Hodowle tkankowe,komórki macierzyste

Typy hodowli

Pierwszorzędowe = pierwotneWtórneLinie komórkoweLinie unieśmiertelnione telomerazaonkogenyonkowirusy nowotworowe

PojęciaMedium = pożywka Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze

Skład: Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe,

Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr Witaminy Sole,glukoza Surowica – zawiera insulinę, transferynę Czerwień fenolowa Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla erytrocytów

Warunki hodowli

Temperatura

Tlen, dwutlenek węgla

pH

Wilgotność powietrza

Laboratorium

Hodowle imitujące warunki fizjologiczne

• ko-kultury

• hodowle podtrzymujące z ang. „feeder layers”

• hodowle 3D na odpowiednich matrycach

• hodowle uniemożliwiające adhezję

Izolacja komórekOddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie

na pojedyncze komórki

rozdrobnienie mechaniczne tkanki

trawienie enzymami proteolitycznymi

traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórka-komórka

Rozbicie komórek

szok osmotyczny

ultradźwięki

przecieranie przez sita

homogenizacja

Rozdział frakcji

Cytometr przepływowy z sorterem

Chemotaksja

Adhezja

Wirowanie

Obecność markerów – antygenów powierzchniowych

Tworzenie CFU

Cytofluorymetria przepływowa z sorterem

MACS – rozdział immunomagnetyczny

Schemat izolacji immunomagnetycznej

Selekcja pozytywna

Selekcja negatywna

Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego

Medium HGF

Izolacja chemotaktyczna

SDF-1 LIF

Wirowanie

W gradiencie gęstości: frakcje wędrują w zależności

od rozmiaru i kształtu gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%);

w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20-70%)

W gradiencie prędkości: frakcje wędrują w zależności

od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć

Liczenie komórek

cytometr

Komora Burkera

Średnia ze zliczeń

Gęstość komórek /cm3: C=n* 105

n- ilość zliczonych komórek

Określenie żywotności

Błękit trypanu – martwe-niebieskie jądraBromek etydyny – martwe-jądra czerwoneJodek propydyny- martwe – jądro czerwoneDwuoctan fluoresceiny – żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Komórki macierzyste

TypyEmbrionalne ESCSomatyczne Z krwi pępowinowej

Cechy komórki macierzystej

Nieograniczona ilość podziałów

Zdolność do różnicowania

Zdolność samoodnawiania

Świat nauki 05/2002

Podziały

Bardzo rzadkie

Symetryczne

Asymetryczne

Regulacja

Świat nauki 07/1999

Typy komórek macierzystych

Totipotencjalne

Pluripotencjalne

Multipotencjalne

Unipotencjalne

www.wi.mit.edu

Blastocysta

Blastocysta =

trofoblast + węzeł zarodkowy

Trofoblast tworzy łożysko

Komórki węzła zarodkowego tworzą 3 listki zarodkowe

www.kumc.edu

Blastocysta

0,1 –0,2 mm średnicy

100 –150 komórek

www.kumc.edu

Hodowla

Komórki węzła zarodkowego

Warstwa odżywcza z inaktywowanych fibroblastów mysich

Surowica bydlęca

Świat nauki 06/1999

Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych

MSC Osteoblasty Osteoklasty

zwiększenie aktywnościalkalicznej fosfatazy

tworzenie ognisk mineralizacji

zmiana morfologii i gromadzenie kropli tłuszczu

zmiana morfologii i odkładanie proteoglikanów

ESC

ZALETY:

Pluripotencjalne

Zgodność antygenowa – brak odrzutu

WADY:

Trudna hodowla Nieprzewidywalny

kierunek różnicowania

Potworniaki 20% Problemy etyczne

Klonowanie terapeutyczne

Jądro komórki somatycznej wprowadzane do pozbawionego jądra oocytuCytoplazma oocytu „odmładza” jądroEmbrion hodowany do stadium blastocysty

www.biochem18.stanford.edu

Problemy

Źródło oocytów

Nieznana wydajność tej techniki

Wydajność 14% -na 1 linię 280 oocytów

Oocyty zwierzęce

www.lef.org

Partenogeneza

Niezapłodniony oocyt pobudzany do rozwoju

Podwójny zestaw chromosomów dawcy oocytu

Komórki pluripotencjalne

www.bedfordresearch.org

Odróżnicowanie

Izolacja enzymów oocytu „odmładzających” jądro

Iniekcja do komórki hematopoetycznej

Komórki odzyskują pluripotencjalność

www.ohsu.edu

Płodowe komórki macierzyste FSC

5-9 tygodniowe płody

Izolacja komórek linii płciowej

Pierwotne komórki zarodkowe EG

www.molbio.princeton.edu

Migracja ESC do organizmu matki

Zaostrzenie chorób autoimmunolo – gicznych

Migracja do miejsca uszkodzenia i regeneracja tkanek – ochrona matki

Świat nauki 12/2005

Krew pępowinowa

Alternatywne źródło krwiotwórczych SC

Przeszczepy autogeniczne i allogeniczne

Możliwość bankowania

130 tys. porcji zbankowanych

3500 przeszczepów

www.hemastem.com

Krew pępowinowa

ZALETY:Dostępność i czas

Bezpieczna metoda pobrania

Większa pula dostępnych dawców

Młode SC

Mniej nasilone GvH

Minimalne ryzyko zakażenia CMV

Brak dylematów moralnych

WADY:Porcja 100 ml bezpieczna dla biorcy 30 kg

Opóźnione zasiedlanie szpiku

Ryzyko obciążeń genetycznych

Nieznany wpływ bankowania

Mniej SC niż w szpiku i krwi mobilizowanej

Możliwości zastosowania krwi pępowinowej

Leczenie białaczek

Leczenie pacjentów po chemioterapii lub radioterapii

Uzyskanie komórek nerwowych

Uzyskanie komórek mezenchymalnych, trzustkowych i hepatocytów

www.waisman.wisc.edu

Banki krwi pępowinowej

PUBLICZNE:

Krew sklasyfikowana pod względem HLA

Przeszczepy allogeniczne

Ponoszą wszystkie koszty

Ogólnodostępny rejestr dawców

Dowolny biorca

KOMERCYJNE:

Przeszczepy autogeniczne lub w obrębie rodziny

Nie ponosi kosztów

Ryzyko zakończenia działalności i zniszczenia komórek

Somatyczne komórki macierzyste

Niezróżnicowane

Ograniczona proliferacja

Liczba z wiekiem maleje

Efekt starzenia

Dostosowanie do niszy tkankowej

Nie tworzą potworniaków

Stan uśpienia

www.rsna.org

Występowanie somatycznych SC

szpik

mięśnie – komórki satelitarne

skóra

jelito

wątroba

mózg

Wykorzystanie somatycznych SC

ZALETY:

Brak dylematów etycznych

Nie tworzą się potworniaki

WADY:

Trudność pozyskania

Brak zgodności tkankowej

Efekt starzenia

W stanach chorobowych lub martwicy mniejsza liczba

Przeszczepy

Autologiczne

Allogeniczne

Ksenogeniczne

Narządów

Tkanek

komórek

Możliwości wykorzystania

Badania embriogenezy

Badania nieprawidłowego rozwoju

Badania działania genów

Testowanie leków

Badanie teratogenów

Zastosowania medyczne

www.kumc.edu

Ograniczenia

Możliwość odrzutu przeszczepu allogenicznegoLinie hodowane na mysich fibroblastach i surowicy cielęcej – możliwość transmisji patogenów SC pobierają mysie białko i prezentują je na swojej powierzchni – odrzucenie przeszczepuTrudności uzyskania, hodowli i różnicowaniaKontrowersje etyczne

www.zaman.com

Oparzenia

Skóra wyhodowana in vitro dostępna komercyjnie

Przeszczep odtwarza włosy i gruczoły łojowe

Prawidłowy układ strefy wzrostu

www.times.hankooki.com

Zawał serca

W Polsce 100 tys. rocznie

Nekroza kardiomiocytów

Blizna łącznotkankowa

Przebudowa ściany

Świat nauki 12/2004

SSC w terapii pozawałowej -próby przedkliniczne

Myszy, szczury, owce, świnie

Poprawa kurczliwości

Indukcja angiogenezy

Prawidłowe ułożenie

Ochrona przed dalszą degeneracją

Po miesiącu 38% blizny zastąpione tkanką mięśniową

www.worldhealthspecialists.org

Badania kliniczne

Poznań i Paryż

Podanie podczas bypassów lub przezskórnie

Makrofagi + SC

Większość komórek nie przeżywa

Zwiększenie frakcji wyrzutowej z 35% do 42%

www.dir.nhlbi.nih.gov

Cukrzyca typu ISSC trzustkowe

Różnicowanie ESC w komórki wysepek trzuskowych

Produkcja insuliny

Możliwy przeszczep w nie fizjologicznej lokalizacji – pod torebkę nerki

www.stemcells.nih.gov

Uszkodzenia wzroku

Stosowana terapia

SSC z rąbka rogówki

In vitro hodowana błonka wszczepiana w miejsce uszkodzenia

Oparzenia rogówki

www.stemcell.umn.edu

Choroba Parkinsona

ok. 300 pacjentów

ESC lub SSC

Tworzyły połączenia neuronalne, produkcja dopaminy

50% redukcja objawów

Efekt utrzymywał sięprzez 5-10 lat

90-95% komórek zamiera po przeszczepie

Na 1 pacjenta potrzeba 6 płodów

www.stemcells.nih.gov

Udar mózgu oraz uszkodzenia rdzenia

kręgowegoPodanie dożylne

Angiogeneza, neurogeneza, regeneracja funkcjonalna

Wydzielają czynniki neuropoezy www.rsna.org

Zęby

Badania na myszach

SC z miazgi zębów mądrości

15 – 20% miało prawidłowy układ tkanek

Ograniczenia: Źródło Rozwój w szczęce

dorosłego Tworzenie korzeni Przewidywalna wielkość

i kształt

Świat nauki 9/2005

Hodowla narządów

Nerka: Autologiczna Na kolagenowym

rusztowaniu Po 12 tygodniach

produkowała mocz

Wątroba

Pęcherz moczowy

www.obgyn.net

CD34+ 2,5% marker SCCD133+ 1,1% marker SCCD33+ 45% marker komórek

hematopoetycznychCD71+ 6% marker limfocytówCD105+ 0,7% marker komórek

szpikuCD19+ 24% marker limfocytów BCD14+ 7,8% marker monocytówCD3+ 34% marker limfocytów T