Post on 01-Mar-2019
1
Instrukcje do ćwiczeń
Chemia Lipidów i Białek Laboratorium
Specjalizacja CHEMIA ŻYWNOŚCI
I rok CHEMII II stopnia
Opracowanie dr hab. Agnieszka Wojtkielewicz,
dr Agnieszka Hryniewicka
Białystok 2015
2
Wymagania
AMINOKWASY i BIAŁKA (ćw.1 i 2)
1. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne (w tym reakcje
charakterystyczne) aminokwasów.
2. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne białek.
3. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych.
LIPIDY I (ćw. 3 i 4)
1. Budowa oraz właściwości fizyczne i chemiczne kwasów tłuszczowych
i triacylogliceroli:
a) reakcja hydrolizy
b) reakcja autooksydacji
c) reakcja uwodornienia
d) addycja halogenów
2. Proces jełczenia. Liczba kwasowa i nadtlenkowa – wyznaczanie i zastosowanie
3. Metody izolacji tłuszczów.
LIPIDY II (ćw. 5, 6, 7)
1. Definicja, budowa, podział lipidów ze szczególnym uwzględnieniem steroidów
2. Liczba jodowa – wyznaczanie i zastosowanie.
3. Zmydlanie tłuszczów. Mydła i detergenty – budowa i działanie.
4. Budowa i rola biologiczna cholesterolu
3
Ćwiczenie 1
Analiza aminokwasów
Sprzęt:
probówki szklane
łaźnia wodna
palnik gazowy
Odczynniki:
- próbka nabiału ok. 10 g (twaróg, jogurt lub mleko) – należy przynieść na zajęcia
1% wodne roztwory aminokwasów: glicyny i proliny
1% wodne roztwory albuminy
1% roztwory aminokwasów: tyrozyny i tryptofanu w 0,1 M HCl
0,1% świeże roztwory aminokwasów: cysteiny i cystyny w 0,1 M HCl
0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu
stężony HNO3
stężony H2SO4
2M roztwór CH3COOH
10% roztwór NaOH
20% roztwór NaOH
stężony NH3 aq.
1% wodny roztwór nitroprusydku sodu Na2[Fe(CN)5NO]
siarczan amonu
10% roztwór NaNO2
40% roztwór formaldehydu (formalina)
0,25M roztwór CuSO4
mocznik
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie poniższych reakcji charakterystycznych
z konkretnymi aminokwasami jak również z przyniesioną próbką nabiału.
1. Reakcja ninhydrynowa
Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do aldehydów z jednoczesną
dekarboksylacją, a potem deaminacją. Powstały amoniak daje z ninhydryną barwny związek –
fioletowo-niebieski produkt zwany purpurą Ruhemanna.
Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę α-aminową,
np. sole amonowe, aminocukry, amoniak, aminy I-rzędowe, peptydy i białka po hydrolizie.
Aminokwasy takie jak prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy α-aminowej, dają
w reakcji z ninhydryną produkt o barwie żółtej.
Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów aminokwasów: glicyny i proliny, a następnie
dodać po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny. Probówki ogrzać do wrzenia we wrzącej
łaźni wodnej obserwując pojawienie się charakterystycznego zabarwienia.
4
2. Reakcja ksantoproteinowa
Aminokwasy aromatyczne (tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan) ulegają reakcji nitrowania.
Reakcja ta zachodzi dla aminokwasów wolnych jak i związanych w białku. Czynnikiem
nitrującym jest jon nitroniowy NO2+. Mieszanina nitrująca, nitruje wszystkie aminokwasy,
natomiast stężony kwas azotowy ma zdolność nitrowania związków zawierających
aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz fenyloalaniny. Produkty reakcji
nitrowania mają barwę żółtą. Alkalizacja roztworu prowadzi do otrzymywania soli sodowych
charakteryzujących się barwą pogłębioną, aż do żółto-pomarańczowej.
Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka albuminy,
a następnie dodać pod dygestorium po 1 ml stężonego kwasu azotowego(V). Probówki
ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut, oziębić pod bieżącą wodą i dodać po 4 ml
20% roztworu NaOH (reakcja silnie egzotermiczna). Zaobserwować, w których probówkach
roztwór zabarwi się na kolor żółto-pomarańczowy.
3. Wykrywanie grup tiolowych
Grupy tiolowe obecne w aminokwasach wolnych i związanych w białkach reagują
z nitroprusydkiem sodu w środowisku amoniakalnym. Otrzymany związek kompleksowy ma
czerwono-fiołkową barwę.
Do 3 probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: cysteiny, cystyny i albuminy, dodać po 1 ml
1% roztworu nitroprusydku sodu, a następnie siarczanu amonu do nasycenia roztworu.
Zalkalizować próby, dodając ok. 1-2 ml amoniaku (pod dygestorium) pojawienie się
czerwono-fiołkowego zabarwienia prób oznacza dodatni wynik na obecność grup tiolowych.
4. Deaminacja aminokwasów kwasem azotowym(III)
Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego(III), tworzącego się in statu nascendi, ulegają
reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie
gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas.
W probówce zmieszać 1 ml NaNO2 z 1 ml roztworu CH3COOH, ogrzewać 1 minutę w łaźni
wodnej. Odczekać, aż zmniejszy się wydzielanie gazu o żółtej barwie (tlenki azotu) i dodać
do probówki 2 ml roztworu glicyny. Trzymając probówkę w drewnianej łapie wytrząsać
i obserwować wydzielanie się azotu – produktu gazowej reakcji deaminacji.
5
5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie
W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem
glioksalowym lub aldehydem mrówkowym dając barwne produkty kondensacji.
Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy,
następnie dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać. Do każdej probówki dodać powoli po ściance
lekko pochylonej probówki – 1 ml stężonego H2SO4 (nie wstrząsać!) i ogrzewać we wrzącej
łaźni wodnej. Pojawienie się ciemnoczerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz oznacza
dodatni wynik na obecność tryptofanu.
6. Reakcja biuretowa
Biuret (dimocznik, H2N-CO-NH-CO-NH2) tworzy w środowisku zasadowym fioletowy
kompleks z solami miedzi(II). Reakcja ta jest charakterystyczna dla związków zawierających
więcej niż jedno wiązanie peptydowe w cząsteczce (peptydy i białka).
Do suchej probówki nr 1 wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym.
Mocznik topi się, a następnie rozkłada. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy
ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści,
do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny. Do
roztworów: biuretu (probówka nr 1), albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH,
wymieszać starannie, wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi(II), w wyniku czego
powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu.
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich
obserwacji i schematu reakcji.
6
Ćwiczenie 2
Oznaczanie i właściwości fizykochemiczne białek. Enzymy.
1. Oznaczanie kazeiny w metodą formylkową Wolkera
Sprzęt:
kolba stożkowa 100 ml
pipety
biureta 50 ml
Odczynniki:
mleko (śmietanka lub jogurt) 10 ml
formaldehyd, roztwór 20% (v/v)
0,1 M roztwór NaOH
fenoloftaleina, roztwór alkoholowy 2%
W I etapie oznaczenia zobojętnia się próbkę roztworem wodorotlenku sodu wobec
fenoloftaleiny (do pH > 8,3). Zobojętnieniu ulegają wówczas wolne grupy -aminowe
aminokwasów w łańcuchu białkowym. W II etapie oznaczenia dodaje się formaldehyd, który
blokując grupy -aminowe lizyny (przemiana grup –NH2 do –N=CH2) powoduje uwalnianie
z nich jonów H+. Uwolnione jony H
+ odmiareczkowuje się roztworem wodorotlenku sodu.
Do kolby stożkowej odmierzyć pipetą 10 ml mleka (śmietanki lub jogurtu), dodać 0,5 ml
fenoloftaleiny (12 kropli) i miareczkować 0,1 M roztworem NaOH do uzyskania lekko
różowego zabarwienia. Następnie dodać 2 ml formaldehydu i miareczkować ponownie 0,1 M
roztworem NaOH do momentu uzyskania lekko różowego zabarwienia próbki, utrzymującego
się przez 30 sekund. Procentową zawartość kazeiny w mleku (X) obliczyć wg wzoru:
gdzie: 1.57 – współczynnik przeliczeniowy dla kazeiny,
VNaOH – objętość NaOH zużytego do miareczkowania po dodaniu formaldehydu [ml].
2. Denaturacja białek
Sprzęt:
probówki
Odczynniki:
roztwór albuminy
1% roztwór FeCl3
2% roztwór Pb(CH3COO)2
2% roztwór CuSO4
1% roztwór kwasu octowego
NaCl
etanol 96%
7
a) Strącanie białek za pomocą kationów (soli metali ciężkich)
Do 3 probówek zawierających po 2 ml roztworu albuminy o pH zasadowym dodać po 15
kropli:
- 1% roztworu FeCl3 (do pierwszej probówki),
- 2% roztworu Pb(CH3COO)2 (do drugiej probówki),
- 2% roztworu CuSO4 (do trzeciej probówki).
Obserwować strącający się osad.
b) Denaturacja cieplna
Do 1 ml roztwory albuminy dodać 1 kroplę 1% roztworu kwasu octowego i ogrzewać do
wrzenia.
Tworzy się biały kłaczkowaty osad, który staje się wyraźny po dodaniu niewielkiej ilości
(około 6 kropli) roztworu NaCl.
c) Działanie alkoholu
Do dwóch probówek nalać po 1 ml roztworu albuminy i dodać po 2 ml 96% etanolu.
Sprawdzić rozpuszczalność osadu otrzymanego w pierwszej probówce w wodzie, przez
dodanie ok. 5 ml wody i wstrząśnięcie probówki. Po około 40 min. sprawdzić
rozpuszczalność osadu tylko w drugiej probówce.
3. Enzymy
Sprzęt:
probówki
pipetki plastikowe
tarka, nóż
zlewka
Odczynniki:
3% nadtlenku wodoru H2O2 (czyli wody utlenionej)
0,3% nadtlenku wodoru H2O2
0,5% pirogalol
sok z ziemniaka
sok z korzenia imbiru lub chrzanu
a) Wykrywanie obecności katalazy w ziemniaku
Przygotować dwie probówki. Do pierwszej nalać 1 ml 3% roztworu H2O2, a następnie dodać
kilka kropli wyciśniętego soku z ziemniaka. Katalaza ziemniaka powoduje szybki rozkład
8
H2O2 do H2O i O2, co uwidacznia się gwałtownym wydzielaniem pęcherzyków tlenu. Do drugiej
probówki nalać 2 ml surowego soku z ziemniaka i gotować go na wrzącej łaźni wodnej przez 5
min. Po schłodzeniu probówki dodać kilka kropli H2O2. Brak pęcherzyków tlenu świadczy o
inaktywacji katalazy.
b) Aktywność peroksydazy
Przygotować 3 probówki. Do pierwszej nalać 1 ml soku z korzenia imbiru (lub chrzanu), do
drugiej probówki 1 ml soku z imbiru, który należy 3-5 minut gotować w łaźni wodnej.
Natomiast do trzeciej probówki wlewamy 1 ml wody destylowanej. Następnie do każdej
probówki dodać 1 ml 0,3% H2O2 i 1 ml 0,5% pirogalolu. Zaobserwować zmiany zachodzące
w kolejnych probówkach.
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,
z uwzględnieniem swoich obserwacji i wniosków.
9
Ćwiczenie 3
Ocena jakościowa tłuszczów. Wpływ ogrzewania na właściwości tłuszczów.
Sprzęt:
zlewka 100 ml x 2
kolba stożkowa 250 ml x 2
cylinder 100 ml
biureta 50 ml x 2
Odczynniki:
smalec
olej słonecznikowy
0.1 M roztwór wodny KOH
etanol + eter dietylowy 1:1 (v/v)
fenoloftaleina 1% roztwór alkoholowy
chloroform
kwas octowy lodowaty
jodek potasu, świeży roztwór nasycony, wolny od jodanów i wolnego jodu
0,001 M roztwór tiosiarczanu sodu
roztwór skrobi 1%
Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową smalcu oraz oleju słonecznikowego. Następnie
ogrzewać ok. 100 g tłuszczu:
a) Tradycyjnie, w zlewce na płaszczu grzejnym, doprowadzając tłuszcz do temperatury
180 °C. Kontynuować ogrzewanie przez 15 minut kontrolując termometrem
temperaturę tłuszczu.
b) Stosując ogrzewanie mikrofalowe przez 15 minut (moc 600-700 W).
Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową tłuszczy po ogrzewaniu.
Oznaczanie liczby kwasowej (wg normy PN-ISO 660)
Liczba kwasowa wyraża ilość miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia
wolnych kwasów tłuszczowych (KT) zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa jest
miarą zawartości wolnych KT, czyli określa stopień hydrolizy tłuszczu.
Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć
10 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 50 ml mieszaniny alkoholu i eteru. Klarowny
roztwór miareczkować roztworem KOH wobec fenoloftaleiny do uzyskania różowego
zabarwienia utrzymującego się przez ok. 1 minutę. Liczbę kwasową obliczyć wg wzoru:
gdzie: CKOH – stężenie roztworu wodorotlenku potasu [mmol/ml]
VKOH – objętość roztworu wodorotlenku potasu zużytego do miareczkowania [ml]
1
0
MKOH – masa molowa wodorotlenku potasu (56,1 mg/mmol)
m – masa tłuszczu [g]
Oznaczanie liczby nadtlenkowej (wg normy PN-ISO 3960)
Liczba nadtlenkowa LOO oznaczana dla tłuszczu informuje o zawartości w próbce
pierwotnych produktów utlenienia lipidów, tj. wodoronadtlenków. Liczba nadtlenkowa jest to
ilość cm3 mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu
wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 kg
tłuszczu. Ilość nadtlenków w próbce, która utlenia jodek potasu w warunkach oznaczenia,
wyraża się jako miliekwiwalenty aktywnego tlenu zawarte w kilogramie tłuszczu [mEq O/kg
tłuszczu] dokładnie w chwili pomiaru.
Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć
2 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 10 ml chloroformu, rozpuścić przez mieszanie.
Dodać 15 ml CH3COOH lodowatego oraz 1 ml nasyconego KI. Kolbę natychmiast zamknąć
korkiem, mieszać 1 minutę, a następnie odstawić w ciemne miejsce na 5 minut. Dodać 75 ml
wody i 5 kropli roztworu skrobi. Zawartość kolby natychmiast miareczkować roztworem
tiosiarczanu sodu do uzyskania odbarwienia trwającego co najmniej pół minuty. Analogiczne
oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania
tłuszczu).
Liczbę nadtlenkową, wyrażoną w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu,
obliczyć wg wzoru:
gdzie: 1000 - współczynnik przeliczeniowy liczby cm3 zużytego Na2S2O3 na milirównoważniki tlenu
w 1 kg tłuszczu
VNa2S2O3 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm3]
V0 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm3]
CNa2S2O3 - stężenie molowe tiosiarczanu sodu [mol/dm3]
m - masa tłuszczu [g]
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z
uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać prawdopodobne
produkty powstające podczas jełczenia oksydatywnego.
1
1
Ćwiczenie 4
Hydroliza oleju roślinnego
Sprzęt:
mieszadło magnetyczne
element mieszający
łaźnia olejowa
kolba okrągłodenna 250 ml
kolba okrągłodenna 100 ml
rozdzielacz 250 ml
cylinder miarowy 100 ml
lejek Buchnera
kolba ssawkowa
erlenmajerka 100 ml
Hydroliza oleju roślinnego
W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml umieścić 15 g oleju roślinnego, 3.45 g
wodorotlenku potasu i 30 ml gliceryny. Kolbę ogrzewać przez 5 minut w łaźni olejowej
w temperaturze 160 °C zapewniając mieszanie. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej
(mieszanina zaczyna krzepnąć) dodać 90 ml rozcieńczonego HCl (75 ml wody i 15 ml
stężonego HCl), doprowadzając do pH = 1. Wytrącony osad wraz z roztworem przenieść do
rozdzielacza, kolbę przemyć eterem dietylowym. Mieszaninę ekstrahować eterem dietylowym
(3 x 30 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad
siarczanem sodu. Po odsączeniu odparować rozpuszczalnik. Zważyć surowy kwas oleinowy
zanieczyszczony kwasami wielonienasyconymi (linolowym, linolenowym).
Wyodrębnienie kwasu oleinowego
Otrzymany produkt przenieść do kolby 100 ml, dodać 16.5 g mocznika i 75 ml metanolu.
Mieszaninę ogrzać do rozpuszczenia osadu, przesączyć, roztwór pozostawić do krystalizacji.
Otrzymane kryształy (kompleks kwasu oleinowego z mocznikiem) odsączyć, a następnie
rozpuścić w 35 ml wody i ekstrahować eterem naftowym (3 x 20 ml). Warstwę organiczną
przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu, odsączyć, odparować.
Zważyć produkt (gęstniejący olej o t.t. 16 °C i obliczyć wydajność procesu).
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,
z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.
Odczynniki:
olej rzepakowy 15 g
gliceryna 30 ml
KOH
eter dietylowy 90 ml
stężony HCl 15 ml
NaCl
Na2SO4
mocznik – metanol
eter naftowy
1
2
Ćwiczenie 5
Izolacja kwasów tłuszczowych z migdałów/ wiórków kokosowych
Sprzęt:
zestaw do destylacji z parą wodną
kolba okrągłodenna 250 ml x 2
chłodnica zwrotna
lejek
rozdzielacz 250 ml
Pozyskanie olejku migdałowego lub kokosowego można dokonać macerując materiał roślinny
eterem naftowym (metoda A) lub destylując go z parą wodną (metoda B).
Metoda A
Rozdrobnione migdały (w płatkach, 15 g) lub wiórki kokosowe oraz 100 ml eteru naftowego
umieścić w kolbie 250 ml zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w temperaturze
wrzenia przez godzinę. Następnie ochłodzić mieszaninę, przesączyć. Kolbę przepłukać
octanem etylu w celu wymycia wszystkich tłuszczowych pozostałości i dołączyć do
przesączu. Całość odparować, zważyć.
Metoda B
Zmontować zestaw do destylacji z parą wodną. W kolbie umieścić 15 g migdałów w płatkach
lub wiórków kokosowych. Destylację (pod wyciagiem) kontynuować do uzyskania 150 ml
destylatu o mleczobiałej barwie. Destylat ekstrahować chloroformem (4 x 50 ml). Warstwę
organiczną osuszyć nad Na2SO4, odparować i zważyć.
Odczynniki:
15 g migdałów lub wiórków kokosowych
chloroform
eter dietylowy
eter naftowy
octan etylu
metanol
etanol
Na2SO4
1
3
Rys. 1. Zestaw do destylacji I
Rys. 2. Zestaw do destylacji II
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,
z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.
1
4
Ćwiczenie 6
Zmydlanie i oznaczenie liczby jodowej oleju kokosowego i migdałowego
Sprzęt:
kolba okrągłodenna 250 ml
chłodnica
biureta 50 ml
kolba stożkowa 250 ml
zlewka 250 ml
cylinder 100 ml
Otrzymywanie mydła
Rozpuścić olejek kokosowy lub migdałowy w 30 ml alkoholu etylowego w kolbie 250 ml
i dodać 45 ml roztworu zawierającego odpowiednią ilość wodorotlenku sodu (na 1 g olejku -
0.25 g NaOH) w mieszaninie etanol : woda (9:1 v/v). Otrzymaną mieszaninę należy ogrzewać
w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Po ochłodzeniu otrzymane mydło przenosi się
łopatką do zlewki zawierającej 110 ml wody z pokruszonym lodem. Następnie należy
przesączyć, osuszyć i zważyć.
Oznaczenie liczby jodowej metodą Morgoschesa
Liczba jodowa stanowi ilość gramów jodu, którą mogą przyłączyć nienasycone kwasy
tłuszczowe zawarte w 100 g tłuszczu. Jej wartość jest miarą zawartości w tłuszczu
nienasyconych kwasów tłuszczowych. Im wyższa wartość liczby jodowej, tym większa
zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Nadmiar nieprzereagowanego jodu usuwa
się poprzez odmiareczkowanie roztworu kwasów tłuszczowych roztworem tiosiarczanu sodu.
Próbkę badanego tłuszczu 0,2 g (olejek migdałowy) lub 1 g (olejek kokosowy) umieścić w
kolbie stożkowej na 250 ml, dodać 15 ml alkoholu metylowego, a następnie 10 ml 0,2 M
alkoholowego roztworu jodu. Roztwór dokładnie wymieszać i natychmiast dodać 100 ml
wody destylowanej i odstawić pod przykryciem nie dłużej niż na 5 minut. Po tym czasie
nieprzereagowany jod odmiareczkować 0,1 M Na2S2O3 wobec 2 ml skrobi, którą należy
dodać pod koniec miareczkowania (gdy roztwór uzyska jasnożółta barwę). Zakończyć
Odczynniki:
olejek kokosowy lub migdałowy
etanol
NaOH
0.1 M Na2S2O3
jod
skrobia
1
5
miareczkowanie gdy roztwór uzyska mleczną barwę. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić
dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu w metanolu).
Liczbę jodową obliczyć wg wzoru:
gdzie: 1,269 – wartość gramorównoważnika jodu (126,92 g) w odniesieniu do 100 g tłuszczu
V0 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w próbie kontrolnej
V1 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w oznaczeniu właściwym
m – masa tłuszczu [g]
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,
z uwzględnieniem celu doświadczenia, celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.
Podać schemat reakcji otrzymywania mydła z kwasu laurynowego i oleinowego oraz addycji
jodu do kwasu oleinowego.
1
6
Ćwiczenie 7
Izolacja i wykrywanie cholesterolu z żółtka jaja kurzego
Sprzęt:
zlewka 100 ml 2x
bagietka
kolba okrągłodenna 250 ml
lejek
płytki chromatograficzne
komory chromatograficzne
probówki
Odczynniki:
jajo kurze
etanol-eter dietylowy (2:1, v/v)
eter dietylowy
aceton
chloroform
cholesterol - wzorzec
kwas siarkowy stężony
bezwodnik octowy
roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym
Izolacja cholesterolu
Dokładnie oddzielić żółtko od białka i zalać je w zlewce 75 ml mieszaniny etanol-eter
dietylowy (2:1, v/v). Rozmieszać żółtko szklaną bagietką i pozostawić mieszaninę
w temperaturze pokojowej na ok. 10 min., od czasu do czasu mieszając. Mieszaninę odsaczyć
na sączku karbowanym do suchej kolby kulistej, a przesącz odparować na wyparce (temp.
łaźni poniżej 50 °C). Żółtą pozostałość rozpuścić w 10 ml eteru dietylowego. Otrzymany
roztwór wkroplić powoli, mieszając, do zlewki zawierającej 30 ml acetonu. Wytrącony osad
surowych lecytyn odsaczyć na sączku karbowanym. Przesącz odparować, a pozostałość
rozpuścić w chloroformie i zachować do TLC i reakcji probówkowych.
Na płytkę chromatograficzną nanieść próbki osadu, przesączu i wzorzec cholesterolu.
Rozwinąć w układzie oraz heksan-octan etylu (7:3). Wywołać: w parach jodu oraz kwasie
siarkowym.
1
7
Wykrywanie cholesterolu
Reakcje probówkowe na obecność cholesterolu w przesączu. Powtórzyć z wzorcem
cholesterolu rozpuszczonym w chloroformie.
Próba Salkowskiego: Do 2 ml roztworu cholesterolu dodać powoli po ściance probówki 1 ml
stężonego kwasu siarkowego. Kwas fluoryzuje na zielono, a warstwa organiczna barwi się na
czerwono.
Próba Liebermana-Burcharda: Do 1 ml roztworu cholesterolu dodać 10 kropli bezwodnika
octowego i kroplę kwasu siarkowego. Pojawia się czerwone zabarwienie, przechodzące przez
niebieskie w zielone.
Próba Windausa: Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu dodać kroplami roztwór
bromu w lodowatym kwasie octowym. Obserwować zanikanie barwy bromu.
W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich
obserwacji i schematu reakcji.