czoło kolumny

wypływ

1. chromatografia

kolumnowa

2. chromatografia

cienkowarstwowa

czoło

start

Ze względu na kształtu złoża można podzielić

Chromatografia

Gazowa

Gazowo-cieczowa

Gaz-ciało stałe

Cieczowa

Ciecz-ciało stałe

Ciecz-ciecz

– zdolna do oddziaływania ze składnikami mieszaniny matryca nie

przemieszczająca się w procesie chromatografii, zwykle ciekła lub stała

– ciecz lub gaz oddziałujący ze składnikami rozdzielanej mieszaniny,

przemieszczający się wzdłuż fazy stacjonarnej

– stała substancja wypełniająca kolumnę lub pokrywająca płytkę, może stanowićfazę stacjonarną lub „podporę” dla stacjonarnej fazy ciekłej

– ciekła faza ruchoma (zwłaszcza w chromatografii kolumnowej)

– wypływająca z kolumny faza ruchoma zawierająca rozfrakcjonowane składniki

mieszaniny

– faza stacjonarna o właściwościach adsorpcyjnych

- składnik mieszaniny ulegający adsorpcji

– obraz graficzny frakcji wypływających z kolumny chromatograficznej

– objętość, w której wypływa z kolumny dana frakcja

– czas, w którym wypływa ze standaryzowanej kolumny dana frakcja

Niezależnie od sposobu przeprowadzenia rozdziału- w chromatografii cienkowarstwowej

- w chromatografii kolumnowej,

są wykorzystywane te same mechanizmy

oddziaływań międzycząsteczkowych

Podział chromatografii ze względu na naturę zjawisk

będących podstawą procesu chromatograficznego

➢ Chromatografia adsorpcyjna

➢ Chromatografia podziałowa

➢ Chromatografia jonowymienna

➢ Chromatografia żelowa (wykluczenia, sitowa lub sączenie

molekularne)

• Chromatogram rozwijamy przemywając złoże (adsorbent w kolumnie)

rozpuszczalnikiem, czyli dzielimy mieszaninę na grupy związków i wymywamy

je (eluujemy) z kolumny, zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z

eluującymi się związkami).

• Oddziaływania międzycząsteczkowe powodują, że rozdzielane substancje w

niejednakowym stopniu zatrzymują się na adsorbencie. Im większe

powinowactwo analitu do fazy stacjonarnej, tym analit jest silniej przez niązatrzymywany.

• Analit z adsorbentu wymywany jest fazą ruchomą. Im silniej zatrzymywany

analit, tym później opuszcza kolumnę, ma większą retencję (opóźnienie w

stosunku do przepływu fazy ruchomej).

• Objętość fazy ruchomej potrzebna do wymycia analitu to objętość retencji,

a czas, w jakim analit zostaje wymyty z kolumny to - czas retencji.

• Objętość retencji i czas retencji analitu liczy się od momentu naniesienia na

kolumnę do momentu opuszczenia kolumny przez maksimum jego stężenia.

Etapy rozdziału chromatograficznego

Rozdziałna nośniku

Graficzne przedstawienie wyników

rozdziału chromatograficznego: profil elucji

1 - Przygotowanie i

pakowanie kolumny

2 - Złoże gotowe do

rozdziału

3 - Nakładanie

mieszaniny

4, 5 - Rozdział

6 - Zbieranie frakcji

1 2 3

4 5 6

Faza stacjonarna: ciało stałe,

Przykłady: żel krzemionkowy, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny,

tlenek glinu, skrobia, octan celulozy

Faza ruchoma (eluent): ciecz o odpowiedniej polarności

Mechanizm oddziaływania: powierzchniowa fizyczna adsorpcja

składników mieszaniny do złoża i ich wypłukiwanie

(adsorpcja/desorpcja)

Adsorpcja wielokrotna w czasie i selektywna

Właściwości warunkujące rozdział: różnica polarności składników

mieszaniny

Ustalenie warunków rozdziału: dopasowanie stopnia polarności

złoża/eluentu

Niewielkie ilości substancji, których rozdzielenie za pomocąkrystalizacji czy destylacji jest niemożliwe

Chemisorpcja: sorpcja powierzchniowa związana z silniejszymi

oddziaływaniami chemicznymi (np. jonowymiana)

Proces chromatograficzny to wielokrotna sorpcja i desorpcja substancji z fazy

ruchomej do stacjonarnej i odwrotnie, z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej.

: woda>alkohol > acetonitryl >heksan

: żel krzemionkowy (tlenek krzemu) >węglowodory > węglowodory aromatyczne

: sole > kwasy > alkohole > ketony > etery > związki aromatyczne > związki alifatyczne długołańcuchowe

Sole Alkohole Etery Aromatyczne Fluorowane

Kwasy Ketony AlifatyczneHalogenowane

Węglowodory

Faza ruchomaWoda Alkohol Acetonitryl THF Heksan

www.waters.com/webassets

Faza stacjonarnaKrzemionka CN C2 C12(OOS)

Chromatografia adsorpcyjna w normalnym układzie faz wykorzystuje oddziaływania polarnych grup funkcyjnych rozdzielanych składników z polarnymi centrami aktywnymi obecnymi na powierzchni fazy stacjonarnej. Faza ruchoma jest niepolarna.

W układzie faz odwróconych (RP) faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma polarna.

Zadanie: należy rozdzielić metodą chromatografii adsorpcyjnej z użyciem żelu krzemionkowego (faza nieruchoma) i alkoholu metylowego jako eluentu (faza ruchoma) mieszaninę dwóch barwników organicznych różniących się polarnością: A-bardziej polarny, i B-mniej polarny.

Który z barwników, A czy B, wypłynie z kolumny jako pierwszy, a który jako drugi?

Odpowiedź: Pierwszy wypłynie ……………. Drugi wypłynie …………….

Wytłumacz, dlaczego?

Szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej,

chemisorpcja analitu związana

z oddziaływaniem jonowym

Faza stacjonarna: jonit (żywica jonowymienna);

Faza ruchoma: roztwór

buforowy o określonym pH,

zdolny do zmiany jonizacji

analitu

Zasada rozdziału: różnice

w ładunku powierzchniowym

skladników mieszaniny

www.waters.com/webassets

❑Wymieniacz jonowy jest substancją, która w zetknięciu z roztworem

wymienia część swoich jonów na jony z roztworu.

❑W jego strukturze można wyróżnić nierozpuszczalną matrycępołączoną wiązaniami kowalencyjnymi z określonymi grupami

funkcyjnymi, które ulegają jonizacji i mogą w sposób odwracalny

asocjować z jonami przeciwnego znaku, tzw. przeciwjonami.

❑ Kationy i aniony będące jonami wymiany, czyli tzw. przeciwjony,

pochodzą z roztworu buforowego używanego do równoważenia

złoża. Podczas rozdziału chromatograficznego przeciwjony sązastępowane przez obdarzone odpowiednim ładunkiem

cząsteczki białka.

Po

wie

rzch

nio

wy ład

un

ek c

ząste

czki

/ b

iałk

a

Ładunek białka

w pH > pIWymiana anionu

0 14

+

Ładunek białka

w pH < pI

Wymiana kationu

Ładunek białka

w pH = pI

Separacja białek za pomocą chromatografii jonowymiennej polega na

wykorzystaniu różnic w ładunku powierzchniowym cząsteczek białka

Wybór warunków chromatografii jonowymiennej:

• Białka zasadowe - pI białek przypada w pH zasadowym: stosujemy

kationit (polianion). Nanosi się białko w pH niższym niż pI białka, np.

białko pI 8,0 będzie kationem w pH 6,5 i zwiąże się do kationitu;

Elucja buforem o wyższym pH niż pH początkowe.

• Białka kwaśne – o pI w pH kwaśnym: stosujemy anionit (polikation).

Nanosimy białko w buforze o pH wyższym niż pI białka.

Np. białko o pI 4,5 będzie anionem w pH 5,7 i zwiąże się do anionitu.

Elucja: buforem o niższym pH niż pH początkowe.

SłabyMocny

Słabe wymieniacze anionowe zwykle tracą swój ładunek wraz ze wzrostem pH.

Przykład słabej grupy wymieniacza anionowego -DEAE (dietyloaminoetylowa).

Mocny Słaby

Słaby wymieniacz kationowy zawiera słaby kwas, który traci swój ładunek wraz ze spadkiem pH

Przykład słabej grupy wymieniacza kationowego –CM (karboksymetylowa).

Procedura

1. Równoważenie złoża

w kolumnie

2. Aplikacja próbki na

kolumnę

3. Elucja

❖ adsorpcja białek o

odpowiednim

ładunku

❖ desorpcja białek

związanych ze

złożem

4. Regeneracja złoża

Równoważenie kolumny

Adsorpcja próbki

Desorpcja próbki

Wymiana anionowa Wymiana kationowa

Elucja gradientem pH

– skokowym lub ciągłym

Elucja gradientem siły jonowej

Miksery pozwalają przygotować solwent

o odpowiednim składzie: np. pH, siły jonowej.

Pobierają solwenty z różnych naczyń i mieszająw nową kompozycję.

Liniowy gradient soli

Skokowy gradient soli

Sił

a j

on

ow

aS

iła

jo

no

wa

Objętość (ml)

Objętość (ml)

Zwana też chromatografią swoistej sorpcji

Wykorzystuje wzajemne powinowactwo biologiczne dwóch substancji.

Oddziaływanie w parze może mieć różny charakter, może to być np.:

- Hormon i receptor,

- Enzym i substrat,

- Enzym i inhibitor,

- Przeciwciało i antygen/hapten,

- Komplementarne odcinki kwasów nukleinowych,

- Kwas nukleinowy i białko,

- Lektyna i glikoproteina,

- Dopełniacz i przeciwciała z grupy IgG, itp.

W przypadku każdej pary oddziałujących cząsteczek, nie ma znaczenia,

która z nich zostanie wybrana jako ligand.

ligand

złoże

izolowana cząstkainne białka i zanieczyszczenia

przepływają swobodnie przez

kolumnę niezależnie od ich ładunku

czy masy.

Izolowane cząsteczki wymywane przez

dodatek wolnego ligandu,

konkurencyjnejncząsteczki, bądź przez

zmianę stężenia soli lub pH

Faza stacjonarna: warstwa cieczy opłaszczająca cząstki stałego złoża

Faza ruchoma: przepływająca przez kolumnę ciecz nie mieszająca się z fazą(cieczą) stacjonarną

Zasada rozdziału: różna rozpuszczalnośćskładników mieszaniny w obu nie mieszających się cieczach

Prawo podziału Nernsta

O rozdzielaniu decyduje różnica współczynników

podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie

fazy ciekłe, tj. pomiędzy ciekłą fazą ruchomą i

ciekłą fazą stacjonarną osadzoną na nośniku.

Stała podziału Kd

Prawo podziału Nernsta, krótko prawo podziału określa sposób, w

jaki substancja rozpuszczona ulega podziałowi pomiędzy dwa nie

mieszające się rozpuszczalniki/ciecze tak, że w stanie równowagi

stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w tych dwóch

rozpuszczalnikach jest stały w danej temperaturze i nie zależy od

ogólnego stężenia substancji

Jeżeli układ składa się z cieczy organicznej (org) i wody (w), wówczas prawo

podziału Nernsta wyraża się jako iloraz dwóch stężeń substancji rozpuszczonej:

gdzie:

- KX (org/w) - stała podziału substancji X pomiędzy fazy "1(org)" i "2(woda)"

(zw. też współczynnikiem podziału, zazwyczaj w skali logarytmicznej logP)

np. oktanol : woda.

- X org - stężenie substancji X w fazie "1(org)",

- X w - stężenie substancji rozpuszczonej w fazie "2(woda)".

Prawo podziału Nernsta może wyjaśnić zachowanie się danej substancji podczas

przenikania przez lipofilowe błony komórkowe oddzielające środowiska

wodne.

Lipofilowość jest ważną właściwością fizykochemiczą związków biologicznie

czynnych, wpływa na ich aktywność biologiczną, charakteryzuje substancje

czynne biologicznie, jak leki czy środki ochrony roślin

• umożliwia przewidywanie profilu wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i

wydalania (tzw. profil ADME), czyli zachowania się substancji w organizmie

człowieka po jej podaniu,

• pozwala określić możliwości wiązania z odpowiednim receptorem,

• podział substancji między fazę wodą i organiczną może stanowić model

podziału in vivo

Optymalne wchłanianie substancji z przewodu pokarmowego na drodze dyfuzji pasywnej po doustnym

podaniu :

1. Bardziej polarna substancja, słabsza przenikalność przez dwuwarstwę lipidową2. Bardziej niepolarna substancja jest słabiej rozpuszczalna w wodzie

3. Dobra jest równowaga między przenikalnością i rozpuszczalnością

Służy do rozdziału makrocząsteczek (białka, kwasy

nukleinowe) różniących się masą, szacowania ich masy,

do oddzielania makrocząsteczek od składników

niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki

używane do znakowania białek np. J125, fluoresceina;

do łagodnej zmiany warunków otoczenia białka (skład

elektrolitowy, pH).

Wykorzystuje mechanizm sorpcji zwany wykluczeniem;

Typ chromatografii podziałowej

Wypełnienie kolumny: porowaty żel

w postaci drobin poprzecinanych

kanałami o średnicy zmniejszającej sięw głębi ziarna

Faza stacjonarna – ciecz wewnątrz

ziaren żelu (wypełnienie kolumny),

Faza ruchoma – ciecz opływająca

ziarna żelu

Rozdzielanie zależne od wielkości

i kształtu cząsteczek w warunkach

eliminacji, sorpcji. Decyduje tylko

różnica czasu dyfuzji cząstek w

przestrzeni porów wypełnienia

kolumny.

Rozdział w kolumnach wypełnionych porowatym sieciowanym

wewnętrznie polimerem, np. poliakrylamid (Biogel), dekstran

(Sephadex), agaroza (Sepharose), w postaci ziaren o średnicy około

0,1 mm i o zdefiniowanej wielkości, czyli tzw. sita molekularne

W żelu małe cząsteczki wnikają do wnętrza ziaren, duże nie.

Droga (objętość, czas wypływu) dla każdego składnika jest nierówna.

Cząsteczki małe pokonuję najdłuższą drogę i dlatego wypływająnajpóźniej z kolumny.

Cząsteczki duże o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren mająkrótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się jako pierwsze

u wylotu kolumny.

Cząsteczki nie wiążą się z wypełniaczem kolumny i skład buforu nie

ma wpływu na rozdział

Wyniki rozdzielania zapisywane są w postaci wykresu,

składającego się z pików chromatograficznych, których

kształt odpowiada rozkładowi stężenia substancji

opuszczających kolejno kolumnę chromatograficzną.

Chromatogram dostarcza informacji:

jakościowych - na podstawie miejsca piku - o rodzaju

rozdzielanych substancji, strukturze molekularnej, ich

właściwościach fizykochemicznych - na podstawie liczby

pików, o liczbie składników w mieszaninie

ilościowych - wartość sygnału detektora, zmierzona jako

wysokość, albo powierzchnia piku, jest funkcją stężenia

bądź masy analitu w próbce dozowanej

rozdziałsłaby!

poprawa warunków

rozdziału

zastosowanie

elucji gradientowej

Rozdzielczość – zdolność do oddzielania

od siebie cząsteczek;

Przepływ solwentu przez kolumnę możliwy jest tylko wtedy, gdy pomiędzy wejściem i wyjściem kolumny panuje różnica ciśnień.

Tę różnicę ciśnień, w postaci ciśnienia hydrostatycznego, wywołuje zwykle pole grawitacyjne, lub

stosuje się specjalne pompy chromatograficzne, wymuszające znacznie większe przepływy, dzięki wyższym ciśnieniom do jakich mechanicznie sprężany jest solwent.

www.waters.com/webassets

schemat systemu HPLC

a – mikser gradientu d - kolumna

b – system pomp e - detektor

c – wstrzykiwanie próby f – wydruk danych

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim

podawany jest eluent na kolumny.

Technika rozdzielania składników mieszanin na podstawie różnic w szybkości

ich migracji przez kolumnę zawierającą mikroziarnistą fazę stacjonarną.

Substancje są przenoszone przez kolumnę w strumieniu ciekłej fazy

ruchomej, poruszającej się pod wpływem ciśnienia, i są wykrywane w eluacie.

Metoda kolumnowa.

W HPLC stosowane są wszystkie mechanizmy sorpcji:

podział, adsorpcja, wymiana jonowa, wykluczenie, powinowactwa i chiralna.

Składniki rozdzielają się na podstawie szybkości migracji zależnej od

powinowactwa do faz.

Nośnik – ściana kolumny, drobnoziarniste ciało stałe.

Dozowanie próbki – ciekłe próbki i roztwory wprowadzane przez dozownik

(zawór) do fazy ruchomej na szczycie kolumny.

Identyfikacja – substancje rozdzielane wykrywane są w fazie ruchomej w

kolejności wypływu przez detektor – zależność stężenia od czasu.

Układ faz normalny: polarna faza stacjonarna (żel

krzemionkowy), eluent początkowo niepolarny ( pentan,

heksan, chloroform

Układ fazy odwróconej: niepolarna faza stacjonarna ( żel

krzemionkowy modyfikowany hydrofobowymi grupami

alkilowymi, np. oktylowymi), polarny eluent (acetinitryl, woda,

kwas octowy)

www.waters.com/webassets

Wysokość piku:

oznaczenie ilościowe

Identyfikacja

substancji: położenie

piku

www.waters.com/webassets

www.waters.com/webassets

Jednym z celów analitycznych chromatografii cienkowarstwowej jest rozdziałpróbki (mieszaniny) na pojedyncze składniki. W analizie nieznanej mieszaniny

na podstawie wartości Rf wzorców substancji i wartości Rf substancji

otrzymanych z rozdzielenia mieszaniny można określić jej skład jakościowy

Wraz z przesuwaniem się rozpuszczalnika przemieszczają się nałożone

składniki mieszaniny. Szybkość ich przemieszczania jest ich cechąindywidualną i zależy od powinowactwa składników do fazy stałej, podłoża

płytki (adsorbcja) i szybkości wymywania (desorpcja).

Dla substancji bezbarwnych stosuje się metodę wizualizacji ich miejsca

położenia na płytce chromatograficznej (wywoływanie chromatogramu)

W wyniku różnej szybkości migracji poszczególnych substancji w danych

warunkach, na płytce chromatograficznej powstaje seria plamek w różnej

odległości od linii startowej. Położenie plamek zaznacza się przez lekkie

obrysowanie ich krawędzi ołówkiem bezpośrednio po wywołaniu.

Następnie oblicza się współczynnik Rf (współczynnik retencji). Mierzy sięodległość środka plamki od linii startowej (w mm) i dzieli przez dystans -

pomiędzy linią startową i końcową też w mm. Pomiaru i obliczenia Rf

dokonuje się dla każdej plamki.

Co można powiedzieć o polarności związków 1 - 5, jeśli fazą stacjonarnąjest żel krzemionkowy a fazą ruchomą mieszanina cykloheksanu i

dichlorometanu (10 : 0,5; v:v)?

Chromatografia jest techniką rozdziału mieszanin substancji opartą na różnicach w szybkości poruszania się związków w dwóch fazach: stacjonarnej i ruchomej

Techniki chromatograficzne oparte są na procesach adsorpcji powierzchniowej lub podziału między dwie fazy ciekłe

W preparatyce białek istotne znaczenie mająchromatografia jonowymienna, powinowactwa i filtracja żelowa

Do celów analitycznych stosuje się wysokosprawnąchromatografię cieczową (HPLC) lub chromatografięcieczowo-gazową (GC)

Klasyczną techniką analityczną jest chromatografia cienkowarstwowa

Łańcuchy boczne aminokwasów kwaśnych i zasadowych odpowiadają za całkowity ładunek cząsteczki

Sumaryczny ładunek białka zależy od jego punktu izoelektrycznego i kwasowości środowiska

W polu elektrycznym ujemnie naładowane cząsteczki

( ) poruszają się w kierunku elektrody o ładunku

dodatnim ( ), a cząsteczki naładowane dodatnio

( ) w kierunku elektrody o ładunku ujemnym

( )

start

silnie ujemny

słabo ujemny

słabo dodatni

silnie dodatni

+-

Ładunek:

Elektroforeza – rozdział cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym

U osób zdrowych obraz elektroforetyczny frakcji białkowych jest stały

Analiza densytometryczna

Obraz elektroforetyczny (elektroforogram)

zmienia się w stanach patologicznych

1-chroniczny

2-ostry

gammapatie

stan zapalnymarskośćwątroby

Rutynowo nie rozdziela

się białek osocza.

Osocze zawiera

Fibrynogen między

frakcjami β i γ, w postaci

ostrego piku frakcji φ.

Może powodowaćto

trudności w identyfikacji

pików białka C-

reaktywnego (CRP) i/lub

części immunoglobulin

monoklonanych

Widoczny układ pasm białek zależy od sposobu barwienia i celu

badania

Zależnie od ruchliwości

elektroforetycznej powstaje

5 pasm izoenzymów

Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej

Lipoproteiny, transportowe kompleksy lipidów z białkami, różnią się składem, wielkością i gęstością

LDL=; VLDL=pre-; HDL=

Swoiste enzymy mogą ciąć DNA w ściśle zdefiniowanych miejscach (restricted sites)

Obraz elektroforetyczny pattern takich fragmentów jest unikalny dla każdego człowieka, jak odcisk palca

W obrazie fragmentów restrykcyjnych DNA wyraźnie widoczne jest pokrewieństwo, czasem też mutacje genomu

Dochodzenie

ojcostwa

Identyfikacja ofiar katastrof

i sprawców zbrodni

Denaturacja białka pod wpływem -merkaptoetanolui SDS (siarczanu dodecylu sodu)

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym daje lepszy rozdział frakcji (ma znacznie większązdolność rozdzielczą niż elektroforeza w agarozie

Kontrola czystości preparatów białkowych

Wyznaczanie masy cząsteczkowej białka

Identyfikacja niektórych mutacji/chorób

Ogniskowanie izoelektryczne – pierwszy wymiar

→pI 7,5

→pI 6,8

→pI 8,5

→pI 10,1

→pI 5,6

Stabilny gradient pH

W niskim pH białka mają ładunek dodatniW wysokim pH białka mają ładunek ujemny

W polu elektrycznym katoda i anoda przyciągają białka do miejsc pH = pI, gdzie stają się one obojętne

Białka przestały migrować, ponieważ znalazły się w miejscu, gdzie pH = pI

Drugi wymiar – SDS-PAGE

Proteomika funkcjonalna: poszukiwanie różnic w ekspresji białek pomiędzy stanami zdrowia i choroby

Proteomika – nauka zajmująca się badaniem białek – ich struktury,

sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi, czyli proteomu

Cząsteczki obdarzone ładunkiem poruszająsię w zewnętrznym polu elektrycznym z szybkością zależną od ich ładunku, wielkości i kształtu

Obraz elektroforetyczny białek może ulegaćzmianie w wyniku procesów chorobowych

Obraz elektroforetyczny białek i lipoproteinmoże być wykorzystywany w diagnostyce

DNA-fingerprinting wykorzystuje się do identyfikacji osób oraz niektórych chorób