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DNA
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IMPORTNCIA1) Utilizao de sondas, microssatlites (padro
caracterstico > DNA-fingerprint)
2) Identificao de indivduos (criminalstica e testesde paternidade)
3) Localizao de genes associados a doenas4) Deteco de genes relacionados ao
desenvolvimento de tumores (retinoblastoma)
5) Terapia gnica
6) Produo de vacinas7) Modulao da expresso gnica
Todas essas tcnicas associadas PCR
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Tcnica de PCR
Finalidade de produzirrapidamente grande quantidade
de cpias de uma determinadasequncia de DNA,com o auxliode primersespecficos.
Prxima aula!
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EXTRAO DNA GENMICO
Pontos a serem considerados
1) Tecido a ser utilizado.** Levar em considerao aquantidade de metablitos secundrios que em geralinterferem com uma extrao bem sucedida
2) O tecido pode ser colhido e mantido 80C, ouliofilizado at o momento da extrao
3) Todo material utilizado na extrao (vidraria,solues, pipetas, etc..), deve estar livre de DNAses.Uso de autoclavagem e forno alta temperatura(180C)
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PROTOCOLOS
Existem vrios protocolos. Mas,recentemente surgiram os que se
caracterizam pela utilizao dodetergente catinico CTAB(Cationichexadecyl trimethyl ammoniumbromide) no tampo de extrao. Dao nome:
Mtodo do CTABDoyle, J.J.T e Doyle, J.L (1987)
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VANTAGEM DO MTODO
Caracteriza-se pela eficincia na extraoa partir de amostras pequenas de tecido(30mg) ou mesmo em larga escala.
Pode ser utilizado para qualquer tipo detecido, incluindo: razes, folhas, plen,sementes, embries, endosperma, cultura
de clulas em suspenso.
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Componentes da clula
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ETAPAS DO PROCESSODE EXTRAO
1) Macerao mecnica para romper asparedes e membranas celulares do tecido.
2) Ressuspenso do material vegetal emum tampo de extrao, contendo umdetergente, antioxidantes, EDTA e agentetamponante, visando a solubilizao demembranas lipoproticas e desnaturaode protenas, deixando o DNA protegido daao de enzimas de degradao.
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Auxlio da temperatura
O uso de temperatura 50-
65C, na extrao, durante 15-
20 minutos, facilita a
solubilizao e
homogeneizao dasuspenso.
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CIAExtrao com um solvente orgnico,
clorofrmio-alcool isoamlico (24V:1V).
Separao da fase orgnica e aquosa
por centrifugao. De forma que
lipdios, protenas e a maioria dos
polissacardeos so retidos na fase
orgnica inferior, enquanto que o DNA,RNA e alguns polissacardeos so
retidos na fase aquosa superior.
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lcool
Adicionado fase aquosa, o
lcool (isopropanol ou
etanol), na presena de um
sal, precipita o DNA, que
pode ser isolado porcentrifugao.
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AMOSTRA DNA GENMICO
O DNA precipitado lavado em etanol
(70%), secado temp. ambiente e
ressuspendido em um tampo Tris-
EDTA (pH=7.5-8.0) acrescido de
RNAse (37 C, 30 min.)
A qualidade e rendimento da amostra
de DNA so avaliados por eletroforese
em gel de agarose (1%)
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GEL APS CORRIDAELETROFORESE
1 2
1.6 kb
1.0 kb
1 2
1.6 kb
1.0 kb
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O TAMPO DE EXTRAO: COMPOSTO DE:
CTAB 2% NaCl 1.4M EDTA 20mM Tris-HCl, pH=8.0 100mM PVP 1% B-Mercaptoethanol 0.2- 1% (dependendo
do material) Protenase K 100 g/mL (opcional) H2O milliQ estril qsp (Volume Final)
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PONTOS A SEREM CONSIDERADOSE FUNO DE CADA COMPONENTE:
pH do tampo: 7.5 - 8.0. Muito
importante para evitar a degradao do
DNA por ataque de enzimas, como:
as lipolticas e lipoxigenases que tm
pH timo entre 5.0 e 6.0, enquanto asDNAses nucleares, tem pH timo em
torno de 7.0
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CTABO CTAB solubiliza as membranas
celulares e dependendo da concentrao
de NaCl no tampo, esse detergente
forma um complexo com o DNA e pode,
portanto, ser utilizado para precipitar o
DNA seletivamente. O sal, alm de ser
necessrio para a solubilizao e ao doCTAB, tambm essencial para permitir a
precipitao do DNA na presena de um
lcool.
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OS OUTROS COMPONENTESDO TAMPO
Visam proteger o DNA da
ao de enzimas nativas
ou compostos secundrios
liberados com o
rompimento das clulas.
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EDTA
O EDTA(ethylenediaminetetraacetate)
includo para inibir enzimasdependentes de metais ,principalmente DNAses.Quelata ctios como Mg2 +eCa2 +
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PVP
PVP (Polyvinylpyrrolidone)tem um efeito antioxidante.
Reduz o efeito da oxidaode compostos fenlicos
como taninos, quinonas epolifenis.
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2--Mercaptoetanol
O agente redutor2--mercaptoetanol protege o
DNA contra as atividades deenzimas tais comoperoxidases epolifenolodidases,desnaturando-as.