AUTOREFERAT - biotechnologia.zut.edu.pl · rozwój oocytów świńskich w warunkach in vitro....

ZAŁĄCZNIK 2

AUTOREFERAT Opis dorobku i osiągnięć naukowych

Dr inż. Tomasz Stankiewicz

Katedra Biotechnologii Rozrodu Zwierząt i Higieny Środowiska

Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

ul. Klemensa Janickiego 29, 71-270 Szczecin

e-mail: [email protected]

Szczecin 2017

mailto:[email protected]

Dr inż. Tomasz Stankiewicz S t r o n a | 2

1. Imię i nazwisko, adres do korespondencji

Dr inż. Tomasz Stankiewicz

Katedra Biotechnologii Rozrodu Zwierząt i Higieny Środowiska

Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt

Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

ul. Klemensa Janickiego 29, 71-270 Szczecin

tel. 505 229 239; e-mail: [email protected]

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne – z podaniem nazwy,

miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej

Tytuł

zawodowy,

stopnie

i tytuł(y)

naukowe

Rok

uzyskania Miejsce uzyskania

Dziedzina,

dyscyplina

Doktor 28 marca

2007

Akademia Rolnicza w Szczecinie,

Wydział Biotechnologii i Hodowli

Zwierząt;

Tytuł rozprawy doktorskiej:

Próba określenia potencjału

rozrodczego pęcherzyków jajnikowych

oraz wpływu wybranych czynników

środowiskowych i genetycznych na

skład płynu pęcherzykowego oraz

rozwój oocytów świńskich w warunkach

in vitro.

Promotor: prof. dr hab. Jan Udała

Nauki rolnicze,

zootechnika

Magister

inżynier

12 czerwca

2002


Wydział Biotechnologii i Hodowli

Zwierząt;

Tytuł pracy magisterskiej:

Profil zmian stężeń steroidowych

hormonów jajnika i koncentracja

cholesterolu we krwi kóz anglo-

nubijskich w posynchronizacyjnym

cyklu rujowym.

Promotor: prof. dr hab. Jan Udała

Kierunek studiów:

Biotechnologia,

specjalność:

Biotechnologia

w produkcji

zwierzęcej i ochronie

środowiska

mailto:[email protected]


3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych

Okres Miejsce zatrudnienia Stanowisko

Od

01-03-2010

do

chwili obecnej

Zachodniopomorski Uniwersytet

Technologiczny w Szczecinie,

Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt,

Katedra Biotechnologii Rozrodu Zwierząt i

Higieny Środowiska

Adiunkt,

1/1 etat

Od

01-01-2009 r.

do

28-02-2010 r.

Zachodniopomorski Uniwersytet

Technologiczny w Szczecinie,


Katedra Biotechnologii Rozrodu Zwierząt

i Higieny Środowiska

Specjalista

inżynieryjno-

techniczny,

1/1 etat

Od

01-06-2007 r.

do

31-12-2008 r.



Katedra Rozrodu Zwierząt

Specjalista

inżynieryjno-

techniczny,

1/1 etat

Od

06-02-2007 r.

do

31-05-2007 r.




Starszy referent

techniczny,

½ etatu

Od

04-11-2002 r.

do

30-09-2006 r.




Międzywydziałowe Studia Doktoranckie

Doktorant

4. Wskazanie osiągnięcia naukowego stanowiącego podstawę do ubiegania

się o stopień naukowy doktora habilitowanego (zgodnie z art. 16 ust. 2

ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule

naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki – Dz. U. nr 65, poz.

595 ze zm.)

4.1. Tytuł osiągnięcia naukowego:

Wybrane transformujące czynniki wzrostu-β, hormony i parametry

biochemiczne u świń z torbielami i bez torbieli jajnikowych


4.2. Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego:

* współczynnik impact factor (IF) wykazany według bazy Journal Citation Reports (JCR)

zgodny z rokiem ukazania się publikacji; dla publikacji H2 i H3 i H6 współczynnik IF

wykazano za rok 2015.

** liczba punktów według wykazu czasopism naukowych MNiSW zgodna z rokiem ukazania

się publikacji; dla publikacji H2, H3 i H6 liczba punktów według wykazu czasopism

naukowych MNiSW z dnia 9 grudnia 2016 roku.

Oświadczenia współautorów wraz z określeniem ich indywidualnego udziału zawarto w

Załączniku nr 6.

Lp. Autorzy i tytuł publikacji IF* Punkty

MNiSW**

H1

Stankiewicz T., Błaszczyk B. 2014: Concentrations of bone

morphogenetic protein-15 (BMP-15) and growth differentiation

factor-9 (GDF-9) in follicular cysts, mono- and polyoocyte

follicles in gilts. Acta Veterinaria-Beograd, 64 (1), 24-32.

0,375 15

H2

Stankiewicz T., Błaszczyk B. 2016: Relationship between the

concentration of bone morphogenetic protein-15 (BMP-15) and

growth differentiation factor-9 (GDF-9) in pre-ovulatory

follicles, ovarian cysts, and serum in sows. Animal Production

Science, 56, (1), 141-146.

0,902 30

H3

Stankiewicz T. 2017: The relationships between transforming

growth factors β and free thyroxine and progesterone in the

ovarian cysts, preovulatory follicles, and the serum of sows.

Archives Animal Breeding, 60, (2), 131-136.

0,493 20

H4

Stankiewicz T. 2015: Biochemical composition of the fluid of

ovarian cysts and pre-ovulatory follicles compared to the serum

in sows. Tierärztliche Praxis Großtiere, 43, (4), 216-221.

0,305 15

H5

Stankiewicz T., Błaszczyk B. 2015: Macro-elements

compositions of cystic and follicular fluid in ovaries and their

relationship to peripheral blood concentration in sows. Acta

Veterinaria-Beograd, 65, (2), 217-225.

0,741 15

H6

Stankiewicz T., Błaszczyk B., Lasota B., Mościcki W.,

Kołodziejska J. 2016: Beziehungen zwischen Progesteron und

Immunglobulinen G und M in präovulatorischen Follikeln,

Ovarialzysten und Serum beim Schwein. Tierärztliche

Umschau, 71, (5), 173-180.

0,079 15

Łącznie H1–H6 2,895 110


Łączna liczba punktów za publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego wg

wykazu czasopism naukowych MNiSW zgodna z rokiem ukazania się pracy wynosi

110 punktów.

Sumaryczny IF za publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego według bazy

Journal Citation Reports (JCR) zgodny z rokiem ukazania się pracy wynosi 2,895.

4.3. Omówienie celu naukowego /artystycznego ww. pracy /prac i osiągniętych

wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania

Osiągnięcie naukowe pod tytułem: „Wybrane transformujące czynniki wzrostu-β,

hormony i parametry biochemiczne u świń z torbielami i bez torbieli jajnikowych”

zostało udokumentowane cyklem sześciu publikacji powiązanych tematycznie.

Celem osiągnięcia naukowego była ocena zależności oraz porównanie jajnikowych i

obwodowych stężeń wybranych czynników wzrostu należących do nadrodziny

transformujących czynników wzrostu β (TGFs-β), hormonów i parametrów

biochemicznych u świń z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych. Pracę tę

wykonano w aspekcie bliższego wyjaśnienia patogenezy torbieli jajnikowych i

ewentualnego zastosowania uzyskanych wyników w diagnostyce i zapobieganiu

tych schorzeń u świń.

Dla realizacji nadrzędnego celu naukowego wyznaczono następujące cele szczegółowe:

I. Określenie stężenia białka morfogenetycznego kości 15 (BMP-15) i czynnika

wzrostowo-różnicującego 9 (GDF-9) w płynie torbieli pęcherzykowych i

pęcherzyków jajnikowych oraz porównanie stężeń tych czynników w pęcherzykach

mono- i polioocytowych u loszek.

II. Określenie zależności i porównanie stężeń BMP-15 i GDF-9 w płynie torbieli

pęcherzykowych, pęcherzyków przedowulacyjnych i surowicy u loch z torbielami i

bez torbieli pęcherzykowych.

III. Określenie zależności między stężeniem wolnej tyroksyny (FT4), progesteronu (P4)

a stężeniem BMP-15 i GDF-9 w płynie torbieli pęcherzykowych, pęcherzyków

przedowulacyjnych i surowicy u loch z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych.

IV. Określenie zależności i porównanie stężeń glukozy, białka całkowitego,

cholesterolu całkowitego, lipoproteiny niskiej (LDL) i wysokiej gęstości (HDL) w

płynie torbieli pęcherzykowych, pęcherzyków przedowulacyjnych i surowicy u

loch z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych.


V. Określenie zależności i porównanie stężeń sodu, wapnia, magnezu i fosforu w

płynie torbieli pęcherzykowych, pęcherzyków przedowulacyjnych i surowicy u

loch z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych.

VI. Określenie zależności i porównanie stężeń progesteronu i immunoglobulin (IgG i

IgM) w płynie torbieli pęcherzykowych, pęcherzyków przedowulacyjnych i

surowicy u loch z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych.

4.3.1. Wprowadzenie i uzasadnienie podjętego tematu badań

Zaburzenia czynności jajników u świni domowej (Sus scrofa. f. domestica)

stanowią poważny problem diagnostyczny i są istotną przyczyną strat ekonomicznych

w hodowli tego gatunku zwierząt (Ebbert i Bostedt, 1993; Fitko i wsp., 1996). Spośród

wszystkich zaburzeń funkcji jajników u świń torbiele stanowią znaczny odsetek (Cech i

Doležel, 2007; Szulańczyk-Mencel i wsp., 2010). Najczęściej stwierdza się je podczas

obserwacji jajników pozyskanych poubojowo od loch wybrakowanych z powodu

problemów w rozrodzie. Przy tym sposobie oceny częstotliwość występowania torbieli

jajnikowych wynosi od 4,7 do 14% (Dalin i wsp., 1997; Karveliene i wsp., 2007;

Tummaruk i wsp., 2009). Jednak faktyczna liczba świń z tymi zaburzeniami jajnika

może być znacznie większa i jak wskazują niektóre badania torbielowatość jajników

może występować nawet u 50% samic w stadzie (Schmidt i wsp., 1995). Torbiele

jajnikowe mogą powodować nieregularne lub wydłużone cykle rujowe oraz być

przyczyną okresowej lub trwałej niepłodności (Ebbert i Bostedt, 1993; Fitko i wsp.,

1996). Jajniki torbielowate u świń mogą być jednostronne lub obustronne, a torbiele

pojedyncze lub mnogie. Duże znaczenie kliniczne mają zwłaszcza torbiele mnogie

obecne na obu jajnikach, które częściej występują u loch niż u loszek stanowiąc

przyczynę znacznego odsetka brakowania świń z powodu zaburzeń płodności

(Heinonen i wsp., 1998, Cech i Doležel, 2007). W większości przypadków pojedyncze

torbiele jajnikowe nie wpływają na płodność świń, ale utrzymywanie się ich na jajniku

może predysponować do powstania wielu torbieli, które z kolei obniżają płodność u

samic tego gatunku (Tummaruk i Kesdangsakonwut, 2012). Duże znaczenie kliniczne

mają zwłaszcza torbiele pęcherzykowe (Szulańczyk-Mencel i wsp., 2010). Wywodzą się

one z nieowulujących pęcherzyków jajnikowych, wypełnionych płynem i osiągają

średnicę 11 mm i większą (Heinonen i wsp., 1998, Cech i Doležel, 2007, Sun i wsp.,


2011). Uważa się, że przyczyną torbieli są zaburzenia w mechanizmach

odpowiedzialnych za rozwój pęcherzyków jajnikowych i owulację. Zaburzenia te

dotyczą głównie dysfunkcji w centralnej regulacji neurohormonalej osi podwzgórze-

przysadka. Ponadto powstawaniu torbieli sprzyja zaburzona regulacja auto- i

parakrynna w obrębie jajnika, a także czynniki środowiskowe (Stankiewicz i wsp.,

2008).

Obecnie wiele badań dotyczących funkcji pęcherzyka jajnikowego skupia się

nad znaczeniem czynników należących do nadrodziny transformujących czynników

wzrostu β (TGFs-β, ang. transforming growth factors β) (Su i wsp., 2008; Knight i

Glister 2006; Sun i wsp., 2010). Spośród tych czynników szczególną uwagę zwraca się

na białko morfogenetyczne kości 15 (BMP-15, ang. bone morphogenetic protein-15) i

czynnik wzrostowo-różnicujący 9 (GDF-9, growth differentiation factor-9). W obrębie

pęcherzyka jajnikowego te dwa czynniki wydzielane są głównie przez oocyty (Su i

wsp., 2008; Orisaka i wsp., 2009; Peng i wsp., 2010, Sun i wsp., 2010). Nie można więc

wykluczyć, iż stężenie tych czynników w płynie pęcherzykowym może zależeć od

liczby oocytów w pęcherzyku. Jak wiadomo większość pęcherzyków jajnikowych

zawiera tylko jeden oocyt, ale u niektórych gatunków występują pęcherzyki zawierające

większą ich liczbę (Safran i wsp. 1998; Payan-Carreira i Pires, 2008; Stankiewicz i

wsp., 2009). Obecność pęcherzyków polioocytowych została udokumentowana między

innymi w jajnikach świń (Stankiewicz i wsp., 2009). Jak dotychczas nie ma jednak

jednoznacznego stanowiska określającego jakość takich pęcherzyków i znajdujących się

w nich oocytów. Niemniej sugeruje się, że mogą one powstawać w wyniku zaburzeń

folikulogenezy (Bristol-Gould i Woodruff, 2006). Uwzględniając fakt, że oocyty

wykazują aktywność wydzielniczą i rozpatrując procesy zachodzące podczas

folikulogenezy intersującym obiektem badań obok torbieli pęcherzykowych są również

pęcherzyki polioocytowe.

Należy także uwzględnić, że źródłem BMP-15 i GDF-9 w pęcherzyku

jajnikowym są nie tylko oocyty, ale również komórki somatyczne. Ekspresję

matrycowego RNA (mRNA, ang. messenger RNA) GDF-9 i BMP-15 stwierdzono

bowiem w różnych typach komórek pęcherzyków jajnikowych świni (Prochazka i wsp.,

2004; Paradis i wsp., 2009). Dotychczasowe badania wykazały, że BMP-15 i GDF-9

poprzez parakrynny i autokrynny szlak sygnałowy wpływają na proliferację i

różnicowanie komórek somatycznych pęcherzyka, steroidogenezę, owulację i

luteinizację (Su i wsp., 2008; Orisaka i wsp., 2009; Peng i wsp., 2010; Sun i wsp.,


2010). W okresie przedowulacyjnym czynniki te biorą udział w procesie dojrzewania

oocytu i ekspansji komórek cumulusa (Su i wsp., 2004; Paradis i wsp., 2009). Ponadto

BMP-15 i GDF-9 uczestniczą w regulacji hormonalnej osi podwzgórze-przysadka-

jajnik (Paulini i Melo, 2011). W zależności od etapu folikulogenezy nasilają lub

osłabiają oddziaływanie gonadotropin na pęcherzyk jajnikowy wpływając na ekspresję

receptorów dla hormonu luteinizującego (rLH, ang. Luteinizing Hormone receptor)

(Knight i Glister, 2006; Crawford i McNatty, 2012). Jest to szczególnie istotne w

przypadku występowania torbieli pęcherzykowych, których bezpośrednią przyczyną są

zakłócenia w oddziaływaniu hormonu luteinizującego na pęcherzyki jajnikowe (LH,

ang. luteinizing hormone) (Ebbert i wsp., 1993; Fitko i wsp., 1996).

W regulacji funkcji świńskiego pęcherzyka jajnikowego oprócz gonadotropin,

hormonów steroidowych i licznych czynników wzrostu ważną rolę odgrywają również

hormony tarczycy. Ich obecność stwierdzono w płynie świńskich pęcherzyków

jajnikowych (Stankiewicz i wsp., 2008). Ponadto w komórkach ziarnistych świńskich

pęcherzyków przedowulacyjnych zidentyfikowano receptory dla hormonów tarczycy

(Maruo i wsp., 1992). W badaniach in vitro wykazano, że hormony te wpływają na

steroidogenezę w komórkach ziarnistych i osłonki wewnętrznej pozyskanych z

pęcherzyków jajnikowych świni (Gregoraszczuk i Skalka, 1996). Ich udział w syntezie

hormonów steroidowych zaznacza się poprzez wpływ na aktywność aromatazy

(Gregoraszczuk i wsp., 1998). Hormony tarczycy wzmagają też działanie hormonu

folitropowego (FSH, ang. Follicle Stimulating Hormone) w hodowlach świńskich

komórek ziarnistych (Maruo i wsp., 1987). Należałoby również uwzględnić je w

patogenezie zaburzeń folikulogenezy. Istnieją bowiem dane, że niedoczynność tarczycy

wzmaga powstawanie torbieli jajnikowych i osłabia aktywność steroidogenną jajników

u loszek (Fitko i wsp., 1995, Fitko i wsp., 1996). Z kolei zaburzona steroidogeneza

pęcherzykowa jest efektem i/lub przyczyną zaburzeń jajnikowych takich jak torbiele

(Babalola i Shapiro, 1990; Szulańczyk-Mencel i wsp., 2010). Jednak dokładny

mechanizm działania omawianych hormonów w patogenezie torbieli jajnikowych nie

jest znany. Można jednak przypuszczać, że ich udział zaznacza się w interakcjach z

innymi czynnikami działającymi lokalnie w obrębie jajnika i/lub obwodowo.

Niewykluczone, że w tych interakcjach uczestniczą czynniki należące do TGFs- β.

W mechanizmie powstawania torbieli jajnikowych nie można wykluczyć

zaburzeń związanych z układem immunologicznym, gdyż istnieje ścisła zależność

pomiędzy układem hormonalnym i immunologiczym (Bukovsky i Caudle, 2008).


Wykazano, że status odpornościowy organizmu ulega zmianom pod wpływem różnych

hormonów, w tym hormonów steroidowych jajnika (Beagley i Gockel, 2003;

Harichandan i wsp., 2014). W odniesieniu do procesów rozrodczych uważa się, że

cykliczne zmiany w wydzielaniu estrogenów i progesteronu wpływają na zmiany w

immunologii żeńskich narządów rozrodczych (Beagley i Gockel, 2003). Układ

rozrodczy uważany jest za część śluzówkowego układu odpornościowego (Hussein i

wsp., 1983; de Buysscher, 1999). Narządy rozrodcze zawierają pełny zestaw komórek

układu immunologicznego, które są odpowiedzialne zarówno za odporność wrodzoną

jak i swoistą. Z kolei liczba i aktywność tych komórek różnią się istotnie podczas fazy

cyklu płciowego i kontrolowane są zmianami stężeń hormonów steroidowych jajnika

(Wira i Kaushic, 1996; Wira i wsp., 1999; Reibiger i Spanel-Borowski, 2000). Ma to

uzasadnienie w tworzeniu obrony przeciw patogenom, na które narażony jest układ

rozrodczy. Przypuszcza się, że immunoglobuliny w płynie pęcherzyków jajnikowych

uczestniczą w procesach obronnych podczas transportu oocytów po owulacji (de

Buysscher, 1999). Ponadto zaburzenia w układzie immunologicznym mogą prowadzić

do patologii jajnika np. do przedwczesnego wygasania funkcji jajnika czy zmian

nowotworowych (Bukovsky 2006; Bukovsky i Caudle, 2008). Nie można też

wykluczyć, że zaburzenia te mogą mieć związek z patogenezą torbieli jajnikowych.

Bardzo ważnym elementem wpływającym na prawidłowe dojrzewanie

pęcherzyków jajnikowych jest płyn pęcherzykowy (Nandi i wsp., 2007). Jest on

mieszaniną składającą się z wody i substancji rozpuszczonych pochodzących z osocza i

produkowanych lokalnie przez komórki pęcherzyka jajnikowego, a także przez komórki

układu immunologicznego. Badania nad zmianami metabolicznymi w płynie bydlęcych

pęcherzyków jajnikowych wykazały, że analiza składu biochemicznego może w

pewnym stopniu odzwierciedlać zmiany zachodzące w organizmie i odwrotnie (Leroy i

wsp., 2004). Dlatego też skład płynu pęcherzykowego może ulegać zmianom nie tylko

na skutek zaburzeń lokalnych, ale również w wyniku zmian w obwodowym krążeniu

spowodowanych procesami patologicznymi (Arshad, 2005). Z badań

przeprowadzonych u różnych gatunków zwierząt wynika, że spośród składników

biochemicznych duże znaczenie w prawidłowym rozwoju pęcherzyka mają zarówno

składniki organiczne jak i nieorganiczne (Bordoloi i wsp., 2001; Błaszczyk i wsp.,

2006; Nandi i wsp., 2007; Alkalby i wsp., 2012; Kor i wsp., 2013; Kor i Moradi, 2013).

Skład płynu pęcherzykowego jest intensywnie badany nie tylko dla pogłębienia

wiedzy na temat rozwoju pęcherzyków jajnikowych i dojrzewania oocytów, ale także


dla wyjaśnienia patogenezy torbieli pęcherzykowych (Mishra i wsp., 2003; Błaszczyk i

wsp., 2006; Stankiewicz i wsp., 2008; Stankiewicz i wsp., 2008; Stankiewicz i wsp.,

2009). Jak podają Khan i wsp. (2011) zaburzenia równowagi pomiędzy różnymi

składnikami płynu pęcherzykowego mogą bowiem powodować zakłócenia w rozwoju

pęcherzyków jajnikowych i owulacji prowadząc do powstawania torbieli

pęcherzykowych. Jednakże, mimo istniejących badań dokładna patogeneza torbieli

jajnikowych nie została w pełni wyjaśniona ani w przypadku świń, ani też samic innych

gatunków ssaków.

4.3.2. Uzyskane wyniki i ich omówienie

Realizacja celu pierwszego (cel szczegółowy I)

Dla realizacji tego celu przeprowadzono badania, których wyniki opublikowano

w artykule pt. „Concentrations of bone morphogenetic protein-15 (BMP-15) and growth

differentiation factor-9 (GDF-9) in follicular cysts, mono- and polyoocyte follicles in

gilts”. W pracy tej wykonano dwa doświadczenia, które przeprowadzono na loszkach

(wiek 7-8 miesięcy) poddawanych ubojowi w lokalnej rzeźni. W doświadczeniu

pierwszym badaniami objęto 31 loszek z pojedynczymi torbielami pęcherzykowymi i

41 loszek bez torbieli. Do analiz przeznaczono płyn pęcherzykowy pozyskany z

pęcherzyków o średnicy od 8 do 10 mm (n=41) i o średnicy od 5 do 8 mm (n=41) oraz

płyn z torbieli pęcherzykowych (n=31). W doświadczeniu drugim do analiz

przeznaczono płyn z pęcherzyków poli- (n=19) i monooocytowaych (n=22). W

uzyskanych próbkach określono stężenie BMP-15 i GDF-9.

Analiza wyników wykazała istotnie wyższe stężenie BMP-15 i GDF-9 w płynie

z torbieli niż w płynie pęcherzykowym (P<0.01). Mogło być to efektem różnic w liczbie

komórek somatycznych między pęcherzykami a torbielami lub różnym nasileniem ich

aktywności wydzielniczej. Wykazano bowiem, że synteza BMP-15 i GDF-9 odbywa się

we wszystkich typach komórek pęcherzyka jajnikowego (Paradis i wsp., 2009;

Prochazka i wsp., 2004). Być może wysokie stężenia tych czynników w torbielach

pęcherzykowych ma związek z odmiennym nasileniem steroidogenezy. U szczura

GDF-9 wzmaga bowiem syntezę androgenów w komórkach osłonki wewnętrznej

pęcherzyka jajnikowego (Solovyeva i wsp., 2000). Pache i wsp. (1991) wykazali


natomiast, że androgeny odgrywają ważną rolę w genezie torbieli jajnikowych. Nie

można zatem wykluczyć, iż specyficzne środowisko hormonalne w torbielach może

wpływać na produkcję omawianych czynników. Należy również uwzględnić, iż w

torbielach dochodzi do zaburzeń w interakcji międzykomórkowej, a efektem tych

zaburzeń może być wysokie stężenie BMP-15 i GDF-9. Sun i wsp. (2012) wskazują, że

powyższe czynniki GDF-9 mają wpływ na równowagę pomiędzy apoptozą a

proliferacją komórek pęcherzykowych.

W związku z tym, iż głównym źródłem BMP-15 i GDF-9 w pęcherzyku

jajnikowym jest oocyt, w niniejszej pracy określono także stężenie tych czynników w

płynie pęcherzyków mono- i polioocytowych. Przeprowadzone badania wykazały, że

stężenie BMP-15 i GDF-9 w pęcherzykach polioocytowych było tylko nieznacznie

wyższe niż w pęcherzykach monooocytowych, a oszacowane różnice nie były

statystycznie istotne. Być może brak różnic spowodowany był zróżnicowaną

aktywnością sekrecyjną oocytów z pęcherzyków polioocytowych, która w

konsekwencji przyczyniła się do nieznacznie tylko wyższej koncentracji BMP-15 i

GDF-9 w tych pęcherzykach. Potwierdzeniem tej sugestii są moje wcześniejsze

badania, w których wykazano różną jakość oocytów z pęcherzyków polioocytowych

(Stankiewicz i wsp., 2009). Z drugiej strony w pęcherzyku niezależnie od liczby

oocytów i ich aktywności sekrecyjnej mogą istnieć mechanizmy utrzymujące optymalne

stężenie BMP-15 i GDF-9 dla prawidłowej folikulogenezy.

W przedstawionej pracy wykazano dodatnią korelację między stężeniem BMP-

15 i GDF-9. Korelację taką zanotowano zarówno w pęcherzykach jajnikowych, jak i

torbielach pęcherzykowych. Wyniki te potwierdzają synergistyczne działanie BMP-15 i

GDF-9 i potrzebę uwzględniania tych dwóch czynników w kompleksowej analizie

procesów zachodzących w jajniku ssaków (Su i wsp., 2004; Knight i Glister, 2006).

Podsumowując wyniki uzyskane w niniejszej pracy należy podkreślić, że

zgodnie z moją wiedzą po raz pierwszy określono i wykazano obecność BMP-15 i

GDF-9 w płynie torbieli pęcherzykowych u loszek. Wykazane różnice w ich stężeniu

między pęcherzykami jajnikowymi a torbielami pęcherzykowymi sugerują ich związek

z zaburzeniami folikulogenezy. Ponadto niniejsze badania wydają się wskazywać, że

liczba oocytów w pęcherzykach jajnikowych nie wpływa na wewnątrzpęcherzykowe

stężenie BMP-15 i GDF-9.


Realizacja celu drugiego (cel szczegółowy II)

Uwzględniając wyniki uzyskane w omówionej powyżej pracy postanowiono

zbadać, czy podobne zależności w zakresie kształtowania się stężeń BMP-15 i GDF-9 w

torbielach i pęcherzykach jajnikowych występują również u loch z jajnikami

wielotorbielowatymi. Postanowiono też zbadać, czy ewentualne różnice dotyczą także

stężeń tych czynników w surowicy badanych loch, co mogłoby mieć zastosowanie

praktyczne w diagnostyce torbieli. Wyniki tej pracy opublikowano w artykule pt.:

„Relationship between the concentration of bone morphogenetic protein-15 (BMP-15)

and growth differentiation factor-9 (GDF-9) in pre-ovulatory follicles, ovarian cysts,

and serum in sows”.

Badania przeprowadzono na lochach wieloródkach (wiek 2-3 lata), które

poddawano ubojowi w lokalnej rzeźni. Podczas uboju z żyły szyjnej zewnętrznej od

każdej badanej lochy pozyskiwano krew. Łącznie przebadano 46 loch, w tym 20 loch, u

których poubojowo stwierdzono jajniki wielotorbielowate oraz 26 loch z pęcherzykami

przedowulacyjnymi. Dla każdej lochy przyporządkowano jedną próbkę płynu (z torbieli

lub pęcherzyka) i odpowiednią próbkę surowicy. W uzyskanych próbkach oznaczono

stężenie BMP-15 i GDF-9.

W niniejszej pracy podobnie jak u loszek stwierdzono obecność BMP-15 i GDF-

9 w płynie pęcherzykowym co potwierdza, iż czynniki te są składowymi tworzącymi

mikrośrodowisko pęcherzykowe u świń. Wykazano też istotne różnice pomiędzy

stężeniem BMP-15 i GDF-9 w płynie torbieli pęcherzykowych a stężeniem tych

czynników w pęcherzykach przedowulacyjnych loch. Okazało się, że w torbielach

stężenie BMP-15 i GDF-9 było wyższe niż w płynie pęcherzykowym (P<0.01). Między

obydwoma badanymi czynnikami stwierdzono dodatnią korelację (P<0.01 lub P<0.05).

Ponadto w surowicy loch, u których stwierdzono torbiele pęcherzykowe stężenie BMP-

15 i GDF-9 było statystycznie istotnie wyższe niż u loch bez torbieli (P<0.05 i P<0.01,

odpowiednio). Wykazano też dodatnie korelacje między stężeniem BMP-15 w surowicy

a stężeniem tego czynnika w pęcherzykach przedowulacyjnych i torbielach

pęcherzykowych (P<0.01 i P<0.05, odpowiednio). Dodatnią korelację stwierdzono

także między stężeniem GDF-9 w surowicy i płynie z torbieli (P< 0.05).

Możliwym wytłumaczeniem dodatnich zależności między stężeniem BMP-15 i

GDF-9 w płynie badanych struktur jajnikowych a ich stężeniem w surowicy jest fakt, że

płyn pęcherzykowy jest produktem zarówno aktywności sekrecyjnej pęcherzyka, jak i


przesączem osocza krwi, a z drugiej strony stężenie wielu substancji biologicznie

czynnych we krwi odzwierciedla aktywność sekrecyjną i status pęcherzyka (Leroy i

wsp., 2004). Wyniki uzyskane w niniejszej pracy sugerują zatem, że BMP-15 i GDF-9

mogą przenikać barierę krew-pęcherzyk. Nie można jednak wykluczyć, iż źródłem

BMP-15 i GDF-9 we krwi mogą być również inne komórki narządów pozajajnikowych.

Ekspresję GDF-9 mRNA stwierdzono w podwzgórzu, przysadce, macicy i szpiku

kostnym u różnych gatunków ssaków (Fitzpatrick i wsp., 1998).

Uzyskane wyniki mogą dostarczać pewnych informacji na temat roli czynników

należących do nadrodziny transformujących czynników wzrostu β (TGF-β) w

mechanizmie powstawania zaburzeń jajnikowych. Zgodnie z moją wiedzą, po raz

pierwszy wykazano bowiem obecność BMP-15 i GDF-9 w płynie torbieli jajnikowych

u loch oraz stwierdzono dodatnią zależność między stężeniem tych czynników w płynie

pęcherzykowym/torbieli pęcherzykowych a surowicą. Nie można więc wykluczyć, iż

określenie stężenia BMP-15 i GDF-9 w surowicy może być pomocne w diagnozowaniu

wielotorbielowatości jajnikowej u loch.

Realizacja celu trzeciego (cel szczegółowy III)

Wyniki uzyskane w przedstawionych dwóch powyższych pracach wskazywały

na konieczność prowadzenia dalszych badań nad ewentualnymi zależnościami między

czynnikami należącymi do TGFs-β a innymi czynnikami działającymi lokalnie w

obrębie jajnika i/lub obwodowo. Dlatego też w kolejnej pracy określono zależności

między stężeniem BMP-15 a stężeniem wolnej tyroksyny (FT4) i progesteronu (P4) u

loch z torbielami i bez torbieli pęcherzykowych. Wyniki tej pracy opublikowano w

artykule pt. „The relationships between transforming growth factors β and free

thyroxine and progesterone in the ovarian cysts, pre-ovulatory follicles, and the serum

of sows”.

Badania przeprowadzono na lochach (wiek od 2 do 3 lat) ubijanych w lokalnej

rzeźni. Podczas uboju z żyły szyjnej zewnętrznej od każdej badanej lochy pozyskiwano

krew. Od loch, u których stwierdzono wielotorbielowatość jajników (n=26)

pozyskiwano płyn z torbieli, a od loch z pęcherzykami przedowulacyjnymi (n=26)

pozyskiwano płyn pęcherzykowy. Dla każdej lochy przyporządkowano jedną próbkę

płynu (z torbieli lub pęcherzyka) i odpowiednią próbkę surowicy. W uzyskanych

próbkach oznaczono stężenie BMP-15, GDF-9, FT4 i P4.


W surowicy loch, u których na jajnikach występowały torbiele, stężenie BMP-

15 i GDF-9 było dodatnio skorelowane ze stężeniem FT4 (P<0.01 i P<0.05,

odpowiednio). Stężenie progesteronu było natomiast dodatnio skorelowane ze

stężeniem BMP-15 w surowicy loch, u których nie stwierdzono torbieli

pęcherzykowych. Z kolei udział BMP-15 i GDF-9 w patogenezie torbieli

pęcherzykowych u świń sugerowano we wcześniejszych pracach (Stankiewicz i

Błaszczyk, 2014; Stankiewicz i Błaszczyk, 2016). Ponadto czynniki te w zależności od

etapu folikulogenezy mogą nasilać lub osłabiać oddziaływanie gonadotropin na

pęcherzyk jajnikowy (Knight i Glister, 2006; Crawford i wsp., 2012). Natomiast

interakcyjny wpływ hormonów tarczycy i gonadotropin na powstawanie torbieli

pęcherzykowych wykazano u loszek (Fitko i wsp., 1995; Fitko i wsp., 1996). Dlatego

też zanotowane interakcje między BMP-15, GDF-9 a FT4 u loch z torbielami mogą być

związane z obwodową kontrolą oddziaływania gonadotropin na jajnik. Jest to możliwa

droga działania BMP-15, GDF-9 i FT4 w mechanizmie powstawania torbieli

pęcherzykowych u loch. Rozpatrując lokalne działanie hormonów tarczycy w obrębie

jajnika interesujące są wyniki w niniejszej pracy dotyczące stężenia FT4 w badanych

strukturach jajnikowych. Stężenie FT4 w torbielach było istotnie wyższe niż w

pęcherzykach (P<0.01). Podobne relacje wykazano w przypadku progesteronu, co

koresponduje z obserwacjami innych autorów w tym zakresie (Babalola i Shapiro,

1990; Kozłowska i wsp., 2013).

Wyniki przeprowadzonego doświadczenia mogą być przydatne do wyjaśnienia

potencjalnej roli tarczycy, aktywności steroidogennej i czynników należących do

nadrodziny transformujących czynników wzrostu β w mechanizmie powstawania

wielotorbielowatości jajników u loch.

Realizacja celu czwartego (cel szczegółowy IV)

W kolejnej pracy przeanalizowano, czy odzwierciedleniem zaburzeń

folikulogenezy są także zmiany w składzie biochemicznym płynu tworzącego

mikrośrodowisko rozwoju pęcherzyka jajnikowego. Wyniki tej pracy opublikowano w

artykule pt.: „Biochemical composition of the fluid of ovarian cysts and pre-ovulatory

follicles compared to the serum in sows”.

Badania przeprowadzono na lochach w wieku od 2 do 3 lat, ubijanych w

lokalnej rzeźni. Podczas uboju z żyły szyjnej zewnętrznej od każdej badanej lochy


pozyskiwano krew. Od loch, u których stwierdzono wielotorbielowatość jajników

(n=21) pozyskiwano płyn z torbieli, a od loch z pęcherzykami przedowulacyjnymi

(n=22) pozyskiwano płyn pęcherzykowy. Dla każdej lochy przyporządkowano jedną

próbkę płynu (z torbieli lub pęcherzyka) i odpowiednią próbkę surowicy. W

uzyskanych próbkach oznaczono stężenie glukozy, białka całkowitego, cholesterolu

całkowitego, lipoproteiny niskiej (LDL) i wysokiej gęstości (HDL).

W niniejszej pracy stężenie glukozy i białka w surowicy było istotnie wyższe niż

w pęcherzykach przedowulacyjnych i torbielach pęcherzykowych (P<0.01). Wyższe

stężenie tych składników w osoczu krwi niż w pęcherzykach jajnikowych stwierdzono

także u innych gatunków zwierząt (Arshad i wsp., 2005; Alkalby i wsp., 2012). Wyniki

te potwierdzają, że skład biochemiczny płynu pęcherzykowego jest podobny, ale nie

identyczny ze składem osocza krwi. Ponadto w torbielach stężenie glukozy było istotnie

wyższe niż w pęcherzykach przedowulacyjnych (P<0.01). Wyniki te mogą wskazywać

na różnice w metabolizmie glukozy i różne jej zużycie w torbielach i pęcherzykach

jajnikowych. Glukoza jest głównym źródłem energii dla pęcherzyków jajnikowych,

które są strukturami bardzo dynamicznymi (Nandi i wsp., 2007). Zachodzą w nich

intensywne przemiany morfologiczne i czynnościowe, natomiast w torbielach

pęcherzykowych dochodzi do degeneracji warstwy ziarnistej (Zhou i wsp., 2008). Nie

można też wykluczyć, iż różnice w stężeniu glukozy między torbielami a pęcherzykami

przedowulacyjnymi spowodowane są zmianami hormonalnymi wpływającymi na

przemiany energetyczne (Braw-Tal i wsp., 2009). Innym możliwym wyjaśnieniem

różnic w stężeniu glukozy mogą być różnice w przepuszczalności bariery krew-

pęcherzyk. Podczas folikulogenezy ultrastruktura tej bariery ulega zmianom, a

nieprawidłowe jej funkcjonowanie może być przyczyną zaburzeń jajnikowych (Siu i

Cheng, 2012). U myszy zwiększenie przepływu krwi i wzrost przepuszczalności bariery

krew-pęcherzyk zaangażowane są w patogenezę zespołu politorbielowatości jajników

(Zhou i wsp., 2008). W prezentowanej pracy nie stwierdzono natomiast różnic w

stężeniu białka całkowitego pomiędzy torbielami a pęcherzykami, co koresponduje z

wynikami uzyskanymi przez Khan i wsp. (2011) u bawoła wodnego.

W przedstawionej pracy stężenie cholesterolu całkowitego, HDL, LDL i

trójglicerydów w surowicy loch z torbielami było istotnie wyższe niż u loch bez torbieli

(P<0.01 lub P<0.01). Wyniki te mogą wskazywać na występowanie zależności między

zmianami stężeń lipidów we krwi a patogenezą torbieli pęcherzykowych. Z badań

wykonanych głównie u kobiet wynika bowiem, że niekorzystne zmiany w gospodarce


lipidowej są ważnym czynnikiem sprzyjającym powstawaniu torbieli jajnikowych

(Bostancı i wsp., 2012). W niniejszej pracy różnice w stężeniu lipidów dotyczyły

również badanych struktur jajnikowych. W płynie pęcherzykowym stężenie HDL i

trójglicerydów było istotnie wyższe niż w płynie torbieli pęcherzykowych (P<0.01).

Zanotowane różnice w stężeniu HDL między torbielami a pęcherzykami wynikają

najprawdopodobniej z różnic w nasileniu steroidogenezy. Na taką możliwość wskazują

prace innych autorów (Huang i wsp., 2002; Thangavel i Nayeem 2004). Z wielu badań

wynika, że w płynie pęcherzykowym brak jest lipoproteiny o niskiej gęstości, a główną

lipoproteiną biorącą udział w syntezie hormonów steroidowych jest HDL (Chang i

wsp., 1976; Brantmeier i wsp., 1987; Le Goff 1994; Błaszczyk i wsp., 2006). W

prezentowanej pracy nie stwierdzono obecności LDL nie tylko w pęcherzykach

jajnikowych, ale również w torbielach pęcherzykowych. Wyniki te wskazują, że

zarówno w pęcherzykach jak i strukturach patologicznych w syntezie hormonów

steroidowych uczestniczy głównie lipoproteina wysokiej gęstości.

Wykazane w prezentowanej pracy różnice w składzie biochemicznym płynu

pęcherzyków przedowulacyjnych i torbieli pęcherzykowych wskazują na różnice w

nasileniu przebiegu procesów metabolicznych w strukturach fizjologicznych i

patologicznych jajnika. Ponadto stwierdzone różnice w stężeniu składników

biochemicznych w surowicy loch z wielotorbielowatością pęcherzykową i loch bez

torbieli sugerują związek przemian ogólnoustrojowych z patogenezą torbieli

pęcherzykowych.

Realizacja celu piątego (cel szczegółowy V)

W kolejnej pracy postanowiono zbadać, czy różnice w składzie biochemicznym

między torbielami a pęcherzykami przedowulacyjnymi u świń dotyczą również

składników mineralnych. Wyniki tej pracy opublikowano w artykule pt.: „Macro-

elements compositions of cystic and follicular fluid in ovaries and their relationship to

peripheral blood concentration in sows”. Badania wykonano na lochach, u których w

czasie uboju pobierano krew z żyły szyjnej zewnętrznej. Łącznie przebadano 46 loch, w

tym 20 loch z torbielami pęcherzykowymi i 26 loch, u których nie stwierdzono torbieli,

a na jajnikach występowały pęcherzyki przedowulacyjne. Dla każdej lochy

przyporządkowano jedną próbkę płynu (z torbieli lub pęcherzyka) i odpowiednią


próbkę surowicy. W uzyskanych próbkach oznaczono stężenie jonów sodowych (Na+)

oraz wapnia całkowitego (Ca), magnezu (Mg) i fosforu (P).

W niniejszej pracy stężenie sodu w surowicy loch było istotnie wyższe niż w

płynie pęcherzykowym i płynie z torbieli (P<0.01), ale zbliżone do stężenia, jakie

zanotowali inni autorzy u świń (Prvulović i wsp., 2007; Dobrzański i wsp., 2010).

Podobne różnice między stężeniem tego pierwiastka w surowicy (lub osoczu krwi) a

stężeniem w płynie pęcherzykowym zanotowano również u innych gatunków zwierząt

(Arshad i wsp., 2005; Leroy i wsp., 2004; Alves i wsp., 2014). Jednakże w

prezentowanej pracy stężenie sodu w płynie z torbieli było istotnie wyższe niż w płynie

pęcherzykowym (P<0.05). Być może spowodowane to było zaburzeniami związanymi z

prawidłową produkcją płynu antralnego w tych patologicznych strukturach jajnika. Sód

jest bowiem głównym elektrolitem płynu zewnątrzkomórkowego i poprzez utrzymanie

ciśnienia osmotycznego bierze udział w regulacji gospodarki wodno-elektrolitowej i

odgrywa zasadnicze znaczenie w regulacji przepuszczalności błon komórkowych. Na

poziomie pęcherzyka jajnikowego wpływa na zmiany przepuszczalności tekalnych

naczyń kapilarnych i bierze udział w mechanizmie gromadzenia się płynu antralnego

(Sharma i wsp., 1995; Rodgers i Irving-Rodgers, 2010).

Kolejnym badanym makroelementem był wapń całkowity, którego stężenie w

płynie z torbieli było wyższe niż w płynie pęcherzykowym, ale różnice te nie były

statystycznie istotne. Uwagę zwracają natomiast wykazane różnice w stężeniu wapnia w

surowicy. U loch z torbielami było ono znacznie niższe i różniło się statystycznie od

stężenia zanotowanego u loch bez torbieli pęcherzykowych (P<0.01). W surowicy loch

bez torbieli stężenie tego makroelementu było zbliżone do stężenia, jakie zanotowali

inni autorzy u świń (Prvulović i wsp., 2007; Winnicka, 2008; Dobrzański i wsp., 2010).

Niższe stężenie wapnia w surowicy loch z wielotorbielowatością jajników sugeruje, że

niedobór tego makroelementu w obwodowym krążeniu może być czynnikiem

sprzyjającym powstawaniu torbieli pęcherzykowych. W medycynie ludzkiej w leczeniu

zespołu wielotorbielowatych jajników podkreśla się skuteczność suplementacji wapnia i

witaminy D (Firouzabadi i wsp., 2012). Ponadto wapń odgrywa ważną rolę w

reprodukcji zwierząt, a jego niedobór wpływa negatywnie na ich płodność (Subha,

2013). Z drugiej strony wykazano pozytywną korelację między stężeniem wapnia w

płynie pęcherzykowym a liczbą zdegenerowanych oocytów u krów mlecznych (Alves i

wsp., 2014).


W niniejszej pracy stężenie magnezu w surowicy loch bez torbieli było zbliżone

do stężenia, jakie zanotowali inni autorzy u świń (Klem i wsp., 2009, Dobrzański i

wsp., 2010). Jednak w surowicy loch z torbielami było ono istotnie niższe niż u loch

bez torbieli (P<0.01); poniżej wartości obserwowanych u świń. Wyniki te sugerują, że

podobnie jak w przypadku wapnia również niskie stężenie magnezu w obwodowym

krążeniu może być czynnikiem sprzyjającym powstawaniu torbieli pęcherzykowych. W

prezentowanej pracy wykazano też różnice między stężeniem magnezu w surowicy a

jego stężeniem w badanych strukturach jajnika. W surowicy stężenie magnezu było

niższe niż w torbielach i pęcherzykach przedowulacyjnych (P<0.01 i P<0.05,

odpowiednio). Niższe stężenie tego makroelementu w surowicy niż w pęcherzykach

jajnikowych zanotowano również u krów (Yamada i wsp., 1998). Nie stwierdzono

istotnych różnic w stężeniu magnezu między pęcherzykami a torbielami, a wartości

stężeń były zbliżone do zanotowanych w dużych pęcherzykach u owiec (Nandi i wsp.,

2007).

Różnice między pęcherzykami a torbielami zanotowano natomiast w stężeniu

fosforu. W płynie pozyskanym z torbieli było ono istotnie niższe niż w płynie

pęcherzykowym (P<0.05). Z kolei stężenie fosforu w surowicy badanych loch było

zbliżone i porównywalne do stężenia notowanego w innych pracach u świń (Dubreuil i

Lapierre, 1997; Dobrzański i wsp., 2010, Cooper i wsp., 2014).

Zanotowane różnice w stężeniu makroelementów w pęcherzykach

przedowulacyjnych i torbielach pęcherzykowych sugerują zmienne nasilenie procesów

metabolicznych w strukturach patologicznych i fizjologicznych jajnika. Ponadto

uzyskane wyniki wskazują, że makroelementy obecne zarówno w surowicy jak i płynie

pęcherzykowym mogą wpływać na prawidłowe dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych,

a zmiany w ich stężeniach mogą być czynnikiem sprzyjającym powstawaniu torbieli

pęcherzykowych.

Realizacja celu szóstego (cel szczegółowy VI)

Uwzględniając znaczenie układu immunologicznego w prawidłowym

funkcjonowaniu jajnika w kolejnej pracy przeanalizowano stężenia immunoglobulin w

płynie torbieli jajnikowych, pęcherzyków przedowulacyjnych i surowicy loch.

Uwzględniono też obecność lub brak ciałek żółtych na jajnikach. Określono również

zależności pomiędzy stężeniem immunoglobulin a stężeniem progesteronu.


Łącznie przebadano 77 loch, w tym 20 loch z torbielami i bez ciałek żółtych

(CL-), 18 loch z torbielami i ciałkami żółtymi (CL

+), 20 loch, u których nie stwierdzono

torbieli, a na jajnikach występowały pęcherzyki przedowulacyjne i 19 loch, u których

na jajnikach oprócz pęcherzyków przedowulacyjnych występowały ciałka krwawe/żółte

(CL+). Dla każdej lochy przyporządkowano jedną próbkę płynu (z torbieli lub

pęcherzyka) i odpowiednią próbkę surowicy. W uzyskanych próbkach oznaczono

stężenie progesteronu (P4), immunoglobulin klasy M (IgM) i G (IgG).

W surowicy loch, u których na jajnikach występowały ciałka żółte stężenie P4

było istotnie wyższe niż u loch bez ciałek żółtych (P<0.01). Ponadto stężenie P4 u loch z

ciałkami żółtymi i torbielami było istotnie wyższe niż u loch z ciałkami żółtymi, ale bez

torbieli (P<0.01). Nie uwzględniając natomiast obecności ciałek żółtych oszacowane

różnice między stężeniem tego hormonu w surowicy loch z torbielami i bez torbieli nie

były statystycznie istotne. Statystycznie istotne różnice zanotowano natomiast między

stężeniem P4 w płynie pęcherzykowym i pozyskanym z torbieli. W torbielach było ono

wyższe niż w pęcherzykach przedowulacyjnych (P<0.01). Podobnie kształtowały się

różnice po uwzględnieniu obecności ciałek żółtych. Ponadto u loch, u których

występowały ciałka żółte stężenie P4 w badanych strukturach jajnikowych było wyższe

niż u loch bez ciałek żółtych (P<0.01).

Zanotowane w niniejszej pracy wyższe stężenie P4 w płynie z torbieli niż w płynie

pęcherzykowym koresponduje z wynikami innych autorów (Babalola i Shapiro, 1990;

Kozłowska i wsp., 2013). Jednak stężenie progesteronu w badanych strukturach

jajnikowych i surowicy zależało od obecności na jajnikach ciałek żółtych. Potwierdza to

potrzebę uwzględniania obecności bądź braku ciałek żółtych w kryteriach podziału

torbieli jajnikowych u loch (Ebbert i Bostedt, 1993). Jest to ważne, zwłaszcza, że

aktywność steroidogenna ciałek żółtych warunkuje wyższe stężenie obwodowego

progesteronu (Niswender i wsp., 1994). Może to wpływać na układ immunologiczny,

ponieważ status odpornościowy organizmu ulega zmianom pod wpływem hormonów

steroidowych jajnika (Harichandan i wsp., 2014). Uważa się, że zmiany stężeń tych

hormonów zmieniają aktywność układu immunologicznego całego układu rozrodczego

(de Buysscher, 1999).

Miernikiem tej aktywności są zmiany ilościowe komórek układu immunologicznego, a

także zmiany stężeń immunoglobulin. W przedstawionej pracy stężenie IgM i IgG w

surowicy loch z torbielami było istotnie wyższe niż u loch bez torbieli (P<0.05).

Również w płynie z torbieli stężenie tych dwóch immunoglobulin było wyższe niż w


płynie pęcherzyków przedowulacyjnych (P<0.01). Nie można więc wykluczyć, że

zanotowane różnice mogły wynikać między innymi z różnic w stężeniu obwodowego

progesteronu. W prezentowanej pracy wykazano bowiem dodatnią korelację między

stężeniem P4 w surowicy a stężeniem IgM w pęcherzykach i torbielach (P<0.05).

Wykazane w pracy różnice w ilościowym składzie immunoglobulin klasy IgM i

IgG i progesteronu, a także stwierdzone zależności między tymi parametrami wskazują

na związek układu immunologicznego z patogenezą torbieli jajnikowych u loch.

Dlatego w badaniach nad zaburzeniami folikulogenezy sugeruje się konieczność

uwzględniania układu immunologicznego.

Podsumowanie

Wyniki przedstawione w cyklu sześciu publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe

pt.: „Wybrane transformujące czynniki wzrostu-β, hormony i parametry

biochemiczne u świń z torbielami i bez torbieli jajnikowych” stały się podstawą do

wyciągnięcia następujących wniosków:

I. Badane transformujące czynniki wzrostu-β (TGF-β) wchodzą w skład

mikrośrodowiska płynu pęcherzykowego i płynu torbieli pęcherzykowych u loszek i

loch. Stężenie tych czynników w torbielach jest znacznie wyższe niż w pęcherzykach

przedowulacyjnych, co wskazuje na ich udział w procesach związanych z

zaburzonych przebiegiem folikulogenezy u świń. Wykazano jednocześnie dodatnią

zależność między jajnikowym stężeniem BMP-15 i GDF-19 a stężeniem tych

czynników we krwi, co może mieć znaczenie w diagnozowaniu torbieli

pęcherzykowych u świń.

II. Wykazane różnice i zależności między stężeniem wolnej tyroksyny, progesteronu,

BMP-15 i GDF-9 w pęcherzykach jajnikowych, torbielach pęcherzykowych i

surowicy wskazują na interakcyjny ich udział w procesach dojrzewania pęcherzyków

jajnikowych u świń. Uzyskane wyniki mogą być wykorzystane w dalszych pracach

nad wielotorbielowatością jajników u świń.

III. Ilościowe różnice w składzie biochemicznym i jonowym płynu pęcherzykowego i

płynu z torbieli wskazują na znaczne różnice w przebiegu procesów metabolicznych

w strukturach fizjologicznych i patologicznych jajnika. Uzyskane wyniki wskazują


ponadto na występowanie związków między przemianami ogólnoustrojowymi z

patogenezą torbieli pęcherzykowych.

IV. Wykazane różnice w stężeniach immunoglobulin klasy IgM i IgG w pęcherzykach

jajnikowych, torbielach pęcherzykowych i surowicy wskazują na związek układu

immunologicznego z patogenezą torbieli jajnikowych u loch. Dlatego w badaniach

nad zaburzeniami folikulogenezy sugeruje się konieczność uwzględniania układu

immunologicznego.

Piśmiennictwo:

1. Alkalby J.M.A., Bushra F.H., Fahad T.A.: Study on some hormonal and biochemical

constituents of follicular fluid and blood plasma in buffaloes. Basrah Journal of

Veterinary Research, 11, 90–102, 2012.

2. Alves B.G., Alves K.A., Lúcio A.C., Martins M.C., Silva T.H., Alves B.G., Braga L.S.,

Silva T.V., Viu M.A., Beletti M.E., Jacomini J.O., Santos R.M., Gambarini M.L.:

Ovarian activity and oocyte quality associated with the biochemical profile of serum and

follicular fluid from Girolando dairy cows postpartum. Animal Reproduction Science,

146, 117–125, 2014.

3. Arshad H.M., Ahmad N., Rahman Z.U., Samad H.A., Akhtar N., Ali S.: Studies on some

biochemical constituents of ovarian follicular fluid and peripheral blood in buffaloes.

Pakistan Veterinary Journal, 25, 189–193, 2005.

4. Babalola G.O., Shapiro B.H.: Sex steroid changes in porcine cystic ovarian disease.

Steroids, 55, 319-324, 1990.

5. Beagley K.W., Gockel C.M.: Regulation of innate and adaptive immunity by the female

sex hormones oestradiol and progesterone. FEMS Immunology & Medical Microbiology,

38, 13-22, 2003.

6. Błaszczyk B., Stankiewicz T., Udała J., Gączarzewicz D., Lasota B., Błaszczyk P.,

Szymańska A., Szymańska-Pasternak J.: Free thyroid hormones and cholesterol in

follicular fluid of bovine ovaries. Bulletin of Veterinary Institute in Pulawy, 50, 189–193,

2006.

7. Bordoloi P.K., Sarmah B.C., Dutta D.J., Deka B.C.: Macro and micro minerals in caprine

follicular fluid. Indian Journal of Animal Reproduction, 22, 23–25, 2001.

8. Bostancı M.S., Bayram M., Sevinç F.C., Pasaoglu H., Elbeg S.: The relationship between

biochemical parameters, interleukin-6 and ovarian morphology in polycystic ovary

syndrome. Journal of Clinical and Experimental Investigation, 3, 307–312, 2012.

9. Braw-Tal R., Pen S., Roth Z.: Ovarian cysts in high-yielding dairy cows. Theriogenology,

72, 690–698, 2009.

10. Bristol-Gould S., Woodruff TK.: Folliculogenesis in the domestic cat (Felis catus).

Theriogenology, 66, 5-13, 2006.

11. Bukovsky A., Caudle M.R.: Immune physiology of the mammalian ovary - a review.

American Journal of Reproductive Immunology, 59, 12-26, 2008.


12. Bukovsky A.: Immune system involvement in the regulation of ovarian function and

augmentation of cancer. Microscopy Research and Technique, 69, 482-500, 2006.

13. Cech S., Doležel R.: Treatment of ovarian cysts in sows – a field trial. Veterinarni

Medicina, 52, 413-418, 2007.

14. Cooper C.A., Moraes L.E., Murray J.D., Owens S.D.: Hematologic and biochemical

reference intervals for specific pathogen free 6-week-old Hampshire-Yorkshire crossbred

pigs. Journal of Animal Science and Biotechnology, 5, 1–5, 2014.

15. Crawford J.L., McNatty K.P.: The ratio of growth differentiation factor 9: bone

morphogenetic protein 15 mRNA expression is tightly coregulated and differs between

species over a wide range of ovulation rates. Molecular and Cellular Endocrinology, 348,

339–343, 2012.

16. Dalin A.M., Gidlund K., Eliasson-Selling L.: Post-mortem examination of genital organs

from sows with reproductive disturbances in a sow-pool. Acta Veterinaria Scandinavica,

38, 253–262, 1997.

17. De Buysscher E.V.: Immune regulation of the female reproductive tract. In: Old Herborn

University Seminar Monograph 12: Vaginal flora in health and disease. Editors: Heidt

P.J., Carter P.B., Rusch V., van der Waaij D. Herborn Litterae, Herborn-Dill, Germany,

15-25, 1999.

18. Dobrzański Z., Pogoda-Sewerniak K., Dragan S., Korniewicz D., Hoffmann K.,

Korniewicz A.: Effect of various feed phosphates on biochemical indices of blood and

mineral composition of bones in finishing Pigs. Acta Veterinaria Brno, 79, 355–361,

2010.

19. Dubreuil P., Lapierre H.: Biochemistry reference values for Quebec lactating dairy cows,

nursing sows, growing pigs and calves. Canadian Journal of Veterinary Research, 61,

235–239, 1997.

20. Ebbert W., Bostedt H.: Cystic Degeneration in porcine ovaries – first communication:

morphology of cystic ovaries, interpretation of the results. Reproducion in Domestic

Animals, 28, 441-450, 1993.

21. Ebbert W., Elsaesser F., Bostedt H.: Cystic degeneration in porcine ovaries – second

communication: concentrations of progesterone, estradiol-17b, and testosterone in cystic

fluid and plasma; interpretation of the results. Reproduction in Domestic Animals 28,

451–463, 1993.

22. Firouzabadi R.D., Aflatoonian A., Modarresi S., Sekhavat L., MohammadTaheri S.:

Therapeutic effects of calcium & vitamin D supplementation in women with PCOS.

Complementary Therapy in Clinical Practice, 18, 85–88, 2012.

23. Fitko R., Kucharski J., Szlezyngier B.: The importance of thyroid hormone in

experimental ovarian cyst formation in gilts. Animal Reproduction Science, 39, 159-168,

1995.

24. Fitko R., Kucharski J., Szlezyngier B., Jana B.: The concentration of GnRH in

hypothalamus, LH and FSH in pituitary, LH, PRL and sex steroids in peripheral and

ovarian venous plasma of hypo- and hyperthyroid, cysts-bearing gilts. Animal

Reproduction Science 45, 123–138, 1996.


25. Fitzpatrick S.L., Sindoni D.M., Shughrue P.J., Lane M.V., Merchenthaler I.J., Frail D.E.:

Expression of growth differentiation factor-9 messenger ribonucleic acid in ovarian and

nonovarian rodent and human tissues. Endocrinology, 139, 2571–2578, 1998.

26. Gregoraszczuk E.L., Skalka M.: Thyroid hormone as a regulator of basal and human

chorionic gonadotrophin-stimulated steroidogenesis by cultured porcine theca and

granulosa cells isolated at different stages of the follicular phase. Reproduction, Fertility

and Development, 8, 961-971, 1996.

27. Gregoraszczuk E.L., Słomczynska M., Wilk R.: Thyroid hormone inhibits aromatase

activity in porcine thecal cells cultured alone and in coculture with granulosa cells.

Thyroid, 8, 1157-1163, 1998.

28. Harichandan P.P., Mohanty D.N., Das S., Patra B.K.: Hormonal and immunological

studies in different trimester of pregnancy in cows. Indian Journal of Animal

Reproduction, 35, 42-44, 2014.

29. Heinonen M., Leppävuori A., Pyörälä S.: Evaluation of reproductive failure of female

pigs based on slaughterhouse material and herd record survey. Animal Reproduction

Science, 52, 235–244, 1998.

30. Huang W.T., Lu S.G., Tang P.C., Wu S.C., Cheng S.P., Ju J.C.: Biochemical

compositions of follicular fluid and the effects of culture conditions on the in vitro

development of pig oocytes. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 15, 1403–

1411, 2002.

31. Hussein A.M., Bourne F.J.: Immunoglobulin concentrations in pig follicular fluid.

International Journal of Fertility, 29, 54-57, 1984.

32. Karveliene B., Zilinskas H., Riskevicience V.: Post-mortem examination of sows genital

organs culled for reproductive disturbances and immunohistochemical studies on ERα

and PR A receptors in the anoestral sows uterus. Reproduction in Domestic Animals, 42,

275–281, 2007.

33. Khan F.A., Das G.K., Pande M., Pathak M.K., Sarkar M.: Biochemical and hormonal

composition of follicular cysts in water buffalo (Bubalus bubalis). Animal Reproduction

Science, 124, 61-64, 2011.

34. Klem T.B., Bleken E., Morberg H., Thoresen S.I., Framstad T.: Hematologic and

biochemical reference intervals for Norwegian crossbreed grower pigs. Veterinary

Clinical Pathology, 39, 221- 226, 2010.

35. Knight P.G., Glister C.: TGF-β superfamily members and ovarian follicle development.

Reproduction, 132, 191-206, 2006.

36. Kor M.N., Khanghah M.K., Veisi A.: Follicular fluid concentrations of biochemical

metabolites and trace minerals in relation to ovarian follicle size in dairy cows. Annual

Review & Research in Biology, 3, 397–404, 2013.

37. Kor M.N., Moradi K.: A review of biochemical metabolites concentration and hormonal

composition of ovarian follicular fluid in domestic animals. Annual Review & Research

in Biology, 3, 246–255, 2013.


38. Kozłowska A., Wojtkiewicz J., Majewski M., Jana B.: The noradrenergic innervation and

steroidogenic activity of porcine cystic ovaries. Physiological Research, 62, 421-433,

2013.

39. Leroy J.L., Vanholder T., Delanghe J.R., Opsomer G., Van Soom A., Bols P.E., de Kruif

A.: Metabolite and ionic composition of follicular fluid from different-sized follicles and

their relationship to serum in dairy cows. Animal Reproduction Science, 80, 201–211,

2004.

40. Maruo T., Hayashi M., Matsuo H., Yamamoto T., Okada H., Mochizuki M.: The role of

thyroid hormone as a biological amplifier of the actions of follicle-stimulating hormone

in the functional differentiation of cultured porcine granulosa cells. Endocrinology, 121,

1233-1241, 1987.

41. Maruo T., Hiramatsu S., Otani T., Hayashi M., Mochizuki M.: Increase in the expression

of thyroid hormone receptors in porcine granulosa cells early in follicular maturation.

Acta Endocrinologica (Copenhagen), 127, 152-160, 1992.

42. Mishra O.P., Pandey J.N., Gawande P.G.: Study on biochemical constituents of caprine

ovarian follicular fluid after superovulation. Asian-Australasian Journal of Animal

Science, 16, 1711–1715, 2003.

43. Nandi S., Kumar V.G., Manjunatha B.M., Gupta P.S.: Biochemical composition of ovine

follicular fluid in relation to follicle size. Development, Growth & Differentiation, 49,

61–66, 2007.

44. Niswender G.D., Juengel J.L., Mcguire W.J., Belfiore C.J., Wiltbank M.C.: Luteal

function: The estrous cycle and early pregnancy. Biology of Reproduction, 50, 239-247,

1994.

45. Orisaka M., Jiang J.Y., Orisaka S., Kotsuji F., Tsang B.K.: Growth differentiation factor

9 promotes rat preantral follicle growth by upregulating follicular androgen biosynthesis.

Endocrinology, 150, 2740–2748, 2009.

46. Pache T.D., Chadha S., Gooren L.J., Hop W.C., Jaarsma K.W., Dommerholt H.B., Fauser

B.C.: Ovarian morphology in long-term androgen-treated female to male transsexuals. A

human model for the study of polycystic ovarian syndrome? Histopathology, 19, 445-

452, 1991.

47. Paradis F., Novak S., Murdoch G.K., Dyck M.K., Dixon W.T., Foxcroft GR.: Temporal

regulation of BMP2, BMP6, BMP15, GDF9,BMPR1A, MPR1B, BMPR2 and TGFBR1

mRNA expression in the oocyte, granulosa and theca cells of developing preovulatory

follicles in the pig. Reproduction (Cambridge, England), 138, 115–129, 2009.

48. Paulini F., Melo E.: The role of oocyte-secreted factors GDF9 and BMP15 in follicular

development and oogenesis. Reproduction in Domestic Animals, 46, 354–361, 2011.

49. Payan-Carreira R., Pires M.A.: Multioocyte follicles in domestic dogs: a survey of

frequency of occurrence. Theriogenology, 69, 977-982, 2008.

50. Peng X., Yang M., Wang L., Tong C., Guo Z.: In vitro culture of sheep lamb ovarian

cortical tissue in a sequential culture medium. Journal of Assisted Reproduction and

Genetics, 27, 247–257, 2010.


51. Prochazka R., Nemcova L., Nagyova E., Kanka J.: Expression of growth differentiation

factor 9 messenger RNA in porcine growing and preovulatory ovarian follicles. Biology

of Reproduction, 71, 1290–1295, 2004.

52. Prvulović D., Jovanović-Galović A., Stanić B., Popović M., Grubor-Lajšić G.: Effects of

a clinoptilolite supplement in pig diets on performance and serum parameters. Czech

Journal of Animal Science, 52, 159–164, 2007.

53. Reibiger I., Spanel-Borowski K.: Difference in localization of eosinophils and mast cells

in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility, 118, 243-249, 2000.

54. Rodgers R.J., Irving-Rodgers H.F.: Formation of the Ovarian Follicular Antrum and

Follicular Fluid. Biology of Reproduction, 82, 1021-1029, 2010.

55. Safran A., Reubinoff B.E., Porat-Katz A., Werner M., Friedler S., Lewin A.:

Intracytoplasmic sperm injection allows fertilization and development of a

chromosomally balanced embryo from a binoovular zona pellucida. Human

Reproduction, 13, 2575-2578, 1998.

56. Schmidt A., Richter L., Weitze K.F.: Sonographische kontrolle von ovarzysten bei

zuchtsauen. Reproduction in Domestic Animals, 31, (Suppl. 3), 80, 1995.

57. Sharma R.K., Vats R., Sawhney A.: Changes in electrolytes of antral follicles in goat.

Indian Journal of Animal Reproduction, 16, 18–21, 1995.

58. Siu M.K., Cheng CY.: The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian

function. Advances in Experimental Medicine and Biology, 763, 186–192, 2012.

59. Solovyeva E.V., Hayashi M., Margi K., Barkats C., Klein C., Amsterdam A., Hsueh A.J.,

Tsafriri A.: Growth differentiation factor-9 stimulates rat theca-interstitial cell androgen

biosynthesis. Biology of Reproduction, 63, 1214–1218, 2000.

60. Stankiewicz T., Błaszczyk B., Udała J., Gączarzewicz D.: Zwyrodnienie cystowate

jajników u świń. Weterynaria w Terenie, 2, 33-36, 2008.

61. Stankiewicz T., Błaszczyk B., Udała J.: A study on the occurrence of polyovular follicles

in porcine ovaries with particular reference to intrafollicular hormone concentrations,

quality of oocytes and their in vitro fertilization. Anatomia, Histologia, Embryologia, 38,

233–239, 2009.

62. Stankiewicz T., Błaszczyk B., Udała J.: Wybrane aspekty dojrzewania oocytów świni w

warunkach fizjologicznych i pozaustrojowych. Medycyna Weterynaryjna, 64, 400–403,

2008.

63. Stankiewicz T., Błaszczyk B.. Lasota B., Gączarzewicz D., Udała J.: Saisonabhängige

Veränderungen der Ovargröße sowie Konzentration von Steroidhormonen und Thyroxin

in der Follikelflüssigkeit beim Schwein. Tierärztliche Praxis Groβtiere, 36, 99-103, 2008.

64. Stankiewicz T., Błaszczyk B.: Concentrations of bone morphogenetic protein-15 (BMP-

15) and growth differentiation factor-9 (GDF-9) in follicular cysts, mono- and polyoocyte

follicles in gilts. Acta Veterinaria-Beograd, 64 (1), 24-32, 2014.

65. Stankiewicz T., Błaszczyk B.: Relationship between the concentration of bone

morphogenetic protein-15 (BMP-15) and growth differentiation factor-9 (GDF-9) in pre-

ovulatory follicles, ovarian cysts, and serum in sows. Animal Production Science, 56,

141-146, 2016.


66. Su Y.Q., Sugiura K., Wigglesworth K., O’Brien M.J., Affourtit J.P., Pangas S.A., Matzuk

M.M., Eppig J.J.: Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus

cells and oocytes: BMP-15 and GDF-9 control cholesterol biosynthesis in cumulus cells.

Development, 135, 111–121, 2008.

67. Su Y.Q., Wu X., O’Brien M.J., Pendola F.L., Denegre J.N., Matzuk M.M., Eppig J.J.:

Synergistic roles of BMP15 and GDF9 in the development and function of the oocyte–

cumulus cell complex in mice: genetic evidence for an oocyte–granulosa cell regulatory

loop. Developmental Biology, 276, 64–73, 2004.

68. Subha G.: Role of Biochemical factors and Mineral Supplementation in Livestock ration

for Maintenance of their Fertility and Healthy Reproductive Status: A Review. Research

Journal of Chemical Science, 3, 102–106, 2013.

69. Sun R.Z., Lei L., Cheng L., Jin Z.F., Zu S.J., Shan Z.Y., Wang Z.D., Zhang J.X., Liu

Z.H.: Expression of GDF-9, BMP-15 and their receptors in mammalian ovary follicles.

Journal of Molecular Histology, 41, 325–332, 2010.

70. Sun Y.L., Ping Z.G., Li C.J., Sun Y.F., Yi K.L., Chen L., Li X.Y., Wang X.L., Zhou X.:

Comparative proteomic analysis of follicular fluids from normal and cystic follicles in

sows. Reproduction in Domestic Animals, 46, 889–895, 2011.

71. Sun Y.L., Zhang J., Ping Z.G., Wang C.Q., Sun Y.F., Chen L., Li X.Y., Li C.J., Zhu X.L.,

Liu Z., Zhang W., Zhou X.: Relationship between apoptosis and proliferation in

granulosa and theca cells of cystic follicles in sows. Reproduction in Domestic Animals,

47, 601–608, 2012.

72. Szulańczyk-Mencel K., Rząsa A., Bielas W.: Relationships between ovarian cysts and

morphological and hormonal state of ovarian cortex in sows. Animal Reproducion

Science, 121, 273–278, 2010.

73. Thangavel A., Nayeem M.: Studies on certain biochemical profile of the buffalo follicular

fluid. Indian of Veterinary Journal, 81, 25–27, 2004.

74. Tummaruk P., Kesdangsakonwut S., Kunavongkrit A.: Relationships among specific

reasons for culling, reproductive data, and gross morphology of the genital tracts in gilts

culled due to reproductive failure in Thailand. Theriogenology, 71, 369–375, 2009.

75. Tummaruk P., Kesdangsakonwut S.: Factors affecting the incidence of cystic ovaries in

replacement gilts. Comparative Clinical Pathology, 21, 1-7, 2012.

76. Winnicka A: Wartości referencyjne podstawowych badań laboratoryjnych w weterynarii.

Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2008.

77. Wira C., Kaushic C.: Mucosal immunity in the female reproductive tract: Effect of sex

hormones on immune recognition and responses. In: Mucosal Vaccines: New Trends in

Immunization (Kiyono H., Ogra P.L., McGhee J.R., Eds.), 375-388. Academic Press,

New York, 1996.

78. Wira C.R., Kaushic C., Richardson J.: Role of sex hormones and cytokines in regulating

the mucosal immune system in the female reproductive tract. In: Mucosal Immunology

(Ogra, P.L. et al., Eds.), 1449-1461. Academic Press, San Diego, CA, 1999.


79. Yamada M., Hirakushi K., Inoue K., Horiuchi T., Sakai J., Okada T., Sugie I.:

Magnesium as a regulator of thrombin formation in bovine ovarian follicular fluid.

Journal of Veterinary Medicine Science, 60, 837–842, 1998.

80. Zhou H., Ohno N., Terada N., Saitoh S., Naito I., Ohno S.: Permselectivity of blood

follicle barriers in mouse ovaries of the mifepristone-induced polycystic ovary model

revealed by in vivo cryotechnique. Reproduction, 136, 599–610, 2008.

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych /artystycznych

5.1. Informacje ogólne o dorobku naukowo-publikacyjnym (bez publikacji

stanowiących osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 ustawy)

Efektem mojej dotychczasowej pracy badawczej jest współautorstwo 28 oryginalnych

publikacji naukowych, z których 23 opublikowano po uzyskaniu stopnia naukowego

doktora. Spośród 28 prac, 22 pozycje stanowią publikacje w czasopismach

znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (JCR). Pozostałe 6 oryginalnych prac

zostało opublikowane w recenzowanych czasopismach krajowych. Jestem także

współautorem 1 artykułu przeglądowego i 5 artykułów popularno-naukowych.

Sumaryczny impact factor (IF) publikacji, liczony zgodnie z rokiem

opublikowania, wynosi 15,368

Łączna liczba punktów za publikacje wg wykazu czasopism naukowych MNiSW,

liczona zgodnie z rokiem ich opublikowania, wynosi 469, z czego 439 punktów

przypada na okres po uzyskaniu stopnia doktora.

Liczba cytowań publikacji wg bazy Web of Science wynosi 71

Index Hirscha opublikowanych publikacji wg bazy Web of Science wynosi 5

Szczegółowy wykaz prac naukowych oraz informacje o współpracy naukowej i

popularyzacji nauki zawarto w Załączniku nr 4.


5.2. Główne kierunki badawcze i ich omówienie

W mojej działalności naukowo-badawczej i publikacyjnej, związanej głównie z oceną

przebiegu czynności rozrodczych samic i samców, wyróżnić można następujące

kierunki badań:

I. Folikulogeneza i jej zaburzenia, pozaustrojowe dojrzewanie i zapłodnienie

oocytów

II. Regulacja i monitorowanie procesów rozrodczych u samic i samców

III. Sezonowość w rozrodzie zwierząt

IV. Ocena wartości biologicznej nasienia samca

V. Selen w organizmach zwierząt

5.2.1. Omówienie pozostałych osiągnieć naukowych

Ad. I. Folikulogeneza i jej zaburzenia, pozaustrojowe dojrzewanie i zapłodnienie

oocytów

Prace dotyczące tego zagadnienia wykazano w Załączniku 4. Jest to 7

oryginalnych prac twórczych (A2, A3, A9, A10, A21, B11), 2 prace przeglądowe (B6,

C1), 1 praca popularnonaukowa (B7), 1 praca pełnotekstowa opublikowana w

materiałach konferencji międzynarodowej (C2) i 11 doniesień konferencyjnych.

Realizując ten kierunek badawczy byłem głównym autorem cyklu doświadczeń

nad określeniem potencjału rozrodczego pęcherzyków jajnikowych świni, oceną ich

statusu hormonalnego i antyoksydacyjnego, a także zbadaniem jakości oocytów i

możliwości ich zapłodnienia. Rezultatem przeprowadzonych badań z tego zakresu

było stwierdzenie występowania zjawiska pęcherzykowej polioocytowości w

jajnikach świni. Wykonano szereg preparatów histologicznych jajników i

udokumentowano, że w jajnikach loszek i loch oprócz licznych pęcherzyków

monocytowych znajdują się także pęcherzyki polioocytowe na różnych etapach

folikulogenezy. Niemniej jednak wykazano, że status hormonalny pęcherzyków

polioocytowych różni się od pęcherzyków monocytowych. W płynie pęcherzyków

polioocytowych stężenie 17β-estradiolu było istotnie wyższe, a progesteronu niższe niż

w pęcherzykach monocytowych. Ponadto stwierdzono różnice w jakości i wielkości


oocytów. Przeprowadzając zapłodnienie in vitro wykazano też niższą zdolność

zapładniającą oocytów pozyskanych z pęcherzyków polioocytowych niż

monoocytowych. Niemniej jednak stwierdzono, że niektóre oocyty z pęcherzyków

polioocytowych mają również zdolność do zapłodnienia in vitro i mogą osiągać stadium

blastocysty.

Współuczestniczyłem też w badaniach nad jakością świńskich oocytów

uwzględniając wiek i dojrzałość samic. W doświadczeniu tym wykazano istotne

różnice w parametrach morfometrycznych oocytów pozyskanych z jajników loszek

i loch.

O moim zainteresowaniu folikulogenezą i jej zaburzeniami u świń świadczy

praca popularnonaukowa na temat zwyrodnienia cystowatego jajników świń. Jestem też

głównym autorem pracy przeglądowej opublikowanej w recenzowanym czasopiśmie, w

której przedstawiono specyfikę dojrzewania oocytów świńskich w warunkach

fizjologicznych oraz problemy dotyczące dojrzewania tych gamet w warunkach

pozaustrojowych.

W ramach omawianego obszaru badawczego prowadziłem także badania na

pęcherzykach jajnikowych krowy. Już na początku swojej działalności naukowej

współuczestniczyłem w pracach określających status steroidogenny i biochemiczny

pęcherzyków jajnikowych w zależności od wielkości antralnych pęcherzyków

jajnikowych. Wyniki tych doświadczeń są uzupełnieniem badań nad aktywnością

sekrecyjną komórek pęcherzykowych, a zależne od wielkości pęcherzyka

jajnikowego różnice w stężeniu hormonów steroidowych i glukozy wskazują na

potrzebę ich uwzględniania w procedurze dojrzewania oocytów in vitro. W

kolejnych pracach wykazano obecność wolnych frakcji jodotryronin w płynie

bydlęcych pęcherzyków jajnikowych. Wyniki tego doświadczenia wskazują na

udział jodotyronin w procesie folikulogenezy i sugerują istnienie związku między

tymi hormonami a metabolizmem cholesterolu na poziomie pęcherzyka

jajnikowego krowy.

Jednym z czynników, który zaburza prawidłową czynność jajnika są estrogeny

środowiskowe. Blokują one receptory estrogenowe, działają hamująco na sekrecję

estrogenów, zaburzają aktywność enzymów uczestniczących w steroidogenezie – co

negatywnie odbija się na funkcjonowaniu całego układu rozrodczego samicy. Znany

jest też negatywny wpływ estrogenów środowiskowych na czynność tarczycy. Stąd

podejmowane są badania nad minimalizowaniem negatywnych skutków tych


związków. Dlatego też uczestniczyłem w badaniach, których celem było sprawdzenie

czy suplementacja chitozanem, może zmniejszać wchłanianie i kumulację

środowiskowych zanieczyszczeń rozpuszczalnych w tłuszczach, takich jak

polichlorowane bifenyle (PCB), a tym samym minimalizować negatywne skutki ich

oddziaływania. Badania te wykonane były na samicach myszy. Udokumentowano, że

zastosowane w doświadczeniu wskaźnikowe i dioksynopodobne polichlorowane

bifenyle spowodowały istotny spadek stężenia 17β-estradiolu w osoczu krwi myszy.

Niestety, suplementacja chitozanem nie zapobiegła temu obniżeniu. Przeciwnie,

stężenie 17β-estradiolu w osoczu krwi myszy, które otrzymały chitozan, było mniejsze

w porównaniu z tymi, którym chitozanu nie podawano. Przypuszczalnie był to efekt

hipocholesterolemicznego działania chitozanu prowadzącego do obniżenia stężenia

cholesterolu będącego niezbędnym substratem do syntezy estradiolu. Jednakże

suplementacja chitozanem wpłynęła na obniżenie kumulacji polichlorowanych bifenyli

w wątrobie, woreczku żółciowym, tkance tłuszczowej, jelicie oraz wpłynęła na wzrost

wydalania tych związków z kałem. Suplementacja chitozanem zapobiegła też obniżeniu

stężenia wolnej trójjodotyroniny (FT3), co obserwowane było pod wpływem ekspozycji

na PCB. W podsumowaniu należy podkreślić, że suplementacja chitozanem, w

warunkach określonego narażenia na PCB, może przyczynić się do ograniczenia

ich kumulacji w poszczególnych narządach zwierząt doświadczalnych, głównie

poprzez wzrost wydalania tych związków z kałem. Efektem zainteresowania tymi

zagadnieniami jest również praca o charakterze przeglądowym, której jest głównym

autorem. W pracy tej przedstawiono aktualny stan wiedzy o wpływie estrogenów

środowiskowych na przebieg procesów rozrodczych samic i samców.

Wyniki prowadzonych doświadczeń w zakresie omawianego obszaru

badawczego zostały zasygnalizowane również na licznych konferencjach krajowych i

międzynarodowych.

Ad. II. Regulacja i monitorowanie procesów rozrodczych u samic i samców

Prace dotyczące tego zagadnienia wykazano w załączniku 4. Jest to 6

oryginalnych prac twórczych (A4, A5, A15, A16, B10), 3 prace popularnonaukowe

(B4, B5, B8), 2 doniesienia konferencyjne.

Realizując tę tematykę uczestniczyłem głównie w pracach dotyczących

przebiegu i kontroli procesów rozrodczych kóz. Już w trakcie realizacji pracy


magisterskiej skupiłem się na problemach związanych z synchronizacją rui u tego

gatunku. W prowadzonych badaniach oceniano zmiany hormonalne zachodzące nie

tylko podczas synchronizowanej rui, ale także w cyklu posynchronizacyjnym. Przy

zastosowaniu ingerencji hormonalnej ważnym jest bowiem nie tylko prawidłowy

przebieg indukowanej owulacji, ale również uniknięcie negatywnych skutków

ingerencji farmakologicznej. Moje zainteresowanie synchronizacją rui dotyczyły

również krów. Aby zwrócić uwagę hodowcom i lekarzom weterynarii na problemy

związane z synchronizacją rui u tego gatunku opublikowano artykuł

popularnonaukowy.

Kolejne prace u kóz mają duże znaczenie diagnostyczne i praktyczne. W

doświadczeniach, w których uczestniczyłem wykazano możliwość wykorzystania

metody immunoflurescencyjnej jako metody alternatywnej do radioimmunologicznej w

oznaczaniu progesteronu u kóz. Wykazano też, że analiza zmian stężeń tego

hormonu we krwi pozwala nie tylko na monitorowanie prawidłowego przebiegu

cyklu jajnikowego, ale również może być pomocna w sygnalizowaniu obecności

torbieli jajnikowych u tego gatunku. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują

też na dużą wartość diagnostyczną ultrasonografii transrektalnej w kontroli cyklu

jajnikowego kóz. Analiza obrazu ultrasonograficznego pozwoliła określić czas

owulacji, czas trwania kolejnych faz cyklu jajnikowego, a także potwierdzić

ewentualne stany patologiczne występujące na jajnikach. Dzięki temu możliwe jest

wczesne wykrycie tych zaburzeń i podjęcie właściwego leczenia.

W doświadczeniach przeprowadzonych u kóz badano też przydatność metody

omometrycznej w monitorowaniu cyklu jajnikowego u tego gatunku zwierząt. Jest to

bardzo prosta metoda, która stosowana jest w monitorowaniu cyklu rujowego - głównie

u krów i suk. Jednakże badania dotyczące kóz są bardzo nieliczne i brak było

jednoznacznych wyników potwierdzających możliwość zastosowania tej metody u tego

gatunku zwierząt. Najprawdopodobniej trudności związane z uzyskaniem

powtarzalnych i wiarygodnych wyników spowodowane są brakiem gruczołów

przedsionkowych u kóz, co wiąże się z koniecznością głębszego wprowadzenia sondy

(w pobliżu ujścia szyjki macicy). Nasze wstępne badania wykazały, że omometr

przeznaczony przez producenta dla owiec i kóz wyposażony jest w sondę dopochwową

o zbyt dużej średnicy (2,2 cm), co powodowało utrudnienia z wprowadzeniem takiej

sondy na odpowiednią głębokość do pochwy kóz. Dlatego też na naszą prośbę

producent zamontował sondę o znacznie mniejszej średnicy (0,8 cm). Pozwoliło to na


bezproblemowe, głębsze, a także bezstresowe dla zwierząt wprowadzenie sondy do

pochwy. Zastosowana modyfikacja umożliwiła uzyskanie powtarzalnych odczytów, a

uzyskane wyniki zostały potwierdzone zmianami w stężeniu progesteronu i objawami

rujowymi. Wyniki naszego doświadczenia wykazały, że pomiary oporności

elektrycznej śluzu pochwowego, ale przy zastosowaniu sondy pomiarowej o

mniejszej średnicy, mogą być użyteczne do monitorowania cyklu rujowego.

Zgodnie z naszą wiedzą po raz pierwszy opisaliśmy też przydatność metody

omometrycznej w sygnalizowaniu obecności torbieli jajnikowych, a także w

określeniu długości trwania sezonu rozrodczego u kóz.

Uczestniczyłem też w badaniach nad genetycznymi zaburzeniami związanymi z

determinacją płci u kóz. W tym doświadczeniu określono profil ekspresji genów

zaangażowanych w ten proces. Chciałem nadmienić, iż w trakcie realizacji procesów

związanych z publikacją tych badań pełniłem funkcję autora korespondującego.

Byłem też współautorem pracy, w której określono i porównano profil ekspresji

genu SOX9 (SRY-box 9) w jądrach niedojrzałych i dojrzałych płciowo kozłów. W pracy

tej wykazano, że ekspresja genu SOX9 zależy od wieku samców. Ponadto, u samców

z właściwie rozwiniętymi jądrami i prawidłowymi parametrami nasienia ekspresja SOX-

9 była istotnie wyższa niż u samców, u których stwierdzono nieprawidłowości

w rozwoju jąder i spermatogenezie.

Obiektem mojego zainteresowania zagadnieniami związanymi z przebiegiem i

monitorowaniem procesów rozrodczych są również inne gatunki zwierząt. Przykładem

jest opublikowana ostatnio praca popularnonaukowa, w której przedstawiono

możliwości wykorzystania ultrasonografii w położnictwie psów.

Ad. III. Sezonowość w rozrodzie zwierząt


oryginalnych prac twórczych (A1, A3, A6, A7, A8, A21, B3), 1 praca

popularnonaukowa (B9) i 2 doniesienia konferencyjne.

Sezonowość w rozrodzie występuje głównie u zwierząt wolno żyjących,

a spośród gatunków gospodarskich najsilniej przejawia się u kóz i owiec. Dlatego też

uczestniczyłem w badaniach prowadzonych na kozłach, u których wykazano zależne od

pory roku zmiany w jakości nasienia, wielkości jąder i ich aktywności steroidogennej,

a także stwierdzono wyraźny roczny rytm uwalniania hormonów tarczycy


z najwyższymi stężeniami w miesiącach, w których aktywność steroidogenna jąder

i jakość nasienia była najniższa. Jednakże sezonowe zmiany w przebiegu procesów

rozrodczych w mniejszym lub większym stopniu występują również u innych gatunków

zwierząt. Przykładem jest świnia domowa, która nie jest typowym gatunkiem

wykazującym sezonowość w rozrodzie. Niemniej jednak, większość parametrów

rozrodu znacznie gorzej kształtuje się latem i wczesną jesienią, natomiast w okresie

zimowo-wiosennym ulega poprawie. To sezonowe osłabienie aktywności rozrodczej

zwanej „syndromem letniej niepłodności” zbiega się z sezonowym anestrus u przodka

współczesnej świni, tj. dzika europejskiego. Efektem zainteresowania tym tematem była

praca popularnonaukowa opublikowana w początkowym okresie mojej działalności

naukowej. Z kolei efektem doświadczeń prowadzonych w zakresie sezonowości

rozrodu u świń było wykazanie sezonowych różnic w wielkości jajników oraz

koncentracji 17-β-estradiolu, progesteronu, testosteronu i tyroksyny, a także

aktywności peroksydazy glutationowej w płynie folikularnym. Uzyskane wyniki

dowodzą, że status hormonalny i antyoksydacyjny pęcherzyka jajnikowego świni

zależy nie tylko od stadium jego rozwoju, ale także od sezonu. Wskazano też, że

sezonowy przebieg pęcherzykowej aktywności steroidogennej z większym jej

nasileniem w okresie zimowym i mniejszym w okresie letnim powinien być

uwzględniany w badaniach nad pozaustrojową „produkcją” zarodków, w których

oocyty pozyskuje się z pęcherzyków jajnikowych w różnych porach roku.

W aspekcie sezonowości rozrodu wykazano też sezonowe różnice w stężeniu

wolnych frakcji jodotyronin oraz cholesterolu w płynie bydlęcych pęcherzyków

jajnikowych. U klaczy natomiast stwierdzono zależne od sezonowych zmian

w aktywności jajników różnice w składzie jonowym płynu pęcherzykowego.

Uczestniczyłem też w badaniach nad sezonowym przebiegiem procesów

rozrodczych u jelenia szlachetnego, który z uwagi na silnie zaznaczoną sezonowość w

rozrodzie jest cennym i bardzo interesującym obiektem badań w tym zakresie.

W pracach tych skupiono się głównie na aktywności sekrecyjnej tarczycy i przytarczyc.

W doświadczeniach na jeleniach wykazano, że niezależnie od dojrzałości płciowej

i wieku występuje okołoroczny rytm uwalniania jodotyronin charakteryzujący się

najwyższymi stężeniami w okresie zimowo-wiosennym i najniższymi w miesiącach

letnio-jesiennych. Stwierdzono też różnice w intensywności uwalniania tyroksyny,

kalcytoniny i parathormonu pomiędzy niedojrzałymi i dojrzałymi łaniami, co

może wskazywać na udział tych hormonów w regulacji procesów związanych


z uzyskaniem dojrzałości płciowej. W cyklu doświadczeń na jeleniach wykazano

także istnienie rocznego rytmu wydzielania kalcytoniny charakteryzującego się

najwyższymi poziomami w okresie letnio-jesiennym i najniższymi w okresie

zimowym. Wyniki te sugerują udział kalcytoniny w procesach życiowych

zależnych od pór roku. We krwi samca jelenia stwierdzono ponadto zależność

między sezonowymi zmianami w stężeniu mikro- i makroelementów a rocznymi

zmianami w stężeniu testosteronu.

Oprócz ssaków sezonowość w rozrodzie występuje również u innych

kręgowców, w tym u ptaków. Wiele badań w tym zakresie prowadzono u przepiórki

japońskiej - czyniąc ją modelowym gatunkiem doświadczalnym w badaniach nad

mechanizmami regulującymi sezonowe procesy rozrodcze. Dlatego w moim dorobku

naukowym znajdują się też prace określające okołodobowy rytm uwalniania

progesteronu i trójjodotyroniny, a także oceniające zmiany hormonalne zachodzące w

czasie dojrzewania przepiórki japońskiej. Są to badania wprowadzające do dalszych

prac nad poznaniem zależności między porą roku a procesami rozrodczymi ptaków.

Ad. IV. Ocena wartości biologicznej nasienia samca


oryginalnych prac twórczych (A12, A13, A14, B1, B2, B12), 1 praca

popularnonaukowa (B5) i 8 doniesień konferencyjnych.

Jednym z głównych nurtów badawczych realizowanych od lat w mojej jednostce

macierzystej jest poszukiwanie i doskonalenie metod oceny właściwości biologicznych

plemników. Włączyłem się w ten nurt badawczy realizując prace nad wdrożeniem

techniki podwójnego barwienia fluorescencyjnego jodkiem propidyny i SYBR-14 oraz

test HOST (hypo-osmotic swelling test) w ocenie integralności strukturalnej

i funkcjonalnej błony komórkowej plemników knura charakteryzującej się zwiększoną

podatnością na uszkodzenia związane z procesami konserwacji. Na podstawie

przeprowadzonych badań stwierdzono przydatność wymienionych technik

w diagnostyce seminologicznej nasienia knura. Wykazano ponadto, że utrata

wartości biologicznej plemników przechowywanych długoterminowo w stanie

płynnym może być związana z uszkodzeniami ich błony komórkowej na różnych

etapach konserwacji.


Oprócz oceny ruchliwości i stabilności środowiska plemników, a także

integralności błony komórkowej plemnika szczególną uwagę zwrócono też na zmiany

aktywności mitochondriów. W badaniach zastosowano barwienie kombinacją trzech

fluorochromów – SYBR-14, PI oraz JC-1 (test SYBR-14/PI/JC-1) i cytochemiczny test

skryningowy na oksydoreduktazy zależne od NADH (NADH-NBT). W wyniku

realizacji tych badań stwierdzono też, że etap rozrzedzania nasienia oraz czas jego

przechowywania w stanie płynnym mogą osłabiać zdolności oksydoredukcyjne

mitochondriów plemników knura. Ponadto wykazano, że temperatura i czas

przechowywania mają istotny wpływ na aktywność mitochondriów plemników

związaną z zaburzeniami ich potencjału błonowego. Stwierdzono też, że przy

wydłużaniu okresu przechowywania nasienia sukcesywnie nasila się depolaryzacja błon

mitochondrialnych plemników, a działanie obniżonej temperatury (5 °C) może być

dodatkowym czynnikiem istotnie wpływającym na tego typu zmiany.

Uczestniczyłem też w pracach, w których w ocenie aktywności mitochondriów

plemnika wykorzystano metodę oksygraficzną. Metodę tę zastosowano do analizy

metabolicznej mitochondrialnych enzymów oddechowych plemników w ejakulatach

knurów różnych ras i w różnym wieku. Uzyskane wyniki wykazały, że metoda

oksygraficzna umożliwia precyzyjne badanie stanu układu oddechowego

plemników i tym samym pozwala na selekcję osobników o najlepszych

parametrach nasienia, z uwzględnieniem ich cech indywidualnych, rasy i wieku.

Zasugerowano możliwość zastosowania tej metody jako uzupełniającej w badaniach

okresowych nasienia, a także przy podejmowaniu decyzji o eliminacji knura.

Jakość nasienia knura badano także w aspekcie zanieczyszczenia

mikrobiologicznego. W tym celu przeprowadzono ilościową i jakościową ocenę

zanieczyszczenia mikrobiologicznego ejakulatów knurów, a także nasienia

przechowywanego w komercyjnym rozcieńczalniku X-cell®

w temperaturze 16 °C.

Określono też zależności zanieczyszczenia bakteryjnego z jakością przechowywanego

nasienia, a także skuteczność działania antybiotyku (siarczanu gentamycyny) zawartego

w rozcieńczalniku. Wykazano, że w ejakulatach knurów występował różny stopień

i rodzaj zanieczyszczenia bakteryjnego. Najczęściej izolowanymi bakteriami były

gronkowce i paciorkowce oraz niezidentyfikowane gatunki należące do rodzaju

Pseudomonas. W trakcie przechowywania nasienia zanotowano redukcję wzrostu

bakterii Gram-ujemnych, z wyjątkiem Pseudomonas spp., przy ograniczeniu inhibicji

wzrostu bakterii Gram-dodatnich. Selektywny wzrost poszczególnych typów bakterii w


czasie konserwacji mógł wynikać z właściwości siarczanu gentamycyny, który

wykazuje większą skuteczność wobec bakterii Gram-ujemnych. Szkodliwy wpływ

niektórych bakterii związany był z ich adhezją do powierzchni wszystkich regionów

morfologicznych plemnika, a towarzysząca im wzmożona aglutynacja plemników

nasilała się wraz z wydłużaniem czasu przechowywania. Przeprowadzone badania

sugerują, że oprócz stosowania wysokich standardów higienicznych przy produkcji

nasienia, należy zwracać uwagę na dobór właściwego pod względem skuteczności

działania przeciwbakteryjnego rozcieńczalnika, który powinien być

dostosowywany do profilu zanieczyszczenia bakteryjnego nasienia danej populacji

knurów.

W ramach badań nad czynnikami kształtującymi właściwości biologiczne

nasienia knura wykazano, że genotyp oraz wiek samca mogą być czynnikami znacząco

różnicującymi i wpływającymi na jakość ich nasienia. Stwierdzono również, że przy

zachowaniu właściwych warunków utrzymania możliwe jest uzyskanie dobrej jakości

nasienia i jednocześnie utrzymanie prawidłowych przyrostów i mięsności.

W zakresie omawianego obszaru badawczego uczestniczyłem też w badaniach

nad szczegółową analizą obrazu morfologicznego plemników knurów. Najczęściej

występującymi wadami głównymi były kropla cytoplazmy w położeniu proksymalnym,

a także niby-kropla w obrębie wstawki oraz zwężenie u podstawy główki plemnika.

Dominującymi wadami podrzędnymi były natomiast kropla cytoplazmy w położeniu

dystalnym oraz pojedyncza pętla witki plemnika. Występowanie tych wad może

wynikać z krótszego czasu dojrzewania plemników w najądrzu. Dlatego też

zasugerowano, że przyczyną wad plemników może być nadmierna eksploatacja

rozpłodowa niektórych, a zwłaszcza starszych knurów.

Wyniki prowadzonych doświadczeń opublikowano w oryginalnych pracach

twórczych, a także zostały też zasygnalizowane na licznych konferencjach krajowych i

międzynarodowych. Jestem też współautorem pracy popularnonaukowej opisującej

znaczenie inseminacji w rozrodzie trzody chlewnej.

Ad. V. Selen w organizmach zwierząt


oryginalnych prac twórczych (A11, A17, A18, A19, A20) i 4 doniesienia

konferencyjne.

AUTOREFERAT - biotechnologia.zut.edu.pl · rozwój oocytów świńskich w warunkach in vitro....

Documents

Transcript of AUTOREFERAT - biotechnologia.zut.edu.pl · rozwój oocytów świńskich w warunkach in vitro....