© Copyright by $taś

- 1 -

ODCZYNY SEROLOGICZNE I ETODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ STOSOWANE W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ

Odczyny serologiczne stosowane w diagnostyce wirusologicznej są oparte na reakcji antygenu z przeciwciałemswoiście przeciwko niemu skierowanym. Odczyny te wykorzystuje się do wykrywania:

Antygenów obecnych w pobranym materiale klinicznym (tzw. szybkie lub bezpośrednie metodydiagnostyczne)Antygenów po namnożeniu wirusa we wrażliwych komórkach (w hodowli komórkowej zarodku kurzym,zwierzętach laboratoryjnych)Przeciwciał obecnych w surowicy chorego będących następstwem reakcji immunologicznej na toczącesię zakażenie

W zależności od celu, w jakim stosujemy odczyn serologiczny, gdy poszukujemy obecności antygenu posługujemysię surowicami wzorcowymi o znanej specyficzności lub gdy chcemy określić miano przeciwciał – wzorcowymiantygenami

Określając poziom przeciwciał w surowicy chorego , można ustalić rozpoznanie na podstawie wykazania:Co najmniej 4-krotnego przyrostu miana w 2 próbkach surowicy pobranych w odstępie 2-3 tygodni(najlepiej w okresie ostrym choroby i rekonwalescencji) lubObecności swoistych przeciwciał klasy IgM

Najczęściej stosowane odczyny:Odczyn neutralizacji (ONt)Odczyn immunoenzymatyczny (ELISA)Odczyn immunofluorescencyjny (OIF)Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA)Odczyn radioimmunologiczny (RIA)Odczyn aglutynacji cząstek opłaszczonych wirusemOdczyn hemolizy radialnejMetoda immunodyfuzjiMetoda immunoblotu (Western blot, WB)

Odczyn neutralizacji (ONt)

To najczulszy i najbardziej swoisty odczyn stosowany zarówno do wykrywania wirusów obecnych wbadanym materiale, jak i przeciwciał w surowicy choregoNiedogodnością ONt jest pracochłonność i stosunkowo długi czas oczekiwania na wynikONt znajduje głównie zastosowanie w diagnostyce enterowirusówIstotą odczynu jest zobojętnienie wirusa przez swoiste przeciwciała, co objawia się utratą jego właściwościzakaźnych.

o Reakcję zobojętniania przeprowadza się w probówce wobec stałej dawki wirusa (gdy określamypoziom przeciwciał) lub wobec surowicy odpornościowej o znanym mianie (gdy typujemynieznany wirus)

Wynik reakcji zobojętnienia jest niewidoczny i można go ocenić dopiero po wprowadzeniu reagentów doukładu indykatorowegoMieszaniną wirusa i surowicy zakaża się wrażliwy obiekt biologiczny, jakim może być zwierzędoświadczalne, zarodek kurzy lub hodowla komórkowa. Brak objawów zakażenia jest wynikiem dodatnim.Dla właściwej interpretacji wyniku konieczne jest przeprowadzenie niezbędnych kontroli.

Wartość miana przeciwciał neutralizujących określa takie najwyższe rozcieńczenie surowicy pacjenta,które zobojętnia właściwości patogenne użytego wirusa w danym systemie biologicznym.

Odczyn immunoenzymatyczny (EIA, ELISA)

Pozwala na jakościową i ilościową ocenę obecności szukanego antygenu lub przeciwciała, który wiążesię ze związanym, (faza stała) przeciwstawnym reagentem.

W wyniku reakcji cały kompleks antygenu z przeciwciałem jest unieruchomiony, w związku z czym nieulega wymyciu w procesie odpłukiwania nadmiaru niezwiązanych reagentów i można go wykazać pododaniu kolejnego przeciwciała połączonego z enzymem (najczęściej jest to peroksydaza chrzanowa lubfosfataza alkaliczna). Pod wpływem enzymu następie zmiana zabarwienia dodanego w kolejnym etapie reakcji substratu, np.aminoetylokarbozolu lub dwuaminobenzydyny. Powstałe zabarwienie jest proporcjonalne do ilościpowstałych kompleksów antygen-przeciwciało. Wynik reakcji może być oceniany wizualnie lub

© Copyright by $taś

- 2 -

spektrofotometrycznie. Stosując enzymatycznie znakowane przeciwciała swoiste dla poszczególnych klasimmunoglobulin, można wykrywać obecność przeciwciała klasy IgG,M,A.Odmianą metod immunoenzymatycznych stosowaną do wykrywania antygenów w utrwalonychskrawkach histologicznych lub preparatach komórkowych, z wykorzystaniem przeciwciał znakowanychperoksydazą lub fosfatazą jest metoda PAP i APAAP. W tych odczynach poszukiwany produkt reakcjiantygenu z przeciwciałem „mostkuje się” za pośrednictwem dodatkowej antyglobuliny (surowicywiążącej) z kompleksem zawierającym przeciwciało-enzym. Utworzenie takiego kilkuwarstwowegokompleksu w reakcji wieloetapowej wpływa na znaczne zwiększenie czułości tych metod. Wynik reakcjiodczytywany jest pod mikroskopom (powiększenie 100-400x)

Zaletą metod immunoenzymatycznych jest bezpieczeństwo i szybkość wykonania odczynu, prostotaodczytu i interpretacji wyniku oraz możliwość pełnej automatyzacji. Odczyny te są szeroko stosowane wdiagnostyce, np. zakażeń wirusami hepatotropowymi, wirusami z rodziny Herpesviridae

W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (1), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała.W przypadku zastosowań diagnostycznych dostępne są zwykle gotowe, opłaszczone antygenem płytki. Na tak przygotowane podłożenanosi się surowicę pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji płytkę się przepłukuje. Jeżeli przeciwciała skierowane przeciwkoantygenowi znajdowały się w surowicy, zwiążą się one z antygenem na płytce (2). Za pomocą drugiego przeciwciała lub innegowyznakowanego ligandu (które wiąże się z jakimś innym epitopem) można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę (4,5), co może dostarczyć dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecność tylko przeciwciał IgMświadczy o tym, że chory przechodzi pierwsze w życiu zakażenie danym drobnoustrojem, zaś obecność IgG świadczy o kolejnymzakażeniu). To drugie przeciwciało lub inny enzym przekształca dodatkowo bezbarwny lub niefluoryzujący substrat w barwny lubfluoryzujący produkt. A intensywność kolory lub fluorescencji jest następnie mierzona dla każdej próby i stanowi podstawę obliczenia ilościobcego w niej Ag.

Odczyn immunofluorescencyjny (OIF)

W przypadku wykrywania antygenów wirusowych stosuje się przeciwciała wzorcowe skoniugowane zbarwikami fluorescencyjnymi, np. izotiocyjanianem fluoresceiny lub rodaminy (surowice znakowane).

Reakcje przeprowadza się na utrwalonych rozmazach z materiałów klinicznych lub preparatachhistologicznych. W miejscu ekspresji antygenu wirusa na powierzchni komórki następuje reakcjaserologiczna, polegająca na utworzeniu kompleksu przeciwciało-antygen. Niezwiązane przeciwciałaspłukuje się, a wynik reakcji odczytuje się w mikroskopie fluorescencyjnym.

Do wykrywania przeciwciał obecnych w surowicy pacjenta stosuje się pośredni OIF. Jako antygenu używasię hodowle komórkowe zakażone laboratoryjnym szczepem danego wirusa. Kompleks antygen-przeciwciało uwidacznia się za pośrednictwem dodatkowej, znakowanej immunoglobuliny zawierającejprzeciwciała swoiste dla ludzkiej globuliny uzyskane w toku immunizacji zwierząt.

Powszechnie stosuje się zarówno bezpośredni i pośredni OIF. Znalazł on, między innymi zastosowanie w tzw.szybkich metodach diagnostycznych, w rozpoznawaniu zakażeń dróg oddechowych.

Odczyn radioimmunologiczny (RIA)

W metodzie tej jako znacznika używa się pierwiastka promieniotwórczegoWykrycie poszukiwanego składnika odbywa się za pomocą pomiaru promieniowania izotopu związanegoz jedną ze składowych reakcji antygen-przeciwciało. Można dokonywać pomiaru radioaktywnościpowstałego kompleksu lub supernatantu, po oddzieleniu tegoż kompleksu.

Najczęściej stosowanym izotopem znacznikowym jest 125J.Metoda RIA cechuje bardzo wysoka czułość;Ich ograniczeniem jest konieczność wyposażenia laboratorium w odpowiedni sprzęt oraz zapewnieniebezpieczeństwa pracy.Odczyn RIA do niedawna stosowany był w diagnostyce zakażeń wywołanych wirusem zapalenia wątrobytypu B

Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

Istotą odczynu jest wiązanie dopełniacza (pochodzącego z surowicy świnki morskiej) przez swoistykompleks antygen-przeciwciało (I faza reakcji).To czy został on związany stwierdza się w II fazie reakcji przez dodanie do układu „uczulonych” krwinekbaranich, to jest krwinek opłaszczonych swoistymi dla nich przeciwciałami (amboceptor hemolityczny).Ulegają one hemolizie tylko wtedy, gdy dopełniacz nie został związany w I fazie reakcji.Brak hemolizy oznacza wynik dodatni, gdyż wskazuje, że w I fazie reakcji powstał kompleks antygen-przeciwciało, który związał całkowicie dopełniaczOWD znalazł zastosowanie głównie do określania miana swoistych przeciwciał, np. dla wirusa herpessimplex, cytomegalii.

© Copyright by $taś

- 3 -

Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA)

Odczyn ten można stosować w diagnostyce wirusów, które posiadają zdolność hemaglutynacji, tj.aglutynowania krwinek czerwonych różnych gatunków zwierząt lub ludzkich „0”Rh(-)(np. ortomyksowirusy,paramyksowirusy, wirus różyczki),.Jeżeli w badanej surowicy znajdują się przeciwciała dla określonej hemaglutyniny wirusowej, to pododaniu wirusa , a następnie odpowiednich krwinek czerwonych nie dochodzi do ich aglutynowania.Za miano surowicy przyjmuje się to największe rozcieńczenie, w którym występuje zahamowaniehemaglutynacji.Ponieważ wiele surowic ludzkich i zwierzęcych zawiera nieswoiste czynniki hamujące aglutynacjęerytrocytów, co może powodować fałszywie dodatnie wyniki, przed użyciem surowic do OZHA koniecznejest zniszczenie lub usunięcie tych inhibitorów.

o W tym celu stosuje się wiele metod, np. ogrzewanie, traktowanie przesączem hodowli bulionowejprzecinkowca cholery (RDE), adsorpcję kaolinem.

Odczyn aglutynacji cząstek opłaszczonych wirusem

Antygen wirusowy zostaje zaadsorbowany na powierzchni nośnika, np. lateksu, bentonitu, erytrocytów(mówimy wówczas o hemaglutynacji pośredniej).Następnie dodaje się surowicę zawierającą przeciwciała, które reagują z tym opłaszczonym na nośnikuantygenemà następuje wytrącenie cząstek nośnika i ich zlepianie (aglutynacja)

Metoda ta znalazła zastosowanie głównie w tzw. szybkich testach diagnostycznych w wykrywaniu np.rotawirusów w kale pacjenta

Odczyn hemolizy radialnej

Jest odczynem wykorzystującym właściwości hemolityczne dopełniacza

1. Antygen wirusowy opłaszcza się na powierzchni erytrocytów.2. Erytrocyty z opłaszczonym antygenem wirusowym miesza się następnie z płynną, podgrzaną agarozą i

rozlewa do płytek Petriego3. Po zakrzepnięciu wycina się w agarozie dołki, do których wlewa się badane surowice.4. W czasie kilkugodzinnej inkubacji następuje dyfuzja przeciwciał (z badanej surowicy w tych „dołkach”) i

ich połączenie z antygenami znajdującymi się na erytrocytach (w agarozie)5. Na powierzchnię pytek nanosi się wtedy roztwór dopełniacza, który powoduje lizę tych krwinek, na których

powstał kompleks antygen-przeciwciało.6. Wielkość strefy hemolizy wokół dołków odpowiada ilości obecnych w surowicy swoistych przeciwciał.

Metoda immunodyfuzji

W tej metodzie, w środowisku żelu agarowego, następuje wędrówka naprzeciw siebie antygenu iprzeciwciała.W miejscu ich zetknięcia powstaje linia precypitacji, której natężenie jest wykładnikiem stężeniareagujących składników.

Metoda ta jest przydatna głównie do wykrywania rozpuszczalnych antygenów wirusowycho Stosowana była np. w diagnostyce wirusowego zapalenia wątroby typu B, obecnie wyparta przez

metody immunoenzymatyczne

Metoda immunoblotu, Western blot (WB)

Metoda ta umożliwia jednoczasowe wykrycie w surowicy pacjenta obecności przeciwciał reagujących zróżnymi białkami danego wirusa

1. Namnożoną i oczyszczoną zawiesinę wirusa poddaje się trawieniu,2. uzyskane w ten sposób białka wirusowe rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym, zgodnie

z ich masą cząsteczkową.3. Pasma poszczególnych białek są przenoszone („blotting”) na błonę nitrocelulozową, z którą silnie się wiążą4. Po wypłukaniu i wysuszeniu błonę tnie się na paski używane do odczynu właściwego,5. Na pasek nanosi się badaną surowicę6. po okresie inkubacji swoiste przeciwciała wiążą się z odpowiednimi białkami wirusowymi

© Copyright by $taś

- 4 -

7. Po odpłukaniu niezwiązanych fragmentów dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiejimmunoglobulinie wyznakowane enzymem.

8. Dodany w kolejnym etapie substrat barwi te prążki, na których zaszła reakcja antygen-przeciwciało.

Odczyn ten jest obecnie stosowany jako test potwierdzający w diagnostyce zakażeń HIV

W diagnostyce wirusologicznej coraz częściej stosuje się metody biologii molekularnej umożliwiające wykrywaniegenomu wirusowego. Metody te wymagają znajomości sekwencji poszczególnych nukleotydów w wirusowym DNAlub RNA. Bardzo wysoka czułość tych technik może być przyczyną uzyskiwania fałszywie dodatnich wynikó·, stądkonieczność zachowani odpowiedniego reżimu postępowania i ostrożnej interpretacji wyników

Metoda hybrydyzacjiWykorzystuje zjawisko komplementarności zasad purynowych i pirymidynowych.

1. W pierwszym etapie reakcji następuje denaturacja kwasu nukleinowego (pod wpływem temperatury,rzadziej działania chemicznego) do pojedynczej nici.

2. Dodana sonda genetyczna (fragment oligonukleotydów o znanej sekwencji, charakterystycznej dlaposzukiwanego wirusa) łączy się (hybrydyzuje) w miejscach, gdzie sekwencja nukleotydów jestkomplementarna do obecnej w badanej próbce.

a. W zależności od znacznika, z którym połączona jest sonda genetyczna (barwnik fluorescencyjny,enzym, białko, radioizotop) stosujemy różne sposoby detekcji reakcji hybrydyzacji.

W praktyce stosujemy odmiany:o Hybrydyzacja in situ

· w tej samej odmianie reakcję hybrydyzacji przeprowadza się na utrwalonymskrawku tkanki lub rozmazie komórkowym.

· Metoda ta umożliwia zlokalizowanie poszukiwanych sekwencji wirusowychwewnątrz zakażonej komórki

o Hybrydyzacja typu „Southern blot”· DNA wyizolowany z badanej próbki poddaje się działaniu enzymów

restrykcyjnych, które tną nić kwasu nukleinowego na krótsze fragmentyoligonukleotydów.

· Fragmenty te rozdziela się elektroforetycznie,· Następnie, po utrwaleniu, przenosi się na filtr nitrocelulozowy, na którym

przeprowadza się hybrydyzację z sondą genetyczną.· Porównanie prążków uzyskanych z materiału klinicznego i wirusa prototypowego

umożliwia dokładne określenie typu wyizolowanego wirusa i umożliwiadochodzenie epidemiologiczne

o hybrydyzacja typu „Northern blot”· w przypadku gdy rozdział dotyczy fragmentów RNA

Polimerazowa reakcja łańcuchowa, PCRUmożliwia w warunkach in vitro, w ciągu kilku godzin, zwielokrotnienie pojedynczej kopii fragmentuwirusowego DNA miliony razy, do takich ilości, które jesteśmy w stanie wykryć dostępnymi nam metodami

1. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze, aparacie charakteryzującym się możliwością szybkich zmiantemperatury

2. Próbkę badanego materiału poddaje się działaniu wysokiej temperatury (>90°C) w celu uzyskaniapojedynczej nici DNA (denaturacja).

3. Po ochłodzeniu do 50-60°C dodaje się primery (startery o budowie oligonukleotydowej), przyłączające sięw sposób swoisty, na zasadzie komplementarności, do dwóch fragmentów przeciwległych nici DNA.

4. Do mieszaniny reakcyjnej, odpowiednio zbuforowanej dodajemy także termostabilną polimerazę DNA oraznukleotydy konieczne do syntezy DNA.

5. W temperaturze 70-75°C w obecności polimerazy następuje dobudowywanie komplementarne nici DNA,zapoczątkowane w miejscach przyłączenia się primerów. Jest to pierwszy cykl reakcji PCR

6. Następnie temperaturę podnosi się, aby denaturować nowo powstałe nici DNA.7. Reakcję przyłączania primerów i polimeryzacji powtarza się automatycznie, zazwyczaj 30-40-krotnie.

© Copyright by $taś

- 5 -

a. Powielanie kopii DNA leżących między zastosowanymi primerami jest możliwe tylko wówczas, gdynastąpiło połączenie primerów z homologiczną sekwencją w poszukiwanym kwasie nukleinowym.

8. Otrzymane DNA rozdziela się w żelu poliaktylamidowym lub agarozowym i uwidacznia w świetle UV przezdodanie bromku etydyny.

9. O swoistości przeprowadzonej reakcji PCR można przekonać się, wykonując, hybrydyzację otrzymanegoproduktu z sondą rozpoznającą zwielokrotnione fragmenty kwasu nukleinowego.

W przypadku wykrywania wirusów zawierających RNA w pierwszym etapie reakcji musi nastąpićprzepisanie informacji genetycznej na nić DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy (metoda RT PCR)