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DNA

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IMPORTNCIA1) Utilizao de sondas, microssatlites (padro

caracterstico > DNA-fingerprint)

2) Identificao de indivduos (criminalstica e testesde paternidade)

3) Localizao de genes associados a doenas4) Deteco de genes relacionados ao

desenvolvimento de tumores (retinoblastoma)

5) Terapia gnica

6) Produo de vacinas7) Modulao da expresso gnica

Todas essas tcnicas associadas PCR

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Tcnica de PCR

Finalidade de produzirrapidamente grande quantidade

de cpias de uma determinadasequncia de DNA,com o auxliode primersespecficos.

Prxima aula!

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EXTRAO DNA GENMICO

Pontos a serem considerados

1) Tecido a ser utilizado.** Levar em considerao aquantidade de metablitos secundrios que em geralinterferem com uma extrao bem sucedida

2) O tecido pode ser colhido e mantido 80C, ouliofilizado at o momento da extrao

3) Todo material utilizado na extrao (vidraria,solues, pipetas, etc..), deve estar livre de DNAses.Uso de autoclavagem e forno alta temperatura(180C)

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PROTOCOLOS

Existem vrios protocolos. Mas,recentemente surgiram os que se

caracterizam pela utilizao dodetergente catinico CTAB(Cationichexadecyl trimethyl ammoniumbromide) no tampo de extrao. Dao nome:

Mtodo do CTABDoyle, J.J.T e Doyle, J.L (1987)

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VANTAGEM DO MTODO

Caracteriza-se pela eficincia na extraoa partir de amostras pequenas de tecido(30mg) ou mesmo em larga escala.

Pode ser utilizado para qualquer tipo detecido, incluindo: razes, folhas, plen,sementes, embries, endosperma, cultura

de clulas em suspenso.

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Componentes da clula

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ETAPAS DO PROCESSODE EXTRAO

1) Macerao mecnica para romper asparedes e membranas celulares do tecido.

2) Ressuspenso do material vegetal emum tampo de extrao, contendo umdetergente, antioxidantes, EDTA e agentetamponante, visando a solubilizao demembranas lipoproticas e desnaturaode protenas, deixando o DNA protegido daao de enzimas de degradao.

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Auxlio da temperatura

O uso de temperatura 50-

65C, na extrao, durante 15-

20 minutos, facilita a

solubilizao e

homogeneizao dasuspenso.

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CIAExtrao com um solvente orgnico,

clorofrmio-alcool isoamlico (24V:1V).

Separao da fase orgnica e aquosa

por centrifugao. De forma que

lipdios, protenas e a maioria dos

polissacardeos so retidos na fase

orgnica inferior, enquanto que o DNA,RNA e alguns polissacardeos so

retidos na fase aquosa superior.

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lcool

Adicionado fase aquosa, o

lcool (isopropanol ou

etanol), na presena de um

sal, precipita o DNA, que

pode ser isolado porcentrifugao.

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AMOSTRA DNA GENMICO

O DNA precipitado lavado em etanol

(70%), secado temp. ambiente e

ressuspendido em um tampo Tris-

EDTA (pH=7.5-8.0) acrescido de

RNAse (37 C, 30 min.)

A qualidade e rendimento da amostra

de DNA so avaliados por eletroforese

em gel de agarose (1%)

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GEL APS CORRIDAELETROFORESE

1 2

1.6 kb

1.0 kb

1 2

1.6 kb

1.0 kb

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O TAMPO DE EXTRAO: COMPOSTO DE:

CTAB 2% NaCl 1.4M EDTA 20mM Tris-HCl, pH=8.0 100mM PVP 1% B-Mercaptoethanol 0.2- 1% (dependendo

do material) Protenase K 100 g/mL (opcional) H2O milliQ estril qsp (Volume Final)

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PONTOS A SEREM CONSIDERADOSE FUNO DE CADA COMPONENTE:

pH do tampo: 7.5 - 8.0. Muito

importante para evitar a degradao do

DNA por ataque de enzimas, como:

as lipolticas e lipoxigenases que tm

pH timo entre 5.0 e 6.0, enquanto asDNAses nucleares, tem pH timo em

torno de 7.0

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CTABO CTAB solubiliza as membranas

celulares e dependendo da concentrao

de NaCl no tampo, esse detergente

forma um complexo com o DNA e pode,

portanto, ser utilizado para precipitar o

DNA seletivamente. O sal, alm de ser

necessrio para a solubilizao e ao doCTAB, tambm essencial para permitir a

precipitao do DNA na presena de um

lcool.

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OS OUTROS COMPONENTESDO TAMPO

Visam proteger o DNA da

ao de enzimas nativas

ou compostos secundrios

liberados com o

rompimento das clulas.

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EDTA

O EDTA(ethylenediaminetetraacetate)

includo para inibir enzimasdependentes de metais ,principalmente DNAses.Quelata ctios como Mg2 +eCa2 +

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PVP

PVP (Polyvinylpyrrolidone)tem um efeito antioxidante.

Reduz o efeito da oxidaode compostos fenlicos

como taninos, quinonas epolifenis.

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2--Mercaptoetanol

O agente redutor2--mercaptoetanol protege o

DNA contra as atividades deenzimas tais comoperoxidases epolifenolodidases,desnaturando-as.