NAUKOWY 2018.docx · Web viewPonadto, wspólnie z Zakładem Diagnostyki Hematologicznej i Kliniki...

PLAN NAUKOWY

INSTYTUTU HEMATOLOGII I TRANSFUZJOLOGII

NA ROK 2018

Warszawa 2017

I. CHARAKTERYSTYKA OGÓLNA

Działalność naukowa Instytutu Hematologii i Transfuzjologii finansowana jest przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego ze środków na działalność statutową, Narodowe Centrum Nauki (NCN), Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (NCBiR), Fundację na rzecz Nauki Polskiej (FNP) - projekty badawcze (granty) oraz dofinansowywana przez IHiT ze środków własnych.Prace naukowe przewidywane do realizacji w 2018 r. zgrupowano w 3 tematach głównych:- Bezpieczna krew- Komórkowe i molekularne składniki krwi w stanach zdrowia i choroby- Specjalistyczne metody diagnostyki i terapii chorób krwii grantach:

Integralność białek kompleksu ligazy E3 ubikwityny jako biomarker odpowiedzi na leczenie immunomodulujące u chorych na szpiczaka plazmocytowego (GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

Heterogenność klonalna szpiczaka plazmocytowego: ewolucja i implikacje terapii celowanej (GRANT NARODOWEGO CENTRUM BADAŃ I ROZWOJU)

Inhibitory pan-PIM jako racjonalna strategia leczenia celowanego w szpiczaku mnogim zaburzająca jego interakcje z mikrośrodowiskiem (DIAMENTOWY GRANT MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO)

Znaczenie mutacji kinazy PIM-1 w progresji przewlekłej białaczki limfocytowej(GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

Genetyczne cechy komórek Reed-Sternberga i ich interakcje makrofagami w klasycznym chłoniaku Hodgkina: identyfikacja mechanizmów oporności na chemioterapeutyki i nawrotów choroby (GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

CDK8 jako racjonalny cel terapii w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL) (DIAMENTOWY GRANT MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO)

Łącznie Plan Naukowy IHiT na 2018 r. obejmuje 37 prac (w tym 9 prac doktorskich) (wrzesień 2017 r.)

II. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁALNOŚCI POSZCZEGÓLNYCH ZAKŁADÓW, KLINIK I SAMODZIELNYCH PRACOWNI

Zakład Diagnostyki Hematologicznej (ZDH)

1) Pracownia Cytogenetyki2) Pracownia Biologii Molekularnej3) Pracownia Immunofenotypowania4) Pracownia Patomorfologii5) Pracownia Analityki Medycznej

Samodzielny pracownik nauki:prof. dr hab. Monika Prochorec-Sobieszek – kierownik ZDH

Pracownia CytogenetykiAdiunkt:dr Katarzyna Borg - kierownikPracownik służby zdrowia:dr Urszula Bany-Łaszewicz

Pracownia Biologii MolekularnejAdiunkci:dr Patryk Górniak – p.o. kierownikadr Iwona SolarskaPracownicy służby zdrowia:mgr Hanna Makuch-Łasicamgr Grażyna NowakIwona Kania

Pracownia ImmunofenotypowaniaPracownicy służby zdrowia:dr Jolanta Woźniak - kierownikdr Urszula Podstawkamgr Agnieszka Krzywdzińska

Pracownia PatomorfologiiSamodzielny pracownik nauki:prof. dr hab. Monika Prochorec-Sobieszek – kierownikAdiunkt:dr Anna Szumera-CiećkiewiczPracownicy służby zdrowia:lek. Olga Szymańska-Giemzamgr Edyta Derezińska

Działalność naukowa Zakładu Diagnostyki Hematologicznej w 2018 roku będzie stanowić głównie kontynuację prac rozpoczętych w roku 2016. Prace będą prowadzone w ścisłej współpracy z Zakładem Hematologii Eksperymentalnej i będą obejmowały:1.Projekt „Eptheron: Epigenetic therapies in Oncology”. Celem projektu jest stworzenie nowych cząstek hamujących aktywność zmutowanych IDH1/2. Efektem prac będą nowe cząsteczki o aktywności przeciwnowotworowej i nowym mechanizmie działania, które w kolejnych fazach rozwoju będą mogły być testowane w badaniach klinicznych.2. Pracę planową: „Diagnostyka i patogeneza chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego”. Celem pracy jest opracowanie i zastosowanie nowych testów/technik diagnostycznych w oparciu o mechanizmy patogenetyczne nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego. 3. Pracę planową: „Kinaza cyklinozależna 8 jako cel terapeutyczny w chłoniakach rozlanych z dużych komórek B”.4. Pracę „Monitorowanie minimalnej choroby resztkowej u chorych na CBF-AML”.5. Kontynuowane będą badania dotyczące roli kinaz PIM w szpiczaku i PMLBCL i znaczenia mechanizmów związanych z metylacją DNA w odpowiedzi na kladrybinę w AML i MDS.6. W oparciu o infrastrukturę Cyfrowego laboratorium badań naukowych w hematoonkologii planowana jest realizacja projektów we współpracy z naukowymi jednostkami zewnętrznymi.

Zakład Hematologii Eksperymentalnej (ZHE)

1) Pracownia Nowotworów Układu Chłonnego2) Pracownia Nowotworów Układu Krwiotwórczego3) Pracownia Immunologii Nowotworów4) Pracownia Biostatystyki

Samodzielny pracownik nauki:Prof. dr hab. Przemysław Juszczyński - kierownikAdiunkci:Dr Emilia BiałopiotrowiczDr Patryk GórniakDr Ewa JabłońskaDr Anna PolakDr Maciej SzydłowskiPracownicy służby zdrowia:Mgr Monika NoyszewskaMgr Karolina Piechna

Działalność naukowa Zakładu Hematologii Eksperymentalnej w 2018 roku będzie stanowić ścisłą kontynuację prac rozpoczętych w roku 2017. Z uwagi na genezę Zakładu, który powstał z usamodzielnienia Pracowni Hematologii Doświadczalnej Zakładu Diagnostyki Hematologicznej – prace realizowane będą we współpracy między ZHE, Zakładem Diagnostyki Hematologicznej oraz Kliniką Hematologii. Szczegółowe tematy realizowane wspólnie dotyczą: 1. Patogenetycznych powiązań między sirtuiną 1 a białkiem HSP90 w chłoniaku DLBCL.2. Roli kinaz PIM w patogenezie chorób układu chłonnego – badania obejmą rolę kinaz PIM w szpiczaku plazmocytowym, pierwotnym chłoniaku śródpiersia i DLBCL. 3. Charakterystyki funkcjonalnej klonogennych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (OBL).Ponadto, wspólnie z Zakładem Diagnostyki Hematologicznej i Kliniki Hematologii, w ramach pracy „Optymalizacja diagnostyki i leczenia chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego”, podejmiemy badania dotyczące enzymów AHCY (hydrolaza S-adenozylohomocysteiny) i MAT (methionine adenosyltransferase, syntaza S-adenozylometioniny) jako celów terapeutycznych u chorych z ostrą białaczką szpikową lub zespołami mieldysplastycznymi i mutacjami IDH1/2 lub TET2. We wcześniejszych badaniach wykazano, że u chorych z AML mutcjami IDH1, u których wskutek nadprodukcji 2-hydroksyglutaranu, onkometabolitu sprzyjającego hipermetylacji DNA, wyniki leczenia z użyciem kladrybiny, analog purynowy działający hipometylująco poprzez hamowanie AHCY, są lepsze niż u chorych bez tej mutacji. W ramach tego projektu zbadane zostaną wyniki leczenia chorych z MDS i mutacjami IDH1, a ponadto biologiczne i molekularne konsekwencje wyłączenia kluczowych enzymów szlaku metylacji – AHCY i MAT.

Obok tych projektów realizowanych wspólnie, ZHE będzie realizować projekty dotyczące roli fosfatazy DEPTOR w DLBCL, oraz następujące granty (również we współpracy z innymi jednostkami):1. Projekt „Eptheron: Epigenetic therapies in Oncology”. Projekt realizowany będzie przez konsorcjum Eptheron (Selvita S.A., Uniwersytet Jagielloński, COI, IHiT, Politechnika Wrocławska, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego). Modyfikacje epigenetyczne determinują strukturę i stopień upakowania chromatyny, przez co wpływają na ekspresję genów i szerokie spektrum procesów biologicznych ważnych dla różnicowania i proliferacji komórek. Zaburzenia regulacji epigenetycznej, wynikające ze zmienionej aktywności enzymów wpływających na modyfikacje epigenetyczne stanowią częstą cechę nowotworów człowieka. Mutacje dehydrogenazy izocytrynianowej (IDH1/2), obecne w znacznej części glejaków i ostrych białaczek szpikowych prowadzą do utraty naturalnej aktywności katalitycznej i produkcji -ketoglutaranu (-KG) i nabycia nowej funkcji - produkcji 2-hydroxyglutaranu (2-HG). 2-HG hamuje aktywność dioksygenaz zależnych od -KG, w tym hydroksylaz DNA, demetylaz histonowych i hydroksylaz prolinowych. Wskutek tych zaburzeń, dochodzi do hipermetylacji DNA, białek histonowych i zaburzeń w ekspresji genów, metabolizmie komórek i ich różnicowaniu. Z tego względu, farmakologiczna interwencja hamująca aktywność zmutowanych IDH1/2 i innych wtórnie deregulowanych enzymów może stanowić racjonalną strategię terapeutyczną w nowotworach człowieka z ich zaburzoną funkcją. Celem projektu EPTHERON (EPigenetic THerapies in ONcology), łączącego zróżnicowane zaplecze naukowe i doświadczenie instytucji naukowych i przedsiębiorcy, jest stworzenie nowych cząstek hamujących aktywność zmutowanych IDH1/2. W trakcie prac Konsorcjum podjęło również działania mające na celu opracowanie inhibitorów PHGDH i PSAT1 – prace dotyczące funkcji tych enzymów i zasadności ich inhibicji w chłoniaku Burkitta są rozpoczęte. Efektem prac będą nowe cząsteczki o aktywności przeciwnowotworowej i nowym mechanizmie działania, które w kolejnych fazach rozwoju będą mogły być testowane w badaniach klinicznych. 2. „Inhibitory kinaz PIM jako racjonalna strategia leczenia w szpiczaku plazmocytowym”. Projekt jest realizowany w ramach Diamentowego Grantu, przez Filipa Garbicza, studenta V roku WUM.

Priorytetowym projektem naukowym ZDH w 2018 roku będzie projekt STRATEGMED „Eptheron”.

Zakład Transfuzjologii (ZT)

1) Pracownia Zapewnienia Jakości2) Pracownia Transfuzjologii Klinicznej z Bankiem Krwi3) Pracownia Transfuzjologii Laboratoryjnej z Bankiem Krwiotwórczych Komórek4) Pracownia Organizacji Służby Krwi5) Ośrodek Dawców Szpiku6) Pracownia Mikrobiologii

Samodzielni pracownicy nauki:Prof. dr hab. Magdalena Łętowska - kierownik Prof. dr hab. Ryszard Pogłód Adiunkci:Dr Jolanta Antoniewicz-PapisDr Elżbieta LachertDr Aleksandra RosiekAsystent:Dr Jolanta Kubis

Działalność naukowa Zakładu Transfuzjologii w 2018 roku obejmować będzie przede wszystkim prace związane z realizacją tematu głównego nr 2 „Bezpieczna krew”. W ramach współpracy z innymi Pracowniami i Zakładami zostaną wykonane następujące prace:

1. Monitorowanie i analiza danych w krwiodawstwie i krwiolecznictwie.

2. Opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny, składnika żelu płytkowego (pilotażowe badania).

Celem prowadzonych prac jest analiza zjawisk i tendencji występujących w polskim krwiodawstwie w okresie dziesięcioletnim, ze szczególnym uwzględnieniem tendencji dotyczących zmienności liczby dawców, metod donacji, rodzajów pozyskiwanych składników krwi i ich wykorzystania do celów klinicznych. Przeprowadzone zostanie także podsumowanie działalności jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi (JOPSK) w Polsce za 2017 rok. Ponadto przeprowadzona będzie analiza wyników kontroli jakości składników krwi otrzymywanych w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi (JOPSK) w latach 2015-2016. Systematyczne porównywanie wyników badań kontroli jakości składników krwi otrzymanych w JOPSK pozwolą ocenić stopień wdrożenia systemu zapewnienia jakości. Przeprowadzona będzie ocena zużycia koncentratu krwinek czerwonych (KKCz) w planowych operacjach chirurgicznych w okresie 12 miesięcy. Wykonane zostaną pilotażowe badania, których celem będzie opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny, jako składnika autologicznego żelu płytkowego.

W Zakładzie Transfuzjologii działa ponadto Zespół ds. Analizy Niepożądanych Zdarzeń i Reakcji w Krwiodawstwie i Krwiolecznictwie w Polsce, w skład którego wchodzą pracownicy tego Zakładu oraz Zakładu Wirusologii i Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej. Zespół ten analizuje zgłoszenia niepożądanych reakcji poprzetoczeniowych oraz zdarzeń niepożądanych związanych z przetoczeniem krwi i jej składników nadsyłanych z centrów krwiodawstwa i krwiolecznictwa z terenu całego kraju oraz dokonuje analizy postępowanie tych centrów. Działalność tego zespołu stanowi istotny element czuwania nad bezpieczeństwem krwi.

Pracownia Zapewnienia Jakości Adiunkt:Dr Elżbieta Lachert - kierownikAsystent:Dr Jolanta KubisPracownicy służby zdrowia:Mgr Ewa PotockaMgr Agata Mikołowska (Płodzich)Tech. Elżbieta WiśniakowskaElżbieta Kowalczyk

Pracownia Transfuzjologii Klinicznej z Bankiem KrwiSamodzielny pracownik nauki:Prof. dr hab. Ryszard Pogłód - kierownik Pracownicy służby zdrowia: Lek. Lech RzymkiewiczMgr Beata WiśniewskaMgr Ewa Pietrowiak Mgr Milena PrusaczykIwona Dziarnowska Bożena Knyt Monika MatuszEwa SzczepańskaMarzena WójcikElżbieta Zawirska

Pracownia Transfuzjologii Laboratoryjnej z Bankiem Krwiotwórczych Komórek Adiunkt: Dr Jolanta Antoniewicz-Papis - kierownikPracownicy służby zdrowia: mgr Karolina Soleckamgr Anna Wilkmgr Artur Ejdukmgr Tomasz Jankowskitech. Małgorzata Pawlik

Inż. Krzysztof SutkowskiPaweł Kłobukowski

Pracownia Organizacji Służby Krwi Adiunkt: Dr Aleksandra Rosiek Pracownicy służby zdrowia: Mgr Anna Tomaszewska - kierownikMgr Krystyna Dudziak

Ośrodek Dawców SzpikuPracownicy służby zdrowia: lek. Monika Grzegorek - kierownikmgr Martyna Romańska-Płużańskamgr Aleksandra Czajkowska – urlop wychowawczy

Pracownia Mikrobiologii Pracownicy służby zdrowia: Mgr Ewa Mik - kierownikMgr Anna Kuziak Tech. Bożena Wasilewska

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej (ZIHiT)

1) Pracownia Konsultacyjna Immunologii Krwinek Czerwonych 2) Pracownia Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi3) Pracownia Immunopatologii Ciąży4) Pracownia Genetyki Komorek Krwi i Chimeryzmu 5) Pracownia Niedokrwistości Uwarunkowanych Genetycznie6) Pracownia Grup Krwi i Prób Zgodności

Samodzielny pracownik nauki:Prof. dr hab. Ewa Brojer – kierownikAdiunkci:Dr Katarzyna GuzDr Agnieszka OrzińskaDr Małgorzata UhrynowskaPracownicy służby zdrowia:Dr Monika Majewska-WierzbickaMgr Pamela Bartoszewicz Mgr Justyna BednarzMgr Justyna DudaMgr Agnieszka GierszonMgr Anna GłówkaMgr Ewa Gołaszewska Mgr Honorata HukowskaMgr Anna KiszłoMgr Edyta Klimczak-JajorMgr Magdalena KrzemieniowskaMgr Katarzyna KuzioraMgr Patrycja ŁopaczMgr Hanna Łopieńska Mgr Magdalena MichalikMgr Anna MyślińskaMgr Magdalena Ołdak (Piłat)Mgr Justyna PastuszkaMgr Arleta PaźMgr Monika Pelc-Kłopotowska Mgr Joanna PiwońskaMgr Sylwia Purchla-SzepiołaMgr Paula SasimowskaMgr Joanna SkulimowskaMgr Justyna Smolarczyk-Wodzyńska Mgr Ewelina SokółMgr Karolina Surma

Mgr Beata SzczepaniakMgr Jadwiga SzczepaniakMgr Joanna TrybusMgr Beata Wojciechowska Inż. Jadwiga Sak-Budzisz St. techn. Ewa DudnikowTechn. Anna PilzakTechn. Beata SierockaMałgorzata Tratkiewicz - pomoc laboratoryjna

Korzystając z materiału i danych klinicznych uzyskanych w ramach prowadzonego do roku 2017 grantu PREVFNAIT wraz z Uniwersytetem w Tromso podejmiemy: 1. analizę skuteczności opracowanego w ramach grantu schematu diagnostycznego kobiet zagrożonych konfliktem HPA-1a i zaproponujemy schemat ich stosowania (wyniki opublikujemy i przedstawimy na European Symposium on Platelet and Granulocyte Immunobiology i Zjeździe PTG; 2. analizę czynników predykcyjnych alloimmunizacji (złożymy projekt grantu NCN); 3. analizę wpływu przeciwciał na strukturę łożyska (wspólny grant Universitetu Tromsø Platelets and placenta – the new hotspot in fetal-maternal crosstalk).Kontynuować będziemy tworzenie biobanku próbek osób z chorobami i powikłaniami poprzetoczeniowymi wynikającymi z alloimmunizacji, z wrodzonymi i nabytymi niedokrwistościami, dawców krwi o unikalnych fenotypach/genotypach antygenów komórek krwi oraz próbek łożyska od kobiet z przeciwciałami anty-HPA. Wdrożymy metody sekwencjonowania do analizy polimorfizmów genów kodujących antygeny HPA i antygeny grup krwi dla ustalenia podłoża nietypowych wyników serologicznych oraz badania cytometryczne dla ustalania stopnia ekspresji antygenów na krwinkach. Obie metody są konieczne dla wykonywana zadań laboratorium referencyjnego, udzielającego konsultacji i wykonującego badania konsultacyjne dla Polskiej Służby Krwi (zadanie ustawowe dla IHiT). Uzyskane wyniki pozwolą na publikowanie prac w czasopismach transfuzjologicznych. W ramach badań nad immunologią granulocytów zamierzamy ustalić, czy u podłoża utrzymującej się głębokiej granulocytopenii u dzieci poniżej 1 roku życia nie leżą przetrwałe matczyne przeciwciała, będące wynikiem przebytego konfliktu granulocytarnego.Będziemy prowadzić badania nad dalszym udoskonaleniem metod nieinwazyjnej prenatalnej diagnostyki (NIPT) konfliktów matczyno-płodowych w antygenach płytek i erytrocytów determinowanych polimorfizmami SNP, których nie udaje się różnicować techniką real-time PCR. Nowatorskim podejściem będzie technika kroplowego cyfrowego PCR (ddPCR – droplet digital PCR), jako nowa trzecia generacja testów PCR, pozwalająca wykrywać pojedyncze kopie rzadkiego allelu w przewadze allelu dominującego, z bardzo wysoką czułością, sięgającą 0.001%. Dysponując unikalnym materiałem osocza od kobiet ciężarnych z konfliktami zbieranym w biobanku jesteśmy w stanie wykonać i opublikować wyniki tych badań.

Priorytetowe zadania naukowe:

1/ Charakterystyka przeciwciał przeciwgranulocytarnych u dzieci z głęboką granulocytopenią oraz u pacjentów z powikłaniami po przetoczeniu lub przeszczepieniu- różnicowanie allo i autoprzeciwciał.Ustalenie, czy przeciwciała anty-HNA wykrywane u kilkumiesięcznych dzieci z głęboką granulocytopenią i pacjentów mogą być wynikiem przebytego konfliktu granulocytarnego, w badaniach ustalimy swoistość przeciwciał u dziecka i matki lub dawcy/biorcy i sprawdzimy różnice w obecności antygenów pomiędzy matką/dzieckiem lub dawcą/biorcą. Wyniki pracy pozwolą na ustalenie dodatkowych procedur diagnostyki auto- i alloimmunizacji HNA Charakter projektu: badania stosowane.

2/ Doskonalenie metod nieinwazyjnej prenatalnej diagnostyki (NIPT) konfliktów matczyno-płodowych w antygenach płytek i erytrocytów determinowanych polimorfizmami SNP.- NIPT jest kluczowy w diagnostyce konfliktów serologicznych, w celu uniknięcia badań inwazyjnych dla oznaczenia fenotypu/genotypu płodu. Zastosowanie nowoczesnych metod genotypowania (typu NGS lub ddPCR) pozwoli na specyficzne oznaczanie genotypu płodu w przypadkach konfliktów u matek z immunizacją do antygenu kodowanego przez polimorfizmy jednonukleotydoweCharakter projektu: badania stosowane.

3/ Analiza polimorfizmów genów kodujących antygeny HPA i antygeny grup krwi dla ustalenia podłoża nietypowych wyników serologicznych oraz stopnia ekspresji antygenów na krwinkach.- Prawidłowe oznaczenie antygenu lub uzasadnienie jego braku i ustalenie podłoża tych zjawisk jest podstawą badań konsultacyjnych wykonywanych w ZIHiT w ramach zadań ustawowych IHiT w dziedzinie nadzoru nad Służbą Krwi. Badania te były jak dotąd wykonywane w referencyjnych ośrodkach zagranicznych, które obecnie zaczynają działać na zasadzie komercyjnej. Istnieje więc konieczność wdrożenia sekwencjonowania genów kodujących antygeny HPA i grup krwi. ZIHiT jest do tego przygotowany pod względem sprzętowym i merytorycznym.

Charakter projektu: badania stosowane + statutowe obowiązki IHiT wynikające z nadzoru nad laboratoriami immunologii transfuzjologicznej.

4/ Platelets and placenta – the new hotspot in fetal-maternal crosstalk - Badania mają zweryfikować hipotezę, że przeciwciała skierowane do antygenu HPA-1a powodują zmiany histopatologiczne łożyska, które mogą doprowadzać do obniżenia wagi urodzeniowej dzieci Charakter projektu: badania stosowane.Grant Uniwersytetu w Tromso.

Zakład Wirusologii (ZW)

1) Pracownia Badań Weryfikacyjnych2) Pracownia Wirusologii Klinicznej3) Pracownia Kontroli Jakości i Analiz

Samodzielny pracownik nauki:Prof. nadzw. dr hab. Piotr Grabarczyk - kierownikPracownicy służby zdrowia:Mgr Anna ChrzanowskaMgr Aleksandra DołęgaMgr Aleksandra KalińskaMgr Katarzyna Koligot (zastępstwo)Mgr Aneta KopaczMgr Dorota Kubicka-RusselMgr Grzegorz LiszewskiMgr Ewa Noceń Mgr Anna PotępaMgr Joanna SierzegaMgr Ewa SulkowskaMgr Justyna ŚledźMgr Katarzyna TkaczukMgr Aleksandra Wójtowicz (zastępstwo)Mgr Paulina ZwolińskaZofia Grzywacz

Aktywność naukowa Zakładu Wirusologii IHiT w 2018 roku będzie się koncentrować wokół analizy sytuacji epidemiologicznej oraz doskonalenia metod badań przeglądowych oraz diagnostycznych w zakresie czynników zakaźnych przenoszonych przez krew. Analizom epidemiologicznym będą podlegały zakażenia Treponema pallidum(TP) oraz parvowirusem B19V u dawców krwi. W przypadku pierwszego czynnika zakaźnego będzie to pierwsze tego typu badanie, które pozwoli na szczegółową ocenę rozpowszechnienia i zapadalności na TP wśród dawców krwi. Badania te będą służyć udoskonaleniu kwalifikacji dawców krwi, algorytmu badań weryfikacyjnych oraz interpretacji wyników. Przeprowadzona zostanie także analiza zmian ryzyka występowania zakażeń ukrytych HBV oraz latentnych CMV wśród dawców. Podjęta będzie także diagnostyka potencjalnych przypadków TT-HEV. W ramach doskonalenia metod diagnostycznych przeprowadzona zostanie charakterystyka „świeżych” zakażeń zidentyfikowanych w trakcie badań przeglądowych dawców krwi. Tego typu próbki będą użyte do oceny czułości klinicznej testów wykorzystywanych do prowadzenia badań przeglądowych u dawców krwi w Polsce oraz do diagnostyki w IHiT. Opracowywane zostaną wyniki badań dot. czynników warunkujących eliminację lub przetrwanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C we wczesnej fazie zakażenia. Analizowane będą: zmienność genetyczna wirusa oraz odpowiedź immunologiczna (grant NCN we współpracy z prof. M. Radkowskim z WUM).

Finansowanie badań ZW w 2018 roku: środki na działalność statutową IHiT.Współfinansowanie: planowane projekty w dużej mierze będą opierały się na analizie wyników rutynowych badań diagnostycznych/przeglądowych.

Priorytetowe projekty naukowe:„Badanie czynników warunkujących eliminację lub przetrwanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) we wczesnej fazie zakażenia: wpływ zmienności genetycznej wirusa oraz odpowiedzi immunologicznej”- został szczegółowo opisany w Planie naukowym IHiT na rok 2015.Charakter projektu - badania podstawowe.Instytucja i rodzaj konkursu, do którego była adresowana aplikacja – NCN, grant Opus, badania będą prowadzone we współpracy z prof. M. Radkowskim (Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski, Zakład Immunopatologii Chorób Zakaźnych i Pasożytniczych), Pracownicy ZW IHiT w projekcie występują w roli wykonawców badań (w tym kierownik ZW w roli głównego wykonawcy).

W 2018 roku podjęta zostanie próba pozyskania środków z NCN lub z NCBiR na system analizy sytuacji epidemiologicznej czynników zakaźnych przenoszonych przez krew (badanych rutynowo u dawców krwi oraz tzw. emerging pathogens).Drugim tematem, który warto podjąć jest charakterystyka wirusologiczna i analiza stanu klinicznego osób z ukrytym zakażeniem HBV.

Zakład Immunogenetyki (ZI)1) Pracownia Zgodności Tkankowej2) Pracownia Doboru Dawców Komórek Krwiotwórczych

Samodzielny pracownik nauki:Prof. nadzw. dr hab. Jacek Nowak– kierownik Pracownicy służby zdrowia:Dr n. med. Urszula SzlendakMgr Renata Mika-Witkowska Mgr Marta Rogatko-KorośMgr Joanna DziopaMgr Daria PawliczakMgr Aleksandra DrapałaMgr Marta ZubalaMgr Klaudia NestorowiczMgr Sławomir Gwozdowicz Mgr Elżbieta Graczyk-Pol

Działalność naukowa Zakładu Immunogenetyki w 2018 r. jest kontynuacją działalności prowadzonej w poprzednich latach i obejmuje następujące kierunki:1) Kontynuacja opracowania tematu częstości populacyjnej par HLA/KIR w polskiej populacji. 2) Kontynuacja opracowania tematu znaczenie konstelacji genów KIR i ligandów HLA u dawców i biorców przeszczepu komórek krwiotwórczych. 3) Badania w zakresie ekspresji cząsteczek HLA, poziomu fosfatydyloinozytolu oraz występowania wewnątrzkomórkowych białek biorących udział w apoptozie w zależności od ich związku z nocną napadową hemoglobinurią. 5) Określenie zasad modyfikacji algorytmu doboru niespokrewnionego dawcy krwiotwórczych komórek macierzystych z uwzględnieniem liczby niezgodnych szerokich haplotypów MHC. 6) Określenie zasad modyfikacji algorytmu doboru rodzinnego dawcy krwiotwórczych komórek macierzystych z uwzględnieniem doboru dawcy haploidentycznego, jako alternatywy w przypadku braku zgodnego dawcy rodzinnego i niespokrewnionego.

Priorytetowe projekty naukowe:1. Ocena poziomu fosfatydyloinozytolu i enzymów zależnych od mutacji genu PIG-A w komórkach układu krwiotwórczego u chorych z nocną napadową hemoglobinurią. Przewidywane jest wykonanie analizy przyczyn niejednorodności wyników wstępnych badań aktywacji komórek CD34+ w zakresie obecności enzymu PKB/Akt oraz PI(3,4,5)P3 u chorych z NNH. Wyniki zostaną zgłoszone na konferencji naukowej. Przygotowane zostanie zgłoszenie grantowe do NCBiR. 2. Konstelacja genów KIR i ligandów HLA u dawców i biorców przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych.

Temat znaczenia oddziaływań HLA-KIR jest godzien dalszego opracowania w Zakładzie Immunogenetyki z następujących powodów: Komórki NK posiadają zdolność eradykacji komórek nowotworowych i zakażonych wirusem. Wskutek wielkiej złożoności integracji sygnałów przez komórkę NK potencjał tych komórek nie jest dotychczas w pełni rozumiany i wykorzystywany w terapii. Oprócz aktywacji i hamowania komórek NK coraz bardziej dostrzegane są inne elementy integracji sygnałów, takie jak pozytywna i negatywna edukacja dzięki ligacji odpowiednio, hamujących i aktywujących receptorów (KIR, NKG2 i innych). Dotychczasowe dane doświadczalne i kliniczne wskazują, że hamowanie komórek NK zachodzi dopiero po wstępnej aktywacji tych komórek i odbywa się poprzez przerwanie szlaków aktywacyjnych w obrębie synapsy immunologicznej. Natomiast pozytywna i negatywna edukacja NK jest prawdopodobnie procesem ciągłym zachodzącym podczas nieustannego skriningu zdrowych komórek organizmu przez komórki NK bez tworzenia trwałej synapsy immunologicznej. Złożoność integracji sygnałów docierających do komórki NK polega również na tym, że zarówno hamowanie jak i pozytywna edukacja są wynikiem ligacji tych samych par HLA: hamujący KIR, a ligacja aktywującego KIR z HLA skutkuje (słabą) aktywacją oraz negatywną edukacją komórek NK. Złożoność integracji sygnałów przez komórki NK jest dodatkowo zwiększona przez oddziaływanie innych aktywujących receptorów, jak NKp30, NKp44, NKp46 i innych, których ligandy mają niską lub zerową ekspresję na „zdrowych” komórkach pacjenta. Ligandy tych receptorów o zwiększonej ekspresji pojawiają się na komórkach transformowanych i to one najsilniej indukują aktywację NK. Scenariusz ten był możliwy do nakreślenia dzięki wielu podstawowym badaniom transfekcyjnym dotyczącym pojedynczych par receptor ligand oraz badaniom klinicznym, w których niespokrewniony dawca różnił się od biorcy KKM oddziaływaniem pojedynczej pary HLA-KIR, w tym kilku naszym badaniom opublikowanym w międzynarodowych czasopismach. W transplantacjach haploidentycznych różnice oddziaływań HLA-KIR przed i po przeszczepieniu mogą być znacznie bardziej skomplikowane w związku z niezgodnością kilku ligandów HLA i wielu receptorów KIR. Uchwycenie tej złożoności może być wstępem do dalszego porządkowania wiedzy nt. eradykacji nowotworów przez komórki NK dawcy, a w konsekwencji do racjonalnej selekcji haploidentycznego dawcy przeszczepu komórek krwiotwórczych lub dawcy komórek NK do terapii adoptywnej. Może to zaowocować skuteczniejszym leczeniem transplantacyjnym niektórych nowotworów. Finansowanie. W związku z rozpisaniem przez Poltransplant nowego konkursu na dobór haploidentycznego dawcy KKM w 2017 r. w zakresie genów HLA, przewiduje się, że znaczna część badań KIR będzie ponadstandardowo wykonywana za zgodą i przy finansowaniu przez Poltransplant. Dane kliniczne będą pochodziły z ośrodków współpracujących z IHiT.

Klinika Hematologii (KH)

1) Oddział Diagnostyki Hematologicznej2) Oddział Chorób Układu Krwiotwórczego3) Oddział Chorób Układu Chłonnego4) Oddział Intensywnej Opieki Hematologicznej5) Poradnia Hematologiczna

Samodzielni pracownicy nauki:Prof. dr hab. Krzysztof Warzocha - kierownikProf. dr hab. Ewa Lech-Marańda - z-ca kierownika Prof. dr hab. Krzysztof Jamroziak - kierownik Oddziału Chorób Układu ChłonnegoProf. nadzw. dr hab. Joanna Góra-Tybor - kierownik Oddziału Chorób Układu KrwiotwórczegoProf. nadzw. dr hab. Ilona Seferyńska - kierownik Oddziału Intensywnej Opieki HematologicznejAdiunkci:Dr Bożena Budziszewska - kierownik Oddziału Diagnostyki HematologicznejDr Agata MalendaAsystenci:Lek. Joanna BarankiewiczLek. Agnieszka KołkowskaLek. Elżbieta PatkowskaPracownicy służby zdrowia:Dr Bartosz PułaDr Aleksandra GołosDr Elżbieta MądroDr Ewa Mendek-CzajkowskaLek. Monika ChełstowskaLek. Monika Dąbrowska - kierownik Poradni HematologicznejLek. Anna EjdukLek. Małgorzata JarzembowskaLek. Agnieszka KońskaLek. Kinga Kos-Zakrzewska Lek. Beata Kwaśniak Lek. Wioletta MakowskaLek. Anna PaczekLek. Aleksander Salomon-PerzyńskiLek. Joanna Sawczuk-ChabinLek. Urszula WalczakLek. Joanna WasilewskaLek. Kamil WiśniewskiLek. Ewa Zaczek

W 2018 roku planowana jest kontynuacja wdrażania i optymalizacji nowych metod diagnostycznych oraz nowych metod leczenia nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego. Większość nowych metod terapii będzie realizowana w ramach badań prowadzonych we współpracy z Polską Grupą ds. Leczenia Białaczek u Dorosłych (PALG), Polską Grupą Badawczą Chłoniaków (PLRG), Polską Grupą Szpiczakową (PGSz) oraz Polskim Konsorcjum Szpiczakowym (PKSz) – stowarzyszeniem powołanym w 2014 r., którego celem jest propagowanie rozwoju badań klinicznych inicjowanych przez badacza dotyczących terapii szpiczaka plazmocytowego (SzP) w Polsce.Wdrażanie nowych metod leczniczych będzie realizowane w ramach badań klinicznych sponsorowanych prowadzonych w Klinice oraz badań klinicznych własnych prowadzonych w ramach PALG. Najważniejsze badania dotyczące nauk podstawowych, które będą prowadzone przez pracowników Kliniki w 2018 roku przedstawiono poniżej.

Priorytetowe projekty naukowe:1. „Heterogenność klonalna szpiczaka plazmocytowego: ewolucja i implikacje terapii celowanej” (Grant ERA-NET TRANSCAN 2).Kierownikiem jest prof. dr hab. n. med. K. Jamroziak

2. „Znaczenie mutacji kinazy PIM-1 w progresji przewlekłej białaczki limfocytowej” (Sonata 11, NCN). Kierownikiem jest dr n. med. Bartosz Puła.

Klinika Transplantacji Komórek Krwiotwórczych (KTKK)

1) Oddział Kliniczny 2) Poradnia Potransplantacyjna

Adiunkci:Dr Kazimierz Hałaburda – kierownik Dr Barbara Nasiłowska-AdamskaDr Agnieszka TomaszewskaPracownik służby zdrowia:lek. Magdalena Tormanowska

W 2018 r. i w latach kolejnych będą podejmowane i kontynuowane zagadnienia badawcze dotyczące różnych aspektów transplantacji komórek krwiotwórczych. Dotyczyć będą diagnostyki i zapobiegania powikłań potransplantacyjnych oraz postępowania eksperymentalnego polegającego na profilaktycznym przeszczepianiu flory jelitowej u biorców alogenicznych komórek krwiotwórczych od dawców rodzinnych. Kolejne zagadnienie będzie dotyczyć wpływu wyjściowej kolonizacji przewodu pokarmowego bakteriami lekoopornymi na wczesne wyniki przeszczepień alogenicznych, a w szczególności na powikłania infekcyjne oraz przeżywalność chorych. Następna planowana analiza będzie dotyczyła wpływu mutacji genetycznych i aberracji chromosomowych na wyniki alotransplantacji u chorych na ostre białaczki szpikowe (w tym znaczenie nadekspresji genu BAALC, dotychczas nie analizowane u chorych po alotransplantacjach).Ważnym zagadnieniem będzie prospektywne badanie dotyczące przeszczepień autologicznych u chorych na szpiczaka mnogiego, polegające na porównaniu wyników przeszczepień pojedynczych i tandemowych. Kolejnym planowanym tematem będzie skuteczność sekwencyjnej wysokodozowanej chemioterapii z przeszczepieniem autologicznych komórek krwiotwórczych u chorych na nawrotowe i oporne nowotwory z komórek rozrodczych (we współpracy z Kliniką Nowotworów Układu Moczowego COI).

Priorytetowe projekty naukowe:1. „Przeszczepianie flory jelitowej i alogenicznych komórek krwiotwórczych od dawców rodzinnych chorym poddawanym transplantacjom.” Opis i cel projektu: Prawidłowa flora jelitowa ma podstawowe znaczenie w homeostazie organizmu ludzkiego (funkcje metaboliczne, strukturalne, ochronne i in.). Jej istotne zaburzenia stwierdza się w szeregu chorób, począwszy od infekcyjnych, poprzez autoimmunizacyjne, kończąc na otyłości. Znaczenie prawidłowego mikrobiomu jelitowego w regulacji odpowiedzi immunologicznej zaczęto dostrzegać niedawno. Szczególnie istotną rolę mają niektóre rodzaje beztlenowców, które hamują rozwój odpowiedzi zapalnej.Udowodniono, że zaburzenia składu mikrobiomu (zmniejszenie różnorodności, zanikanie niektórych beztlenowców) istotnie zwiększa ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD – Graft versus Host Disease) i śmiertelności po allotransplantacjach, a nawet ryzyko nawrotu choroby zasadniczej. Większość chorych poddawanych alloprzeszczepieniom komórek krwiotwórczych ma istotnie zaburzony mikrobiom jelitowy na

skutek wcześniejszej chemioterapii, antybiotykoterapii oraz kolonizacji bakteriami lekoopornymi. W projekcie planowana jest korekta składu flory jelitowej za pomocą przeniesienia od zdrowego osobnika, będącego jednocześnie dawcą komórek krwiotwórczych. Skład mikrobiomu jelitowego dawcy i biorcy będzie analizowany przez sekwencjonowanie podjednostki 16S rybosomu w próbkach kału. Skuteczność korekcji mikrobiomu zostanie oceniona po trzykrotnym przeniesieniu od dawcy przed transplantacją. Po regeneracji hematologicznej po przeszczepieniu procedura zostanie powtórzona.Jednocześnie planowana jest u chorych seryjna ocena biomarkerów we krwi charakterystycznych dla GvHD oraz stężenia indykanu w moczu (odzwierciedlenie metabolizmu bakterii beztlenowych). Wyniki zostaną skorelowane z danymi klinicznymi obejmującymi przede wszystkim częstość i nasilenie GvHD, śmiertelność związaną z procedurą oraz częstość nawrotów. Przeprowadzenie u chorych korekcji flory jelitowej przy pomocy materiału pobranego od dawców komórek krwiotwórczych potencjalnie powinno zredukować częstość i nasilenie GvHD oraz korzystnie wpłynąć na przebieg procedury transplantacyjnej. Planowane jest włączenie do badania około 30 chorych w ciągu 3 lat. Przed złożeniem wniosku o grant planowane jest przeprowadzenie badania pilotażowego u kilku chorych.Charakter projektu: badanie podstawowe i stosowane.Instytucja i rodzaj konkursu, do którego zostanie adresowana aplikacja: NCN.

Klinika Zaburzeń Hemostazy i Chorób Wewnętrznych (KZHiChW)

1) Oddział Zaburzeń Hemostazy2) Oddział Chorób Wewnętrznych3) Poradnia Kinezyterapii

Samodzielny pracownik nauki:Prof. dr hab. Jerzy Windyga – kierownikAdiunkt:Dr Anna SikorskaPracownicy służby zdrowia:Dr Magdalena Górska-KosickaDr Robert WasilewskiLek. Anna BuczmaLek. Adela GwozdowskaLek. Sławomir JurekLek. Joanna Falkowska (rezydent) – urlop wychowawczy

Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych (ZHiChM)

1) Pracownia Hemostazy2) Pracownia Choroby von Willebranda3) Pracownia Porfirii

Samodzielni pracownicy nauki:Prof. dr hab. Jerzy Windyga - kierownik Prof. dr hab. Ksenia BykowskaPracownicy służby zdrowia:Dr Agnieszka LipniackaDr Edyta OdnoczkoDr Beata BaranMgr Ewelina Ejchman-Pac – urlop wychowawczy Mgr Anna BućkoMgr Anna CyrtaMgr Ewelina KaniugaTechn. Anna MoszczyńskaSt. techn. Irena Kamińska

Działalność naukowa Kliniki i Zakładu dotyczy różnych problemów hemostazy, skaz krwotocznych i zakrzepic oraz porfirii. W 2018 r. prowadzone będą badania w głównych tematach nr 3 i 4 Planu naukowego IHiT. Kontynuowane projekty to: 1) Ocena tromboelastometrycznych właściwości skrzepu oraz maksymalnego stężenia i potencjału generowanej trombiny u polskich pacjentów z rzadko występującymi wrodzonymi niedoborami czynników krzepnięcia krwi oraz

2) Patogenezanabytej choroby von Willebranda (AVWS) u chorych z nadpłytkowością samoistną (ET) na podstawie analizy klinicznej oraz laboratoryjnej oceny niedoboru czynnika von Willebranda, aktywacji płytki krwi, stopnia generacji trombiny i częstości występowania czynników ryzyka zakrzepicy.Nowe projekty to: 1) Analiza związku stężenia inhibitora szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego, potencjału trombinowego osocza i mutacji sprawczej w genie F8 lub F9 z nasileniem objawów skazy krwotocznej u nosicielek hemofilii A i B; 2) Optymalizacja rozpoznawania i leczenia zaburzeń hemostazy – trombofilii, wrodzonych i nabytych mikroangiopatii zakrzepowych, hemofilii, hemofilii powikłanej inhibitorem, choroby von Willebranda, rzadkich skaz krwotocznych pokrewnych hemofilii oraz udoskonalanie metod laboratoryjnych monitorowania antykoagulantów oraz diagnozowania i monitorowania leczenia chorych na porfirię i pacjentów z nocną napadową hemoglobinurią.

Priorytetowy projekt naukowy – Temat nowy: „Analiza związku stężenia inhibitora szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego, potencjału trombinowego osocza i mutacji sprawczej w genie F8 lub F9 z nasileniem objawów skazy krwotocznej u nosicielek hemofilii A i B”.Opis i cel projektu: Hemofilia A (HA) i B (HB) to jedne z najczęściej rozpoznawanych wrodzonych skaz krwotocznych. U ich podłoża leży brak, niedobór lub dysfunkcja czynnika krzepnięcia VIII (Factor VIII, FVIII) w przypadku HA, bądź czynnika krzepnięcia IX (Factor IX, FIX) w przypadku HB. Zarówno gen kodujący FVIII (F8), jak i gen kodujący FIX (F9), zlokalizowane są na chromosomie X, dlatego HA i HB dziedziczą się w sposób recesywny sprzężony z płcią, przez co chorują mężczyźni, a kobiety są nosicielkami. Nasilenie objawów skazy krwotocznej w hemofilii jest determinowane przez stopień niedoboru FVIII/FIX w osoczu. Wyróżnia się postać ciężką hemofilii (gdzie FVIII/FIX wynosi <1 j.m./dl), umiarkowaną (FVIII/FIX 1-5 IU/dl) oraz łagodną (FVIII/FIX >5-40 IU/dl). U zdrowych osób aktywność zarówno FVIII, jak i FIX wynosi 50-150 j.m./dl. U większości nosicielek HA lub HB aktywność FVIII lub FIX wynosi około 50% normy, co sprawia, że nosicielstwo hemofilii przebiega zwykle w tej grupie kobiet bezobjawowo. Jednak u części z nich obserwuje się nadmierną skłonność do krwawień oraz skłonność do krwawień pourazowych, a nawet spontanicznych. Większość kobiet obarczonych hemofilią nie znajduje się pod opieką ośrodków zajmujących się tą skazą krwotoczną, dlatego niewiele jest danych odnośnie realnego nasilenia u nich objawów skazy krwotocznej, skłonności do powikłań krwotocznych czy niepowodzeń położniczych. U chorych na hemofilię wytwarzanie trombiny jest osłabione z powodu braku FVIII lub FIX. Dlatego ciekawe jest to w jakim stopniu osłabienie tego procesu dotyczy nosicielek hemofilii, gdyż być może to ma związek z występowaniem u nich mniej lub bardziej nasilonych objawów skazy krwotocznej. Proces wytwarzania trombiny in vitro można śledzić za pomocą pomiaru generacji trombiny (Thrombin Generation Assay, TGA)bądź jej endogennego potencjału (Endogenous thrombin potential, ETP). Potencjalnym modyfikatorem procesu wytwarzania trombiny jest inhibitor szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego (Tissue factor pathway inhibitor, TFPI). Zaburzenia TFPI mogą utrudniać wytworzenie dostatecznej ilości trombiny co upośledza kolejne etapy procesu krzepnięcia. Ponieważ niewiele jest danych jak ten modulator procesu krzepnięcia wpływa na skłonność do

krwawień u nosicielek hemofilii A i B, dlatego zagadnienie to wydaje się być bardzo interesujące. Innowacyjność proponowanego projektu polega m.in. na tym, że po raz pierwszy zostanie przeprowadzona analiza związku potencjalnego wpływu stężenia TFPI i mutacji sprawczej hemofilii na proces generacji trombiny u nosicielek hemofilii A i B oraz ich związku ze skłonnością do krwawień w tej grupie kobiet, dlatego zasadne wydaje się być podjęcie tego zadania. Badaniem zostanie objętych około 50 nosicielek hemofilii A i B, od których zostanie zebrany szczegółowy wywiad odnośnie przebiegu skazy krwotocznej. Główne cele projektu to: 1) Zbadanie, czy istnieje zależność pomiędzy przebiegiem klinicznym skazy krwotocznej u nosicielek hemofilii A i B ze stężeniem TFPI, potencjałem trombinowym osocza, aktywnością FVIII lub FIX mierzonej metodą koagulacyjną i chromogenną oraz mutacją odpowiedzialną za wystąpienie choroby w rodzinie. 2) Określenie wpływu osoczowego stężenia TFPI na proces generacji trombiny w badanej populacji nosicielek hemofilii A i B.3) Analiza związku stężenia TFPI i potencjału trombinowego osocza z wynikami pomiaru aktywności i antygenu FVIII lub FIX mierzonej metodą koagulacyjną i chromogenną.4) Uzyskanie wyników w/w badania pilotażowego, które staną się podstawą aplikowania o grant zewnętrzny.Charakter projektu: badanie podstawowe.Inne(poza NCN i NCBiR) potencjalne źródła finansowania: częściowo oznaczenia zostaną wykonane w ramach świadczeń kontraktowanych z NFZ oraz na rzecz podmiotów prywatnych w ramach badań komercyjnych.

Klinika Chirurgii Ogólnej, Onkologicznej i Metabolicznej (KChO)1) Oddział Chirurgii Ogólnej2) Oddział Chirurgii Onkologicznej i Metabolicznej3) Pracownia Endoskopowa4) Poradnia Chirurgiczna

Samodzielny pracownik nauki:Prof. dr hab. Andrzej Szczepanik – kierownikAdiunkt:Dr Konrad Pielaciński Pracownicy służby zdrowia:Prof. dr hab. Marek DedecjusDr Sławomir HuszczaDr Wojciech JaśkowiakDr Andrzej MisiakLek. Wojciech DąbrowskiLek. Sławomir GajdaLek. Daria IwaniukLek. Michał Kuryłowicz

Rozpoczęta zostanie prospektywna, kontrolowana praca nad zastosowaniem autologicznego, mrożonego kleju fibrynowego w chirurgii tarczycy. Oceniony zostanie wpływ kleju na krwawienie pooperacyjne, przebieg gojenia rany, a także powikłania infekcyjne.Prowadzone będą prace nad optymalizacją leczenia chirurgicznego chorych ze schorzeniami hematologicznymi, zwłaszcza ze skazami krwotocznymi. Prace będą dotyczyły operacji wykonywanych metodą laparoskopową w nowotworach układu moczowego u chorych z hemofilią A i B oraz chorobą von Willebranda. Operacje nowotworów złośliwych u chorych na hemofilie i pokrewne skazy krwotoczne obarczone są ryzykiem powikłań krwotocznych, pomimo właściwie prowadzonego leczenia substytucyjnego. Podkreślona zostanie konieczność wykonywania powyższych operacji w referencyjnych ośrodkach dysponujących doświadczonym mutlidyscyplinarnym zespołem.Przedstawione zostaną doniesienia o nie opisanym dotąd w literaturze przypadku ropni śledziony jako powikłania wszczepienia sztucznej komory serca Heart Ware® u chorego oczekującego na zabieg transplantacji serca, a także praca o leczeniu krwawienia z pseudoguza hemofilowego przy pomocy unikatowej metody endoskopowej koagulacji argonowej krwawiącego naczynia tętniczego we wnętrzu pseudoguza z dostępu przez kanał przetoki.

Klinika Chirurgii Naczyniowej (KChN)

1) Oddział Chirurgii Naczyniowej2) Poradnia Chirurgii Naczyniowej

Samodzielny pracownik nauki:Prof. nadzw. dr hab. Piotr Szopiński – kierownikAdiunkt:Dr Eliza PlebanAsystent:Dr Adam WiszniewskiPracownicy służby zdrowia:Dr Marcin JanasDr Jacek MichalakDr Maciej StrygaLek. Radosław BilskiLek. Tomasz DobrowolskiLek. Marcin Sitarz

Działania naukowe Kliniki w 2018 r. będą obejmowały przygotowanie materiałów i kontynuację prac związanych z prowadzeniem trzech projektów badawczych. Kontynuowane będą prace w ramach projektu „Zastosowanie stent-graftów w leczeniu tętniaków aorty piersiowej i brzusznej” oraz „Zastosowanie protez biologicznych u chorych z zakażeniem lub wysokim ryzykiem zakażenia pomostu naczyniowego”. W ramach przewodu doktorskiego prowadzone będą badania z tematu „Ocena wyników odległych angioplastyki tętnic podudzia przy użyciu cewników balonowych pokrytych paclitaxelem u chorych na cukrzycę”.Organizowane będą przez Zespół Kliniki szkolenia indywidualne oraz cykliczne warsztaty z zakresu chirurgii naczyniowej dla lekarzy z Polski i zagranicy oraz dla pielęgniarek.

Temat 1 „Hematologia a zdrowie publiczne”

Temat 2 „Bezpieczna krew”

KARTA PRACY PLANOWEJ nr 2.1 2/001/2018(PRACA NOWA)

Epidemiologia czynników zakaźnych przenoszonych przez krew

Wstęp: Dotychczasowe analizy przeprowadzone w Zakładzie Wirusologii wykazały, że w latach 2005-2015 doszło do istotnych zmian w epidemiologii czynników zakaźnych przenoszonych przez krew. W przypadku wirusów zapalenia wątroby typu B (HBV) i C (HCV) obserwowano spadek rozpowszechnienia zakażeń wśród dawców, natomiast w przypadku HIV odnotowuje się trend rosnący. Zapadalność w przypadku HCV jest stabilna, w przypadku HBV istotnie się zmniejsza, natomiast rośnie w przypadku HIV. Obserwowane zmiany mają wpływ na wielkość teoretycznego ryzyka zakażeń związanych z tzw. „okienkiem diagnostycznym”. Dużo trudniejsze jest oszacowanie ryzyka przeniesienia tzw. OBI (ukrytego zakażenia HBV) oraz zakażeń latentnych CMV. Ten typ zakażeń jest istotny nie tylko w krwiodawstwie, ale także w transplantologii i onkologii, ponieważ mogą one podlegać reaktywacji w czasie choroby podstawowej lub podczas leczenia np. immunosupresyjnego. Do oszacowania ryzyka przeniesienia tego typu infekcji lub ich reaktywacji wskazana jest analiza markerów przebytego zakażenia. Dotychczas nie analizowano wykrywalności markerów zakażenia Treponema pallidum oraz wpływu dyskwalifikacji dawców zakażonych B19V na dostępność krwi. Wskazana jest weryfikacja obecnych rekomendacji dotyczących postępowania z dawcą zakażonym B19V w świetle najnowszych opisów przypadków przeniesienia tego wirusa przez składniki krwi oraz w kontekście polskich obserwacji epidemiologicznych i charakterystyki wirusologicznej zakażeń B19V u dawców krwi.Innym ważnym źródłem zakażeń przenoszonych przez krew są tzw. emerging pathogens. Ich szerzenie się ma coraz częściej przebieg gwałtowny i jest związane z łatwością podróżowania oraz zmianami klimatycznymi. W badaniach ZW IHiT wykazano, że rozpowszechnienie wirusa HEV, dotychczas uważanego za problem epidemiologiczny Azji i Afryki, w naszym kraju jest największe w Europie. W związku z tym, konieczna jest ocena konsekwencji niekorzystnej sytuacji epidemiologicznej dla bezpieczeństwa transfuzji.

Hipoteza badawcza: Na terenie Polski dochodzi do zmiany sytuacji epidemiologicznej w zakresie czynników zakaźnych przenoszonych przez krew – zarówno tych badanych rutynowo u dawców krwi, jak i tzw. emerging pathogens.Hipotezy szczegółowe do weryfikacji:1. maleje liczba zakażeń latentnych HBV i CMV;2. w przypadku TP, tak jak w przypadku zakażenia HIV rośnie rozpowszechnienie i zapadalność;3. konsekwencją wysokiego rozpowszechnienia zakażeń HEV jest występowanie potransfuzyjnych przypadków przeniesienia zapalenia wątroby typu E.

Cele badania:- Analiza epidemiologii czynników zakaźnych przenoszonych przez krew.

Plan realizacji projektu i metodyka:- Badanie anty-HBc oraz anty-CMV w grupach wiekowych dawców krwi, których próbki pobierane były w odstępach dziesięcioletnich.- Analiza wiremii, polimorfizmu oraz markerów serologicznych w przebiegu zakażenia B19V u dawców krwi. - Analiza wykrywania anty-TP u dawców krwi.- Analiza markerów zakażenia HEV u dawców i biorców krwi w przypadku podejrzenia TT-HEV (ang. transfusion transmitted HEV).

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Jeśli maleje częstość markerów świadczących o przebytym HBV, może to świadczyć o zmniejszaniu się ryzyka reaktywacji/przeniesienia OBI. W przypadku CMV taki trend epidemiologiczny z jednej strony wskazywałby na zmniejszenie ryzyka reaktywacji/przeniesienia zakażenia latentnego i jednocześnie na wzrost ryzyka zakażeń pierwotnych. Takie zmiany mogą prowadzić do zwiększenia trudności doboru dawców zgodnych serologicznie z biorcą. Pogorszenie sytuacji epidemiologicznej w odniesieniu TP, a w szczególności w zakresie zapadalności wskazywałoby na konieczność prowadzenia badań wyłącznie testami o najwyższej czułości (np. EIA). Dokonana zostanie aktualizacja obowiązujących obecnie rekomendacji dotyczących postępowania z dawcą zakażonym B19V.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane

Referencje: Nico Lelie, Roberta Bruhn, Michael Busch, Marion Vermeulen, Wai-Chiu Tsoi, Steven Kleinman, and

the International NAT Study Group Detection of different categories of hepatitis B virus (HBV) infection in a multi-regional study comparing the clinical sensitivity of HBsAg and HBV DNA testing. Transfusion2017;57;24–35

Sulkowska E, Kubicka-Russel D, Liszewski G, Kopacz A, Łętowska M. Grabarczyk P, Molecular and serological markers of hepatitis E virus infection (HEV) in Polish blood donors. 34th International Congress of the ISBT, Dubai, United Arab Emirates, September 3 - 8, 2016

Okres realizacji pracy: 2018-2020.Zadania do wykonania w 2018 roku: Analiza wykrywania markerów TP oraz B19V u dawców krwi w latach 2005-2015, zbadanie anty-CMV oraz anty-HBc u dawców w latach 2008 i 2018.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Praca przygotowana do druku.Wykonawcy: P. Grabarczyk, A. Kopacz, D. Kubicka-Russel, G. Liszewski, E. Sulkowska, A. Chrzanowska, J. Śledź, A. Kalińska, M. Łętowska, A. Dołęga, K. Hałaburda, A. Tomaszewska


Doskonalenie badań przeglądowych i diagnostycznych czynników zakaźnych przenoszonych przez krew

Wstęp: Wykrywanie czynników zakaźnych przenoszonych przez krew u dawców krwi oraz u pacjentów obejmuje dwa etapy: badanie testem przeglądowym/przesiewowym oraz weryfikacja wyniku powtarzalnie reaktywnego. Z dotychczasowych badań, również przeprowadzonych w ZW IHiT wynika, że testy przeglądowe pomimo wysokiej deklarowanej przez producenta czułości analitycznej charakteryzują się odmienną czułością kliniczną w odniesieniu do różnych form polimorficznych czynników zakaźnych. Ponadto, wynik ostateczny zależy od metodyki oraz algorytmu procedury weryfikacyjnej.W proponowanym projekcie badawczym zamierzamy dokonać charakterystyki wirusologicznej zakażeń identyfikowanych u dawców wielokrotnych oraz tzw. zakażeń okienkowych (WP – ang. window period). W obu przypadkach do zakażenia doszło w nieodległej przeszłości (w przypadku dawcy wielokrotnego po ostatniej ujemnej donacji, w przypadku WP w ostatnich tygodniach). Zatem próbki tego rodzaju reprezentują zakażenia szerzące się obecnie w polskiej populacji. Analiza ich wykrywania przy pomocy stosowanych lub wprowadzanych testów umożliwia ocenę czułości klinicznej badań prowadzonych na terenie naszego kraju.W ostatnich latach dopracowanie algorytmu badań weryfikacyjnych zwiększyło m.in. efektywność identyfikacji dawców seronegatywnych zakażonych HBV. Dotychczas nie oceniono skuteczności algorytmu badań weryfikacyjnych w kierunku TP (Treponema pallidum). W przypadku wirusa HEV w Polsce istnieje istotny brak dostępu do diagnostyki oraz wiedzy na temat metod identyfikacji osób zakażonych.

Hipoteza badawcza: Poprzez zmianę metod prowadzenia badań przeglądowych i weryfikacyjnych oraz doskonalenie sposobu kontroli jakości możliwe jest poprawienie skuteczności/efektywności identyfikacji zakażeń.

Cele badania:- Charakterystyka wirusologiczna świeżych zakażeń wirusami przenoszonymi przez krew w celu oceny czułości klinicznej testów przeglądowych i diagnostycznych/potwierdzenia.- Weryfikacja algorytmu wykrywania/potwierdzania zakażenia TP.- Opracowanie algorytmu postępowania diagnostycznego zakażenia HEV w Polsce.

Plan realizacji projektu i metodyka:- Badania molekularne i serologiczne próbek dawców zakażonych w niedawnym czasie (zakażenia u dawców wielokrotnych oraz tzw. zakażenia okienkowe) HCV, HBV i HIV.- Analiza wyników badań przeglądowych w kierunku TP u polskich dawców krwi oraz weryfikacja dotychczasowego algorytmu badań potwierdzających.- Opracowanie postępowania diagnostycznego HEV na terenie naszego kraju.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:- Aktualizacja bazy próbek używanych do sprawdzianów kontroli jakości wykrywania HCV, HBV i HIV oraz ocena czułości klinicznej testów przeglądowych stosowanych w polskim krwiodawstwie.- Weryfikacja algorytmu wykrywania zakażenia TP.- Opracowanie optymalnego postępowania diagnostycznego zakażenia HEV (badania serologiczne i molekularne).


Referencje:- Grabarczyk P, Koppelman M, Boland F, Sauleda S, Fabra C, Cambie G, Kopacz A, O’Riordan K, van Drimmelen H, O’Riordan J, Lelie N. Inclusion of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) in a multiplex transcription mediated amplification assay does not affect detection of HIV-1 and hepatitis B and C virus genotypes: A multi-Center performance evaluation study. Transfusion 2015; 55: 2246–2255. - Kopacz A, G.Liszewski, D.Kubicka-Russel, E.Sulkowska, Roth K, Lelie N, Grabarczyk P Enhancing sensitivity of HBV DNA confirmatory testing to discriminate between true and false repeat reactive NAT screening results. Vox Sanguinis 2015, 109, S1: P-387.

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Charakterystyka wirusologiczna donacji od zakażonych HCV, HBV, HIV dawców wielokrotnych oraz donacji w tzw. okienku serologicznym, ocena czułości klinicznej testów przeglądowych, analiza wyników badań weryfikacyjnych w polskim krwiodawstwie w latach 2015-2016, analiza piśmiennictwa oraz wyników własnych badania HEV.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Praca przygotowana do druku.Wykonawcy: A. Kopacz, P. Grabarczyk, E. Sulkowska, D. Kubicka-Russel, G. Liszewski, A. Kalińska, P. Zwolińska, E. Noceń


Analiza polimorfizmów genów kodujących antygeny HPA i antygeny grup krwi dla ustalenia podłoża nietypowych wyników serologicznych oraz badanie ekspresji tych genów

na krwinkach

Wstęp: Prawidłowe oznaczenie antygenu lub podłoża jego braku ekspresji jest podstawą dochodzenia przyczyny immunizacji danym antygenem. Z uwagi na liczne polimorfizmy współtowarzyszące polimorfizmom SNP, które w większości odpowiadają za występowanie zmienności antygenów płytek krwi i erytrocytów, może dojść do sytuacji, kiedy taki dodatkowy polimorfizm wpływa na zmianę epitopu antygenowego i wtedy przeciwciała monoklonalne i/lub poliwalentne, o swoistości skierowanej do tego epitopu, nie wykrywają antygenu, choć on jest obecny. Sekwencjonowanie eksomowe umożliwia zlokalizowanie mutacji i analizę jej wpływu na ekspresję swoistości antygenowej. Z drugiej strony brak antygenu może wynikać z tzw. fenotypu null (dotyczy to niektórych układów grup krwi, brak ekspresji jakichkolwiek antygenów z danego układu), który powodują różne polimorfizmy w obrębie genu. Jedynie sekwencjonowanie genów umożliwia dojście przyczyny braku ekspresji antygenu, z szansą na znalezienie mutacji powtarzających się w populacji, czyli możliwych do przetransponowania na inną technikę ich oznaczania. ZIHiT widzi potrzebę wdrożenia sekwencjonowania genów kodujących antygeny HPA i grup krwi. Jako laboratorium referencyjne wykonujące badania konsultacyjne styka się z potrzebą bezpośredniego sekwencjonowania pacjentów/dawców krwi z nietypowymi wynikami serologicznymi, głównie dotyczącymi braku ekspresji antygenów. Posiada w zasobie tworzonego biobanku unikatowe próbki, wymagające zidentyfikowania podłoża braku ekspresji (głównie antygeny układu Rh, Jra, Fy, ABO). Jest to naturalna kontynuacja 2 planów naukowych: rzadkich grup (2.6/2017) i biobanku (3.2/2017) oraz badań konsultacyjnych w ramach Służby Krwi. Dodatkowo konieczne jest uzupełnienie zakresu analiz o badania cytometryczne w celu ustalania koncentracji antygenów na krwinkach. Także w trakcie badań przeglądowych antygenu HPA-1a zidentyfikowano 2 nietypowe przypadki rozbieżności fenotypowania antygenu HPA-1a przeciwciałem Sz21 (HPA-1a ujemna) i genotypowania (HPA-1a/b). Prawidłowe oznaczenie antygenu HPA-1a jest kluczowe dla identyfikacji ciąż zagrożonych konfliktem HPA-1a odpowiedzialnym za 85% alloimmunologicznej małopłytkowości płodów-noworodków (AIMPN). Przy takiej rozbieżności typowania powstaje pytanie, czy taka osoba jest narażona na immunizację, bo ma osłabioną ekspresję antygenu czy nie. Identyfikacja mutacji umożliwia teoretyczną analizę jej wpływu na ekspresję i jest podstawą do planowania projektów udowadniających zmianę konformacji epitopu (ekspresja w liniach komórkowych) i podatności na immunizację (modele zwierzęce). Jedna pacjentka została w ramach grantu PREVFNAIT zbadana przez zespół współpartnera z UiT w Tromso (heterozygota T/C w pozycji 196, definiującej antygeny HPA-1a/b i heretozygota z 2 mutacjami G175T i C176T w 2 eksonie w pozycji cis w allelu kodującym antygen HPA-1a, wprowadzające substytucję C26F na poziomie białka). Druga pacjentka ma zabezpieczony materiał i czeka na analizę. W grupie kobiet HPA-1a ujemnych z PREVFNAIT zidentyfikowano też kilka pacjentek o nietypowanych wynikach przeciwciał (na granicy wykrywania w teście MAIPA; wykrywane testem Luminex, a nie

wykrywane MAIPA lub brak przeciwciał, a mimo to u noworodka wylew do OUN). Być może przyczyną takiego obrazu jest dodatkowy polimorfizm w obrębie genu – sekwencjonowanie eksonowe umożliwi weryfikację tej hipotezy. Geny kodujące antygeny HPA i większość układów grupowych krwinki czerwonej są wieloeksonowe, zatem ich sekwencjonowanie na poziomie DNA wymaga wdrożenia technik sekwencjonowania metodą Sangera w formacie płytki 96-dołkowej. Dobór starterów jest obecnie bardzo ułatwiony, bo istnieją katalogi zwalidowanych par primerów przeznaczonych do sekwencjonowania genomu człowieka. Są też podwaliną opracowywania paneli genów w technologii NSG, jako punkt odniesienia. Oprócz tego wdrożone zostanie sekwencjonowanie na poziomie mRNA o ile będzie dostęp do próbki spełniającej wymogi zabezpieczenia RNA.

Hipoteza badawcza: Dodatkowe polimorfizmy mogą zaburzać rozpoznawanie epitopu antygenowego, definiowanego przez polimorfizm SNP, przez przeciwciała rozpoznające swoiście antygen lub zaburzać ekspresję takiego antygenu. Sekwencjonowanie eksomowe pozwala identyfikować takie mutacje i dochodzić przyczyn całkowitego braku ekspresji w przypadku tzw. fenotypów null. Badania techniką FACS pozwolą na określenie liczby cząsteczek antygenu na krwince.

Cele badania: 1/ Sekwencjonowanie eksomowe dla identyfikacji mutacji wpływających na zmianę epitopów antygenowych lub brak ich ekspresji (podłoże fenotypów null) w wybranych genach, kodujących antygeny HPA i grup krwi. 2/ Badania cytometryczne dla ustalenia liczby cząsteczek na krwinkach w w/w przypadkach.

Plan realizacji projektu i metodyka: Sekwencjonowanie metodą Sangera w formacie 96-płytek następujących genów:- ITGB3 i ITGA2B (kodujące glikoproteinę GPIIbIIIa) u 10 osób (2 pacjentki z rozbieżnym typowaniem antygenu HPA-1a z PREVFNAIT; 4 pacjentki z PREVFNAIT z nietypowymi przeciwciałami anty-HPA-1a; 4 próbki dawców o różnych genotypach HPA-1,3);- ABCB6 (koduje antygen LAN), ABCG2 (koduje antygen Jr), AB0 z pacjentów/dawców z zasobu biobanku IHiT (na razie łącznie ok 30 osób);- wdrożenie sekwencjonowania innych genów kodujących antygeny grup krwi i HPA w miarę potrzeby;- wdrożenie analizy ekspresji metodą cytometryczną.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Opracowanie warsztatu do sekwencjonowania genów kodujących antygeny HPA i grup krwi dla laboratorium referencyjnego. Publikacje dotyczące wykrycia nietypowych mutacji w próbkach zgromadzonych w biobanku ZIHiT oraz PREVFNAIT. Opracowanie warsztatu badania ekspresji genów na krwinkach metodą FACS, wykonywanie tych badań w przypadkach próbek krwi przesyłanych do konsultacji i publikowanie wyników.

Referencje: Brojer E, Husebekk A, Dębska M, Uhrynowska M, Guz K, Orzińska A, Dębski R, Maślanka K.

Fetal/Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia: Pathogenesis, Diagnostics and Prevention.Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2016 Aug;64(4):279-90

Guz K, Krzemienowska M, Orzińska A, Uhrynowska M, Maślanka K, Woźniewska D, Nowak G, Brojer E. [The +24G>del polymorphism in the intron 3 of ITGB3 gene in the diagnostic region of HPA-1a allele genotyping: consequences and verification methods]. J Transf Med 2013; 6: 33-40.

Keller MA. The role of red cell genotyping in transfusion medicine. Immunohematology. 2015;31(2):49-52.

Schoeman EM, Lopez GH, McGowan EC, Millard GM, O'Brien H, Roulis EV, Liew YW, Martin JR, McGrath KA, Powley T, Flower RL, Hyland CA. Evaluation of targeted exome sequencing for 28 protein-based blood group systems, including the homologous gene systems, for blood group genotyping. Transfusion. 2017 Apr;57(4):1078-1088. doi: 10.1111/trf.14054

McBean RS, Hyland CA, Flower RL.Approaches to determination of a full profile of blood group genotypes: single nucleotide variant mapping and massively parallel sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 2014 Sep 23;11(19):147-51. doi: 10.1

Polin H, Pelc-Kłopotowska M, Danser M, Suessner S, Gabriel Ch, Wilflingseder J, Zmudzin A, Orzińska A, Guz K, Michalewska B, Brojer E.: Compound heterozygosity of two novel RHAG allele leads to a considerable disruption of Rh complex. Transfusion, 2016 vol 56 suppl 950 – 5.

Michalewska B, Olsson ML, Naremska G, Walenciak J, Hult AK, Ozog A, Guz K, Brojer E, Storry JR. FUT1 mutations responsible for the H-deficient phenotype in the Polish population, including the first example of an abolished start codon.Blood Transfus. 2016; 21:1-4. doi: 10.2450/2016.0135-16

Arndt PA, Horn T, Keller JA, Heri SM, Keller MA. First example of an FY*01 allele associated with weakened expression of Fya on red blood cells. Immunohematology. 2015;31(3):103-7

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w 2018 r.:- sekwencjonowanie ITGB3 i ITGA2B (10 osób);- sekwencjonowanie ABCB6 (koduje antygen LAN), ABCG2 (koduje antygen Jr), AB0 z pacjentów/dawców z zasobu biobanku IHiT (łącznie ok. 30 osób);- opracowanie metodyki analizy ekspresji antygenów z układu ABO i Rh.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport, doniesienia na zjeździe ISBT i sympozjum Immunologii Płytek i Granulocytów ESPGI.Wykonawcy: K. Guz, A. Orzińska, J. Skulimowska, M. Pelc-Kłopotowska, A. Gierszon, M. Uhrynowska, M. Krzemienowska, P. Łopacz, J. Spychalska, J. Szczepaniak, E. Brojer

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26564154


Opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny, składnika żelu płytkowego(pilotażowe badania)

Wstęp: Bardzo częstym problemem po przeprowadzeniu różnego rodzaju zabiegów chirurgicznych jest leczenie trudno gojących się ran. Nawet, pomimo rozwoju nowoczesnych technik chirurgicznych oraz poprawy kontroli śródoperacyjnej hemostazy, wciąż trwają poszukiwania idealnego czynnika hemostatycznego. Wprowadzane do użycia syntetyczne materiały bardzo często są przyczyną powstawania reakcji alergicznych u pacjentów. Dlatego też, coraz większym zainteresowaniem cieszą się preparaty opracowane na bazie autologicznej krwi lub jej składników. Preparatem, z którym wiążę się największe nadzieje jest autologiczny żel płytkowy (autologiczne osocze bogato płytkowe i autologiczna trombina). Wartość leczniczą tego preparatu stanowią polipeptydowe czynniki wzrostu uwalniane z płytkowych ziarnistości (gęstych i alfa) po dodaniu trombiny do osocza bogatopłytkowego. Czynniki te przyspieszają gojenie ran, regulują proliferację, chemotaksję oraz mają wpływ na różnicowanie i metabolizm komórek. Rolą czynników wzrostu pochodzenia płytkowego jest spotęgowanie fizjologicznej odpowiedzi, jaka zachodzi podczas gojenia się rany. Ze względu na to, że autologiczne żele płytkowe nie stwarzają ryzyka przeniesienia czynników zakaźnych, nie inicjują reakcji alergicznych, a dodatkowo szybko ulegają resorpcji można stwierdzić, że są one bezpieczne dla pacjenta. W IHiT od lat otrzymywane są i stosowane podstawowe składniki żelu płytkowego, takie jak: autologiczne koncentraty krwinek płytkowych lub osocze bogatopłytkowe. Nadal jednak drugi składnik krwi stanowi komercyjny preparat trombiny otrzymywany ze zlewanego osocza allogenicznego. W związku z powyższym opracowanie metody autologicznej trombiny nie tylko zwiększy bezpieczeństwo, stosowanych preparatów, ale także obniży koszty związane z koniecznością zakupienia trombiny otrzymywanej komercyjnie.

Hipoteza badawcza: Na podstawie analizy piśmiennictwa można stwierdzić, że nie opracowano optymalnej metody otrzymywania autologicznej trombiny. Problemem do rozwiązania w trakcie tej pracy będzie: opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny, a w szczególności dobranie odpowiednich proporcji mieszaniny osocza ubogo komórkowego i chlorku wapnia oraz wybranie optymalnych warunków inkubacji mieszaniny. Na podstawie analizy piśmiennictwa można stwierdzić, że nie opracowano optymalnej metody otrzymywania autologicznej trombiny. Problemem do rozwiązania w trakcie tej pracy będzie: opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny, a w szczególności dobranie odpowiednich proporcji mieszaniny osocza ubogo komórkowego i chlorku wapnia oraz wybranie optymalnych warunków inkubacji mieszaniny.

Cele badania: Celem naszej pracy jest opracowanie metody otrzymywania preparatu autologicznej trombiny, niezbędnej zarówno do aktywacji krwinek płytkowych w osoczu bogatopłytkowym w celu uwalniania czynników wzrostu, jak i zainicjowania procesu tworzenia czopu hemostatycznego.

Plan realizacji projektu i metodyka: Otrzymanie autologicznego osocza bogatopłytkowego (PRP). Otrzymanie koncentratu krwinek płytkowych i osocza ubogokomórkowego (KKP, PPP). Otrzymywanie autologicznej trombiny (osocze ubogokomórkowe, chlorek wapnia). Ocena otrzymanej autologicznej trombiny.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Opracowanie metody otrzymywania autologicznej trombiny znacząco zmniejszy ryzyko wystąpienia niepożądanych reakcji, szczególnie u pacjentów z trudno gojącymi się ranami, u których opatrunki z żelu płytkowego wykonywane są z dużą częstotliwością.Rodzaj pracy: praca rozwojowa.

Referencje:- Rock G., Neurath D., Semple E, Harvey M &Freedman M: Preparation and characterization of human thrombin for use in a fibrin glue. Transfusion Medicine 2007, 17: 187–1.- Silva RF, Álvarez ME, Ríos D, López C, Carmona JU, Rezende CMF: Evaluation of the effect of calcium gluconate and bovine thrombin on the temporal release of transforming growth factor beta 1 and platelet-derived growth factor isoform BB from feline platelet concentrates. BMC VeterinaryResearch 2012, 8, 212.- Franco D., Franco T., Schettino A.M. Joa, Filho MT, Vendramin FS: Protocol for Obtaining Platelet-Rich Plasma (PRP), Platelet-PoorPlasma (PPP), and Thrombin for Autologous Use. AesthPlastSurg (2012) 36:1254–1259.- Man D, Plosker H, Winland-Brown JE (2001) The use of autologous platelet rich plasma (platelet gel) and autologous plateletpoor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. PlastReconstrSurg107:229–237.- Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, CampanatiB, Moroni M, Carabelli A (2004) Platelet gel for healing cutaneouschronic wounds. TransfusApherSci 30:151–154.- Zimmermann R, Jakubietz R, Jakubietz M, Strasser E, Schlegel A, A, Wiltfang J, Eckstein R: Different preparation methodsto obtain platelet components as a source of growth factors forlocal application. Transfusion 2001, 41:1217–1224.- Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, CampanatiB, Moroni M, Carabelli A (2004) Platelet gel for healing cutaneouschronic wounds. TransfusApherSci 30:151–154. Rock G., Neurath D., Semple E, Harvey M &Freedman M: Preparation and characterization of human thrombin for use in a fibrin glue. Transfusion Medicine 2007, 17: 187–1.- Silva RF, Álvarez ME, Ríos D, López C, Carmona JU, Rezende CMF: Evaluation of the effect of calcium gluconate and bovine thrombin on the temporal release of transforming growth factor beta 1 and platelet-derived growth factor isoform BB from feline platelet concentrates. BMC VeterinaryResearch 2012, 8, 212.- Franco D., Franco T., Schettino A.M. Joa, Filho MT, Vendramin FS: Protocol for Obtaining Platelet-Rich Plasma (PRP), Platelet-PoorPlasma (PPP), and Thrombin for Autologous Use. AesthPlastSurg (2012) 36:1254–1259.- Man D, Plosker H, Winland-Brown JE (2001) The use of autologous platelet rich plasma (platelet gel) and autologous plateletpoor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. PlastReconstrSurg107:229–237.- Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, CampanatiB, Moroni M, Carabelli A (2004) Platelet gel for healing cutaneouschronic wounds. TransfusApherSci 30:151–154.- Zimmermann R, Jakubietz R, Jakubietz M, Strasser E, Schlegel A, A, Wiltfang J, Eckstein R: Different preparation methodsto obtain platelet components as a source of growth factors forlocal application. Transfusion 2001, 41:1217–1224.- Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, CampanatiB, Moroni M, Carabelli A (2004) Platelet gel for healing cutaneouschronic wounds. TransfusApherSci 30:151–154.

Okres realizacji pracy: 2018 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Całość pracy.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Praca przygotowana do druku.

Wykonawcy: E. Lachert, J. Kubis, J. Antoniewicz-Papis, A. Rosiek, B. Baran, M. ŁętowskaKARTA PRACY PLANOWEJ nr 2.5 2/005/2018

(PRACA NOWA)Analiza zjawisk i tendencji występujących w polskim krwiodawstwie

w okresie dziesięcioletnim

Wstęp: Odpowiednie do potrzeb zaopatrzenie w krwi jej składniki stanowi podstawę prawidłowego funkcjonowania krwiolecznictwa. Wraz z intensywnym rozwojem nauk medycznych coraz więcej specjalności medycznych stosuje metody leczenia wymagające stosowania składników krwi. Są to m.in. skomplikowane zabiegi chirurgiczne, przeszczepienia narządów i komórek krwiotwórczych, leczenie wielu chorób układu krwiotwórczego i nowotworów. Konieczność zapewnienia odpowiedniego zabezpieczenia w krew i jej składniki prowadzi do zwiększenia ich zużycia, generując tym samym rosnące zapotrzebowanie na krew. Sprawne zaopatrzenie w krew i jej składniki stanowi jeden z zasadniczych warunków sprawnego funkcjonowania systemu opieki zdrowotnej i podstawowy cel działania polskiej służby krwi. Śledzenie zmian zachodzących w kolejnych latach funkcjonowania krwiodawstwa i krwiolecznictwa oraz analizowanie występujących problemów należy do istotnych zadań Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w ramach nadzoru merytorycznego sprawowanego nad jednostkami organizacyjnymi publicznej służby krwi.Jednocześnie składniki krwi stosowane w krwiolecznictwie muszą spełniać odpowiednie parametry jakościowe. Zadaniem systemu zapewnienia jakości wdrożonego w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi (JOPSK) jest monitorowanie wszystkich etapów procesu otrzymywania składników krwi. Jednym z elementów tego systemu jest kontrola jakości składników krwi. W przypadku, gdy ponad 25% badanych składników krwi nie spełnia zakresu normy, należy bezzwłocznie podjąć działania naprawcze i zapobiegawcze polegające przede wszystkim na weryfikacji całego procesu otrzymywania składników krwi.Do prawidłowej oceny systemu krwiodawstwa i krwiolecznictwa niezbędna jest także analiza zużycia składników krwi do celów klinicznych. Nadmierne i często niezasadne zamawianie i krzyżowanie KKCz do planowych operacji chirurgicznych, a także niezgodne ze wskazaniami jego stosowanie w połączeniu z dążeniem do zmniejszenia niepotrzebnych kosztów leczenia determinują podejmowanie działań prowadzących do optymalizacji leczenia krwią w tej specjalności medycznej. Do podjęcia takich działań obliguje także zjawisko zmniejszającej się liczby dawców krwi i zasobów krwi. Proces obsługi transfuzjologicznej operacji jest bardziej złożony niż typowego leczenia krwią pacjentów niezabiegowych. Na świecie obserwowana jest bardzo duża zmienność zużycia krwi w oddziałach chirurgicznych. Od wielu lat tworzone są programy zużycia i zamawiania maksymalnej liczby j. KKCz do planowych zabiegów chirurgicznych, tzw. MSBOS (Maximum Surgical Blood Ordering Schedule). Istotnym ich założeniem pozostaje stworzenie listy zabiegów operacyjnych wymagających „standardowego zamówienia” określonej liczby j. KKCz. Opracowanie takiego MSBOS jest użyteczne w rutynowej praktyce, gdyż sprzyja zamówieniu i krzyżowaniu właściwej liczby j. KKCz do określonego rodzaju operacji. Może też prowadzić do zmniejszenia kosztów leczenia krwią, poprzez zmniejszenie m.in. liczby wykonanych prób zgodności do planowych zabiegów.

Hipoteza badawcza: Działalności polskiej służby krwi towarzyszą zjawiska i tendencje, mogące w sposób istotny wpływać na dostępność i bezpieczeństwo krwi i jej składników. Niektóre z obserwowanych zależności mają charakter lokalny, inne natomiast stanowią element zjawisk o zasięgu globalnym, stanowiąc niekiedy element długoterminowych tendencji. Zachodzące zmiany mogą w sposób istotny wpływać na dostępność i bezpieczeństwo krwi i jej składników. Należy założyć, że analiza badań kontroli jakości składników krwi umożliwi nie tylko ocenę ich jakości, a w konsekwencji wartości leczniczej, ale także pozwoli ocenić procesy zachodzące w JOPSK. Systematyczne porównanie wyników badań kontroli jakości składników krwi otrzymanych w JOPSK pozwoli ocenić stopień wdrożenia systemu zapewnienia jakości w JOPSK. Liczba krzyżowanych i niewykorzystanych jednostek KKCz w klinikach chirurgii IHiT do planowych operacji wydaje się zbyt duża. Koszty ponoszone na wykonywanie prób zgodności mogą być zbyt wysokie i niepotrzebnie zawyżać koszty leczenia pacjentów chirurgicznych.

Cele badania:1. Analiza zjawisk i tendencji występujących w polskim krwiodawstwie w okresie dziesięcioletnim.2. Działalność jednostek organizacyjnych służby krwi w Polsce w 2017 roku.3. Kontrola jakości składników krwi w latach 2015-2016.4. Ocena zużycia koncentratu krwinek czerwonych (KKCz) w planowych operacjach chirurgicznych w okresie jednego roku (2018).

Celem badania jest analiza podstawowych wskaźników działania jednostek organizacyjnych polskiej służby krwi w okresie dziesięcioletnim i w roku 2017 porównaniu z wynikami obserwacji z lat wcześniejszych, przy uwzględnieniu w szczególności tendencji dotyczących:

obserwowanych zmian liczby aktywnych krwiodawców, odsetka dawców pierwszorazowych i wielokrotnych, najczęściej stosowanych metod donacji, miejsc przeprowadzania pobrań krwi pełnej (centra krwiodawstwa, oddziały terenowe,

ekipy), liczby donacji autologicznych, rodzajów pozyskiwanych składników krwi, wykorzystania poszczególnych składników krwi do celów klinicznych, zakresu stosowania dodatkowych metod preparatyki składników krwi (leukoredukcja,

napromieniowanie), działań mających na celu zwiększenie bezpieczeństwa składników krwi, problemów związanych z zagrożeniami charakterze globalnym (nowo pojawiające się

czynniki zakaźne), niektórych zmian organizacyjnych służby krwi.

Celem pracy jest także prześledzenie wyników badań kontroli jakości składników krwi otrzymywanych w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi w latach 2015-2016.W odniesieniu do oceny zużycia krwi określono następujące cele badania:

- analiza ilościowego zużycia KKCz w każdym rodzaju planowej operacji przeprowadzanej w IHiT na podstawie ogólnie przyjętych wskaźników transfuzjologicznych, tj. liczby zamówionych i przetoczonych KKCz oraz liczby skrzyżowanych i niewykorzystanych KKCz,- identyfikacja zabiegów chirurgicznych, do przeprowadzenia których krzyżowany jest KKCz, stworzenie listy tych zabiegów z kategoryzacją (podziałem na kategorie zabiegów dużego, średniego i niewielkiego/żadnego, tj. nie wymagającego krzyżowania krwi zużycia),- analiza danych klinicznych i laboratoryjnych pacjentów przed zabiegiem (wiek, płeć, choroba podstawowa będąca wskazaniem do operacji, choroby współistniejące oraz parametry morfotyczne krwi).

Plan realizacji projektu i metodyka:Analiza retrospektywna danych przesyłanych przez JOPSK w postaci rocznych sprawozdań z działalności w okresie dziesięcioletnim. Wykorzystane zostaną dane zgłoszone wg ujednoliconego wzoru (szczegółowy formularz), opracowanego przez IHiT wspólnie z Narodowym Centrum Krwi (NCK). Analiza retrospektywna wyników badań kontroli jakości składników krwi otrzymywanych w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi w latach 2015-2016 z uwzględnieniem danych zawartych w protokołach opracowanych po kontrolach tych jednostek.Prospektywna analiza zużycia KKCz w zabiegach u pacjentów Klinik Chirurgicznych. Oceniane będzie zużycie krwi w trakcie samej operacji i okołooperacyjne, tj. wyłącznie w dniu, w którym operacja była wykonywana. Ponadto dodatkowo zostaną opracowane przypadki konieczności przetaczania KKCz w kolejnych dobach po zabiegu, w sytuacji zaistnienia takiej potrzeby. Skalkulowane zostaną powszechnie stosowane współczynniki poprawności transfuzji, w tym CT tj. crossmatch/transfusion - współczynnik skrzyżowanych do rzeczywiście przetoczonych jednostek KKCz. Utworzona zostanie lista zabiegów z określeniem ilościowego zużycia krwi. Analiza zostanie przeprowadzona w oparciu bazę danych pacjentów Klinik Chirurgicznych oraz dokumentację Banku Krwi. Praca będzie wykonywana przy współpracy lekarzy Bloku Operacyjnego, Kliniki Chirurgii Ogólnej i Naczyniowej.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Dokonanie analizy zasadniczych tendencji związanych z funkcjonowaniem jednostek organizacyjnych polskiej służby krwi w okresie dziesięcioletnim i w minionym roku oraz porównanie uzyskanych wniosków z obserwacjami pochodzącymi z innych krajów może stanowić podstawę identyfikacji niekorzystnych zjawisk oraz opracowania metod zaradczych, a w konsekwencji umożliwić usprawnienie działania polskiego krwiodawstwa i krwiolecznictwa i poprawę zaopatrzenia podmiotów leczniczych w bezpieczną krew i jej składniki.Przeprowadzenie analizy wyników badań kontroli jakości składników krwi w latach 2015-2016 może służyć jako punkt wyjścia do odpowiedzi na pytanie, czy i w jaki sposób zmiany zachodzące w procesie pobierania krwi, preparatyki oraz przechowywania wpływają na jakość otrzymanych składników krwi. Dodatkowo analiza ta pozwoli odpowiedzieć na pytanie, które procesy (pobierania krwi, preparatyki, przechowywania) lub metody badań stosowane w procesie kontroli jakości

składników krwi powinny być doskonalone oraz które procesy powinny być objęte systematycznym, przypominającym cyklem szkoleń.Ustalone zostanie rzeczywiste zużycie KKCz do określonego zabiegu. Pozwoli to na zamawianie/krzyżowanie właściwej liczby j.KKCz do określonej operacji. We współpracy z klinikami chirurgicznymi mogą zostać opracowane ogólne wytyczne do zamawiania określonej liczby krwi.Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane.Referencje:- Dyrektywa 2002/98/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 27 stycznia 2003 r., ustanawiająca normy jakości i bezpiecznego pobierania, testowania, przetwarzania, przechowywania i dystrybucji krwi ludzkiej i składników krwi oraz zmieniająca dyrektywę 2001/83/WE- European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM). Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15, wyd. 18, 2015.- Łętowska, M. (red.). Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa, 2014.- Ustawa dnia 22 sierpnia 1997 r. o publicznej służbie krwi (Dz. U. Nr 106, poz. 681 z późn. zmian.).- Whitaker B., Rajbhandary S., Kleinman S. i wsp. Trends in United States blood collection and transfusion: results from the 2013 AABB Blood Collection, Utilization, and Patient Blood Management Survey. Transfusion 2016; 56 (9): 2173–2183.- Stramer S.L., Hollinger F.B., Katz L.M. i wsp. Emerging infectious disease agents and their potential threat to transfusion safety. Transfusion 2009; 49 (suppl.): 1S–29S.- Pogłód R., Rosiek A., Grabarczyk P., Łętowska M. Charakterystyka podstawowych wskaźników dotyczących krwiodawstwa i krwiolecznictwa w Europie — aktualne wyzwania i działania. J.Trans. Med. 2015; 8 (2): 60–77.- Thomas RAB , Daniels H, J. Duncan J. Blood Transfusion in General Surgery; MSBOS guidelines are accurate and can decrease blood wastage.IntJ Surg. 2010; 8, 7; 559 .- Frank, S. M., I wsp. (2013). Optimizing preoperative blood ordering with data acquired from an anesthesia information management system.Anesthesiology 2013; 118: 1286-1297.- The Sanguis Study Group.Use of red blood cells for elective surgery in 43 European hospitals. Transfusion Medicine1994; 4, 251–268. - Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components Recommendation No. R (95) 15, 19th Edition.- Devine D. V., Chen D.: A fresh look at measuring quality in blood components. ISBT Science Series 2014, 9, 148–154.- Fischer J. C., Moog R., GiersG.:Quality control of leucocyte-reduced blood components: overestimation of WBC content due to nucleated red blood cells. VoxSanguinis 2012, 102, 79–81.- Schrezenmeier H., Seifried E.: Buffy-coat-derived pooled platelet concentrates and apheresis platelet concentrates: which product type should be preferred? VoxSanguinis 2010, 99, 1–15.- Chabanel A., Andreu G., Carrat F., Hervé P.: Quality control of leucoreduced cellular blond components in France. VoxSanguinis 2002, 82, 67–71. - Heddle NM, LiuY, Barty R. Factors affecting the frequency of red blood cell outdates: anapproach to establish benchmarking targets. Transfusion, 2009;49:219–226.- Begic D , Mujicic E , JozoCoric J i wsp. Analysis of the Blood Consumption for Surgical Programs. Med Arch. 2016; 70: 248–251. - Mahar FK , Moiz B , Khurshid M , Chawla T . Implementation of Maximum Surgical Blood Ordering Schedule and an Improvement in Transfusion Practices of Surgeons subsequent to Intervention. Indian J Hematol Blood Transfus. 2013; 29: 129–133.- Yazer MH, Alcantara R, Beizai P i wsp.The Crossmatch/Issue Ratio: Use of a Novel Quality Indicator and Results of an International Survey on RBC Crossmatching and Issuing Practices. Am J ClinPathol August 2016;146:238-243.Okres realizacji pracy: 2018 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Całość pracy.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3710564/


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chawla%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24426357

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khurshid%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24426357

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moiz%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24426357

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mahar%20FK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24426357


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coric%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27703282

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mujicic%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27703282

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Begic%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27703282

Forma rozliczenia pracy: Praca przygotowana do druku.Wykonawcy: A. Rosiek, A. Tomaszewska, E. Lachert, J. Antoniewicz-Papis, J. Kubis, M. Grzegorek, A. Ostas, A. Wiszniewski, S. Gajda, A. Mikołowska, M. Łętowska

Temat 3 „Komórkowe i molekularne składniki krwi w stanach zdrowia

i choroby”

KARTA PRACY PLANOWEJ nr 3.1 3/001/2017(PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.4 w Planie Naukowym 2017)

Zastosowanie protez biologicznych u chorych z zakażeniem lub wysokim ryzykiem zakażenia pomostu naczyniowego

Wstęp: Coraz większa liczba chorych poddanych rekonstrukcji naczyniowej z wykorzystaniem protezy sprawia, że do ośrodków naczyniowych nadal trafiają chorzy, u których rozpoznaje się zakażenia protez naczyniowych. Opisywana w literaturze częstość powikłań infekcyjnych po operacjach naczyniowych wynosi 1–10%, przy czym infekcje wszczepionej protezy dotyczą 1–3% operowanych chorych. Istotny wydaje się także fakt stosunkowo częstego występowania późnych zakażeń protezy, często wiele miesięcy lub lat po wykonanej operacji naczyniowej. Infekcja protezy naczyniowej jest nadal jednym z największych wyzwań dla chirurga naczyniowego. Konieczność usunięcia protezy i wykonania rekonstrukcji naczyniowej w środowisku zakażonym, przy często bardzo złym stanie ogólnym chorego, wynikającym zarówno z zaawansowania schorzeń współistniejących, jak i powikłań samej infekcji, istotnie wpływają na wyniki leczenia. Mimo coraz doskonalszych biomateriałów, profilaktyki antybiotykowej oraz rosnącego doświadczenia chirurgicznego, dotychczas nie udało się wyeliminować całkowicie powikłań infekcyjnych po zabiegach naczyniowych, zarówno w okresie wczesnym, jak i odległym. Ciągle brakuje idealnego sposobu leczenia infekcji protez naczyniowych. Niezadowalające wyniki leczenia, polegającego na miejscowym opanowywaniu zakażenia, stosowaniu pomostów pozaanatomicznych i wymianie zakażonej protezy naczyniowej na protezy o zwiększonej oporności na infekcję, stanowiły podstawę do podjęcia prób klinicznych wykorzystania materiału biologicznego. Do rekonstrukcji naczyń używa się zarówno tętnic, jak i żył chorego, a także żył lub tętnic pobranych od dawcy narządów. Zastosowanie materiału tkankowego w miejsce substancji syntetycznej ułatwia proces gojenia ogniska zapalnego. W przypadku przeszczepów allogenicznych, dodatkowym problemem jest ich antygenowość i konieczność stosowania immunosupresji. Wprowadzenie operacji pozaanatomicznych, zastosowanie homograftu, protez nasączanych roztworami antybiotyków lub pokrywanych srebrem czy też wykorzystanie w rekonstrukcji w środowisku zakażonym żył układu głębokiego kończyn, mimo poprawy wyników, nadal wiąże się ze znacznym odsetkiem powikłań śmiertelnych i amputacji. W ostatnich latach pojawiły się dwa rodzaje protez biologicznych, które stanowią alternatywę dla stosowanych dotychczas sposobów leczenia. Pierwsze produkowane są z osierdzia wołowego poddawanego detoksyfikacji, sieciowaniu i utrwalaniu poprzez stabilne wiązanie z glutaraldehydem z użyciem heparyny, drugie to protezy biosyntetyczne kalogenowe.

Hipoteza badawcza: Celem pracy jest retrospektywna i prospektywna ocena zastosowania protez biologicznych u chorych z zakażeniem lub wysokim ryzykiem zakażenia pomostu naczyniowego.

Dotychczasowa realizacja celów badania:

Dotychczas wszczepiono trzy protezy No-React w segmencie aortalno-biodrowym oraz 26 protez Omniflow w segmencie aortalno-biodrowym i udowo-podkolanowym. Wyniki leczenia w obu grupach są bardzo obiecujące.Plan realizacji projektu i metodyka:

Oceniane będą wyniki bliskie i odległe leczenia chorych z zakażeniem lub wysokim ryzykiem zakażenia pomostu naczyniowego w segmencie aortalno-biodrowym oraz poniżej więzadła pachwinowego, z użyciem protez osierdziowych No-React oraz biosyntetycznych kolagenowych Omniflow;

W każdym przypadku badany będzie czynnik etiologiczny zakażenia (posiew oraz antybiogram), rozległość zakażenia, ryzyko operacyjne;

Po zabiegu pacjenci będą otrzymywać profilaktykę przeciwzakrzepową oraz przedłużoną antybiotykoterapię celowaną;

Wyniki leczenia oceniane będą na podstawie badania przedmiotowego z dokładną oceną gojenia ran pooperacyjnych i owrzodzeń stanowiących źródło zakażenia (o ile będą występować) oraz badań obrazowych (ultrasonografia, tomografia komputerowa w opcji naczyniowej);

Dotychczas wszczepiono dwie protezy No-React w segmencie aortalno-biodrowym oraz 21 protez Omniflow w segmencie aortalno-biodrowym i udowo-podkolanowym;

Wyniki leczenia w obu grupach są bardzo obiecujące.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Nie są planowane modyfikacje planu realizacji projektu.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Oba rodzaje protez wykazują dużą odporność na zakażenia. Biorąc pod uwagę niezadowalające wyniki leczenia chorych z zakażeniem protezy naczyniowej dotychczasowymi metodami (reperacje z użyciem pomostów pozaanatomicznych, wykorzystaniem allograftów, homograftów i protez nasączanych jonami srebra) możliwość wykorzystania tego rodzaju materiału powinno w znaczący sposób poprawić wyniki leczenia chorych z zainfekowanych graftem lub z wysokim ryzykiem zakażenia protezy przy operacji pierwotnej.


Referencje: Ziaja K, Urbanek T, Bursig H. Homograft w leczeniu infekcji protez naczyniowych — wyniki wczesne

i odległe. Polski Przegląd Chirurgiczny 2003; 75, 5: 460–473. Sharp WJ, Hoballah JJ, Mohan CR et al. The management of the infected aortic prosthesis: a current

decade of experience. J Vasc Surg. 1994; 19: 844–850. Chiesa R, Astore D, Frigerio S et al. Vascular prosthetic graft infection: epidemiology, bacteriology,

pathogenesis, treatment. Acta Chirurgica Belg. 2002; 102: 238–247. Seeger JM, Pretus HA, Burress Welborn M et al. Long term outcome after treatment of aortic graft

infection with staged extranatomical by-pass grafting and aortic graft removal. J Vasc Surg. 2000; 32: 451–461.

Bandyk DF, Novotney ML, Back MR et al. Expanded application of in situ replacement for prosthetic graft infection. J Vasc Surg. 2001; 34: 411–419.

Nevelsteen A, Lacroix H, Suy R. Autogenous reconstruction with the lower extremity deep veins: an alternative treatment of prosthetic graft infection after reconstructive surgery for aortoiliac disease. J Vasc Surg. 1995; 22: 129–134.

Naylor AR. Regarding “limitations in use of rifampicin-gelatin grafts agains virulent organisms”. J Vasc Surg. 2002; 35: 823–824.

Zegelman M, Gunther G. Prosthetic arterial graft infection mandates graft removal but treatment with another silver impregnated Dacron graft may be curative. Proc 29th Annual Veith Symposium. New York 2002; XIX 8.1–8.3.

Bandyk DF, Novotney ML, Johnson BL et al. Use of rifampicin — soaked gelatin — sealed polyster grafts for in situ treatment of primary aortic and vascular prosthetic infections. J Surg Res. 2001; 95: 44–49.

Pirelli S, Arii V, Bozzani A et al. Aortic graft infections: treatment with arterial allograft. Transplantation Proceedings 2005; 37: 2694–2696.

Kieffer E, Bahnini A, Koskas F et al. In situ allograft replacement of infected infrarenal aortic prosthetic grafts: results in forty three patients. J Vasc Surg. 1993; 17: 349–356.

Brown PM Jr, Kim VB, Lalikos JF et al. Autologus superficial femoral vein reconstruction in infected fields. Ann Vasc Surg. 1999; 13: 32–36.

Harris JP, Sheil AG, Stephen MS. Lession learnt in the management of aorto-enteric fistulae. J Cardiovascular Surg Torino 1987; 28: 449–452.

Scorate AM, Rosati L, Locati P. Surgical treatment of aortoenteric fistulas. Minerva Cardioangiologica 2001; 49: 37–45.

Szilagyi ED, Smith RF, Elliott JP et al. Infection of arterial reconstruction with synthetic graft. Ann Surg. 1972; 176: 321–333.

Bunt TJ. Synthetic vascular graft infections. I. Graft infections. Surgery 1983; 93, 6: 733–746. Bunt TJ. Synthetic vascular graft infections. II. Graft — enteric erosions and graft — enteric fistulas.

Surgery 1983; 94: 1–9. Töpel I, Betz T, Uhl C, Wiesner M et al. Use of biosynthetic prosthesis (OmniflowII®) to replace

infected infrainguinal prosthetic grafts--first results. Vasa. 2012;41:215-20 Wiltberger G, Matia I, Schmelzle M et al. Mid- and long-term results after replacement of infected

peripheral vascular prosthetic grafts with biosynthetic collagen prosthesis. J Cardiovasc Surg (Torino). 2014;55:693-8

Bozoglan O, Mese B, Eroglu E et al. Which prosthesis is more resistant to vascular graft infection: polytetrafluoroethylene orOmniflowII biosynthetic grafts? Surg Today. 2016;46:363-70

Grohmann J, Höhn R, Fleck T et al. No-React® Injectable BioPulmonic™ valves re-evaluated: discouraging follow-up results. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2015;21:657-65

Pozostały okres realizacji pracy: 2018-2019 r.Zadania do wykonania w 2018 roku: Dalsze opracowywanie danych z zabiegów i obserwacji odległej chorych. Przygotowanie publikacji i doniesień zjazdowych. Przygotowanie kursów dla chirurgów naczyniowych.Forma rozliczenia pracy w 2018 r. Raport.Wykonawcy: E. Pleban, P. Szopiński, J. Michalak, T. Dobrowolski, M. Stryga, M. Janas, R. Bilski, M. Sitarz, A. Wiszniewski

KARTA PRACY PLANOWEJ nr 3.2 3/005/2016(PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.5 w Planie Naukowym 2017PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.5 w Planie Naukowym 2016)

Patogeneza nabytej choroby von Willebranda (AVWS) u chorych z nadpłytkowością samoistną (ET) na podstawie analizy klinicznej oraz laboratoryjnej oceny niedoboru

czynnika von Willebranda, aktywacji płytki krwi, stopnia generacji trombiny i częstości występowania czynników ryzyka zakrzepicy

Wstęp: Obraz kliniczny nabytej choroby von Willebranda (Acquired von Willebrand Syndrome, AVWS) jest podobny do wrodzonej choroby von Willebranda (VWD). Podłożem AVWS może być upośledzenie syntezy czynnika von Willebranda (VWF), pojawienie się przeciwciał, degradacja przez enzymy proteolityczne, absorbcja lub wiązanie się z komórkami krwi. AVWS pojawia się w przebiegu chorób o podłożu immunologicznym, bardzo często towarzyszy chorobom mieloproliferacyjnym w tym nadpłytkowości samoistnej (ET, essential thrombocythemia).Uważa się, że podłożem skazy krwotocznej u chorych z AVWS w przebiegu ET jest niedobór czynnika von Willebranda (VWF) spowodowany absorbcją VWF na płytkach krwi i szybkim usuwaniu kompleksów VWF-płytki krwi z krążenia. U chorych z ET może występować zarówno skaza krwotoczna jak i zakrzepica. Skaza krwotoczna pojawia się u około 20%, natomiast zakrzepica u 2-22% chorych. Jak wykazały nasze wcześniejsze badania, prowadzone w latach 2011-2014, ryzyko wystąpienia zakrzepicy jest takie same u chorych z ET-AVWS jak i ET-bez AVWS. Dotychczasowe badania prowadzone zarówno przez nas w IHiT jak i w innych ośrodkach nie pozwalają na ustalenie związku AVWS - ET ze skazą krwotoczną. Jest to przede wszystkim spowodowane małą liczebnością grup badanych.

Hipoteza badawcza: Nasza hipoteza zakłada, że wysoka liczba płytek krwi prowadzi do ich aktywacji i wiązania z czynnikiem von Willebranda. Powstające agregaty VWF-płytki są usuwane z krążenia powodując niedobór VWF i w części przypadków skazę krwotoczną. Wystąpienie skazy krwotocznej u chorych z ET-AVWS zależy w dużym stopniu od obecności dodatkowych czynników takich jak polimorfizmy VWF zwiększające powinowactwo VWF do płytek krwi, czynniki ryzyka zakrzepicy, wiek, obecność mutacji JAK2V617F. Obecność dodatkowych czynników prozakrzepowych może powodować, że skaza krwotoczna nie pojawia się lub jest łagodniejsza.

Plan realizacji projektu i metodyka:- Grupę badaną będą stanowić chorzy (100 osób) ze świeżo rozpoznanym ET, którzy wyrażą zgodę na udział w pracy i przeprowadzenie objętych tą pracą badań. W całej grupie zostanie przeprowadzony wywiad rodzinny i chorobowy w kierunku skazy krwotocznej i zakrzepicy.- Badania laboratoryjne będą oceniały: -niedobór VWF; -aktywację płytek krwi; -stężenie PF4, mikropłytki; - generację trombiny (F1+2); - obecność mutacji prozakrzepowych.

Dotychczasowa realizacja celów badania:

- Zebrano materiał od 35 chorych z nadpłytkowością samoistną; od 21 zdrowych dawców (badania kontrolne) i od 50 chorych z trombofilią (kontrola badań prozakrzepowych: ELISA F1+2).- Wyizolowano DNA i oznaczono mutacje prozakrzepowe: czynnika V Leiden, genu protrombiny G20210A, genu reduktazy tetrahydrofolianowej (MTHFR). Oznaczono kofaktor rystocetyny (VWF:RCo) i antygen (VWF:Ag).- Pozostałe objęte tą praca badania będą wykonywane po zebraniu materiału od 40 z nadpłytkowością.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu:Kwotę zaplanowaną na rok 2018 na koszty publikacji chcielibyśmy przenieść na usługi obce ponieważ opracowanie wyników (ocena statystyczna) będzie wymagało współpracy zewnętrznej.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Przeprowadzone badania pozwolą na ocenę ryzyka powikłań krwotocznych/zakrzepowych i mogą mieć znaczenie w profilaktyce skazy krwotocznej/zakrzepicy u chorych z ET.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane.

Referencje: Tefferi A, Barbui T.: Polycythemia vera and Essentials thrombocythemia: 2015 update on diagnosis,

risk-stratification and management. Am J Hematol 2015, 90, 162-173. Goyal J, Reddy VV, Margues MB.: Acquired von Willebrand’s disease In myelofibrosiis and Essentials

thrombocythemia. Haemophilia 2013, 19(4):e256-7. Federici AB, Budde U, Castaman G, Rand JH, Tiede A.: Current diagnostics and Therapeutic

Approaches to patients with acquired von Willebrand syndrome:A 2013 update. Semin Thromb Hemost 2013, 39, 191-201

Szanto T, Schlammadinger A, Staeelens S, De Meyer S.F, Freson K, Pareyn I, Vauterin S, Harsfalvi J, Deckman H, Vanhoorelbeke K.: The A/T 1381 polymorphism In the A1 domain of von Willebrand factor influences the affinity of von Willebrand factor for platelet glycoprotein Ibα. Thromb.Haemost, 2007, 98, 178-185.

Bowen DJ, Collins PW, An amino acid polymorphism In von Willebrand factor correlates with increased susceptibility to proteolysis by ADAMTS13. Blood 2004, 103, 941-947.

Rottenstreich A, Kleinstern G, Krichevsky S, Varon D, Lavie D, Kalish Y. Eur J Intern Med 2016. Prais I, Kuliczkowskim K. Predictive factors of thrombosis for patients with essential

thrombocythaemia: A single center study. Adv Clin Exp Med 2017, 26, 115-121.

Pozostały okres realizacji pracy: 2018 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Uzupełnienie grupy z ET do 70-100 osób, wykonanie zaplanowanych badań, opracowanie wyników, napisanie raportu. Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: RaportWykonawcy: K. Bykowska; E. Mendek-Czajkowska, A. Bućko, B. Baran, B. Sokołowska, B. Ceglarek, K. Warzocha, J. Windyga


Stworzenie banku próbek osocza, krwi, łożysk i DNA Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej

Wstęp: Badania naukowe prowadzone w Zakładzie Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej (ZIHiT) dotyczą chorób i powikłań poprzetoczeniowych wynikających z alloimmunizacji komórkami krwi i obejmują także zagadnienia analizy podłoża genetycznego różnych antygenów komórek krwi. Badania prowadzone są we współpracy międzynarodowej oraz we współpracy z Regionalnymi Centrami Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK). Na najbliższe lata zaplanowano badania u kobiet w ciąży i u krwiodawców, od których pozyskamy unikalny materiał (dawcy homozygotyczni w różnych antygenach, wśród których poszukiwać będziemy dawców o rzadkich grupach krwi; kobiet z przeciwciałami do różnych antygenów). Wysiłek podejmowany dla pozyskania tego materiału jest bardzo duży. Stąd konieczność, by materiał ten został zarchiwizowany i mógł być wykorzystany w dalszych projektach naukowych, m.in. dla poszukiwania czynników predykcyjnych alloimmunizacji.

Hipoteza badawcza: Stworzenie i utrzymywanie profesjonalnie skonstruowanego banku próbek i rejestru danych jest konieczne dla podejmowania badań naukowych w dziedzinie alloimmunizacji antygenami komórek krwi i polimorfizmów antygenów komórek krwi. To także jeden z elementów realizacji zadań statutowych IHiT w dziedzinie krwiodawstwa.

Cele badania: Utworzenie banku próbek do badań naukowych, ekspertyz i opinii.

Plan realizacji projektu i metodyka: W ramach grantu PREVFNAIT opracowano zautomatyzowane, przeprowadzane pod nadzorem programów komputerowych metody separacji różnego materiału do bankowania (osocze, pełna krew, DNA). Dla stworzenia profesjonalnego biobanku wdrożono też moduł zarządzania informacjami o zgromadzonym materiale w 96-dołkowych płytkach oraz w probówkach z kodem 2D (oprogramowanie ARCA skomunikowane ze stacją pipetującą i skanerami kodów 2D dla płytek i probówek). W ramach programu Optimed utworzono moduł PREVFNAIT, gdzie gromadzi się dane kliniczne i wyniki badań. Na tym module wzorowane będą odpowiednie moduły tworzonego obecnie banku i rejestru. Dla usprawnienia badań przesiewowych opracowano moduł zleceń grupowych według listy, z elektronicznym zaciąganiem wyników do systemu i ich automatycznym wydrukiem. W tworzeniu banku próbek osocza, krwi i DNA ZIHiT wykorzystane będą doświadczenia z grantu PREVFNAIT i utworzone będą moduły analogiczne do PREVFNAIT, służące do zarządzania biobankiem i dla elektronicznego wprowadzania wyników badań masowych. Wiele elementów na poziomie programów OPTIMED i ARCA korzystałoby z już utworzonych rozwiązań i byłoby wzbogacone o kolejne niezbędne elementy. Dla zainicjowania tematu biobanku nawiązano już współpracę z RCKiK, które będą przesyłały wyselekcjonowane próbki do badań.

W ramach tego projektu kontynuować będziemy gromadzenie próbek łożysk od kobiet HPA-1a ujemnych z przeciwciałami anty-HPA-1a, które wykorzystane będą do badań w ramach grantu „Platelets and placenta – the new hotspot in fetal-maternal crosstalk” prowadzonego przez Uniwersytet w Tromso. ZIHiT jest współwykonawcą grantu, a członkowie zespołu ZIHiT są imiennie w nim wymienieni. IHiT musi pokryć koszty materiałów do pobierania i przesyłania próbek i koszty udziału w zagranicznym Sympozjum, gdzie będą omawiane wyniki analiz.

Dotychczasowa realizacja celów badania:Utworzenie banku próbek do badań naukowych, ekspertyz i opinii. W roku 2016 wramach współpracy z RCKiK zgromadzono 240 próbek unikalnego materiału od dawców homozygotycznych w różnych antygenach lub o rzadkich grupach krwi i od 12 pacjentów z rzadko występującymi przeciwciałami do różnych antygenów.Materiał – 600ul pełnej krwi został zbankowany w -80oC w pojedynczych probówkach (w 1 do 3 powtórzeniach), oklejonych naklejką z kodem 2D; a dodatkowo materiał od dawców zbankowano automatycznie w 96-dołkowych płytkach. Zbankowano 252 próbki DNA. Trwa obecnie procedura zakupu zamrażarki -80oC niezbędnej do gromadzenia próbek, ustalenia rozbudowy programu archiwizującego „ARCA” oraz ustalenia dotyczące utworzenia protokołów do stacji pipetujących Hamilton (szczegóły w raporcie za rok 2016). Złożenie projektu do NCN (Sonata12 - 15.12.2016 r.) na badania próbek zdeponowanych w biobanku.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Biobank próbek i rejestr danych jest konieczny dla podejmowania zadań naukowych. Jest też potrzebny do wykonywania zadań wynikających z nadzoru IHiT nad służbą krwi, na które przeznaczone są fundusze przyznawane przez Ministerstwo Zdrowia (MZ). W ramach dotacji nie można natomiast wykonać struktury zarządzania bankiem, o który aplikujemy w ramach obecnej pracy planowej. Bank jest też potrzebny do badań służących wydawaniu opinii dotyczących odczynników oraz wszelkich rekomendacji, w tym przygotowywanych dla MZ. Rodzaj pracy: praca rozwojowa.

Referencje:- Uhrynowska ME, Dębska M, Guz K, Orzińska A, Wróbel A, Maślanka K, Dębski R, Brojer E.[PREVFNAIT prevention of foetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) in Polish foetusesand newborns--the PREVFNAIT program].Ginekol Pol. 2015;86(1):62-6.

Okres realizacji pracy: 2016-2018 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Utworzenie odpowiednich modułów w ramach systemów Optimed i ARCA dla separowania, archiwizowania i zarządzania próbkami biobanku oraz utworzenie rejestrów do wprowadzania danych osobowych, klinicznych, diagnostycznych i sterowania procesem zleceń badań z elektronicznym przechwytem wyników do bazy. Utworzenie infrastruktury informatycznej banku na podstawie doświadczeń z grantu PREVFNAIT. Gromadzenie próbek łożyska.Forma rozliczenia pracy: Raport.

Wykonawcy: A. Orzińska, K. Guz, B. Michalewska, M. Pelc-Kłopotowska, H. Łopieńska, M. Uhrynowska, I. Kopeć, M. Michlik, P. Łopacz, A. Gierszon, B. Wojciechowska, S. Purchla-Szepioła, E. Przytuła, E. Brojer

KARTA PRACY PLANOWEJ nr 3.4 3/004/2014(PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.1 w Planie Naukowym 2017PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.1 w Planie Naukowym 2016PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.4 w Planie Naukowym 2015

PRACA KONTYNUOWANA – nr 3.16 w Planie Naukowym 2014)Diagnostyka i patogeneza chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego

Wstęp: Zdefiniowanie czynników patogenetycznych w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego jest podstawą wdrożenia nowych testów diagnostycznych i zaplanowania nowoczesnych terapii. Opracowanie nowych i optymalizacja dotychczasowych metod diagnostycznych w tych chorobach pozwala na lepsze ich rozpoznawanie i zastosowanie odpowiedniego leczenia.

Hipoteza badawcza: Celem pracy jest opracowanie i zastosowanie nowych testów/technik diagnostycznych w oparciu o mechanizmy patogenetyczne nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego.Nowym zadaniem, jakie planujemy podjąć w roku 2018 w ramach niniejszej pracy są badania pilotażowe dotyczące patogenetycznej roli AHCY (hydrolaza S-adenozylohomocysteiny) w nowotworach układu krwiotwórczego charakteryzujących się fenotypem hipermetylacji i mutacjami IDH1/2. Enzym ten kluczowym ogniwem szlaku metioninowego, mającego za zadanie dostarczenie S-adenozylometioniny – donora grup metylowych w reakcjach metylacji. Enzym ten może zatem potencjalnie może stanowić cel terapeutyczny w AML, a jego wyłączenie będzie prowadzić do hipometylacji DNA i odwrócenia fenotypu spowodowanego mutacjami IDH1 i 2. W ramach tego zadania, z udziałem Pracowników Kliniki Hematologii (Krzysztof Warzocha, Joanna Góra-Tybor, Elżbieta Patkowska, Kamil Wiśniewski) stworzymy bazę danych pacjentów z AML leczonych DA, DAC w ostatnich 5 latach oraz bazę danych pacjentów z ostrą białaczką szpikową z progresją po leczeniu azacytydyną, którzy byli leczeni schematem Kladrybina + LD-AraC. Bazy te posłużą do oceny roli IDH1/2 i AHCY jako markerów odpowiedzi na 2CdA , a ponadto posłużą do identyfikacji chorych, dla których zbankowano materiał biologiczny do oceny roli AHCY w hipermetylacji DNA.

Dotychczasowa realizacja celów badania:W ramach tematu opublikowano prace oryginalne, opisy przypadków oraz prace poglądowe objęte oddzielnymi formularzami sprawozdań.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu:

Planowana jest kontynuacja publikacji prac dotyczących optymalizacji diagnostyki i poszukiwania czynników patogenetycznych w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Optymalizacja diagnostyki i zdefiniowanie nowych czynników patogenetycznych mających znaczenie diagnostyczne w zakresie nowotworów układu chłonnego i krwiotwórczego umożliwia ustalenie prawidłowego, zgodnego z najnowszymi standardami rozpoznania, co wpływa na zastosowanie odpowiedniego, często celowanego leczenia i bardzo często wyleczenie chorego z chorobą nowotworową, co niesie za sobą szereg oczywistych korzyści zdrowotnych i ekonomicznych.


Pozostały okres realizacji pracy w latach: 3 lata.Zadania do wykonania w 2018 r.: Kontynuacja prac.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Praca przygotowana do druku/publikacja.Wykonawcy: M. Prochorec-Sobieszek, A. Szumera-Ciećkiewicz, O. Szymańska-Giemza, J. Woźniak, U. Podstawka, K. Borg, H. Makuch-Łasica, I. Solarska, M. Wojtas, M. Szydłowski, A. Polak, P. Górniak, E. Białopiotrowicz, E. Jabłońska, M. Kraj, G. Nowak, E. Derezińska-Wołek, M. Noyszewska-Kania, K. Warzocha, J. Góra-Tybor, E. Patkowska, K. Wiśniewski, P. Juszczyński


Kinaza cyklinozależna 8 jako cel terapeutyczny w chłoniakach rozlanychz dużych komórek B

Wstęp: Kinazy zależne od cyklin (CDK) regulują wejście komórki w kolejne fazy cyklu komórkowego oraz mogą kontrolować transdukcję sygnałów, różnicowanie i apoptozę komórek. Ich aktywność podlega nadzorowi punktów kontrolnych na drodze mechanizmów molekularnych. Zablokowanie CDK w komórkach nowotworowych może prowadzić do upośledzenia proliferacji i indukcji apoptozy. Kompleks Cykliny C (CCNC) - CDK8 i jej homologa CDK19 (homologia całkowita na poziomie 77%, o obrębie domeny katalitycznej 94%) odgrywa kluczową rolę w regulacji transkrypcji. Z jednej strony pełni funkcję regulatora negatywnego poprzez fosforylację i supresję czynników transkrypcyjnych (np. STAT1/5 i SMAD2); z drugiej natomiast aktywuje transkrypcję na drodze podstawowych mechanizmów transkrypcyjnych i poprzez uruchomienie szlaków p53 i Wnt/β-kateniny.Geny dla CCNC i CDK19 leżą obok siebie w rejonie 6q21; delecję potwierdzono w wielu nowotworach m.in. raku płuca, jajnika, prostaty, białaczkach, mięsaku kościopochodnym. Równoczesną delecję CCNC i CDK19 stwierdzono w 10% T-ALL i7% DLBCL.Obniżenie ekspresji CDK19 obserwowano w białaczkach, chłoniakach oraz raku przełyku natomiast nadekspresję i amplifikację CDK8 stwierdzono w około 50% raków jelita grubego. W pierwszych badaniach w raku jelita grubego uzyskano obiecujące wyniki dotyczące wpływu hamowania CDK8 na blokowanie proliferacji komórek nowotworowych.Gorsze rokowanie obserwowano również u chorych na raka piersi i w grupie pacjentek z rakiem jajnika opornym na terapię platyną. Podwójna rola pełniona przez kompleks CDK8 (onkogen vs. gen supresorowy) determinuje konieczność przeprowadzania analizy skuteczności terapii inhibitorami CDK8 w zależności od typu histopatologicznego nowotworu.Chłoniak rozlany z dużych komórek B (DLBCL) jest najczęstszym chłoniakiem nieziarniczym u dorosłych; stanowi 35% wszystkich chłoniaków B-komórkowych i niemal 80% chłoniaków agresywnych. Stanowi jedną z najbardziej heterogennych grup nowotworów pod względem biologicznym i genetycznym. Aktualny podział obejmuje klasyfikację powstałą w oparciu podgrupy molekularne [Cell of Orgin (COO) - 2 kategorie: z komórek B ośrodków rozmnażania (GCB) i z aktywowanych komórek B (ABC) lub Comprehensive Cluster (CCC) - 3 kategorie: host response, B-cell receptor signaling/proliferation, oxidative phosphorylation].O złożoności mechanizmów molekularnych wpływających na aktywację lub hamowanie czynników transkrypcyjnych może świadczyć fakt, iż w przygotowywanej najnowszej klasyfikacji WHO 2017 przewiduje się wprowadzenie kategorii wysokozłośliwego chłoniaka z komórek B z rearanżacją BCL2 lub/i BCL6 i z towarzyszącą nadekspresją MYC. Grupa ta charakteryzuje się słabszą reakcją na chemioterapię i znacznie gorszym rokowaniem. Aktualnie nie ma dostępnych wyników badań pozwalających na doprecyzowanie mechanizmów wpływających na aktywność kompleksu CDK8 w DLBCL wraz z określeniem

zależnych od niego substratów. Spośród nowotworów hematologicznych dostępne skąpe dane obejmują przede wszystkim ostre białaczki szpikowe.

Cele badania: Ocena immunohistochemicznej ekspresji CDK8 z uwzględnieniem podziału na podgrupy molekularne ABC / GCB DLBCL (klasyfikacja WHO 2008) i "double-expressor” high grade B-cell lymphoma (MYC and BCL2 and/or BCL6) high grade B-cell lymphoma (klasyfikacja WHO 2017).Ocena aktywności kompleksu CDK8 na liniach komórkowych z określeniem substratów E2F1. Ocena skutków inhibicji : SEL120 i shCDK8.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Przeprowadzono barwienia IHC oraz wstępne badania in vitro.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: bez zmian.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Otrzymane wyniki będą stanowić minimalną podstawę do rozszerzenia badań nad scharakteryzowaniem mechanizmów molekularnych regulujących działanie kompleksu CDK8. Określenie skutków inhibicji kompleksu CDK8 przez SEL120 może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w DLBCL.

Rodzaj pracy: badanie naukowe podstawowe

Referencje: Allen BL, Taatjes DJ. The Mediator complex: a central integrator of transcription. Nature reviews

Molecular cell biology 2015;16:155-66. Bancerek J, Poss ZC, Steinparzer I, et al. CDK8 kinase phosphorylates transcription factor STAT1 to

selectively regulate the interferon response. Immunity 2013;38:250-62. Putz EM, Gotthardt D, Hoermann G, et al. CDK8-mediated STAT1-S727 phosphorylation restrains

NK cell cytotoxicity and tumor surveillance. Cell reports 2013;4:437-44. Alarcon C, Zaromytidou AI, Xi Q, et al. Nuclear CDKs drive Smad transcriptional activation and

turnover in BMP and TGF-beta pathways. Cell 2009;139:757-69. Donner AJ, Szostek S, Hoover JM, Espinosa JM. CDK8 is a stimulus-specific positive coregulator of

p53 target genes. Molecular cell 2007;27:121-33. Morris EJ, Ji JY, Yang F, et al. E2F1 represses beta-catenin transcription and is antagonized by both

pRB and CDK8. Nature 2008;455:552-6. Trakala M, Malumbres M. Cyclin C surprises in tumour suppression. Nature cell biology

2014;16:1031-3. Li N, Fassl A, Chick J, et al. Cyclin C is a haploinsufficient tumour suppressor. Nature cell biology

2014;16:1080-91. Firestein R, Bass AJ, Kim SY, et al. CDK8 is a colorectal cancer oncogene that regulates beta-catenin

activity. Nature 2008;455:547-51. Caro P, Kishan AU, Norberg E, et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular

subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer cell 2012;22:547-60. Chen L, Monti S, Juszczynski P, et al. SYK inhibition modulates distinct PI3K/AKT- dependent

survival pathways and cholesterol biosynthesis in diffuse large B cell lymphomas. Cancer cell 2013;23:826-38.

Monti S, Savage KJ, Kutok JL, et al. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood 2005;105:1851-61.

Hu S, Xu-Monette ZY, Tzankov A, et al. MYC/BCL2 protein coexpression contributes to the inferior survival of activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphoma and demonstrates high-risk gene expression signatures: a report from The International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program. Blood 2013;121:4021-31; quiz 250.

Swerdlow SH, Campo E, Pileri SA, et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016;127:2375-90.

Aleem E, Arceci RJ. Targeting cell cycle regulators in hematologic malignancies. Frontiers in cell and developmental biology 2015;3:16.

Dodurga Y, Oymak Y, Gunduz C, et al. Leukemogenesis as a new approach to investigate the correlation between up regulated gene 4/upregulator of cell proliferation (URG4/URGCP) and signal transduction genes in leukemia. Molecular biology reports 2013;40:3043-8.

Hales EC, Taub JW, Matherly LH. New insights into Notch1 regulation of the PI3K-AKT-mTOR1 signaling axis: targeted therapy of gamma-secretase inhibitor resistant T-cell acute lymphoblastic leukemia. Cellular signalling 2014;26:149-61.

Pelish HE, Liau BB, Nitulescu, II, et al. Mediator kinase inhibition further activates super-enhancer-associated genes in AML. Nature 2015;526:273-6.

Okres realizacji pracy w latach: 2016-2018 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Oceny molekularnych mechanizmów toksyczności wynikającej z zahamowania CDK8, wykonanie multibloczków i barwień immuno-histochemicznych.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Złożenie grantu, publikacja.Wykonawcy: A. Szumera-Ciećkiewicz, M. Prochorec-Sobieszek, M. Noyszewska-Kania, M. Szydłowski, E. Jabłońska, P. Juszczyński


Monitorowanie minimalnej choroby resztkowej u chorych na CBF-AML

Wstęp: Ostre białaczki szpikowe z grupy tzw. core binding factor (core binding factor-acute myeloid leukemias, CBF-AML), czyli z obecnością genów fuzyjnych RUNX1-RUNX1T1 oraz CBFB-MYH11 stanowią około 15% wszystkich ostrych białaczek szpikowych u dorosłych. Intensywna chemioterapia umożliwia uzyskanie trwałej remisji oraz długoletnie przeżycie u ponad 60% chorych z tej grupy. Jednak u około 50% chorych z RUNX1-RUNX1T1 oraz 30% chorych z CBFB-MYH11 dochodzi do nawrotu białaczki.Uznanymi czynnikami ryzyka wznowy białaczek z grupy CBF-AML są wiek i wysoka leukocytoza oraz obecność mutacji c-KIT i FLT3 [Ayatollahi et al., Hematol. Oncol. Stem Cell Ther. 2017]. Niektórzy badacze udowadniają również znaczenie nadekspresji genów BAALC i MN1 [Hoyos et al., Haematology, 2013].Najsilniejszym czynnikiem predykcyjnym wznowy białaczki, niezależnym od innych, jest jednak obecność minimalnej choroby resztkowej (minimal residual disease, MRD). Uważa się, że obecność MRD może być silniejszym predyktorem wznowy białaczki niż mutacje c-KIT i FLT3 [Jourdan et al., Blood, 2013]. Rozbieżności dotyczą określenia optymalnego momentu oceny MRD techniką RQ-PCR. Udowodniono, że obecność MRD po zakończeniu leczenia indukująco-konsolidującego oraz konwersja wyniku ujemnego w dodatni w tym zakresie pozostają w korelacji z wysokim, 60% ryzykiem nawrotu białaczki [Carbacioglou et al., JCO, 2010]. Wciąż jednak nie wiadomo kiedy, po zakończeniu indukcji remisji czy być może po konsolidacji remisji ocena tą techniką ma większe znaczenie. W którym momencie leczenia stanowi silniejszy wskaźnik ryzyka. Czy tylko przetrwała/nieobecna MRD ma znaczenia, czy również można określić poziom ekspresji transkryptu, jak to jest w przypadku przewlekłej białaczki szpikowej, który miałby przełożenie praktyczne na ocenę ryzyka dla tej grupy chorych. Według A. Carbacioglou i wsp. dla chorych z AML i obecnością genu fuzyjnego CBFB-MYH11 można określić trzy punkty kontrolne, w których analiza MRD ma znaczenie prognostyczne. Pierwszym jest ocena po zakończeniu konsolidacji. Wykrywalna MRD pozostaje w korelacji z wysokim ryzykiem wznowy, natomiast negatywizacja wyników koreluje z 2-letnim czasem wolnym od wznowy (relapse free survival, RFS) na poziomie 79%. Drugi punkt kontrolny określany jest serią oznaczeń od konsolidacji do wczesnego ‘follow-up’. Z badania wynika, że ujemna MRD oceniana w kilku oznaczeniach techniką RQ-PCR koreluje z 2-letnim RFS wynoszącym 91% [Corbacioglou et al., JCO 2010]. Z kolei Liu Yin i wsp. w swojej pracy dowodzą, że punktem istotnym klinicznie do oceny poziomu MRD jest zakończenie indukcji remisji. Badacze wskazują również na określone poziomy transkryptów RUNX1-RUNX1T1 i CBFB-MYH11, które według nich pozostają w korelacji z niskim ryzykiem nawrotu. Autorzy pracy wykazali również, że konkretne poziomy MRD po zakończeniu leczenia, mogą korelować z wysokim ryzykiem nawrotu białaczki [Liu Yin et al., Blood, 2012].

Hipoteza badawcza: Proponowana praca ma na celu weryfikację: czy ocena MRD techniką RQ-PCR w określonym momencie leczenia (po zakończeniu indukcji, po zakończeniu

konsolidacji) ma znaczenie predykcyjne. Czy istnieje predykcyjny poziom MRD oceniający techniką RQ-PCR ilość transkryptów RUNX1-RUNX1T1 i CBFB-MYH11.

Cele badania: Porównanie technik cytometrii przepływowej oraz biologii molekularnej do oceny MRD u chorych na CBF-AML. Identyfikacja określonych punktów czasowych leczenia jako czynnika predykcyjnego wznowy. Identyfikacja predykcyjnego poziomu MRD ocenianego techniką real-time PCR, jako czynnika ryzyka wznowy białaczki.

Plan realizacji projektu i metodyka:Grupę badaną będzie stanowiło 33 chorych na CBF-AML (16 z RUNX1-RUNX1T1 i 17 z CBFB-MYH11) rozpoznanych w IHiT w latach 2008-2017, u których monitorowano MRD metodą RQ-PCR w trakcie standardowej chemioterapii. Ci chorzy zostaną poddani analizie retrospektywnej pod względem molekularnych czynników ryzyka w materiale wyjściowym z rozpoznania oraz korelacji oceny MRD techniką cytometrii przepływowej i RQ-PCR. W kolejnych latach (2018-2020) planowane jest włączenie do analizy nowo rozpoznanych chorych z obecnością ww. genów fuzyjnych. Prospektywnie, dla jednego chorego przewidujemy wykonanie szeregu oznaczeń w określonych punktach czasowych. W momencie rozpoznania w celu określenia aberrentnego fenotypu oraz poziomu ekspresji genu fuzyjnego, jako punktu odniesienia do kolejnych oznaczeń MRD (badania cytometryczne i molekularne) oraz oznaczenie czynników prognostycznych takich jak mutacje c-KIT, FLT3-ITD, NPM1, CEBP, IDH1-IDH2, MLL-PTD, nadekspresja BAALC. Dla chorych ocenianych prospektywnie przewidujemy równoległą ocenę MRD metodami cytometrii przepływowej oraz RQ-PCR po kolejnych indukcjach i konsolidacjach, a po zakończeniu leczenia indukująco-konsolidującego w 3-miesięcznych interwałach przez okres co najmniej 18 miesięcy.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Znajomość prognostycznych poziomów MRD oznaczanych techniką RQ-PCR na wczesnym etapie leczenia może przełożyć się na szybsze podjęcie interwencji terapeutycznych mających na celu zapobieżenie nawrotowi białaczki na poziomie klinicznym. Uzyskane wyniki staną się podstawą publikacji.


Okres realizacji pracy: 2018-2020Zadania do wykonania w 2018 r.: Podsumowanie danych retrospektywnych. Wykonanie brakujących oznaczeń czynników prognostycznych do pełnej analizy ryzyka molekularnego w badanej retrospektywnie grupie chorych, w tym mutacji IDH1-IDH2. Bieżące rekrutowanie chorych, analiza czynników prognostycznych w materiale z rozpoznania oraz oznaczanie minimalnej choroby resztkowej metodami cytometrii przepływowej oraz technikami biologii molekularnej (RQ-PCR).Forma rozliczenia pracy: RaportWykonawcy: I. Solarska, M. Wojtas, B. Nowak, J. Woźniak, A. Ejduk, M. Prochorec-Sobieszek, E. Lech-Marańda

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 3.7 3/004/2016(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 3.6 w Planie Naukowym 2016PRACA KONTYNUOWANA – Nr 3.6 w Planie Naukowym 2017)

Powiązania białka szoku cieplnego HSP90α i sirtuiny 1 (SIRT1) w patogenezie chłoniaków rozlanych z dużych komórek B

Wstęp: Nadekspresja białek opiekuńczych z grupy białek szoku cieplnego (HSPs) jest istotnym elementem patogenezy nowotworów, gdyż prowadzi do stabilizacji kluczowych onkogenów. Dlatego HSPs stanowią racjonalny cel terapeutyczny w komórkach nowotworowych. Część chłoniaków rozlanych z dużych komórek B (DLBCL) charakteryzuje się nadekspresją białka szoku cieplnego HSP90α (1). Badania z użyciem inhibitorów HSP90 wykazały, że białko to może stanowić atrakcyjny cel terapeutyczny w DLBCL (1,2). Mechanizmy prowadzące do nadekspresji HSP90α w komórkach DLBCL pozostają niewyjaśnione. Jednym z regulatorów ekspresji genu dla HSP90α jest czynnik transkrypcyjny HSF1 (heat shock factor 1), którego aktywność zależy od sirtuiny 1 (SIRT1), (3). Białko SIRT1 deacetyluje histony oraz liczne białka niehistonowe związane z nowotworzeniem, takie jak p53, FOXO i Bcl6. Zwiększona ekspresja SIRT1 jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym w DLBCL (4). Mechanizmy odpowiadające za nadekspresję SIRT1 w DLBCL nie zostały do tej pory zbadane. Badania przeprowadzone w Zakładzie Hematologii Eksperymentalnej ujawniły, że linie modelowe DLBCL z nadekspresją HSP90α charakteryzują się zwiększonym poziomem SIRT1, który wynika ze zwiększonej stabilności białka SIRT1. Eksperymenty koimmunoprecypitacji przeprowadzone na komórkach HEK z nadekspresją zmodyfikowanego białka SIRT1-FLAG (SIRT1 z dołączoną na C-końcu metką FLAG) wykazały bezpośrednie oddziaływanie SIRT1-FLAG z HSP90α. Zahamowanie aktywności SIRT1 z użyciem inhibitora sirtuin (tenowina-6) w modelowych liniach DLBCL prowadziło do obniżenia ekspresji genu HSP90α i w konsekwencji do śmierci komórek.

Hipoteza badawcza: Nasze dotychczasowe badania wskazują na istnienie mechanizmów wzajemnej regulacji pomiędzy SIRT1 i HSP90α. Nadekspresja HSP90α w chłoniakach DLBCL przyczynia się do zwiększonej stabilności SIRT1 w komórce, zaś zwiększony poziom SIRT1 prowadzi do nadekspresji HSP90α. Dlatego zakładamy, że farmakologiczne przerwanie patogenetycznego sprzężenia pomiędzy SIRT1 i HSP90α z użyciem inhibitorów obydwu białek może stanowić racjonalne połączenie w terapii chłoniaków DLBCL.

Cele badania: Określenie regionu białka SIRT1 odpowiedzialnego za bezpośrednie oddziaływanie z HSP90α. Ocena wpływu łącznego zastosowania komercyjnie dostępnych inhibitorów sirtuin i HSP90 na żywotność komórek DLBCL. Zbadanie molekularnego mechanizmu odpowiedzialnego za cytotoksyczność inhibitorów sirtuin. Zbadanie ekspresji białek SIRT1 i HSP90α w diagnostycznych skrawkach parafinowych od chorych na DLBCL.

Plan realizacji projektu i metodyka: Region białka SIRT1 oddziałujący z HSP90α zostanie zdefiniowany metodą koimmunoprecypitacji przy użyciu linii komórkowej HEK oraz specjalnie zaprojektowanych wektorów ze wstawkami kodującymi fragmenty SIRT1. Ocena toksyczności kombinacyjnego zastosowania inhibitorów SIRT1 i HSP90 na komórki linii

DLBCL zostanie przeprowadzona testem MTS. W celu zbadania molekularnych mechanizmów odpowiadających za cytotoksyczność inhibitorów sirtuin w komórkach DLBCL, oceniony zostanie wpływ podania tych związków na deacetylację i aktywność wybranych substratów SIRT1 metodami western blot oraz ilościowym PCR w czasie rzeczywistym. Korelacja pomiędzy ekspresją białek SIRT1 i HSP90α w materiale pierwotnym zostanie oceniona metodą immunohistochemii w Pracowni Patomorfologii.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Proponowane badania mają na celu wyjaśnienie molekularnych mechanizmów prowadzących do nadekspresji SIRT1 i HSP90α w chłoniakach DLBCL. Uzyskane rezultaty mogą przynieść biologiczne uzasadnienie dla łączenia inhibitorów SIRT1 i HSP90 w terapii tego typu chłoniaków.

Dotychczasowa realizacja celów badania: 1. Porównano wpływ inhibitora SIRT1 (tenowiny-6, ten6) na odpowiedź apoptotyczną komórek OxPhos-DLBCL i komórek podtypu DLBCL zależnego od receptora B-komórkowego (BCR-DLBCL). Pomimo znacząco niższego poziomu SIRT1, komórki BCR-DLBCL charakteryzowała wyższa odpowiedź apoptotyczna na ten6. Przeżywalność komórek BCR-DLBCL jest zależna od onkogenu Bcl6, którego aktywność jest regulowana przez SIRT1. Zaobserwowano, że ten6 w komórkach BCR-DLBCL prowadzi do zwiększonej acetylacji i spadku poziomu białka Bcl6 oraz uruchomienia transkrypcji genów hamowanych przez ten represor (FCER2, CCL3, BLIMP1, CD74). Wyniki tych badań wskazują na różny mechanizm toksyczności inhibitorów SIRT1 w podtypach chłoniaków OxPhos-DLBCL i BCR-DLBCL. 2. Oceniono wpływ łącznego zastosowania inhibitorów SIRT1 (ten6) i HSP90 (17-AAG) na żywotność komórek OxPhos- i BCR- DLBCL. W liniach OxPhos-DLBCL połączenie ten6 z 17-AAG powodowało synergistyczny wzrost toksyczności. Otrzymane wyniki wskazują, że jednoczesna inhibicja SIRT1 i HSP90 może stanowić atrakcyjną strategię terapeutyczną w chłoniakach DLBCL o podtypie OxPhos.


Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Dotychczasowy plan pracy uzupełniono o eksperymenty z zastosowaniem techniki Proximity Ligation Assay (PLA), które umożliwią potwierdzenie bezpośredniego oddziaływania pomiędzy białkami SIRT1 i HSP90α na materiale pierwotnym. Eksperymenty te podniosą wartość merytoryczną publikacji stanowiącej końcową formę rozliczenia pracy.

Rodzaj pracy: badanie naukowe podstawowe.

Referencje:1. Abramson JS, Chen W, Juszczynski P, i wsp. 2008. The heat shock protein 90 inhibitor IPI-504 induces apoptosis of AKT-dependent diffuse large B-cell lymphomas. Br J Hematol 144: 358-66.2. Cerchietti LC, Lopes EC, Yang SN, i wsp. 2009. A purine scaffold Hsp90 inhibitor destabilizes Bcl6 and has specific anti-tumor activity in Bcl6 dependent B-cell lymphoma. Nat Med 15: 1369-76.3. Westerheide SD, Anckar J, Stevens Jr. SM i wsp. 2009. Stress-inducible regulation of heat shock factor 1 by the deacetylase SIRT1. Science 323: 1063-1066.4. Jang KY, Hwang SH, Kwon KS, i wsp. 2008. SIRT1 expression is associated with poor prognosis of diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol 32:1523-31.

Pozostały okres realizacji pracy:1 rok.Zadania do wykonania w 2018 r.: A) Potwierdzenie bezpośredniego oddziaływania pomiędzy SIRT1 i HSP90α w liniach komórkowych DLBCL oraz na materiale pierwotnym przy użyciu techniki Proximity Ligation Assay (PLA). B) Zbadanie ekspresji białek SIRT1 i HSP90α w diagnostycznych skrawkach parafinowych od chorych na DLBCL.C) Zbadanie molekularnego mechanizmu odpowiedzialnego za cytotoksyczność inhibitorów sirtuin w chłoniakach OxPhos-DLBCL. Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: PublikacjaNazwiska wykonawców: E. Białopiotrowicz, M. Noyszewska-Kania, M. Prochorec-Sobieszek, K. Borg, A. Szumera-Ciećkiewicz, P. Juszczyński

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 3.8 3/002/2017(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 3.9 w Planie Naukowym 2017)DEPTOR: potencjalne białko supresorowe w chłoniakach rozlanych

z dużych komórek B (DLBCL)

Wstęp: Badania przeprowadzone w ramach zakończonego projektu TEAM wykazały, że nadekspresja onkogennych mikroRNA miR-155 i miR-17-92 w DLBCL wpływa na aktywność receptora BCR poprzez obniżanie ekspresji białek PTEN i SHIP1, PP2A, PTPROt i c-CBL (1). Białka te wykazują aktywność negatywnych regulatorów sygnału płynącego od receptora BCR, a ich wyciszenie wpływa na amplitudę i kinetykę tego sygnału oraz wrażliwość komórek DLBCL na działanie inhibitorów tego szlaku (w tym ibrutinibu i fostamatinibu). W badaniach tych zidentyfikowaliśmy ponadto nowy cel dla miR-155, białko DEPTOR. Rola tego białka jest dotychczas słabo poznana. DEPTOR poprzez domenę PDZ w C-końcowej części białka wiąże się z białkiem mTOR i hamuje jego funkcję - zarówno w kompleksie mTORC1 jak i mTORC2 (2). W różnych nowotworach DEPTOR pełni funkcję albo onkogenu, albo białka supresorowego. Rola DEPTOR w DLBCL nie została scharakteryzowana. W badaniach pilotażowych wykazaliśmy, iż w diagnostycznych skrawkach parafinowych od chorych z DLBCL dochodzi do utraty ekspresji tego białka wyłącznie w podtypie ABC. Wyłączenie DEPTOR w modelu linii komórkowych zwiększało zdolności proliferacyjne komórek, ich oporność na apoptozę indukowaną głodzeniem lub działaniem inhibitora szlaku BCR.

Hipoteza: Przeprowadzone analizy bioinformatyczne i dane pilotażowe wskazują, iż DEPTOR pełni funkcję supresora nowotworowego. Celem badania jest weryfikacja tej hipotezy.

Cele badania: 1) Zbadanie transkrypcyjnych mechanizmów wyłączenia ekspresji DEPTOR w ABC-DLBCL. 2) Zbadanie konsekwencji nadekspresji DEPTOR w modelu in vitro i in vivo.

Plan realizacji i metodyka: 1) W przeprowadzonych dotychczas badaniach wykazaliśmy, iż ekspresja białka DEPTOR jest regulowana przez miR-155, ale istnieją prawdopodobnie inne - transkrypcyjne - mechanizmy regulacji ekspresji DEPTOR. Nadekspresja inhibitora NFkB (IkB-SR) powoduje w komórkach ABC-DLBCL ponad dwukrotny wzrost ilości mRNA DEPTOR. Badania te wskazują, iż NFkB jest represorem transkrypcji DEPTOR. W ramach tego zadania planujemy zbadać wiązanie NFkB z DNA w obrębie promotora DEPTOR (ChIP) oraz modyfikacje epigenetyczne tego regionu związane z zahamowaniem transkrypcji. Zbadany zostanie wpływ NFkB na aktywność reportera lucyferazowego będącego pod kontrolą promotora DEPTOR. 2) Gen DEPTOR lub jego mutant pozbawiony domeny wiązania mTOR (PDZ) zostaną wklonowane do wektora systemu indukowalnej ekspresji tet-on, który zostanie wprowadzony do komórek ABC- DLBCL. Proliferacja komórek przed i po indukcji ekspresji zostanie oceniona w teście MTS, a aktywność szlaku mTORC1 i mTORC2 - metodą Western blotting. W przypadku potwierdzenia hipotezy iż DEPTOR jest białkiem supresorowym w DLBCL, przeprowadzone zostaną eksperymenty GEP i badania in vivo

(modele ksenoprzeszczepów do myszy NSG) we współpracy z Dana Farber Cancer Institute. Ponadto, planujemy zbadanie za pomocą IHC zmian ekspresji DEPTOR w bioptatach od chorych z DLBCL, u których doszło do progresji.Dotychczasowa realizacja celów badania: W celu zbadania, czy NFkB reguluje transkrypcję DEPTOR poprzez wiązanie się z DNA w obrębie promotora DEPTOR, wygenerowano serię wektorów kodujących gen lucyferazy pod kontrolą fragmentów promotora DEPTOR. W kolejnych eksperymentach zbadany zostanie wpływ NFkB na aktywność reportera lucyferazowego będącego pod kontrolą promotora DEPTOR. Gen DEPTOR jak również jego mutant nie ulegający fosforylacji przez mTOR, a więc nie podlegający degradacji, zostały wklonowane do wektora pMIG. Wektory te zostaną wprowadzone do komórek linii ABC-DLBCL, a następnie ocenimy proliferację tych komórek i aktywność mTOR.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Bez merytorycznych modyfikacji.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Celem pracy jest wykazanie nowego mechanizmu patogenetycznego związanego z rozwojem chłoniaków DLBCL.


Referencje:1. MiR-17-92 represses PTPROt and PP2A phosphatases and amplifies tonic BCR signaling in DLBCL cells. Jablonska E, Gorniak P, Szydlowski M, Sewastianik T, Bialopiotrowicz E, Polak A, Warzocha K, Juszczynski P. Exp Hematol. 2016 Oct 6. doi: 10.1016/j.exphem.2016.09.0112. DEPTOR is an mTOR inhibitor frequently overexpressed in multiple myeloma cells and required for their survival. Peterson TR, Laplante M, Thoreen CC, Sancak Y, Kang SA, Kuehl WM, Gray NS, Sabatini DM. Cell. 2009;137:873-86.

Okres realizacji pracy w latach: 2 lata (2018-2019)Zadania do wykonania w 2018 r.: W przypadku potwierdzenia hipotezy, iż DEPTOR jest białkiem supresorowym w DLBCL, przeprowadzone zostaną eksperymenty GEP i badania in vivo (modele ksenoprzeszczepów do myszy NSG) we współpracy z Dana Farber Cancer Institute. Ponadto, planujemy zbadanie za pomocą IHC zmian ekspresji DEPTOR w bioptatach od chorych z DLBCL, u których doszło do progresji.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport.Nazwiska wykonawców: E. Jabłońska, M. Szydłowski, M. Prochorec- Sobieszek, A. Szumera-Ciećkiewicz, P. Juszczyński

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 3.9 3/006/2016(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 3.7 w Planie Naukowym 2016PRACA KONTYNUOWANA – Nr 3.7 w Planie Naukowym 2017)

Charakterystyka funkcjonalna klonogennych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (OBL): rola komórkowych mechanizmów regulacji potencjału redox

Wstęp: Ostra białaczka limfoblastyczna (OBL) to heterogenna pod względem klinicznym i molekularnym grupa złośliwych rozrostów klonalnych wywodzących się z komórek prekursorów limfocytów B. Obecne standardy terapeutyczne pozwalają na uzyskanie całkowitej remisji w większości przypadków OBL, jednak u 20% dzieci i 60% dorosłych chorych dochodzi do wznów1,2. Za najważniejszy czynnik predykcyjny pozwalający przewidywać nawrót choroby uznaje się obecnie stan MRD (ang. minimal residual disease). Dodatni stan MRD po leczeniu indukującym wskazuje, że w heterogennej populacji blastów OBL znajdują się klony zdolne do uniknięcia apoptozy wywołanej przez stosowane leki. Procesy śmierci i życia komórek są ściśle kontrolowane przez wewnątrzkomórkowy stan redox. W fizjologicznych warunkach równowaga pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) a usuwaniem ROS jest warunkiem zachowania homeostazy redox. Do zaburzeń stanu redox bardzo często dochodzi w komórkach nowotworowych na skutek zwiększonej produkcji ROS oraz zwiększonej aktywności systemów komórkowych pośredniczących w redukcji ROS. W ten sposób komórki nowotworowe nabywają zdolności do kontroli procesów życia i śmierci. Istotne znaczenie ma również fakt, że utrzymanie niskiego stężenia wewnątrzkomórkowego ROS jest kluczowe dla zachowania potencjału do samoodnowy hematopoetycznej komórki macierzystej (HSC) i utrzymania jej w fazie G0 3. Z danych literaturowych wynika, że jest to cecha wspólna z białaczkową komórką macierzystą (LSC) w przypadku ostrej białaczki szpikowej (AML) oraz nowotworową komórką macierzystą (CSC) w raku piersi 4,5. Cechą odróżniającą HSC od LSC jest metabolizm energetyczny. Glikoliza jest niezbędna do przetrwania HSC, a metabolizm OXPHOS jest niezbędny do przetrwania populacji komórek LSC w AML. Wyłączenie tego metabolizmu specyficznie eliminuje populacje LSC pozostając bez wpływu na HSC4. Ponieważ metabolizm OXPHOS jest kluczowy dla przetrwania LSC, a przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy sprzyja wyciekowi ROS, komórki te muszą być zaopatrzone w efektywne systemy redukcji ROS aby zapobiec nadmiernej proliferacji i utrzymać potencjał do samoodnowy. Komórki AML CD34+ (wzbogacone w LSC) oraz komórki raka piersi Thy1+ CD24+ Lin– (wzbogacone w CSC) charakteryzują się wyższą ekspresją systemów eliminujących ROS, co jest podstawą utrzymania homeostazy redox 4,5. Ponieważ z naszych obserwacji wynika, że komórki OBL o wyższym potencjale klonogennym charakteryzują się nadekspresją genów zaangażowanych w metabolizm ROS przypuszczamy, że utrzymanie tej populacji w komórkach OBL może zależeć od podobnego mechanizmu jaki istnieje w komórkach LSC w AML.Podsumowując, zależność nowotworowych komórek macierzystych od metabolizmu OXPHOS i wyższa aktywność systemów eliminujących ROS mogą być konserwowanym mechanizmem biologicznym identyfikującym komórki macierzyste w białaczkach. Wyższa aktywność systemów eliminujących ROS w komórkach macierzystych sugeruje ponadto, że komórki te mogą być potencjalnie wrażliwe na czynniki zmieniające równowagę redox. Z tego powodu szczegółowe zrozumienie biologii redox komórek OBL może stać się podstawą

opracowania celowanych form terapii efektywnie eliminujących komórki o wyższym potencjale klonogennym w OBL.

Hipoteza badawcza: Niskie stężenie wewnątrzkomórkowego ROS, zależność od metabolizmu OXPHOS oraz wyższa aktywność systemów eliminujących ROS charakteryzują komórki OBL o wyższym potencjale klonogennym. Deregulacja metabolizmu energetycznego i homeostazy redox doprowadzi do eliminacji komórek opornych na konwencjonalne cytostatyki i zmniejszy ryzyko wznowy.

Cele badania: Zbadanie mechanizmów odpowiadających za generację i utylizację ROS w komórkach B-OBL: a) Rola metabolizmu tlenowego; b) Rola układów GSH i tioredoksyny

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Przewidujemy, iż identyfikacja mechanizmów kluczowych dla utrzymania populacji komórek OBL o wyższym potencjale klonogennym stanie się w przyszłości podstawą do opracowania celowanych form terapii wykorzystujących czynniki modulujące homeostazę redox i metabolizm energetyczny w OBL.

Dotychczasowa realizacja celów badania:- Analiza bioinformatyczna poziomu ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm mitochondrialny i kontrolę stanu redox w blastach OBL w oparciu o istniejące dane mikromacierzowe.- Rozdział heterogennej populacji komórek OBL na subpopulacje na podstawie markerów metabolicznych (wewnątrzkomórkowy poziom ROS).- Ocena zdolności komórek OBL z niską i wysoką zawartością ROS do formowania kolonii.- Ocena potencjału proliferacyjnego i poziomu białek (cMYC, SIRT1, p21, p27, TRX, PRDX1) linii OBL sortowanych na zawartość ROS.- Wstępna identyfikacja markerów różnicujących populację OBL z wysoką i niską zawartością ROS.- Ocena wpływu czynników modulujących równowagę redox/metabolizm energetyczny (inhibitor SIRT1, Tenovin-6, inhibitor MYC, JQ1, inhibitor B-OX, BrCA, inhibitor BCL2, Venetoclax, inhibitor syntezy glutationu, BSO) na żywotność linii komórkowych OBL.- Przygotowanie materiału biologicznego do analizy profilu ekspresji genów w populacji komórek OBL z wysoką i niską zawartością ROS.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: nie dotyczy

Rodzaj pracy: badanie naukowe podstawowe /badanie naukowe stosowane

Referencje:1. Bassan R. Evolving strategies for the management of high-risk adult acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2005 Oct;90(10):1299. PubMed PMID: 16219555. eng.2. Klumper E, Pieters R, Veerman AJ, Huismans DR, Loonen AH, Hählen K, et al. In vitro cellular drug resistance in children with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 1995 Nov;86(10):3861-8. PubMed PMID: 7579354. eng.

3. Jang YY, Sharkis SJ. A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem cells that may reside in the low-oxygenic niche. Blood. 2007 Oct;110(8):3056-63. PubMed PMID: 17595331. Pubmed Central PMCID: PMC2018677. eng4. Lagadinou ED, Sach A, Callahan K, Rossi RM, Neering SJ, Minhajuddin M, et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 2013 Mar;12(3):329-41. PubMed PMID: 23333149. Pubmed Central PMCID: PMC3595363. eng.5. Diehn M, Cho RW, Lobo NA, Kalisky T, Dorie MJ, Kulp AN, et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 2009 Apr;458(7239):780-3. PubMed PMID: 19194462. Pubmed Central PMCID: PMC2778612. eng.

Pozostały okres realizacji pracy:1 rok.Zadania do wykonania w 2018 r.:1. Scharakteryzowanie markerów identyfikujących populację uśpionych/opornych na terapię komórek OBL na podstawie dostępnych danych RNAseq. Korelacja uzyskanych danych z wcześniejszymi wynikami. 2. Ocena poziomu ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm energetyczny i utylizację ROS w pierwotnych komórkach OBL sortowanych na zawartość ROS (materiał z diagnozy) oraz u chorych z OBL MRD+ (materiał z MRD).3. Określenie korelacji między profilem ekspresji genów komórek pochodzących z MRD a komórek ROS-low pochodzących z diagnozy.4. Określenie profilu metabolicznego komórek OBL z wysoką i niską zawartością ROS (linie komórkowe, materiał pierwotny).5. Ocena wpływu czynników modulujących równowagę redox na żywotność pierwotnych komórek OBL z wysoką i niską zawartością ROS.6. Ocena wpływu modulacji metabolizmu energetycznego na żywotność pierwotnych komórek OBL z wysoką i niską zawartością ROS.7. Ocena łącznego zastosowania chemioterapeutyków i czynników modulujących metabolizm i stan redox w komórkach pierwotnych OBL z wysoką i niską zawartością ROS.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport / publikacja.Nazwiska wykonawców: A. Polak, P. Górniak, M. Szydłowski, E. Lech-Marańda, H. Makuch-Łasica, P. Juszczyński

Temat 4 „Specjalistyczne metody diagnostyki i terapii chorób krwi”

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 4.1 4/016/2010(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.1/ 4.2 w Planie Naukowym 2013

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.1 / 4.2 w Planie Naukowym 2014PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.1 / 4.2 w Planie Naukowym 2015

PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.1 w Planie Naukowym 2016PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.1 w Planie Naukowym 2017)

Optymalizacja metod diagnostycznych i leczenia chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego

Wstęp: Badania diagnostyczne służą do ustalenia rozpoznania chorób, czynników prognostycznych, monitorowania wyników leczenia. Determinują wybór metod leczenia u chorych. Na całym świecie prowadzone są próby udoskonalenia diagnostyki w celu zwiększenia wyleczalności chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego. W ostatnich latach wyniki badań cytogenetycznych i molekularnych stały się podstawą rozpoznawania, prognozowania i oceny skuteczności leczenia. Odsetek uzyskiwanych trwałych remisji w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego jest wciąż niski, a odsetek nawrotów choroby jest wciąż znaczny. Na całym świecie prowadzone są próby udoskonalenia metod leczenia celem zwiększania wyleczalności chorób rozrostowych.

Hipoteza badawcza: Zastosowanie nowych metod leczenia chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego lub optymalizacja istniejących w oparciu o czynniki biologiczno-kliniczne, jak też zastosowanie nowych metod diagnostycznych (metody cytogenetyczne oraz biologii molekularnej) pozwolą na lepszą diagnostykę, stratyfikację prognostyczną oraz poprawę wyników terapii.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Celem pracy jest kontynuacja oceny skuteczności nowych metod leczenia nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego, jak też wdrażanie i optymalizacja nowych metod diagnostycznych, w tym cytogenetycznych i molekularnych. Większość nowych metod diagnostycznych i nowych metod leczenia będzie realizowana we współpracy z Polską Grupą ds. Leczenia Białaczek u Dorosłych (PALG), Polską Grupą Badawczą Chłoniaków (PLRG), Polską Grupą Szpiczakową (PGSz) oraz Polskim Konsorcjum Szpiczakowym. W szczególności, do zadań badawczych realizowanych w ramach tej pracy należeć będą:1. Rejestr generyków imatynibu - badanie obserwacyjne PALG - projekt we współpracy z prof. Tomaszem Sachą, aktualnie w fazie follow-up. Kierownik: Joanna Góra-Tybor. Zespół: Krzysztof Warzocha, Aleksandra Gołos.2. Rejestr chorych na PBSZ dotyczący wpływu chorób współistniejących i terapii dodatkowych na efekty leczenia - badanie obserwacyjne PALG. Kierownik: Joanna Góra-Tybor. Zespół: Krzysztof Warzocha, Elżbieta Patkowska, Ilona Seferyńska.3. Odstawienie imatynibu – projekt PALG we współpracy z prof. Tomaszem Sachą. Kierownik: Joanna Góra-Tybor. Zespół: Krzysztof Warzocha, Elżbieta Patkowska, Ilona Seferyńska.

4. Wtórne zespoły mielodysplastyczne po terapii innego nowotworu hematologicznego - rejestr w ramach klubu „Młodych Hematologów”. Kierownik: Aleksandra Gołos. Zespół: Joanna Góra-Tybor, Kamil Wiśniewski, Krzysztof Warzocha.5. Analiza retrospektywna infekcji grzybiczych u pacjentów z AML otrzymujących profilaktykę pozakonazolem podczas indukcji DA, DAC – współpraca z Kliniką Hematologii UM w Gdańsku – Kierownik: Aleksandra Gołos. Zespół: Joanna Góra-Tybor, Kamil Wiśniewski, Krzysztof Warzocha.6. Analizy retrospektywne u pacjentów z rozpoznaniem szpiczaka plazmocytowego koordynowane przez PGSZ (leczenie daratumumabem, VTD, VCD, terapia chorych dializowanych, alloSCT). Kierownik: Krzysztof Jamroziak. Zespół: Krzysztof Warzocha, Aleksander Salomon-Perzyński, Bartosz Puła, Agnieszka Końska i 2 studentki z Koła naukowego – Katarzyna Tusznio i Agnieszka Gałązka.7. Analizy retrospektywne w przewlekłej białaczce limfocytowej: porównanie skuteczności i tolerancji schematów RFC (RFC-lite) i RB, ocena znaczenia prognostyczne zmian cytogenetycznych, stężenia B2-mikroglobuliny w odniesieniu do klirensu kreatyniny i BMI oraz badania obserwacyjne PALG dotyczące leczenia ibrutynibem i idelalyzibem. Kierownik: Krzysztof Jamroziak. Zespół: Krzysztof Warzocha, Bartosz Puła, Aleksander Salomon-Perzyński, Agnieszka Końska, Agata Malenda, Urszula Walczak.8. Porównanie skuteczności i tolerancji schematów RCHOP i BR u chorych starszych z rozpoznaniem chłoniaka z komórek płaszcza. Kierownik: Krzysztof Warzocha. Zespół: Krzysztof Jamroziak, Aleksander Salomon-Perzyński, Bartosz Puła, Joanna Barankiewicz.9. Analiza porównawcza skuteczności schematów DA-EPOCH-R i R-CHOP w leczeniu 1 linii u chorych na pierwotnego chłoniaka śródpiersia z komórek B. Kierownik: Krzysztof Warzocha. Zespół: Krzysztof Jamroziak, Ewa Lech-Marańda, Agnieszka Kołkowska, Agata Malenda.10. Analiza retrospektywna terapii białaczki włochatokomórkowej w IHiT (Skuteczność i mechanizm działania kladrybiny w białaczce włochatokomórkowej). Kierownik: Krzysztof Warzocha. Zespół: Krzysztof Jamroziak, Agnieszka Kołkowska-Leśniak, Joanna Barankiewicz, Kinga Kos-Zakrzewska.11. Analiza porównawcza przebiegu chłoniaków z cechami pośrednimi DLBCL/HL i DLBCL/Burkitt. Wpływ poszczególnych anomalii molekularnych (c-myc, bcl-2, bcl-6) we współpracy z PLRG. Kierownik: Krzysztof Warzocha. Zespół: Krzysztof Jamroziak, Monika Chełstowska, Ewa Lech-Marańda, Aleksander Salomon-Perzyński, Małgorzata Jarzembowska12. Analiza retrospektywna wyników leczenia pacjentów z rozpoznaniem amyloidozy AL – planowane rozszerzenie na poziom krajowy w ramach PGSz. Kierownik: Krzysztof Jamroziak. Zespół: Krzysztof Warzocha, Aleksander Salomon-Perzyński, Bartosz Puła.13. Ocena wpływu składowych całościowej oceny geriatrycznej na wyniki leczenia u pacjentów powyżej 60 lat z rozlanym chłoniakiem z dużych limfocytów B – badanie prospektywne, obserwacyjne. Kierownik: Katarzyna Budziszewska. Zespół: Krzysztof Warzocha, Agata Malenda, Joanna Barankiewicz, Monika Chełstowska.14. Ocena wpływu stanu ogólnego w skali ECOG i wskaźnika chorób współistniejących w skali CIRS na wyniki leczenia u pacjentów powyżej 60 lat z rozlanym chłoniakiem z dużych limfocytów B – badanie retrospektywne, obserwacyjne. Kierownik: Katarzyna Budziszewska.

Zespół: Krzysztof Warzocha, Ewa Lech-Marańda, Agata Malenda, Joanna Barankiewicz, Monika Chełstowska.15. Wyniki leczenia wg schematu R-mini-CHOP pacjentów w wieku 80 lat lub powyżej z rozlanym chłoniakiem z dużych limfocytów B – badanie prospektywne, obserwacyjne. Kierownik: Krzysztof Warzocha. Zespół: Katarzyna Budziszewska, Joanna Barankiewicz, Aleksander Salomon-Perzyński, Urszula Walczak, Kinga Kos-Zakrzewska.16. PALG-AML 2/2016 - Prospektywne badanie obserwacyjne Polskiej Grupy Leczenia Białaczek Dorosłych (PALG) oceniające wyniki leczenia chorych na ostre białaczki szpikowe w wieku 60 lat lub powyżej z uwzględnieniem całościowej oceny geriatrycznej. Kierownik: Katarzyna Budziszewska. Zespół: Krzysztof Warzocha, Ewa Lech-Marańda, Agata Malenda, Kinga Kos-Zakrzewska, Aleksandra Gołos, Joanna Góra-Tybor. 17. PALG-AML 2/2016 - Prospektywne badanie obserwacyjne Polskiej Grupy Leczenia Białaczek Dorosłych (PALG) oceniające wyniki leczenia chorych na ostre białaczki szpikowe w wieku poniżej 60 lat. Kierownik: Joanna Góra-Tybor. Zespół: Krzysztof Warzocha, Ewa Lech-Marańda, Katarzyna Budziszewska, Aleksandra Gołos, Elżbieta Patkowska.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: Badania będą wykonywane według obowiązujących światowych standardów diagnostycznych. Ponadto będą prowadzone nowatorskie badania nad ustaleniem nowych czynników prognostycznych oraz monitorowaniem choroby resztkowej z zastosowaniem badań immunofenotypowych i molekularnych.Planowane jest również kontynuowanie wdrażania nowych metod leczenia chorych wg programów terapeutycznych wprowadzanych przez PALG, PLRG i PGSz. Wyniki badań będą raportowane do ośrodków koordynujących badania kliniczne, jak również poddawane analizie wewnętrznej.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Opracowanie bardziej skutecznych metod diagnostycznych w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego i zastosowanie uzyskanych danych do optymalizacji metod leczenia. Opracowanie bardziej skutecznych metod leczenia chorób nowotworowych układu krwiotwórczego i chłonnego.

Pozostały okres realizacji pracy w latach: 3 lata.Zadania do wykonania w 2018 r.: Kontynuacje prac realizowanych dotychczas w ramach PALG, PLRG i PGSz dotyczących diagnostyki i leczenia ostrych i przewlekłych białaczek, chłoniaków i szpiczaka plazmocytowego.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raporty i publikacje, w tym część z nich przedstawiana będzie podczas konferencji PALG, PLRG oraz PGSz. Nazwiska wykonawców: K. Warzocha, E. Lech-Marańda, P. Juszczyński, P. Górniak, E. Białopiotrowicz, K. Jamroziak, J. Góra-Tybor, I. Seferyńska, B.K. Budziszewska, E. Mendek-Czajkowska, J. Barankiewicz, A. Malenda, B. Puła, E. Mądro, M. Dąbrowska, T. Szpila, A. Ejduk, J. Sawczuk-Chabin, A. Kołkowska-Leśniak, E. Patkowska, W. Makowska, A. Paczek, M. Chełstowska, B. Kwaśniak, M. Jarzembowska, A. Końska, K. Kos-Zakrzewska, U. Walczak, J. Wasilewska, I. Solarska, H. Makuch-Łasica, K. Borg, B. Kruk, A. Gołos, K. Wiśniewski, A. Salomon-Perzyński


Optymalizacja postępowania diagnostycznego i terapeutycznego związanego z transplantacjami hematopoetycznych komórek macierzystych

Wstęp: Transplantacje komórek krwiotwórczych stanowią obecnie codzienną praktykę kliniczną, dając szansę wyleczenia wielu pacjentów z nowotworowych chorób układu krwiotwórczego i chłonnego. Dalszy rozwój tej dziedziny i poprawa wyników przeszczepiania wymaga szczegółowych ocen retrospektywnych i obserwacji prospektywnych z uwzględnieniem znanych i hipotetycznych czynników prognostycznych. Główne planowane tematy badań dotyczą przede wszystkim:

Prospektywnej obserwacji i analizy skuteczności tandemowych przeszczepień autologicznych w porównaniu z przeszczepieniami pojedynczymi u chorych na szpiczaka mnogiego;

Wpływu mutacji genetycznych w ostrych białaczkach szpikowych na wyniki allotransplantacji;

Wpływu kolonizacji przewodu pokarmowego bakteriami lekoopornymi na wyniki przeszczepień komórek krwiotwórczych;

Prospektywnej oceny skuteczności i działań niepożądanych zapobiegania zakażenia/reaktywacji CMV walgancyklowirem u chorych po alotransplantacjach (uzyskana zgoda komisji bioetycznej).

Hipoteza badawcza: Analiza czynników prognostycznych oraz skuteczności przyjętego postępowania terapeutycznego może pozwolić na poprawę wczesnych i odległych wyników leczenia chorych poddawanych transplantacjom komórek krwiotwórczych.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Rozpoczęto zbieranie i analizę danych chorych poddawanych transplantacjom wIHiT.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu:Planowana jest kontynuacja zgodnie z założeniami.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Poprawa wyników przeszczepiania na podstawie przeprowadzonych analiz i ich wniosków. Zaproponowanie ulepszonych sposobów postępowania terapeutycznego iż zapobiegawczego u chorych poddawanych transplantacjom.

Rodzaj prac: badanie naukowe stosowane / praca rozwojowa

Pozostały okres realizacji pracy: 2018-2019 r.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Raport.Wykonawcy: K. Hałaburda, A. Tomaszewska, B. Nasiłowska-Adamska, M. Tormanowska


Przeszczepianie flory jelitowej i alogenicznych komórek krwiotwórczych od dawców rodzinnych chorym poddawanym transplantacjom

Wstęp: Prawidłowa flora jelitowa ma podstawowe znaczenie w homeostazie organizmu ludzkiego (funkcje metaboliczne, strukturalne, ochronne i in.). Jej istotne zaburzenia stwierdza się w szeregu chorób, począwszy od infekcyjnych, poprzez autoimmunizacyjne, kończąc na otyłości. Znaczenie prawidłowego mikrobiomu jelitowego w regulacji odpowiedzi immunologicznej zaczęto dostrzegać niedawno. Szczególnie istotną rolę mają niektóre rodzaje beztlenowców, które hamują rozwój odpowiedzi zapalnej. Udowodniono, że zaburzenia składu mikrobiomu (zmniejszenie różnorodności, zanikanie niektórych beztlenowców) istotnie zwiększa ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD – Graft versus Host Disease) i śmiertelności po alotransplantacjach, a nawet ryzyko nawrotu choroby zasadniczej. Większość chorych poddawanych alloprzeszczepieniom komórek krwiotwórczych ma istotnie zaburzony mikrobiom jelitowy na skutek wcześniejszej chemioterapii, antybiotykoterapii oraz kolonizacji bakteriami lekoopornymi.W projekcie planowana jest korekta składu flory jelitowej za pomocą przeniesienia od zdrowego osobnika, będącego jednocześnie dawcą komórek krwiotwórczych. Skład mikrobiomu jelitowego dawcy i biorcy będzie analizowany przez sekwencjonowanie podjednostki 16S rybosomu w próbkach kału. Skuteczność korekcji mikrobiomu zostanie oceniona po trzykrotnym przeniesieniu od dawcy przed transplantacją. Po regeneracji hematologicznej po przeszczepieniu procedura zostanie powtórzona. Jednocześnie planowana jest u chorych seryjna ocena biomarkerów we krwi charakterystycznych dla GvHD oraz stężenia indykanu w moczu (odzwierciedlenie metabolizmu bakterii beztlenowych). Wyniki zostaną skorelowane zdanymi klinicznymi obejmującymi przede wszystkim częstość i nasilenie GvHD, śmiertelność związaną z procedurą oraz częstość nawrotów. Przeprowadzenie u chorych korekcji flory jelitowej przy pomocy materiału pobranego od dawców komórek krwiotwórczych potencjalnie powinno zredukować częstość i nasilenie GvHD oraz korzystnie wpłynąć na przebieg procedury transplantacyjnej. Planowane jest włączenie do badania około 30 chorych wciągu 3 lat. Przed złożeniem wniosku o grant planowane jest przeprowadzenie badania pilotażowego u pięciu chorych.

Hipoteza badawcza: Przeniesienie flory jelitowej ze zdrowego dawcy do pacjenta ma na celu:

Zachowanie bioróżnorodności flory jelitowej i utrzymanie odpowiedniej ilości korzystnych beztlenowców u chorych poddawanych allotransplantacjom;

Potencjalne zmniejszenie ryzyka ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi dzięki interakcji limfocytów T dawcy z mikrobiomem jelitowym pochodzącym także od dawcy;

Potencjalne zmniejszenie śmiertelności nie związanej z nawrotem we wczesnym i późnym okresie potransplantacyjnym (dane literaturowe);

Potencjalne zmniejszenie ryzyka nawrotu choroby zasadniczej.

Dotychczasowa realizacja celów badania:Opracowano protokół badania wraz ze szczegółową informacją dla chorych i formularzem uświadomionej zgody. Uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej na przeprowadzenie badania.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: jak w celach badania.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane / praca rozwojowa

Referencje: Raghunathan VM, Sheng I, Lim SH. Intestinal dysbiosis and allogeneic hematopoietic progenitor

celltransplantation. J Transl Med. 2016 Dec 3;14(1):335 Weber D, Jenq RR, Peled JU, Taur Y, Hiergeist A, Koestler J, Dettmer K, Weber M, Wolff D, Hahn J, Pamer EG,

Herr W, Gessner A, Oefner PJ, van den Brink MR, Holler E. Microbiota Disruption Induced by Early Use of Broad-Spectrum Antibiotics Is an Independent Risk Factor of Outcome after AllogeneicStem Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2017 May;23(5):845-852.

Taur Y, Jenq RR, Perales MA, Littmann ER, Morjaria S, Ling L, No D, Gobourne A, Viale A, Dahi PB, Ponce DM, Barker JN, Giralt S, van den Brink M, Pamer EG. The effects of intestinal tract bacterial diversity on mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2014 Aug 14;124(7):1174-82.

Pozostały okres realizacji pracy: 2018-2019 r.Zadania do wykonania w2018 r.: Intensywna rekrutacja chorych – planowane wykonanie procedury u 15 pacjentów.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: RaportWykonawcy: K. Hałaburda, A. Tomaszewska, B. Nasiłowska-Adamska, M. Tormanowska


Ocena tromboelastometrycznych właściwości skrzepu oraz maksymalnego stężenia i potencjału generowanej trombiny u polskich pacjentów z rzadko występującymi

wrodzonymi niedoborami czynników krzepnięcia krwi

Wstęp: Do grupy rzadko występujących skaz krwotocznych zalicza się niedobory pojedynczych osoczowych czynników krzepnięcia (I, II, V, VII, X, XI, XIII) oraz niedobory złożone (czynników V i VIII lub czynników zależnych od witaminy K – II, VII, IX IX). Częstość występowania tych defektów waha się od 1 na 350 000 osób ogólnej populacji (w przypadku niedoboru czynnika VII) do 1 na 2 000 000 (w przypadku niedoboru czynnika II lub XIII). Rzadko występujące niedobory czynników krzepnięcia są chorobami uwarunkowanymi genetycznie, dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny. Na dzień 07.05.2015r. w Ogólnopolskim Rejestrze Wrodzonych Skaz Krwotocznych prowadzonym w IHiT znajdowało się 409 pacjentów z rzadko występującymi wrodzonymi niedoborami czynników krzepnięcia: 26 osób z niedoborem czynnika V, 21 – z niedoborem czynnika X, 0 – z niedoborem czynnika II, 231 – z niedoborem czynnika VII, 51 – z niedoborem czynnika XI, 69 – z niedoborem czynnika I, 10 – z niedoborem czynnika XIII oraz 1 osoba ze złożonym niedoborem czynników V i VIII.Ze względu na bardzo heterogenny obraz kliniczny skazy krwotocznej w tej grupie pacjentów (u których stopień niedoboru czynnika krzepnięcia w osoczu rzadko koresponduje z nasileniem krwawień) poszukuje się innych testów laboratoryjnych umożliwiających ocenę stopnia ryzyka wystąpienia krwawień. Do testów takich można zaliczyć:- badanie tromboelastometryczne (Thromboelastometry, TEM), pozwalające ocenić właściwości fizyczne wytworzonego skrzepu;- badanie maksymalnego stężenia i potencjału generowanej trombiny (Thrombin Generation Assay, TGA) w osoczu. Analiza wyników TEM i TGA w powiązaniu z podłożem molekularnym defektu, może istotnie przyczynić się do rozwoju diagnostyki i leczenia rzadkich skaz krwotocznych. W badaniu zostaną wykorzystane dane pilotażowe uzyskane przy realizacji innych projektów, w których poznano np. podłoże molekularne większości przypadków niedoboru czynników XIII, XI, V i VIII oraz VII.

Hipoteza badawcza: Rzadko występujące wrodzone skazy krwotoczne na tle niedoboru czynników krzepnięcia charakteryzują się zróżnicowaną i trudną do oceny tendencją do krwawień. Fakt ten obserwuje się zarówno u pacjentów z tym samym typem niedoboru, czy tej samej aktywności niedoborowego czynnika krzepnięcia, a nawet z tą samą mutacją odpowiedzialną za wystąpienie choroby. Poznanie właściwości wytworzonego skrzepu w badaniu tromboelastometrycznym oraz określenie maksymalnego stężenia i potencjału powstałej w osoczu trombiny być może przyczyni się do optymalizacji diagnostyki i leczenia tej grupy pacjentów.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Dotychczas badaniem objęto 59 niespokrewnionych pacjentów zarejestrowanych w

rejestrze wrodzonych skaz krwotocznych prowadzonym w IHiT; Po uzyskaniu świadomej zgody na udział w badaniu od każdego włączonego pacjenta

zebrano wywiad odnośnie przebiegu klinicznego defektu i pobrano próbki krwi obwodowej na testy laboratoryjne;

Zaplanowane testy laboratoryjne (tj. ocena tromboelestometryczna skrzepu ROTEM Delta; ocena maksymalnego stężenia i tempa generowanej trombiny oraz wyliczenie potencjału trombinowego osocza (TGA, Technoclone); poszukiwanie mutacji sprawczych metodą bezpośredniego automatycznego sekwencjonowania wg Sangera) są prowadzone w Zakładzie Hemostazy i Chorób Metabolicznych;

Do końca 2017 roku zaplanowano włączenie co najmniej 10 niespokrewnionych pacjentów.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Wykorzystanie TEM i TGA w ocenie ryzyka wystąpienia powikłań krwotocznych u

pacjentów z rzadko występującymi skazami krwotocznymi; Określenie podłoża genetycznego rzadko występujących skaz krwotocznych i

skorelowanie genotypu z fenotypem, czyli obrazem klinicznym co pozwoli precyzyjniej sklasyfikować badane choroby pod kątem zagrożenia powikłaniami krwotocznymi;

Rozszerzenie poradnictwa genetycznego rzadkich skaz krwotocznych i weryfikacja epidemiologiczna stanu nosicielstwa tych defektów w Polsce.


Referencje Palla R, Peyvandi F, Shapiro AD. Rare bleeding disorders: diagnosis and treatment. Blood. 2015 Mar

26;125(13):2052-2061. Mumford AD, Ackroyd S, Alikhan R, Bowles L, Chowdary P, Grainger J, Mainwaring J, Mathias M,

O'Connell N; BCSH Committee. Guideline for the diagnosis and management of the rare coagulation disorders: aUnited Kingdom Haemophilia Centre Doctors' Organization guideline on behalf of the British Committee for Standards in Haematology. Br J Haematol. 2014 Nov;167(3):304-26.

Peyvandi F, Menegatti M, Palla R.Rare bleeding disorders: worldwide efforts for classification, diagnosis, and management. Semin Thromb Hemost. 2013 Sep;39(6):579-84.

Zekavat OR, Haghpanah S, Dehghani J, Afrasiabi A, Peyvandi F, Karimi M. Comparison of thrombin generation assay with conventional coagulation tests in evaluation of bleeding risk in patients with rare bleeding disorders. Clin Appl Thromb Hemost. 2014 Sep;20(6):637-44. doi: 10.1177/1076029613475473.

Van Geffen M, Menegatti M, Loof A, Lap P, Karimi M, Laros-van Gorkom BA, Brons P, Van Heerde WL Retrospective evaluation of bleeding tendency and simultaneous thrombin and plasmin generation in patients with rare bleeding disorders. Haemophilia. 2012 Jul;18(4):630-8.

Ivaskevicius V, Windyga J, Baran B, Bykowska K, Daugela L, Watzka M, Seifried E, Oldenburg J. The first case of combined coagulation factor V and coagulation factor VIII deficiency in Poland due to anovel p.Tyr135Asn missense mutation in the MCFD2 gene. Blood Coagul Fibrinolysis. 2008 Sep;19(6):531-534.

Ivaskevicius V, Windyga J, Baran B, Schroeder V, Junen J, Bykowska K, Seifried E, Kohler HP, Oldenburg J. Phenotype-genotype correlation in eight Polish patients with inherited Factor XIII deficiency: identification of three novel mutations. Haemophilia . 2007 Sep;13(5):649-57.

Pozostały okres realizacji pracy w latach: 2018 r.Zadania do wykonania w2018 r.:- Nawiązanie kontaktu z kolejnymi pacjentami;- W grupie zakwalifikowanych do badania pacjentów wykonanie zaplanowanych testów laboratoryjnych w Zakładzie Hemostazy i Chorób Metabolicznych;- Analiza uzyskanych wyników;- Aplikacja o grant zewnętrzny (IV kwartał 2018 lub I kwartał 2019 r.).Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Raport.Wykonawcy: J. Windyga, E. Odnoczko, B. Baran, K. Bykowska, E. Stefańska-Windyga, A. Sikorska, M. Górska-Kosicka, A. Buczma, A. Gwozdowska, S. Jurek, R. Wasilewski, B. Ceglarek


Optymalizacja rozpoznawania i leczenia zaburzeń hemostazy – trombofilii, wrodzonych i nabytych mikroangiopatii zakrzepowych, hemofilii, hemofilii powikłanej inhibitorem,

choroby von Willebranda, rzadkich skaz krwotocznych pokrewnych hemofilii oraz udoskonalanie metod laboratoryjnych monitorowania antykoagulantów oraz

diagnozowania i monitorowania leczenia chorych na porfirię i pacjentów z nocną napadową hemoglobinurią

Wstęp: Klinika Zaburzeń Hemostazy i Chorób Wewnętrznych oraz Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych aktywnie uczestniczy w szeregu projektów naukowych i edukacyjnych, których celem jest optymalizacja zarówno metod diagnostycznych (klinicznych i laboratoryjnych), jak i sposobów leczenia różnych zaburzeń hemostazy. Przykładami mogą być: próba wykorzystania testów globalnych hemostazy, takich jak generacja trombiny i tromboelastometria w celu diagnozowania i leczenia wrodzonych skaz krwotocznych i trombofilii, optymalizacja metod laboratoryjnych stosowanych do wykrywania oraz ilościowego pomiaru patologicznych inhibitorów czynników krzepnięcia, uczestnictwo w próbach klinicznych oceniających bezpieczeństwo i skuteczność m.in. modyfikowanych genetycznie białek w leczeniu hemofilii i choroby von Willebranda, poszukiwanie optymalnych metod laboratoryjnego monitorowania stosowania antykoagulantów, w tym Direct Oral Anticoagulants. Nadto we współpracy z ośrodkami i organizacjami krajowymi i zagranicznymi realizowane są różne projekty naukowe, które obejmują zagadnienia mieszczące się w zaproponowanym tytule obecnej pracy. W ostatnim czasie zakres zainteresowań naukowych Kliniki i Zakładu poszerzył się o nocną napadową hemoglobinurię i aktywność naukowa na tym polu będzie intensyfikowana w kolejnych latach.

Hipoteza badawcza: Pomimo postępu zarówno w zakresie diagnostyki laboratoryjnej, jak i terapii zaburzeń hemostazy wciąż istnieje potrzeba optymalizacji procedur diagnostyczno-leczniczych w tej dziedzinie medycyny. Zadaniem lekarzy i diagnostów laboratoryjnych z Kliniki Zaburzeń Hemostazy i Chorób Wewnętrznych oraz Zakładu Hemostazy i Chorób Metabolicznych jest prowadzenie działalności naukowej, szkoleniowo-edukacyjnej i publikacyjnej w celu realizacji tego celu. Tytuł niniejszej pracy określa zakres ww. działalności.

Cele badania: W 2018 r. realizowane będą następujące zadania: a) ocena skuteczności trzeciorzędowej profilaktyki krwawień u dorosłych pacjentów z ciężką hemofilią, b) ocena skuteczności i bezpieczeństwa stosowania koncentratów czynników krzepnięcia u pacjentów z hemofilią i chorobą von Willebranda, c) ocena leczenia hemostatycznego pacjentów z wrodzonymi skazami krwotocznymi, którzy są poddawani operacjom chirurgicznym, d) ocena przebiegu klinicznego i podłoża genetycznego zespołu Upshaw-Schulmana, e) ocena możliwości zastosowania testu generacji trombiny i aktywności anty-Xa w monitoringu bezpośrednich doustnych antykoagulantów z grupy anty-Xa, f) ocena efektu ITI w grupie pacjentów z hemofilią a i przetrwałym inhibitorem czynnika VIII, g) optymalizacja metod

wykrywania oraz ilościowego pomiaru miana inhibitora wobec czynnika krzepnięcia we wrodzonych oraz nabytych skazach krwotocznych.

Plan realizacji projektu i metodyka: W realizacji powyższych celów nie przewiduje się konieczności zakupu aparatury. Wyniki testów laboratoryjnych wykorzystanych do realizacji celów projektu są wykonywane w większości rutynowo lub w ramach prób klinicznych. Metodyka badań jest uzależniona od tematów konkretnych projektów cząstkowych składających się na całość pracy. Najważniejszym elementem realizacji projektu jest ogłoszenie i opublikowanie uzyskanych wyników. Docelowo przewiduje się prezentacje prac na konferencjach naukowo-szkoleniowych, jak i publikacje prac poglądowo-przeglądowych, oryginalnych i streszczeń zjazdowo-konferencyjnych.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Aktualizacja stanu wiedzy dotyczącej rozpoznawania i leczenia wybranych zaburzeń hemostazy, umożliwiająca optymalne postępowanie diagnostyczno-terapeutyczne w grupie chorych na wrodzone i nabyte skazy krwotoczne i stany pro-zakrzepowe. Rodzaj pracy: badanie naukowe podstawoweReferencje:

1. Coppola A , Windyga J , Tufano A, Yeung C, Di Minno MN. Treatment for preventing bleeding in people with haemophilia or other congenital bleeding disorders undergoing surgery. Cochrane Database Syst Rev. 2015 Feb 9;2:CD009961.

2. Oldenburg J. Optimal treatment strategies for hemophilia: achievements and limitations of current prophylactic regimens.Blood. 2015;125: 2038-44.

3. Björkman S . Population pharmacokinetics of recombinant factor IX: implications for dose tailoring. Haemophilia. 2013; 19: 753-7.

4. Fischer K, Lassila R, Peyvandi F, Calizzani G, Gatt A, Lambert T, Windyga J, Iorio A, Gilman E, Makris M; EUHASS participants. Inhibitor development in haemophilia according to concentrate. Four-year results from the European Haemophilia Safety Surveillance (EUHASS) project.J Thromb Haemost 2015; 113: 968-973.

5. Barrowclifee TW. Monitoring haemophilia severity and treatment: new or old laboratory tests? Haemophilia 2004; 10 (supl. 4): 109-114.

6. Colvin BT, Astermark J, Fischer K, Gringeri A, Lassila R, Schramm W, Thomas A, Ingerslev J. For the Interdisciplinary Working Group. European principles of haemophilia care. Haemophilia 2008; 14: 361-374.

7. Oldenburg J, Ananyeva NM, Saenko EL. Molecular basis of haemophilia A. Haemophilia 2004; 10 (supl. 4): 133-139.

8. Windyga J, Stefańska E, Łopaciuk S, Juszyński A, Woźniak D, Strzelecki D. Stan narządu ruchu w wybranej grupie chorych na ciężką hemofilię. Pol. Arch. Med. Wew. 2005; 113: 6, 562-569.

9. Goodeve AC . Hemophilia B: molecular pathogenesis and mutation analysis. J Thromb Haemost . 2015; 13:1184-95.

10. Dargaud YG., Klamroth R., Rusen L., Windyga J., Bichler J., Knaub S., Negrier C. Thrombin generation and bleeding phenotype during personalized prophylaxis with recombinant human FVIII in previously treated patients with severe hemophilia A. Blood 2016; 128: 1410.

11. Scully M., Knoebl P., Kentouche K., Rice L., Windyga J., Schneppenheim R., Kremer Hovinga JA., Kajiwara M., Maggiore C., Doralt J., Martell L., Ewenstein BM. Pharmacodynami profile of a recombinant ADAMTS13 (BAX930) in hereditary thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman Syndrome (USS)). Blood 2016; 128: 135.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Goodeve+AC.+JThromb+Haemost+2015%3B+13%3A+1184-1195.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Goodeve%20AC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25851415

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25567324


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=137.%09Bjorkman+Haemophilia+2012%3B+19%3A+753-757.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bj%C3%B6rkman%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23731351



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coppola%2C+Windyga+Cochrane+2015.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coppola%2C+Windyga+Cochrane+2015.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Di%20Minno%20MN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25922858

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yeung%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25922858

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tufano%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25922858

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Windyga%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25922858

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coppola%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25922858

12. Windyga J, Dolan G, Altisent C, Katsarou O, López Fernández MF, Zülfikar B; EHTSB. Practical aspects of factor concentrate use in patients with von Willebrand disease undergoing invasive procedures: a European survey.Haemophilia. 2016 Sep;22(5):739-51.

13. Windyga J. Is Continuous Low-Dose Prophylaxis Superior to On-Demand Treatment for Patients with Hemophilia?Semin Thromb Hemost. 2016 Jul;42(5):533-40.

14. Oldenburg J, Windyga J, Hampton K, Lalezari S, Tseneklidou-Stoeter D, Beckmann H, Maas Enriquez M.Safety and efficacy of BAY 81-8973 for surgery in previously treated patients with haemophilia A: results of the LEOPOLD clinical trial programme.Haemophilia. 2016 May;22(3):349-53.

15. Windyga J, Dolan G, Altisent C, Katsarou O, López Fernández MF, Zülfikar B; EHTSB. Practical aspects of DDAVP use in patients with von Willebrand Disease undergoing invasive procedures: a European survey.Haemophilia. 2016 Jan;22(1):110-20.

16. Kentouche K., Voigt A., Schleussner E., Schneppenheim R., Budde U., Beck J. F., Stefańska-Windyga E., Windyga J. Pregnancy in Upshaw-Schulman Syndrome. Hämostaseologie 2013, 33, 144-148.

17. Undas A, Pasierski T, Windyga J, Crowther M. Practical aspects of new oral anticoagulant use in atrial fibrillation.Pol Arch Med Wewn. 2014;124(3):124-35.

18. Windyga J., Chojnowski K., Klukowska A i wsp. Zasady postępowania w hemofilii A i B powikłanej inhibitorem. Acta Haematol. Pol. 2008; 39 (3): 565–579.

19. Buczma A, Windyga J. Nabyta hemofilia. Pol. Arch. Med. Wew. 2007; 5-6: 241-245.20. Bardi E, Astermark J. Genetic risk factors for inhibitors in haemophilia A. Eur J Haematol. 2015 Feb;94

Suppl 77:7-10.21. Fischer K, Iorio A, Lassila R, Peyvandi F, Calizzani G, Gatt A, Lambert T, Windyga J, Gilman EA,

Makris M; EUHASS Participants. Inhibitor development in non-severe haemophilia across Europe. Thromb Haemost. 2015 Oct;114(4):670-5.

22. Astermark J, Altisent C, Batorova A, Diniz MJ, Gringeri A, Holme PA, Karafoulidou A, Lopez-Fernández MF, Reipert BM, Rocino A, Schiavoni M, von Depka M, Windyga J, Fijnvandraat K; European Haemophilia Therapy Standardisation Board. Non-genetic risk factors and the development of inhibitors in haemophilia: a comprehensive review and consensus report. Haemophilia. 2010 Sep 1;16(5):747-66.

23. Coppola A, Favaloro EJ, Tufano A, Di Minno MN, Cerbone AM, Franchini M. Acquired inhibitors of coagulation factors: part I-acquired hemophilia A. Semin Thromb Hemost. 2012 Jul;38(5):433-46.

24. Franchini M, Lippi G, Favaloro EJ. Acquired inhibitors of coagulation factors: part II. Semin Thromb Hemost. 2012 Jul;38(5):447-53.

25. Verbruggen B; Diagnosis and quantification of factor VIII inhibitors. Haemophilia. 2010 May;16(102):20-4.

26. Verbruggen B, Dardikh M, Polenewen R, van Duren C, Meijer P. The factor VIII inhibitor assays can be standardized: results of a workshop. J Thromb Haemost. 2011 Oct;9(10):2003-8.

27. Favaloro EJ, Verbruggen B, Miller CH. Laboratory testing for factor inhibitors. Haemophilia. 2014 May;20 Suppl 4:94-8.

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Optymalizacja diagnostyki i postępowania leczniczego w chorobie von Willebranda, hemofilii oraz hemofilii powikłanej inhibitorem, m.in. profilaktyka długoterminowa i postępowanie okołooperacyjne, modyfikacja i optymalizacja metody czynnościowego pomiaru miana inhibitora. Długoterminowa profilaktyka krwawień w hemofilii powikłanej inhibitorem. Długoterminowa profilaktyka krwawień w hemofilii niepowikłanej inhibitorem u chorych z obecną artropatią hemofilową. Optymalizacja leczenia pacjentów z zespołem Upshaw-Schulmana.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Raport.Wykonawcy: J. Windyga,K. Bykowska, B. Baran, E. Odnoczko, E. Stefańska-Windyga, A. Sikorska, M. Górska-Kosicka, A. Buczma, A. Gwozdowska, S. Jurek, R. Wasilewski, J. Falkowska, B. Ceglarek


Analiza związku stężenia inhibitora szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego, potencjału trombinowego osocza i mutacji sprawczej wgenie F8 lub F9 z nasileniem

objawów skazy krwotocznej u nosicielek hemofilii A i B

Wstęp: Hemofilia A (HA) i B (HB) to jedne z najczęściej rozpoznawanych wrodzonych skaz krwotocznych. U ich podłoża leży brak, niedobór lub dysfunkcja czynnika krzepnięcia VIII (Factor VIII, FVIII) w przypadku HA, bądź czynnika krzepnięcia IX (Factor IX, FIX) w przypadku HB. Zarówno gen kodujący FVIII (F8), jak i gen kodujący FIX (F9), zlokalizowane są na chromosomie X, dlatego HA i HB dziedziczą się w sposób recesywny sprzężony z płcią, przez co chorują mężczyźni, a kobiety są nosicielkami. Nasilenie objawów skazy krwotocznej w hemofilii jest determinowane przez stopień niedoboru FVIII/FIX w osoczu. Na tej podstawie wyróżnia się postać ciężką hemofilii, w której aktywność FVIII/FIX nie przekracza jednej jednostki międzynarodowej (International Unit, IU) /dl, umiarkowaną – FVIII/FIX w granicach 1-5 IU/dl oraz łagodną – FVIII/FIX >5-40 IU/dl. U zdrowych osób aktywność zarówno FVIII jak i FIX mieści się w przedziale 50 - 150 jednostek międzynarodowych w decylitrze (j.m./dl). U większości nosicielek HA lub HB aktywność FVIII lub FIX wynosi około 50% normy, co sprawia, że nosicielstwo hemofilii przebiega zwykle w tej grupie kobiet bezobjawowo. Nie mniej jednak u części z nich obserwuje się nadmierną skłonność do krwawień (m.in. przedłużone krwawienia miesięczne, łatwość siniaczenia się, krwawienia z dziąseł) oraz skłonność do krwawień pourazowych, a nawet spontanicznych. Istnieją także stany kliniczne, w których ryzyko wystąpienia krwawienia u nosicielki hemofilii znacznie wzrasta, są to m.in. poród i połóg. Ponadto wiadomo, że u kobiet w przypadku pewnych rzadkich mechanizmów genetycznych (tj. skrajnej lionizacji chromosomu X, monosomii chromosomu X lub translokacji zrównoważonej z udziałem locus Xq27-28) może wystąpić pełnoobjawowa hemofilia. Na dzień 19.05.2017 r. w Ogólnopolskim Rejestrze Wrodzonych Skaz Krwotocznych prowadzonym w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie (IHiT) zarejestrowanych jest 33 nosicielki hemofilii A oraz 21 nosicielek hemofilii B. Większość kobiet obarczonych hemofilią nie trafia pod opiekę ośrodków zajmujących się tą skazą krwotoczną, dlatego nie wiele jest danych odnośnie realnego nasilenia u nich objawów skazy krwotocznej, skłonności do powikłań krwotocznych czy niepowodzeń położniczych.Podstawowym testem laboratoryjnym w rozpoznawaniu hemofilii jest oznaczenie w osoczu aktywności koagulacyjnej odpowiedniego czynnika krzepnięcia, tj. czynnika VIII (FVIII:C, FVIII coagulation activity) - w przypadku hemofilii A, bądź aktywności koagulacyjnej czynnika IX (FIX:C, FIX coagulation activity) - w przypadku hemofilii B. Współcześnie uważa się, że rozpoznawanie nosicielstwa hemofilii nie powinno opierać się wyłącznie na oznaczeniu aktywności czynnika VIII lub IX, gdyż u większości nosicielek uzyskuje się wartości w zakresie referencyjnym. Pewne rozpoznanie nosicielstwa hemofilii A lub B daje wyłącznie wynik badania molekularnego identyfikującego mutację sprawczą choroby. Identyfikacja defektu genetycznego odpowiedzialnego za hemofilię A lub B w rodzinie umożliwia przede wszystkim postawienie pewnego rozpoznania stanu nosicielstwa u kobiet

dotkniętych hemofilią, ułatwia śledzenie drogi dziedziczenia się choroby w rodzinie, a także usprawnia poradnictwo genetyczne i diagnostykę prenatalną. Ustalenie rozpoznania nosicielstwa hemofilii ważne jest także przed planowaną ciążą, bo umożliwia to wybór optymalnej strategii postępowania w okresie okołoporodowym i zmniejszenie ryzyka wystąpienia powikłań krwotocznych.Istotą procesu krzepnięcia krwi jest sprawne wytworzenie odpowiedniej ilości trombiny przekształcającej fibrynogen do fibryny. U chorych na hemofilię wytwarzanie trombiny jest osłabione z powodu braku FVIII lub FIX. Dlatego ciekawe jest to w jakim stopniu osłabienie tego procesu dotyczy nosicielek hemofilii, gdyż być może to ma związek z występowaniem u nich mniej lub bardziej nasilonych objawów skazy krwotocznej. Ponadto zasadne jest prowadzenie badań pogłębiających wiedzę o wpływie niedoboru FVIII/FIX na proces powstawania trombiny. Proces wytwarzania trombiny in vitro można śledzić za pomocą pomiaru generacji trombiny (Thrombin Generation Assay, TGA)bądź jej endogennego potencjału (Endogenous thrombin potential, ETP). Potencjalnym modyfikatorem procesu wytwarzania trombiny jest inhibitor szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego (Tissue factor pathway inhibitor, TFPI). Rola TFPI w procesie krzepnięcia polega na odwracalnym hamowaniu aktywnego czynnika X oraz kompleksu czynnika tkankowego (Tissue factor, TF) z aktywnym czynnikiem VII. Zaburzenia TFPI mogą utrudniać wytworzenie dostatecznej ilości trombiny co upośledza kolejne etapy procesu krzepnięcia. Patofizjologia TFPI nie została jeszcze dobrze poznana, a w piśmiennictwie jest niewiele danych jak ten modulator procesu krzepnięcia wpływa na skłonność do krwawień u nosicielek hemofilii A i B, dlatego zagadnienie to wydaje się być bardzo interesujące. Ponieważ jak dotąd nie badano potencjalnego wpływu stężenia TFPI i mutacji sprawczej hemofilii na proces generacji trombiny u nosicielek hemofilii A i B oraz ich związku ze skłonnością do krwawień w tej grupie kobiet, zasadne wydaje się być podjęcie tego zadania.

Hipoteza badawcza: Nosicielstwo hemofilii A i B u kobiet charakteryzuje się zróżnicowaną tendencją do krwawień. Skłonność do nadmiernych krwawień być może wynika z upośledzonego procesu powstawania trombiny, która jest kluczowym enzymem biorącym udział w procesie krzepnięcia krwi. Wszystkie szlaki aktywujące krzepnięcie krwi prowadzą do wytworzenia jej w stężeniu, które zapewni powstanie fibryny i uformowanie stabilnego skrzepu. Do potencjalnych modyfikatorów procesu wytwarzania trombiny w osoczu należą warianty genetyczne F8 i F9 oraz stężenie inhibitora szlaku krzepnięcia zależnego od czynnika tkankowego. Kliniczna i laboratoryjna charakterystyka stanu nosicielstwa hemofilii pozwoli na optymalizację diagnostyki i opieki nad tą grupą pacjentek.

Cele badania:- Ocena przebiegu klinicznego skazy krwotocznej oraz analiza wyników testów koagulacyjnych i genetycznych u włączonych do badania nosicielek hemofilii. - Określenie wpływu osoczowego stężenia TFPI na proces generacji trombiny w badanej populacji nosicielek hemofilii A i B. - Analiza związku stężenia TFPI i potencjału trombinowego osocza z wynikami pomiaru aktywności i antygenu FVIII lub FIX mierzonej metodą koagulacyjną i chromogenną.

- Zbadanie zależności mutacji sprawczych w genie F8 lub F9 potencjałem trombinowym i stężeniem TFPI w badanej grupie kobiet zakwalifikowanych do badania.- Scharakteryzowanie profilu mutacji sprawczych w genie F8/F9 wśród nosicielek HA i HB z uwzględnieniem współistnienia więcej niż jednej mutacji sprawczej.- Określenie związku zidentyfikowanych mutacji sprawczych HA i HB z zawartością antygenu i aktywnością FVIII lub FIX mierzonej metodą koagulacyjną i chromogenną.- Zbadanie czy istnieje zależność pomiędzy przebiegiem klinicznym skazy krwotocznej u nosicielek hemofilii A i B ze stężeniem TFPI, potencjałem trombinowym osocza, aktywnością FVIII lub FIX mierzonej metodą koagulacyjną i chromogenną oraz mutacją odpowiedzialną za wystąpienie choroby w rodzinie.- Próba oceny ryzyka wystąpienia krwawień u nosicielek hemofilii w oparciu o wyniki uzyskanych testów laboratoryjnych.- Uzyskanie wyników w/w badania pilotażowego, które staną się podstawą aplikowania o grant zewnętrzny (np. NCN Opus). Po zakupieniu w IHiT sekwenatora nowej generacji (NGS) planowane jest przeprowadzenie badań w ramach grantu z jego wykorzystaniem.

Plan realizacji projektu i metodyka:- Do badania planujemy włączyć co najmniej 50 nosicielek HA lub HB.- Po uzyskaniu świadomej zgody na udział w badaniu, zostaną pobrane próbki krwi obwodowej do wykonania badań osoczowych i genetycznych, które realizowane będą w IHiT. - Od każdej pacjentki zostanie zebrany szczegółowy wywiad odnośnie przebiegu skazy krwotocznej z uwzględnieniem informacji dotyczących przebiegu porodu i połogu oraz niepowodzeń położniczych.- Bezpośrednim materiałem do testów koagulacyjnych i chromogennych będzie ubogopłytkowe osocze, uzyskiwane na drodze podwójnego wirowania krwi cytrynianowej. Materiałem do badań genetycznych będzie DNA genomowe izolowane z leukocytów obwodowej krwi żylnej pobranej na EDTA. - Wykonanie laboratoryjnych testów hemostazy w próbkach osocza, z uwzględnieniem:oznaczenia aktywności i antygenu FVIII/FIX metodą koagulacyjną jednostopniową i metodą chromogenną; badania stężenia TFPI metodą Elisa; pomiaru generacji trombiny z użyciem substratu fluorogennego; pomiaru endogennego potencjału trombiny metodą chromogenną.- W ramach badań molekularnych poszukiwane będą w F8 mutacje inwersyjne (INV22 i/lub INV1) metodą Inverse-PCR, zaś mutacje punktowe - w F8 i F9 metodą bezpośredniego sekwencjonowania wg Sangera. - Analiza uzyskanych wyników.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:- Kliniczna i laboratoryjna charakterystyka stanu nosicielstwa hemofilii przyczyni się w przyszłości do personalizacji procesu diagnostyczno-terapeutycznego nosicielek HA i HB, co niewątpliwie podniesie standardy opieki nad tą grupą pacjentek.- Pozwoli na optymalizację diagnostyki i opieki nad tą grupą pacjentek. - Projekt umożliwi ustalenie pewnego rozpoznania hemofilii wśród włączonych do badania kobiet.

- Wyniki w/w prowadzonego badania być może pozwolą na rozszerzenie poradnictwa genetycznego hemofilii A i B oraz będą zwiastunem pozwalającym na weryfikację epidemiologiczna stanu nosicielstwa tych defektów w Polsce.- Spodziewamy się, że przeprowadzone doświadczenia umożliwią pogłębienie wiedzy o mechanizmach patofizjologicznych hemofilii i roli TFPI, procesu generacji trombiny oraz FVIII/FIX w hemostazie. - Wykorzystanie w diagnostyce oznaczeń TFPI i potencjału trombinowego w cenie ryzyka wystąpienia powikłań krwotocznych u nosicielek hemofilii A i B.


Referencje: Adams M. Tissue factor pathway inhibitor: new insights into an old inhibitor. Semin Thromb Hemost.

2012 Mar;38(2):129-34. Beltrán-Miranda CP, Khan A, Jaloma-Cruz AR, Laffan MA. Thrombin generation and phenotypic

correlation in haemophilia A. Haemophilia. 2005 Jul;11(4):326-34. Brummel-Ziedins KE, Whelihan MF, Gissel M, Mann KG, Rivard GE. Thrombin generation and

bleeding in haemophilia A. Haemophilia 2009; 15, 1118-1125. Camire RM1. Rethinking events in the haemostatic process: role of factor V andTFPI.

Haemophilia.2016 Jul;22 Suppl 5:3-8. Kadir R.A, Lee C.A. Obstetrics and gynecology: hemophilia. W: Christine A. Lee C.A, Berntorp E.E,

Hoots K.W. (red). Textbook of Hemophilia. Willey-Blackwell Wydanie II, 2010: 269-277. Kadir R.A, Davies J, Winikoff R. iwsp. Pregnancy complications and obstetric care in women with

inherited bleeding disorders. Haemophilia 2013; 19: 1–10. Maroney SA,Mast AE. New insights into the biology of tissue factor pathway inhibitor. J Thromb

Haemost.2015 Jun;13 Suppl 1:S200-7. Odnoczko E, Windyga J. Badania genetyczne wdiagnostyce hemofilii A. Hematologia 2014; 5: 1–10. Odnoczko E, Windyga J. Badania genetyczne wdiagnostyce hemofilii B. Hematologia 2015; 6(3):264-

270. Shetty S, Bhave M, Ghosh K. Challenges of multiple mutations in individual patients with haemophilia.

Eur J Haematol. 2011 Mar;86(3):185-90. Srivastava A, Brewer A.K, Mauser-Bunschoten E.P. iwsp. Treatment Guidelines Working Group on

behalf of the World Federation of Hemophilia. Guidelines for management of hemophilia. Haemophilia 2013; 19: e1–e47.

Tripodi A. ThrombinGeneration Assay and Its Application in the Clinical Laboratory. Clin Chem.2016 May;62(5):699-707.

White GC, Rosendaal FR, Aledort L. Definitions in hemophilia. Thromb Haemost 2001; 85: 560. Windyga J, Chojnowski K, Klukowska A. iwsp. Polskie zalecenia postępowania we wrodzonych

skazach krwotocznych na tle niedoboru czynników krzepnięcia. Część I. Acta Haemat. Pol. 2008; 39: 537–564.

Windyga J, iwsp. Hemofilia ipokrewne skazy krwotoczne wPolsce. Pol Arch Med Wew 2004; 112: 1197-1202.

Wood JP, Ellery PE, Maroney SA, Mast AE. Biology of tissue factor pathway inhibitor. Blood. 2014 May 8;123(19):2934-43.

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w2018 r.:- Zaprojektowanie świadomej zgody na badanie oraz ankiety pacjenta w celu zebrania szczegółowego wywiadu chorobowego.

- Kontakt telefoniczny lub listowny z prośbą o zgłaszanie się pacjentek.- W grupie około 20 pacjentek zakwalifikowanych do badania - wykonanie zaplanowanych testów laboratoryjnych w Zakładzie Hemostazy i Chorób Metabolicznych.- Wstępna analiza uzyskanych wyników.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Raport etapowy.Wykonawcy: E. Odnoczko, M. Górska-Kosicka, E. Stefańska-Windyga, B. Baran, A. Sikorska, A. Buczma, K. Bykowska, J. Windyga


Badania nad patofizjologią chorób spowodowanych immunizacją w stosunku do komórek krwi i wrodzonych niedokrwistości i małopłytkowości i udoskonalanie metod ich

diagnostyki

Cel pracy/Aktualny stan wiedzy: A/ Alloimmunizacja i autoimmunizacja antygenami obecnymi na komórkach krwi, a także wrodzone i nabyte defekty tych komórek są podłożem szeregu chorób hematologicznych, których diagnostykę prowadzi Zakład Immunologii. Jest ona sukcesywnie modyfikowana i unowocześniana. Analiza metod ich standaryzacji i wartości klinicznej jest omawiana w ramach grup eksperckich, których ZIHiT jest członkiem. Obrady i prezentacje wyników odbywają się w czasie zjazdów ISBT i Europejskiego Sympozjum Immunologii Płytek i Granulocytów, w których musimy uczestniczyć jako Laboratorium referencyjne dla Polskiej Służby Krwi (ustawowy obowiązek IHiT). B/ W ciągu najbliższych trzech lat szczególną uwagę poświęcimy charakterystyce przeciwciał przeciwgranulocytarnych u dzieci z neutropenią i w przypadkach niehemolitycznych gorączkowych odczynów poprzetoczeniowych i ostrej poprzetoczeniowej niewydolności płuc (TRALI) i ewentualnie powikłaniach potransplatacyjnych (immunizacja/odrzucenie przeszczepu). Podstawą rozpoznania jest wykrycie przeciwciał anty-HNA i ustalenie ich swoistości. Z powodu zróżnicowanej reaktywności przeciwciał, badania należy wykonywać przy użyciu szerokiego spektrum metod, w tym genotypowania. Dodatkowo różnicowanie allo- i autoimmunizacji jest trudne, a często niemożliwe za względu na brak odpowiedniej liczby granulocytów do badań u chorego. Ustalenie immunologicznego podłoża granulocytopenii jest istotne, gdy stan ten utrzymuje się przez długi czas, a szczególnie ważne u noworodków i małych dzieci, które są często poddawane inwazyjnym badaniom dla identyfikacji wrodzonego charakteru granulocytopenii. Ustalenie podłoża immunologicznego zmienia postępowanie lecznicze. W Pracowni Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi bada się rocznie około 230 surowic pacjentów i dawców krwi w kierunku przeciwciał granulocytarnych. Wśród nich diagnostyce poddawanych jest około 50 dzieci w wieku poniżej 1 roku. Zgodnie z danymi literaturowymi u części z nich granulocytopenia może być skutkiem konfliktu matczyno-płodowego w HNA (1/500-1/1000 porodów). Przeciwciała matczyne u dziecka mogą niszczyć jego granulocyty nawet przez rok od porodu, choć najczęściej zanikają po około 6 miesiącach. Ustalenie, czy granulocytopenia jest skutkiem przebytego konfliktu jest istotne nie tylko dla chorego dziecka. Zbadanie przeciwciał anty-HNA u matki, które planujemy w obecnej pracy jest istotne dla prowadzenia jej kolejnych ciąż oraz ze względu na grożące jej wyżej wymienione powikłania potransfuzyjne/potransplantacyjne.Taka diagnostyka nie jest prowadzona – lekarze pediatrzy nie mogą pokrywać kosztów badania matki. W Pracowni wykonano badania w przypadku 3-tygodniowego dziecka z ciężką neutropenią i z przeciwciałami anty-HNA, które pochodziły od matki, co ustalono badając jej surowicę. Swoistość wykrytych przeciwciał u matki i dziecka była identyczna. Nie możemy przewidzieć liczby zgłaszanych do diagnostyki dzieci. W grupie badanej uwzględnimy też pojedyncze przypadki powikłań potransfuzyjnych/potransplatacyjnych z przeciwciałami granulocytarnymi.

Hipoteza badawcza: Przeciwciała anty-HNA wykrywane u dzieci w wieku do 1 roku z utrzymującą się granulocytopenią mogą być przetrwałymi w ich krwioobiegu alloprzeciwciałami matki powstałymi w wyniku konfliktu granulocytarnego. Takie przeciwciała mogą być też obecne u pacjentów z powikłaniami poprzetoczeniowymi /poprzeszczepowymi.

Cele pracy: A/ Publikowanie prac poglądowych i oryginalnych oraz prezentacja wykładów dotyczących patofizjologii chorób spowodowanych immunizacją w stosunku do komórek krwi i wrodzonych niedokrwistości i małopłytkowości.B/ Weryfikacja w/w hipotez poprzez wykonanie u dziecka i jego rodziców (lub dawcy/biorcy) kompletu badań w kierunku alloimmunologicznej granulocytopenii noworodków.Weryfikacja hipotezy dokonana będzie przez: określenie swoistości przeciwciał, potwierdzenie, że matka lub dawca/biorca nie posiada antygenu do którego skierowane są przeciwciała, a dziecko/ojciec lub biorca/dawca go posiadają.

Plan realizacji projektu i metodyka: A/ Będziemy opracowywać i upowszechniać wyniki badań diagnostycznych. B/ Planujemy wykonać badania wciągu 3 lat wokoło 30 przypadkach

Metodyka: Badania przeciwciał w testach: aglutynacji (GAT – granulocyte agglutination test), immunofluorescencyjnym (GIFT – granulocyte immunoflurescence test), enzymatycznym (MAIGA – monoclonal antibody immobilization of granulocyte antigens), LABScreen Multi (One Lambda) na platformie Luminex. Wymienione metody badań były zwalidowane i poddawane zewnętrznej kontroli jakości (ISBT, INSTAND).Genotypowanie antygenów HNA –PCR SSP lub sekwencjonowanie.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: A/ Publikowanie prac poglądowych i oryginalnych oraz prezentacja wykładów dotyczących patofizjologii tych schorzeń i postępów w diagnostyce jest istotne dla upowszechniania wiedzy na ten temat. Uczestnictwo w obradach ISBT i ESPGI jest konieczne dla wprowadzania modyfikacji metod diagnostycznych badań konsultacyjnych.B/ Ustalenie, że alloprzeciwciała matczyne stanowią podłoże niektórych granulocytopenii u dzieci oraz u dawców/biorców krwi, przeszczepień ma istotne znaczenie praktyczne i spowoduje rozszerzenie zakresu badań wykonywanych w IHiT na zlecenie klientów zewnętrznych. Obserwacje będą publikowane w czasopiśmie transfuzjologicznym i przedstawione na Europejskim Sympozjum Immunobiologii Płytek i Granulocytów, a także na posiedzeniach Grupy roboczej ds. immunologii granulocytów ISBT.

Referencje:- P. Faruggia Immune neutropenias of infants and childchood World J Pediatr , Vol 12 No 2, May 15,2016- R. Tooren-de Groot, M. Ottink, E. Huiskes, A. Rossum, B. Vorn, L. Porcelijn: Acta Pediatrica, 2014 103, pp.e.467-e474- A. Maheshwari, R.D. Christensen, D.A.: Calhoun Immune –mediated neutropenia in the neonate Acta pediatrica 2002, Suppl 438:98-10

- S. Taniuchi, M. Masuda, M. Hasui, S. Tsuji, H. Takahashi, Y. Kobayashi: Differential diagnosis and clinical course of autoimmune neutropenia in infancy: comparison with congenital neutropenia Acta Pediatr 91:1179-1182, 2002- B. Kaczorowska-Hać, J. Wierzba, J Stefanowicz, K. Sielachowicz, M. Wlazłowski, A. Balcerska: Neutropenia niemowlęca-czasem przewlekła i łagodna-obserwacje własne Medycyna Wieku Rozwojowego , 2008, XII,3;767-770- B. Curtis, A. Roman, M. Sullivan, C. Raven, J. Larison, L Weitekamp: Two cases of maternal alloimmunization against human neutrophil alloantigen-4b, one causing severe alloimmune neonatal neutropenia. Transfusion , Vol. 56 , January 2016- Y.L. Fung , L.A. Pitcher , J.E. Willet: Alloimmune neonatal neutropenia linked to anti-HNA-4a. Transf Med 2003;13:49-52- M. Tomic, M. Starcevic, R. Ribicic et a: . Alloimmune neonatal neutropenia in Croatia during the 1998-2008 period Am J Reprod Immunol 2014;71:451-457

Okres realizacji pracy: 3 lata.Zadania do wykonania w2018 r.: Pisanie prac, doniesień i prezentacja wykładów, w tym opracowań dotyczących immunologii płytek i granulocytów oraz erytrocytów które będziemy prezentować i omawiać w grupach eksperckich w czasie Europejskiego Sympozjum Immunologii Płytek i Granulocytów w Holandii i ISBT w Kanadzie. Rekrutacja przypadków klinicznych – we współpracy z lekarzami kierującymi pacjentów do diagnostyki. Wykonanie badań.

Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Doniesienia na Zjazd ISBT i na Europejskie Sympozjum i Immunologii Płytek i Granulocytów i przygotowanie publikacji.Wykonawcy: E. Brojer, K. Guz, A. Orzińska, M. Uhrynowska, M. Majewska-Wierzbicka, J. Spychalska, P. Bartoszewicz, J. Bednarz, J. Duda, A. Gierszon, A. Główka, E. Gołaszewska, H. Hukowska, A. Kiszło, E. Klimczak-Jajor, M. Krzemieniowska, K. Kuziora, P. Łopacz, H. Łopieńska, M. Michalik, A. Myślińska, M. Ołdak (Piłat), J. Pastuszka, A. Paź, M. Pelc-Kłopotowska, J. Piwońska, S. Purchla-Szepioła, P. Sasimowska, J. Skulimowska, J. Smolarczyk-Wodzyńska, E. Sokół, B. Wojciechowska, J. Sak-Budzisz, E. Dudnikow, A. Pilzak, B. Sierocka, K. Surma, B. Szczepaniak, J. Szczepaniak, J. Trybus, A. Sikorska, B. Ceglarek, I. Kopeć


Doskonalenie metod nieinwazyjnej prenatalnej diagnostyki (NIPT) konfliktów matczyno-płodowych w antygenach płytek i erytrocytów determinowanych polimorfizmami SNP

Wstęp: NIPT jest kluczowy w diagnostyce konfliktów serologicznych, w celu uniknięcia badań inwazyjnych dla oznaczenia fenotypu/genotypu płodu. W przypadku konfliktów czerwonokrwinkowych opracowano procedury śledzenia niedokrwistości u płodu poprzez badanie przepływów metodą Dopplera, ale są takie sytuacje, kiedy objawy kliniczne u płodu pojawiają się na tyle wcześnie, że diagnostyka USG jeszcze nie jest w pełni możliwa (m.in. w konflikcie w zakresie antygenu K, z uwagi na bardzo wczesną jego ekspresję na erytrocytach płodu i towarzyszącą blokadę hematopoezy przez przeciwciała anty-K). Wtedy badanie NIPT jest rozstrzygające czy konieczne będzie badanie inwazyjne. W przypadku konfliktów płytkowych (najistotniejszy to HPA-1a) przydatność kliniczna NIPT jest ogromna, bo nie ma możliwości nieinwazyjnego wykrycia małopłytkowości w życiu płodowym – USG może wykazać tylko jej skutki w postaci wylewu do OUN. Możliwości leczenia płodu transfuzjami KKP są już wtedy ograniczone. Płód można leczyć przezłożyskowo IVIG zanim wylew nastąpi, ale trzeba wiedzieć czy dziecko jest niezgodne z matką, a inwazyjne pobranie krwi pępowinowej wiąże się z dużym ryzykiem krwawienia w przypadkach głębokiej małopłytkowości u płodu. Jak wykazaliśmy w 15% ciąż dziecko jest zgodne z matką. IHiT ma doświadczenie, ma publikacje dotyczące tego tematu i na kolejnych zjazdach dotyczących NIPT jesteśmy zapraszane do wygłoszenia wykładu lub do prezentacji ustnej.Polimorfizmy SNP w badaniach NIPT stosowanych w IHiT sprawiają trudności, co wykazaliśmy w dotychczasowych pracach i wymagają zastosowania modyfikacji klasycznej reakcji real-time PCR (dodatkowe substytucje w specyficznych starterach, modyfikacje LNA w starterach, trawienie enzymem restrykcyjnych allelu matki, zastosowanie sond PNA do blokowania allelu matki), by wyeliminować zjawisko niespecyficznej amplifikacji allelu matczynego, zaburzającego obraz detekcji allelu płodu. Mamy wstępne wyniki takich badań.Techniki omijające ten problem wykorzystują technologie NGS. W kooperacji z COI stworzyliśmy panel do sekwencjonowania klinicznie istotnych antygenów grup krwi i HPA dla dawców na aparacie Ion Torrent PGM. Pilotażowe badania pacjentek ciężarnych z zastosowaniem tego panelu wykazały możliwość oznaczania poziomu chimeryzmu płodowego w DNA osoczowym matki. Wadą tej techniki jest jednak jej wysoki koszt dla pojedynczego badania.Nowatorskim podejściem jest technika kroplowego cyfrowego PCR (ddPCR – droplet digital PCR), jako nowa 3-cia generacja testów PCR, pozwalająca wykrywać pojedyncze kopie rzadkiego allelu w przewadze allelu dominującego z bardzo wysoką czułością, sięgającą 0.001%. Zaletą tej techniki jest jej stosunkowo niska jednostkowa cena i potencjalnie używanie tych samych odczynników, co do klasycznych reakcji real-time PCR.Kolejnym zagadnieniem jest wybór sposobu pobierania materiału zawierającego wolnokrążące DNA płodowe. W związku z szerokim rozpowszechnieniem badań nieinwazyjnych, dotyczących aneuploidalności płodów, na rynku pojawiły się specjalne probówki do pobierania krwi na badania DNA płodowego. Ograniczają one zjawisko rozpadu krwinek, przez co redukują poziom DNA matczynego w próbce separowanego osocza.

Wstępne obserwacje z badań materiału pobranego do takich probówek wskazały na potrzebę udoskonalenia etapu przedanalitycznego w obecnie stosowanych protokołach NIPT, ze względu na brak możliwości kontroli wydajności i efektywności etapu izolowania DNA z osocza (obecnie kontrola jest oparta na detekcji DNA matczynego). Z doniesień ze zjazdu 3rd International Meeting on cfDNA, Kopenhaga (04.2017) wynika, że konieczne jest dodanie kontroli plazmidowej przed izolacją DNA do badanego osocza i późniejsza detekcja sekwencji plazmidu w reakcji multipleksowej wraz z detekcją badanego allelu. Na zjeździe także prezentowane były wyniki wykrywania materiału płodowego z osocza ciężarnych bez klasycznego etapu izolacji DNA, co obniża koszt i skraca czas całego badania.

Hipoteza badawcza: Zastosowanie nowoczesnych metod genotypowania (typu NGS lub ddPCR) pozwoli na specyficzne oznaczanie genotypu płodu w przypadkach konfliktów u matek z immunizacją do antygenu kodowanego przez polimorfizmy jednonukleotydowe. Modyfikacje fazy przedanalitycznej pozwolą na zwiększenie swoistości i czułości badań NIPT i skrócą czas ich wykonywania.

Cele badania: Przeprowadzenie badań NIPT ciężarnych z przeciwciałami anty-HPA l lub do antygenów czerwonokrwinkowych, których krew pobrano do klasycznych lub nowych probówek zabezpieczających frakcję cffDNA:- metodą NGS z zastosowaniem opracowanego już wcześniej panelu;- metodą ddPCR.Udoskonalenie obecnego protokołu NIPT poprzez opracowanie kontroli etapu izolowania DNA dla próbek pobieranych do nowych probówek dedykowanych dla cffDNA. Próba opracowania detekcji DNA płodowego z materiału nie poddanemu klasycznej procedurze izolowania DNA.

Plan realizacji projektu i metodyka: W 2018 r. zostaną przeprowadzone badania NIPT dla ciężarnych metodą NGS z zastosowaniem opracowanego dla dawców panelu (we współpracy z COI) oraz techniką ddPCR z materiału zgromadzonego w banku ZHiT w ramach pracy planowej nr 3.2/2017 lub od kolejnych rekrutowanych zimmunizowanych pacjentek.W 2019 r. standaryzacja protokołu NIPT dla materiału pobranego do probówek dla cffDNA oraz z materiału niepoddanemu klasycznej procedurze izolowania DNA płodowego.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Opracowane badanie NIPT pozwoli na przewidzenie HPA-1a lub innych klinicznie istotnych antygenów płodu we wczesnej ciąży, kiedy podejmuje się decyzję o leczeniu. Analiza oznaczeń statusu płodu wykonanych nowoczesnymi metodami genotypowania będzie miała istotne znaczenie praktyczne i posłuży do opracowania badania do wprowadzenia do diagnostyki konfliktów serologicznych. Uzyskane wyniki będą opublikowane w indeksowanym czasopiśmie.

Rodzaj pracy: badanie naukowe stosowane.

Referencje: Brojer E, Uhrynowska M, Orzińska A.: Konflikty matczyno-płodowe wzakresie antygenów krwinek

czerwonych, płytek igranulocytów. Hematologia 2016, 330-339. Orzińska A, Guz K, Dębska M, Uhrynowska M, Celewicz Z, Wielgoś M, Brojer E. 14 Years of Polish

Experience in Non-Invasive Prenatal Blood Group Diagnosis.Transfus Med Hemother. 2015 Nov;42(6):361-4.

Orzińska A. Wybrane zagadnienia dotyczące nieinwazyjnych badań antygenów krwinkowych płodu wświetle doniesień prezentowanych na XXXIII Światowym Zjeździe Międzynarodowego Towarzystwa Przetaczania Krwi wSeulu (Korea Południowa) Journal of Transfusion Medicine 2015;8(3):109-113.

Orhant L et al. Droplet digital PCR, anew approach to analyze fetal DNA from maternal blood: application to the determination of fetal RHD genotype. Ann Biol Clin (Paris). 2016 Jun 1;74(3):269-77. doi: 10.1684/abc.2016.1139.

Wienzek-Lischka S, Krautwurst A, Fröhner V, et al. Noninvasive fetal genotyping of human platelet antigen-1a using targeted massively parallel sequencing. Transfusion. 2015;55:1538-4

Okres realizacji pracy: 2018-2019 r.Zadania do wykonania w2018 r.:- 1-2 miesięczne wykorzystanie aparatu „demo” z pokryciem kosztów odczynników koniecznych do standaryzacji metody ddPCR i sukcesywne wykonywanie badań u rekrutowanych pacjentek HPA-1a ujemnych. - Badania genotypu urodzonego dziecka dla weryfikacji prawidłowości wyniku NIPT.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Wykonawcy: A. Orzińska, M. Krzemienowska, K. Guz, A. Kiszło, M. Uhrynowska, I. Kopeć


Zastosowanie stent-graftów wleczeniu tętniaków aorty piersiowej i brzusznej

Wstęp: Tętniakiem nazywamy poszerzenie tętnicy o co najmniej 50% w stosunku do wartości prawidłowej. Tętniak aorty piersiowej jest to poszerzenie aorty piersiowej powyżej 3,5 cm występujące w jej części wstępującej, zstępującej lub łuku aorty, a w odcinku podnerkowym powyżej 3 cm. Najczęściej tętniaki aorty występują w części wstępującej aorty lub poniżej odejścia tętnic nerkowych. Tętniakowe poszerzenie aorty może również przechodzić przez jej rozwidlenie na tętnice biodrowe.Tętniaki aorty brzusznej występują 4-8 razy częściej u mężczyzn niż u kobiet, rozwijają się zwykle po 55. roku życia. Częstość występowania tętniaków wzrasta wraz z wiekiem. Wśród mężczyzn powyżej 65. roku życia rozpoznaje się go u około 7% badanych. Do czynników ryzyka należą: starszy wiek, płeć męska, palenie tytoniu, przewlekła obturacyjna choroba płuc, nadciśnienie tętnicze, hipercholesterolemia, miażdżyca zarostowa tętnic obwodowych, choroba niedokrwienna serca, a także czynniki dziedziczne.W miarę powiększania się średnicy tętniaka wzrasta ryzyko jego pęknięcia. Pęknięcie tętniaka obarczonej jest ok. 90% śmiertelnością. Ocenia się, że przy średnicy poniżej 5cm, ryzyko pęknięcia jest mniejsze niż ryzyko zabiegu chirurgicznego.Zasadniczym celem leczenia TAB jest zapobieganie śmiertelnemu, powikłaniu jakim jest pęknięcie tętniaka. Na podstawie przeprowadzonych dużych programów badawczych UK Small Aneurysm Trial i amerykańskiego Aneurysm Detection and Management study (ADAM) przyjęto za granicę bezpieczeństwa i wskazanie do zabiegu średnicę TAB powyżej 55 mm. Dla kobiet oraz dla mężczyzn z podwyższonym ryzykiem pęknięcia przyjęto 50 mm.Znane są obecnie dwie metody leczenia zabiegowego: operacja tradycyjna z rozległym otwarciem jamy brzusznej i zastąpieniem zmienionego odcinka aorty sztuczną protezą naczyniową oraz zabieg wewnątrznaczyniowy z wszczepieniem stentgraftu z dostępu przez tętnice udowe i umieszczeniu go w zdrowym odcinku aorty z jednoczesnym wyłączeniem tętniaka.Śmiertelność okołooperacyjna w metodzie otwartej waha się w zależności od ośrodka w granicach 1,2-5,6% w operacjach planowych. W przypadku leczenia wewnątrznaczyniowego śmiertelność we wczesnym okresie po zabiegu (do 30 dni) jest mniejsza niż w metodzie otwartej, natomiast w późniejszym okresie śmiertelność w tych metodach jest zbliżona u chorych, którzy nadawali się do leczenia oboma sposobami.Pierwsze zabiegi wewnątrznaczyniowe na aorcie piersiowej przeprowadzono w1987, a na brzusznej w1989 (Nikołaj Volodos, Charków). W latach 90. ubiegłego stulecia metoda wewnątrznaczyniowa zaczęła szybko się rozwijać, co było związane z wprowadzaniem nowych typów stent-graftów. Obecnie większość chorych z tętniakiem aorty zstępującej i brzusznej jest leczona w sposób małoinwazyjny. Wraz z rozwojem metody do leczenia tą metodą kwalifikowani są pacjenci z tętniakami o coraz bardziej złożonej anatomii. Wymaga to zastosowania coraz bardziej złożonych technik operacyjnych z użyciem stent-graftów fenestrowanych, branchowych, technik kominowych, a czasem także przeprowadzenia zabiegów hybrydowych łączących obie metody leczenia. Jednym z problemów jest także

konieczność wykonania zabiegów naprawczych po wcześniejszych operacjach, zarówno klasycznych, jak i małoinwazyjnych. Sukces w przeprowadzaniu wyżej wymienionych operacji z zastosowaniem nowych technologii jest możliwy wyłącznie dzięki pracy zespołowej chirurgów naczyniowych, radiologów interwencyjnych i anestezjologów.Uzyskiwanie dobrych wyników leczenia i minimalizowanie powikłań gwarantuje wyposażenie ośrodka, w wysokiej klasy operacyjne sale hybrydowe oraz sprzęt jednorazowy pozwalający na przeprowadzanie najbardziej skomplikowanych operacji naczyniowych.

Hipoteza badawcza: Celem pracy jest retrospektywna i prospektywna ocena zastosowania zaawansowanych metod wewnątrznaczyniowych w leczeniu chorych z tętniakami aorty piersiowej, brzusznej i piersiowo-brzusznej.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Opracowano dane pacjentów leczonych w latach 2010-2016 z użyciem zaawansowanych metod wewnątrznaczyniowych w leczeniu chorych z tętniakami aorty piersiowej, brzusznej i piersiowo-brzusznej. Opublikowano pracę dotyczącą leczenia chorych z tętniakami aorty brzusznej i tętnic biodrowych z zachowaniem przepływu przez tętnice biodrowe wewnętrzne.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Nie są planowane modyfikacje planu realizacji projektu.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Chorzy z tętniakami aorty piersiowej i brzusznej ze skomplikowaną anatomią mogą być operowani jedynie w ośrodkach referencyjnych II, a takim jest Klinika Chirurgii Naczyniowej IHiT. Doświadczenie zespołu i ośrodka pozwala na wprowadzanie unikalnych i nie stosowanych dotychczas rozwiązań technicznych oraz rozwój technik operacyjnych wprowadzanych w innych tego typu ośrodkach. Klinika Chirurgii Naczyniowej IHiT jest jednym z wiodących ośrodków chirurgii naczyniowej w Polsce i liczącym się ośrodkiem na arenie międzynarodowej. W Klinice w przeciwieństwie do innych ośrodków stosuje się większość dostępnych na rynku protez naczyniowych, co pozwala na unikalną możliwość łączenia systemów w czasie jednego zabiegu, porównywania skuteczności leczenia różnymi stent-graftami, a także indywidualnego dopasowania protezy wewnątrznaczyniowej do anatomii tętniaka. Poza publikacjami dotyczącymi wyników leczenia planowane jest prowadzenie kursów i szkoleń dla chirurgów naczyniowych z Polski i zagranicy. W czerwcu b.r. w Instytucie Hematologii zostanie zorganizowana konferencja międzynarodowa z udziałem wybitnych specjalistów z całej Europy. Tematem dwudniowego spotkania będzie praktyczne zastosowanie trzech nowych systemów stent-graftów w leczeniu tętniaków aorty brzusznej.Podczas konferencji zostaną przeprowadzone dla uczestników transmisje operacji przeprowadzonych w sali hybrydowej dziedziny chirurgii naczyniowej, a w przyszłości aktywne włączenie się Kliniki w proces szkolenia przyszłych chirurgów naczyniowych, co będzie miało wpływ na podniesienie rangi polskich chirurgów naczyniowych na arenie międzynarodowej.


Referencje: Ashton HA, Buxton MJ, Day NE et al.: The Multicentre Aneurysm Screening Study (MASS) into the

effect of abdominal aortic aneurysm screening on mortality in men: arandomised controlled trial. Lancet 2002; 360(9345): 1531-1539.

Lindholt JS, Juul S, Fasting H, Henneberg EW: Screening for abdominal aortic aneurysms: single centre randomised controlled trial. BMJ 2005; 330(7494): 750.

Norman PE, Jamrozik K, Lawrence-Brown MM et al.: Population based randomised controlled trial on impact of screening on mortality from abdominal aortic aneurysm. BMJ 2004; 329(7477): 1259.

Scott RA, Wilson NM, Ashton HA, Kay DN: Influence of screening on the incidence of ruptured abdominal aortic aneurysm: 5-year results of arandomized controlled study. Br J Surg 1995; 82(8): 1066-1070.

Singh K, Bonaa KH, Jacobsen BK et al.: Prevalence of and risk factors for abdominal aortic aneurysms in apopulation-based study: The Tromso Study. Am J Epidemiol 2001; 154(3): 236-244.

Vega de Ceniga M, Gomez R, Estallo L et al.: Growth rate and associated factors in small abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006; 31(3): 231-236.

Brady AR, Fowkes FG, Greenhalgh RM et al.: Risk factors for postoperative death following elective surgical repair of abdominal aortic aneurysm: results from the UK Small Aneurysm Trial. On behalf of the UK Small Aneurysm Trial participants. Br J Surg 2000; 87(6): 742-749.

Lederle FA, Johnson GR, Wilson SE et al.: The aneurysm detection and management study screening program: validation cohort and final results. Aneurysm Detection and Management Veterans Affairs Cooperative Study Investigators. Arch Intern Med 2000; 160(10): 1425-1430.

Conrad MF, Crawford RS, Pedraza JD et al.: Long-term durability of open abdominal aortic aneurysm repair. J Vasc Surg 2007; 46(4): 669-675.

McPhee JT, Hill JS, Eslami MH: The impact of gender on presentation, therapy, and mortality of abdominal aortic aneurysm in the United States, 2001-2004. J Vasc Surg 2007; 45(5): 891-899.

Lobato AC, Camacho-Lobato L. anewtechniqueto enhance endovascular thoracoabdominal aortic aneurysm therapy--thesandwichprocedure.Semin Vasc Surg. 2012 Sep;25(3):153-60.

Lindblad B, Bin Jabr A, Holst J, Malina M. Chimney Grafts in AorticStentGrafting: Hazardous or UsefulTechnique? Systematic Review of Current Data.Eur J Vasc Endovasc Surg. 2015 Dec;50(6):722-31

FenestratedEndovascular Aortic Aneurysm Repair as aFirst Line Treatment Option to Treat Short Necked, Juxtarenal, and Suprarenal Aneurysms.

Lim CS, Naji Y, Hussain ST, Pleban E, Wiszniewski A, Onida S, Mosquera Arochena NJ, Szopinski P. ModifiedSandwich-graftTechniqueEmploying Aorfix and ViabahnStent-grafts to Preserve Hypogastric Flow in Cases of Complex Aortoiliac andIsolated Common Iliac Artery Aneurysms Including the Internal Iliac Artery Ostium.Eur J Vasc Endovasc Surg. 2016 Mar;51(3):364-70.

Pozostały okres realizacji pracy: 2016-2018 r.

Zadania do wykonania w2018 r.: Dalsze opracowywanie danych z zabiegów i obserwacji odległej chorych. Przygotowanie publikacji i doniesień zjazdowych. Przygotowanie kursów dla chirurgów naczyniowych.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Raport / publikacja.Wykonawcy: E. Pleban, P. Szopiński, J. Michalak, J. Iwanowski, T. Dobrowolski, M. Stryga, M. Janas, R. Bilski, M. Sitarz, A. Wiszniewski

KARTA PRACY PLANOWEJ nr 4.10 4/021/2012

(PRACA KONTYNUOWANA – nr 4.2 wPlanie Naukowym 2017PRACA KONTYNUOWANA – nr 4.11 wPlanie Naukowym 2016PRACA KONTYNUOWANA – nr 4.21 wPlanie Naukowym 2015PRACA KONTYNUOWANA – nr 4.20 wPlanie Naukowym 2014PRACA KONTYNUOWANA – nr 4.31 wPlanie Naukowym 2013)

Optymalizacja leczenia chirurgicznego chorych ze schorzeniami hematologicznymi oraz bez zaburzeń hematologicznych

Wstęp: Klinika Chirurgii Ogólnej i Hematologicznej uczestniczy w projektach naukowych i edukacyjnych, których celem jest optymalizacja leczenia chirurgicznego u chorych ze schorzeniami hematologicznymi, a zwłaszcza z wrodzonymi i nabytymi skazami krwotocznymi.

Hipoteza badawcza: Prace obecnego projektu będą koncentrować się wokół następujących zagadnień:- Sformułowanie algorytmu postępowania w krwawieniach z przewodu pokarmowego w rzadkich skazach krwotocznych pokrewnych hemofilii m.in. trombastenii Glanzamanna.- Skuteczność splenektomii w rzadkich schorzeniach śledziony- Opracowanie strategii postępowania w operacjach urologicznych nowotworów układu moczowego wykonywanych metodą laparoskopową u chorych z wrodzonymi skazami krwotocznymi.- Profilaktyka krwawień po strumektomii z zastosowaniem autologicznego, mrożonego żelu płytkowego i kleju fibrynowego.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Opublikowano pracę przedstawiającą pierwszą w piśmiennictwie światowym nefrektomię laparoskopową z powodu raka nerki u chorego na hemofilię B. Podkreślono konieczność wykonywania operacji u chorych ze skazami krwotocznymi w referencyjnych ośrodkach dysponujących dużym doświadczeniem i multidyscyplinarnym zespołem klinicznym.Przedstawiono pracę określającą zasady postępowania w hemofilii A powikłanej inhibitorem o wysokim mianie i krwawieniu z żylaków przełyku. Po doraźnym leczeniu endoskopowym, zatrzymującym krwawienie, zastosowano powtarzane zabiegi skleroterapii uzyskując całkowitą eradykację żylaków przełyku. Procedury endoskopowe przeprowadzono w zabezpieczeniu rFVIIa iaPCC. Ustalono dawki leczenia omijającego inhibitor oraz czas stosowania koncentratów. Opracowany schemat postępowania umożliwił bezpieczne przeprowadzanie zabiegów, bez żadnych powikłań krwotocznych i zakrzepowych.Przedstawiono pracę oceniającą zastosowanie żelu płytkowego i kleju fibrynowego w zabezpieczeniu hemostazy okołooperacyjnej usunięcia zakażonego portu żylnego u chorej z głęboką małopłytkowością (<10,0 G/l) oporną na leczenie steroidami i dożylnymi immunoglobulinami. Przedstawiono również zastosowanie autologicznego, mrożonego żelu płytkowego w leczeniu pseudoguza hemofilowego powikłanego krwawieniem.Opublikowano pracę oceniającą skuteczność laparoskopowej cholecystektomii w bezkamiczym zapaleniu pęcherzyka żółciowego w przebiegu ostrej białaczki limfoblastycznej. Przedstawiono strategię postępowania u chorej z martwicą żołądka w ciężkiej neutropenii.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: Proponujemy kontynuację pracy w 2018 roku ze względu na realizowane projekty i posiadany materiał kliniczny wymagający dalszych publikacji.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Aktualizacja stanu wiedzy dotyczącej leczenia chirurgicznego chorych za skazami krwotocznymi i innymi schorzeniami hematologicznymi umożliwiające optymalne postępowanie diagnostyczno-lecznicze.

Rodzaj pracy: praca rozwojowa

Referencje: Rogenhofer S, Hauser S, Breuer aet al.: Urological surgery in patients with hemorrhagic bleeding

disorders hemophilia A, hemophilia B, von Willebrand disease: aretrospective study with matched pair analysis. World J Urol 2013; 31: 703-707.

Goldman G, Holoborodska Y, Oldenburg J et al.: Perioperative management and outcome of general andabdominal surgery in hemophiliacs. Am J Surg. 2010; 199: 702-707.

Ligohr P, Bensoukehal S, Matthaei H et al.: Value and risk of laparoscopic surgery in hemophiliacs - experience from atertiary referral center for hemorrhagic dietheses. Langenbecks Arch Surg 2014; 399: 609-618.

Peyvandi F, Bolton-Maggs PH, Batorova A, De Moerloose P: A. Rare bleeding disorders. Haemophilia 2012; 18, Suppl 4: 148-153.

Green BT: Splenic abscess: report of six cases and review of the literature. ANN Surg 2001; 67: 80-85. Ferraioli G, Brunetti E, Gulizia R et al.: Management of splenic abscess: report on 16 cases from

asingle center. Int J Inf Dis. 2009; 13: 524-530 Schaffer JM, Allen JG, Weiss ES et al.: Infectious complications after pulsatile-flow and continuous-

flow left ventricular assist device implantation. J Heart Lung Transplant. 2011; 30: 167-174. Simon D, Fischer S, Grossman aet al: Left ventricular assist device-related infection: treatment and

outcome. Clin Infect Dis 2015; 40; 1108-1115. Pereda D, Conte JV: Left ventricular assist device driveline infections. Cardiol. Clin. 2011; 29: 515-

527. Walter V, Stock UA, Soriano-Romero M et al.: Eradication of achronic wound and driveline infection

after redo-LVAD implantation. J Cardiothorac Surg2014; 9: 63-66.

Okres realizacji pracy:4 lata.Zadania do wykonania w2018 r.: - Analiza leczenia chirurgicznego pacjentów z rzadkimi, wrodzonymi skazami krwotocznymi i rzadkimi schorzeniami śledziony.- Gromadzenie i analiza danych klinicznych, przygotowanie publikacji.Forma rozliczenia pracy w2018 r.: Publikacja.Wykonawcy: A. Szczepanik, S. Gajda, K. Pielaciński, A. Misiak, W. Dąbrowski, M. Kuryłowicz, D. Iwaniuk, E. Lachert, J. Kubis, J. Antoniewicz-Papis, M. Łętowska


Monitorowanie minimalnej choroby resztkowej u chorych na szpiczaka plazmocytowego i amyloidozę AL

Wstęp: Wprowadzenie do praktyki klinicznej nowych klas leków przeciwnowotworowych, m.in. inhibitorów proteasomu i leków immunomodulujących znacznie poprawiło wyniki terapii szpiczaka plazmocytowego (SzP) i amyloidozy (AL) [1, 2]. Dzięki temu głębokie odpowiedzi kliniczne, do których zaliczamy bardzo dobrą odpowiedź częściową (VGPR), całkowitą remisję (CR) i rygorystyczną całkowitą remisję (sCR), uzyskuje większość pacjentów już po terapii pierwszoliniowej. Pomimo poprawy skuteczności chemioterapiiu większości chorych dochodzi jednak do nawrotu SzP, spowodowanej prawdopodobnie przetrwaniem rezydualnych plazmocytów szpiczakowych, niewykrywalnych standardowymi metodami diagnostycznymi. Jak wykazały liczne obserwacje, poziom redukcji klonu nowotworowego koreluje z korzystnymi odległymi wynikami leczenia. Wykazano, że obecność choroby resztkowej (MRD) określanej na poziomie czułości przynajmniej 10-4, stanowi niezależny czynnik prognostyczny dla PFS i OS [3, 4].Głębsza redukcja klonu nowotworowego, niż określana jako CR, wydaje się mieć również istotne znaczenie w odniesieniu do terapii chorych na AL. Niektóre wyniki badań wskazują, że u części pacjentów z AL do zatrzymania progresji zmian narządowych, w tym kardiomiopatii amyloidowej, konieczne jest skuteczne leczenie choroby resztkowej [2]. W celu zdefiniowania MRD w szpiku kostnym stosowane są techniki wieloparametrowej cytometrii przepływowej (FC) i metody molekularne wykorzystujące sekwencjonowanie nowej generacji (next generation sequencing, NGS). Umożliwiają one oznaczenie MRD z czułością 10-5 - 10-6, co oznacza identyfikację 1 nowotworowej komórki plazmatycznej nawet wśród 1000000 prawidłowych komórek szpiku [6-8].Najnowsze wytyczne International Myeloma Working Group z 2016 roku, dotyczące oceny odpowiedzi w SzP, uwzględniają kategorie głębokich odpowiedzi obejmujące MRD[8]. Ta istotna zmiana w podejściu terapeutycznym do SzP i AL, wskazująca na celowość dążenia do eradykacji MRD, powoduje konieczność wprowadzenia czułych metod monitorowania MRD w referencyjnych ośrodkach hematologicznych. Uzyskiwane obecnie wyniki oznaczania MRD mają znaczenie głównie prognostyczne, jednak w bliskiej przyszłości mogą być podstawą indywidualizacji terapii (np. decyzji o włączeniu leczenia podtrzymującego lub leczenia preemptywnego nawrotu).

Hipoteza badawcza:- Oznaczanie MRD za pomocą NGS ma wyższą czułość niż badanie cytometryczne. - Poziom MRD w szpiku kostnym u pacjenta ze SzP, który osiągnął CR po zakończeniu pierwszej linii leczenia, ma znaczenie prognostyczne w odniesieniu do PFS i OS.- Monitorowanie MRD w szpiku kostnym w regularnych interwałach czasowych pozwala na rozpoznanie progresji w okresie przedklinicznym.

Dotychczasowa realizacja celów badania:1. Zaprojektowano świadomą zgodę na badanie oraz informację o badaniu dla pacjenta, projekt został zaakceptowany przez Komisję Bioetyczną przy IHiT.

2. Zoptymalizowano procedurę barwienia, w celu uzyskania możliwości zebrania 3-5 milionów komórek w badaniu cytometrycznym.3. Określono wyjściowy fenotyp komórek nowotworowych i zabezpieczono materiał DNA od 8 pacjentów z rozpoznanym szpiczakiem plazmocytowym i 1 z amyloidozą.4. Opracowano ankietę „Ocena choroby resztkowej w szpiczaku plazmocytowym w polskich Ośrodkach Hematologicznych”, która rozesłana została do ośrodków prowadzących terapię SzP. W przygotowaniu praca opisująca wyniki badania.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu: nie dotyczy

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Wdrożenie nowoczesnych technik badania MRD za pomocą FC i NGS umożliwi wykonywanie oceny odpowiedzi na chemioterapię u chorych na SzP i AL zgodnie z najnowszymi wytycznymi międzynarodowymi. Monitorowanie MRD w obu tych jednostkach chorobowych stanie się również podstawą do indywidualizacji terapii. Uzyskane w pracy wyniki staną się podstawą publikacji naukowych.


Referencje:1.Smith D, Yong K. Advances in understanding prognosis in myeloma. Br J Haematol. 2016 Nov;175(3):367-380.2.Mahmood S, Palladini G, Sanchorawala V, Wechalekar A. Update on treatment of light chain amyloidosis. Haematologica. 2014 Feb;99(2):209-21. 3.Rowstron A.C., Child J.A., de Tute R.M., et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol 2013; 31: 2540-47.4.Paiva B, van Dongen J. J. M,Orfao A. New criteria for response assessment: role of minimal residual disease in multiple myeloma. Blood 2015; 125: 3059-3068.5. Paiva B., Vidriales M.B, Cerveró J. i wsp. Multiparameter flow cytometric remission is the most relevant prognostic factor for multiple myeloma patients who undergo autologous stem cell transplantation. Blood, 2008 ,112:4017-23.6.Martinez-Lopez J, et al., Clinical applicability and prognostic significance of molecular response assessed by fluorescent PCR of immunoglobulin genes in multiple myeloma. Results from a GEM/PETHEMA study. Br J Haematol, 2013, 163, 581-589.7.Martinez-Lopez J, et al., Prognostic value of deep sequencing method for minimal residual disease detection in multiple myeloma. Blood, 2014, 123: 3073–3079.8.Yuan C.M., Lin P., Stetler-Stevenson M., Marti G.E. (red.) Special Issue: Multiple Myeloma: The Flow Cytometric Detection of Minimal Residual Disease. Cytometry Part B 2016; 90: 1-100.9.Kumar S., Paiva B., Anderson K.C., et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17: 328-46.

Pozostały okres realizacji pracy: 2 lata.Zadania do wykonania w 2018 r.: Włączenie do badania kolejnych chorych ze szpiczakiem i amyloidozą. Wykonanie badania MRD u dostępnych chorych ze SzP po autoSCT, którzy osiągnęli odpowiedź co najmniej CR oraz z AL z odpowiedzią co najmniej VGPR.Dostosowanie panelu przeciwciał w badaniu cytometrycznym do rekomedacji EuroFlow.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport.

Wykonawcy: K. Jamroziak, M. Prochorec-Sobieszek, I. Solarska, A. Krzywdzińska


Wstępna ocena zmian konstelacji genów KIR i HLA klasy I u pacjentów i haploidentycznych dawców przeszczepu krwiotwórczych

komórek macierzystych (haplo-HSCT)

Wstęp: Przeszczepy krwiotwórczych komórek macierzystych od dawcy haploidentycznego są nową, obiecującą metodą terapii chorób hematologicznych. Wiodące ośrodki transplantacyjne w Polsce podjęły próby wykonania transplantacji haploidentycznych (25 w 2015 r. i 31 w 2016 r.) oraz prognozowany jest dalszy wzrost ich liczby w latach następnych. Dawcy haploidentyczni są niezgodni z biorcą w zakresie wielu antygenów HLA, zwykle 5/10. Stwarza to niespotykane dotychczas problemy w zakresie zrozumienia i wykorzystania immunologicznych oddziaływań komórek odpornościowych (dawcy) z komórkami docelowymi pacjenta, szczególnie w zakresie nadzoru immunologicznego nad komórkami nowotworowymi. W potransplantacyjnej kontroli immunologicznej nowotworu istotną rolę odgrywają m.in. komórki NK dawcy. Zgodnie z hipotezą deficytu rozpoznania selfu (ang. missing self recognition) korzystny jest brak u biorcy cząsteczki HLA klasy I, która wiąże się ze swoistym hamującym receptorem KIR (killer cell immunoglobulin-like receptor) komórek NK dawcy, bo komórki NK pozbawione hamowania skuteczniej niszczą tkankę nowotworową z deficytem HLA. Teorię tę potwierdzono jak dotąd w niektórych badaniach klinicznych dotyczących transplantacji haploidentycznych w ostrej białaczce szpikowej (u dorosłych) i ALL (u dzieci), w których niezgodność ligandów KIR była związana ze spadkiem odsetka nawrotów i poprawą przeżycia chorych. Co zastanawiające, opisano również podobne badania z odwrotnym wynikiem klinicznym, przeczące przyjętej teorii. Wyniki w innych rodzajach nowotworów są niespójne. Być może przyczyną obserwowanych rozbieżności jest skupienie się badaczy na niezgodności ligandów KIR (tj. cząsteczek HLA klasy I) z pominięciem konstelacji ich oddziaływań z receptorami KIR oraz nieuwzględnienie integracji wielu sygnałów przez komórkę NK. Badania własne w grupie pacjentów po transplantacji KKM od dawcy niespokrewnionego wykazały, że to właśnie oddziaływanie par receptor-ligand jest kluczowe zarówno dla hamowania komórek NK jak i dla innego zjawiska – edukacji, czyli licencjonowania komórek NK. (Licencjonowanie polega na uzyskaniu bardzo silnej kompetencji cytotoksycznej przez komórki NK dawcy w środowisku z równoczesną ekspresją hamującego receptora KIR i jego ligandu, czyli cząsteczki HLA klasy I.) Funkcja komórek NK dawcy może się zmienić w nowym środowisku HLA biorcy. Co istotne, w transplantacjach „niespokrewnionych” mieliśmy najczęściej do czynienia ze zmianą pojedynczej cząsteczki HLA (czysty model zmiany oddziaływań HLA:KIR), natomiast w transplantacjach haploidentycznych sytuacja wydaje się być znacznie bardziej skomplikowana w związku z niezgodnością zwykle 3 cząsteczek HLA klasy I, które mogą, ale nie muszą być rozpoznawane przez receptory KIR obecne na k. NK dawcy, w zależności od genotypu KIR. Dlatego istotna będzie ocena konstelacji wszystkich oddziaływań HLA:KIR.

Hipoteza badawcza: Zanik licencjonowania przyjmujemy za zjawisko niekorzystne, a pojawienie się dodatkowego licencjonowania za korzystne dla nadzoru immunologicznego ze strony komórek NK przeszczepu nad chorobą zasadniczą pacjenta z nowotworem. W zakresie ryzyka wznowy choroby nowotworowej u biorców przeszczepów haploidentycznych KK korzystniejszym dawcą jest ten, u którego nie stwierdzono niekorzystnego zaniku licencjonowania oraz wykazano możliwość dodatkowego licencjonowania komórek NK ze strony receptorów KIR w nowym środowisku HLA biorcy.

Cele badania: 1. Badania KIR u biorców i dawców haploidentycznych KKM; ocena złożoności i analiza zmian licencjonowania komórek NK dawcy po haploHSCT.2. Poszukiwanie konstelacji HLA: KIR sprzyjających zmianie stopnia licencjonowania komórek NK po transplantacji KKM od dawcy haploidentycznego. 3. Analiza konstelacji aktywujących genów KIR ich przypuszczalnych ligandów.4. Gromadzenie danych do oceny klinicznej.

Plan realizacji projektu i metodyka: Grupa badana – biorcy z chorobą nowotworową oraz dawcy i potencjalni dawcy haploidentycznych KKM. Badania obejmować będą: 1. Gromadzenie retrospektywne lub badanie receptorów KIR metodą genetyczną (SSP lub SSO-Luminex) u par biorca-dawca po haploHSCT.2. Określenie przynależności grupowej dawcy i biorcy HLA I do grup ligandów: C1, C2, Bw4, A3/11 i A11/C-long.3. Określenie występowania odpowiadających sobie par hamujących KIR-HLA I u biorcy i dawcy: C1:KIR2DL2/3, C2:KIR2DL1, Bw4:KIR3DL1 i A3/11:KIR3DL2.4. Analiza uzyskanych wyników pod kątem zaniku licencjonowania, braku zmiany licencjonowania i nabycia dodatkowego licencjonowania po haploHSCT.5. Gromadzenie dokumentacji klinicznej w zakresie PFS, RI, OS, aGvHD i TRM.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:Zamierzamy przeprowadzić badania konstelacji genów HLA klasy I i KIR w dostępnej grupie pacjentów poddanych transplantacji od dawcy haploidentycznego i wstępnie ocenić zakres możliwych konstelacji HLA:KIR. Teoretycznie możliwe jest nabycie lub zanik 5 swoistych par HLA:KIR i wszystkie konstelacje pośrednie (liczbowo: od +5 do -5). Badanie wykaże, czy wszystkie te konstelacje są rzeczywiście możliwe i jaka jest ich spodziewana częstość. Podjęta zostanie próba oceny wielkości próby pacjentów, jaką należy poddać badaniom, aby uzyskać wiarygodne wyniki oceny klinicznej. Będzie to wstępem do klinicznej oceny przeciwnowotworowej funkcji komórek NK przeszczepu KKM od haploidentycznego dawcy.W związku z przewidywaną stosunkowo niewielką liczbą transplantacji haploidentycznych w okresie realizacji projektu przewidywane wyniki pozwolą na określenie skali i różnorodności zmian licencjonowania w grupie badanej oraz na wstępne zarysowanie trendów ich wpływu na przebieg kliniczny. Będzie to przyczynkiem do wystąpienia o grant wieloośrodkowy obejmujący znacznie szerszą próbę badaną.


Referencje:1.Cooley i wsp. Donor selection for natural killer cell receptors genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood 2010, 116:2411-9.2. Nowak i wsp. Donor NK cell licensing in control of malignancy in hematopoietic stem cell transplant recipients. Am J Hematol 2014, 89:E176-83. 3. Nowak i wsp. Role of donor activating KIR-HLA ligand-mediated NK cell education status in control of malignancy in hematopoietic cell transplant recipients. Biology of Blood and Marrow Transplantation 2015; 21 (5), 829-39.

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Retrospektywne genotypowanie KIR u około 14 par (28 osób) haploidentyczny dawca-biorca, u których wykonano transplantację haploidentyczną w latach 2014-2017 w Klinice Transplantacji Komórek Krwiotwórczych IHiT i współpracujących klinikach zewnętrznych. Prospektywne genotypowania KIR chorych i ich haploidentycznych krewnych (5-8 chorych i ich dawców). Bieżące gromadzenie danych HLA. Gromadzenie danych klinicznych dotyczących przebiegu przypadków z lat 2014-2018. Wstępna analiza konstelacji HLA-KIR. Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport.Wykonawcy: J. Nowak, K. Nestorowicz, S. Gwozdowicz, R. Mika-Witkowska, M. Rogatko-Koroś, J. Dziopa, D. Pawliczak, A. Drapała, M. Zubala, K. Hałaburda, A. Tomaszewska, B. Nasiłowska, A. Szczepiński, M. Wójcik


Polimorfizm epitopów cząsteczek HLA oddziałujących z receptorami KIR

Wstęp: Cząsteczki HLA klasy I są swoistymi ligandami różnych receptorów KIR. Oddziaływanie HLA:KIR jest jednym z najistotniejszych mechanizmów hamowania cytotoksycznej reaktywności komórek NK przeciwko „zdrowym” komórkom organizmu prezentującym ekspresję HLA klasy I oraz zwiększania potencjału cytotoksycznego (edukacji) komórek NK przeciwko komórkom zakażonym wirusem i komórkom nowotworowym. Badanie ligacji HLA:KIR znajduje zastosowanie w transplantacjach komórek krwiotwórczych, immunoterapii adoptywnej komórkami NK, chorobach zakaźnych i nowotworowych, a także w immunologicznym oddziaływaniu matczynej i płodowej części trofoblastu. W badaniach nad tymi procesami bardzo istotna jest predykcja rzeczywistych oddziaływań HLA:KIR, czyli określenie, które cząsteczki HLA są ligandami receptorów KIR obecnych na komórkach NK badanych osób. Ostateczny efekt przeciwwirusowy lub przeciw-nowotworowy zależy bowiem od konstelacji oddziaływań HLA:KIR. Pary kognatów HLA:KIR określa się na podstawie obecności odpowiedniego motywu aminokwasów w cząsteczce białkowej HLA. Np. cząsteczki HLA-C posiadające asparaginę 77 i lizynę 80 należą do grupy C2 i są swoistymi ligandami receptora KIR2DL1. Pozostałe cząsteczki HLA-C posiadają serynę 77 i asparaginę 80, należą zatem do grupy C1 i są ligandami KIR2DL2 i KIR2DL3. Około 1/3 cząsteczek HLA-B należy do grupy Bw4 i są one ligandami KIR3DL1. Cząsteczki te posiadają odpowiednią sekwencję aminokwasów w pozycjach 77-83 zwaną epitopem Bw4. Pozostałe cząsteczki HLA-B nie oddziałują z receptorami KIR, a w pozycjach 77-83 posiadają motywy aminokwasowe Bw6. Od przedstawionych tu zasad istnieją jednak istotne wyjątki, które zaburzają prawidłową predykcję oddziaływań HLA:KIR i zaburzają badanie ich klinicznego znaczenia. Do wyjątków tych należą między innymi: i) posiadanie motywu Bw4 przez niektóre cząsteczki HLA-A, ii) oddziaływanie niektórych cząsteczek HLA-B jako ligandów z grupy C1, iii) przynależność cząsteczek kodowanych przez allele C*16:01 i C*16:02 odpowiednio do grup C1 i C2, iv) posiadanie przez cząsteczki HLA z grupy C2 i Bw6 identycznego kluczowego motywu 77-83, i inne. Nieregularność ta jest związana z polimorfizmem genów HLA w obrębie eksonów kodujących aminokwasy należące do interfejsu HLA:KIR. Polimorfizm HLA obejmuje między innymi mutacje punktowe i rekombinacje, co skutkuje zmianą sekwencji aminokwasów, a także powstawaniem hybrydowych cząsteczek HLA.

Hipoteza badawcza: Zakłada się, że cząsteczki HLA klasy I posiadają szereg motywów aminokwasowych bądź epitopów, które wchodzą w kontakt z receptorami KIR. Sekwencje tych motywów decydują o przynależności cząsteczek HLA do grup C1, C2, Bw4, Bw6, A3/11 oraz o swoistości i sile powinowactwa oddziaływań z poszczególnymi receptorami KIR.

Cele badania: Badanie ma na celu wychwycenie prawidłowości, które decydują o zróżnicowanym oddziaływaniu cząsteczek HLA-A, B i C z konkretnymi receptorami KIR. Przeprowadzona zostanie:

- analiza opracowań krystalograficznych w celu określenia pozycji aminokwasów cząsteczki HLA należących do interfejsu HLA:KIR;- analiza opracowań nt. biologicznych własności oddziaływań ligandów HLA z poszczególnymi receptorami KIR;- analiza opublikowanych sekwencji aminokwasów w cząsteczkach HLA klasy I w celu określenia i klasyfikacji epitopów cząsteczek HLA należących do interfejsu HLA:KIR;- ostatecznym celem jest stworzenie założeń do algorytmu predykcji oddziaływań HLA:KIR na podstawie genotypów HLA i KIR badanych osób.

Plan realizacji projektu i metodyka: Na podstawie piśmiennictwa dotyczącego badań krystalograficznych określone zostaną pozycje aminokwasów w sekwencji HLA, które wchodzą w kontakt z KIR. Na podstawie opublikowanych sekwencji aminokwasów w bazie HLA oraz anomalnych oddziaływań HLA:KIR określony zostanie zakres motywów odpowiedzialnych za przynależność do grupy i swoistość ligacji KIR. Sekwencje te zostaną pogrupowane w motywy/epitopy na podstawie homologii i różnic sekwencji aminokwasów. Stworzona zostanie klasyfikacja cząsteczek HLA w zakresie przynależności do grup ligandów KIR. Podjęta zostanie próba analizy motywów aminokwasowych pod względem siły powinowactwa do KIR. Określenie powyższych prawidłowości będzie przygotowaniem do stworzenia algorytmów: 1) optymalnego parowania HLA:KIR na podstawie sekwencji aminokwasów w cząsteczkach HLA-A, B i C; 2) predykcji zmian licencjonowania komórek NK dawców w nowym środowisku HLA biorcy, do wykorzystania w doborze optymalnego dawcy komórek krwiotwórczych lub dawcy komórek NK do immunoterapii adoptywnej.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne:- poznanie zasad oddziaływania HLA z różnymi receptorami KIR; - stworzenie klasyfikacji przynależności HLA do grup ligandów KIR;- stworzenie modelu bezbłędnego przypisania kognatów;- określenie warunków stworzenia algorytmu predykcji oddziaływań HLA:KIR po alotransplantacji KKM.


Referencje:- Hilton HG, et al. Mutation at positively selected positions in the binding site for HLA-C shows that KIR2DL1 is a more refined but less adaptable NK cell receptor than KIR2DL3. J Immunol. 2012;189(3):1418-30.- Boyington JC, et al. Crystal structure of an NK cell immunoglobulin-like receptor in complex with its class I MHC ligand. Nature. 2000; 405: 537-43.- Zemmour J, et al. The molecular basis for reactivity of anti-Cw1 and anti-Cw3 alloantisera with HLA-B46 haplotypes. Tissue Antigens. 1992; 39: 249-57.- Foley BA, et al. The reactivity of Bw4+ HLA-B and HLA-A alleles with KIR3DL1: implications for patient and donor suitability for haploidentical stem cell transplantations. Blood. 2008; 112: 435-43.- Vivian JP, et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL1-mediated recognition of human leukocyte antigen B. Nature. 2011; 479: 401-5.

- Nowak i wsp. Donor NK cell licensing in control of malignancy in hematopoietic stem cell transplant recipients. Am J Hematol 2014, 89:E176-83. - Nowak i wsp. Role of donor activating KIR-HLA ligand-mediated NK cell education status in control of malignancy in hematopoietic cell transplant recipients. Biology of Blood and Marrow Transplantation 2015; 21 (5), 829-39.

Okres realizacji pracy: 2018-2020 r.Zadania do wykonania w 2018 r.: Sprowadzenie aktualnej listy alleli HLA-A, B i C i sprowadzenie kompletnych sekwencji aminokwasów w cząsteczkach HLA. Przygotowanie formatu sekwencji w pliku xls pozwalającego na sortowanie w zakresie wybranych pozycji. Na podstawie danych krystalograficznych sporządzenie wykazu pozycji reszt aminokwasowych (aa.) cząsteczek HLA biorących udział w ligacji HLA:KIR. Wstępna selekcja kluczowych i pomocniczych pozycji aa. Wstępne określenie wielkości i położenia epitopów cząsteczek HLA oddziałujących z KIR. Wstępne określenie liczebności motywów o określonych sekwencjach. Przygotowanie listy prototypowych alleli HLA, dla których wiadomo, do jakiej grupy ligandów KIR one przynależą z racji wykonanych badań funkcjonalnych. Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Raport.Wykonawcy: J. Nowak, S. Gwozdowicz, K. Nestorowicz, U. Szlendak

KARTA PRACY PLANOWEJ Nr 4.14 4/008/2015(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.20 w planie Naukowym 2015PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.15 w planie Naukowym 2016)PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.10 w planie Naukowym 2017)

Kinazy PIM w patogenezie chorób układu krwiotwórczego i chłonnego

Wstęp: Kinazy PIM (PIM1/2/3) ulegają nadekspresji w wielu nowotworach hematologicznych i guzach litych [1]. W nowotworach hematologicznych nadekspresja tych kinaz wynika z zaburzeń aktywności receptora FLT3, ekspresji kinazy BCR-ABL i aktywacji osi JAK-STAT i czynnika transkrypcyjnego NFkB. Onkogenne działanie tych kinaz polega regulacji kluczowych białek tj. Myc, NFkB-p65, BAD, 4EBP1 czy p53, przekładającą się na promocję metabolizmu i cyklu komórkowego oraz działaniu antyapoptotycznym [2]. W ostatnich latach wykazano, iż w chłoniaku grudkowym i chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL) ekspresja kinaz PIM1 i PIM2 jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym[3,4]. Kinazy PIM zostały także zdefiniowane w badaniach in vitro i in vivo jako racjonalny cel terapeutyczny w przewlekłej i ostrej białaczce szpikowej, przewlekłej białaczce limfocytowej, szpiczaku plazmocytowym czy DLBCL [4,5-7]. Stworzone dotychczas inhibitory tych kinaz nie przechodziły do kolejnych faz badań klinicznych, min. ze względu na kardiotoksyczność. Badania przeprowadzone w Pracowni Hematologii Doświadczalnej wskazują, iż kinazy PIM ulegają ekspresji w liniach modelowych dla chłoniaka Hodgkin’a (HL) i mogą być celem interwencji farmakologicznej w tej chorobie. Ponadto, otrzymane dane wskazują, iż ekspresja kinaz PIM w komórkach HL zależy od aktywności osi JAK-STAT i NFkB, a zasadniczym mechanizmem toksyczności inhibicji kinaz PIM w HL jest osłabienie czynności osi NFkB, pełniącej centralną rolę w patogenezie tej choroby. Do inaktywacji kinaz PIM w komórkach HL użyto nowego, wysoce specyficznego inhibitora – SEL24-B489, opracowanego przez firmę Selvita S.A. (Kraków), charakteryzującego się dużo niższą toksycznością w modelach in vivo, w porównaniu do wspomnianych substancji.

Hipoteza badawcza: Komórki chłoniaka śródpiersia (PMBCL) charakteryzują się zbliżonym profilem ekspresji genów do komórek HL, a także konstytutywną aktywacją osi JAK-STAT i NFkB. Bioinformatyczna analiza mikromacierzy, wykonana w naszej Pracowni, wykazała nadekspresję wszystkich trzech kinaz PIM w linii modelowej dla PMBCL – Karpas1106P. W związku z powyższym zakładamy, iż kinazy PIM mogą ulegać ekspresji w PMBLC i stanowić racjonalny cel terapeutyczny w tym chłoniaku. Jakkolwiek kinazy PIM zostały zdefiniowane jako cel terapeutyczny w szpiczaku plazmocytowym, nie przeprowadzono dotychczas badań mających na celu określenie czy ekspresja kinaz ma znaczenie prognostyczne w tej chorobie.

Cele badania: Zbadanie aktywności JAK-STAT in NFkB w linii modelowej PMBLC – Karpas 1106P oraz materiale klinicznym. Zbadanie ekspresji kinaz PIM1/2/3 w linii Karpas 1106P oraz w materiale klinicznym, ocena korelacji ekspresji tych kinaz z aktywnością JAK-STAT i NFkB i znaczenia ekspresji dla przebiegu choroby. Ocena konsekwencji inhibicji

farmakologicznej kinaz PIM w PMBCL. Ocena korelacji ekspresji kinaz PIM1/2/3 z przebiegiem choroby w materiale klinicznym od chorych na szpiczaka plazmocytowego.

Plan realizacji projektu i metodyka: Ocena aktywności czynników transkrypcyjnych STAT3/5 i NFkB (p65, c-Rel, RelB) oraz ekspresji kinaz PIM1/2/3 w materiale klinicznym zostanie przeprowadzona metodą immunohistochemii w Pracowni Patomorfologii, a związek między ich ekspresją a parametrami kliniczno-prognostycznymi zostanie zbadany we współpracy z Kliniką Hematologii.

Dotychczasowa realizacja celów badania: Do chwili obecnej w badaniu potwierdzono ekspresję wszystkich trzech izoform kinaz PIM-1/2/3 oraz aktywność czynników transkrypcyjnych STAT-1/3/6 i NFκB (RelA, cRel, RelB) mogących odpowiadać za ekspresję tych kinaz w linii modelowej PMBCL – Karpas 1106P. Wykazano iż inhibicja kinaz PIM przy użyciu SEL24 powodowała istotne zahamowanie proliferacji linii PMBCL (IC50 = 0,97µM), co sugeruję rolę tych kinaz w podtrzymaniu fenotypu komórek PMBCL. Ponadto, stwierdzono iż farmakologiczna inhibicja PIM obniża fosforylację (aktywność) NFκB -RelA (S276), STAT3 (Tyr 705), RP-S6 (S235/236), 4EBP1 (S65) oraz. STAT1 (Tyr 701), co sugeruje iż w komórkach PMBCL kinazy PIM wspierają translację oraz aktywność NFκB-RelA oraz STAT1/3. Zgodnie z tym, w komórkach PMBCL po inhibicji PIM obserwowano istotny spadek poziomu transkryptu dla licznych genów NFκB- i STAT-zależnych, w tym kodujących białka anty-apoptotyczne (BCL-XL, Bfl-1) ale także białek immunomodulacyjnych, jak PD-L1 i PD-L2, wpływających na immunologiczne uprzywilejowanie komórek nowotworowych. Po inkubacji komórek PMBCL z inhibitorem pan-PIM, przy użyciu cytometrii przepływowej obserwowano także obniżenie powierzchniowej ekspresji PD-L1 oraz PD-L2. SEL24 spowodował także istotny spadek mRNA dla wszystkich trzech izoform PIM, co może świadczyć o roli czynników NFκB oraz STAT w regulacji ekspresji tych kinaz w komórkach PMBCL. Do chwili obecnej gromadzono i przygotowywano materiał kliniczny od chorych z PMBCL oraz MM do analizy immunohistochemicznej w celu weryfikacji ekspresji kinaz PIM1/2/3.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu:Proponowane jest rozszerzenie badań immunohistochemicznych o analizę ekspresji kinaz PIM, Myc oraz E2F1 i E2F2 w materiale od chorych z DLBCL, z szczególnym uwzględnieniem przypadków „double-hit” Myc+/BCL2+, oraz analizę ekspresji CD105 /Endoglin w materiale od chorych z MM. Ponadto proponowane jest rozszerzenie badań in vitro o analizę wpływu wyciszenia ekspresji Myc, E2F1 i E2F2 na ekspresję kinaz PIM w liniach komórkowych DLBCL, a także ocenę ekspresji CD47 i CD20 w liniach komórkowych DLBCL inkubowanych z SEL24. Wyniki dotychczasowych badań in vitro wykonanych w Zakładzie Hematologii Eksperymentalnej przy użyciu inhibitorów Myc sugerują istotną rolę tego czynnika w indukcji ekspresji kinaz PIM1-3 w liniach podtypu GCB jak i ABC-DLBCL. Analizy bioinformatyczne nie wykazały kanonicznych miejsc wiązania Myc w proksymalnych promotorach PIM-1 i -2, natomiast wykazały miejsca wiązania dla czynników regulowanych przez Myc - E2F1 i E2F2. Dalsze analizy bioinformatyczne z wykorzystaniem publicznie dostępnych danych z mikromacierzy ekspresyjnych wykonanych na materiale od

chorych z DLBCL (n=420) wykazały tendencję do koekspresji PIM-1/2 z Myc ale także silną pozytywną korelację między ekspresją PIM-1/2 a czynnikami E2F1 i E2F2, sugerując iż mogą one bezpośrednio regulować ekspresję kinaz PIM w DLBCL. Ponieważ wyniki wcześniejszych prac wykonanych w naszym zakładzie sugerują rolę kinaz PIM w zwiększaniu stabilności białka Myc w DLBCL, potwierdzenie korelacji między ekspresją kinaz PIM a Myc, E2F1/E2F2 w materiale od chorych z DLBCL, oraz roli tych czynników transkrypcyjnych w indukcji ekspresji kinaz PIM przy użyciu metod interferencji RNA, sugerowało by mechanizm dodatniego sprzężenia zwrotnego pomiędzy kinazami PIM a Myc. Ponadto, wykazanie takiej korelacji mogło by znaczyć potencjale klinicznym inhibicji kinaz PIM w szczególnie źle rokującej grupie „double-hit” DLBCL. Ponieważ w ostatnim czasie wykazano iż Myc może regulować ekspresję białka „don’t eat me” – CD47, proponowane jest zbadanie wpływu inhibicji kinaz PIM na ekspresję CD47 oraz CD20 w komórkach DLBCL. Zakładany spadek ekspresji CD47 przy równoczesnym zachowaniu ekspresji CD20 sugerowałby możliwość synergistycznego działania inhibitora pan-PIM z rytuksymabem. Ponieważ kinazy PIM mogą pośrednio wpływać na angiogenezę w szpiczaku plazmocytowym (projekt realizowany w Instytucie Hematologii przez Filipa Garbicza w ramach grantu diamentowego), rozszerzenie badań immunohistochemicznych o marker angiogenezy – CD105/Endoglin, pozwoliło by na określenie korelacji pomiędzy ekspresją kinaz PIM a stopniem nasilenia angiogenezy w MM.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Proponowane badania mają na celu scharakteryzowanie patogenetycznej i klinicznej roli kinaz PIM w PMLBCL i w MM.

Rodzaj pracy: badanie naukowe podstawowe / badanie naukowe stosowane

Referencje:1.Brault L., Gasser C., Bracher F., Huber K., Knapp S., Schwaller J. PIM serine/threonine kinases in the pathogenesis and therapy of hematologic malignancies and solid cancers. Haematologica. 2010; 95: 1004-15.2.Nawijn M.C., Alendar A., Berns A. For better or for worse: the role of Pim oncogenes in tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 2011; 11: 23-34.3.Schatz J.H., Oricchio E., Wolfe A.L. i wsp. Targeting cap-dependent translation blocks converging survival signals by AKT and PIM kinases in lymphoma. J Exp Med. 2011; 208: 1799-807.4.Brault L., Menter T., Obermann E.C. i wsp. PIM kinases are progression markers and emerging therapeutic targets in diffuse large B-cell lymphoma. Br J Cancer. 2012; 107: 491-500.5.Keeton E.K., McEachern K., Dillman K.S. i wsp. AZD1208, a potent and selective pan-Pim kinase inhibitor, demonstrates efficacy in preclinical models of acute myeloid leukemia. Blood. 2014; 123: 905-13.6.Chen L.S., Redkar S., Bearss D., Wierda W.G., Gandhi V. Pim kinase inhibitor, SGI-1776, induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Blood. 2009; 114: 4150-7.7.Chen L.S., Redkar S., Taverna P., Cortes J.E., Gandhi V. Mechanisms of cytotoxicity to Pim kinase inhibitor, SGI-1776, in acute myeloid leukemia. Blood. 2011; 118: 693-702.

8. Szydłowski M., i wsp. Expression of PIM kinases in Reed-Sternberg cells fosters immune privilege and tumor cell survival in Hodgkin lymphoma.Blood. 2017, DOI: 10.1182/blood-2017-01-760702.

Pozostały okres realizacji pracy: 2 lata (2017-2018)Zadania do wykonania w 2018 r.: Badania in vitro. Barwienia IHC. Zebranie oraz analiza danych klinicznych.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: RaportWykonawcy: M. Szydłowski, A. Szumera-Ciećkiewicz, M. Prochorec-Sobieszek, E. Lech-Marańda, A. Malenda, J. Barankiewicz, K. Warzocha, E. Jabłońska, P. Juszczyński

PRACE DOKTORSKIE

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.1 4/009/2013Ocena wpływu wybranych czynników serologicznych i molekularnych

na przebieg alloimmunologicznej małopłytkowości płodowo/noworodkowej spowodowanej przeciwciałami anty-HPA-1a

(PRACA DOKTORSKA)

Wstęp: Alloimmunologiczna małopłytkowość płodu/noworodka (AIMP/N) występuje z częstością 1/1000 żywo urodzonych dzieci. Jest wynikiem konfliktu między matką i płodem w zakresie antygenów płytek krwi (HPA) i w ok. 90% dotyczy niezgodności w zakresie układu HPA-1. Skutkiem konfliktu jest niszczenie płytek dziecka przez alloprzeciwciała wytwarzane przez HPA-1a ujemną matkę w wyniku jej immunizacji antygenem HPA-1a płodu odziedziczonym po ojcu. AIMP/N może prowadzić do wylewu do OUN, a w 10-20% przypadków nawet do śmierci płodu lub noworodka. Może występować już w pierwszej ciąży. Nie wszystkie kobiety HPA-1a ujemne wytwarzają przeciwciała anty-HPA-1a. W indukcji ich tworzenia uczestniczą limfocyty T, których odpowiedź zależy od repertuaru antygenów HLA-DR. Czynnikami rokowniczymi mogą być: obecność u matki allelu DRB3*0101 (choć tylko ok. 30% kobiet z tym allelem wytwarza przeciwciała anty-HPA-1a) oraz dawka genu kodującego ten allel. Nie wiadomo, czy czynnikami rokowniczymi ciężkości przebiegu klinicznego AIMP/N mogą być również: 1/ stężenie przeciwciał anty-HPA-1a u matki; 2/ równoczesna obecność przeciwciał anty-HLA niewiążących dopełniacza (mogą hamować niszczenie płytek dziecka poprzez blokowanie aktywności niszczących je makrofagów, ale nie można wykluczyć ich roli w zwiększonym niszczeniu płytek płodu); 3/ inne allele HLA, w tym HLA DQB1, HLA DRB4 i DRB5, które mogą uczestniczyć w prezentowaniu antygenu HPA-1a limfocytom T i tym samym indukować wytwarzanie przeciwciał anty-HPA-1a;4/ stężenie naturalnych przeciwciał skierowanych do antygenów układu ABO;ich obecność zmniejsza prawdopodobnie ryzyko wystąpienia małopłytkowości u płodu.Przeprowadzenie wyżej wymienionych badań u zimmunizowanych kobiet ciężarnych HPA-1a ujemnych może być przydatne w podjęciu decyzji o ich leczeniu w ciąży, mającym na celu zapobiec lub zmniejszyć objawy AIMP/N.

Hipoteza badawcza:- Dawka genu DRB3*0101 oraz obecność alleli HLA DQB1, HLA DRB4 i DRB5 mogą być czynnikiem predykcyjnym alloimmunizacji antygenem HPA-1a.- Ocena stężenia przeciwciał anty-HPA-1a, anty-HLA niewiążących dopełniacza i przeciwciał grupowych mogą być pomocne w przewidywaniu ryzyka wystąpienia i ciężkości przebiegu AIMP/N.

Dotychczasowa realizacja celów badania:- na bieżąco systematyzowano dane prospektywne na temat przebiegu ciąży oraz stanu klinicznego dzieci kobiet diagnozowanych w Pracowni Immunologii Leukocytów i Płytek Krwi IHiT pod kątem konfliktu w zakresie antygenu HPA-1a;- uzupełniano wcześniej sporządzony rejestr badanych matek i ich dzieci z AIMP/N;

- oceniono aktywność przeciwciał anty-HPA-1a przy użyciu standardu WHO anty-HPA-1a nr 03/152 (NIBSC, Wlk. Brytania) w 55 surowicach pochodzących od 38 kobiet ciężarnych;-w 2015 r. uzyskano zgodę na zakup testów do oznaczania antygenów HLA DRB3*0101, HLADQB1*0201, HLA DRB4*0101 i DRB5*0101 (Immucor, USA) z Funduszu Badań Własnych IHiT – badania zostaną wykonane u ok. 30 kobiet HPA-1b/1b, które wytworzyły przeciwciała anty-HPA-1a i u ok. 30 kobiet z grupy ryzyka, które nie uległy immunizacji tym antygenem w czasie ciąży;- w 2014 r. zaprezentowano na XIII European Symposium on Platelet and Granulocyte Immunobiology, Bad Homburg, Niemcy doniesienie pt. „Standardization of automatic FACS analysis for HPA-1a typing”, autorstwa: Wróbel A., Guz K., Orzińska A. i wsp.;- w2014 r. na konferencji szkoleniowej Postępy w Immunohematologii 2014 przedstawiono doniesienie „Prezentacja przypadku klinicznego AIMP/N” Wróbel A. ;- w 2015 r. na konferencji naukowo-szkoleniowej Diagnostyka Transfuzjologiczna przedstawiono wykład „Prezentacja przypadków klinicznych AIMP/N”, autorstwa Wróbel A.

Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu:brak.

Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Jeżeli stwierdzimy korelację przeprowadzonych badań serologicznych i molekularnych z ciężkością przebiegu AIMP/N, to mogą być one wprowadzone do praktyki klinicznej.


Referencje: Husebekk A, Skogen B, Killie MK et al. Foetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT).

ISBT Science series 2011, 6: 261-264. Maślanka K, Guz K, Żupańska B. Antenatal screening of unselected pregnant women for HPA-1a

antigen, antibody and alloimmune thrombocytopenia. Vox Sang. 2003;85: 326-327. Kamphuis MM, Paridans N, Porcelijn L, Haas de M et al. Screening in pregnancy for fetal or neonatal

alloimmune thrombocytopenia:systematic review. Jour. Obstet. Gynecol. 2010, 1335-1343. Uhrynowska M., Maślanka K., Żupańska B. Kliniczne i immunologiczne obserwacje w

alloimmunologicznej małopłytkowości płodowo-noworodkowej. Pediat. Pol., 2002, 3, 197-202. Wu S, Maslanka K, Gorski J. An integrin polymorphism that defines reactivity with alloantibodies

generates an anchor for MHC class II peptide binding a model for undirectional alloiimune response. J.Immunol. 1997; 158: 3221-3226.

Sarab GA, Moss M, Barker RN, Urbaniak SJ. Naturally processed peptides spanning the HPA-1a polymorphism are efficiently generated and displayed from platelet glycoprotein by HLA-DRB3*0101-positive antigen-presenting cells. Blood 2009;114:1954-1957.

Tad de MW, Klohe E, Grosset A et al. Neonatal alloimmune thrombocytopenia with HLA alloimmunization: case report with immunohematologic and placental findings. Pediatr. Develop. Pathol. 2002, 5: 200-205.

Thude H, Schorner U, Helfricht C et al. Neonatal alloimmune thrombocytopoenia caused by human leucocyte antigen-B-27 antibody. Transf. Med. 2006; 16: 143-149.

Curtis BR, Fick A, Lochowicz AJ, McFarland JG et al. Neonatal alloimune thrombocytopenia associated with maternal-fetal incompatibility for blood group B. 2008, Transfusion; 48: 358-364.

Ahlen MT, Husebekk A, Killie MK et al. The development of severe neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-HPA-1a antiobodies is correlated to maternal ABO genotypes. Clin.Develop. Immuno. 2012, 67:1-5.

Killie M.K., Kjeldsen-Kragh J., Randen I, Skogen B., Husebekk A. Evaluation of anew flow cytometric HPA 1a screening method. A rapid and reliable tool for HPA 1a screening of blood donors and pregnant women. Transfusion and Apheresis Science, 2004; 30:89-92.

Pozostały okres realizacji pracy: 1 rok.Zadania do wykonania w 2018 r.: Pisanie rozprawy, obrona.Forma rozliczenia pracy w 2018 r.: Obrona rozprawy doktorskiej.Wykonawca: A. Gierszon

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.2 4/018/2011Charakterystyka serologiczna i molekularna odmian antygenu RhD w Polsce

(PRACA DOKTORSKA)Wykonawca: M. Pelc-Kłopotowska

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.3 4/012/2013Odpowiedź suboptymalna na leczenie imatynibem u chorych na przewlekłą białaczkę

szpikową w fazie przewlekłej jako czynnik prognostyczny niepowodzenia leczenia(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: A. Kołkowska-Leśniak

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.4 4/013/2013Diagnostyka i epidemiologia wczesnego i ukrytego zakażenia DNA HBV u polskich

dawców krwi bez antygenu HBs w latach 2005-2012(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: A. Kopacz

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.5 3/003/2013Ocena wybranych komórkowych i immunomodulujących czynników rokowniczych

u chorych na chłoniaka Hodgkina monitorowanych badaniem PET(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: O. Szymańska-Giemza

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.6 4/020/2012Ocena odległych wyników angioplastyki tętnic podudzia przy użyciu cewników balonowych

pokrytych paklitakselem u chorych na cukrzycę(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: R. Bilski

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.7 4/005/2016Charakterystyka przebiegu klinicznego z oceną jakości życia i identyfikacja mutacji

sprawczych w genie czynnika IX (F9) u pacjentów z ciężką hemofilią B w Polsce(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: A. Buczma

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.8 4/004/2017Ocena czynników ryzyka zakażeń krwi związanych z centralnym cewnikiem żylnym

u pacjentów hospitalizowanych w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: M. Giemza

KARTA PRACY PLANOWEJ 5.9 4/005/2017Charakterystyka kliniczna oraz wyniki leczenia chorych na

ostrą białaczkę szpikową z lokalizacją pozaszpikową(PRACA DOKTORSKA)

Wykonawca: E. Patkowska

PROJEKTY BADAWCZE, GRANTY

KARTA PRACY PLANOWEJ – G 49„Ekspresja genów i białek CRBN, CUL4A i DDB1 u chorych ze szpiczakiem

plazmocytowym i zespołem 5q- jako biomarker odpowiedzi na leki immunomodulujące”(PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.20 w Planie Naukowym 2013PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.12 w Planie Naukowym 2014PRACA KONTYNUOWANA – Nr 4.13 w Planie Naukowym 2015)

„Integralność białek kompleksu ligazy E3 ubikwityny jako biomarker odpowiedzi na leczenie immunomodulujące u chorych na szpiczaka plazmocytowego”

(GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

Wstęp: Mimo klinicznej skuteczności leków immunomodulujących (IMiDs) w szpiczaku plazmocytowym ich mechanizm działania ani biomarker identyfikujący chorych, u których leki te przyniosą efekt kliniczny nie są w pełni zrozumiałe. W ostatnich latach zidentyfikowano mechanizm teratogennego działania talidomidu, zależny od ekspresji białka CRBN (cereblon). Cereblon tworzy kompleks o aktywności ligazy E3 ubikwityny wraz z białkami CUL4A i DDB1. Kompleks ten u zwierząt bierze udział w procesie formowania kończyn. Działanie teratogenne talidomidu wynika z wiązania CRBN i zahamowania aktywności enzymatycznej tego kompleksu. Ekspresja CRBN jest niezbędna do przeciwszpiczakowego działania IMiD w modelu in vitro jak i u chorych. Wysoka ekspresja tego białka wiązała się u chorych z lepszą odpowiedzią na talidomid i lenalidomid, a u chorych z wtórną opornością na lenalidomid jest ona niższa o 20-90% niż u chorych wrażliwych na ten lek. Utrata lub niska ekspresja CRBN może stanowić zatem biomarker oporności na IMID. Znaczenie ekspresji pozostałych białek kompleksu (DDB1 i CUL4A) dla odpowiedzi na IMiDs nie jest znane. W proponowanej pracy proponujemy zbadanie ekspresji białka CRBN oraz CUL4a i DDB1 u chorych na SzP otrzymujących lenalidomid lub talidomid w kontekście odpowiedzi na stosowane leczenie. Hipoteza badawcza: W świetle powyższych obserwacji, można oczekiwać, że ekspresja wszystkich białek kompleksu - CRBN, CUL4A i DDB1 stanowi warunek skuteczności leków immunomodulujących u chorych na SzP.Dotychczasowa realizacja celów badania: W dotychczas przeprowadzonych badaniach oceniono ekspresję dwóch białek kompleksu tj. CUL4A i DDB1 metodą immunohistochemiczną w materiale archiwalnym (trepanobiopsje) pochodzącym od chorych na SzP i MDS 5q-. Wysoką ekspresję CUL4A i DDB1 stwierdzono u 83% chorych na SzP. Obserwowano dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białek CUL4A i DDB1 (p= 0,001, 2

test). Ponadto, u chorych na SzP, którzy odpowiedzieli na leczenie lenalidomidem w porównaniu z pacjentami nieodpowiadającymi na terapię, zaobserwowano tendencję do wyższej ekspresji DDB1 (89,5% vs. 10,5%, p= 0,06, 2 test). Nie stwierdzono różnic w ekspresji CUL4A w odniesieniu do odpowiedzi na leczenie lenalidomidem, jednak częstość zgonów związanych z progresją SzP była wyższa u pacjentów z niską ekspresją CUL4A w porównaniu do tych z wysoką ekspresją CUL4A (75% vs. 28%, p=0,07, 2 test). Proponowane modyfikacje planu realizacji projektu wraz z uzasadnieniem: W związku z uzyskaniem grantu NCN na finansowanie powyższego projektu dostosowano tytuł pracy planowej do tytułu grantu i rozszerzono o następujące cele badawcze:

1. Ocena ekspresji genów oraz białek CRBN, DDB1, CUL4A oraz Roc1 w ustalonych liniach komórkowych szpiczaka plazmocytowego oraz komórkach szpiku kostnego (materiał archiwalny) uzyskanego od 200 chorych na PCM.2. Określenie roli CRBN, CUL4A, DDB1 oraz Roc1 w przeciwnowotworowym działaniu IMiDs na podstawie badań czynnościowych z wykorzystaniem ustalonych linii komórkowych szpiczaka plazmocytowego.3.Ocena ekspresji białek IKZF1 oraz IKZF3 w kontekście integralności białek kompleksu ligazy E3 ubikwityny na podstawie badań czynnościowych z wykorzystaniem ustalonych linii szpiczaka plazmocytowego oraz w komórkach plazmatycznych wyizolowanych ze szpiku kostnego od 50 dotychczas nieleczonych chorych na PCM.4. Ocena potencjalnych korelacji pomiędzy ekspresją poszczególnych elementów kompleksu E3 ligazy ubikwityny a parametrami klinicznymi i prognostycznymi u chorych na PCM.Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: Ekspresja białek i genów odpowiadających za biologiczne skutki działania talidomidu i lenalidomidu może stanowić biomarker wrażliwości na te leki w SzP, który może zracjonalizować ich zastosowanie. Referencje: 1. Ren S, Xu C, Cui Z, et al. Oncogenic CUL4A determines the response to thalidomide treatment in prostate cancer.J Mol Med (Berl). 2012 [Epub ahead of print]2. Lopez-Girona A, Mendy D, Ito T et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia 2012 doi: 10.1038/leu.2012.119. [Epub ahead of print]3. Ito T, Ando H, Suzuki T, et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.Science. 2010; 327: 1345-50.

Okres realizacji pracy: 2015-2018.Zadania do wykonania w 2017 r.: zgodnie z harmonogramem grantu. Forma rozliczenia pracy w 2017 r.: streszczenie zjazdowe.Wykonawcy: E. Lech-Marańda, A. Malenda, A. Szumera-Ciećkiewicz, P. Juszczyński, M. Prochorec-Sobieszek, K. Warzocha

KARTA PRACY PLANOWEJ – IntraMMclo„Heterogenność klonalna szpiczaka plazmocytowego: ewolucja

i implikacje terapii celowanej”(GRANT FINANSOWANY PRZEZ NARODOWE CENTRUM BADAŃ I ROZWOJU)

Okres realizacji pracy: 2017 - 2019Wykonawcy: K. Jamroziak

KARTA PRACY PLANOWEJ – G 51 (Diamentowy Grant)

„Inhibitory pan-PIM jako racjonalna strategia leczenia celowanego w szpiczaku mnogim zaburzająca jego interakcje z mikrośrodowiskiem”

(GRANT MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO)

Okres realizacji pracy: 2017-2019Wykonawcy: F. Garbicz (opiekun naukowy Prof. Przemysław Juszczyński)

KARTA PRACY PLANOWEJ – G 52

„Znaczenie mutacji kinazy PIM-1 w progresji przewlekłej białaczki limfocytowej”(GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

Wstęp: Wcześniejsze badania wykazały znaczącą rolę rodziny kinaz PIM (PIM-1, PIM-2, PIM-3) w patogenezie nowotworów hematologicznych oraz guzów litych i pozwoliły zidentyfikować ich onkogenny potencjał. Białka te należą do grupy kinaz serynowo-treoninowych i biorą udział w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej regulując m.in. procesy proliferacji, apoptozy, migracji, transkrypcji oraz odpowiedzi na stres komórkowy. Wysoki poziom ekspresji kinaz PIM zaobserwowano m.in. w CLL, agresywnych chłoniakach rozlanych z dużych komórek B (DLBCL), ostrej białaczce szpikowej, szpiczaku plazmocytowym, czy nowatorach litych, w których to ich podwyższony poziom ekspresji korelował z gorszym rokowaniem pacjentów. Kinazy PIM stanowią efektory szlaków sygnalizacyjnych związanych z kinazą Janus (JAK), czynnikami transkrypcyjnymi STAT oraz jądrowym czynnikiem transkrypcyjnym κB (NFκB), jak również kinazami ABL i FLT3. Wskazuje to na ich onkogenny potencjał, który potwierdzono z wykorzystaniem inhibitorów kinaz PIM blokujących progresję nowotworów układu chłonnego oraz krwiotwórczego w modelach in vitro. Nieliczne doniesienia wskazują na występowanie mutacji w strukturze kinazy PIM-1, które mogą wpływać na aktywność oraz stabilność tego białka, a zatem również na proces onkogenezy nowotworów układu chłonnego. Wstępne badania

przeprowadzone na małych grupach pacjentów wskazują na ich występowanie w chłoniakach i białaczkach wywodzących się z ośrodków rozmnażania węzłów chłonnych (CLL, chłoniak strefy brzeżnej, chłoniak grudkowy oraz DLBCL), a częstość ich występowania rośnie wraz ze wzrostem potencjału złośliwości choroby. Wykazano ponadto, że obecność mutacji w obrębie PIM-1 w DLBCL może być związana z opornością na leczenie ibrutynibem, inhibitorem kinazy Brutona, stosowanym w zaawansowanych i agresywnych chłoniakach oraz CLL. Dotychczas wpływ mutacji w obrębie kinazy PIM-1 na przebieg procesu powstawania i progresji chłoniaków oraz CLL, z uwzględnieniem znaczenia prognostycznego oraz predykcyjnego, nie został w pełni zdefiniowany.Hipoteza badawcza: Biorąc pod uwagę wzrost częstości mutacji w obrębie kinazy PIM-1 wraz ze wzrostem agresywności chłoników, hipotetycznie analogiczne zmiany w obrębie PIM-1 w komórkach CLL mogą potencjalnie wspomagać ich przeżycie, prowadzić do wzrostu ich agresywności oraz transformacji do DLBCL.Cele badania: Cel 1. Analiza częstości występowania mutacji PIM-1 oraz ich związku z przebiegiem klinicznym przypadków CLL. Cel 2. Charakteryzacja skutków mutacji PIM-1 w stosunku do specyficzności substratowej oraz przeżywalności komórek CLL w modelu in vitro.Cel 3. Określenie wrażliwości komórek CLL ze zmutowaną formą PIM-1 w stosunku do inhibitorów kinaz PIM.Plan realizacji projektu i metodyka: Częstość występowania oraz rodzaj mutacji PIM-1 zostanie określony z wykorzystaniem techniki sekwencjonowania oraz PCR, zarówno w materiale klinicznym oraz ustalonych liniach komórkowych CLL. Uzyskane wyniki zostaną skorelowane z danymi kliniczno-patologicznymi pacjentów, co pozwoli określić znaczenie prognostyczne oraz predykcyjne tych mutacji. Równolegle do ww. badań zostaną przeprowadzone eksperymenty in vitro polegające na wprowadzeniu zmutowanych form kinazy PIM-1 z wykorzystaniem techniki CRISPR/Cas9 w nowotworowych liniach komórkowych. W zaplanowanych badaniach przewidziano charakterystykę funkcjonalną utworzonych linii (analiza cyklu komórkowego, apoptozy i migracji, określenie ekspresji biomarkerów zaangażowanych w onkogenezę ww. chłoniaków). W tym celu wykorzystane zostaną takie techniki jak cytometria przepływowa, inkorporacja BrdU, test MTS i uwalniania LDH, oraz Western-blot. Z użyciem chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią mas zostanie podjęta próba identyfikacji nowych substratów zmutowanych form kinazy PIM-1 mogących mieć znaczenie w progresji choroby. Ponadto, określona zostanie podatność mutantów na zahamowanie ich aktywności przez komercyjnie dostępne inhibitory, zarówno w monoterapii, jak i w kombinacji z tradycyjnymi i nowymi lekami cytostatycznymi.Przewidywane wyniki i potencjalne skutki praktyczne: CLL należy do najczęściej rozpoznawanych białaczek układu chłonnego. Przedstawiony projekt pozwoli na lepsze poznanie procesu jej nowotworzenia oraz progresji. Oprócz poznawczego charakteru badań, projekt ma również duże znaczenie kliniczne, gdyż uzyskane wyniki pozwolić mogą na poszerzenie wiedzy dotyczącej zastosowania inhibitorów kinaz PIM w klinice. Przełożyć się to może na spersonalizowanie terapii przeciwnowotworowej, co znacząco może wpłynąć na sukces terapeutyczny i minimalizację potencjalnych skutków ubocznych leczenia.

Okres realizacji pracy: 2017-2020Wykonawcy: B. Puła, E. Białopiotrowicz, P. Górniak

KARTA PRACY PLANOWEJ – G 53 „Genetyczne cechy komórek Reed-Sternberga i ich interakcje makrofagami w klasycznym

chłoniaku Hodgkina: identyfikacja mechanizmów oporności na chemioterapeutyki i nawrotów choroby”

(GRANT NARODOWEGO CENTRUM NAUKI)

Okres realizacji pracy: 2017-2020Wykonawcy: K. Warzocha

KARTA PRACY PLANOWEJ – G 54 (Diamentowy Grant)„CDK8 jako racjonalny cel terapii w chłoniaku rozlanym

z dużych komórek B (DLBCL)”(GRANT MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO)

Okres realizacji pracy: 2017-2019Wykonawcy: A. Tracz (opiekun naukowy Prof. Przemysław Juszczyński)

NAUKOWY 2018.docx · Web viewPonadto, wspólnie z Zakładem Diagnostyki Hematologicznej i Kliniki...

Documents

Transcript of NAUKOWY 2018.docx · Web viewPonadto, wspólnie z Zakładem Diagnostyki Hematologicznej i Kliniki...