na 18 h po 4h inkubacji Oocyty przeniesione do MEM na 18 h po 4h inkubacji w 6-DMAP posiadały odtworzone wrzeciono w 6-DMAP posiadały odtworzone wrzeciono podziałowe- efekt działania 6-DMAP na mikrotubule podziałowe- efekt działania 6-DMAP na mikrotubule jest odwracalny.jest odwracalny.

Oocyty w 6-DMAP tworzą jadro bardzo Oocyty w 6-DMAP tworzą jadro bardzo gwałtownie – gwałtowniej niż w wyniku gwałtownie – gwałtowniej niż w wyniku działania innych substancji, lecz nie tak działania innych substancji, lecz nie tak gwałtownie jak w przypadku gwałtownie jak w przypadku stosowania kombinacji różnych stosowania kombinacji różnych substancji.substancji.

Około 20% oocytów posiadało 2 jądra – Około 20% oocytów posiadało 2 jądra – w wyniku oddzielenia się w wyniku oddzielenia się chromosomów . Większość posiadała 1 chromosomów . Większość posiadała 1 jądro.( diploidalne )jądro.( diploidalne )

W żadnym z oocytów nie W żadnym z oocytów nie zaobserwowano ciałka kierunkowego.zaobserwowano ciałka kierunkowego.

A:kontrolaA:kontrola B:6-DMAPB:6-DMAP C:6-DMAP 4 h MEM C:6-DMAP 4 h MEM

18h18h D:6-DMAP 1h D:6-DMAP 1h

oddzielone oddzielone chromosomychromosomy

E:6-DMAP 3hE:6-DMAP 3h

PodsumowaniePodsumowanie

6-DMAP uniemożliwia fosforylacje białek w 6-DMAP uniemożliwia fosforylacje białek w około 20% mysich oocytów w metafazie II.około 20% mysich oocytów w metafazie II.

Kinaza białkowa C (PKC) jest aktywowana Kinaza białkowa C (PKC) jest aktywowana przez PMA . Są dowody na to , iż 6-DMAP i przez PMA . Są dowody na to , iż 6-DMAP i PKC działają w podobny sposób.PKC działają w podobny sposób.

Fosforylacja i aktywacja kinazy MAP jest Fosforylacja i aktywacja kinazy MAP jest hamowana przez 6-DMAP.hamowana przez 6-DMAP.

MAPMAP

Niezbędna do aktywacji CSF - 6-DMAP Niezbędna do aktywacji CSF - 6-DMAP pwoduje,że oocyty przchodzą do pwoduje,że oocyty przchodzą do interfazy.interfazy.

Powoduje , ze MPF jest stabilnyPowoduje , ze MPF jest stabilny Niezbędna do utworzenia wrzeciona Niezbędna do utworzenia wrzeciona

podziałowego- w oocytach podziałowego- w oocytach traktowanych 6-DMAP zanikło traktowanych 6-DMAP zanikło wrzeciono podziałowe.wrzeciono podziałowe.

Jeśli u myszy MAP jest częścią CSF ( tak jak u Jeśli u myszy MAP jest częścią CSF ( tak jak u Xenopus ) Xenopus ) to 6-DMAP hamuje aktywność CSF.to 6-DMAP hamuje aktywność CSF.

W oocytach małż i żab 6-DMAP zapobiega W oocytach małż i żab 6-DMAP zapobiega degradacji cykliny B – proteoliza cykliny B jest degradacji cykliny B – proteoliza cykliny B jest niezbędna do inaktywacji MPF i wyjścia z niezbędna do inaktywacji MPF i wyjścia z metafazy.Jeśli podobnie jest u myszy to powinien metafazy.Jeśli podobnie jest u myszy to powinien on utrudniać wyjście z metafazy-może dlatego on utrudniać wyjście z metafazy-może dlatego tylko cześć oocytów została zaktywowanych.tylko cześć oocytów została zaktywowanych.

Może 6-DMAP destabilizuje CSF , ale aktywacja Może 6-DMAP destabilizuje CSF , ale aktywacja zachodzi tylko wtedy gdy MPF nie był zachodzi tylko wtedy gdy MPF nie był wystarczająco aktywny aby oocyt mógl pozstać w wystarczająco aktywny aby oocyt mógl pozstać w metafazie.metafazie.

W oocytach w metafazie III aktywacje powoduje W oocytach w metafazie III aktywacje powoduje chwilowe zmniejszenie ilości MPF.chwilowe zmniejszenie ilości MPF.

Aby MPF był obecny w oocycie musi Aby MPF był obecny w oocycie musi zachodzić ciągła synteza białek oraz zachodzić ciągła synteza białek oraz fosforylacja przez kinazy wrażliwe na 6-fosforylacja przez kinazy wrażliwe na 6-DMAP.DMAP.

Sygnały aktywujące oocyt mogą pozbawiać Sygnały aktywujące oocyt mogą pozbawiać oocytu fosfoprotein , które wpływają na oocytu fosfoprotein , które wpływają na aktywność MPF.aktywność MPF.

„„Młode oocyty” mogą mieć większy poziom Młode oocyty” mogą mieć większy poziom fosfoprotein i dlatego przechodzą do fosfoprotein i dlatego przechodzą do stadium metafazy III.stadium metafazy III.