(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186517 - …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/200862.pdf ·...

RZECZPOSPOLITAPOLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186517(21 ) Numer zgłoszenia: 322504(22) Data zgłoszenia: 26.02.1996

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:26.02.1996, PCT/AU96/00098

(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

03.10.1996, W096/30503,PCT Gazette nr 44/96

(13) B1

(51) IntCl7C12N 9/96C12Q 1/52 C12Q 1/58

(54) Odczynnik i sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała

(30) Pierwszeństwo:28.03.1995,AU,PN2006

(43) Zgłoszenie ogłoszono:02.02.1998 BUP 03/98

(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.01.2004 WUP 01/04

(73) Uprawniony z patentu:THERMO TRACE Ltd., Clayton, AU

(72) Twórcy wynalazku:Joseph De Giorgio, Clayton, AU W ayne Jensen , Clayton, AU

(74) Pełnomocnik:Witek Rafał, POLSERVICE

(57) 1. Odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarzestopnia utlenienia koenzymu, znamienny tym, że zawiera układ redukujący koenzymskładający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzy-mem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwia-jąc stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analitjest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transa-minazę alaninową, moczniki amoniak.

PL 18

6517

B1

Odczynnik i sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała

Z a s t r z e ż e n i a p a t e n t o w e

1. Odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stop-nia utlenienia koenzymu, znamienny tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy za-wierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.

2. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukoza.

3. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci jednej fiolki.4. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że ciągła regeneracja koenzymu za-

chodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.5. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym jest enzymem mikrobiolo-

gicznym.6 . Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień specyficzności między

wspomnianym enzymem i wspomnianym 2 substratem jest mniejszy niż 10% w oparciuo równoważność molową.

7. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydroge-nazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.

8 . Odczynnik według zastrz. 7, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 1, korzystnie określony w tabeli 2 .

9. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehydrogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bu-for Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.

10. Odczynnik według zastrz. 8 , znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4.

11. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę suro-wicy bydlęcej i azydek sodu.

12. Odczynnik według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B.

13. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowi-cy bydlęcej i azydek potasu.

14. Odczynnik według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 6A, korzystnie określony w tabeli 6B.

15. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.

186 517 3

16. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.17. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza aspa-

raginianowa.18. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza alaninowa.19. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest mocznik.20. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak.21. Sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała, znamienny tym, że próbkę

płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawierającym koenzym i mierzy się stopień utle-nienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną specyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.

22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się odczynnik w postaci jed-nej fiolki.

23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.

24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny.

25. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowaną parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukozę.

26. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stopień specyficzności między en-zymem i substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową.

27. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transaminaząjest transaminaza aspa-

raginianowa.29. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transaminaząjest transaminaza ala-

ninowa.30. Odczynnik według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest mocznik.31. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak.

* * *

Wynalazek ten dotyczy odczynników stosowanych w enzymatycznych metodach okre-ślania stężenia analitów w próbce płynu ciała. W szczególności, wynalazek ten dotyczy od-czynników stosowanych w metodach, w których ilość utlenionego koenzymu w próbce, w której zachodzi reakcja, odpowiada bezpośrednio stężeniu analitu obecnego w próbce. Wy-nalazek dotyczy także ulepszonych sposobów przeprowadzania określenia stężenia analitu.

Anality, które można określić przy użyciu odczynników według wynalazku, obejmują transaminazy, amoniak, mocznik, dehydrogenazę mleczanową, triglicerydy oraz salicylany.

Aminotransferaza asparaginianowa jest enzymem którego wysoki poziom znajduje się w sercu, wątrobie, w krwinkach czerwonych i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on nastę-pującą reakcję:

asparaginian + 2 -oksoglutaran <-> szczawiooctan + glutaminianPodwyższony poziom aminotransferazy asparaginianowej w surowicy stwierdza się

w wielu chorobach wątroby, gdzie zachodzi niszczenie komórek wątroby, zwłaszcza np. w za-paleniu wątroby. Wyższe poziomy są także notowane po zawale mięśnia sercowego i przy cho-robie mięśni.

4 186 517

Enzym aminotransferaza alaninowa znajduje się także w wysokich stężeniach w wątro-bie i w mniejszym stopniu w sercu, nerkach i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on nastę-pującą reakcję:

alanina + 2 -oksoglutaran <-> pirogronian + glutaminianWzrosty poziomu tego enzymu w surowicy stwierdza się zazwyczaj w schorzeniach

wątroby, zwłaszcza w zapaleniu wątroby.Pośrednie określenie ilościowe enzymów, w szczególności transaminaz aminotransfera-

zy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej w próbce płynów ciała, może dotyczyć, w przeciwieństwie do próbki „ślepej”, w której miała miejsce przemiana enzymatyczna analitu związanego z interesującym enzymem. Aby dokonać enzymatycznej konwersji analitu, specyficzny dla substratu enzym (transaminazę), pozostawia się pod działaniem substratów enzymu znanego, jako użytecznego w kwantyfikacji interesującego enzymu. Zmianę w ukła-dzie reakcji, biorąc pod uwagę próbkę ślepą, można kalkulować różnymi metodami, mierzą-cymi zmianę w absorbancji układu. Zmiana w absorbancji koreluje bezpośrednio z ilością transaminazy obecnej w próbce. Chociaż metody tradycyjne, takie jak określanie koloryme-tryczne, rozwinęły się odpowiednio, analiza enzymatyczna okazała się w ogromnej mierze bardziej dokładna, niezawodna i prosta od tych innych metod, jeśli chodzi o określanie po-ziomu transaminazy.

Powszechnie stosowana metodą kwantyfikacji transaminazy w próbce jest użycie sprzę-żonej reakcji enzymatycznej w sposób kinetyczny.

W przypadku aminotransferazy asparaginianowej (AST), szczawiooctan utworzony przez AST ulega przemianie do maleinianu, przez włączenie dehydrogenazy maleinianowej (MDH) w układ oznaczenia. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu dinukleotydu nikotynamido- -adeninowego (NADH do NAD4), co można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji jest zazwyczaj następująca:

L-asparaginian + 2-oksoglutaran < AST > szczawiooctan + L-glutaminian

szczawiooctan + NADH <■ ■—---> L-maleinian + NAD+

pirogronian z próbki + NADH < ■ — ■ > mleczan + NAD+

Od trzeciej reakcji oczekuje się eliminacji możliwej obecności wysokich poziomów pirogronianu w próbkach pacjenta. Teoria opóźnienia włączenia wysokich poziomów enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) jest taka, że jeśli włącza się wysoki poziom do odczynni-ka, w wypadku gdy próbka pacjenta posiada wysoki poziom pirogronianu, obecność NADH i LDH szybko wyeliminuje pirogronian z próbki przez przemianę go do mleczanu, nie inge-rującego w reakcję.

Potrzeba obciążenia odczynnika LDH, w celu eliminacji tej pobocznej reakcji, może wpłynąć na stabilność odczynnika przez wprowadzenie więcej zanieczyszczeń.

Dla aminotransferazy alaninowej (ALT), szczawiooctan utworzony przez ALT ulega przemianie do mleczanu, przez wprowadzenie dehydrogenazy mleczanowej do mieszaniny reakcyjnej. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu NADH do NAD+, które znowu można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji przeprowadzana z użyciem odczynnika, jest następująca:

L-alanina + 2-oksoglutaran <..ALT > pirogronian + glutaminian

pirogronian + NADH <■ LD-—> mleczan + NAD+

pirogronian z próbki + NADH mleczan + NAD+

Teoria i metodologia pomiaru ALT jest podobna do odczynnika AST z wyjątkiem tego, że przy ALT do pomiaru wymagany jest tylko jeden enzym endogeniczny, dokładnie LDH (w przeciwieństwie do AST, gdzie wymagane są LDH i MDH). Do odczynników ALT wpro-wadza się mniej zanieczyszczeń jako takich, co generalnie oznacza, że ich odtworzona prze- chowalność może być nieco dłuższa niz odczynników AST.

Dla obu odczynników tempo tworzenia NAD+ koreluje ze stężeniem transaminazy pierwotnie obecnej w próbce.

Mocznik jest głównym produktem metabolicznym, zawierającym azot, w katabolizmie białek, syntetyzowanym w wątrobie przez enzymy wątrobowe wątroby, i wydzielanym przede wszystkim przez nerki. Podniesione poziomy mocznika w surowicy mogą być konsekwencją upośledzenia funkcji nerek, choroby wątroby, zmian w diecie, zastoinowej niewydolności serca, cukrzycy i infekcji.

Poziom mocznika w ludzkiej surowicy i moczu można wykrywać metodami bezpośred-nimi i pośrednimi. Metody bezpośrednie zwykle dotyczą odmian reakcji Fearona. W tym układzie reakcyjnym, diacetyl reaguje z mocznikiem, aby utworzyć chromogen diazyne, który można mierzyć spektrofotometrycznie, dzięki jego silnej absorbancji przy 540 nm. Najbar-dziej powszechna metoda pomiaru mocznika w ludzkiej surowicy i moczu dotyczy układu pośredniej sprzężonej reakcji enzymatycznej. Ureazę, pierwszy enzym w układzie reakcyj-nym, stosuje się do przemiany mocznika w amoniak i jony wodorowęglanowe. Dehydrogena-za glutaminianowa (GLDH), dru^i enzym w układzie reakcyjnym sprzęga NADH i jon amo-nowy, w celu wytworzenia NAD i glutaminianu. Reakcję tę śledzi się spektrofotometrycznie przy 340 nm, gdy NADH ulega przemianie do NAD+. Alternatywnie, można kwantyfikować jon amonowy, przez potencjometrię lub konduktometrię.

W ten sposób proces reakcyjny zwykle stosowany do określania stężenia mocznika jest następujący:

Mocznik + H20 > 2NH3 + C 0 2

NH3 + a-ketoglutaran + NADH — GLDH > L-glutaminian + NAD+

Mierzy się obniżenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADH przechodzi w NAD+ i jest ono proporcjonalne do stężenia mocznika w pierwotnej próbce.

Głównym źródłem krążącego amoniaku jest przewód pokarmowy. Amoniak metaboli-zowany jest w wątrobie, ulega przemianie do mocznika w cyklu mocznikowym. Podniesiony poziom amoniaku w ludzkiej surowicy jest najczęściej związany z zaawansowaną chorobą wątroby. Hiperamonemia wywiera toksyczny wpływ na centralny układ nerwowy.

Poziom amoniaku w ludzkiej surowicy mierzy się najczęściej bezpośrednią jednoeta-pową metodą enzymatyczną, obejmującą dehydrogenazę glutaminianową. W tej reakcji, przemianę amoniaku, a-ketoglutaranu i NADH (lub NAPH) w glutaminian i NAD+ (lub NADP+) mierzy się spektrofotometrycznie przy 340 nm.

Powszechnie stosowana sekwencja reakcji, do określania stężenia amoniaku w próbce, jest następująca:

NH3 + a-ketoglutaran + NADPH — GLDH > L-glutaminian + NADP+Mierzy się zmniejszenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADPH przechodzi w NADP+,

i jest ono proporcjonalne do stężenia amoniaku w próbce pacjenta.W przeszłości, jak wspomniano powyżej, odczynniki z transam inazą obarczone były

słabą odtworzoną stabilnością. Stabilność tych odczynników, zwłaszcza w formacie poje-dynczej fiolki, ograniczona jest zwykle do około jednego miesiąca maksymalnie, w wa-runkach schłodzenia. Powód tej niestabilności można by przypisać zarówno degeneracji składników endogennych, jak i niestabilności NADH w roztworze. Główne powody nie-stabilności NADH w roztworze w iążą się bezpośrednio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych, mianowicie LDH i MDH w odczynniku AST i LDH w od-czynniku ALT. Handlowe preparaty enzymów endogenicznych MDH i LDH, czy to po-chodzenia zwierzęcego, czy drobnoustrojowego, zaw ierają zanieczyszczenia, które osta-tecznie wpływają na odtworzoną stabilność NADH i w konsekwencji stabilność odczyn-ników. Zanieczyszczeniami tymi są zazwyczaj niskie poziomy AST i ALT, enzymy pożą-dane do pomiaru, oraz oksydaza NADH, z których wszystkie inicjują utlenienie NADH w odczynniku.

pH odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH, ponieważ NADH bę-dzie się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym. Większość od-

186 517 5

6 186 517

czynników do określania transaminazy, wytwarza się się przy zakresie pH 7,3-8,0. Bardziej zasadowy odczynnik, większa stabilność NADH w roztworze.

Ponadto, odczynniki amoniakowe i mocznikowe także obarczone są problemami ze sta-bilnością i stabilność tych odczynników w formacie pojedynczej fiolki oraz w niskich tempe-raturach, zwykle ogranicza się do maksimum jednego miesiąca w przypadku amoniaku, i dwóch miesięcy w przypadku mocznika. Powód tej niestabilności mógłby być związany z rozpadem endogenicznych składników w odczynnikach, niestabilnością NADH lub NADPH w roztworze i zanieczyszczeniem amoniakiem, obecnym w wodzie, użytej do odtworzenia proszku odczynników.

Główne powody niestabilności NADH lub NADPH w roztworze wiążą się bezpośred-nio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych. pH odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH lub NADPH, jako, że NADH i NADPH będą się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym.

NADPH powszechnie używa się w odczynnikach amoniakowych (chętniej niż NADH), w celu przezwyciężenia ingerencji w test przez endogeniczną dehydrogenazę mleczanową w surowicach pacjentów. Endogeniczną dehydrogenaza mleczanowa i pirogronian z próbek pacjentów będzie specyficznie reagować z NADH w następującej sekwencji reakcji:

pirogronian z próbki + NADH < ■■— —■> mleczan + NAD+

Na utrzymanie NAPH w roztworze będzie także miała wpływ obecność zanieczyszczeń w handlowych preparatach dehydrogenazy glutaminianowej, które zapoczątkowują utlenianie NAPH w odczynniku amoniakowym. Podobnie, obecność zanieczyszczeń handlowych prepa-ratów ureazy i dehydrogenazy glutaminianowej, będzie inicjować utlenianie NADH w od-czynniku mocznikowym.

Jednym ze środków przezwyciężenia tej trudności, związanej ze stabilnością NADH i NADPH w roztworze, było wytworzenie zredukowanego koenzymu w odczynniku, tuż przed jego użyciem.

Jeden taki sposób opisano w australijskim zgłoszeniu patentowym AU-A-61906/90 dla F. Hoffmann La Roche AG, nawiązując szczególnie do podobnych układów enzymatycznych do pomiaru wodorowęglanu i amoniaku w surowicy. W tym opisie zredukowany koenzym wytwarza się in situ, albo równocześnie, albo przed ponownym utlenieniem koenzymu przez analit, substrat i specyficzne enzymy. Osiąga się to przez włączenie do mieszaniny reakcyjnej enzymu i substratu enzymu, umożliwiając redukcję utlenionego koenzymu. Specyficzną reak-cją ujawnioną i opisaną dzięki uprzejmości F. Hoffmann La Roche AG jest:

NADH' + Glukozo-6-fosforan (G-6 -P )_______________H+ + NADH + 6-fosfoglukonolakton

DehydrogenazaGlukozo-6-fosforanu(G-6-P)

Udostępnia to zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadenozynowy.Problemem związanym z tym sposobem wytwarzania NADH jest to, że stabilna konfi-

guracja odczynnika dla pojedynczej fiolki, nie jest możliwa.Do pewnego stopnia F. Hoffmann La Roche AG pokonał ten problem, przez podzielenie

układu odczynników na 2 fiolki. Pierwszy odczynnik obejmuje w przypadku kwantyfikacji amoniaku, NADP+ i G-6-P, a drugi odczynnik a-ketoglutaran, G6PDH i GLDH. Reakcja określania przebiega więc następująco:

186 517 7

Odczynnik 2

a-ketoglutaran + G-6-PD + GLDH

< - (A)---dodana surowicapacj enta

Vkoenzymzredukowany

dodana surowica___(B)__________pacjenta

Vkoenzym utleniony

gdzie (A) i (B) oznaczają alternatywne, równoważne drogi.Jednakże trudności w tym układzie odczynników pozostają. Poza faktem, że dwie fiolki

z odczynnikiem wymagają większych kosztów, zapasów i strat, wymagane są bardzo dokład-ne poziomy glukozo-6-fosforanu, a ponadto układ ogranicza użycie szczególnych chemicz-nych analizerów. Gdy odczynniki połączy się, wytworzenie NADH z NAD+ ma miejsce przez wyczerpanie glukozo-6-fosforanu. Ponieważ glukozo-6 -fosforan w ten sposób wyczerpuje się, na stabilność połączonych odczynników poważny wpływ miałoby, jeśli dwa odczynniki mia-łyby być połączone, lecz nie od razu użyte. Jeśli poziomy glukozo-6-fosforanu są niedokładne lub nadmierne, czas związany z inkubacją odczynnika staje się krytyczny. Rezultatem tego mogą być fałszywie niskie zmiany absorbancji i rażąco niedokładne wyniki.

Wcześniejszym roztworem także związanym z pomiarem poziomów analitów opisanym w opisie patentowym US 4 394 449 dla Modrovicha, stosuje pary substrat/enzym, w celu wytworzenia zredukowanego koenzymu tak, jak w roztworze Roche'a, jednkaże w tym wy-padku głukozo-6-fosforan wytwarza się z glukozy zgodnie z następującym:

D-glukoza + ATP — heksokinaza > ADP+ glukozo-6 -fosforan NAD+ reaguje następnie z utworzonym glukozo-6-fosforanem w obecności enzymu dehydrogenazy glukozo-6 - fosforanu, aby wytworzyć NADH. Modrovich włącza także do preparatu zarówno NADH jak i NAD+ tak, że gdy NADH utleni się lub zniszczy, NAD+ obecny w odczynniku, pomoże re-generować NADH. Jest to także odczynnik dwufiolkowy.

Wcześniejszej alternatywy dostarcza Klose i in., w opisie patentowym US 4 019 961. Wynalazek ten polega na etapach różnych oddzielnych reakcji i układzie regeneracji enzyma-tycznej. Układ ten ma tę wadę, że polega na przeprowadzeniu etapów różnych reakcji i eta-pów separacji, co czyni go testem zużywającym czas. Ponadto, ten układ odczynników jest odpowiedni tylko dla substratów, które można fosforylować.

Generalnym problemem związanym z mechanizmem wytworzenia NADH i NADPH adoptowanym przez każdy z opisanych tu powyżej wynalazków, czyli

NAD+ + glukozo-6 -fosforan —°~6~pp”--» NADH + 6 -fosfoglukonolakton + H+

jest to, ze pojedynczy etap reakcji z użyciem jednej fiolki jest niemożliwy, ponieważ gdy tylko doda się surowicy pacjenta do odczynnika, zachodzą dwie równoczesne reakcje:

(a) obniżenie absorbancji z powodu przemiany NADH (lub NADPH) w NAD+ (NADP+),

Odczynnik 1

NADP+ + G-6-P

(b) wytworzenie NADH (NADPH) z NAD+ (NADP+) co daje w wyniku wzrost absorbancji.Te dwie reakcje zachodzą z podobnymi prędkościami z rezultatem netto, będącym fał-

szywie niską zmianą absorbancji i rażąco niedokładnymi wynikami.W związku z tym, celem tego wynalazku jest dostarczenie układu odczynników do sto-

sowania przy określaniu poziomów analitów w surowicy, co zasadniczo udoskonali problemy układów odczynników z wcześniejszego stanu wiedzy, stosowanych w analizie enzymatycz-nej poziomów analitów w surowicy, polegających na utlenieniu koenzymu, szczególnie tych problemów, które dotyczą endogenicznych lub egzogenicznych zanieczyszczeń odczynnika. Dalszym celem tego wynalazku jest dostarczenie ulepszonego sposobu określania stężenia poziomów analitów w próbce pacjenta, sposobu zwalczania problemów, związanych z meto-dami z wcześniejszego stanu wiedzy, włączając przedwczesne utlenienie determinanta koen-zymu, oraz konieczność układu wielu fiolek, aby zminimalizować degradację odczynnika. Istota wynalazku.

Tak określone cele zostały zrealizowane w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wyna-lazku jest odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stop-nia utlenienia koenzymu charakteryzujący się tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. Korzystnie wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo- 6-fosforanowa/D-glukoza.

Korzystnie odczynnik według wynalazku jest w postaci jednej fiolki.Korzystnie ciągła regeneracja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9

mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.Korzystnie enzym jest enzymem mikrobiologicznym. Korzystnie stopień specyficzności

między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niz 10% w oparciuo równoważność molową.

Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo- 6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 1, korzystniej określony w tabeli 2 .

Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6 -fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehy-drogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4. Korzystnie, gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B.

Korzystnie, gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. W korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 6A, korzystnie określony

w tabeli 6B.W korzystnej realizacji odczynnika według wynalazku analitem jest transaminaza. Ko-

rzystnie analitem jest transaminaza asparaginianowa. Równie korzystnie analitem jest transa-

8 186 517

186 517 9

minaza alaninowa. Równie korzystnie analitem jest mocznik. Równie korzystnie analitem jest amoniak.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała charakteryzujący się tym, że próbkę płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawiera-jącym koenzym i mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną spe-cyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność mo-lową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, nato-miast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę aspa- raginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.

Korzystnie stosuje się odczynnik w postaci jednej fiolki.Korzystnie ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9

mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.Korzystnie stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny. Korzystnie stosowaną

parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukozę.Korzystnie stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 10%

w oparciu o równoważność molową.Korzystnie analitem jest transaminaza, korzystnie transaminazą jest transaminaza aspa-

raginianowa, albo transaminaza alaninowa. Korzystnie analitem jest mocznik, albo amoniak.Szczegółowy opis wynalazkuDostarcza się odczynnika do enzymatycznego określania stężenia analitu u pacjenta,

w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wy-braną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowy-wania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabili-zuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i sub-strat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy asparaginianowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koen-zymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia aminotransferazy alaninowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koen-zymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia mocznika u pa-cjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przecho-wywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia amoniaku u pa-cjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przecho-wywania wspomnianego odczynnika.

W szczególnej realizacji układ redukujący koenzymu obejmuje enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym posiada niecałkowitą specyficzność dla wspomnianego substratu,

10 186 517

wynikiem czego jest zredukowany współczynnik reaktywności wzajemnej. Odczynnik taki występuje w konfiguracji pojedynczej fiolki.

W tym szczegółowym opisie, term in,»niecałkowita specyficzność” stosuje się ze wzglę-du na pary enzym i substrat, w którym wybrany substrat nie jest naturalnym substratem wy-branego enzymu, a więc ma mniej niż 100% specyficzności wzajemnej dla enzymu, o który chodzi.

Wynalazek ten opiera się na odkryciu, że przez sprzężenie enzymu i substratu o niecał-kowitej specyficzności w stosunku do siebie, tempo redukcji koenzymu jest poważnie spo-wolnione. Przez spowolnienie reakcji redukcji, podstawowe składniki odczynnika mogą być zawarte w jednej fiolce do przechowywania, zawartość stabilizuje się przeciw zanieczyszcze-niom przez niski poziom ciągłej regeneracji koenzymu. Przez spowolnienie procesu, regene-racja NADH i NADPH może zachodzić bez wpływu na pomiar analitów. Regeneracja może zachodzić w odczynniku nie będącym w użyciu i prędkość, z jaką zachodzi regeneracja, może być doskonale dostrojona przez wyregulowanie charakteru wybranej pary enzym/substrat i jej poziomu.

W kolejnej postaci realizacji wynalazku, dostarcza się odczynnika do stosowania w en-zymatycznym określaniu stężenia analitu u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, charakteryzującego się tym, że wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić regenerację wspomnianego koenzymu z prędkością 0,01-0,9 mAbs/minutę, przy 340 nm.

Korzystnie tempo regeneracji odczynnika zgodnie z tym aspektem wynalazku wynosi 0,05 -0,4 mAbs/minutę, a najkorzystniej tempo regeneracji wynosi 0,05-0,25 mAbs/minutę w temperaturze pokojowej (18-25°C) i przy 340 nm.

W zalecanej postaci realizacji wynalazku stopień specyficzności między substratem i enzymem układu redukującego koenzymu, wynosi korzystnie mniej niż 100%, korzystniej mniej niż 50%, a najkorzystniej mniej niż 10% w oparciu o równoważność molową. Opty-malnie, można stosować parę enzym/substrat posiadającą reaktywność wzajemną mniejszą niż 5% w oparciu o równoważność molową.

Koenzymami stosowanymi w odczynniku według wynalazku są zredukowany dinukleotyd nikotynamido-adeninowy (NADH) i zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamido- adeninowego (NADPH), chociaż odpowiednie mogą być także analogi koenzymu, takie jak fosforan dinukleotydu nikotynamido-hipoksantynowego lub tioNADH.

Niespodziewanie, odkryto, że odczynniki według wynalazku dostarczają dalszych ko-rzyści, szczególnie jeśli chodzi o odczynniki amoniakowe i mocznikowe. Poziomy NADH i/lub NADPH będą wyczerpywane w odczynnikach amoniakowych i mocznikowych, przez obecność zanieczyszczenia amoniakowego, wprowadzonego z wodą używaną do odtworzenia proszku odczynników. Podobnie, amoniak z powietrza, który rozpuszcza się w ciekłym od-czynniku mocznikowym/amoniakowym z upływem czasu, będzie wyczerpywał poziomy NADH i/lub NADPH. Obecność zanieczyszczającego amoniaku w odczynniku amoniakowym i mocznikowym, może prowadzić nie tylko do niedokładnych określeń mocznika i amoniaku, lecz może oznaczać, że reakcja z a-ketoglutaranem i NADH w obecności GLDH, zajdzie przed dodaniem próbek. Prowadzi to do wyczerpania poziomów NADH lub NADPH i w ten sposób do błędów w określaniu stężeń amoniaku i mocznika w próbkach. Jednakże, niniejszy wynalazek pozwala na usunięcie zanieczyszczeń amoniakiem, a także na regenerację NADH lub NADPH, aby umożliwić dokładne określenie stężenia amoniaku i mocznika w próbkach pacjentów.

Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości transaminazy w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6- fosforanowa (G-6 -P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa.

Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości mocznika lub amoniaku w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G-6-P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa.

Odpowiednie mogą być także enzymy, takie jak dehydrogenaza mrówczanowa, dehy-drogenaza glicerolowa, dehydrogenaza leucynowa. Odpowiednie mogą być także dehydroge-naza L-alaninowa, dehydrogenaza 3a-hydroksysteroidowa, dehydrogenaza L-mleczanowa (z Lactobacillus sp) lub dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa. Zalecanym enzymem stoso-wanym w odczynniku do określania poziomu transaminazy/amoniaku i mocznika, jest de-hydrogenaza glukozo-6 -fosforanowa. Można ją otrzymać z każdego odpowiedniego źródła, takie jak Leuconostoc mesenteroides, Bacilłus stearothermophilus, Zymomonas mobilus lub drożdże.

Enzymy takie pochodzą korzystnie ze źródeł drobnoustrojowych. Odkryto, że włączenie do odczynnika enzymów ze źródeł drobnoustrojowych minimalizuje obecność endogenicz-nych zanieczyszczeń, takich jak oksydaza NADH i proteazy, które dotychczas poważnie wpływały na stabilność odczynników. Enzymy drobnoustrojowe posiadają także dodatkową korzyść większej termostabilności, a tym samym poprawienia długookresowej stabilności w roztworze.

Bardziej zalecanym źródłem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest Leuconostoc mesenteroides. Jeśli stosuje się glukozo-6-fosforan od Bacillus stearothermophilus lub Zy-momonas mobilus, prędkość reakcji zmniejsza się. Podobnie, jeśli jako źródło dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu stosuje się drożdże, musi być użyty koenzym NADPH, jako alternatywa dla NADH, ponieważ dehydrogenaza glukozo-6 -fosforanowa drożdży jest specyficzna tylko dla NADP+. Odpowiednia ilość dehydrogenazy glukozo-6 -fosforanowej, obecna w odczynni-kach według wynalazku, będzie się zmieniać zgodnie z pożądanym tempem regeneracji. Jed-nakże, szczególnie zalecaną dla odczynnika AST, jest ilość około 2000 jednostek/litr, aby pozwolić na degradację z upływem czasu w roztworze. Dla ALT szczególnie zaleca się stęże-nie 2000 jednostek/litr. Zalecanym stężeniem dla odczynnika mocznikowego jest 2000 jedno-stek/litr, a zalecanym stężeniem dla odczynnika amoniakowego jest 3500 jednostek/litr.

Biorąc pod uwagę, że wybór substratu i enzymu musi być taki, że w układzie redukcyjnym koenzymu mają one niecałkowitą specyficzność w stosunku do siebie, odpowiednie substraty do użytku w odczynniku według wynalazku obejmują: rybozo-5-fosforan, glukozo-1-fosforan, kwas 6-fosfoglukonowy, 2-deoksyglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2-fluoroglukozo-6-fosforan, 2 -deoksy- 2-chloroglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2 ,2-difluoroglukozo-6-fosforan, 2-0 -metyloglukozo-6-fosforan, mannozo-6-fosforan, glukozoamino-6-fosforan, 3-deoksyglukozo-6-fosforan, 3-deoksy-3- fluoroglukozo-6-fosforan, 3-0-metyloglukozo-6-fosforan, allozo-6-fosforan, ahrozo-6-fosforan, 4-deoksy-4-fluoroglukozo-6-fosforan, galaktozo-6 -fosforan, 5-tioglukozo-6-fosforan, analogi fos- fonianowe, glukozo-6-stallan, [3-D-glukoza, D-galaktoza, 2-deoksyglukoza, arabinoza, ksyloza,1-sorboza, D-mannoza, D-fruktoza, D-laktoza, D-sorbital, D-mannitol, sacharozą, inozytol, maltoza.

Przy użyciu NADH, jako zalecanego koenzymu w odczynniku, zalecanym połączeniem enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6 -fosforanowa(G-6-P-DH)/D-glukoza. Zalecany-mi alternatywnymi substratami w stosunku do D-glukozy są takie, dla których, w stosunku do specyficzności miedzy glukozo-6-fosforanem (G-6-P) i G-6 -P-DH, prędkość reakcji między enzymem G-6-P-DH i wybranym substratem jest mniejsza niż 50%, korzystniej mniej niż 10%, a najkorzystniej mniej niż 5% w stosunku do specyficzności między glukozo-6 - fosforanem (G-6-P) i G-6-P-DH. Biorąc znowu pod uwagę wymaganą prędkość regeneracji, poziom D-glukozy najbardziej odpowiedni dla odczynników według wynalazku, a zatem za-lecany, wynosi około 100 mmoli/litr, chociaż można stosować poziomy do 1000 mmoli/litr. Rozpuszczalność D-glukozy w odczynniku staje się zagadnieniem przy wyższych stężeniach.

Gdy stosuje się zalecane połączenie D-glukozy/dehydrogenazy glukozo-6 -fosforanowej, można wprowadzić do kompozycji jony fosforanu potasu, w postaci dwuzasadowego fosfora-nu potasu. Zmieniający się poziom jonów fosforanowych może być odpowiedni w zależności od żądanej prędkości regeneracji. Jednkaże, gdy stężenie D-glukozy wynosi np. około 100 mmoli/litr (lecz może się zmieniać między 20 i 200 mmoli/litr), a odpowiadający poziom de-hydrogenazy glukozo-6-fosforanowej wynosi około 2000 jednostek/litr (lecz może się zmie-niać między 500 i 3500 jednostek/litr), odpowiedni poziom jonów fosforanowych, może wy-nosić 2,0-20 mmoli/litr. Zwiększenie stężenia jonów fosforanowych zwiększy tempo regene-racji. Zalecanym poziomem dodatku jonów fosforanowych jest około 10 mmoli/litr dla AST

186 517 11

12 186 517

i około 5 mmoli dla ALT. Dla odczynnika mocznikowego zalecane stężenie dodawanych jo -nów fosforanowych wynosi około 5 mmoli, a także około 5 mmoli dla odczynnika amonia-kowego.

Gdy wykorzystuje się zalecane połączenie D-glukozy i dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, lub rzeczywiście w każdym układzie, w którym nie wytwarzają się wolne jony fosforanowe, zasadniczo należy wprowadzić wolne jony fosforanowe do odczynnika. W szczególności, wolne jony fosforanowe wymagane są do utworzenia niespecyficznego kompleksu z D-glukozą, w celu inicjacji regeneracji w obecności dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej.

Zalecaną alternatywą do użycia D-glukozy/G-6-P-DH jest użycie dehydrogenazy gluko-zowej (GLD) zgodnie z następującą reakcją, w której D-glukoza jest 100% reaktywnym sub-stratem:

D-glukoza + NAD+ GLD- -> D-glukono-5-lakton + NADH + H+Jeśli stosuje się dehydrogenazę jako enzym, zalecanymi substratami dla redukcji koenzymu

NAD i ich relatywnym stopniem reaktywności wzajemnej w porównaniu z D-glukozą są:

Substrat Relatywna aktywnośćKsyloza 8,9%L-sorboza 0,3%D-mannoza 2,4%D-fruktoza 0 ,8%D-galaktoza 0 ,1%D-laktoza 1,2%D-sorbitol 0 ,1%Inozytol 0 ,2%Maltoza 3,9%

w których cyfry oznaczają tempo reakcji w stosunku do dehydrogenazy glukozowej w obec-ności naturalnego substratu 1 p-D-glukozy.

Alternatywnie, użycie dehydrogenazy glicerolowej (GLY.DH) jako enzymu, odpowied-nie substraty w reakcji

glicerol + NAD+ —GLP PH > dihydroksyaceton + NADH + H+ oraz ich aktywność w stosunku do glicerolu ( 100%) są następujące:

Substrat Relatywna aktywnośćGlicerolo-a-monochlorohydryna 48,5%Glikol etylenowy 7,8%2,3-Butadienol 52,6%

w których jako enzym stosuje się dehydrogenazę leucyny (L.D), zgodnie z reakcją

substrat + NAD+ + H2O < LD > a-ketoizokapronian + NH3 + NADH + H+odpowiednie substraty i ich aktywność w stosunku do L-leucyny (100%) są następujące:

Substrat Relatywna aktywnośćL-walina 74%L-izoleucyna 58%L-norwalina 41%L-norleucyna 10%L-metionina 0,6%L-cysteina 0,3%

Jeśli jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-alaninową (A.D), w układzie reakcyjnym podobnym do użytego dla dehydrogenazy leucynowej, odpowiednim substratem i jego aktyw-nością w stosunku do L-alaniny (100%) jest

Substrat Relatywna aktywnośćL-seryna 5%

Jako enzym można także użyć dehydrogenazę 3a-hydroksysteroidową (H.DH), w połą-czeniu z substratami wymienionymi poniżej. Ich aktywności w stosunku do kwasu cholowego wymieniono także.

Substrat Relatywna aktywnośćKwas litocholowy 96%Kwas etiocholowy 60%

Gdzie jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-mleczanową (LDH) z Lactobacillus sp,w następującej reakcji pirogronian + NAD + H+ < ^DH > L-mleczan + NAD+ przy czym od-powiednie substraty i ich aktywności w stosunku do L-mleczanu są następujące:

Substrat Relatywna Aktywność2-oksoglutaran 0,09%szczawiooctan 36%

Gdy koenzymem jest NADP+, np. z drożdży, zalecanymi połączeniami substrat/enzym są:G-6-P-HD/galaktozo-6-P 25%G-6-P-DH/2-deoksyglukozo-6-P 18%G-6-P-DH/glukozoamino-6-P 2%

Cyfry z prawej strony oznaczają reaktywność w stosunku do pary G-6-P-DH/G-6-P.Jest także możliwe użycie NADP+ jako koenzymu, aby połączyć jako enzym/substrat

dehydrogenazę glicerolo-3-fosforanowąz fosforanem dihydroksyacetonu.Jak opisano we wstępie do tego szczegółowego opisu, innymi wymaganiami odczynnika

według wynalazku, do stosowania w określaniu poziomów AST w surowicy, są dehydrogena-za mleczanowa, dinukleotyd nikotynamido-adeninowy, zredukowany (NADH), dehydrogena-za maleinianowa (MDH), asparaginian i 2-oksoglutaran. W przypadku ALT dehydrogenaza maleinianowa nie jest wymagana, a zamiast asparaginianu, pożądana jest L-alanina. W przy-padku odczynnika mocznikowego, wymagana jest także ureaza oraz a-ketoglutaran, chociaż a-ketoglutaran jest także pożądany przy odczynniku amoniakowym.

Asparaginian dostępny jest w postaci różnych soli, takich jak sole sodowe i potasowe. Zale-caną solą według wynalazku jest sól potasowa, ponieważ wydaje się, że jest ona bardziej rozpusz-czalna i mniej uwodniona niż sól sodowa. Zakres stężenia dopuszczalnego w odczynnikach we-dług wynalazku, wynosi 180-240 mmoli/litr. Najbardziej zalecane jest ostateczne stężenie wyno-szące około 200 mmoli/litr i należy zauważyć, że jest poziom zalecany przez IFCC.

Zakres 2-oksoglutaranu uważany za korzystny dla odczynników według wynalazku wy-nosi około 1-15 mmoli/litr, jednakże zauważa się, że wysokie stężenia tego substratu mogły ograniczać ilość NADH, którą można dodać do kompozycji, ponieważ 2-oksoglutaran absor-buje się przy 340 nm, dostarczając tła absorbancji dla absorbancji NADH. Ograniczając ilość 2-oksoglutaranu dodanego do kompozycji, odczynnik można wykorzystać bez trudności na większości analizerów spektralnych. Zalecane stężenie tego substratu dla odczynników AST i ALT wynosi około 12 mmoli/litr, co jest znów poziomem zalecanym przez IFCC. Dla od-czynników mocznikowego i amoniakowego zalecane stężenie wynosi około 7,5 mmola/litr.

Poleca się, aby ilość alaniny w odczynniku ALT była obecna w pewnych granicach, z powodu rozpuszczalności tego składnika. W szczególności, zalecanym zakresem jest 200- 500 mmoli/litr, mimo, ze przy wyższym zakresie nie obserwuje się widocznego podniesienia aktywności katalitycznej. Najbardziej korzystnym stężeniem tego substratu jest około 400 mmoli/litr, z powodu rozpuszczalności tej substancji.

Poziom koenzymu w odczynniku będzie się zmieniał zgodnie z następującymi czynnikami:• liniowość wymagana w pomiarze• wybrana długość fali• stosunek objętości próbki do odczynnika• układ fotometryczny wybranego analizera

186 517 13

Zazwyczaj, zwiększenie objętości próbki poprawia czułość, lecz zmniejsza liniowość uzyskanego odczytu, natomiast zmniejszenie objętości próbki polepsza liniowość kosztem straty czułości.

Zalecaną długością fali dla pomiaru jest 320-400 nm, jednakże poziom użytego koen-zymu powinien być ustawiony tak, że absorbancja korzystnie nie przekracza 2,0 A. Zalecaną długością fali absorbancji według wynalazku jest 340 nm.

MDH korzystnie uzyskuje się ze źródeł drobnoustrojowych tak, aby ograniczyć ryzyko endogenicznych zanieczyszczeń i ponieważ wykazuje podwyższoną charakterystykę ze względu na stabilność termiczną. Odpowiedni zakres poziomów to 150-1500 jednostek/litr, bardziej korzystny to 200-800 jednostek/litr. Najbardziej korzystnym poziomem według wy-nalazku jest około 250 jednostek/litr.

W odczynniku AST, LDH bierze udział w usuwaniu endogenicznego pirogronianu z próbki. Poziom LDH korzystnie wprowadzonego do odczynnika AST według wynalazku był taki, że 1,0 mmol/litr próbki pirogronianu oczyszczał się w ciągu 1 minuty, wykorzystując stosunek próbki do odczynnika 1:10. Poziom ten określono na około 2000 jednostek/litr.

W odczynniku ALT, LDH bierz udział w dwóch reakcjach, (i) w sprzężonej reakcji en-zymu do pomiaru ALT oraz (ii) w usuwaniu endogenicznego pirogronianu z próbki. Poziom wprowadzonego LDH, jak przy odczynniku AST był taki, że odczynnik usunie do 1,0 mmola/litr pirogronianu z próbki w 1 minutę. Główną reakcję można więc mierzyć po 1 minucie bez zakłóceń, pochodzących od endogenicznego pirogronianu z próbki. Minimalny poziom LDH wymagany do klirensu endogenicznego pirogronianu w próbce, określono na 1500 jed-nostek/litr. Zalecana ilość wprowadzona do odczynnika ALT według wynalazku wyniosła około 2000 jednostek/litr.

W odczynniku mocznikowym, minimalna aktywność ureazy, wymagana przy pH 8,5, jako enzymu nie ograniczającego prędkości w kinetycznym modelu testowania, wynosi około 5000 jednostek/litr. Można włączyć ilości w nadmiarze, aby zwiększyć stabilność długotermi-nową odczynnika.

Zalecany rodzaj pomiaru analitu w odczynnikach mocznikowym i amoniakowym opiera się na zasadach kinetycznych. Ponieważ dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) jest enzy-mem ograniczającym prędkość w preparacie, poziom aktywności GLDH włączonego do od-czynnika, jest krytyczny dla liniowości testu. Poziom wymaganej aktywności GLDH będzie się także zmieniał, jako funkcja pH układu odczynnika. Odpowiedni zakres aktywności GLDH może się zmieniać między 250-10000 jednostek/litr. Najbardziej odpowiednimi enzy-mami są enzymy pochodzenia drobnoustrojowego, jako że handlowe preparaty GLDH ze źró-deł zwierzęcych są zwykle mniej stabilne i prawdopodobnie zawierają wyższe poziomy ak-tywnej oksydazy NADH, jako zanieczyszczenia. Zalecaną aktywnością GLDH dla odczynnika mocznikowego, przy pH 8,50, jest około 500 jednostek/litr i dla odczynnika amoniakowego, przy pH 8,50, jest około 8500 jednostek/litr.

Odczynniki według wynalazku mogą zawierać w dodatku do redukującego układu ko-enzymu i innych podstawowych substratów i enzymów koniecznych do określenia stężenia analitu, konserwanty, środki chelatujące, środki powierzchniowo czynne, inhibitory proteazy, bufory, kofaktory, środki przeciwbakteryjne i inne składniki, które pełnią funkcje wzmocnie-nia stabilności, lecz nie wpływają materialnie na charakterystykę wynalazku.

Pierwotnymi kryteriami wyboru buforu jest dobra zdolność buforowania przy wybranym pH, z minimalnym wiązaniem kationu dwuwartościowego. pH i układ buforowy dla odczyn-ników AST i ALT wybiera się zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) dla pomiaru transaminaz. Generalną praktyczną regułą jest to, że bufor można uznać za skuteczny, jeśli pKA wynosi ± 1,0 jednostek pH z wybranego pH. Zalecane pH odczynnika według wynalazku wynosi 7-9. Dla transaminazy asparaginianowej, optymal-na aktywność katalityczna zachodzi przy pH około 7,0-8,2, w temperaturze 30°C. Najbardziej zalecane pH dla odczynnika AST wynosi około 8,1 ± 0,1 w temperaturze 20°C, ponieważ przy tym pH NADH jest stabilny. Dla odczynnika ALT, maksymalna aktywność katalityczna zachodzi przy pH, wynoszącym około 7,3-7,9 w temperaturze 20°C. Najbardziej zalecanym pH dla odczynnika ALT jest 7,7 w temperaturze 20° C. Przy tych zalecanych pH osiąga się

14 186 517

186 517 15

kompromis miedzy optymalną aktywnością enzymu i stabilnością enzymów i koenzymu w roztworze. Niższe pH może dać w wyniku zwiększenie degradacji koenzymu.

Zalecanym układem buforowym dla odczynnika mocznikowego jest Tris przy pH 8,50, chociaż zakres 7,6-9,5 można uznać za dopuszczalny. Zalecanym stężeniem buforu, dla sku-tecznego zdolności buforowania, jest 100 mM Tris, chociaż można stosować zakres 20-200 mM Tris. W tym układzie buforowym można stosować szeroki zakres alternatywnych bufo-rów, co dostarcza skutecznej zdolności buforowania, w zakresie 7,5-9,5.

Zalecanym układem buforującym dla odczynnika amoniakowego jest Tris przy pH 8,5- 9,0, chociaż każde pH w zakresie 7,5-9,5 można uznać za dopuszczalne. Zalecanym stęże-niem buforu dla skutecznej zdolności buforowania jest 100 mM Tris, chociaż można użyć wszystko w zakresie 20-200 mM Tris.

Odpowiednie bufory dla odczynników AST i ALT obejmują HEPES, kwas 4-morfolino- propanosulfonowy (MOPS) lub kwas 2-[tris(hydroksymetylo)metyloamino]-l-etanosulfo- nowy (TES) albo dietanoloamina albo inne dobre bufory, Tricine, Bicine, TEA i TAPS, TAPSO i POPSO. Zalecanym buforem według wynalazku jest TRIS, o całkowitym stężeniu korzystnie wynoszącym 30-150 mmoli/litr, a korzystniej około 70-100 mmoli/litr, chociaż preferuje się około 80 mmoli/litr. Przy wyższych stężeniach buforu AST jest silnie hamowa-ny. Zauważono, że bufory fosforanowe wydają się zwiększać tempo rozkładu NADH i hamo-wać łączenie pirydoksalo-5-fosforanu(P-5-P) z apoenzymem transaminazy. Testowaną próbkę można rozcieńczyć jeśli trzeba, każdym odpowiednim rozcieńczalnikiem, takim jak woda dejonizowana lub roztwór soli. W dodatku do wyżej wymienionych buforów odpowiednich dla odczynników AST i ALT, następujące dobre bufory są także odpowiednie dla odczynni-ków mocznikowych i amoniakowych: CAPSO, CHES i AMPSO.

Odpowiednie są także konserwanty, takie jak azydek sodu (NaN^), kwas hydroksyben- zoesowy, gentamycyna, Thymol i konserwanty pozbawione rtęci dostępne od Boehringer Mannheim, takie jak metyloizotiazolon. Odpowiednim poziomem jest taki, że konserwant zachowuje swoje właściwości konserwujące przez co najmniej 6-8 miesięcy, przy przecho-wywaniu w temperaturze 2-8°C, bez inhibicji enzymów obecnych w odczynniku. Odpowied-nim zakresem spełniającym te kryteria jest 0 ,1- 1,0 g/litr.

Różne środki chelatujące, takie jak EDTA, EGTA, kwas N-(2-hydroksyetylo)ety- lenodiaminotrioctowy (HEDTA), itd. są także odpowiednie jako niespecyficzne środki stabilizują-ce. W odczynnikach AST i ALT według wynalazku, korzystnie wykorzystuje się EDTA, przy po-ziomie około 2,0-10,0 mmoli/litr, w celu stabilizacji 2-oksoglutaranu. Jest on dostępny jako sól tetrasodowa, a także sól potasowa, ale zalecaną solą według wynalazku jest sól disodowa. W odczynnikach mocznikowym i amoniakowym, EDTA obecna jest w zakresie 0,2-10 mM. Szczególnie zalecanym stężeniem EDTA jest 1 mM.

Środki stabilizujące enzymy można także wprowadzić do odczynników według wyna-lazku. Zalecanym środkiem stabilizującym jest albumina surowicy bydlęcej, klasy pozbawio-nej proteazy. Inne odpowiednie mogą zawierać gamma globulinę bydlęcą, N-acetylo cysteinę i glicerol.

Jeśli trzeba, można także dodać odpowiednich środków przeciw pienieniu. Środki po-wierzchniowo czynne, które można stosować, obejmują środki powierzchniowo czynne Zwitterionic i niejonowe środki powierzchniowo czynne, o poziomach, nie hamujących en-zymów obecnych w odczynnikach.

W innym aspekcie wynalazku dostarcza się ulepszonego sposobu enzymatycznego okre-ślenia stężenia analitu w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koen-zymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu, przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia transami-nazy w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak,

16 186 517

aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania aminotransferazy asparaginianowej w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wy-braną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowy-wania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania aminotransferazy alaninowej w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wy-braną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowy-wania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia mocznika w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulep-szenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utle-nieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspo-mnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia amoniaku w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulep-szenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utle-nieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspo-mnianego odczynnika.

W zalecanym sposobie zgodnie z tym aspektem, enzym w parze enzym i substrat, ma niecałkowitą specyficzność wobec wspomnianego substratu, zmniejszając przez to tempo wzajemnej reaktywności między enzymem i substratem.

W zalecanej postaci realizacji tego aspektu wynalazku, układ redukcyjny koenzymu za-wiera enzym i substrat, posiadające specyficzność wobec siebie, w stosunku do specyficzności enzymu wobec jego naturalnego substratu, wynoszącą mniej niż 100%, korzystnie mniej niż 50%, a najkorzystniej mniej niż 10%. Najkorzystniej, wzajemna specyficzność pary en-zym/substrat, w stosunku do specyficzności enzymu wobec jego naturalnego substratu, jest mniejsza niż 5%, celowo około 2%.

Wyboru koenzymu, substratu i enzymu można dokonać spośród wymienionych tu po-wyżej, w związku z odczynnikami według wynalazku, w zależności od oznaczanego analitu.

W jednej postaci realizacji tego aspektu wynalazku, zalecanymi komponentami układu redukującego koenzymu, stosowanego do określania stężenia analitu, są NADH, G-6-P-FH i D-glukoza tak, że zachodzącą reakcją regeneracji jest

D-glukoza + NAD+ —°-6-p-DH_ > NADH + glukonolakton

Z powodu niskiej specyficzności G-6-P-DH wobec D-glukozy, ta reakcja regeneracji jest powolna, a więc nie kompetytywna z głównymi reakcjami, dotyczącymi określania po-ziomów analitów.

Zalecane postacie realizacjiW jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik ALT zasadniczo zawiera

L-alaninaLDHNADHK2H P 042-oksoglutaran

G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymu substratenzymy specyficzne wobec substratukoenzymaktywatorsubstrat

186 517 19

c.d. tabeli 41 2 3 4

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 2000 jednostek

D-glukoza 180,16 100 mM 18,016 g

MDH drobnoustrojowe 200 jednostek

Preparat jest 10% stężeniem, aby umożliwić rozcieńczenie próbki.

W zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik mocznikowy zasadniczo zawiera G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymuUreaza enzymy specyficzne wobec analitua-ketoglutaran substratNADH koenzymK2HPO4 aktywatorGLDH enzym specyficzny wobec substratu

Odczynnik mocznikowy sporządzony według wynalazku jest następujący:

Ta b e 1 a 5A

Surowce Ciężar cząsteczkowy Ilość/litr

Bufor Tris 121,14 5,0-10,0 g

Tris HC1 157,60 3,5-9,5 g

a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 190,1 0,5-3,5 g

EDTA-disodowy 372,24 0,1-1,Og

NADH, Na2, 3H20 763,5 0,1-0,3 g

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)

174,18 0,3-2,0 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,05-2,0 g

Azydek sodu 65,01 0,1-1,Og

D-glukoza 180,16 3,0-2 1,0 g

Ureaza (drobnoustrojowa) 4000-9000 jednostek

GLDH (drobnoustrojowy) 250-1000 jednostek

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 1000-4500 jednostek

W szczególności, zalecany odczynnik mocznikowy według wynalazku sporządza się następująco:

Ta b e 1 a 5B

Surowce Ciężar cząsteczkowy Stężenie Ilość/litr

1 2 3 4

Tris 121,14 61,3 mM 7,43 g

Tris HC1 157,60 38,7 mM 6,10 g

a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 190,1 7,5 mM 1,43 g

EDTA-disodowy 372,24 1,0 mM 0,372 g

NADH, Na2, 3H20 763,5 0,28 mM 0,214 g

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 174,18 5,0 mM 0,871 g

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę su-rowicy bydlęcej i azydek sodu.

Jeden odczynnik ALT sporządzony zgodnie z wynalazkiem jest następujący:T a b e l a 1

186517 17

Surowce Ciężar cząsteczkowy Ilość/litrBufor Tris 121,14 1,5-3,5 gTris HC1 157,60 8,0-14,0 gL-alanina 89,09 34,0-45,0 ga-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 190,1 0,5-3,5 g

EDT A-disodowy 372,24 1,0-3,0 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,1-2,0 gNADH, Na2, 3H20 763,5 0,1-0,3 gFosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 174,18 0,3-1,3 g

Azydek sodu 65,01 0 ,l- l,0 g

LDH drobnoustrojowe 2000-5000 jednostekG-6-PDH 200-3000 jednostek

D-glukoza 180,16 15,0-21,0 g

W szczególności, jeden zalecany odczynnik ALT według wynalazku sporządza się nastę-pująco:

T a b e l a 2

Surowce Ciężar cząsteczkowy Stężenie liość/litr

Bufor Tris 121,14 18 mM 2,18 g

Tris HC1 157,60 70 mM 11,03 g

L-alanina 89,09 440 mM 39,2 g


EDT A-di odowy 372,24 5,5 mM 2,04 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,1% 1,00 g

NADH,Na2, 3H20 763,5 0,26 mM 0,199 g

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 174,18 5 mM 0,87 g

Azydek sodu 65,01 7,7 mM 0,50 g

LDH drobnoustrojowe 4000 jednostek

G-6-PDH 2000 jednostek

D-glukoza 180,16 100 mM 18,016 g

Preparat jest 10% stężeniem, aby umożliwić rozcieńczenie próbki.

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik AST zasadniczo zawiera

G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymuL-asparaginian substratLDH enzymy specyficzneMDH wobec substratuNADH koenzymK2HPO4 aktywator2-oksoglutaran substrat

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę su-rowicy bydlęcej i azydek sodu.

Jeden odczynnik AST sporządzony zgodnie z wynalazkiem jest następujący:

18 186 517

T a b e l a 3


Bufor Tris 121,14 2,0-6,0 g

Tris HC1 157,60 6,0-11,0 g

L-asparaginian, sól K 172,2 34,0-43,0 g


EDT A-disodowy 372,24 1,0-3,0 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,1-2,0 g

NADH, Na2, 3H20 763,5 0,1-0,3 g

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 174,18 0,3-2,0 g

Azydek sodu 65,01 0,1-l.Og

LDH drobnoustrojowe 1000-4000 jednostek

G-6-PDH (Toyobo) Leuconostoc mesenteroides 1000-4500 jednostek

D-glukoza 180,16 15,0-2 1,0 g

MDH drobnoustrojowe 100-600 jednostek

W szczególności, jeden zalecany odczynnik AST według wynalazku sporządza się następująco:

Ta b e 1 a 4


1 2 3 4

Bufor Tris 121,14 31,2 mM 3,78 g

Tris HC1 157,60 56,8 mM 8,95 g

L-asparaginian, sól K 172,2 220 mM 37,88 g


EDT A-disodowy 372,24 5,5 mM 2,04 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,1% 1,00 g

NADH, Na2, 3H20 763,5 0,26 mM 0,199 g

Fosforan potasu dwuzasadowy(k 2h p o 4)

174,18 10,0 mM 1,74 g

Azydek sodu 65,01 7,7 mM 0,50 g

LDH drobnoustrojowe 2000 jednostek

20 186 517

c.d. tabeli 5B1 2 3 4

Albumina surowicy bydlęcej 0,05% 0,50 gAzydek sodu 65,01 7,7 mM 0,50 g

D-glukoza 180,16 100 mM 18,016 g

Ureaza (drobnoustrojowa) 6500 jednostek

GLDH (drobnoustrojowy) 500 jednostek

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 2000 jednostek

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku odczynnik amoniakowy obejmuje za-sadniczo:

G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymua-ketoglutaran substratNADH koenzymK2HPO4 aktywatorGLDH enzym specyficzny wobec substratu

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, ADP-K, al-buminę surowicy bydlęcej i azydek sodu..

Ta b e 1 a 6A


Bufor Tris 121,14 5,0-10,0 g

Tris HC1 157,60 3,5-9,5 g


EDTA-disodowy 372,24 0 ,l- l,0 g

NADPH, Na4, 4H20 905,4 0,l-0,35g

ADP-K 501,3 01,Og

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04)

174,18 0,3-2,0 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,05% 0,05-2,0 g

Azydek sodu 65,01 0 ,l- l,0 g

D-glukoza 180,16 3-21 g

GLDH (drobnoustrojowy) 6000-10000 jednostek

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 1000-4000 jednostek

W szczególności, zalecany odczynnik mocznikowy według wynalazku sporządza się na-stępująco:

Ta b e 1 a 6B


Tris 121,14 61,30 mM 7,430 g

Tris HC1 157,60 38,70 mM 6,100 g


EDTA-disodowy 372,24 1,00 mM 0,372 g

NADPH, Na4, 4H20 905,40 0,28 mM 0,254 g

ADP-K 501,30 2 mM l,0 g

186 517 21

c.d. tabeli 6B1 2 3 4

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 174,18 5,00mM 0,871 g

Albumina surowicy bydlęcej 0,05% 0,500 gAzydek sodu 65,01 7,70 mM 0,500 gD-glukoza 180,16 100 mM 18,016 gGLDH (drobnoustrojowy) 8500 jednostek

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 3 500 jednostek

Mimo, że zaleca się, żeby odczynniki według wynalazku były sporządzane w konfigura-cji pojedynczej fiolki, możliwe jest także sporządzenie w konfiguracji dwóch fiolek. Należy tylko zawrzeć w jednej z fiolek składnik regeneracyjny preparatu. W szczególności, IFCC zaleca, aby dla odczynników ALT i AST, 2-oksoglutaran był sporządzany jako składnik od-dzielny od pozostałości preparatu. Odczynnik a (wyłączając 2-oksoglutaran)można inkubować z próbką pacjenta przez okres 5-10 minut, który pozwala na całkowite zajście wszystkich re-akcji pobocznych. Po okresie inkubacji, można dodać 2-oksoglutaran, aby rozpocząć główną reakcję. Alternatywą do użycia 2-oksoglutaranu jako składnika inicjującego, możliwe jest także użycie asparaginianu lub alaniny w ten sam sposób, ponieważ obecność 2-oksoglutaranu zabezpiecza AST lub ALT przed inaktywacją podczas reakcji pobocznych. Układ regenerują-cy, zawierający niedopasowaną parę enzymu i substratu, powinien być dodany do składnika układu dwóch fiolek, który obejmuje NADH.

Jeśli stosuje się układ dwóch fiolek, zaleca się, aby preparat zawierał P-5-P, ponieważ podczas okresu inkubacji, w obecności próbki, dodanie P-5-P do surowicy aktywuje apoen- zymy i pozwala na pomiar całkowitego stężenia aktywności katalitycznej AST lub ALT w dostarczonej surowicy, całkowicie nasyconej P-5-P. Zalecanym poziomem P-5-P do stoso-wania w układzie dwóch fiolek jest 80-120 (|j.moli/litr, z korzystniejszym poziomem, wyno-szącym 100 fimoli/litr.

P r z y k ł a d 1Stabilność czterech poszczególnych odczynników sporządzonych zgodnie z wynalaz-

kiem testowano jak następuje:Preparat:.Odczynnik AST:

Ta b e 1 a 7A

Bufor Tris 3,78 g/litr

Tris HC1 8,95 g/litr

Asparaginian 37,88 g/litr

a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 2,51 g/litr

Azydek sodu 0,50 g/litr

Albumina surowicy bydlęcej 1,0 g/litr

NADH, Na23H20 0,199 g/litr

EDTA-disodowy 2,04 g/litr

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 0,87 g/litr

D-glukoza 18,016 g/litr

G-6-PDH (L.Mesenteroides) 3500 jednostek/litr

D-LDH (drobnoustrojowy) 2000 jednostek/litr

MDH (drobnoustrojowy) 650 jednostek/litr

22

Ta b e 1 a 7B

186 517



L-Asparaginian, sól K 37,88 g/litr





EDT A-disodowy 1,86 g/litr


D-glukoza 18,0 16 g/litr

G-6-PDH (Toyobo) Luconostoc Mesenteroides 2000 jednostek/litr

LDH 2000 jednostek/litr

MDH (drobnoustrojowy) 200 jednostek/litr

Odczynnik ALT:Ta b e 1 a 8A



L-alanina 39,2 g/litr





EDTA-disodowy 2,04 g/litr


D-glukoza 18,016 g/litr

G-6-PDH (Luconostoc Mesenteroides) 3500 jednostek/litr

LDH (drobnoustrojowy) 3000 jednostek/litr

T a b e l a 8B



L-alamna 39,20 g/litr





EDT A-disodowy 1,860 g/litr

186 517 23

c.d. tabeli 8B1 2

Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HP04) 0,87 g/litrD-glukoza 18,016 g/litrG-6-PDH (Luconostoc Mesenteroides) 2000 jednostek/litrLDH (drobnoustrojowy) 4000 jednostek/litr

Warunki przechowywania: zamknięte i schłodzone (2-8°C)Parametry spektrofotometryczne (Shimadzu PC2101):• temperatura reakcji 37°C• objętość próbki do objętości odczynnika 1:10 do 1:25• długość fali 340 nm• długość drogi optycznej kuwety 1 cmFaza zwłoki pomiaru wynosi około 1 minuty lub mniej, a czas pomiaru wynosi do 3 mi-

nut po fazie zwłoki.Te parametry spektrofotometryczne stosuje się do określania następujących:• początkowej absorbancji odczynnika przy 340 nm• tempa regeneracji w temperaturze 20°C (wyrażonego w mABS/minutę)Użyto Cobas Mira, aby określić odzyski w kontrolnych standardach.Uzyskano następujące wyniki:

Ta b e 1 a 9ADane absorbancji dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7A i 8A

Przechowywanie w temperaturze 8°C Absorbancja przy 340 nm 1 (tygodnie)

odczynnik AST odczynnik ALT

świeży odczynnik 1,88 1,99

1 1,77 1,95

3 1,72 1,88

6 1,65 1,78

10 1,54 1,64

15 1,40 1,46

20 1,25 1,29

25 1,18 1,18

29 1,13 1,10

33 1,07 1,01

Ta b e 1 a 9BDane absorbancji dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7B i 8B

Przechowywanie w temperaturze 2-6°C ., , . , nJ t , .r Absorbancja przy 340 nm 4- (dni)

odczynnik AST odczynnik ALT

1 2 3

Świeży odczynnik 1,83 1,86

22 1,82 1,81

24 186 517

c.d. tabeli 9B1 2 329 1,80 1,80

60 1,73 1,70

92 1,67 1,61

125 1,60 1,52

159 1,52 1,41187 1,46 1,33

194 1,45 1,32

Następujące tabele (tabela 10A i 10B) dostarczają dowodu ciągłej działalności zarówno odczynnika AST jak i ALT przez 7 miesięcy. Dla każdego przebiegu, przeprowadzono pulę surowicy z wysoką i niską zawartością AST i ALT, stosując zarówno odczynnik świeżo spo-rządzony jak i odczynnik przechowywany w temperaturze 8°C, w różnych przedziałach cza-sowych.

Ta b e 1 a 10AKontrolne odzyski surowic dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7A i 8A

Przechowywanie w tem-peraturze 8°C (tygodnie)

Odczynnik ALT (jednostki/litr) Odczynnik AST (jednostki/litr)

odczynnik świeżyodczynnik przecho-wywany w tempera-

turze 8°Codczynnik świeży

odczynnik przechowy-wany w temperaturze

8°C

pula surowicy -> niska wysoka niska wysoka niska wysoka niska wysoka

0 40 156 42 152 45 188 45 192

4 38 154 42 162 45 185 46 191

9 41 150 38 151 46 182 46 194

12 39 157 42 152 46 189 46 187

15 32 133 33 132 40 163 38 164

25 32 121 33 117 38 180 39 180

29 31 117 32 112 33 164 37 170

Ta b e 1 a 10BKontrolne odzyski surowic dla odczynników AST i ALT ukazane w tabelach 7B i 8B

Przechowywanie (dni) Odczynnik ALT (jednostki/litr) Odczynnik AST (jednostki/litr)

odczynnik przecho-wywany w tempe-raturze 20°C

odczynnik przecho-wywany w tempera-turze 4°C

odczynnik przecho-wywany w tempe-raturze 20°C

odczynnik przechowy-wany w temperaturze

4°C

pula surowicy —» niska wysoka niska wysoka niska wysoka niska wysoka

1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 32 123 32 123 40 186 40 186

186 517 25

c.d. tabeli 10B1 2 3 4 5 6 7 8 97 33 120 - - 41 191 - -

14 32 121 - - 41 184 - -

21 33 121 33 122 41 182 40 184

28 32 120 32 120 41 185 40 184

35 33 118 33 117 42 185 44 183

60 - - 33 120 - - 41 185

92 - - 36 122 - - 45 190

125 - - 35 123 - - 44 189

159 - - 36 123 - - 43 188

187 - - 35 125 - - 44 187

Ta b e 1 a 11ABadania liniowości dla odczynników AST i ALT ukazane w tabelach 7A i 8A

Odczynnik AST (jednostek/litr) Odczynnik ALT (jednostek/litr)

oczekiwana obserwowana oczekiwana obserwowana

4 głównapartia

odczynnikdoświadczalny 4

głównapartia

odczynnikdoświadczalny

400 393 389 380 380 357

200 182 182 120 121 119

100 98 96 60 65 63

50 50 51 30 34 28

Ta b e 1 a 1 IBBadania liniowości dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7B i 8B

Odczynnik AST (jednostek/litr) Odczynnik ALT (jednostek/litr)

oczekiwana obserwowana oczekiwana obserwowana

świeżyodczynnik

200 dni w tempe-raturze 4°C

świeżyodczynnik

200 dni w tempe-raturze 4°C

120 122 113 141 137 133

240 241 237 282 285 273

300 301 295 353 353 352

360 360 357 424 422 416

420 420 416 494 493 476

480 479 472 565 560 551

540 538 527 635 635 621

600 598 596 706 710 684

26 186 517

Uwaga: odczynnik doświadczalny przechowywano w temperaturze 8°C przez okres 31 tygodni

Główną partię świeżo odtworzono do tego badania.Z prezentowanych rezultatów wynika wyraźnie, że regenerowane odczynniki AST

i ALT wykazują co najmniej 6-7 miesięczną stabilność podczas przechowywania w zamknięciu, w temperaturze 2-8°C. Aby działać, odczynnik musi posiadać absorbancję początkową 1,0 A. Po 7 miesiącach odczynnik wciąż posiada absorbancję co najmniej 1,0 A.

Z wyników otrzymanych w tabeli 10A i 1 OB jasno wynika, że nie ma znacznych różnic w odzyskach surowic kontrolnych, uzyskanych ze świeżym odczynnikiem, w przeciwieństwie do odczynnika przechowywanego w temperaturze 8°C przez okres do 29 tygodni. Wyniki prezentowane w tabelach 11A i 11B wskazują że odczynniki AST i ALT, obejmujące tech-nologię regeneracji koenzymu, są wciąż zdolne do spełnienia wymagań liniowości, po 31 ty-godniach przechowywania w temperaturze 8°C.

Wprowadzenie układu regeneracyjnego według wynalazku dało w wyniku wzrost od-tworzonej stabilności pomiaru surowicy, zawierającej zamknięty odczynnik AST i ALT, od 1 miesiąca w temperaturze 2-8°C do co najmniej 6-8 miesięcy w temperaturze 2-8°C.

P r z y k ł a d 2Sporządzono odczynniki mocznikowe ze składników jakie opisano w tabeli 5B powy-

żej, z wyjątkiem tego, że włączono do preparatów 0,33 mM NADH, i poziom D-glukozy ob-niżono do 20 mM dla jednego z odczynników.

Preparaty w ten sposób sporządzone posiadały pH 8,5. Jako kontroli, użyto konwencjo-nalnego preparatu odczynnika mocznikowego. Odczynniki sporządzono z poziomem 0,15 mM amoniaku, wprowadzonego do układu odczynnika (ostateczne stężenie), jako zanieczyszcze-nie. Ten poziom zanieczyszczenia amoniakiem jest wystarczający do zużycia 0,15 mM NADPH w odpowiednich odczynnikach - równoważnik 0,93 jednostek absorbancji przy 340 nm. Po zakończeniu reakcji (to jest klirensu amoniaku w preparacie odczynnikowym), monitorowano absorbancję różnych roztworów w czasie (umieszczonych w szczelnych ku-wetach) na spektrofotometrze Shimadzu przy 340 nm, i w temperaturze 20°C.

Wyniki prezentowane w fig. 1 ukazują regenerację zależną od czasu NADH z NAD+ i pre-paracie odczynnika mocznikowego według wynalazku, po zanieczyszczeniu 0,15 mM amoniaku.

W fig. 1:Tabela A ukazuje, regenerację NADH dla konwencjonalnego odczynnika mocznikowego;Tabela B ukazuje regenerację NADH odczynnika mocznikowego, zawierającego 5 mM

fosforanu sodowego, 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 20 mM D-glukozy;Tabela C ukazuje regenerację NADH odczynnika mocznikowego, zawierającego 5 mM

fosforanu potasu, 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 100 mM D-glukozy.Po 48 godzinach w temperaturze 20°C, odczynnik konwencjonalny zaprzestał regeneracji

jakiegokolwiek zużytego NADH, po zanieczyszczeniu odczynnika amoniakiem. Po takim samym okresie czasu, odczynnik mocznikowy według wynalazku z 20 mM D-glukozy zregenerował 0,23 jednostki absorbancji, lub 0,04 mM NADH. Przez 48 godzin, odczynnik mocznikowy według wynalazku ze 100 mM D-glukozy zregenerował 0,70 jednostki absorbancji, albo 0,11 mM NADH. Wyniki te wskazują zdolność opisanego tutaj odczynnika do przezwyciężania wyczerpania NADH w odczynniku mocznikowym, po zanieczyszczeniu odczynnika amoniakiem.

Ta b e 1 a 12Maksymalne współczynniki regeneracji dla odczynnika mocznikowego w temperaturze 20°C,

mierzone przy 340 nm.

Warunki odczynnika mocznikowego Współczynnik regeneracji (m/Abs/minutę)

Odczynnik konwencjonalny - 0,020

Odczynnik według wynalazku, zawierający 5 mM Na-P04 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 2 mM D- glukozy

+ 0,088

Odczynnik według wynalazku, zawierający 5 mM K-P04 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 100 mM D-glukozy

+ 0,386

Maksymalne współczynniki regeneracji NADH, W odpowiednich odczynnikach moczniko-wych, pokazano w tabeli 12. W konwencjonalnym odczynniku mocznikowym, zachodziła powol-na utrata absorbancji w czasie, po klirensie zanieczyszczenia amoniakiem. W preparacie według wynalazku, współczynnik regeneracji NADH wzrastał, razem ze wzrostem stężenia D-glukozy w odczynniku.

Odczynniki amoniakowe sporządzono ze składnikami jakie opisano w powyższej tabeli 6B, z wyjątkiem tego, że stosunek buforu Tris/Tris HC1 (100 mM całkowitego buforu) zmieniał się tak, że wartości pH odczynnika uzyskano w zakresie pH 8,0-9,3. Ostateczne stężenie 0,2 mM NADPH użyto także w sporządzonych odczynnikach amoniakowych. Sporządzono także kontrolny odczynnik amoniakowy, bez D-glukozy, fosforanu potasu czy G-6-PDH. Odczynni-ki sporządzono z poziomem 0,1 mM amoniaku wprowadzonego do układu odczynnika (stężenie ostateczne) jako zanieczyszczenie. Ten poziom zanieczyszczenia amoniakiem jest wystarczający do zużycia 0,1 mM NADPH w odpowiednich odczynnikach - równoważny 0,62 jednostek absor-bancji przy 340 nm. Po zakończeniu reakcji (to jest klirensu amoniaku w preparacie odczynniko-wym), monitorowano absorbancję różnych roztworów w czasie (umieszczonych w szczelnych kuwetach) na spektrofotometrze Shimadzu przy 340 nm, i w temperaturze 20°C.

Wyniki prezentowane w fig. 2 pokazują regenerację zależną od czasu NADPH z NADP w preparatach odczynnika amoniakowego, między wartościami pH 8 ,0-9,3, według wynalaz-ku, po zanieczyszczeniu 0,1 mM amoniaku. Regenerację NADPH, następującą po klirensie zanieczyszczenia amoniakiem, zakończono w 24 godziny po zanieczyszczeniu amoniakiem, w temperaturze 20°C. Maksymalne współczynniki regeneracji NADPH w odpowiednich od-czynnikach amoniakowych pokazano w tabeli 13. W konwencjonalnym odczynniku amonia-kowym przy pH 8,0, absorbancja roztworu utrzymywała się między 0,6-0,65, z powolną utratą absorbancji. W preparatach według wynalazku przy wszystkich testowanych wartościach pH, współczynnik regeneracji NADPH był zupełnie podobny. Maksymalny współczynnik regene-racji NADPH był przy pH 8,50. Wyniki te jasno wskazują zdolność opisanego tutaj wynalaz-ku do przezwyciężania wyczerpania NADPH w odczynniku amoniakowym, po zanieczysz-czeniu odczynnika amoniakiem.

T a b e l a 13

186 517 27

Maksymalne współczynniki regeneracji NADPH dla odczynnika amoniakowego w temperaturze 20°C,mierzonych przy 340 nm

Warunki odczynnika amoniakowego Współczynnik regeneracji (m/Abs/minutę)

pH 8,0 odczynnik konwencjonalny -0,03

pH 8,0 preparat według wynalazku + 0,78




P r z y k ł a d 3Współczynniki utraty NAD(P)H w odczynnikach amoniakowym i mocznikowymA Odczynnik mocznikowySporządzono odczynniki mocznikowe ze składem preparatu jaki opisano w tabeli 5B,

z następującymi odmianami. Końcowe stężenie NADH w preparatach odczynnika wynosiło 0,25 mM. pH odczynnika mocznikowego ustawiono przez zróżnicowanie stosunku Tris/Tris HC1 (100 mM całkowitego buforu). Kontrolne roztwory odczynnika mocznikowego sporzą-dzono przy nieobecności D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH.

Absorbancję roztworu próbki odczynnika, przechowywanego w szczelnych kuwetach w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowano przy 340 nm.

Zmniejszenie absorbancji roztworów odczynnika mocznikowego w czasie, przechowy-wanego w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowanego przy 340 nm, pokazano w tabeli 14. Oka-

28 186 517

żuje się, że zarówno w obecności jak i nieobecności układu regeneracyjnego koenzymu we-dług wynalazku, roztwory tracą absorbancję szybciej przy pH 8,0 niż przy pH 8,5. W prepara-cie według wynalazku, jednakże, tempo utraty absorbancji roztworu odczynnika, było także zacznie wolniejsze. Innymi słowy, podniesione pH i wprowadzenie układu regenerującego koenzymu według wynalazku, znacznie zmniejsza tempo zanikania NADPH z roztworu od-czynnika mocznikowego.

Powinno się zauważyć, że chociaż wzrost pH powyżej 8,5 będzie także sprzyjać stabil-ności NADH, dostępne w handlu enzymy ureaza i dehydrogenaza glutaminianowa stają się coraz mniej stabilne i mniej aktywne w preparacie odczynnika. W konsekwencji, pożądana jest równowaga w pH preparatu odczynnika tak, aby utrzymać odpowiednią aktywność i sta-bilność enzymów, chociaż także zapewnienie rozsądnej stabilności NADH. Na tej podstawie zaleca się pH preparatu odczynnika około 8,5.

Ta b e 1 a 14Absorbancja (340 nm) roztworów odczynnika mocznikowego, przechowywanych w temperaturze 20°C,

jako funkcja czasu.

Okres inkubacji (dni)

pH 8,0 preparat konwencjonalny

pH 8,0 preparat według wynalazku

pH 8,5 preparat kowencjonalny

pH 8,0 preparat według wynalazku

0 1,73 1,72 1,77 1,74

7 1,63 1,68 1,70 1,75

14 1,52 1,61 1,64 1,70

23 1,36 1,48 1,54 1,62

29 1,25 1,40 1,47 1,53

37 1,12 1,30 1,38 1,52

B Odczynnik amoniakowySporządzono odczynniki amoniakowe ze składem preparatu jaki opisano w tabeli 6B,

z następującymi odmianami. pH odczynnika amoniakowego ustawiono przez zróżnicowanie stosunku Tris/Tris HC1 (100 mM całkowitego buforu). Końcowe stężenie NADPH w roztwo-rach odczynnika amoniakowego wynosiło 0,2 mM. Kontrolne roztwory odczynnika amonia-kowego sporządzono bez D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH.

Absorbancję roztworu próbki odczynnika, przechowywanego w szczelnych kuwetach w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowano przy 340 nm.

Zmniejszenie absorbancji roztworów odczynnika amoniakowego w czasie, przechowy-wanego w temperaturze 20°C, monitorowanego przy 340 nm, pokazano w tabeli 15. Okazuje się, że zarówno w obecności jak i nieobecności układu regeneracyjnego koenzymu według wynalazku, roztwory tracą absorbancję szybciej przy niższym pH. W preparatach według wy-nalazku, jednakże, tempo utraty absorbancji roztworu odczynnika, było także znacznie wol-niejsze. Innymi słowy, podniesione pH i wprowadzenie układu regenerującego koenzymu według wynalazku, znacznie zmniejsza tempo zanikania NADPH z roztworu odczynnika amoniakowego.

Powinno się zauważyć, że chociaż wzrost pH będzie także sprzyjać stabilności NADPH, dostępna w handlu dehydrogenaza glutaminianowa staje się coraz mniej stabilna i mniej ak-tywna w preparacie odczynnika powyżej pH 8,5. W konsekwencji, pożądana jest równowaga w pH preparatu odczynnika tak, aby utrzymać odpowiednią aktywność i stabilność enzymów, chociaż także zapewnienie rozsądnej stabilności NADH. Na tej podstawie zaleca się pH pre-paratu odczynnika około 8,5-9,0.

186 517 29

Ta b e 1 a 15Absorbancja (340 nm) roztworów odczynnika amoniakowego, przechowywanego w temperaturze 20°C,

jako funkcja czasu

Okresinkubacji

(dni)

PH 8,0 prepa-rat konwen-

cjonalny

pH 8,0 prepa-rat z technolo-gią regenera-cyjną według

wynalazku

pH 8,5 prepa-rat konwen-

cjonalny

pH 8,5 prepa-rat z technolo-gią regenera-cyjną według

wynalazku

pH 9,0 prepa-rat konwen-

cjonalny

pH 9,0 preparat z technologią regene-racyjną według wy-

nalazku

0 1,39 1,41 1,38 1,41 1,4 1,41

6 1 1,09 1,20 1,27 1,31 1,36

12,9 0,64 0,79 0,99 1,12 1,2 1,29

20,1 0,39 0,57 0,79 0,97 1,09 1,22

32,9 0,15 0,33 0,49 0,74 0,87 1,07

38,1 0,13 0,28 0,39 0,67 0,8 1,03

P r z y k ł a d 4Funkcjonalność odczynników amoniakowego i mocznikowegoA Odczynnik mocznikowySporządzono odczynnik mocznikowy według składników wymienionych w tabeli 5B,

w obecności i nieobecności D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH. Jednakże, stężenie ostateczne NADH w preparacie odczynnika, wynosiło 0,25 mM. Lineamość odczynników porównano z kontrolami Verichem/Normal/Abnormal, na urządzeniu Roche® Cobas Mira™, stosując pa-rametry wymienione poniżej.

Temperatura reakcji: 37°C Obj ętość próbki do odczynnika: 1:100Długość fali: 340 nm

Wyniki prezentowane w tabeli 16 wskazują, że odczynnik mocznikowy przy pH 8,50 według niniejszego wynalazku, jest liniowy do najwyższych poziomów testowanej moczni-kowej próby kontrolnej (Verichem poziom E, z 37,4 mM mocznika), ze zmierzonymi zmien- nościami wartości, wynoszącymi 5% wyszczególnionego stężenia. Odczynnik mocznikowy według wynalazku daje odczyt dokładnie w zakresie odchylenia od wartości dla normalnych i nienormalnych mocznikowych próbek kontrolnych.

Ta b e ł a 16Badania liniowości z użyciem odczynnika mocznikowego, przy pH 8,50

Próbka kontrolnaPoszczególne stężenia mocznika

dla próbek kontrolnych (mM)Oszacowane stężenie mocznika dla próbek kontrolnych (mM)

odczynnik mocznikowy według wynalazku

odczynnik mocznikowy (konwencjonalny)

Verichem poziom A 1,8 2 2

Verichem poziom B 10,7 10,8 11,3

Verichem poziom C 19,6 19,9 19,6

Verichem poziom D 28,5 27,7 26,7

Verichem poziom E 37,4 35,9 35,8

Kontrola normalna 5,2 ± 1,4 5,2 5,2

Kontrola nienormalna 18,3 ±2,1 19,1 18,6

30 186 517

B Odczynnik amoniakowySporządzono odczynnik amoniakowy, w obecności i nieobecności D-glukozy, fosforanu

i G-6-PDH, według składników wymienionych w tabeli 6B. Liniowość odczynników porów-nano z kontrolami wodnego roztworu amoniaku, na urządzeniu Roche® Cobas Mira™, stosu-jąc parametry wymienione poniżej.

Temperatura reakcji: 37°C Objętość próbki do odczynnika: 1:10Długość fali: 340 nm

Wyniki prezentowane w tabeli 17 wskazują, że odczynnik amoniakowy przy pH 8,50 według wynalazku, jest liniowy do najwyższych poziomów testowanej amoniakowej próby kontrolnej (1200 |j.M amoniaku), ze zmierzonymi zmiennościami wartości, wynoszącymi 5% wyszczególnionego stężenia.

Ta b e 1 a 17Badania liniowości z użyciem odczynnika amoniakowego, przy pH 8,50

Poszczególne stężenia amoniaku dla wodnego roztworu próbki kontrolnej (|iM)

Średnie oszacowane stężenie amoniaku dla próbek kontrolnych (jiM), z podwojonych pomiarów

10 11,6 ± 6

20 24,2 ± 2,3

50 52,5 ±3,1

100 101,9 ±2,7

200 203,5 ± 1,3

400 409,7 ±3,1

800 789,3 ± 3,5

1200 1164 ±2,2

P r z y k ł a d 5Odczynnik mocznikowy można konfigurować w formacie dwóch fiolek, zgodnie z konfigu-

racją preparatu wyszczególnioną poniżej. Stosunek objętości odczynnika dodanego do fiolki Ai fiolki B wymagany, aby uzyskać odczynnik połączony, wynosi 5:1 dla fiolki a : fiolki B.

Fiolka A mocznikowa


Tris 121,14 61,3 mM 7,43 g

Tris HC1 157,6 38,7 mM 6,10 g

NADH, Na2, 3H20 763,5 0,34 mM 0,26 g

NaN3 65,01 7,7 mM 0,5 g

k 2h p o 4 174,18 5,0 mM 0,871 g

D-glukoza 180,16 100 mM 18,02 g

BSA 0,05% 0,5 g

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 2000 jednostek/litr 2000 jednostek

186 517 31

Fiolka B mocznikowa


Tris 121,14 61,3 mM 7,43 g

Tris HC1 157,60 38,7 mM 6,10 g

a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 190,1 45 mM 8,55 g

EDTA Na2, 3H20 372,24 1 mM 0,372 g

BSA - 0,05% 0,5 g

GLDH (drobnoustrojowy) - 50000 jednostek/litr 50000 jednostek

Ureaza (drobnoustrojowa) - 40000 jednostek/litr 40000 jednostek

Odczynnik amoniakowy, format 2 fiołkowyOdczynnik amoniakowy można konfigurować w formacie dwóch fiolek, zgodnie z kon-

figuracją preparatu wyszczególnioną poniżej. Stosunek objętości odczynnika dodanego do fiolki a i fiolki B wymagany, aby uzyskać odczynnik połączony, wynosi 5:1 dla fiolki A: fiolki B. W dostarczonym przykładowo preparacie, stosuje się NADH zamiast NADPH. W konsekwencji, do fiolki a włącza się LDH, w celu usunięcia z próbki pacjenta zakłócające-go pirogronianu, przed rozpoczęciem głównej reakcji oznaczenia.

Fiolka A amoniakowa


Tris 121,14 61,3 mM 7,43 g

Tris HC1 157,60 38,7 mM 6,10 g

NADH, Na2,3H20 763,5 0,34 mM 0,26 g

NaN3 65,01 7,7 mM 0,5 g

k 2h p o 4 174,18 5 mM 0,871 g

D-glukoza 180,16 100 mM 18,02 g

BSA - 0,05% 0,5 g

G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides 2000 jednostek/litr 2000 jednostek

LDH (drobnoustrojowy) 2000 jednostek/litr 2000 jednostek

Fiolka B amoniakowa


Tris 121,14 61,3 mM 7,43 g

Tris HC1 157,60 38,7 mM 6,10 g

a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna) 190,1 45 mM 8,55 g

EDTA Na2,3H20 372,24 1 mM 0,372 g

BSA - 0,05% 0,5 g

GLDH (drobnoustrojowy) - 50000 jednostek/litr 50000 jednostek

Ureaza (drobnoustrojowa) - 40000 jednostek/litr 40000 jednostek

Inne wielkie zalety odczynnika i sposób według wynalazku są takie, że odczynnik jest w najkorzystniejszej postaci, odczynnikiem w pojedynczej fiolce, przez co zabiera mniej miej-sca oraz pomniejsza problemy magazynowania, towarzyszące odczynnikom z dotychczasowego stanu techniki, jest on także możliwy do przystosowania w różnych układach oprzyrządowania.

Należy docenić, że jest tam wiele „niespecyficznych” par enzym/substrat, które można stosować do spowalniania regeneracji koenzymu użytego w odczynniku i sposobie według wynalazku. Oprócz tych wymienionych tutaj, istnieją inne, niedostępne w handlu lub trudno osiągalne z powodu wysokiej ceny.

Doceni się także, że ten wynalazek będzie możliwy do zastosowania w stabilizacji od-czynników innych niż AST, ALT, amoniakowym i mocznikowym, np. LDH (pirogronian do mleczanu), triglicerydowym i salicylanowym. Wynalazku nie powinno się uznać za ograni-czony przez zilustrowanie go w tym szczegółowym opisie, szczególnie ze względu na AST, ALT, amoniakowy i mocznikowy.

32 186 517

186 517

Fig 2.

186 517

F i g . 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186517 - …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/200862.pdf ·...

Documents

Transcript of (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186517 - …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/200862.pdf ·...